KR20140123489A - T 세포들을 증식시키는 방법 - Google Patents

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Abstract

본 개시내용은 자가 또는 동종 항원 특이적 T 세포들을 실험실내 증식시키는 신규한 방법으로서, a) 자가 PBMC 세포들의 집단을 i) 표적 항원과 관련된 펩타이드/펩타이드 혼합물로 펄스화된 수지상 세포들 또는 표적 항원과 관련된 펩타이드/펩타이드 혼합물, 및 ii) 적어도 하나의 사이토카인의 존재 하에 배양하는 단계, 및 b) 단계 a)로부터의 T 세포들의 집단을 i) 표적 항원과 관련된 펩타이드/펩타이드 혼합물로 펄스화된 수지상 세포들 또는 표적 항원과 관련된 펩타이드/펩타이드 혼합물 및 인공 공동자극 인자로 펄스화된 자가 항원 제시 T 세포들(T-APC들), 및 ii) 임의로 사이토카인의 존재 하에 배양하는 단계를 포함하고, 상기 방법은 생 바이러스 및/또는 바이러스 벡터들 또는 관련 T 세포 집단의 증식에서의 DNA 또는 RNA 코딩 항원들의 사용을 이용하지 않는 것을 특징으로 하는 방법에 관한 것이다. 본 개시내용은 또한 상기 방법으로부터 얻은 세포 집단들, 상기 세포 집단들을 포함하는 약제학적 조성물들 및 치료, 특히 예를 들면 면역 손상된 또는 면역 경쟁 환자들에서의 바이러스 감염 및/또는 암의 치료 또는 예방을 위한 세포들 및 조성물들의 용도로 확장된다.

Description

T 세포들을 증식시키는 방법{PROCESS OF EXPANDING T CELLS}
본원발명은 US 가출원 제61/569,577호(참조문헌으로 본 명세서에 포함됨)에 대한 우선권을 주장한다.
본 발명은 T 세포들, 예컨대 자가 T 세포들, 이로부터의 세포 집단들을 증식시키기 위한 신규한 방법, 상기 세포 집단들을 포함하는 약제학적 조성물들 및 치료를 위한 세포들 및 조성물들의 용도, 특히 예를 들면 면역 손상 또는 면역 경쟁 인간 환자에서의 바이러스 감염 및/또는 암의 치료 또는 예방에 관한 것이다.
바이러스는 감염성 질환의 원인으로서 널리 인식되고 있고, 특정한 바이러스는 또한 인간 암과 관련된다. 인간 면역계는 바이러스 감염 및 또한 발암성 바이러스와 관련된 것으로 나타난 악성종양의 조절에서 중추적이다. 인간 면역계를 구성하는 세포들, 항체들 및 면역조절 분자들의 복잡한 어레이 내에, 흉선 기원의 림프구들(T 세포들)은 바이러스 감염 및 암을 조절하는 데 중요한 역할로 작동한다. 그러므로, 바이러스 감염 및 암을 예방하거나 치료하는 일 접근법은 이들 환자들로부터 T 세포들을 취하고 이들을 실험실내 자극하고/하거나 증식시킨 후 이들을 환자에게 다시 수혈하는 것이다.
생체 내 T 세포 활성화 및 항원 특이적 증식은 일반적으로 2개의 신호 과정으로부터 생기는 것으로 생각되고, 여기서 제1 신호는 T 세포 수용체/CD3 복합체와 펩타이드 항원을 제시하는 주조직 적합성 복합체 I형 또는 II형 분자(MHC I형 또는 MHC II형)와의 결합(ligation)에 의해 개시된다. MHC I형 또는 MHC II형 및 펩타이드 복합체는 세포(항원 제시 세포 또는 APC)의 표면 위에 발현된다. 펩타이드 항원은 내인성 과정(endogenous processing)을 겪는 세포 내의 분자로부터 생기고, 특히 체내 천연적으로 발생하는 (1) "자기" 항원; (2) 암과 관련된 돌연변이로부터 생긴 종양 항원 또는 (3) 감염 또는 암과 관련된 바이러스 항원일 수 있다. T 세포 수용체에 의한 항원의 인식은 제1 신호 및 제2 신호가 T 세포 위의 추가의 표면 분자들과 APC 위의 추가의 분자들과의 결합로부터 생기는 공동자극(co-stimulation)으로부터 생기는 것으로 생각된다. 제1 신호가 이를 성취하는 데 단독으로 충분하지 않을 수 있으므로, T 세포와 APC 사이의 이 공동자극 분자들의 상향조절 및 결합은 T 세포 활성화를 실행하거나 증대시키는 데 필요할 수 있다. 2개의 신호 활성화는 T 세포를 증식시켜서 병원균 또는 암을 제어하도록 더 많은 수의 항원 특이적 T 세포들이 이용 가능하게 하여 면역 반응을 발생시킬 수 있다. 이 2개의 신호 활성화의 고전적인 이해는 반응하는 T 세포에 대한 제1 신호 및 제2 신호 둘 다를 제공하는 동일한 APC에 기초하여 공동자극은 항원 인식과 직접 관련된다. T 세포들의 실험실내 활성화 및 증식은 전통적으로 길고 복잡하고 자원 집약 과정이다. 통상적인 과정은 예를 들면 8주 내지 12주가 걸리고, 대개 항원 제시 세포들(APC)에 의한 항원 제시를 성취하기 위해 생 "표적" 바이러스 및/또는 바이러스 벡터들을 사용한다. 일반적으로 T 세포 활성화/증식은 교반된(stirred) 또는 물리적으로 진탕된(agitated) 배양 시스템보다는 정적 조건들을 요한다.
엡스타인 바 바이러스(Epstein-Barr: EBV)의 LMP1 및 LMP2 항원들을 인식하는 항원 특이적 T 세포들을 배양하는 하나의 선행 기술 방법이 하기 요약될 수 있다:
준비 단계들
ㆍ 제어된 방식으로 2개의 신호 T 세포 활성화 및 증식 과정을 성취하기 위해, 환자로부터 취한 B 세포들의 세포감염(transfection)을 통해 항원 제시 세포를 생성하는 것이 유용하다. 이를 자가 림프아구성 세포주의 확립이라 칭하고, EBV(EBV-LCL)에 의한 세포의 감염을 통해 수행된다. 이는 이 세포주를 발달시키는 데 약 6주 내지 8주가 걸리고, 따라서 이것은 항원 제시에 대해 EBV-LCL에 의존하는 배양 과정의 일부(part)로서 시작할 수 있는 제1 단계 중 하나이다. EBV 특이적 T 세포 성장 및 LCL의 제거를 억제하기 위해 이것은 사이클로스포린 A의 존재 하에 환자로부터의 B 세포들을 EBV 바이러스와 배양함으로써 제조된다.
o EBV-LCL들과의 증식 단계 전에, 배양 시스템은 (EBV 단백질들 LMP1 및 LMP2를 코딩하는) 바이러스 벡터들 Ad5f35-LMP1-LMP2로 형질유도된 자가 수지상 세포들를 갖는 LMP-1 및 LMP-2 특이적 T 세포들의 초기 활성화 및 증식을 포함한다(0일 내지 8일).
o 9일 내지 12일 세포독성 T 림프구(CTL)를 수확하고 새로운 배지 중에 재현탁시키고 Ad5f35-LMP1-LMP2로 형질유도된 EBV-LCL들로 재자극한다.
o 13일 내지 16일 세포독성 T 림프구를 새로운 배지 및 재조합 인간 IL-2와 공급한다.
o 이후, CTL:LCL를 사용하여 매주 재자극하고, 4주 내지 8주 기간 동안 IL-2를 주마다 2회 첨가한다.
ㆍ 환자 샘플로부터 PBMC들을 취하고 이들을 IL-4 및 GM-CSF로 활성화하여 부착성 PBMC들을 제공함으로써 상기 과정에서 사용하기 위한 수지상 세포들을 또한 제조해야 한다. 이후, 이 세포들을 (즉, EBV 단백질 LMP1 및 LMP2를 코딩하는) 바이러스 벡터들 Ad5f35-LMP1-LMP2로 형질유도한다. 마지막으로, IL-1β, IL-6, PGE-1 및 TNF-α를 첨가하여 수지상 세포들을 성숙시킨다.
T 세포 증식 단계들의 요약
(세포독성 T 림프구들(CTL들)의 제조라고도 칭함)
ㆍ 제조되면, 형질유도된 수지상 세포들을 약 10일의 기간 동안 환자로부터 새로운 PBMC들과 배양한다.
ㆍ 이 단계로부터 얻은 T 세포들을 이후 약 1주의 기간 동안 형질유도된 EBV-LCL들과 배양한다.
ㆍ 이후, 후자의 단계로부터 얻은 T 세포들을 추가로 10일 동안 IL-2개의 존재 하에 형질유도된 EBV-LCL들과 배양하여 자가 T 세포 항원 특이적 생성물을 제공한다.
ㆍ 충분한 T 세포들이 증식될 때까지 이 과정을 반복한다.
문헌[J Immunother Vol 33, Number 3, April 2010]은 GRex™ 시스템으로 공지된 윌슨 울프(Wilson Wolf)로부터의 시스템을 사용하여 23일의 기간 동안 세포들을 배양하는 더 빠르고 더 효율적인 방법을 기술한다. 그러나, 이 신속한 과정은 세포들에 대한 전통적인 바이러스 자극들을 여전히 이용한다.
선행 기술 전략에 의한 다양한 문제점이 존재한다:
(ⅰ) 생 바이러스(예컨대 EBV) 및 바이러스 벡터의 사용은 표적 바이러스 특이적 CTL들의 효과적인 생성을 방해할 수 있는 벡터들에 대한 면역우세 반응을 발생시킬 가능성을 갖는다;
(ⅱ) 생 바이러스의 사용은 안전성 문제로 인해 3상 임상을 진행하는 데 장애물이다;
(ⅲ) B 세포들이 EBV-LCL을 제조하는 데 필요요건인, 이제 (B 세포들을 고갈시키는) 리툭산이 대부분의 림프종 환자들에 대한 표준 치료가 된다는 것은 이 기술이 많은 환자들에 이용 가능할 수 없다는 것을 의미한다;
(ⅳ) 제조 기간(EBV-LCL을 확립하는 데 최소 6주 및 CTL 증식에 추가로 5주 내지 7주)은 매우 불편하고 실행 불가능하고 경제적으로 힘들다;
(ⅴ) 세포 조작의 복잡성은 생성물의 오차 및 오염의 많은 기회를 제공하고, 그러므로, 우수 관리 실행(GMP) 원칙을 준수하기 어렵다;
(ⅵ) T 세포 증식을 자극하기 위해 사용되는 자가 항원 제시 세포들은 표적 항원 이외의 항원들을 발현할 수 있어서, 치료학적 T 세포 생성물에 바람직한 항원 특이적 T 세포들의 순도를 감소시킬 수 있다.
그럼에도 불구하고, 당업자는 치료학적 특성을 갖는 생성물을 생성하는 데 각각의 단계가 필요한 것으로 생각되므로 확립 과정을 이동시키고, 특히 생체 내 바이러스 항원들을 발현하는 생 바이러스들 및 암들에 의해 감염된 세포들을 인식하기에 적합한 T 세포 집단들을 생성하는 것을 꺼린다.
본 개시내용은 표적 항원에 대한 특이성을 갖는 항원 특이적 T 세포들의 신속하고 효과적인 제조 방법을 제공한다.
본 개시내용은 항원 특이적 T 세포들, 예컨대 자가 항원 특이적 T 세포들을 실험내 실 증식시키는 방법으로서,
a) 자가 PBMC 세포들의 집단을
i) 표적 항원(들)과 관련된 펩타이드/펩타이드 혼합물로 펄스화된 수지상 세포들 또는 표적 항원(들)과 관련된 펩타이드/펩타이드 혼합물, 및
ii) 적어도 하나의 사이토카인의 존재 하에 배양하는 단계, 및
b) 단계 a)로부터의 T 세포들의 집단을
i) 표적 항원(들)과 관련된 펩타이드/펩타이드 혼합물로 펄스화된 수지상 세포들 또는 표적 항원(들)과 관련된 펩타이드/펩타이드 혼합물 및 인공 공동자극 인자로 펄스화된 자가 항원 제시 T 세포들(T-APC들), 및
ii) 임의로 사이토카인의 존재 하에 배양하는 단계를 포함하고,
상기 방법은 생 바이러스 및/또는 바이러스 벡터들 또는 관련 T 세포 집단의 증식에서의 DNA 또는 RNA 코딩 항원들의 사용을 이용하지 않는 것을 특징으로 하는 방법을 제공한다.
일 실시양태에서, 항원 특이적 T 세포들을 실험실내 증식시키는 방법으로서,
a) 자가 PBMC 세포들의 집단을
i) 표적 항원(들)과 관련된 펩타이드 혼합물로 펄스화된 수지상 세포들, 및
ii) 적어도 하나의 사이토카인의 존재 하에 배양하는 단계, 및
b) 단계 a)로부터의 T 세포들의 집단을
i) 표적 항원(들)과 관련된 펩타이드 혼합물 및 인공 공동자극 인자로 펄스화된 자가 항원 제시 T 세포들(T-APC들), 및
ii) 사이토카인의 존재 하에 배양하는 단계를 포함하고,
상기 방법은 생 바이러스 및/또는 바이러스 벡터들 또는 관련 T 세포 집단의 증식에서의 DNA 또는 RNA 코딩 항원들의 사용을 이용하지 않는 것을 특징으로 하는 방법을 제공한다.
본 개시내용의 방법에서, 단계 a)에서의 PBMC들 또는 수지상 세포들 및 단계 b)의 항원 제시 세포들을 표적 항원으로부터 에피토프들을 제시하도록 선택된 펩타이드들로 일반적으로 펄스화(로딩이라고도 칭함)한다. 이 펩타이드들은 하기 더 자세히 기재되어 있다.
본 발명자들은 하기에 의해 선행 기술의 문제점을 극복하였다:
ㆍ EBV-LCL들을 생성할 필요성을 제거하여 항원 제시에 생 바이러스의 사용을 피함(이는 이전에 예를 들면 리툭산 치료에 의해 B 세포 고갈된 환자들로부터 항원 특이적 T 세포들을 생성시킴).
ㆍ 항원 제시 세포들에서 항원 발현 및 제시를 성취하기 위해 바이러스 벡터들-, 또는 DNA-, 또는 RNA 코딩된 항원을 사용할 필요성을 제거함.
ㆍ 항원 제시에 DC들의 사용을 제거할 옵션을 제공함.
ㆍ 자극 신호가 자가 세포 집단에 의해 제공되고 공동자극 신호가 재조합 세포주 또는 인공 공동자극 복합체에 의해 제공되는 T 세포 활성화에 대한 방법을 제공함.
ㆍ 3주 이하 동안 적합한 항원 특이성을 갖는 전체 예를 들면 10e7 초과의 CD3 T 림프구를 생성하는 효과적이고 탄탄한 2단계 배양 과정을 제공함.
ㆍ 2형 잠복 종양들(림프종 및 NPC)에서 발현되지 않은 항원들에 의해 우세하지 않다면, 임상 관련 바이러스 항원, 예컨대 EBV 항원들에 대한 특이성을 갖는 T 세포의 자극에 집중함.
현재 청구된 발명은 자가 T 세포 생성물들의 제조에 중요한 이점을 갖고 가능하게는 치료가 더 넓은 환자들 집단에 이용 가능하게 한다. 이는 또한 치료학적 생성물을 제조하는 데 필요한 시간, 중재 및 자원을 최소화하고, 또한 유리하게는 오염 가능성을 최소화한다.
더구나, 얻어진 치료학적 생성물의 특이성 및 특성은 선행 기술 방법에 의해 제조된 생성물과 적어도 동일하고 다수의 양태에서 개선된 특성을 가질 수 있다.
환자 세포들이 대개 아네르기(anergic)인 것으로, 즉 감염 또는 암과 관련된 항원들에 대한 면역 반응을 전달할 수 없는 것으로 발견되므로, 특정한 환자들(예컨대 암 환자들)로부터의 자가 세포들은 건강한 개체들로부터 얻은 세포들과 다르다. 면역 억제는 대개 전신(systemic)인 것으로 생각되지만, 아네르기는 일반적으로 항원 특이적 기준으로 기재되고, T 세포들의 특이적 클론은 표적 항원에 대해 면역 반응을 더 이상 전달할 수 없다. 암 미세환경은, 예를 들면 아네르기를 생성할 수 있어서 암 항원들을 인식하는, T 세포들이 더 이상 기능적이지 않다.
면역 아네르기 또는 억제의 증거는 예를 들면 바이러스 감염 및/또는 바이러스 관련 암 세포들의 존재를 없애는 능력 부족이다. 건강한 개체들에서, 이들 세포들은 면역계에 의해 없어진다(Teague, R. M., B. D. Sather, J. A. Sacks, M. Z. Huang, M. L. Dossett, J.Morimoto, X. Tan, S. E. Sutton, M. P. Cooke, C. Ohlen, and P. D. Greenberg. 2006. Interleukin-15 rescues tolerant CD8+ T cells for use in adoptive immunotherapy of established tumors. Nat. Med. 12:335-341 and Chemnitz, J. M., D. Eggle, J. Driesen, S. Classen, J. L. Riley, S. bey-Pascher, M. Beyer, A. Popov, T. Zander, and J. L. Schultze. 2007. RNA fingerprints provide direct evidence for the inhibitory role of TGF beta and PD-1 on CD4+ T cells in Hodgkin lymphoma. Blood 110:3226-3233).
추가로, 비인두암(NPC)을 앓는 환자들에서, 항원 특이적 세포독성 T 림프구(CTL들)에 의한 자가 T 세포 면역치료의 결과는 비교적 비효과적이다. 일 임상실험에서, 11명 중 불과 1명의 환자가 완전한 반응을 가졌고, 이는 이들 환자들로부터 LMP 특이적 T 세포들을 재활성하는 능력 부족으로 설명될 수 있다. 사실, 본 발명자들은 NPC가 바이러스 종양 항원들에 대한 특이성을 갖는 T 세포들을 아네르기화한다고 가설을 세웠다.
따라서, 몇몇 환자들에서, 선행 기술 방법은 적절한 항원 특이적 T 세포들을 적절하게 재활성화시킬 수 없다.
주입된(infused) T 세포들의 효율은 표적화된 종양 항원들을 인식하는 것뿐만 아니라, 에피토프 손실, 바이러스 균주 변이 및 T 세포 유발 돌연변이로 인해 종양 탈출을 방지하기 위해 이들 항원들 내에 다수의 에피토프들을 인식하는 능력에 따라 달라지지 않는다. 그러므로, NPC 및 EBV 양성 림프종들에서 발현된 LMP1- LMP2-, EBNA1 및 BARF1-과 같은 항원들로부터 에피토프들의 광범위한 레퍼토리를 인식하는 CTL들을 재현 가능하게 재활성화하고 증식시키는 제조 전략을 개발할 필요가 있다.
당해 분야의 선두자인 본 발명자들에 의한 작업 전에, 바이러스 감염 및 바이러스들과 관련된 암의 예방 및 치료를 위해 자가 항원 특이적 T 세포 집단을 생성하기 위해 펩타이드들이 사용되는지에 대해 공지되지 않았다. 본 발명의 방법에서 사용되는 수지상 세포들 또는 T-APC들이 상기 펩타이드들을 사용하는 항원 제시 세포들로서 유용해지는지도 공지되지 않았다. 펩타이드들에 T 세포 반응들이 더 많다는 것은 면역계가 인식하는 자연에서 처리된 펩타이드들의 맥락에서 관련되는 것으로 보인다.
본 발명은 (자가) 항원 특이적 T 세포 제제의 제조에서 매우 중요한 진전을 나타내고, 환자들 및 의학 숙련의들에게 실질적인 이익을 발생시킬 것이다.
본 개시내용의 증식된 T 세포 집단들에서 중요한 인자들은 하기이다:
ㆍ 인식된 각각의 에피토프에 대한 T 세포들의 결합도,
ㆍ 각각의 항원 내에 인식된 에피토프들의 수,
ㆍ 인식된 항원들의 수,
ㆍ T 세포들의 배수 증식 및 원하는 특이성을 갖는 T 세포들의 빈도.
도 1은 EVB 특이적 T 세포들을 생성하기 위한 선행 기술 방법의 도식적 표시(다이아그램)를 나타낸다. 이 방법은 후속 라운드의 활성화/증식을 위한 제1 라운드의 활성화/증식 및 림프아구성 세포주들(LCL)에 대한 자가 수지상 세포들(DC)의 제조를 요한다. Dc들 및 LCL들 둘 다 EBV 특이적 T 세포들의 성장을 자극하기 위해 선택된 EBV 항원들을 포함하는 아데노바이러스 벡터들로 세포감염된다.
도 2는 본 발명의 다양한 실시양태의 도식적 표시를 나타낸다. 다이아그램은 EBNA1, LMP1 및 LMP2 특이적 T 세포들을 생성하기 위한 펩타이드들의 사용을 보여줌으로써 본 발명의 방법을 나타낸다. 모든 새로운 방법에서, 아데노바이러스 벡터들의 사용은 항원(들)을 제공하는 방식으로서 외인성(exogenous) 펩타이드(들)의 첨가에 의해 대체된다. 또한, 제2 라운드의 활성화/증식에 대한 LCL의 사용은 폐지되고 펩타이드 로딩된 자가 DC들 또는 펩타이드 로딩된 항원 제시 자가 T 세포들(T-APC) 및 aK562 세포들로 대체된다. 다른 실시양태는 제1 자극은 DC의 사용 없이 수행될 수 있고, PBMC 집단에 존재하는 항원 제시 세포들을 사용한다는 것을 나타낸다.
PBMC들, DC들 및 T-APC들의 생성은 각각 프로토콜 1, 2 및 3 하에 본 문헌에 기재되어 있다.
도 3 시리즈에서의 도면들은 본 발명의 청구항 1의 단계 b)에서 T-APC들을 사용한 aK562에 의한 T 세포 증식의 자극을 나타낸다. 이는 제2 라운드의 활성화/증식에 대해 강력한 항원 특이적 T 세포 자극을 성취하기 위한 신규한 시스템의 사용을 나타낸다. 이는 제1(항원 특이적, 자극) 신호 및 제2(공동자극) 신호가 2개의 별개의 성분에 의해 제공될 수 있다는 놀라운 발견에 기초한다. 도시된 예에서, 제1 신호는 펩타이드 로딩된 T-APC들에 의해 제공되고, 제2 신호는 MHC가 아니라 본 공동자극 분자들로 변형된 aK562 세포들에 의해 제공된다. 이는 본 발명의 청구항 1의 단계 b)에 설명된 바이다.
도　 3a는 본 발명의 청구항 1의 단계 b)에 따른 aK562 및 T-APC들을 사용하는 T 세포들의 증식을 나타낸다. 이 도면은 상기 방법의 제2 자극 및 생성된 세포 증식 동안 상이한 비의 CTL:T-APC:aK562를 사용한 6명의 정상 공여자들에서의 결과를 나타낸다. 1:1:5 비가 대부분의 공여자들에서 가정 최적인 것으로 나타났다.
도 3b 는 본 발명의 청구항 1의 단계 b)에서 T 세포 증식에 대한 최적의 CTL 대 aK562 대 T-APC 비를 나타낸다. (C) (각각 도 3a에 도시된) 배수 증식, (D) 배양물에서의 CD56+, CD3- 세포들의 백분율 및 (E) 상이한 세포 대 세포 비(SCF = 스팟 형성 콜로니들)를 이용하여 생성된 최종 세포 생성물의 인터페론-γ(IFNγ) ELISPOT에서의 반응을 비교하여 결과를 생성한다.
도 3c는 다양한 비율의 CTL들 대 T-APC들 대 aK562 세포들 및 상이한 항원들을 사용한 EBV 특이적 T 세포들의 배양물에서의 인터페론 감마 분비 세포들의 비교를 나타낸다. 2명의 각각의 공여자들에서 ELISPOT 분석에서 IFNγ를 생성하는 최종 배양물에서의 세포들의 수, 이어서 상이한 배양 비에서의 제2 자극이 도시되어 있다. 이는 관심 있는 3개의 각각의 EBV 항원들 및 항원이 없는 대조군에 대해 도시되어 있다.
도 3d 는 T-APC가 HLA I형 및 II형 제한된 항원들에 대해 항원 제시 세포들로서 작용할 수 있다는 것을 나타낸다.
A. OKT3 및 CD28 항체들(T-APC)에 의한 PBMC의 활성화 시, T 세포들은 HLA II형, 및 공동자극 분자들(예컨대 CD80, CD83, CD86 및 4-1BBL)을 상향조절하기 시작한다. 일주일이 끝날 때 HLA II형이100% 이하에 도달하더라도, 공동자극 분자들의 농도(level)은 일시적이고 여전히 낮다.
B. aK562는 안정하고 높은 농도의 CD80, CD83, CD86 및 4-1BBL를 발현하도록 조작된 HLA (-) 백혈병 세포주이다.
도 4 시리즈에서의 도면들은 건강한 공여자들로부터 EBV 특이적 세포들을 증식시키기 위해 선행 기술 및 본 발명의 다양한 실시양태를 사용하는 결과를 나타낸다.
도 4a는 선행 기술 방법 및 본 발명의 다양한 실시양태의 단계들 및 이들의 명명법의 도식적 표식이다. 이 다이아그램은 음영 박스에서의 선행 기술 및 제1 전극 및 제2 자극을 언급하는 데 사용된 명명법을 나타낸다. 처음에 APC로서 사용된 세포 유형, 이어서 항원이 전달되는 방식(Ad 벡터들 또는 펩타이드들 - Px)이 도시되어 있다. T-APC 및 aK562와 함께 펩타이드를 사용하는 실시양태의 경우, 이는 데이터에서 ATC로 축약된다.
도 4b는 선행 기술 및 본 발명의 다양한 실시양태를 사용하는 EBV 특이적 T 세포들의 증식을 나타낸다. 이 도면은 9명의 건강한 공여자들로부터의 결과의 요약을 나타낸다. 선행 기술 및 도 4a에 도시된 3개의 다른 방법을 사용하는 EBV 특이적 T 세포들의 증식 이후, 세포들을 9일, 16일 및 23일에 계수하고, 결과는 하기 수백만개의 세포들을 나타낸다. 이는 각각 3명 및 4명의 NPC 공여자들을 대표한다. aK562를 DC들 또는 T-APC들과 조합하여 사용하는 방법 둘 다는 선행 기술보다 유의적으로 우수한 증식을 나타낸다.
도 4c 는 선행 기술 및 본 발명의 다양한 실시양태를 사용하여 EBV 특이적 T 세포들의 배양물에서 인터페론 감마 분비 세포들의 비교를 나타낸다. 배양 이후, 선행 기술 방법 및 다양한 실시양태를 사용하여 세포 집단들을 ELISPOT 분석(assay)에서 펩타이드들로 재자극한다. 관심 있는 3개의 항원(EBNA-1, LMP1 및 LMP2)들로부터의 펩타이드들 사용하고, 선행 기술과 비교할 때 반응은 증대되거나 동일하였다. (전체 9명의 건강한 공여자들의) 대표적인 일 예, 이어서 ATC를 사용하는 실시양태에 대한 모든 정상 공여자들로부터의 정보를 수집한 그래프가 도시되어 있다.
도 4d 는 선행 기술 및 본 발명의 다양한 실시양태에 의해 증식된 EBV 특이적 T 세포들에 대한 T 세포 수용체 친화도(affinity)를 나타낸다. 세포들을 도 4a에 도시된 상이한 방법을 이용하여 16일로 배양한 후, 이들을 ELISPOT 분석에서 펩타이드의 증가하는 희석액으로 재자극하여 본 발명의 새로운 실시양태가 펩타이드에 대한 T 세포 수용체들의 결합도(avidity)에 해로운지를 결정한다. 사실, 새로운 방법은 각각의 EBV 펩타이드들에 대해 유사한 결합도 및 EBNA1의 경우에 유의적으로 증가된 결합도를 나타낸다.
도 4e 는 선행 기술 및 본 발명의 다양한 실시양태를 사용하여 증식된 세포들에 대한 다양한 T 세포 마커들의 분포를 나타낸다. 16일에 4개의 상이한 방법을 이용하여 제조된 T 세포들을 수확하고 유세포분석기(flow cytometer)를 사용하여 면역 표현형을 분석하였다. 이는 선행 기술 방법과 본 발명의 실시양태 사이에 변화되지 않은 세포 생성물들의 조성물을 나타낸다. CD62L의 발현의 면에서 선행 기술과 새로운 실시양태 사이에 차이가 있다. 이는 중심(central) 기억 T 세포들 및 원래의 것들에 표시되고, 이팩터 기억 T 세포들에 의해 하향조절되고, 따라서 이는 다시 본 발명의 실시양태에 대한 이점으로 보인다.
도 4f 는 선행 기술을 이용하는 세포들의 배양이 림프종 및 NPC 환자들로부터 EBV+ 암 세포들에 존재하는 잠복(latent) 2형 항원들에서보다 LCL 세포들에서 발현된 항원들에 대한 반응들을 왜곡한다는 것을 나타낸다. 선행 기술 및 본 발명의 실시양태를 이용하여 세포들을 생성시켰다. 이후, 이들을 ELISPOT 분석에서 다양한 EBV 펩타이드들로 재자극하였다. 이는 선행 기술 방법이 특이적 LCL 우세 에피토프들에 대한 반응을 왜곡하고, 새로운 방법이 암 관련 항원들, 예컨대 EBNA1에 대한 활성 증가를 나타낸다는 것을 보여준다.
도 5 시리즈에서의 도면들은 NPC 환자들로부터 EBV 특이적 세포들을 증식시키기 위해 선행 기술 및 본 발명의 다양한 실시양태를 사용하는 결과를 나타낸다.
도 5a는 선행 기술 방법 및 본 발명의 다양한 실시양태의 단계들 및 이들의 명명법의 도식적 표식이다. 이 다이아그램은 음영 박스에서의 선행 기술 및 제1 전극 및 제2 자극을 언급하는 데 사용된 명명법을 나타낸다. 처음에 APC로서 사용된 세포 유형, 이어서 항원이 전달되는 방식(Ad 벡터들 또는 펩타이드들 - Px)이 도시되어 있다. T-APC 및 aK562와 함께 펩타이드를 사용하는 실시양태의 경우, 이는 데이터에서 ATC로 축약된다.
도 5b는 선행 기술 및 본 발명의 다양한 실시양태를 사용하는 EBV 특이적 T 세포들의 증식을 나타낸다. 선행 기술 및 도 5a에 도시된 3개의 다른 방법을 사용하는 EBV 특이적 T 세포들의 증식 이후, 세포들을 9일, 16일 및 23일에 계수하고, 결과는 하기 수백만개의 세포들 또는 배수 증식을 나타낸다. 이는 각각 3명 및 4명의 NPC 공여자들을 대표한다. aK562를 DC들 또는 T-APC들과 조합하여 사용하는 방법 둘 다는 선행 기술보다 유의적으로 우수한 증식을 나타낸다.
도 5c 는 선행 기술 및 본 발명의 다양한 실시양태를 사용하여 EBV 특이적 T 세포들의 배양물에서 인터페론 감마 분비 세포들의 비교를 나타낸다. 배양 이후, 선행 기술 방법 및 다양한 실시양태를 사용하여 세포 집단들을 ELISPOT 분석에서 펩타이드들로 재자극한다. EBNA-1, LMP1 및 LMP2인 관심 있는 3개의 항원들로부터의 펩타이드들 사용하고, 선행 기술과 비교할 때 NPC 환자들에서의 반응은 증대되었다. 대표적인 일 예가 도시되어 있다.
도 5d 는 선행 기술 및 본 발명의 다양한 실시양태에 의해 증식된 EBV 특이적 T 세포들에 대한 T 세포 수용체 친화도를 나타낸다. 세포들을 도 5a에 도시된 상이한 방법을 이용하여 16일로 배양하였다. 이후, 이들을 ELISPOT 분석에서 펩타이드의 증가하는 희석액으로 재자극하여 본 발명의 새로운 실시양태가 펩타이드에 대한 T 세포 수용체들의 결합도에 해로운지를 결정한다. 사실, 새로운 방법은 각각의 EBV 펩타이드들에 대해 유사한 결합도 및 EBNA1의 경우에 유의적으로 증대된 결합도를 나타낸다.
도 5e는 선행 기술 및 본 발명의 다양한 실시양태를 사용하여 증식된 세포들에 대한 다양한 T 세포 마커들의 분포를 나타낸다. 31일에 도 5a에 기재된 4개의 상이한 방법을 이용하여 제조된 T 세포들을 수확하고 유세포분석기를 사용하여 면역 표현형을 분석하였다. 이는 선행 기술 방법과 본 발명의 실시양태 사이에 변화되지 않은 세포 생성물들의 조성물을 나타낸다. CD62L의 발현의 면에서 선행 기술과 새로운 실시양태 사이에 차이가 있다. 이는 나이브(naive) 기억 T 세포 및 중심 기억 T 세포들 상에 발현되고, 이팩터 기억 T 세포들에 의해 하향조절되고, 따라서 이는 다시 본 발명의 실시양태에 대한 이점으로 보인다.
도 5a에 도시된 방법에 여러 변화가 있다. 이는 하나 초과의 재자극 단계로 처리되는 NPC 환자 세포들로 인한다. 그러나, 각각의 자극의 명명법은 동일하게 있다. 이 데이터는 4명의 NPC 환자들을 대표한다.
도 5f 는 본 발명의 새로운 실시양태를 이용하여 증식된 NPC 환자들로부터의 T 세포들(CD3+/CD19-)이 선행 기술에 의해 증식된 T 세포들로서 4일 및 10일 동안의 동시배양에서 LCL(EBV+ 암 세포주, CD3-/CD19+)을 더 우수하게 사멸한다는 것을 나타낸다. T 세포들 및 LCL을 1:1 비율로 항온처리하였다.
도 6 시리즈에서의 도면들은 림프종 환자들로부터 EBV 특이적 세포들을 증식시키기 위해 선행 기술 및 본 발명의 다양한 실시양태를 사용하는 결과를 나타낸다.
도 6a 는 선행 기술 방법 및 본 발명의 다양한 실시양태의 단계들 및 이들의 명명법의 도식적 표식이다. 이 다이아그램은 음영 박스에서의 선행 기술 및 제1 전극 및 제2 자극을 언급하는 데 사용된 명명법을 나타낸다. 처음에 APC로서 사용된 세포 유형, 이어서 항원이 전달되는 방식(Ad 벡터들 또는 펩타이드들 - Px)이 도시되어 있다. T-APC 및 aK562와 함께 펩타이드를 사용하는 실시양태의 경우, 이는 데이터에서 이전에 ATC로 축약되지만, 또한 대안적으로 데이터의 이 섹션에서 KATpx 및 ATpk로 축약된다.
도 6b 는 선행 기술 및 본 발명의 다양한 실시양태를 사용하는 EBV 특이적 T 세포들의 증식을 나타낸다. 선행 기술 및 도 6a에 도시된 3개의 다른 방법을 사용하는 EBV 특이적 T 세포들의 증식 이후, 세포들을 9일 및 16일에 계수하고, 결과는 하기 수백만개의 세포들 또는 배수 증식을 나타낸다. 이는 4명의 림프종 환자들로부터의 세포들에 의한 결과를 대표한다.
도 6c 는 선행 기술 및 본 발명의 다양한 실시양태를 사용하여 EBV 특이적 T 세포들의 배양물에서 인터페론 감마 분비 세포들의 비교를 나타낸다. 배양 이후, 선행 기술 방법 및 다양한 실시양태를 사용하여 세포 집단들을 ELISPOT 분석에서 펩타이드들로 재자극한다. EBNA-1, LMP1 및 LMP2인 관심 있는 3개의 항원들로부터의 펩타이드들을 사용하고, 선행 기술과 비교할 때 림프종 환자들에서의 반응은 증대되었다. 대표적인 일 예가 도시되어 있다.
이 결과는 PBMC들 또는 DC들로 펄스화된 펩타이드가 제1 증식에 사용될 때, 항원 특이적 T 세포들의 수가 9일 후 선행 기술이 사용되는 배양에 비해 유의적으로 증가한다는 것을 나타낸다.
도 6d는 본 발명의 새로운 실시양태를 이용하여 증식된 림프종 환자들로부터의 T 세포들(CD3+/CD19-)이 선행 기술에 의해 증식된 T 세포들로서 2일 및 4일 동안의 동시배양에서 LCL(EBV+ 암 세포주, CD3-/CD19+)을 또한 동등하게 또는 더 우수하게 사멸한다는 것을 나타낸다. T 세포들 및 LCL을 1:1 비율로 항온처리하였다.
도 7 시리즈에서의 도면들은 건강한 공여자들로부터 VZV 특이적 세포들을 증식시키기 위해 선행 기술 및 본 발명의 다양한 실시양태를 사용하는 결과를 나타낸다. PBMC들을 IL-4 및 IL-7의 존재 하에 VZV 단백질들, gE, ORF10. IE61, IE62 및 IE63에 이르는 중첩 펩타이드 라이브러리들(11개의 아미노산들이 중첩되는 15합체)(펩믹스(pepmix)들)로 펄스화한다. 9일, 16일 및 23일에, 공동자극 분자들 CD80, CD83, CD86 및 4-1BB 리간드(K562-cs)를 발현하는 aK562 세포들의 존재 하에 이들을 동일한 펩믹스로 펄스화된 자가 활성화 T 세포들(AATC들, T-APC들)로 1:1:5의 CTL들 대 T-APC들 대 K562-cs의 비로 재자극하였다. 이의 증식률을 계수하여 측정하고, 항원 특이성을 감마 인터페론 ELISPOT 분석에서 측정하였다.
도 7a 는 선행 기술 방법 및 본 발명의 다양한 실시양태의 단계들 및 이들의 명명법의 도식적 표식이다.
도 7b 는 선행 기술 및 본 발명의 다양한 실시양태를 사용하는 EBV 특이적 T 세포들의 증식을 나타낸다. 상기 기재된 프로토콜을 이용하여 증식된 T 세포들의 성장률. 22일 동안 500배 초과의 증식이 관찰될 수 있다.
도 7c 는 선행 기술 및 본 발명의 다양한 실시양태를 사용하여 EBV 특이적 T 세포들의 배양물에서 인터페론 감마 분비 세포들의 비교를 나타낸다. 0일에 펩믹스 펄스화된 PBMC들 또는 DC들 및 9일, 16일 및 23일에 펩믹스 펄스화된 자가 활성화 T 세포들(T-APC들)과 함께 K-562-cs 세포들에 의한 활성화 후 VZV 펩타이드들에 의한 자극에 반응하여 감마 인터페론을 분비하는 6명 내지 9명의 건강한 VZV 혈청 양성 공여자들로부터의 T 세포들의 빈도. 각각의 기호는 1명의 공여자를 나타낸다. 제1 증식 동안 펩타이드 펄스화된 PBMC들 또는 DC들 및 후속 증식 동안 aK562들과 조합하여 T-APC들을 사용하는 본 발명의 실시양태는 사용된 다양한 VZV 항원들에 걸친 표적 CTL들의 유의적인 증식을 발생시킨다.
자가 T 세포들은 환자 유래의 세포들, 즉 공여자로부터의 세포들과 반대의 환자에 천연인 세포들이다. 바이러스 감염과 관련된 특정한 종양들은 바이러스 특이적 T 세포들의 존재에도 불구하고 환자에서 성장하는 방식을 발생하였다. 이는 T 세포들에 억제적인 분자들의 발현 및 바이러스 유전자 발현의 조절을 수반한다. 따라서, 이러한 환자들에서의 T 세포들은 아네르기 형태로서 기재될 수 있는 암 세포들에 대한 작용이 감소될 수 있다.
자가 T 세포 치료에서, T 세포들의 샘플을 생체외 활성화 및 증식을 위해 환자로부터 제거한다. 항원 특이적 T 세포 집단을 제조하면, 이것을 환자에게 주입하고, T 세포 세포들은 추가로 증식하고 직접 기전(세포독성) 및 간접 기전(면역 조절)에 의해 이의 표적 항원들을 제시하는 세포들을 제거한다.
"T 세포"는 당해 분야에서 흔히 사용되는 용어이고, 흉선세포들, 미성숙 T 림프구들, 성숙 T 림프구들, 휴지기 T 림프구들 또는 활성화 T 림프구들을 포함하도록 의도된다. T 세포는 T 보조(Th) 세포, 예를 들면 T 보조 1(Th1) 또는 T 보조 2(Th2) 세포일 수 있다. T 세포는 CD4+ T 세포, CD8+ T 세포, CD4+CD8+ T 세포, CD4-CD8- T 세포 또는 T 세포들의 임의의 다른 하위세트일 수 있다.
본 명세서에 사용되는 항원 특이적 T 세포는 예를 들면 특정한 항원에 반응하여 사이토카인들을 증식시키고/시키거나 생성함으로써 이를 인식하고 이에 반응하는 T 세포들을 의미하도록 의도된다.
하나 이상의 실시양태에서, 본 방법은 특이성을 자극하기 위한 재조합 표적 항원들을 사용하지 않는다. 본 명세서에서 재조합 항원들은 재조합 기술들에 의해 제조된 전체 항원들 또는 이들의 큰 단편들을 의마한다. 반대로, 사용된 펩타이드들 항원의 작은 단편들이고, 일반적으로 합성이다.
본 발명은 세포들의 생체외 제조 방법 및 이로부터 얻은 T 세포 생성물들에 관한 것이다. 일반적으로, 본 발명은 환자로부터 샘플을 얻는 단계를 포함하지 않는다.
환자로부터 샘플을 얻는 단계는 (처리될 수 있고 임의로 성분채집 생성물로서 제공될 수 있는) 혈액 샘플을 취하는 일상적인 기술이다. 이 과정은 환자에게 위험을 거의 나타내지 않고, 의사가 수행할 필요가 없지만, 적절히 훈련된 보조원이 수행할 수 있다. 일 실시양태에서, 환자 유래의 샘플은 대략 200㎖ 이하, 예를 들면 150㎖ 이하, 예컨대 100-150㎖ 범위에서의 혈액이다. 일반적으로 적어도 약 60㎖의 혈액이 필요하다.
통상적으로, T 세포 증식, DC 생성 및 T-APC 생성을 위한 PBMC들을 당해 분야의 당업자에게 공지된 피콜(Ficoll) 밀도 구배 분리에 의해 혈액 또는 성분채집 생성물로부터 얻는다.
피콜 밀도 구배 분리는 합성 수크로스 중합체를 이용하고, 이의 농도는 침강 동안 상이한 세포들의 분리를 이용하기 위해 용액에 걸쳐 변한다. 예를 들면 쥐이 헬쓰케어(GE Healthcare)로부터 예컨대 피콜 파크(Ficoll Paque)™ 플러스와 같은 적합한 시약들이 구입 가능하다.
일 실시양태에서, 혈액 샘플을 채취하거나 혈액 샘플을 수송하는 것을 담당하는 기관은 수송 전에 피콜 밀도 구배 분리에 의해 샘플을 처리한다.
일 실시양태에서, 혈액 샘플 또는 처리된 혈액 샘플을 주변 온도, 예를 들면 4℃ 초과 약 30℃ 이하에서 수송한다.
일 실시양태에서, 혈액 샘플 또는 처리된 혈액 샘플을 컨테이너, 예컨대 2개의 챔버를 포함하는 백으로 충전하고, 1개의 챔버는 첨가제들, 예컨대 보존제들 및/또는 항응고제들을 포함하고, 혈액 또는 처리된 혈액을 제2 챔버에 충전하고, 이후 제1 챔버와 제2 챔버 사이의 시일(seal)을 파괴하고, 2개의 챔버의 내용물을 혼합한다.
본 명세서에서 사용된 세포들을 배양하는 것은 실험실내 세포들을 활성화하고 증식시키고/시키거나 분화시키는 것을 의미하도록 의도된다.
적합한 T 세포 증식 배지에서 T 세포들의 증식이 일반적으로 수행되는 것으로 당업자에게 공지되어 있다. 일반적으로, 배지를 교체하지 않고 단계 a)의 공정을 수행할 수 있다. 일반적으로, 배지를 교체하지 않고 단계 b)의 공정을 수행할 수 있다. 그러나, 예를 들면 시스템에서의 포도당이 100㎎/㎗ 미만이 되는 경우 혈당측정기로 표시된 것처럼 배지를 바꿔야 한다. 따라서, 본 개시내용의 방법은 T 세포들을 증식시키는 데 필요한 조정량(amount of intervention)을 최소화한다는 점에서 효율적이다.
생존 가능한 CD3+ 세포들을 계수함으로써 T 세포 증식을 평가할 수 있다.
예를 들면, 트립판 블루(및 광학 현미경) 또는 7-아미노-악티노마이신 D에 의한 세포 염색, 670㎚에서 방출하는 생체 염료(또는 7AAD의 상업용 레디 투 유즈(ready-to-use) 용액인 비아프로브(ViaProve)) 및 당해 분야의 당업자에게 공지된 기술을 이용하는 유세포분석기에 의해 생존 가능한 세포들을 시험할 수 있다. 염색이 세포들에 침투하는 경우, 세포들은 생존 가능하지 않은 것으로 생각된다. 염료에 흡수되지 않은 세포들은 생존 가능한 것으로 생각된다. 예시적인 방법은 세포들 현탁액 대략 100㎕당 약 5㎕의 7AAD 및 약 5㎕의 아넥신-V(아폽토시스 동안 노출된 외부 인지질 포스파티딜세린에 결합하는 인지질 결합 단백질)를 사용할 수 있다. 이 혼합물을 광의 부재 하에 약 15분 동안 주변 온도에서 항온처리할 수 있다. 이후, 유세포분석기를 사용하여 분석을 수행할 수 있다. 예를 들면 문헌[MG Wing, AMP Montgomery, S. Songsivilai and JV Watson. An Improved Method for the Detection of Cell Surface Antigens in Samples of Low Viability using Flow Cytometry. J Immunol Methods 126: 21-27 1990]을 참조한다.
T 세포 증식 배지는 일반적으로 관련 증식 단계(즉, 단계 a) 또는 단계 b))에서 사용된 혈청, 배지 및 임의의 사이토카인들을 포함한다.
일 실시양태에서, 사용된 혈청은 예를 들면 15% 이하의 혈청, 예컨대 10%의 혈청이고, 특정 인간 혈청을 사용한다.
일 실시양태에서, 배지는 라이프 테크놀로지스(Life Technologies)로부터 구입 가능한 어드밴스드(Advanced) RPMI 또는 RPMI 1640이다.
일 실시양태에서, 사용된 사이토카인들은 하기 기재되어 있다.
일 실시양태에서, 세포 증식 배지는 10%의 인간 AB 혈청, 200mM의 L-글루타민, 45%의 얼 햄(Earle's Ham's) 아미노산들(EHAA 또는 클릭 배지(Click's medium)) 및 45%의 어드밴스드 RPMI 또는 RPMI-1640을 포함한다.
일 실시양태에서, 사용된 배지는 혈청의 사용을 필요로 하지 않는다.
본 명세서에서 사용된 세포 증식은 세포 분열의 결과로서 세포들의 집단에서 표적 세포들의 수를 증가시키는 것을 의미한다.
일 실시양태에서, 단계 a)에서 PBMC들을 펩타이드/펩타이드 혼합물로 직접 처리한다. 특히 하기 문헌으로부터의 메시지는 수지상 세포들이 최적 항원 제시 세포들이라는 것이므로, 자가 PBMC들이 자가 수지상 세포들이 존재할 때와 유사한 방식으로 펩타이드들의 존재 하에 T 세포들을 활성화한다는 것이 매우 놀랍다. Chen ML, Wang FH, Lee PK, Lin CM. Immunol Lett. 2001 Jan 1; 75(2):91-6.
다른 실시양태에서, 본 발명의 방법의 단계 a)에서 환자들 PBMC들로부터 제조된 수지상 세포들을 사용한다.
혈액 샘플은 일반적으로 세포들의 초기 물리적 선택, 예를 들면 성분채집 집단으로부터 세포들의 하위집단(또는 T 세포들)의 선택으로 처리되지 않는다.
일 실시양태에서, 1 내지 2×107개의 PBMC들을 30㎖의 배지 내에서 GRex40 중의 사이토카인들의 존재 하에 0.5 내지 1×106개의 펩타이드 펄스화된 DC들로 자극한다. 배양 9일 내지 14일 후 예를 들어, 50 내지 80×107개의 항원 특이적 반응 T 세포들(responder T cells) 범위와 같은 세포들을 수확한다. 그러나, 이것은 아네르기 T 세포들을 갖는 환자들에서 더 낮을 수 있다.
(혈당측정기에서) 100㎎/㎗ 미만인 포도당 하강으로 표시되는 경우에만 배지(45%의 어드밴스드 RPMI, 45%의 EHAA, 10%의 FC들 및 200mM의 L-글루타민)를 바꾼다.
수지상 세포들을 당해 분야의 당업자가가 대개 전문적 항원 제시 세포들이라 칭한다. 상기 용어는 수지상 세포들이 2개의 신호 활성화 과정을 T 세포들에 전달하는 데 최적이라는, 즉 세포 표면 상에 항원을 제시하는 것 이외에, 수지상 세포들이 또한 강한 공동자극 신호를 제공한다는 사실을 의미한다. 항원 제시에 의한 자극 및 공동자극인 신호 둘 다는 T 세포 활성화를 성취하는 데 필요하다.
펩타이드 혼합물(이의 상세내용은 하기 기재되어 있음)을 펄스화(또는 로딩)함으로써 환자들 PBMC들의 샘플로부터 본 발명의 방법에서 사용하기 위한 수지상 세포들을 생성할 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 펄스화 또는 로딩은 적절한 배지 중에 관련 세포들, 예컨대 PBMC들 또는 수지상 세포들을 펩타이드 혼합물에 노출시키는 것을 의미하도록 의도된다.
환자 샘플로부터 PBMC들을 취하고 이들을 플라스틱에 부착함으로써 본 발명의 방법에서 사용하기 위한 수지상 세포들을 제조할 수 있다. 일반적으로, 단핵구 집단은 달라붙고 모든 다른 세포들은 세척될 수 있다. 이후, 부착 집단을 IL-4 및 GM-CSF로 분화시켜 단핵구 유래 수지상 세포들을 제조한다. 이들 세포들을 (수지상 세포의 표면 상의 중요한 공동자극 분자들을 상향조절하는) IL-1β, IL-6, PGE-1 및 TNF-α의 첨가에 의해 성숙시키고, 이후 본 명세서에서 기재된 펩타이드 혼합물로 형질유도하여 필요한 수지상 세포들을 제공할 수 있다.
이러한 방식으로 DC의 생성 및 성숙에 대한 참조문헌은 문헌[Jonuleit H, Kuhn U, Muller G, et al. Pro-inflammatory cytokines and prostaglandins induce maturation of potent immunostimulatory dendritic cells under fetal calf serum-free conditions. Eur J Immunol. 1997;27:3135-3142]에서 확인한다.
펩타이드들은 1 내지 100ng의 펩타이드/15×106개의 PBMC들 또는 ATC들(하기 토의 참조) 또는 각각의 펩타이드 라이브러리/펩믹스에 대해 DC들 2×106개당 1 내지 100ng의 펩타이드로 첨가될 수 있다.
일 실시양태에서, PBMC들을 3일 내지 5일 동안 IL-4 및 GM-CSF로 자극한 후 GM-CSF, IL-4, TNF-a, IL-1b, PGE-1 또는 PGE-2 및 IL-6으로 1일 또는 2일 동안 성숙시킨 후, 상기 펩타이드들로 펄스화한다.
따라서, 일 실시양태에서, 단계 a)에서의 수지상 세포들은 자가이다.
일 실시양태에서, CD4 및 CD8 반응인 생성된 수지상 세포 반응은 균형을 이룬다.
본 명세서에서 사용되는 균형을 이룬 CD4 및 CD8 반응은 CD4 세포들 또는 CD8이 증식 과정에서 고갈되지 않는다는 사실을 의미하도록 의도된다. 그러나, 본 명세서에서 사용되는 균형을 이룬 집단은 CD8 세포들보다 더 많은 CD4 세포들이 존재하거나 그 반대일 수도 있다는 점에서 여전히 왜곡될 수 있다.
일 실시양태에서, 단계 a)에서의 PBMC들 대 수지상 세포들의 비는 각각 10:1 내지 50:1, 예를 들면 15:1, 16:1, 17:1, 18:1, 19:1, 20:1, 21:1, 22:1, 23:1, 24:1, 25:1, 예컨대 약 20:1 범위이다.
수지상 세포들은 T 세포들의 강력한 활성화를 제공하고, 예를 들면 단계 a)에서 배양물에서의 항원 특이적 T 세포들의 빈도가 낮을 때(100개 중 1개 미만의 T 세포들이 관심 있는 항원들에 특이적일 수 있음) 수지상 세포들을 사용하는 것이 효과적이다. 그러나, 항원 특이적 T 세포들의 수 및 빈도가 확대되고, 특이적 T 세포들 대 수지상 세포들의 비가 증가하면서, 수지상 세포들의 수가 증가할 수 있지 않은 한, 수지상 세포들의 활성화의 효율은 감소한다. 항원 특이적 T 세포들은 활성화 이후 수지상 세포에 대해 세포독성 반응을 자주 전달할 것이다. 이후, 수지상 세포들의 사멸은 표적 항원 특이적 T 세포들을 계속해서 활성화시키고 증식시키도록 이용 가능한 활성화 신호를 감소시킨다.
T 세포들을 자극하여 표적 항원에 특이적인 집단들로 증식시키는 데 수지상 세포들이 매우 효과적이지만, 많은 분량의 수지상 세포들을 생성하기 어렵다. 따라서, 단계 b)가 실제적으로 수지상 세포들을 사용할 수 있고, 단계 b)에서 상이한 항원 제시 세포들 및 인공 공동자극 인자를 사용하는 것에 이점이 존재한다. 몇몇 경우에, T 세포들에 대한 수지상 세포들의 수가 너무 적을 때, T 세포들의 활성화가 관찰되지 않는다. 이는 하기 더 자세히 기재되어 있다.
유리하게는, 수지상 세포들은 기억 T 세포들 및 나이브 T 세포들 둘 다를 활성화할 수 있는 것으로 생각된다. 본 발명에 따른 세포 집단들 중의 기억 T 세포들의 존재는 중요할 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 소수 집단이 소수 집단에서의 세포들의 절대 수가 전체 집단의 30% 이하와 같이 원하는 집단에서의 세포들의 수보다 유의적으로 적다는 사실을 의미하도록 의도된다.
하기 기재된 펩타이드 혼합물은 수지상 세포들의 펄스화, 항원 제시 세포들의 펄스화로부터 선택되는 하나 이상의 목적에 사용될 수 있거나, 단계 a)에서 PBMC들과 직접 사용될 수 있다.
펩타이드 혼합물들은 관련 바이러스 항원, 예를 들면 EBV 바이러스 항원 유래이다. 흔히 EBV라 칭하는 엡스타인-바 바이러스는 헤르페스 바이러스 과(family)의 구성원이고, 세계 인구에서 95% 넘게 만성적으로 감염시킨다.
일 실시양태에서, 펩타이드들은 유두종(papilloma) 바이러스의 항원 유래이다.
일 실시양태에서, 펩타이드들은 C형 간염(hepatitis C) 바이러스의 항원 유래이다.
일 실시양태에서, 펩타이드들은 백시니아 바이러스(VV, vaccinia virus)의 항원 유래이다.
일 실시양태에서, 펩타이드들 바리셀라 조스터 바이러스(VZV, varicella zoster virus)의 항원 유래이다.
일 실시양태에서, 펩타이드들은 인간 면역결핍 바이러스(human immunodeficiency virus)의 항원 유래이다.
일 실시양태에서, 펩타이드들은 B형 간염(Hepatitis B), HHV-8, CMV, HTLV-1, SV40 및/또는 메르켈(merckel) 세포 바이러스의 항원 유래이다.
일 실시양태에서, 펩타이드들은 바이러스들, 예를 들면 본 명세서에서 기재된 임의의 2 이상, 예컨대 EBV 및 VZV, EBV 및 VV, VZV 및 VV 또는 EBV, VZV 및 VV의 오염으로부터 생긴다.
관련 바이러스, 예컨대 EBV로 감염된 세포들의 존재 하에 또는 바이러스 단백질들을 코딩하는 아데노바이러스 벡터들의 존재 하에 자가 T 세포들을 배양하는 것 이외에, 세포들을 펩타이드 또는 펩타이드들의 혼합물로 펄스화된 항원 제시 세포들의 존재 하에 배양한다. 환자로 주입될 T 세포 생성물을 무균시키는 방법이 없으므로, 이는 중요한 병원균들에 의한 최종 생성물의 오염의 위험을 감소시킨다.
일 실시양태에서, 혼합물 내의 펩타이드 혼합물 또는 펩타이드들 중 몇몇은 항원 LMP1(잠재성(latent) 막 단백질 1 유니프로트 P03230호)의 서열 중 일부 또는 전부를 포함한다.
일 실시양태에서, 혼합물 내의 펩타이드 혼합물 또는 펩타이드들 중 몇몇은 항원 LMP2(잠재성 막 단백질 2 유니프로트 Q1HVJ2호)의 서열 중 일부 또는 전부를 포함한다.
일 실시양태에서, 혼합물 내의 펩타이드 혼합물 또는 펩타이드들 중 몇몇은 특정한 EBNA 1에서 항원 EBNA 1, 2, 3, 4, 5 또는 6의 서열 중 일부 또는 전부 또는 이들의 조합을 포함한다.
엡스타인-바 핵 항원 1(EBNA1)은 엡스타인-바 바이러스과 관련된 다작용성 이합체 바이러스 단백질이다. 이는 모든 EBV 관련 악성종양에서 발견되고 따라서 표적에 대한 중요한 항원인 EBV의 유일한 바이러스 단백질이다. EBV로 감염될 때 세포들이 취하는 변경 상태를 확립하고 유지시키는 데 있어서 이것은 중요하다. EBNA1은 단백질을 아미노 말단 및 카복시 말단 도메인들로 분리시키는 글리신-알라닌 반복 서열을 보유한다. 이 서열은 또한 단백질을 안정화시켜, 프로테아좀 분해를 방지하고, 항원 처리 및 MHC I형 제한 항원 제시를 손상시키는 것으로 보인다. 이는 이로써 바이러스 감염된 세포들에 대한 CD8 제한 세포독성 T 세포 반응을 억제한다. EBNA1 전사체(transcript) 구역은 제1 잠복 단계(latency phases Ⅰ) 및 제 2 잠복 단계 (latency phases II) 동안 Qp 프로모터에서 생긴다. 이는 제1 잠복 단계 동안 발현되는 유일한 바이러스 단백질이다. EBNA1 펩믹스는 HLA II형 제한 세포독성 CD4 T 세포들을 활성화한다.
일 실시양태에서, 혼합물 내의 펩타이드 혼합물 또는 펩타이드들 중 몇몇은 항원 BARF 1(BamHI A 우측 리딩 프레임 1, 유니프로트 Q777A5호)의 서열 중 일부 또는 전부 또는 이들의 조합을 포함한다.
BARF1은 EBV 게놈의 BamHI-A 단편에 위치한 BARF 1 유전자에 의해 코딩된 221개의 아미노산 단백질이다. BARF1은 다양한 EBV 관련 상피모양 악성종양, 예를 들면 NK/T 림프종들 및 버킷 림프종에서 발현된다.
다른 가능한 EBV 항원들은 LP 및 BHRF1을 포함한다.
백시니아 바이러스에 대한 주요 비리온/엔벨로프(virion/envelope) 단백질들은 문헌[PNAS January 7, 203 vol 100 no. 1 page 217-222 (Drexler et al)]에 기재되어 있다. 이들은 A10L(주요 코어 단백질 p4a), H3L(헤파린 결합 단백질), C7L(숙주 범위 단백질 2), D8L(세포 표면 결합 단백질), B22R(미지의 기능) 및 G5R(미지의 기능)을 포함한다.
바리셀라 조스터 바이러스 면역원들은 gE, ORF10, IE61, IE62 및 IE63을 포함한다.
상기 기재된 특이적 표적 항원들의 각각으로부터의 펩타이드들은 독립적으로 본 발명의 단계 a) 및/또는 단계 b)에서 사용될 수 있다.
일반적으로, 단계 a) 및 단계 b)에서 T 활성화를 위해 1차 신호를 제공할 목적으로 사용되거나 발현되는 에피토프들/항원들/펩타이드들의 일부 또는 전부는 단계들 둘 다에 공통적이다.
펩타이드들은 표적 항원의 일부 또는 전부를 포함할 수 있고, 예를 들면 면역학적 관련 방식으로 에피토프의 아미노산들을 제시하는 기회를 증가시키기 위해 중첩될 수 있다. 대안적으로 또는 추가로, 공지된 에피토프들의 펩타이드들은 포함될 수 있고, 필요한 경우 과표현되고, 즉 더 상당한 백분율의 펩타이드들이 제시될 수 있다.
HIV에서의 항원들은 gag, pol, env, nef, gp180, gp120 등을 포함한다.
본 명세서에서 사용되는 "항원의 서열 중 일부 또는 전부를 포함한다"는 펩타이드와 전체 길이 항원의 관련 부분 사이에 동일성 또는 유의적인 유사성이 존재한다는, 예를 들면 펩타이드가 항원의 인접 구역에 실질적으로 동일하다는 사실을 의미하도록 의도된다.
본 명세서에서 본 발명의 에피토프들을 선택하는 것은 에피토프의 선형 서열이 공지되어 있고 펩타이드 혼합물(즉, 공지된 에피토프들을 코딩하는 펩타이드들이 선택됨)들로 포함되거나, 예를 들면 항원 서열이 에피토프 맵핑되지 않는 경우 펩타이드들이 하나 이상의 적절한 에피토프들을 제시할 기회를 최대화하는 중첩 방식으로 서열 중 일부 또는 전부를 포함하도록 설계된다는 사실을 의미하도록 의도된다. 물론, 이 2 단계의 혼합물이 원하는 경우 사용될 수 있고, 예를 들면 공지된 에피토프들이 펩타이드 혼합물 중에 더 높은 정도로 표현될 수 있다.
일 실시양태에서, 혼합물 내의 펩타이드들은 1개 이상, 예를 들면 1개, 2개, 3개, 4개 이상의 관련 바이러스 항원들 유래이다.
일 실시양태에서, 펩타이드 혼합물은 적어도 LMP1 및 LMP2로부터의 서열들을 포함하거나 이들로 이루어진다.
또한 일 실시양태에서, EBNA1 및/또는 BARF1을 항원 혼합물에 첨가하여 바이러스 항원들의 하향조절 또는 돌연변이에 의한 면역 도피의 기회를 감소시킨다.
본 명세서에 사용되는 펩타이드는 펩타이드 결합들에 의해 연결된 아미노산들의 짧은 중합체들을 의미하도록 의도되고, 펩타이드들은 적어도 2개, 그러나 일반적으로는 50개 이하의 아미노산들을 포함한다.
사용되는 펩타이드들은 하나 이상의 선형 에피토프들을 제시하기에 충분히 길고, 예를 들면 평균 7개, 8개, 9개, 10개, 11개, 12개, 13개, 14개, 15개, 16개, 17개, 18개, 19개 또는 20개 길이의 아미노산들이다.
일 실시양태에서, 혼합물의 펩타이드들 중 몇몇은 (단일 항원의 서열과 관련하여) 중첩되고, 즉 이들은 단일 항원 유래이고, 모 서열로부터의 아미노산들의 단편들 및 특정한 서열의 일부들이 혼합물의 하나 초과의 펩타이드 단편에서 존재하도록 배열된다. 펩타이드들의 중첩은 아미노산 서열에서 가외성(redundancy)이 존재한다는 것을 의미한다. 그러나, 이 방법은 특히 모 항원에 에피토프 맵핑 정보가 이용 가능하지 않을 때 적절한 방식으로 모 항원으로부터 본 발명의 에피토프들에 대한 기회를 최대화한다.
일 실시양태에서, 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 11개, 12개, 13개, 14개 또는 15개의 아미노산들이 각각의 펩타이드에서 중첩된다.
일 실시양태에서, 각각의 단백질에 대한 라이브러리들 내의 펩타이드들은 15개 길이의 아미노산들이고, 11개의 아미노산들이 중첩하여 모든 가능한 HLA I형 에피토프들은 단백질로부터 제시될 수 있다. 펩타이드들은 더 길 수 있고, 예를 들면 20개의 아미노산들은 15개로 중첩되거나, 30개의 아미노산들은 25개로 중첩된다.
적합한 펩타이드들 서열들의 예는 본 명세서와 함께 제출된 서열 목록에 포함된다.
일 실시양태에서, 펩타이드 혼합물은 2개 내지 1000개의 펩타이드들, 더 구체적으로 2개 내지 500개, 예를 들면 2개 내지 400개, 2개 내지 300개, 2개 내지 200개 또는 2개 내지 100개, 예컨대 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 11개, 12개, 13개, 14개, 15개, 16개, 17개, 18개, 19개, 20개, 21개, 22개, 23개, 24개, 25개, 26개, 27개, 28개, 29개, 30개, 31개, 32개, 33개, 34개, 35개, 36개, 37개, 38개, 39개, 40개, 41개, 42개, 43개, 44개, 45개, 46개, 47개, 48개, 49개, 50개, 51개, 52개, 53개, 54개, 55개, 56개, 57개, 58개, 59개, 60개, 61개, 62개, 63개, 64개, 65개, 66개, 67개, 68개, 69개, 70개, 71개, 72개, 73개, 74개, 75개, 76개, 77개, 78개, 79개, 80개, 81개, 82개, 83개, 84개, 85개, 86개, 87개, 88개, 89개, 90개, 91개, 92개, 93개, 94개, 95개, 96개, 97개, 98개, 99개, 100개, 101개, 102개, 103개, 104개, 105개, 106개, 107개, 108개, 109개, 110개, 111개, 112개, 113개, 114개, 115개, 116개, 117개, 118개, 119개, 120개, 121개, 122개, 123개, 124개, 125개, 126개, 127개, 128개, 129개, 130개, 131개, 132개, 133개, 134개, 135개, 136개, 137개, 138개, 139개, 140개, 141개, 142개, 143개, 144개, 145개, 146개, 147개, 148개, 149개, 150개, 151개, 152개, 153개, 154개, 155개, 156개, 157개, 158개, 159개, 160개, 161개, 162개, 163개, 164개, 165개, 166개, 167개, 168개, 169개, 170개, 171개, 172개, 173개, 174개, 175개, 176개, 177개, 178개, 179개, 180개, 181개, 182개, 183개, 184개, 185개, 186개, 187개, 188개, 189개, 190개, 191개, 192개, 193개, 194개, 195개, 196개, 197개, 198개, 199개, 200개 이상의 펩타이드들을 포함하거나, 이들로 이루어진다.
상기 방법의 단계 a)의 펩타이드들 또는 단계 a) 또는 b)에서 항원 특이적 수지상 세포들를 생성하도록 이용되거나 단계 b)의 항원 제시 세포들을 제조하기 위해 이용되는 펩타이드들은 상기 기준에 기초하여 독립적으로 선택된다. 그러나, 사용되는 펩타이드들 또는 사용되는 재료(예컨대 수지상 세포들 및/또는 항원 제시 세포들)의 일부 또는 전부가 동일한 에피토프들의 전부 또는 일부와 펄스화되는 방법이 더 효과적이다. 이러한 상황에서, 단계 b)는 단계 a)에서 생성된 반응들을 강화하고 증대시킨다.
상기 방법의 단계 b)에서 몇몇 실시양태에서 사용되는 항원 제시 T 세포들(T-APC)을 생성하기 위해 상기 기재된 펩타이드 혼합물들을 또한 사용할 수 있다. 항원 제시 T 세포들을 제조하기 위해, 이들은 하기 기재된 바대로 PBMC들을 형성하도록 생성되고 관련 펩타이드 혼합물과 펄스화되고, 예를 들면 펩타이드들은 각각의 펩타이드 라이브러리에 대해 1 내지 100ng의 펩타이드/15×106개의 T-APC들로 첨가된다.
본 명세서에 사용되는 각각의 라이브러리는 각각의 항원에 제조된 펩타이드들를 의미할 수 있다.
일 실시양태에서, 항원 제시 세포들은 자가이다.
활성화 T 세포들은 HLA I형을 발현하고 II형 항원들 및 CD80 및 CD86을 (일시적으로) 상향조절한다.
일 실시양태에서, 특이적 T-APC들을 제공하도록 펩타이드들을 펄스화한 후, 이 T-APC들을 조사하여 이들이 단계 b)에서 사용될 때 더 이상 증식되지 않도록 보장한다.
감마 방사선 공급원 또는 X선 공급원을 이용하여 조사(irradiation)를 수행할 수 있다.
일 실시양태에서, 9일 내지 14일에, 단계 a)로부터의 약 5×107개의 반응 T 세포들을 14일 이하 동안 IL-15를 포함하는 400㎖의 배지 내에 GRex 500 중의 5×107개의 조사된 T-APC들 및 5×107개의 aK562들로 자극한다.
US 제2003/0147869호는 이 특허에 기재된 aK562 세포들이 항원 제시 세포들이 되도록 조작될(engineered) 수 있다는 것을 개시한다. 이론상 이 세포들은 유의적인 수로 발현된다. 이들을 단계 b)의 T-APC들에 대한 대안으로서 사용할 수 있다고 생각할 것이다. 그러나, 이들 aK562 항원 제시 세포들은 HLA를 발현하지 않고, 이들이 발현한다면, HLA 표현형은 이팩터 T 세포 제한 패턴과 일치하지 않고, 이들은 동종항원(alloantigen) 특이적 T 세포들을 활성화한다. 본 발명자들은 HLA 발현 세포들의 부재 하에 관련 표적 T 세포 집단의 활성화가 부족하다는 것을 발견하였다. 이론상 이들 aK562 세포들이 HLA를 발현하도록 조작될 수 있지만, 이것은 각각의 경우에 환자에 일치될 필요가 없어서 상기 방법이 불필요하게 복잡하고 비싸게 만든다.
7,196개의 HLA 대립유전자들(alleles)이 존재한다. 이들은 각각의 개체에 대해 (2개의 염색체에서) 6개의 HLA I형 및 6개의 HLA II형 대립유전자들로 분할될 수 있다. 이들은 임의 방식으로 혼합되고 일치될 수 있고 따라서 (1) 모든 가능한 T 세포들을 재활성화하고 (b) 동종 반응성을 유도하지 않도록 HLA 대립유전자들의 적절한 조합을 aK562 세포들로 도입하는 것은 이때에 가능하지 않다.
본 발명에 따른 T-APC들은 표적 항원으로부터의 평균적으로 적어도 하나의 에피토프를 제시하고, 예를 들면 2개, 3개, 4개, 5개, 6개 이상의 에피토프들을 제시할 수 있다.
일 실시양태에서, T-APC들은 하나 초과의 표적 항원, 예를 들면 2개, 3개, 4개 이상의 표적 항원들로부터 에피토프들을 제시한다.
일 실시양태에서, 단계 a)로부터 얻은 세포들(또는 CTL들) 대 T-APC들의 비율은 4:1 내지 1:2 범위, 예를 들면 1:1이다. 높은 비율의 T-APC들은 증식 효율을 최대화한다. 일반적으로, 이러한 높은 비율의 수지상 세포들을 생성하는 것이 어렵고, 이는 관련 T 세포 집단의 증식에 걸리는 시간이 항원 제시 세포들에 의한 증식에 걸리는 시간보다 수지상 세포들에 의해 더 길 수 있다는 것을 의미한다. 수지상 세포들의 수가 매우 낮은 몇몇 경우에, 증식은 결코 일어나지 않을 수 있다. 따라서, 단계 b)에서 항원 제시 세포들을 사용하는 방법은 증식에 걸리는 기간이 더 짧고 따라서 더 효과적인 방법을 제공한다는 점에서 유리할 수 있다.
따라서, 일 실시양태에서 T-APC들은 본 방법의 단계 b)에서 사용된다.
본 방법에서 T-APC들의 사용은 선행 기술 방법에서의 LCL들의 사용을 대체한다. LCL 세포주들은 생 EBV 바이러스에 의한 감염에 의해 불멸화된다. 본 방법에서 LCL들의 사용을 피하는 것은 대단한 이점이다.
아데노바이러스 벡터들에 의한 감염을 통해 다른 바이러스 항원들을 제시하도록 조작되거나 펩타이드들로 펄스화된 LCL들은 효과적인 제2 자극을 제공할 수 있지만, 약한 항원들의 경우, 벡터들 및 LCL로부터의 아데노바이러스 및 EBV 단백질들 둘 다는 각각 강한 경쟁을 제공하여, 최종 CTL 생성물의 주요 성분은 대개 LCL들에서 발현되지만 2형 잠복 종양들(림프종 및 NPC)에서 발현되지 않는 아데노바이러스 또는 우세한 EBV 항원들에 특이적이다.
본 발명자들의 경험이 단계 a)로부터 생긴 CTL들에 펩타이드 혼합물들을 제시하는 것이 단순히 세포들을 "혼란"시키고 이들이 이들의 표면 위에 펩타이드들을 제시하도록 하므로, 단계 b)에서의 단순한 펩타이드들의 사용은 생존 가능해 보이지 않는다. 이후, 이는 서로에 표적화되는 CTL들을 생성시키고 이들은 이들 자체를 파괴하기 시작한다. 이는 세포들을 고갈시키고, 이는 명확히 바람직하지 않고 상기 방법을 수행하는 목적과 반대이다.
일 실시양태에서, 충분한 수의 관련 항원 특이적 T 세포 집단이 얻어질 때까지 1회 초과, 예를 들면 2회, 3회, 4회, 5회 이상 단계 b)를 수행한다.
충분한 수는 예를 들면 생체 내 계속해서 증식하고 표적 바이러스 감염 및/또는 표적 관련 암에 대한 환자의 면역 반응을 자극하기에 충분한 세포들일 수 있고, 예컨대 1 내지 90×103개, 1 내지 90×104개, 1 내지 90×105개, 1 내지 90×106개, 1 내지 90×107개, 1 내지 90×108개 이상의 세포들, 예컨대 80×107개의 세포들이다.
일 실시양태에서, 세포들이 단계 b) 후 충분히 증식되지 않는 경우 이들이 하기에 의한 추가의 자극을 수용할 수 있는 방법이 제공된다:
(1) 펩타이드 펄스화, 조사된 자가 활성화 T 세포들 및 조사된 공동자극 aK562 세포들,
(2) 혈액 뱅크 승인된 동종(이계)(allogenic) 공여자들로부터의 조사된 PBMC들, 및/또는
(3) 항-CD3개의 하위유사분열(submitogenic) 용량; 1㎖당 1 내지 100ng, 예를 들면 1㎖당 50ng.
T-APC들은 전문적인 항원 제시 세포들이 아니다. 따라서, T-APC들에 의해 제공된 항원 제시 이외에, T 세포 증식 및 분화를 자극하기 위해 공동자극 인자가 필요하다.
본 명세서에서 사용되는 인공 공동자극 인자는 T-APC 항원 제시 신호 보완을 위한 T 세포 활성화 신호를 제공하기 위해 배양물에 첨가되는 외인성 인자이고, 예를 들면 공동자극 인자 및 T-APC 항원 제시 신호는 함께 특이적 방식으로 증식하는 자가 T 세포들을 자극하거나 촉진하고, 즉 표적 항원에 특이적으로 증식하면서 세포들의 표적 집단을 자극하고, 특이성 양태는 T-APC에 의해 생긴다. 외인성 인자는 첨가 없이 PBMC들의 배양물에 존재하지 않는 것이거나, 세포 배양물 중에 존재하는 자연적으로 발생하는 양이 적고 인자의 외인성 양의 첨가에 의해 증대되는 것이다.
CD80/86을 보유하는 비드는 공동인자로서 사용될 수 있다. 항-CD28(CD80/86 리간드) 및 항-4-1BB를 갖는 비드가 이용 가능하지만, 이들은 또한 증식의 원하는 항원 매개 특이성을 제거하는 항-CD3을 포함한다. 따라서, 항-CD28(CD80/86 리간드) 및 항-4-1BB를 갖는 비드는 항-CD3개의 부재 하에 본 개시내용의 양태를 형성한다.
일 실시양태에서, 인공 공동자극 인자는 HLA 음성 세포주와 같이 이의 표면 위의 또는 이의 표면과 회합된(세포의 표면 위의 특정한 항체들의 회합(association)에 대해 US 제2003/0147869호를 참조한다) 특정한 단백질(들)을 발현하도록 조작되고, US 제7,745,140호에 개시된 aK562 세포주와 같이 공동자극 분자들을 발현하도록 유전 조작된 세포 또는 세포주이다. 세포주, 예컨대 후자는 장기간 공동자극 신호를 제공하기 위해 본 발명에서 사용될 수 있다.
따라서, 일 실시양태에서, 세포주, 예컨대 aK562는 HLA를 발현하지 않는다.
따라서, 일 실시양태에서, 세포주, 예컨대 aK562는 항원을 발현하지 않는다.
본 명세서에서 사용되는 aK562 세포는 US 제7,745,140호에 기재된 원래의 세포주를 의미할 수 있다. 그러나, 본 발명의 목적을 위해 일반적으로 항-CD3 항체는 일반적으로 표면 위의 Fcγ 수용체에 로딩되지 않는다. 바람직하게는 본 명세서에서 언급되는 aK562 세포는, 특히 항-CD28 항체, 항-CD80 항체, 항-CD86 항체 및 4-1BBL을 포함하는 군으로부터 독립적으로 선택되는, 표면 위에 적어도 1개, 예컨대 1개, 2개, 3개 또는 4개의 공동자극 인자들을 포함하는 원래의 aK562 세포주의 이의 유도체이다.
하나 이상의 공동인자들은 T 세포들의 아폽토시스를 감소시키고 예를 들면 약 7 내지 10의 세포 분할의 증식 사이클을 유도하는 데 있어서 역할을 가질 수 있다.
세포는 T 세포들의 자극(활성화 또는 분화) 또는 생존에서 중요한 신호들을 제공하고 항원 제시 세포들의 표면 위의 항원들의 제시에 의해 생성된 신호를 보완하는 이의 표면 위에 공동자극 인자들을 발현하도록 조작된다. 세포주 표면 위에 발현될 수 있는 분자들의 예는 CD80, CD86, CD83, 4-1BB 리간드 및 이들의 조합, 예를 들면 이들 중 1개, 2개, 3개 또는 4개를 포함하는 군으로부터 선택된다. 4개의 구성요소는 함께 강력한 공동자극 신호를 제공한다.
일 실시양태에서, aK562 세포는 이의 표면에서 OX-40 리간드를 추가로 발현한다.
이 세포들은 상기 기재된 T-APC들과 함께 작용하여 T 세포 활성화에 필요한 신호들 모두를 제공한다.
CD80 및 CD86은 인간들에서 말초 T 세포들의 약 80%로 존재하는 표면 당단백질인 CD28에 결합한다. T 세포 수용체의 활성화와 함께, 이 결합은 T 세포들의 강력한 자극을 제공한다. T 세포 수용체 진입과 함께 (T 세포 상에서) 더 많은 CD28이 이의 리간드에 결합한다는 것은 IL-2개의 생성을 유도한다.
일 실시양태에서, 단계 b)에서의 배양은 내인성 IL-2만을 포함한다.
대안적으로, 인공 공동자극 인자는 예를 들면 CD28을 표적화하는 항체들과 같은 관련 수용체에 대한 아고니스트(agonistic) 항체일 수 있다. 이들 항체들은 배지로 직접 제공되거나, 비드에 부착되거나, 세포주(예컨대, aK562)의 표면에 부착될 수 있다. 이는 US 제2003/0147869호(참조문헌으로 본 명세서에서 포함됨)에 자세히 기재되어 있다.
비드 위에 공동인자들을 제공하는 것은 가장 효과적인 항원 특이적 증식이 가능하게 하지 않는다. 따라서, 일 실시양태에서, 공동인자들은 aK562 세포와 같은 세포 위에 발현되거나 이것과 관련된다.
본 발명의 단계 b)에서 사용된 이 인공 공동자극 세포(예컨대, aK562 세포)는 새롭고 놀라운 기전으로 작용하는 것으로 보인다.
본 개시내용의 방법은 항원 제시가 1개의 세포에 제공될 수 있고, 공동자극이 T 세포들을 자극하고 활성화하는 상이한 세포에 의해 제공될 수 있는 제1 시간에 대한 증거이다. 항원 특이적 T 세포들을 생성하는 맥락에서, 이는 매우 놀라운데, 왜냐하면 실제로 과거에 일반적으로 aK562 세포들이 HLA 분자들 또는 T 세포 수용체를 표적화하는 항체를 발현하고 생체 내 시스템들(여기서, T 세포 수용체는 신호를 매개하고 공동자극 신호는 1개의 세포에 의해 제공됨)을 모델링하도록 조작되기 때문이다(즉, 2개의 세포들 사이에 접촉이 있고, 예를 들면 TCR 진입과 함께 T 세포들 위의 CD28 결합은 연속 증식을 촉발하는 IL-2개의 생성을 유도한다; June et al 1994, Jenkins et al 1993 and Schwartz 1992). 따라서, MHC 1형 A2 및 A3을 발현하는 특정한 aK562 세포주들이 확립되었다(Britten, C.M.; Meyer, R.G.; Kreer, T.; Drexler, I.; Wolfel, T.; Herr, W. (2002), "The use of HLA-A*0201-transfected aK562 as standard antigen-presenting cells for CD8(+) T lymphocytes in IFN-gamma ELISPOT assays", Journal of Immunological Methods 259 (1-2): 95-110, and Clark, R.E.; Dodi, I.A.; Hill, S.C.; Lill, J.R.; Aubert, G.; Macintyre, A.R.; Rojas, J.; Bourdon, A. et al. (2001), "Direct evidence that leukemic cells present HLA-associated immunogenic peptides derived from the BCR-ABL b3a2 fusion protein", Blood 98 (10): 2887-93). 따라서, 특정한 실시양태에서, aK562 세포와 같은 공동자극 세포는 T-APC들과 함께 표적 T 세포 집단의 항원 특이적 증식을 자극하는 자율적 공동자극 인자(제3자 공동자극 인자)에 효과적이다. 이론상 Fc 수용체를 발현하고, 독립적 활성화 신호를 제공하기 위해 항원을 제공하여 항-CD3 항체(예컨대, OKT3 항체)로 로딩될 수 있는 aK562 세포는 적어도 하나의 실시양태에서 본 방법에서 사용될 수 있지만, 일반적으로 비특이적 신호가 바람직하지 않으므로 aK562(또는 조작된 세포)는 항-CD3 항체로 로딩되지 않는다.
본 개시내용은 또한 T 세포들(예컨대 자가 T 세포들)의 증식에서 항원 제시에 독립적인 인공 공동자극 신호를 제공하기 위한 aK562 세포와 같은 조작된 세포들주의 용도로 확장된다.
따라서, 일 실시양태에서, 상기 방법은 단계 b)에서 세포들의 집단을 증식시키는 방법이 (1) T-APC들, (2) 후자에 펄스화/로딩하는 펩타이드들 및 (3) 항원 특이적 제시 특징(quaility) 없이 공동자극 분자들만을 발현하도록 형질유도된 aK562 세포들에 의존한다는 맥락에서 놀랍다는 것을 추가로 특징으로 한다. 기재된 상기 방법은 aK562 세포들이 특이적 항원들을 제시하도록 조작되지 않는다는 사실에도 불구하고 (증식 과정 동안 항원 특이적 T 세포들의 백분율 증가로 측정된) 항원 특이적 기준으로 증식을 성취한다. 이 단계에서의 다른 APC들(예를 들면, DC들)의 첨가 없이, 증식 과정은 따라서 표적 항원의 제시와 관련하여 제1 신호 활성화를 성취하기 위해 T-APC들에 의존한다. 항원 제시 및 공동자극 둘 다와 관련하여 T-APC들이 차선인 것으로 생각되므로 이는 일반적이지 않다. 공동자극을 제공하고 증식을 증대시키는 aK562 세포들의 역할이 이전에 기재되어 있지만, aK562 세포가 특이적 항원들을 제시하도록 조작되지 않으므로 이전의 설명은 항원 특이성 감소를 희생하면서 일반적인 CD3+ T 세포 증식을 나타낸다. 본 발명에서, 항원 특이성은 증식으로 함께 증가하여, 이는 aK562 세포로부터의 제2 신호 공동자극과 상승적으로 작용하는 T-APC에 의한 제1 신호 항원 인식 단계가 성취된다는 것을 나타낸다. 항원 제시 및 공동자극 신호들의 이러한 분기(bifurcation)는 항원 특이적 T 세포 증식에 대한 현재 수용되는 패러다임에 저촉되고, 제1 신호 및 제2 신호는 동일한 APC로부터 전달된다.
일 실시양태에서, 본 발명은 제1 세포(또는 세포들의 집단) 및 제2 명확한 세포인 인공 공동자극 인자에 항원 제시를 이용하는 항원 특이적 T 세포 증식을 자극하고 활성화하는 방법을 제공한다.
일 실시양태에서, 조작된 세포주, 예컨대 aK562 세포주는 본 개시내용의 방법에서 사용하기 전에 예를 들면 X선 공급원의 감마선 공급원에 의해 조사된다.
조작된 세포주(예컨대 aK562 세포주)는 냉동된 형태로 제공될 수 있고, 이런 경우 냉동 후 세포들의 조사를 수행할 수 있다.
일 실시양태에서, CTL들 대 공동자극 인자(예를 들면, 여기서 공동인자는 세포주임)의 비는 각각 2:1 내지 1:10, 예컨대 1:5의 비이다.
CTL들:항체:공동자극 세포들의 적합한 비는 1:1:0.2 내지 1:1:10, 예컨대 1:1:5의 범위이다.
유리하게는, T-APC들 및 인공 공동자극 인자들, 예컨대 조작된 세포들을 사용하는 방법은 선행 기술 방법과 비교하여 개선된 농도의 항원 특이적 T 세포 증식을 제공할 수 있다.
단계 a) 및 임의로 단계 b)에서 사용되는 사이토카인 또는 사이토카인들은 T 세포 성장 또는 분화를 자극하고/하거나 활성화하는 데 적절해야 하거나, T 세포 생존을 촉진하는 등과 같은 몇몇 다른 유용한 기능을 수행한다.
본 개시내용의 방법에서 사용될 수 있는 사이토카인들은 IL-1, IL-2, IL-4, IL-6 IL-7, IL-12 및 IL-15를 포함한다.
일 실시양태에서, 본 개시내용에 따라 상기 방법에서 사용되는 사이토카인들은 IL-4, IL-7 및 IL-15, 예컨대 이들의 조합으로부터 독립적으로 선택된다.
일 실시양태에서, 단계 a)에서 사용되는 사이토카인들은 IL-4 및/또는 IL-7이다. 이론에 의해 구속되고자 함이 없이 본 발명자들은 이들 사이토카인들이 바이러스 항원 특이적 세포들의 빈도, 레퍼토리 및 증식과 관련하여 역할을 한다는 것을 의미한다.
일 실시양태에서, IL-2가 단계 a)에서 사용되는 경우, 이것을 초기가 아니라 배양 약 3일 또는 4일에 첨가한다.
풀들(pools)에 분취된 펩타이드 라이브러리들에 의한 자극 후 ELISPOT 분석에 의해 T 세포들의 레퍼토리를 결정할 수 있어서, 각각의 펩타이드는 2개의 풀에서 독특하게 표시된다(Kern, F., N. Faulhaber, C. Frommel, E. Khatamzas, S. Prosch, C. Schonemann, I. Kretzschmar, R. Volkmer-Engert, H. D. Volk, and P. Reinke. 2000. Analysis of CD8 T cell reactivity to cytomegalovirus using protein- spanning pools of overlapping pentadecapeptides. Eur J Immunol. 30:1676-1682 and Straathof, K. C., A. M. Leen, E. L. Buza, G. Taylor, M. H. Huls, H. E. Heslop, C. M. Rooney, and C. M. Bollard. 2005. Characterization of latent membrane protein 2 specificity in CTL lines from patients with EBV-positive nasopharyngeal carcinoma and lymphoma. J. Immunol. 175:4137-4147).
일 실시양태에서, 단계 b)에서, 사용된 사이토카인은 IL-15이다. 이론에 의해 구속되고자 함이 없이, 본 발명자들은 IL-15이 관련 T 세포 집단에 생존전(pro-survival) 영향을 미친다고 믿는다.
일 실시양태에서, 단계 b)에서 사용된 사이토카인은 IL-15이다.
IL-15와 같은 사이토카인들은 예를 들면 매주 2회 배양 동안 대체될 수 있다.
일 실시양태에서, 본 명세서의 실시양태 중 임의의 하나에서 기재된 특정한 사이토카인들만이 사용된다.
IL-12는 Th1 포커싱에 역할을 갖고, 균형 이룬 Th1/Th2가 바람직한 경우 외인성 IL-12는 생략될 수 있다. 일 실시양태에서, 본 개시내용의 외인성 IL-12를 사용하지 않는다. 그러나, 본 발명의 T 세포 생성물의 맥락에서, CD4+ 집단에서의 Th1 반응은 바람직한 것으로 생각된다.
외인성 사이토카인들은 세포들이 배양 시스템으로 이동될 때 또는 소정의 단계의 시작 시의 동시 첨가를 비롯하여 적절한 공정의 임의의 단계에서 첨가될 수 있다. 후자는 단계 a) 및/또는 단계 b)에 적용된다.
단계 a) 및/또는 단계 b)에서 외인성 사이토카인들의 존재는 대안적으로 예를 들면 단계가 개시된 1일, 2일, 3일, 4일 이상 후에 단계에 걸쳐 부분적으로 첨가될 수 있다.
일 실시양태에서, 본 개시내용의 방법은 CD4+ T 세포 집단(예를 들면 Th1 집단)을 포함하는 세포 집단을 제공하도록 이용된다. 본 명세서에서 사용되는 Th1 집단은 세포들의 5% 이상, 예컨대 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 이상이 Th1로서 분류화되는 CD4+ 집단을 의미하도록 의도된다.
다른 기능들 중에서, Th1 세포들은 일반적으로 대식세포들의 사멸 효율 및 세포독성(cytolytic) CD8+ 세포들의 증식을 최대화한다.
기억 T 세포들은 Th1 세포들의 하위카테고리이다.
일 실시양태에서, 상기 방법으로부터 얻은 세포들의 집단은 기억 T 세포들의 하위집단을 포함한다. 이론에 의해 구속되고자 함이 없이, 본 발명자들은 상기 방법으로부터 얻은 T 세포들의 상당한 부분이 시작 집단의 기억 부분으로부터 유래한다고 생각한다.
일 실시양태에서, 이 사이토카인에 의해 촉진된 증식이 너무 비특이적이고 NK 세포들, 원치않는 기능/특이성의 T 세포들 및 세포들에서 특정한 양의 아네르기를 생성할 수 있는 T 조절 세포들의 증식을 생성할 수 있으므로, IL-2는 단계 (a)에서 사용되지 않는다. 따라서, 일 실시양태에서, 배양물에 존재하는 IL-2만이 내인성 IL-2이고, 즉 이것은 세포들에 의해 분비된다.
일 실시양태에서, IL-2는 IL-15보다 더 분화된 표현형을 촉진할 수 있으므로 단계 (b)에서 사용되지 않는다.
본 명세서에서 사용되는 아네르기는 항원 자극에 대한 세포들의 반응성 결여를 의미하도록 의도된다. 예를 들어, 관련 세포 집단에 의한 인터페론 감마 분비와 같은 기능적 분석을 이용하여 아네르기를 측정할 수 있다. 완전 작용성(비아네르기) 세포들과 비교하여 더 낮은 농도의 인터페론 감마 분비는 아네르기의 정도를 나타낼 수 있다. 물론, 세포들에서의 아네르기 정도가 더 클수록, 특정한 (마커) 기능성이 더 낮아진다.
상기 기재된 바대로, 증식된 생성물의 맥락에서 아네르기는 하나 이상의 관련 방식으로 세포 기능 감소를 의미하는 일반 용어인 것으로 의도된다. 상기 용어는 세포 고갈을 포함하고, 예를 들면 세포들은 더 이상 분열할 수 없다. 상기 세포를 노쇠화라 칭한다. 복제에 필요한 염색체 말단의 DNA의 보호성 조각인 텔로미어(telomere)들이 각각의 복제로 짧아지고 결국 소모되므로, 세포들은 분열을 중지한다.
세포들의 표면 위에 발현된 PD-1(프로그래밍된 세포사 단백질 1; 유니프로트 Q15116호)이 아네르기의 마커인 것으로 생각된다. 일 실시양태에서, 관련 증식된 T 세포 집단의 10% 미만, 예를 들면 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, 0.5% 이하, 예컨대 약 1%가 PD-1을 발현한다.
NPC가 재발된 환자와 같은 T 세포들에서의 높은 농도의 아네르기를 갖는 환자들에서, LMP/EBNA1-특이적 T 세포들의 빈도는 PD-L1 또는 PD-1에 대한 차단 항체들(즉, 수용체에 결합하는 리간드로부터의 신호전달을 차단)의 존재 하에 증가할 수 있다.
이러한 현상은 건강한 공여자들에서 발견되지 않고, 이는 2형 잠복 항원 특이적 T 세포들이 NPC 환자들에서 아네르기라는 것을 제시한다.
본 명세서에서 사용되는 표적 항원은 EBV와 같은 특정한 바이러스와 같은 치료학적 표적에 대해 T 세포들에서 특이성을 생성하도록 사용되는 항원을 의미하도록 의도된다. 따라서, 표적 바이러스 또는 암 세포들에 의해 감염된 세포들은 일반적으로 표적 항원을 발현하고, 그러므로 그 자체가 면역계에 의한 제거에 대한 표적이 된다.
일 실시양태에서, 증식된 T 세포들의 집단은 밸런스 CD4+ 및 CD8+ 집단이고, 즉 세포 집단은 CD4+ 및 CD8+ 세포들 둘 다를 포함하지만, 동일한 양으로 필요하지는 않는다. 본 명세서의 맥락에서 균형은 CD4+ 또는 CD8+ 집단들 중 하나가 증식 동안 고갈되지 않는다는 것을 암시하도록 사용된다.
본 개시내용의 방법을 이용하여 증식된 세포 집단들은 원하는 T 세포 집단을 포함하고, 일반적으로 오직 원하는 집단으로 이루어지지 않는다. 환자에게 투여된 최종 생성물은 증식을 표적화하지 않는 수많은 다른 세포들을 포함할 수 있다. 일 실시양태에서, CD4+ 및 CD8+ 세포들의 원하는 집단은 세포들의 전체 집단 중 약 60% 이하를 포함한다. 당해 분야의 당업자에게 공지됨감마-IFN ELISPOT 분석 또는 멀티머(Multimer)(예를 들면, 테트라머) 염색 둘 다를 이용하여 세포 집단들의 빈도를 측정할 수 있다.
일 실시양태에서, 상기 방법으로부터 얻은 T 세포들 집단은 우세한 클론의 출현 없이 스펙트로타이핑에 의해 분석될 때 다양하다. 즉, 시작 샘플에서의 T 세포 다양성은 상당히 증식된 T 세포들에 의해 표시되고, 즉 증식은 일반적으로 단일클론 또는 올리고 클론 표적 세포 집단을 제공하지 않는다.
상당한 비율, 예를 들면 30% 내지 60%의 증식된 세포들은 일반적으로 CD27, CD28, CD62L 및/또는 CD45RO을 포함하는 이팩터 기억 마커들을 발현한다.
본 개시내용에 따른 항원 특이적 T 세포들 중 50% 이상, 예컨대 60%, 70%, 80%, 90% 또는 95%이 증식 과정에서 사용되는 항원들을 발현하는 표적 세포들을 사멸시킬 수 있는 것으로 예상된다.
본 발명자들은 Ad 벡터들 및 LCL들을 사용하는 LMP-T 세포 배양의 28일 내지 63일과 비교하여 T 세포 배양의 16일 내지 24일의 범위가 걸리는 본 개시내용의 방법을 이용하는 2개의 자극들을 사용하여 환자들의 치료에 필요한 가장 높은 세포 용량들의 경우에도 충분한 세포들을 제조할 수 있다고 믿는다.
본 발명의 방법에 의해 더 많은 세포들이 제조될 수 있다는 것은 선행 기술 방법에 의해 제조된 세포들과 비교하여 더 특이적이고, 더 높은 농도의 감마 인터페론을 제조하고/하거나 더 낮은 농도의 아네르기 마커들을 발현시킨다는 점에서 유리할 수 있다.
일 실시양태에서, 암 환자들로부터의 아네르기 T 세포들은 빈약하게 성장하고 3개의 자극들을 요할 수 있다. 제3 자극은 추가의 자극 성분들을 포함한다. 이때 대부분의 세포들은 특이적이어야 하므로, 원치않는 세포들의 증식에 대한 우려가 없다.
일 실시양태에서, 제3 자극 배양은 (1) 펩타이드 펄스화, 조사된 자가 활성화 T 세포들, (2) 조사된 공동자극 세포주(예컨대 aK562 세포들), (3) 혈액 뱅크 승인된 동종이계 공여자들로부터 조사된 PBMC들 및 (4) 항-CD3의 하위유사분열 용량(1㎖당 1ng 내지 100ng 예를 들면 1㎖당 50ng)을 포함한다.
일 실시양태에서, 치료에 사용되는 세포들의 적합성을 확립하기 위해, 예를 들면 인터페론 감마 ICS(세포내 사이토카인 염색) 및/또는 인터페론 감마 ELISPOT 분석과 같은 하나 이상의 시험들을 수행한다.
일 실시양태에서, 적합성 시험은 단일 유세포분석기 분석과 조합된다.
일 실시양태에서, 비특이적 사멸에 대한 51Cr 방출 분석을 수행하지만, 이것은 일반적으로 적합성 분석의 일부를 형성하지 않는다.
일 실시양태에서, 뱃치 방출 시험이 표 1에 기재되어 있다:
Figure pct00001
본 개시내용의 방법은 웰 또는 컨테이너들에서 수행될 수 있지만, 가장 적합하게는 가스 투과성 시스템에서 사용된다. 본 명세서에서 사용되는 용기는 세포들, 배지 등을 보유하기에 적합한 임의의 유형의 컨테이너, 예를 들면 백, 예컨대 주입 유형 백(infusion type bag)(가스 투과성 부분으로 제공됨) 또는 경질 용기, 예컨대 GRex™ 시스템을 의미하도록 의도된다. 가스 투과성 층은 세포들의 신속한 증식을 수월하게 하고, 필요한 배지 변화의 수를 최소화한다.
일 실시양태에서, 단계 a)를 GRex™ 10 시스템에서 수행한다. GRex™ 10 시스템은 1×108개의 T 세포들을 배양하기에 적합하다.
일 실시양태에서, 단계 b)를 GRex™ 100 시스템에서 수행한다.
WO 제2005/035728호(본 명세서에서 참조문헌으로 포함됨)는 가스 투과성 용기를 어떻게 제조하는지를 기술하고 있다. 일 실시양태에서, 실리콘 가스 투과성 재료를 사용한다.
일 실시양태에서, 사용된 시스템은 윌슨 울프(Wilson Woolf)로부터의 GRex™ 시스템이다. 일 실시양태에서, 상기 시스템은 미국 가출원 제61/550,246호(본 명세서에서 참조문헌으로 포함됨)에 기재된 무균 제제를 제공하도록 조정된다.
일반적으로, 상기 시스템은 표면적 1㎠당 약 50만개의 세포들로 시딩된다. 표면적이 10㎠인 GRex-10에서, 최소 500만 및 2000만개의 세포들이 시딩된다.
일 실시양태에서, 단계 (a)에서 2000만개의 세포들이 GRex-10에서 시딩된다. PBMC 내에, 1% 미만의 세포들이 펩타이드들에 특이적이어서, 기껏해야 20만개의 특이적 세포들이 시딩된다. 남은 PBMC들은 공급 세포들로서 작용한다.
일 실시양태에서, 단계 (b)에서 5000만개의 조사된 aK562 세포들과 1000만개의 펩타이드 펄스화 활성화 및 조사된 T 세포들 및 1000만개의 이팩터 T 세포들이 GRex-100(100㎠)으로 시딩되다. 이런 경우, 오직 이팩터 T 세포들만이 증식한다.
일 실시양태에서, 본 개시내용은 상기 방법으로부터 직접 얻은 세포 조성물로 확장된다.
일 실시양태에서, 본 개시내용에 따른 방법은 환자에 적어도 2개의 각각의 용량들을 제공하는 충분한 CD3+ 세포들을 생성시킨다.
본 발명은 또한 본 명세서에 개시된 방법에 의해 제조된 세포 집단들의 동일한 바람직한 특성을 갖는 조성물로 확장된다.
따라서, 일 양태에서 본 개시내용은 표적 항원, 예컨대 바이러스에 특이적 T 세포들의 집단을 포함하도록 실험실 내 증식된 자가 T 세포 집단을 제공하고, 이 집단은 표적 바이러스 오염 및 바이러스 벡터들에 대한 반응들을 실질적으로 갖지 않는다.
본 발명의 방법은 또한 특히 본 명세서 기재된 항원 특이적 T 세포 집단들의 증식에 사용하기 위한 펩타이드 혼합물들 및 이들로부터 얻은 세포 집단들로 펄스화된 수지상 세포들의 제조에 관한 것이다.
본 발명의 방법은 또한 펩타이드 혼합물들 및 이들로부터 얻은 세포 집단들로 펄스화된 T-APC를 제조하는 방법에 관한 것이다.
본 개시내용은 또한 예를 들면 CD4+ 및 CD8+ 항원 특이적 T 세포들의 집단을 포함하는 본 명세서에서 기재된 자가 T 세포 집단들에 관한 것이고, 항원은 바이러스 감염된 세포들 또는 암 세포들과 관련된다.
하나 이상의 실시양태에서, 본 개시내용에 따른 세포 집단들은 선행 기술 방법에 의해 제조된 세포들과 비교하여 하나 이상의 유리한 특성을 갖는다.
일 실시양태에서, 관련 T 세포 집단에서의 세포들의 평균 세포 직경은 10 내지 14μM이다.
유리하게는, 본 발명의 세포들 배양물은 주입 후 일반적으로 낮은 독성을 생성하고, 예를 들면 아주 적은 독성 내약성 반응들, 예를 들면 염증성 반응들, 세포 손상, 감기 유사 증상, 오심, 탈모 등과 관련된다.
본 개시내용에 따른 세포 집단들은 또한 유리한 특성, 예를 들면 높은 농도의 인터페론 감마 발현을 제공한다.
본 명세서에서 이용되는 높은 농도의 인터페론 감마 발현은 평균하여 본 발명의 방법에 의해 제조된 세포 집단들이 선행 기술 방법에 의해 제조된 세포들보다 더 높은 농도의 인터페론 감마를 발현하고 특히 환자로부터 얻은 원래의 아네르기 세포들보다 더 높은 농도의 인터페론 감마를 발현할 수 있다는 사실을 의미하도록 의도된다.
일 실시양태에서, 본 개시내용의 세포들은 예를 들면 본 명세서에 개시된 분석에서 항원 특이성 증대를 나타내고, 예를 들면 본 개시내용의 세포들은 선행 기술 방법에 의해 제조된 세포들과 비교하여 항원들에 의한 자극에 반응하여 사이토카인들을 분비하는 더 높은 빈도의 세포들을 포함한다. 이 숫자는 일반적으로 집단에 대해 얻은 값으로부터 유도된 세포 값을 존재하는 세포들의 수로 나눈 평균이다.
일 실시양태에서, 본 개시내용의 세포 집단들은 선행 기술 방법에 의해 제조된 세포 집단들에 필적하는 (유의적으로 다르지 않은) 결합도를 나타낸다.
결합도를 결정하기 위해, 자가 활성화 T 세포들은 51크롬으로 라벨링되고 표준 세포독성 분석에서 표적으로 사용되는 펩타이드의 희석액으로 펄스화될 수 있다. 대부분의 아비드(avid) T 세포들은 가장 낮은 농도의 펩타이드로 펄스화된 표적 세포들을 사멸하는 세포들이다. 대안적으로, IFN 감마 생성은 펩타이드의 희석액에 의해 ELISPOT 분석을 이용하여 측정될 수 있다.
일 실시양태에서, 본 개시내용의 세포 집단들은 선행 기술 방법에 의해 제조된 세포 집단들과 비교하여 표적 세포들을 사멸하는 능력 증가를 나타낸다.
일 실시양태에서, 본 개시내용에 의해 제공된 T 세포 집단들은 표적 바이러스와 관련된 표적 바이러스 및/또는 암 세포들에 의해 감염된 세포들에 적절한 면역 반응을 제공하기 위해 생체 내 증식시키는 데 효과적이다.
본 발명은 또한 본 발명에 따른 자가 T 세포 집단들을 포함하는 조성물들로 확장된다. 이들 조성물들은 주요 공정 단계들 후에 세포 집단에 첨가되는 희석제, 담체, 안정화제, 계면활성제, pH 조절제 또는 임의의 다른 약제학적으로 허용되는 부형제를 포함할 수 있다. 부형제는 일반적으로 제제를 안정화시키고, 반감기를 연장시키고, 조성물이 환자의 생체 내 시스템과 더 상용성이 되게 하는 등의 기능을 갖는다.
일 실시양태에서, 안정화제로서 작용할 수 있는 알부민, 특히 인간 혈청 알부민과 같은 단백질 안정화제는 제조 후 세포 배양물에 첨가된다. 제제에서 사용되는 알부민의 양은 10 내지 50%(w/w), 예컨대 약 12.5%(w/w)일 수 있다.
일 실시양태에서, 상기 제제는 또한 냉동보존제, 예컨대 DMSO를 포함한다. DMSO의 분량은 일반적으로 20% 이하 예컨대 약 12%, 특히 10%(w/w)이다.
실시양태에서, 본 발명의 방법은 약제학적으로 허용되는 부형제, 특히 본 명세서에 기재된 부형제, 예를 들면 희석제, 안정화제 및/또는 보존제를 첨가하여 약제학적 제제를 제조하는 추가의 단계를 포함한다.
본 명세서에서 사용되는 부형제는 생물학적 또는 생리학적 기능을 갖지 않는 T 세포 집단에 첨가되는 모든 성분들을 포함하는 일반 용어이다.
최종 제제가 제조되면, 이는 적합한 컨테이너, 예를 들면 주입 백 또는 냉동바이알로 충전된다.
일 실시양태에서, 본 개시내용에 따른 방법은 T 세포 집단 또는 이의 약제학적 제제를 적합한 컨테이너, 예컨대 주입 백에 충전하고 이를 실링하는 추가의 단계를 포함한다.
일 실시양태에서, 본 개시내용의 T 세포 집단 또는 이를 포함하는 약제학적 조성물로 충전된 컨테이너는 저장 및 수송을 위해 냉동되고, 예를 들면 액체 질소의 기상에서 예를 들면 약 -135℃에서 저장된다.
일 실시양태에서, 본 개시내용의 방법은 본 개시내용의 T 세포 집단 또는 이를 포함하는 약제학적 조성물을 냉동시키는 추가의 단계를 포함한다. 일 실시양태에서, 형성된 결정들이 작고 세포 구조를 파괴하지 않도록 예를 들면 온도를 분당 1℃ 감소시켜 "생성물"을 제어 속도 냉동 공정에 의해 냉동시킨다. 샘플이 약 -100℃에 도달할 때까지 이 공정을 계속할 수 있다.
본 개시내용에 따른 생성물은 본 개시내용의 배양된 세포 집단 또는 이를 포함하는 약제학적 조성물을 의미하도록 의도된다.
일 실시양태에서, 생성물은 냉동된 형태로 환자의 위치로 옮겨지고, 이송되고, 수송된다.
일 실시양태에서, 본 개시내용에 따른 생성물은 비경구 투여, 예를 들면 주입, 저속 주사 또는 볼루스(bolus) 주사에 적합한 형태로 제공된다. 일 실시양태에서, 상기 제제는 정맥내 주입에 적합한 형태로 제공된다.
일 양태에서, 본 개시내용은 본 개시내용에 따른 생성물을 제조 장소 또는 편리한 수집 지점으로부터 예를 들면 의도되는 환자의 근처(여기서, T 세포 생성물은 이동 동안 0℃ 미만, 예컨대 -135℃에서 저장됨)로 수송하는 방법을 제공한다.
일 실시양태에서, 저장 및/또는 이송 동안 T 세포 생성물의 온도 변동을 모니터링한다.
일 실시양태에서, 예를 들면 바이러스 관련 질환 또는 악성종양, 예컨대 EBV 감염, CMV 감염, 아데노바이러스 감염, HIV 감염, C형 간염 또는 B 감염, 파르보바이러스 감염, 인플루엔자 바이러스 감염, 또는 바이러스 기원의 암, 예를 들면 EBV 관련 림프종 또는 암종, HHV8 관련 육종, 유두종바이러스 관련 암종 또는 SV40 관련 암들의 치료에서 치료제로서 사용하기 위한 본 개시내용의 생성물이 제공된다.
다른 바이러스 질병들(morbidities)은 바리셀라 조스터 바이러스 감염, 백시니아 바이러스 감염 및 이들 중 하나의 합병증을 포함한다.
일 실시양태에서, 치료는 면역억제 환자의 치료이다.
일 실시양태에서, 환자는 면역 손상되지 않는다.
일 실시양태에서, 본 명세서에 정의된 치료학적 유효량의 생성물을 투여하는 단계를 포함하는 본 개시내용에 따른 생성물로 환자를 치료하는 방법이 제공된다.
치료학적 유효량은 즉시 치료학적으로 효과적인 양을 반드시 의미하는 것은 아니지만, 치료학적 효과를 제공하도록 (투여 후) 생체 내 증식할 수 있는 용량을 포함한다.
따라서, 예를 들면 원하는 치료학적 효과를 제공하기 위해 생체 내 증식할 수 있는 증식된 T 세포들의 치료학적 용량 이하의 용량인 치료학적 유효량을 환자에게 투여하는 방법이 제공된다.
일 실시양태에서, 생성된 항원 특이적 T 세포 집단은 EBV 바이러스에 특이적이고, EBV 및/또는 이들과 관련된 임상 병원균들, 예를 들면 EBV 관련 암들로 감염된 세포들을 예방하거나, 경감시키거나, 제거한다.
감염의 증상은 열, 인후통 및 림프절 부종을 포함한다. 때때로, 비장 또는 간 부종 개입이 발생할 수 있다. 심장 문제 또는 중추 신경계의 개입이 아주 드물게 생긴다. EBV는 인간의 남은 삶 동안 혈액에서 약간의 세포들에 여전히 우세하거나 잠복하고, 면역 조절이 감소하거나 부재할 때 예를 들면 면역억제 환자들에서 재활성화될 수 있다. 감염이 건강한 면역계에서 개체에 치명적인 것은 아니지만, 감염은 면역억제 환자들에서는 중증의 합병증 및 사망을 발생시킬 수 있다.
EBV는 감염성 단핵증의 원인으로 잘 알려져 있다. 이는 또한 특정한 형태의 암, 특히 호치킨 림프종(hodgkin's lymphoma), 비(non)호치킨 림프종, 버킷(Brkutt's) 림프종, 비인두암, 위 암종 및 HIV와 관련된 중추 신경계 림프종들과 관련된다. 마지막으로, 바이러스에 의한 감염이 더 높은 위험의 특정한 자가면역 질환들, 특히 피부근염, 전신 홍반성 낭창, 류마티스 관절염, 쇼그렌 증후군 및 다발성 경화증과 관련된다는 증거가 있다.
일 실시양태에서, 치료에 대한 표적 환자 집단은 비인두암을 앓는다.
일 실시양태에서, 치료에 대한 표적 환자 집단은 위 암종을 앓는다.
따라서, 본 개시내용에 따라 EBV에 특이적인 T 세포 집단들은 상기 조건들 중 하나 이상의 치료 또는 예방에 사용될 수 있다.
일 실시양태에서, 본 개시내용에 따라 VZV에 특이적인 T 세포들을 포함하는 치료학적 유효량의 T 세포 집단을 투여하는 단계를 포함하는 뇌염, 폐렴, 대상포진 후 신경통, 대상포진, 신경 포진, 척수염, 안부 대상포진 및 무발진 대상포진을 포함하는 바리셀라 조스터 바이러스 감염 및/또는 이와 관련된 합병증의 치료 또는 예방이 제공된다.
일 실시양태에서, 백시니아 바이러스 감염 및/또는 이와 관련된 합병증의 치료 또는 예방 방법이 제공된다.
일 실시양태에서, 1㎡당 적어도 1×107개의 세포들 또는 1㎏당 2×105개의 세포들의 용량이 사용된다.
일 실시양태에서, 1㎡당 약 2×107개의 제1 용량 및 1㎡당 2×107개 또는 1×108개의 T 세포들의 제2 용량이 사용된다.
일 실시양태에서, 본 개시내용은 자가 항원 특이적 T 세포들의 증식에 사용하기에 적합한 자가 수지상 세포들을 생성하기 위한 바이러스 또는 암 항원(들)을 포함하는 펩타이드 혼합물의 용도를 제공한다.
일 실시양태에서, 본 개시내용은 항원 특이적 T 세포들의 증식에 사용하기에 적합한 자가 T-APC들을 생성하기 위한 바이러스 또는 암 항원(들)을 포함하는 펩타이드 혼합물의 용도를 제공한다.
일 실시양태에서, 본 개시내용은 예를 들면 항원 특이적 T 세포들, 특히 항원 특이적 T 세포들, 예컨대 자가 항원 특이적 T 세포들의 증식을 위해 T-APC들과 함께 사용되는 항원 특이적 T 세포들의 증식(특히 자가 T 세포 증식)에서 위의 항원을 동시에 제시함이 없이 공동자극 인자로서 사용하기 위한 aK562 세포들 또는 다른 인공 공동자극 인자의 용도를 제공한다.
일 실시양태에서, 특히 T 세포 증식, 예컨대 자가 항원 특이적 T 세포 증식에서 사용하기 위해 바이러스 또는 암 항원(들) 및 인공 공동자극 인자, 예컨대 aK562 세포를 포함하는 펩타이드 혼합물을 포함하는 키트가 제공된다. 일 실시양태에서, 키트는 IL-15를 추가로 포함한다.
일 실시양태에서, 키트는 항원 특이적 T 세포들, 예를 들면 자가 항원 특이적 T 세포들의 증식에 사용하기 위해 바이러스 또는 암 항원(들) 및 IL-4 및 IL-7을 포함하는 펩타이드 혼합물을 포함한다.
프로토콜들 및 실시예들
약어들
APC들 항원 제시 세포들
ATC 활성화 T 세포
CTL 들 세포독성 T 림프구
DC들 수지상 세포들
EBV 엡스타인-바 바이러스(바이러스들 중 헤르페스 과로부터의 바이러스)
LCL 림프아구성 세포주
EBV-LCL EBV로 감염된 림프아구성 세포주
LMP1 잠재성 막 단백질 1 유니프로트 P03230호
LMP2 잠재성 막 단백질 2 유니프로트 Q1HVJ2호
BARF1 BamHI 우측 리딩 프레임 유니프로트 P03228호에 의해 코딩된 단백질
EBNA1 EBV 핵 항원 1 유니프로트 P03211호
PBMC 말초 혈액 단핵 세포
CMV 사이토메갈로 바이러스
프로토콜 1: PBMC들을 얻기 위한 샘플의 제조
하기 단계들은 무균 기술 및 하기 보편적인 주의를 이용하여 증명된 생물 안전 작업대(biological safety cabinet)에서 수행되어야 한다.
혈액 샘플 또는 성분채집(apheresis) 샘플 또는 백혈구 연층(buffy coat) 샘플(대부분의 백혈구들 및 혈소판들을 포함하는 밀도 구배 원심분리 후 항응고 혈액 샘플의 분획)을 주변 온도(실온)에서 동일 용적의 둘베코(Dulbecco's) 인산염 완충 식염수 또는 RPMI 배지(예를 들면, 라이프 테크놀로지스로부터 구입 가능한 RPMI 1640)로 희석하였다.
50 ㎖의 원심분리 관에서, 15 ㎖의 림포 제조물(Lympho-prep)을 조심스럽게 약 30 ㎖의 희석 혈액에 더했다. 모든 이용 가능한 세포들을 사용하도록 이 단계를 조정할 수 있다.
재료를 주변 온도에서 약 40분 동안 400 x G에서 원심분리하였다.
분취량, 예를 들면 3×1 ㎖의 혈장 분취량을 -80℃에서 저장할 수 있다.
PBMC들 계면을 동일 용적의 둘베코 인산염 완충 식염수 또는 RPMI 배지(예를 들면, 라이프 테크놀로지스로부터 구입 가능한 RPMI 1640)로 수확하였다. 실온에서 약 10 분 동안 약 450 x G에서 원심분리한 후 상청액을 흡인시켰다(aspirate). 얻은 펠렛을 약 20 ㎖의 둘베코 인산염 완충 식염수 또는 RPMI 배지(예를 들면, 라이프 테크놀로지스로부터 구입 가능한 RPMI 1640) 중에 풀어내고 재현탁시켜야 한다.
공정을 수회 수행하는 경우, 세포들을 단일 원심분리 관에서 조합하고 완전히 재현탁시킬 수 있다. 일반적으로 20 ㎕의 세포들을 제거하고 20 ㎕의 50 % 적혈구 세포 용혈 용액(lysis buffer)를 첨가하여 세포들을 계수하고, 제조업자의 지시에 따라 혈구계수기(hemacytometer)를 사용하여 계수하였다.
PBMC들을 항원 특이적 T 세포들의 증식, CD3 및 CD28 활성화 T 세포들의 증식 및 수지상 세포들의 제조에서 사용할 수 있다.
주의: 제조된 PBMC들 세포들이 궁극적으로 환자들로의 주입을 위해 의도되므로, 환자 샘플들의 식별(identification) 및 취급을 위해 절차를 고수하는 것이 필수적이다. 하나의 환자의 샘플만이 한번에 취급되어야 한다. 일반적으로, 회수된 PBMC들의 수는 혈액 1 ㎖당 0.5 내지 2.0×106개의 PBMC들 범위이다. 백혈구 연층으로부터 1×109개 까지를 회수할 수 있다.
참조문헌:
Sili U et al Large-scale expansion of dendritic cell-primed polycolonal human cytotoxic T-lymphocyte lines using lymphoblastoid cells for adoptive immunotherapy. J. Immuother. 2003 May-Jun: 26(3): 241-56
Leen AM et al Contact-activated monocytes: efficient antigen presenting cells for the stimulation of antigen-specific T cells. J Immunother. 2007 Jan:30(1): 96-107.
Bollard CM et al The generation and characterization of LMP2-specific CTL for use as adoptive transfer from patients with relapsed EBV-positive Hodgkin disease J. Immunother.
프로토콜 2: 수지상 세포들의 생성
GM-CSF 및 IL-4 중에 배양하여 CD14 선택된 PB 단핵 세포들(PBMC)의 부착물로부터 수지상 세포들을 분화시킬 수 있다. 이후, GM-CSF, IL-4, IL-1β, IL-6, TNF-α 및 PGE-1 또는 PGE-2(PGE = 프로스타글란딘 E)를 사용하여 수지상 세포들을 성숙시킬 수 있다. 펩타이드들로 로딩된 수지상 세포들은 TCR을 통해 항원 특이적 T 세포들에 HLA I형 및 II형 분자들 상의 펩타이드들을 제시할 수 있다.
부착성 PBMC들의 제조 - 주변 온도(실온)에서 동일 용적의 둘베코 인산염 완충 식염수 또는 RPMI 배지(예를 들면, 라이프 테크놀로지스로부터 구입 가능한 RPMI 1640) 중에 예를 들면 30 ㎖의 헤파린화(heparinized) 말초 혈액을 희석하였다.
대안적으로 이전에 냉동된 PBMC를 해동하고, CellGenix DC 배지에서 2회 세척하고, 세포들을 계수하였다.
50㎖의 원심분리 관에서, 15 ㎖의 림포 제조물을 조심스럽게 대략 30 ㎖의 희석 혈액에 더했다. 모든 이용 가능한 세포들을 사용하도록 이 단계를 조정할 수 있다.
재료를 주변 온도에서 약 40 분 동안 400 x G에서 원심분리하였다.
PBMC들 계면을 동일 용적의 둘베코 인산염 완충 식염수 또는 RPMI 배지(예를 들면, 라이프 테크놀로지스로부터 구입 가능한 RPMI 1640)로 수확하였다. 실온에서 약 10분 동안 약 450 x G에서 원심분리한 후 상청액을 흡인시켰다. 얻은 펠렛을 약 20 ㎖의 둘베코 인산염 완충 용액 중에 풀어내고 재현탁시켜야 한다.
상기 단계들은 실시예와 동일하고, 이후 재료를 실온에서 약 5분 동안 400 x G에서 원심분리하였다. 이후, 상청액을 제거하고 펠렛을 20 ㎖의 DC 배지 중에 재현탁시켰다.
실시예 1에 정의된 바대로 세포들을 계수하였다. 농도가 1 ㎖당 5×106개보다 큰 경우, CellGenix DC 배지를 첨가하여 1 ㎖당 5×106개로 조정하였다. 농도가 1 ㎖당 5×106개 미만인 경우, CellGenix DC 배지 중에 1 ㎖당 5×106개로 펠렛을 재현탁시켰다.
75㎠ 플라스크당 10 ㎖의 세포들 또는 6웰 플레이트의 웰당 2 ㎖의 세포들을 옮겼다.
약 2시간 동안 37℃ 및 5% 이산화탄소로 옮겼다. 플라스크를 3회 세정하고, 10㎖의 둘베코 인산염 완충 식염수 또는 RPMI 배지를 PBMC 비부착성 분획을 포함하는 상청액들과 조합하였다.
T-75 배양 플라스크(팔콘(Falcon)으로부터 구입 가능)의 경우, IL-4의 1㎖당 1000단위 및 GM-CSF의 1㎖당 800단위를 포함하는 10㎖의 DC 배양 배지를 부착성 세포들에 첨가하였다.
6웰 플레이트의 경우, IL-4의 1㎖당 1000단위 및 GM-CSF의 1㎖당 800단위를 포함하는 2㎖의 DC 배양 배지를 부착성 세포들에 첨가하였다.
플라스크 또는 플레이트를 37℃ 및 5% 이산화탄소에서 항온처리기(incubator)로 옮겼다.
이전에 냉동보존(cryopreserved)되지 않은 경우, 반응 T 세포들의 제조에서 추가로 사용하기 위해 비부착성 세포들을 냉동보존할 수 있다.
3일 또는 4일에 IL-4의 1㎖당 1000단위 및 GM-CSF의 1㎖당 800단위를 첨가하였다.
첨가된 사이토카인들의 요약이 표 1에 제공되어 있다:
Figure pct00002
이후, 배양물을 37℃ 및 5% 이산화탄소에서 약 2일 동안 항온처리한 후 수지상 세포들을 자가 PBMC에 대한 자극제로서 제조 준비하였다.
수지상 세포들을 수확하고 계수하였다. 수회 세척될 때 세포들이 소실되고, 따라서 수지상 세포수가 제한적인 경우 세척 단계들이 생략될 수 있다는 것에 유의한다. 수지상 세포들은 분열하지 않고, 조사의 생략이 중요하지 않다.
5×105개 초과의 형질유도된 수지상 세포들이 회수되면, (후자가 이용 가능한 경우) 비형질유도된 수지상 세포들과 함께 표현형분석(phenotyping)을 위해 대략 105개를 보냈다.
5×105개 미만의 형질유도된 수지상 세포들이 회수되면, 펩타이드 로딩을 진행하였다.
상청액을 원심분리 후 흡인시키고, 1×106개의 수지상 세포들당 5㎕(5ng)의 각각의 펩타이드 라이브러리(즉, 각각의 항원의 경우)를 첨가하였다. 이후, 혼합물을 5% 이산화탄소 항온처리기에서 30 내지 60분 동안 항온처리한 후 30 Gray에서 조사하였다.
세포들을 20 ㎖의 배지 중에 재현탁시키고, 400 x G에서 약 5분 동안 원심분리하였다. CTL 배양 배지로 1 ㎖당 105개로 세포들을 재현탁시켰다. 수지상 세포들을 이제 PBMC들에 대한 자극자(stimulators)로서 사용 준비하였다.
실시예 1에서처럼, 이들 세포들이 환자들로 주입되므로, 적절한 절차들을 따라야 한다.
전체 수지상 세포들의 회수는 시작 집단의 1% 내지 8%이어야 한다.
참조문헌:
Gahn B et al Adenoviral Gene Transfer into Dendritic Cells Efficiently Amplifies the Immune Response to the LMP2A-Antigen; a potential treatment strategy for EBV virus-positive Hodgkin's lymphoma. Int. J. Cancer 2001 Sep 1; 93(5): 706-13
Bollard CM etalThe generation and characterisation of LMP2-specific CTLs for use in adoptive transfer from patients with relapsed EBV-positive Hodgkin disease J. Immunother (1997). 2004 Jul-Aug; 27(4):317-327
Gottschalk S et al Generating CTLs against subdominant Epstein-Barr virus LMP1 antigen for the Blood 2003 Mar 1; 101(5): 1905-12.
프로토콜 3: T- APC 들의 생성
1. 비 조직 배양 처리된 24웰 플레이트들 또는 T-75 비 조직 배양 처리된 플라스크들을 CD3 및 CD28 항체들(밀테니(Miltenyi))로 코팅하였다.
1.1. 웰당 1×106개의 세포들 또는 T-75 플라스크당 30-50×106개의 세포들로 평판배양하고자 하는 PBMC 수에 기초하여 코팅하고자 하는 웰들/플라스크들의 수를 계산하였다.
1.2. 웰들의 경우, 웰당 1ng의 CD3(0.2㎎/㎖ 스톡의 H2O의 5㎕/㎖) 및 1g CD28(0.5㎎/㎖ 스톡의 H2O의 2ℓ/㎖)을 포함하는 0.5㎖의 H2O를 평판배양하였다.
1.3. T-75 플라스크들의 경우, 18㎖의 H2O로 예비세척한 후; 플라스크당 18㎖의 H2O 중에 90㎕의 CD3(스톡 0.2㎎/㎖) 및 36㎕의 CD28(스톡 0.5㎎/㎖)을 사용하였다.
1.4. 37℃ 항온처리기에서 적어도 3시간 동안 항온처리하였다.
1.5. 임의: CD3-CD28 코팅된 플레이트를 4℃에서 밤새(overnight) 항온처리할 수 있다.
2. 웰들 또는 플라스크들을 세척하였다.
2.1. CD3/28 용액을 제거하고 웰당 1㎖의 PBS 또는 배지 또는 T-75 플라스크당 10㎖로 1회 세정하였다.
3. 30㎖의 T 세포 배지(10%의 인간 AB 혈청, 45%의 RPMI 1640(또는 어드밴스드 RPMI), 45%의 EHAA 및 200mM L-글루타민) 중에 PBMC들을 2×106개로 재현탁시켰다.
3.1. CD3/28 코팅된 웰당 2㎖ 또는 15㎖ 내지 25㎖를 T-75 플라스크에 분취하였다.
3.2. 플라스크가 편평하게 놓이게 하고 2일 동안 항온처리기로 옮겼다.
4. 2일에 IL-2 1㎖당 100단위들을 첨가하였다.
5. 4일 내지 5일에 세포들을 재현탁시키고 세포들을 계수하였다.
6. 얻은 세포수에 따라 세포들을 분할하였다.
6.1. GRex 10마다 5×106개의 세포들
6.2. GRex 100마다 5×107개.
7. 3일 내지 4일 후에, 세포들을 수확하고 계수하였다.
7.1. 단계 4에서처럼 추가로 증식시켰다.
7.2. 또는 냉동보존하였다.
8. 냉동보존
8.1. 세포들을 원심분리하고 상청액을 흡인시켰다.
8.2. 펠렛을 풀어내어 10분 내지 30분 동안 재현탁시키고 얼음으로 옮긴다.
8.3. 얼음 냉각 냉동 배지(10%의 DMSO, 50%의 인간 AB 혈청, 40%의 RPMI 1640) 1㎖당 5×106개 내지 10×106개의 세포들을 재현탁시켰다.
8.4. 냉동 컨테이너들(냉동백들 또는 냉동바이알들)로 옮겼다.
8.5. 적어도 90분 동안 분당 약 -1℃로 냉동 컨테이너들에서 냉동시킨 후, 액체 질소로 옮겼다.
9. 항원 제시 세포들에서 사용 전에, T 세포들을 단계 3에서처럼 2일 내지 4일 동안 CD3/28 항체 코팅된 플레이트들에서 재자극하여 공동자극 분자들을 상향조절하였다.
9.1. 이 단계는 T 세포들이 휴식 표현형을 갖는 것처럼 중요하고, 이들은 T 조절 세포들을 유도할 수 있다.
프로토콜 4: 본 발명의 바람직한 실시양태를 이용한 자가 항원 특이적 T 세포들의 증식
1. IL-4 및 IL-7을 포함하는 T 세포들 배지 1㎖당 PBMC들을 2×106개로 재현탁시켰다.
T 세포 배지는 10%의 인간 AB 혈청, 45% 어드밴스드 RPMI, 45%의 EHAA 및 200mM L-글루타민이다. IL-4를 1㎖당 20ng(10ng/㎖의 최종 희석) 첨가하고, IL7을 1㎖당 3332단위(1666U/㎖의 최종 희석) 첨가하였다.
2. 펩타이드 코팅된 수지상 세포들을 1㎖당 1×105개 내지 2×105개로 재현탁시켰다.
3. PBMC들 및 DC들을 1:1 비로 혼합하였다.
4. GRex-10당 20㎖(20×106개의 PBMC들)를 옮기고, IL-4(1㎖당 1666단위) 및 IL-7(1㎖당 10ng)을 포함하는 10㎖의 추가의 배지를 첨가하였다. 7일 동안 항온처리기로 옮겼다.
5. 7일에 20 ㎖의 배지를 제거하고 세포들을 재현탁시키고 계수하였다.
50×106개 초과의 세포들인 경우, 2개의 GRex-10들 사이에 분할하였다. 50×106개 미만인 경우, 1개의 GRex-10이 남았다.
IL-4 및 IL-7을 포함하는 배지 30 ml를 각각의 GRex-10에서 30㎖에 첨가하였다(IL-4의 최종 농도는 1㎖당 1666단위이고, IL-7의 최종 농도는 1㎖당 10ng이다)
2 내지 3일 초과 동안 항온처리기로 옮겼다.
6. 9일 또는 10일에 펩타이드 코팅된 T-APC들 및 aK562 세포들로 재자극하였다.
GRex로부터 반응 T 세포들을 수확하고 계수하였다.
1㎖당 1×106 개의 세포들로 재현탁시켰다.
항온처리기로 옮겼다.
6.1 5:1의 aK562-CS 대 T 세포 비를 제공하도록 aK562-CS 세포들을 제조하였다.
6.1.1. aK562-CS 세포들을 100 GY(Grays)로 조사하였다.
6.1.2. 5분 및 400 G 동안 원심분리하였다.
6.1.3. 완전(complete) T 세포 배지에서 재현탁시켰다.
6.1.4. 필요한 aK562-CS 세포들의 수를 계수하고 예상하였다.
6.1.4.1. 반응 T 세포들 x 5의 수
6.2. 펩타이드 펄스화, 조사된, 활성화된 자가 T 세포들(T-APC들)을 제조하였다.
6.2.1. 자가 T 세포들(ATC들)은 사용 2일 내지 4일 전에 CD3/28로 자극되거나 재자극되어야 한다.
6.2.2. 프로세싱 동안 손실을 고려하여 자극에 대한 충분한 수의 ATC들 + 약 30%를 수확하였다.
6.2.3. 400G에서 5분 동안 세포들을 원심분리하고 상청액을 흡인시켰다.
6.2.4. 손가락 움직임에 의해 세포 펠렛을 풀어냈다.
6.2.5. 10×106개의 ATC들마다 각각의 펩타이드 10ng을 첨가하였다.
6.2.6. 30 내지 90분 동안 공기 중에 5% CO2에서 37℃에서 항온처리하였다.
6.2.7. 약 20㎖의 배지 중에 재현탁시켰다.
6.2.8. 30 GY 조사하였다.
6.2.9. 5분 동안 400G 원심분리하고 상청액을 흡인시켰다.
6.2.10. 1㎖당 106개의 세포로 재현탁시켰다.
6.3. 1×107개의 반응 T 세포들을 GRex-100당 1×107T-APC들 및 5×107개의 조사된 aK562-CS 세포들과 조합했다.
6.3.1. 배지를 400㎖에 첨가한다.
6.3.2. 1㎖의 IL-7(2mg)당 10ng 및 IL-4의 6.6×105개의 단위를 첨가하였다.
6.3.3. 3일 내지 4일 동안 항온처리기로 옮겼다.
7. IL-2(1㎖당 50 내지 100단위) 또는 1㎖당 IL-15 10ng을 첨가하였다.
7.1. 3일 내지 4일 동안 배양물로 복귀시켰다.
7.2. 3일 내지 4일마다 사이토카인들을 첨가하였다.
8. 7일부터 포도당을 측정하였다.
8.1. 배지 1방울을 제거하고, 표준 휴대용(hand-held) 혈당측정기를 시험하였다.
8.2. 100 미만의 포도당 농도은 배지/사이토카인들의 변화를 촉발해야 한다.
8.3. 반응 T 세포들은 충분한 수가 얻어질 때 냉동보존되어야 한다.
9. 불충분한 세포들이 얻어지는 경우, 제3 자극(단계 7, 8 및 9)을 수행할 수 있다.
실시예 1: 비인두암 및 림프종을 앓는 건강한 공여자들 및 환자들에 EBNA1, LMP1 및 LMP2 특이적 T 세포들의 생성.
하위실험: 림프종 환자 1에 대한 EBNA1, LMP1 및 LMP2 특이적 T 세포들의 생성.
D1 OKT3/CD28 플레이트의 코팅
5ug 각각의 OKT3 및 CD28 항체들을 5㎖의 무균수(sterile water)에 첨가하여 OKT3 및 CD28 항체들을 제조하였다. 0.5㎖의 이 혼합물을 비조직 배양 처리된 24웰 플레이트(24-w-p)의 각각의 웰에 첨가하였다. 4℃에서 밤새 항온처리하였다. 주의: 이는 배양 (-) 8일이다.
D2 비부착성 PBMC 집단으로부터 OKT3 아세포들의 부착 및 생성에 의한 냉동된 PBMC들로부터의 수지상 세포들의 생성 - 배양 (-) 7일
림프종 환자 1 말초 혈액 단핵 세포들(PBMC들) 냉동된 스톡을 GMP 뱅크로부터 취하고, 샘플들은 PI(Cath Bollard)의 허가로 진행시킴: PBMC들의 4개의 바이알들, 모두 2010년 2월과 3월 사이에 냉동시킴, 500만개의 각각의 바이알, 전체 2000만개. PBMC들을 40㎖의 따뜻한 CellGenix 배지의 2개의 바이알들에서 해동하고 스핀 다운 하였다. 환자 1의 PBMC 수: 2250만개
환자 1 PBMC들을 스핀 다운하고 전체 6㎖의 따뜻한 CellGenix 배지 중에 재현탁시킨 후, 웰당 2㎖로 24-w-p의 3웰들 중 PBMC를 평판배양하였다. 3시간 후, 비부착성 부분을 무균 PBS로 2회 온화하게 세척하고, 배지를 IL4 및 GM-CSF를 갖는 CellGenix로 대체하였다. 37℃에서 항온처리하였다. 상기 비부착성 부분을 OKT3 아세포들을 생성시키도록 사용하였다.
OKT3 아세포 생성:
전날 코팅되고 4℃에서 저장된 OKT3 및 CD28을 갖는 플레이트를 웰당 0.5㎖의 T 세포 배지로 1회 세척하였다. PBMC들의 비부착성 부분을 약 10개의 웰들로 평판배양하였다. 37℃에서 항온처리하였다.
D3 50단위/㎖의 최종 배양 농도를 만들기 위해 웰에서의 배지의 ½를 IL2개의 100단위/㎖를 갖는 CTL 배지로 대체하여 IL2를 갖는 OKT3 아세포들 공급하였다.
D4 웰마다 1㎖의 배지를 IL4 및 GMP-CSF를 갖는 새로운 배지로 대체하여 IL4 및 GMP-CSF를 갖는 DC들을 공급하였다.
OKT3 아세포들을 새로운 조직 배양 처리된 24-w-p로 이동시켰다. 37℃에서 항온처리하였다.
D7 5000의 MOI에서 Ad-LMP1-LMP2를 스크래핑하고, 계수하고, 스핀 다운하고 이후 첨가하면서 세포들을 수확하여 Ad-LMP1-LMP2로 각각의 환자 DC의 1웰을 형질유도하였다.
환자 1: 50만명의 DC, 따라서 5x10^12vp/㎖ 농도에서 0.5㎕의 바이러스를 첨가하였다.
37℃에서 1.5시간 동안 항온처리하면서 약 15분마다 관들을 움직였다. 세포들을 GM-CSF, IL4, IL1b, IL6, TNFa 및 PGE2를 포함하는 배지에서 다시 재현탁시키고, 2㎖의 배지를 갖는 각각의 24-2-p의 1웰로 다시 평판배양하였다.
아데노바이러스 벡터들 없는 조건의 경우, ½ 배지를 꺼내고, 이후 2x의 GMP-CSF, IL4, IL1b, IL6, TNFa 및 PGE2를 갖는 CellGenix 배지를 웰에 다시 첨가하였다. 37℃에서 항온처리하였다.
배지를 대체하거나 세포들을 추가의 웰로 분할하여 OKT3 아세포들 공급을 계속하였다.
D9 제1 자극에 대한 D0 셋팅.
수지상 세포들을 수확하고 계수하였다:
환자 1: 비형질유도된 DC들: 20만명; 형질유도된 DC: 5만명
자극하고자 하는 GMP(2009에서 냉동된 세포들)로부터의 환자 1 PBMC들의 냉동된 바이알을 제거하고, 이후 30% FBS를 갖는 따뜻한 CTL 배지를 사용하여 세포들을 해동하였다:
환자 1: 800만개 회수된 바이알마다 1000만개의 냉동된 PBMC들의 1 바이알
DC 및 전체 PBMC들을 펩믹스들로 펄스화:
- 각각 200㎕의 무균 PBS로 (DMSO 중의) 1㎕의 스톡 펩믹스 용액을 첨가하여 EBNA1, LMP1 및 LMP2 펩믹스들을 희석하였다.
- 공여자들 둘 다로부터의 모든 비형질유도된 DC을 스핀 다운하고, 모두 그러나 약 50㎕의 배지를 흡인시켰다. 관을 움직여 펠렛들을 풀어냈다. 약 10㎕의 희석된 펩믹스를 펠렛들에 첨가하고, 가끔 움직이면서 37℃에서 30분 동안 항온처리하였다.
- 공여자 1로부터의 300만개의 PBMC들을 각각 새로운 깨끗한 관에 넣고, 스핀 다운하고, 모두 그러나 약 50㎕의 배지를 흡인시켰다. 약 3㎕의 희석된 펩믹스를 펠렛으로 첨가하였다. 가끔 움직이면서 37℃에서 30분 동안 항온처리하였다.
환자 1의 경우 T 세포 배양 0일을 설정:
현재의 GMP 조건: 항온처리 후 DC들을 0.5㎖의 배지로 스핀 다운하고 재현탁시키고; 100만개의 PBMC들을 취하고, 0.5㎖의 완전 CTL 배지(1㎖당 200만개) 중에 스핀 다운하고 재현탁시켰다. 둘 다를 48-w-p의 웰에 첨가하였다. 5㎍의 IL15를 첨가하여 5ng/㎖의 최종 농도로 만들었다. 이 조건의 DC:PBMC 비는 1:20이었다. 37℃에서 항온처리하였다.
조건 DC(px): 20㎖의 PBS로 펩믹스들로 펄스화된 DC를 세척하였다. 2㎖의 완전 CTL 배지로 재현탁시키고, 24-w-p의 웰마다 1㎖ 평판배양하였다. 400만개의 PBMC들을 취하고, 1㎖당 200만개로 스핀 다운하고 재현탁시켰다. IL4 및 IL7을 2x 농도(20ng/㎖)로 PBMC들에 첨가하였다. IL4 및 IL7의 최종 농도가 10ng/㎖로 감소하도록 이미 DC를 갖는 각각의 웰에 1㎖를 첨가하였다. 이 조건의 DC:PBMC 비는 1:20이다. 37℃에서 항온처리하였다.
조건 Px: PBMC 펠렛을 2㎖의 완전 CTL 배지 중에 재현탁시키고, IL4 및 IL7을 10ng/㎖로 첨가하고, 24-w-p의 1개의 웰로 평판배양하였다. 37℃에서 항온처리하였다.
D10 2개의 완전 24-w-p로 증식된 환자 1의 OKT3 아세포들. 수: 6500만개. 약 1500만개의 세포들로 각각의 바이알로 4개 바이알들 중에 냉동시켰다.
D15 OKT3/CD28 플레이트의 코팅
각각 5㎍의 OKT3 및 CD28 항체들을 5㎖의 무균수에 첨가하여 OKT3 및 CD28 항체들을 제조하였다. 0.5㎖의 이 혼합물을 비조직 배양 처리된 24웰 플레이트(24-w-p)의 각각의 웰에 첨가하였다. 4℃에서 밤새 항온처리하였다.
D16 Ad-LMP1-LMP2로 형질유도된 LCL
공여자 1 배양물로부터의 약 300만개의 LCL을 취하고, 스핀 다운한 후, 3㎕의 바이러스를 5000의 MOI에 5x10^12vp/㎖의 농도로 첨가하였다. 간헐적으로, 관을 움직여 37℃에서 1.5시간 동안 항온처리하였다. 항온처리 후, 세포들을 약 5㎖의 완전 RPMI 중에 재현탁시켰다. 37℃에서 항온처리하였다.
활성화된 OKT3 아세포들:
30% FBS를 갖는 따뜻한 CTL 배지 중에 바이알마다 1000만개로 공여자 1로부터의 각각의 OKT3 아세포들의 바이알을 해동하였다. 세포들을 스핀 다운하고 20㎖의 CTL 배지 중에 재현탁시켰다. CTL 배지로 코팅된 OKT3 및 CD28의 플레이트를 세척하고, 이후 세포들을 24-w-p의 10웰들로 평판배양하였다. 37℃에서 항온처리하였다.
D18 배양 10일
환자 1로부터의 T 세포들을 수확하고 10일 계수하였다:
조건 GMP: 213만개
조건 DC(px): 240만개
조건 Px: 304만개
환자 1 OKT3 아세포들을 수확하고 30Gy에서 조사하였다. 수: 1340만개.
aK562cs를 수확하고 100Gy에서 조사하였다. 수: 440만개. 세척하고, 스핀 다운하고 1㎖당 40만개의 세포 농도에 대해 11㎖ 중에 재현탁시켰다.
환자 1 형질유도된 LCL을 수확하고, 40Gy에서 조사하였다. 수: 570만개
본 발명자들은 ELISpot에 의해 항원 특이성을 시험하거나 림프구 아형들에 대해 표현형 분석하기에 충분한 세포들를 갖지 않으므로, 본 발명자들은 오직 이들 배양물들을 자극하였다.
제2 자극:
펩믹스들에 의한 OKT3 아세포들의 펄스화:
- (DMSO 중에) 1㎕의 스톡 펩믹스 용액을 각각 200㎕의 무균 PBS 중에 첨가하여 EBNA1, LMP1 및 LMP2 펩믹스들을 희석하였다.
- OKT3 아세포들을 스핀 다운하고, 모두, 그러나 약 50㎕의 배지를 흡인시켰다. 관들을 움직여 펠렛들을 풀어냈다. 약 20㎕의 희석 펩믹스를 펠렛들에 첨가하고, 때때로 움직이면서 30분 동안 37℃에서 항온처리하였다. 20㎖의 PBS로 세척하고, 스핀 다운하였다.
- OKT3 아세포들을 1㎖당 100만개의 농도로 재현탁시켰다.
조건 GMP:
LCL을 스핀 다운하고, 1㎖당 40만개의 농도에 대해 14.25㎖의 CTL 배지 중에 재현탁시켰다. 0.5㎖ 또는 20만개의 LCL을 24-w-p의 4웰들에 평판배양하였다.
D9 T 세포들을 GMP 조건으로 스핀 다운하고, 대략 60만개의 T 세포들에 웰마다 4㎖ 중에 재현탁시키고, LCL을 갖는 각각의 4웰들에 1㎖를 첨가하였다. T 세포 대 LCL 비는 약 3:1이다. 37℃에서 항온처리하였다.
조건 DC(px):
DC(px) 9일에 T 세포들을 스핀 다운하고, 20ng/㎖에서 2x IL4 및 IL7 농도를 갖는 T 세포 배지 4㎖ 중에 재현탁시켰다. 24-w-p의 웰마다 1㎖를 평판배양하였다. 0.5㎖의 펩믹스 펄스화된 OKT3 아세포들을 첨가한 후, 각각의 웰에 0.5㎖의 aK562cs를 첨가하여 1:1:1의 T 세포:OKT3 아세포들:aK562cs 비율(이용 가능한 aK562cs 총량이 낮음으로 인해 aK562cs의 낮은 비율)로 웰마다 2㎖의 최종 용적을 만들었다. 37℃에서 항온처리하였다.
조건 Px:
Px 9일에 T 세포들을 스핀 다운하고, 20ng/㎖에서 2x IL4 및 IL7 농도를 갖는 T 세포 배지 6㎖ 중에 재현탁시켰다. 24-w-p의 웰마다 1㎖를 평판배양하였다. 0.5㎖의 펩믹스 펄스화된 OKT3 아세포들을 첨가한 후, 각각의 웰에 0.5㎖의 aK562cs를 첨가하여 1:1:1의 T 세포: OKT3 아세포들:aK562cs 비율(이용 가능한 aK562cs 총량이 낮음으로 인해 aK562cs의 낮은 비율)로 웰마다 2㎖의 최종 용적을 만들었다. 37℃에서 항온처리하였다.
D21 각각의 웰에서의 1㎖의 배지를 1㎖당 100단위의 IL2를 갖는 1㎖의 배지로 대체하여 IL2를 배양 14일에 첨가하여 50단위/㎖의 최종 IL2개의 농도를 만들었다.
D22 OKT3/CD28 플레이트의 코팅
5㎍의 각각의 OKT3 및 CD28 항체들을 5㎖의 무균수에 첨가하여 OKT3 및 CD28 항체들을 제조하였다. 0.5㎖의 이 혼합물을 비조직 배양 처리된 24웰 플레이트(24-w-p)의 각각의 웰에 첨가하였다. 4℃에서 밤새 항온처리하였다.
D23 2000만개의 세포들을 갖는 냉동된 바이알을 해동하여 환자 1 OKT3 아세포들을 활성화한 후, 이들을 OKT3/CD28 코팅된 플레이트에 평판배양하였다.
200만개의 LCL을 스핀 다운하여 환자 1 LCL을 형질유도하여 약 50㎕의 배지가 남았고, 이후 5000의 MOI에 5x10^12vp/㎖로 2㎕의 Ad-LMP1-LMP2를 첨가하였다. 약 15분마다 관을 움직이고 1.5시간 후 5㎖의 완전 RPMI 배지 중에 재현탁시켰다.
D24 배양 16일: 임의의 사이토카인들 없이 배지를 새로운 배지로 대체하였다. 37℃에서 항온처리하였다.
D17의 ELISpot 분석을 위해 플레이트를 코팅하였다:
- 96-w 이모빌론(immobilon)-P 막 플레이트를 웰마다 50㎕의 35% EtOH로 예비 습윤시켰다. PBS로 세척하였다.
- 100㎍의 정제된(purified) 마우스 항-인간 IFNγ 1-D1K 항체를 10㎖의 코팅 완충액에 첨가하여 IFNγ 용액을 만들었다. 웰마다 100㎕를 첨가하여 플레이트를 코팅하였다. 4℃에서 밤새 저장하였다.
D25 배양 17일
환자 1 17일 T 세포들을 수확하고 계수하였다:
조건 GMP: 820만개
조건 DC(px): 550만개
조건 Px: 1560만개
OKT3 아세포들을 수확하고, 30Gy에서 조사하고 계수하였다: 1360만개
환자 1 LCL을 수확하고, 40Gy에서 조사하고 계수하였다: 120만개
aK562cs를 수확하고, 100Gy에서 조사하고 계수하였다: 2250만개
IFN γ 방출을 검출하기 위한 ELISpot 분석 셋팅 :
- T 세포 배지를 갖는 96-w-플레이트(하루 전일로부터 IFNγ 1차 항체로 코팅된 막을 갖는)를 37℃에서 1시간 동안 차단하였다.
- 반응 세포들을 제조하였다: GMP 조건으로부터 약 150만개의 T 세포들, DC(px) 조건으로부터 80만개 및 Px 조건으로부터 80만개를 취하고, 스핀 다운하고, 1㎖당 50만개로 재현탁시켰다.
- DMSO(0.2㎍/㎕) 중의 4㎕의 펩믹스 스톡을 EBNA1, LMP1, LMP2개의 항원들의 800㎕의 T 세포 배지에 첨가하여 펩믹스 용액을 제조하고, DMSO 중의 1.5㎕의 펩믹스 스톡을 EBNA3a, EBNA3b, EBNA3c, Bzlf1, NY-ESO1(음성 대조군에 무관한 항원), 스타프 아우레우스(staph aureus) 초항원(양성 대조군)의 항원들의 300㎕의 T 세포 배지에 첨가하였다. 약 100만개의 세포들을 취하고, 스핀 다운하고, 1㎖당 100만개 중에 재현탁시켜 환자 1 LCL을 제조하였다. 이들 항원들 및 표적들을 하기처럼 반응 T 세포들에 첨가하고, 각각의 공간은 2개의 웰(이중)을 나타낸다:
Figure pct00003
- 100㎕ 또는 50,000개의 세포들을 GMP 24웰, DC(px) 및 Px(각각 12웰을 가짐)로 각각의 웰에 첨가하였다.
- 37℃에서 밤새 항온처리하였다.
임의의 단계들
제3 자극:
펩믹스들에 의한 OKT3 아세포들의 펄스화:
- (DMSO 중에) 1㎕의 스톡 펩믹스 용액을 각각 200㎕의 무균 PBS에 첨가하여 EBNA1, LMP1 및 LMP2 펩믹스들을 희석하였다.
- OKT3 아세포들을 스핀 다운하고, 모두, 그러나 약 50㎕의 배지를 흡인시켰다. 관들을 움직여 펠렛들을 풀어내었다. 약 20㎕의 희석된 펩믹스를 펠렛들에 첨가하고, 때때로 움직이면서 37℃에서 30분 동안 항온처리하였다. 20㎖의 PBS로 세척하고, 스핀 다운하였다.
- OKT3 아세포들을 1㎖당 100만개의 농도로 재현탁시킨 후, 1㎖당 40만개로 추가 희석시켰다.
조건 GMP:
조사된 LCL을 스핀 다운하고, 1㎖당 12만개의 농도에 10㎖의 CTL 배지 중에 재현탁시켰다. 10만개 또는 1㎖를 각각 24-w-p의 6웰들에서 평판배양하였다.
GMP 조건으로 300만개의 D17 T 세포들을 스핀 다운하고, 6㎖ 중에 재현탁시키고, LCL를 갖는 각각의 6웰에 1㎖를 첨가하였다. T 세포 대 LCL 비는 약 4:1이다. 37℃에서 항온처리하였다. T 세포들의 나머지를 냉동시켰다.
조건 DC(px):
200만개의 DC(px) 17일에 T 세포들을 스핀 다운하고, 20ng/㎖에서 2x IL4 및 IL7 농도를 갖는 10㎖의 T 세포 배지 중에 재현탁시켰다. 24-w-p의 웰마다 1㎖를 평판배양하였다. OKT3 아세포들로 펄스화된 0.5㎖의 펩믹스를 첨가한 후, 0.5㎖의 aK562cs를 각각의 웰에 첨가하여 2:2:5의 T 세포:OKT3 아세포들:aK562cs 비율로 웰마다 2㎖의 최종 용적을 만들었다. 37℃에서 항온처리하였다. (제2 자극 후 성장이 크지 않으므로, T 세포 및 OKT3 아세포들 농도를 증가시켰다). T 세포들의 나머지를 냉동시켰다.
조건 Px:
200만개의 Px 17일 T 세포들을 스핀 다운하고, 20ng/㎖에서 2x IL4 및 IL7 농도를 갖는 10㎖의 T 세포 배지 중애 재현탁시켰다. 24-w-p의 웰마다 1㎖를 평판배양하였다. OKT3 아세포들로 펄스화된 0.5㎖의 펩믹스를 첨가한 후, 각각의 웰에 0.5㎖의 aK562cs를 첨가하여 2:2:5의 T 세포:OKT3 아세포들:aK562cs 비율로 웰마다 2㎖의 최종 용적을 만들었다. 37℃에서 항온처리하였다. (DC(px) 조건과 일치하도록 T 세포 및 OKT3 아세포들 농도를 증가시켰다). T 세포들의 나머지를 냉동시켰다.
D29 ELISpot IFNγ 플레이트를 전개시킨다(developed).
10㎕의 항체를 10㎖의 PBS+0.5% BSA에 첨가한 후, 0.2㎕의 필터로 여과시켜 비특이적 결합을 방지하도록 접합된 항체들의 덩어리를 제거하여 2차 IFNγ 항체(7B6-1 비오틴)를 제조하였다. 매번 웰마다 플레이트를 6회 100㎕의 PBS + 0.05% 트윈(Tween)으로 세척하였다. 100㎕의 이 2차 항체 용액을 각각의 웰에 첨가하였다. 37℃에서 2시간 동안 항온처리하였다.
PBS+0.05% 트윈 중에 10㎖의 아비딘-과산화효소 복합 용액을 1.5시간 제조한 후, 혼합하고 실온에서 항온처리하였다. 2시간 종료시, 플레이트를 매번 웰마다 100㎕의 PBS + 0.05% 트윈으로 6회 세척하였다. 100㎕의 아비딘-과산화효소 복합 용액을 각각의 웰에 첨가하고, 실온에서 1시간 동안 항온처리하였다.
항온처리 종료 후, 처음에 AEC 정제(tablet)를 2.5㎖의 디메틸포름아미드로 용해시키고, 이후 47.5㎖의 아세테이트 완충액(4.6㎖의 0.1N 아세트산, 11㎖의 아세트산나트륨, 47㎖의 물)를 첨가하고, 다음에 25㎕의 30% 과산화수소를 첨가하고, 0.45㎕의 필터로 혼합하고 여과시켜 AEC 기질을 제조하였다. 플레이트를 PBS+0.05% 트윈으로 세척하고, 3회 반복하고, PBS로 세척하고, 3회 반복하고, AEC 기질을 첨가하고, 4분 이하 동안 전개시켰다. 물로 세정하여 반응을 중지시켰다. 분석색(back)을 벗겨내고 막을 건조시켰다. 결과를 기록하고 계수를 위해 전송하였다.
D31 각각의 웰에서의 1㎖의 배지를 1㎖당 100단위의 IL2를 갖는 1㎖의 배지로 대체하여 20일에 IL2를 배양물에 첨가하여 최종 IL2 농도 50단위/㎖를 만들었다.
D32 OKT3/CD28 플레이트의 코팅
각각 5㎍의 OKT3 및 CD28 항체들을 5㎖의 무균수에 첨가하여 OKT3 및 CD28 항체들을 제조하였다. 0.5㎖의 이 혼합물을 비조직 배양 처리된 24웰 플레이트(24-w-p)의 각각의 웰에 첨가하였다. 4℃에서 밤새 항온처리하였다.
D33 웰마다 약 100만개로 OKT3/CD28 코팅된 플레이트에서 진행 중인 환자 1 OKT3 아세포 배양물을 평판배양하여 환자 1 OKT3 아세포들을 활성화하였다.
200만개의 LCL을 스핀 다운하여 환자 1 LCL을 형질유도한 후, 약 50㎕의 배지가 남았고, 이후 5000의 MOI에 5x10^12vp/㎖로 2㎕의 Ad-LMP1-LMP2를 첨가하였다. 약 15분마다 관을 움직이고 1.5시간 후 5㎖의 완전 RPMI 배지 중에 재현탁시켰다.
D34 배양 23일: 임의의 사이토카인들 없이 배지를 새로운 배지로 대체하고 약 400만개 초과의 세포들인 임의의 웰을 분할하였다. 37℃에서 항온처리하였다.
ELISpot 분석을 위해 플레이트를 코팅하였다:
- 96-w 이모빌론-P 막 플레이트를 웰마다 50㎕의 35% EtOH로 예비 습윤시켰다. PBS로 세척하였다.
- 100㎍의 정제된 마우스 항-인간 IFNγ 1-D1K 항체를 10㎖의 코팅 완충액에 첨가하여 IFNγ 용액을 만들었다. 웰마다 100㎕를 첨가하여 플레이트를 코팅하였다. 4℃에서 밤새 저장하였다.
D35 배양 24일
환자 1 24일 T 세포 배양물을 수확하고 계수하였다:
조건 GMP: 2220만개
조건 DC(px): 3980만개
조건 Px: 1620만개
OKT3 아세포들을 수확하고, 30Gy에서 조사하고, 계수하였다: 980만개
환자 1 LCL을 수확하고, 40Gy에서 조사하고, 계수하였다: 230만개
aK562cs를 수확하고, 100Gy에서 조사하고, 계수하였다: 2000만개
IFN γ 방출을 검출하기 위한 ELISpot 분석 셋팅 :
- T 세포 배지를 갖는 96-w-플레이트를 37℃에서 1시간 동안 차단하였다.
- 반응 세포들을 제조하였다: GMP 조건, DC(px) 조건 및 Px 조건으로부터 약 250만개의 T 세포들을 취하고, 스핀 다운하고, 1㎖당 100만개로 재현탁시켰다.
- DMSO(0.2㎍/㎕) 중의 4㎕의 펩믹스 스톡을 EBNA1, LMP1, LMP2개의 항원들의 800㎕의 T 세포 배지에 첨가하여 펩믹스 용액을 제조하고, DMSO 중의 1.5㎕의 펩믹스 스톡을 EBNA3a, EBNA3b, EBNA3c, Bzlf1, NY-ESO1(음성 대조군에 무관한 항원), 스타프 아우레우스 초항원(양성 대조군)의 항원들의 300㎕의 T 세포 배지에 첨가하였다. 약 100만개의 세포들을 취하고, 스핀 다운하고, 1㎖당 100만개 중에 재현탁시켜 환자 1 LCL을 제조하였다. 이들 항원들 및 표적들을 하기처럼 반응 T 세포들에 첨가하고, 각각의 공간은 2개의 웰(이중)을 나타낸다:
Figure pct00004
- 100㎕ 또는 50,000개의 세포들을 GMP 24웰, DC(px) 및 Px(각각 12웰을 가짐)로 각각의 웰에 첨가하였다.
- 37℃에서 밤새 항온처리하였다.
림프종 환자 1 T 세포들 및 자가 LCL의 동시배양의 셋팅
각각의 조건의 경우, T 세포 및 LCL을 하기 비로 24-w-p의 웰에 첨가하였다:
Figure pct00005
50㎍/㎖의 최종 농도에 IL2를 배양물에 첨가하고, 이동 피펫으로 온화하게 혼합하였다. 200㎕의 각각의 배양물을 취하고, 3㎖의 PBS+0.5% FBS로 세척하고, 스핀 다운하고, 상청액을 흡인시키고, 5㎕의 각각의 CD19-PE, CD56-FITC 및 CD3-PerCP의 항체들을 첨가하여 0일에 표현형을 분석하였다. 4℃에서 1시간 동안 항온처리하였다. 3㎖의 PBS로 세척하고, 스핀 다운하고, 상청액을 흡인시키고, 관마다 250㎕의 사이토픽스(cytofix) 및 50㎕의 카운트브라이트(CountBright) 비드를 첨가하였다. 유세포 분석기로 분석하였다.
제4 자극:
펩믹스들에 의한 OKT3 아세포들의 동기화:
- (DMSO 중에) 1㎕의 스톡 펩믹스 용액을 각각의 200㎕의 무균 PBS에 첨가하여 EBNA1, LMP1 및 LMP2 펩믹스들을 희석하였다.
- OKT3 아세포들을 스핀 다운하고, 모두, 그러나 약 50㎕의 배지를 흡인시켰다. 관들을 움직여 펠렛들을 풀어냈다. 약 20㎕의 희석된 펩믹스를 펠렛들에 첨가하고, 때때로 움직이면서 37℃에서 30분 동안 항온처리하였다. 20㎖의 PBS로 세척하고, 스핀 다운하였다.
- OKT3 아세포들을 1㎖당 100만개의 농도로 재현탁시킨 후, 1㎖당 40만개로 추가 희석시켰다.
- 1㎖당 200만개로 aK562cs를 재현탁시켰다.
조건 GMP:
조사된 LCL을 스핀 다운하고, 1㎖당 12만개의 농도로 18.4㎖의 CTL 배지 중에 재현탁시켰다. 12만개 또는 1㎖를 각각 24-w-p의 10개의 웰들에 평판배양하였다. GMP 조건으로 500만개의 D24 T 세포들을 스핀 다운하고, 10㎖ 중에 재현탁시키고, LCL을 갖는 각각의 10개의 웰들에 1㎖를 첨가하였다. T 세포 대 LCL 비율은 약 4:1이다. 37℃에서 항온처리하였다. T 세포들의 나머지를 냉동시켰다.
조건 DC(px):
200만개의 DC(px) 24일 T 세포들을 스핀 다운하고, 20ng/㎖에서 2x IL4 및 IL7 농도를 갖는 10㎖의 T 세포 배지 중에 재현탁시켰다. 24-w-p의 웰마다 1㎖를 평판배양하였다. OKT3 아세포들로 펄스화된 0.5㎖의 펩믹스를 첨가한 후, 각각의 웰에 1㎖당 200만개로 0.5㎖의 aK562cs를 첨가하여 1:1:5의 T 세포:OKT3 아세포들:aK562cs 비율로 웰마다 2㎖의 최종 용적을 만들었다. 37℃에서 항온처리하였다. T 세포들의 나머지를 냉동시켰다.
조건 Px:
200만개의 Px 24일 T 세포들을 스핀 다운하고, 20ng/㎖에서 2x IL4 및 IL7 농도를 갖는 10㎖의 T 세포 배지 중에 재현탁시켰다. 24-w-p의 웰마다 1㎖를 평판배양하였다. OKT3 아세포들로 펄스화된 0.5㎖의 펩믹스를 첨가한 후, 각각의 웰에 0.5㎖의 aK562cs를 첨가하여 1:1:5의 T 세포:OKT3 아세포들:aK562cs 비율로 웰마다 2㎖의 최종 용적을 만들었다. 37℃에서 항온처리하였다. T 세포들의 나머지를 냉동시켰다.
D36 ELISpot IFNγ 플레이트를 전개시킨다.
10㎕의 항체를 10㎖의 PBS+0.5% BSA에 첨가한 후, 0.2㎕의 필터로 여과시켜 비특이적 결합을 방지하도록 접합된 항체들의 덩어리를 제거하여 2차 IFNγ 항체(7B6-1 비오틴)를 제조하였다. 매번 웰마다 플레이트를 6회 100㎕의 PBS + 0.05% 트윈(Tween)으로 세척하였다. 100㎕의 이 2차 항체 용액을 각각의 웰에 첨가하였다. 37℃에서 2시간 동안 항온처리하였다.
PBS+0.05% 트윈 중에 10㎖의 아비딘-과산화효소 복합 용액을 1.5시간 제조한 후, 혼합하고 실온에서 항온처리하였다. 2시간 종료시, 플레이트를 매번 웰마다 100㎕의 PBS + 0.05% 트윈으로 6회 세척하였다. 100㎕의 아비딘-과산화효소 복합 용액을 각각의 웰에 첨가하고, 실온에서 1시간 동안 항온처리하였다.
항온처리 종료 후, 처음에 AEC 정제를 2.5㎖의 디메틸포름아미드로 용해시키고, 이후 47.5㎖의 아세테이트 완충액(4.6㎖의 0.1N 아세트산, 11㎖의 아세트산나트륨, 47㎖의 물)를 첨가하고, 다음에 25㎕의 30% 과산화수소를 첨가하고, 0.45㎕의 필터로 혼합하고 여과시켜 AEC 기질을 제조하였다. 플레이트를 PBS+0.05% 트윈으로 세척하고, 3회 반복하고, PBS로 세척하고, 3회 반복하고, AEC 기질을 첨가하고, 4분 이하 동안 전개시켰다. 물로 세정하여 반응을 중지시켰다. 분석색(back)을 벗겨내고 막을 건조시켰다. 결과를 기록하고 계수를 위해 전송하였다.
동시배양 2일 표현형 분석
- 1㎖의 배지를 IL2개의 100단위를 갖는 1㎖의 새로운 T 세포 배지로 대체하였다.
- 200㎕의 각각의 조건을 취하고, 3㎖의 PBS+0.5% FBS로 세척하고, 스핀 다운하고, 상청액을 흡인시키고, 5㎕의 각각의 CD19-PE, CD56-FITC 및 CD3-PerCP의 항체들을 첨가하여 2일에 표현형을 분석하였다. 4℃에서 1시간 동안 항온처리하였다. 3㎖의 PBS로 세척하고, 스핀 다운하고, 상청액을 흡인시키고, 관마다 250㎕의 사이토픽스 및 50㎕의 카운트브라이트 비드를 첨가하였다. 유세포 분석기로 분석하였다.
D38 동시배양 4일 표현형 분석
200㎕의 각각의 조건을 취하고, 3㎖의 PBS+0.5% FBS로 세척하고, 스핀 다운하고, 상청액을 흡인시키고, 10㎕의 각각의 CD19-PE, CD56-FITC 및 CD3-PerCP(증가된 세포수와 일치하도록 증가된 항체 양)의 항체들을 첨가하였다. 4℃에서 1시간 동안 항온처리하였다. 3㎖의 PBS로 세척하고, 스핀 다운하고, 상청액을 흡인시키고, 관마다 250㎕의 사이토픽스 및 50㎕의 카운트브라이트 비드를 첨가하였다. 유세포 분석기로 분석하였다.
각각의 웰에서의 1㎖의 배지를 1㎖당 100단위의 IL2를 갖는 1㎖의 배지로 대체하여 배양 20일에 IL2를 배양물에 첨가하여 최종 IL2 농도 50단위/㎖를 만들었다. 포화상태 웰들을 분할하였다.
D39 동시배양 5일 표현형 분석
200㎕의 각각의 조건을 취하고, 3㎖의 PBS+0.5% FBS로 세척하고, 스핀 다운하고, 상청액을 흡인시키고, 10㎕의 각각의 CD19-PE, CD56-FITC 및 CD3-PerCP의 항체들을 첨가하였다. 4℃에서 1시간 동안 항온처리하였다. 3㎖의 PBS로 세척하고, 스핀 다운하고, 상청액을 흡인시키고, 관마다 250㎕의 사이토픽스 및 50㎕의 카운트브라이트 비드를 첨가하였다. 유세포 분석기로 분석하였다.
D41 배양 30일: 임의의 사이토카인들 없이 배지를 새로운 배지로 대체하고 약 400만개 초과의 세포들인 임의의 웰을 분할하였다. 37℃에서 항온처리하였다.
ELISpot 분석을 위해 플레이트를 코팅하였다:
- 96-w 이모빌론-P 막 플레이트를 웰마다 50㎕의 35% EtOH로 예비 습윤시켰다. PBS로 세척하였다.
- 100㎍의 정제된 마우스 항-인간 IFNγ 1-D1K 항체를 10㎖의 코팅 완충액에 첨가하여 IFNγ 용액을 만들었다. 웰마다 100㎕를 첨가하여 플레이트를 코팅하였다. 4℃에서 밤새 저장하였다.
D42 배양 31일
환자 1 31일 T 세포 배양물을 수확하고 계수하였다:
조건 GMP: 1720만개; 조건 DC(px): 2060만개; 조건 Px: 2680만개
결과
표 2: 전체 배양 증식: 현재의 표준 프로토콜(GMP)과 비교하여, 제4 자극 종료시까지 나빠지지 않으면 바로 웰에서 증식된 KATpx로 배양물을 설정하였다.
Figure pct00006
본 발명자들은 림프종 환자에서 EBNA1, LMP1 및 LMP2에 대해 동일하게 우수한 또는 더 우수한 증식 및 더 높은 T 세포 항원 특이적 빈도를 생성시키는 신규한 항원 제시 복합체, KATpx를 최적화하였다. 이들 세포들은 동시배양물에서 종양 세포들을 효과적으로 제거하고, 이러한 사멸은 HLA 특이적이다. 더구나, 이러한 접근법을 이용하여, 본 발명자들은 LCL 및 아데노바이러스 벡터들에 대한 수요를 제거하여, LCL 및 아데노바이러스 벡터들에 의해 발현된 방관자(bystander) 항원들에 특이적인 T 세포들의 활성화 및 생성 시간을 감소시켰다.
본 명세서에 기재된 하나 초과의 실시양태는 기술상 적절한 바대로 조합될 수 있는 것으로 고려된다. 본 명세서의 맥락에서, "포함하는"은 "함유하는"으로 해석되어야 한다. 특정한 구성요소(elements)를 포함하는 본 개시내용의 양태는 또한 관련 구성요소의 대안적인 실시양태 "이루어지는" 또는 "로 실질적으로 이루어지는"으로 연장되는 것으로 의도된다. 본 명세서에 언급된 모든 언급은 구체적으로 참조문헌으로 포함된다.
<110> CELL MEDICA LIMITED BAYLOR COLLEGE OF MEDICINE <120> Process for T Cell Expansion <130> P14-4196 <150> US 61/569,577 <151> 2011-12-12 <160> 340 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 15 <212> PRT <213> Virus Herpesviridae (EBV-protein EBNA1 fragment) <400> 1 Met Ser Asp Glu Gly Pro Gly Thr Gly Pro Gly Asn Gly Leu Gly 1 5 10 15 <210> 2 <211> 15 <212> PRT <213> Virus Herpesviridae (EBV-protein EBNA1 fragment) <400> 2 Gly Pro Gly Thr Gly Pro Gly Asn Gly Leu Gly Glu Lys Gly Asp 1 5 10 15 <210> 3 <211> 15 <212> PRT <213> Virus Herpesviridae (EBV-protein EBNA1 fragment) <400> 3 Gly Pro Gly Asn Gly Leu Gly Glu Lys Gly Asp Thr Ser Gly Pro 1 5 10 15 <210> 4 <211> 15 <212> PRT <213> Virus Herpesviridae (EBV-protein EBNA1 fragment) <400> 4 Gly Leu Gly Glu Lys Gly Asp Thr Ser Gly Pro Glu Gly Ser Gly 1 5 10 15 <210> 5 <211> 15 <212> PRT <213> Virus Herpesviridae (EBV-protein EBNA1 fragment) <400> 5 Lys Gly Asp Thr Ser Gly Pro Glu Gly Ser Gly Gly Ser Gly Pro 1 5 10 15 <210> 6 <211> 15 <212> PRT 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Virus Herpesviridae (EBV-protein EBNA1 fragment) <400> 43 Gly Glu Pro Asp Val Pro Pro Gly Ala Ile Glu Gln Gly Pro Ala 1 5 10 15 <210> 44 <211> 15 <212> PRT <213> Virus Herpesviridae (EBV-protein EBNA1 fragment) <400> 44 Val Pro Pro Gly Ala Ile Glu Gln Gly Pro Ala Asp Asp Pro Gly 1 5 10 15 <210> 45 <211> 15 <212> PRT <213> Virus Herpesviridae (EBV-protein EBNA1 fragment) <400> 45 Ala Ile Glu Gln Gly Pro Ala Asp Asp Pro Gly Glu Gly Pro Ser 1 5 10 15 <210> 46 <211> 15 <212> PRT <213> Virus Herpesviridae (EBV-protein EBNA1 fragment) <400> 46 Gly Pro Ala Asp Asp Pro Gly Glu Gly Pro Ser Thr Gly Pro Arg 1 5 10 15 <210> 47 <211> 15 <212> PRT <213> Virus Herpesviridae (EBV-protein EBNA1 fragment) <400> 47 Asp Pro Gly Glu Gly Pro Ser Thr Gly Pro Arg Gly Gln Gly Asp 1 5 10 15 <210> 48 <211> 15 <212> PRT <213> Virus Herpesviridae (EBV-protein EBNA1 fragment) <400> 48 Gly Pro Ser Thr Gly Pro Arg Gly Gln Gly Asp Gly Gly Arg Arg 1 5 10 15 <210> 49 <211> 15 <212> PRT <213> Virus Herpesviridae 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Herpesviridae (EBV-protein LMP2 fragment) <400> 227 Glu Asp Pro Pro Phe Asn Ser Leu Leu Phe Ala Leu Leu Ala Ala 1 5 10 15 <210> 228 <211> 15 <212> PRT <213> Virus Herpesviridae (EBV-protein LMP2 fragment) <400> 228 Phe Asn Ser Leu Leu Phe Ala Leu Leu Ala Ala Ala Gly Gly Leu 1 5 10 15 <210> 229 <211> 15 <212> PRT <213> Virus Herpesviridae (EBV-protein LMP2 fragment) <400> 229 Leu Phe Ala Leu Leu Ala Ala Ala Gly Gly Leu Gln Gly Ile Tyr 1 5 10 15 <210> 230 <211> 15 <212> PRT <213> Virus Herpesviridae (EBV-protein LMP2 fragment) <400> 230 Leu Ala Ala Ala Gly Gly Leu Gln Gly Ile Tyr Val Leu Val Met 1 5 10 15 <210> 231 <211> 15 <212> PRT <213> Virus Herpesviridae (EBV-protein LMP2 fragment) <400> 231 Gly Gly Leu Gln Gly Ile Tyr Val Leu Val Met Leu Val Leu Leu 1 5 10 15 <210> 232 <211> 15 <212> PRT <213> Virus Herpesviridae (EBV-protein LMP2 fragment) <400> 232 Gly Ile Tyr Val Leu Val Met Leu Val Leu Leu Ile Leu Ala Tyr 1 5 10 15 <210> 233 <211> 15 <212> PRT <213> Virus Herpesviridae 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fragment) <400> 282 Gly Pro Val Phe Met Cys Leu Gly Gly Leu Leu Thr Met Val Ala 1 5 10 15 <210> 283 <211> 15 <212> PRT <213> Virus Herpesviridae (EBV-protein LMP2 fragment) <400> 283 Met Cys Leu Gly Gly Leu Leu Thr Met Val Ala Gly Ala Val Trp 1 5 10 15 <210> 284 <211> 15 <212> PRT <213> Virus Herpesviridae (EBV-protein LMP2 fragment) <400> 284 Gly Leu Leu Thr Met Val Ala Gly Ala Val Trp Leu Thr Val Met 1 5 10 15 <210> 285 <211> 15 <212> PRT <213> Virus Herpesviridae (EBV-protein LMP2 fragment) <400> 285 Met Val Ala Gly Ala Val Trp Leu Thr Val Met Ser Asn Thr Leu 1 5 10 15 <210> 286 <211> 15 <212> PRT <213> Virus Herpesviridae (EBV-protein LMP2 fragment) <400> 286 Ala Val Trp Leu Thr Val Met Ser Asn Thr Leu Leu Ser Ala Trp 1 5 10 15 <210> 287 <211> 15 <212> PRT <213> Virus Herpesviridae (EBV-protein LMP2 fragment) <400> 287 Thr Val Met Ser Asn Thr Leu Leu Ser Ala Trp Ile Leu Thr Ala 1 5 10 15 <210> 288 <211> 15 <212> PRT <213> Virus Herpesviridae (EBV-protein LMP2 fragment) <400> 288 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Arg Tyr Cys Cys Tyr Tyr Cys Leu Thr Leu 1 5 10 15 <210> 295 <211> 15 <212> PRT <213> Virus Herpesviridae (EBV-protein LMP2 fragment) <400> 295 Cys Arg Tyr Cys Cys Tyr Tyr Cys Leu Thr Leu Glu Ser Glu Glu 1 5 10 15 <210> 296 <211> 15 <212> PRT <213> Virus Herpesviridae (EBV-protein LMP2 fragment) <400> 296 Cys Tyr Tyr Cys Leu Thr Leu Glu Ser Glu Glu Arg Pro Pro Thr 1 5 10 15 <210> 297 <211> 15 <212> PRT <213> Virus Herpesviridae (EBV-protein LMP2 fragment) <400> 297 Leu Thr Leu Glu Ser Glu Glu Arg Pro Pro Thr Pro Tyr Arg Asn 1 5 10 15 <210> 298 <211> 13 <212> PRT <213> Virus Herpesviridae (EBV-protein LMP2 fragment) <400> 298 Ser Glu Glu Arg Pro Pro Thr Pro Tyr Arg Asn Thr Val 1 5 10 <210> 299 <211> 15 <212> PRT <213> Virus Herpesviridae (EBV-protein BARF 1 fragment) <400> 299 Met Ala Arg Phe Ile Ala Gln Leu Leu Leu Leu Ala Ser Cys Val 1 5 10 15 <210> 300 <211> 15 <212> PRT <213> Virus Herpesviridae (EBV-protein BARF 1 fragment) <400> 300 Ala Gln Leu Leu Leu Leu Ala Ser Cys Val Ala Ala Gly Gln Ala 1 5 10 15 <210> 301 <211> 15 <212> PRT <213> Virus Herpesviridae (EBV-protein BARF 1 fragment) <400> 301 Leu Ala Ser Cys Val Ala Ala Gly Gln Ala Val Thr Ala Phe Leu 1 5 10 15 <210> 302 <211> 15 <212> PRT <213> Virus Herpesviridae (EBV-protein BARF 1 fragment) <400> 302 Ala Ala Gly Gln Ala Val Thr Ala Phe Leu Gly Glu Arg Val Thr 1 5 10 15 <210> 303 <211> 15 <212> PRT <213> Virus Herpesviridae (EBV-protein BARF 1 fragment) <400> 303 Val Thr Ala Phe Leu Gly Glu Arg Val Thr Leu Thr Ser Tyr Trp 1 5 10 15 <210> 304 <211> 15 <212> PRT <213> Virus Herpesviridae (EBV-protein BARF 1 fragment) <400> 304 Gly Glu Arg Val Thr Leu Thr Ser Tyr Trp Arg Arg Val Ser Leu 1 5 10 15 <210> 305 <211> 15 <212> PRT <213> Virus (EBV - protein BARF 1) <400> 305 Leu Thr Ser Tyr Trp Arg Arg Val Ser Leu Gly Pro Glu Ile Glu 1 5 10 15 <210> 306 <211> 15 <212> PRT <213> Virus Herpesviridae (EBV-protein BARF 1 fragment) <400> 306 Arg Arg Val Ser Leu Gly Pro Glu Ile Glu Val Ser Trp Phe Lys 1 5 10 15 <210> 307 <211> 15 <212> PRT <213> Virus Herpesviridae (EBV-protein BARF 1 fragment) <400> 307 Gly Pro Glu Ile Glu Val Ser Trp Phe Lys Leu Gly Pro Gly Glu 1 5 10 15 <210> 308 <211> 15 <212> PRT <213> Virus Herpesviridae (EBV-protein BARF 1 fragment) <400> 308 Val Ser Trp Phe Lys Leu Gly Pro Gly Glu Glu Gln Val Leu Ile 1 5 10 15 <210> 309 <211> 15 <212> PRT <213> Virus Herpesviridae (EBV-protein BARF 1 fragment) <400> 309 Leu Gly Pro Gly Glu Glu Gln Val Leu Ile Gly Arg Met His His 1 5 10 15 <210> 310 <211> 15 <212> PRT <213> Virus Herpesviridae (EBV-protein BARF 1 fragment) <400> 310 Glu Gln Val Leu Ile Gly Arg Met His His Asp Val Ile Phe Ile 1 5 10 15 <210> 311 <211> 15 <212> PRT <213> Virus Herpesviridae (EBV-protein BARF 1 fragment) <400> 311 Gly Arg Met His His Asp Val Ile Phe Ile Glu Trp Pro Phe Arg 1 5 10 15 <210> 312 <211> 15 <212> PRT <213> Virus Herpesviridae (EBV-protein BARF 1 fragment) <400> 312 Asp Val Ile Phe Ile Glu Trp Pro Phe Arg Gly Phe Phe Asp Ile 1 5 10 15 <210> 313 <211> 15 <212> PRT <213> Virus Herpesviridae (EBV-protein BARF 1 fragment) <400> 313 Glu Trp Pro Phe Arg Gly Phe Phe Asp Ile His Arg Ser Ala Asn 1 5 10 15 <210> 314 <211> 15 <212> PRT <213> Virus Herpesviridae (EBV-protein BARF 1 fragment) <400> 314 Gly Phe Phe Asp Ile His Arg Ser Ala Asn Thr Phe Phe Leu Val 1 5 10 15 <210> 315 <211> 15 <212> PRT <213> Virus Herpesviridae (EBV-protein BARF 1 fragment) <400> 315 His Arg Ser Ala Asn Thr Phe Phe Leu Val Val Thr Ala Ala Asn 1 5 10 15 <210> 316 <211> 15 <212> PRT <213> Virus Herpesviridae (EBV-protein BARF 1 fragment) <400> 316 Thr Phe Phe Leu Val Val Thr Ala Ala Asn Ile Ser His Asp Gly 1 5 10 15 <210> 317 <211> 15 <212> PRT <213> Virus Herpesviridae (EBV-protein BARF 1 fragment) <400> 317 Val Thr Ala Ala Asn Ile Ser His Asp Gly Asn Tyr Leu Cys Arg 1 5 10 15 <210> 318 <211> 15 <212> PRT <213> Virus Herpesviridae (EBV-protein BARF 1 fragment) <400> 318 Ile Ser His Asp Gly Asn Tyr Leu Cys Arg Met Lys Leu Gly Glu 1 5 10 15 <210> 319 <211> 15 <212> PRT <213> Virus Herpesviridae (EBV-protein BARF 1 fragment) <400> 319 Asn Tyr Leu Cys Arg Met Lys Leu Gly Glu Thr Glu Val Thr Lys 1 5 10 15 <210> 320 <211> 15 <212> PRT <213> Virus Herpesviridae (EBV-protein BARF 1 fragment) <400> 320 Met Lys Leu Gly Glu Thr Glu Val Thr Lys Gln Glu His Leu Ser 1 5 10 15 <210> 321 <211> 15 <212> PRT <213> Virus Herpesviridae (EBV-protein BARF 1 fragment) <400> 321 Thr Glu Val Thr Lys Gln Glu His Leu Ser Val Val Lys Pro Leu 1 5 10 15 <210> 322 <211> 15 <212> PRT <213> Virus Herpesviridae (EBV-protein BARF 1 fragment) <400> 322 Gln Glu His Leu Ser Val Val Lys Pro Leu Thr Leu Ser Val His 1 5 10 15 <210> 323 <211> 15 <212> PRT <213> Virus Herpesviridae (EBV-protein BARF 1 fragment) <400> 323 Val Val Lys Pro Leu Thr Leu Ser Val His Ser Glu Arg Ser Gln 1 5 10 15 <210> 324 <211> 15 <212> PRT <213> Virus Herpesviridae (EBV-protein BARF 1 fragment) <400> 324 Val Leu Thr Val Thr Cys Thr Val Asn Ala Phe Pro His Pro His 1 5 10 15 <210> 325 <211> 15 <212> PRT <213> Virus Herpesviridae (EBV-protein BARF 1 fragment) <400> 325 Ser Glu Arg Ser Gln Phe Pro Asp Phe Ser Val Leu Thr Val Thr 1 5 10 15 <210> 326 <211> 15 <212> PRT <213> Virus Herpesviridae (EBV-protein BARF 1 fragment) <400> 326 Phe Pro Asp Phe Ser Val Leu Thr Val Thr Cys Thr Val Asn Ala 1 5 10 15 <210> 327 <211> 15 <212> PRT <213> Virus Herpesviridae (EBV-protein BARF 1 fragment) <400> 327 Val Leu Thr Val Thr Cys Thr Val Asn Ala Phe Pro His Pro His 1 5 10 15 <210> 328 <211> 15 <212> PRT <213> Virus Herpesviridae (EBV-protein BARF 1 fragment) <400> 328 Cys Thr Val Asn Ala Phe Pro His Pro His Val Gln Trp Leu Met 1 5 10 15 <210> 329 <211> 15 <212> PRT <213> Virus Herpesviridae (EBV-protein BARF 1 fragment) <400> 329 Phe Pro His Pro His Val Gln Trp Leu Met Pro Glu Gly Val Glu 1 5 10 15 <210> 330 <211> 15 <212> PRT <213> Virus Herpesviridae (EBV-protein BARF 1 fragment) <400> 330 Val Gln Trp Leu Met Pro Glu Gly Val Glu Pro Ala Pro Thr Ala 1 5 10 15 <210> 331 <211> 15 <212> PRT <213> Virus Herpesviridae (EBV-protein BARF 1 fragment) <400> 331 Pro Glu Gly Val Glu Pro Ala Pro Thr Ala Ala Asn Gly Gly Val 1 5 10 15 <210> 332 <211> 15 <212> PRT <213> Virus Herpesviridae (EBV-protein BARF 1 fragment) <400> 332 Pro Ala Pro Thr Ala Ala Asn Gly Gly Val Gly Ser Leu Ser Val 1 5 10 15 <210> 333 <211> 15 <212> PRT <213> Virus Herpesviridae (EBV-protein BARF 1 fragment) <400> 333 Ala Asn Gly Gly Val Gly Ser Leu Ser Val Ala Val Asp Leu Ser 1 5 10 15 <210> 334 <211> 15 <212> PRT <213> Virus Herpesviridae (EBV - protein BARF 1 fragment) <400> 334 Gly Ser Leu Ser Val Ala Val Asp Leu Ser Leu Pro Lys Pro Trp 1 5 10 15 <210> 335 <211> 15 <212> PRT <213> Virus Herpesviridae (EBV-protein BARF 1 fragment) <400> 335 Ala Val Asp Leu Ser Leu Pro Lys Pro Trp His Leu Pro Val Thr 1 5 10 15 <210> 336 <211> 15 <212> PRT <213> Virus Herpesviridae (EBV-protein BARF 1 fragment) <400> 336 Leu Pro Lys Pro Trp His Leu Pro Val Thr Cys Val Gly Lys Asn 1 5 10 15 <210> 337 <211> 15 <212> PRT <213> Virus Herpesviridae (EBV-protein BARF 1 fragment) <400> 337 His Leu Pro Val Thr Cys Val Gly Lys Asn Asp Lys Glu Glu Ala 1 5 10 15 <210> 338 <211> 15 <212> PRT <213> Virus Herpesviridae (EBV-protein BARF 1 fragment) <400> 338 Cys Val Gly Lys Asn Asp Lys Glu Glu Ala His Gly Val Tyr Val 1 5 10 15 <210> 339 <211> 15 <212> PRT <213> Virus Herpesviridae (EBV-protein BARF 1 fragment) <400> 339 Asp Lys Glu Glu Ala His Gly Val Tyr Val Ser Gly Tyr Leu Ser 1 5 10 15 <210> 340 <211> 220 <212> PRT <213> Virus Herpesviridae (EBV-protein BHRF 1) <400> 340 Met Ala Arg Phe Ile Ala Gln Leu Leu Leu Leu Ala Ser Cys Val Ala 1 5 10 15 Ala Gly Gln Ala Val Thr Ala Phe Leu Gly Glu Arg Val Thr Leu Thr 20 25 30 Ser Tyr Trp Arg Arg Val Ser Leu Gly Pro Glu Ile Glu Val Ser Trp 35 40 45 Phe Lys Leu Gly Pro Gly Glu Glu Gln Val Leu Ile Gly Arg Met His 50 55 60 His Asp Val Ile Phe Ile Glu Trp Pro Phe Arg Gly Phe Phe Asp Ile 65 70 75 80 His Arg Ser Ala Asn Thr Phe Phe Leu Val Val Thr Ala Ala Asn Ile 85 90 95 Ser His Asp Gly Asn Tyr Leu Cys Arg Met Lys Leu Gly Glu Thr Glu 100 105 110 Val Thr Lys Gln Glu His Leu Ser Val Val Lys Pro Leu Thr Leu Ser 115 120 125 Val His Ser Glu Arg Ser Gln Phe Pro Asp Phe Ser Val Leu Thr Val 130 135 140 Thr Cys Thr Val Asn Ala Phe Pro His Pro His Val Gln Trp Leu Met 145 150 155 160 Pro Glu Gly Val Glu Pro Ala Pro Thr Ala Ala Asn Gly Gly Val Met 165 170 175 Lys Glu Lys Asp Gly Ser Leu Ser Val Ala Val Asp Leu Ser Leu Pro 180 185 190 Lys Pro Trp His Leu Pro Val Thr Cys Val Gly Lys Asn Asp Lys Glu 195 200 205 Glu Ala His Gly Val Tyr Val Ser Gly Tyr Leu Ser 210 215 220

Claims (29)

  1. 항원 특이적 T 세포들, 예컨대 자가 항원 특이적 T 세포들을 실험실 내 증식시키는 방법으로서,
    a) 자가 PBMC 세포들의 집단을
    i) 표적 항원(들)과 관련된 펩타이드/펩타이드 혼합물로 펄스화된 수지상 세포들 또는 표적 항원(들)과 관련된 펩타이드/펩타이드 혼합물, 및
    ii) 적어도 하나의 사이토카인의 존재 하에 배양하는 단계, 및
    b) 단계 a)로부터의 T 세포들의 집단을
    i) 표적 항원(들)과 관련된 펩타이드/펩타이드 혼합물로 펄스화된 수지상 세포들 또는 표적 항원(들)과 관련된 펩타이드/펩타이드 혼합물 및 인공 공동자극 인자로 펄스화된 자가 항원 제시 T 세포들(T-APC들), 및
    ii) 임의로 사이토카인의 존재 하에 배양하는 단계를 포함하고,
    상기 방법은 생 바이러스 및/또는 바이러스 벡터들 또는 관련 T 세포 집단의 증식에서의 DNA 또는 RNA 코딩 항원들의 사용을 이용하지 않는 것을 특징으로 하는 방법.
  2. 청구항 1에 있어서, 단계 b)를 충분한 분량의 상기 관련 T 세포 집단이 얻어질 때까지 2회 이상(예컨대, 3회, 4회, 5회 이상) 수행하는 것인 방법.
  3. 청구항 1 또는 청구항 2에 있어서, 단계 a)의 상기 배양을 12일 이하 동안 수행하는 것인 방법.
  4. 청구항 1 내지 청구항 3 중 어느 한 항에 있어서, 단계 b)의 상기 배양 단계를 12일 이하 동안 수행하는 것인 방법.
  5. 청구항 1 내지 청구항 4 중 어느 한 항에 있어서, 배양을 가스 투과성 배양 표면을 포함하는 용기에서 수행하는 것인 방법.
  6. 청구항 1 내지 청구항 5 중 어느 한 항에 있어서, 상기 증식된 T 세포들은 엡스타인-바(Epstein-Barr) 바이러스, 백시니아(Vaccinia) 바이러스 또는 바리셀라 조스터(Varicella Zoster) 바이러스 항원 또는 항원들, 예컨대 EBV에 특이적인 것인 방법.
  7. 청구항 1 내지 청구항 6 중 어느 한 항에 있어서, 단계 a) 및/또는 b)의 상기 펩타이드들은 2개 내지 1000개의 펩타이드들, 예를 들면 2개 내지 500개의 펩타이드들, 2개 내지 300개의 펩타이드들 또는 2개 내지 100개의 펩타이드들을 포함하는 것인 방법.
  8. 청구항 1 내지 청구항 7 중 어느 한 항에 있어서, 단계 a) 및/또는 b)의 상기 펩타이드들은 예를 들면 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 11개, 12개, 13개, 14개, 15개 이상의 아미노산이 중첩되는 것인 방법.
  9. 청구항 1 내지 청구항 8 중 어느 한 항에 있어서, 단계 a) 및/또는 b)의 상기 펩타이드들은 약 10개, 11개, 12개, 13개, 14개, 15개, 16개, 17개, 18개, 19개 또는 20개의 길이의 아미노산들, 예컨대 15개의 길이의 아미노산들인 방법.
  10. 청구항 1 내지 청구항 9 중 어느 한 항에 있어서, 파트 a) 및/또는 b)의 상기 펩타이드들은 항원 LMP1의 부분 길이 또는 전부 길이를 포함하는 것인 방법.
  11. 청구항 1 내지 청구항 10 중 어느 한 항에 있어서, 파트 a) 및/또는 b)의 펩타이드들은 항원 LMP2개의 부분 길이 또는 전부 길이를 포함하는 것인 방법.
  12. 청구항 1 내지 청구항 11 중 어느 한 항에 있어서, 파트 a) 및/또는 b)의 펩타이드들은 항원 EBNA1의 부분 길이 또는 전체 길이를 포함하는 것인 방법.
  13. 청구항 1 내지 청구항 12 중 어느 한 항에 있어서, 파트 a) 및/또는 b)의 펩타이드들은 항원 BARF1의 부분 길이 또는 전체 길이를 포함하는 것인 방법.
  14. 청구항 1 내지 청구항 13 중 어느 한 항에 있어서, 단계 a)에 존재하는 상기 사이토카인은 IL-4인 방법.
  15. 청구항 1 내지 청구항 14 중 어느 한 항에 있어서, 단계 a)에 존재하는 상기 사이토카인은 IL-7인 방법.
  16. 청구항 1 내지 청구항 15 중 어느 한 항에 있어서, 단계 b)에 존재하는 상기 사이토카인은 IL-15인 방법.
  17. 청구항 1 내지 청구항 15 중 어느 한 항에 있어서, 상기 인공 공동자극 인자는 하나 이상의 관련 단백질 또는 단백질 단편들이 세포 표면 상에 존재하는 조작된 세포주, 예컨대 aK562 세포인 방법.
  18. 청구항 17에 있어서, 상기 단백질 또는 단백질 단편들은 CD80, CD86, CD83, OX-40 리간드 및 41BB 리간드로부터 독립적으로 선택되는 것인 방법.
  19. 청구항 18에 있어서, 상기 단백질 또는 단백질 단편들은 모두 공동자극 세포의 표면 상에 존재하는 것인 방법.
  20. 청구항 1 내지 청구항 19 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법을 GRex™ 시스템에서 수행하는 것인 방법.
  21. 청구항 1 내지 청구항 20 중 어느 한 항에 정의된 방법으로부터 얻을 수 있거나 얻은 증식된 자가 또는 동종 T 세포 생성물.
  22. 청구항 21에 있어서, 하나 이상의 표적 세포 집단들은 바이러스 벡터들을 이용하여 증식되고 특정한 표적 항원들을 과발현하는 EBV-LCL들로 재자극된 세포들과 비교하여 필적하는 표적 항원 특이성을 갖는 것인 증식된 자가 또는 동종 T 세포 생성물.
  23. 청구항 21 또는 청구항 22에 있어서, 하나 이상의 표적 세포 집단들은 바이러스 벡터들을 이용하여 증식되고 특정한 표적 항원들을 과발현하는 EBV-LCL들로 재자극된 세포들보다 소정의 시점에서 더 높은 표적-항원 특이성을 갖는 것인 증식된 자가 또는 동종 T 세포 생성물.
  24. 청구항 21 내지 청구항 23 중 어느 한 항에 정의된 증식된 T 세포 생성물 및 부형제, 담체, 안정화제, 계면활성제 또는 다른 비치료학적 활성 성분을 포함하는 약제학적 조성물.
  25. 청구항 21 내지 청구항 23 중 어느 한 항에 정의된 증식된 T 세포 생성물 또는 청구항 24에 정의된 약제학적 조성물의 적절한 용량의 투여에 의한 바이러스에 의해 유도된 바이러스 감염 환자 또는 암 환자, 예컨대 면역억제 환자를 치료하는 방법.
  26. T 세포들, 예컨대 자가 T 세포들의 항원 특이적 증식에서의, 항원의 동시 제시 없이 인공 공동자극 인자로서의 조작된 세포주, 예컨대 aK562 세포의 용도.
  27. 항원 특이적 T 세포들의 증식을 위한, 항원-펩타이드/펩타이드 혼합물들로 펄스화된 수지상 세포들의 용도.
  28. 항원 특이적 T 세포들의 증식을 위한, 항원-펩타이드/펩타이드 혼합물들로 펄스화된 T-APC들의 용도.
  29. 항원 특이적 T 세포들의 증식을 위한, PBMC들과의 항원-펩타이드 혼합물들의 용도.
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