JP2019533463A - 遺伝子組換えにより内在性foxp3遺伝子の発現が安定化されたcd4 t細胞を使用した自己免疫疾患の治療方法 - Google Patents
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Abstract
Description
本明細書において「核酸」または「核酸分子」は、ポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドを指し、たとえば、デオキシリボ核酸(DNA)またはリボ核酸(RNA)、オリゴヌクレオチド、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)により得られた断片、ならびにライゲーション、切断、エンドヌクレアーゼ作用、エキソヌクレアーゼ作用および合成のいずれかにより得られた断片などが挙げられる。核酸分子は、天然のヌクレオチドモノマー(DNA、RNAなど)、または天然のヌクレオチドの類似体(たとえば、天然のヌクレオチドのエナンチオマー)からなるモノマー、またはこれらの組み合わせから構成されていてもよい。修飾ヌクレオチドは、糖部分および/またはピリミジン塩基部分もしくはプリン塩基部分に修飾を有していてもよい。糖部分の修飾としては、たとえば、ハロゲン、アルキル基、アミンおよびアジド基による1つ以上のヒドロキシル基の置換が挙げられ、糖部分はエーテル化またはエステル化されていてもよい。さらに、糖部分全体が、立体構造的に類似の構造や電子的に類似の構造と置換されていてもよく、このような構造として、たとえば、アザ糖および炭素環式糖類似体が挙げられる。修飾塩基部分としては、アルキル化プリン、アルキル化ピリミジン、アシル化プリン、アシル化ピリミジン、およびその他の公知の複素環置換基が挙げられる。核酸モノマーは、ホスホジエステル結合またはこれと似た結合により連結することができる。ホスホジエステル結合と似た結合としては、ホスホロチオエート結合、ホスホロジチオエート結合、ホスホロセレノエート結合、ホスホロジセレノエート結合、ホスホロアニロチオエート(phosphoroanilothioate)結合、ホスホロアニリデート(phosphoranilidate)結合またはホスホロアミデート結合が挙げられる。「核酸分子」は、いわゆる「ペプチド核酸」も包含し、これは、ポリアミド主鎖に付加された天然の核酸塩基または修飾核酸塩基を含む。核酸は、一本鎖であってもよく、二本鎖であってもよい。
制御性T細胞は、抗原特異的免疫寛容を誘導できる可能性があることから、制御性T細胞による自己免疫疾患の治療に興味を持っている研究グループは多い。制御性T細胞(「Treg」)には様々な形態があり、現在の命名法によれば、T細胞の発生過程において胸腺で生じる制御性T細胞(胸腺由来制御性T細胞または「tTreg」と呼ばれる)と、末梢で誘導される制御性T細胞(末梢由来制御性T細胞または「pTreg」と呼ばれる)とに分類される。
図6に示すように、MNDプロモーターの制御下で、内在性FOXP3遺伝子のN末端に融合したGFPを発現するように遺伝子組換えした細胞は、TALENヌクレアーゼを導入しなかったT細胞よりも、GFP-FOXP3融合タンパク質の発現量が多かった。図7に示すように、遺伝子編集細胞では、シームレスな相同組換えにより標的部位への組み込みが行われたことが示されている。図7に示した実験では、図に示したプライマーセット(すなわち、図の赤色の矢印で示す位置に対応するプライマー)を使用してPCRを実施し、得られたPCR産物をアガロースゲル電気泳動で分析した。標的化された組み込みが正確に起こった場合、標的テンプレートの外側の1種のプライマー(プライマー1またはプライマー2)と内側の1種のプライマー(プライマー3またはプライマー4)とを使用したPCRを実施することによって、正確な大きさのバンドが示される。左側のゲル片は、mock遺伝子編集細胞において標的が組み込まれていないことを示し、右側のゲル片は、遺伝子編集細胞において正確な大きさのバンドが見られることを示す。
図10は、Treg細胞の表面マーカーの表現型とサイトカインの表現型を示す模式図を示す。遺伝子編集細胞が特定の表面マーカーの表現型を有しているかどうかを確認することが望ましい。図11に示すように、フローサイトメトリーを使用して、FOXP3を安定に発現した遺伝子組換えT細胞におけるCD25、CD127、CTLA4およびLAG3の発現を分析した。内在性制御性T細胞と同様に、遺伝子組換え細胞は、CD25を高発現し、CD127を低発現し、CTLA4およびLag3を高発現することが示された。
制御性T細胞の抑制活性を測定するためのアッセイの概要を図16に示す。CFSEで標識した応答細胞を、遺伝子編集Tregまたはmock遺伝子編集細胞と混合し、ビーズで刺激する。96時間後のCFSEの希釈度からアッセイの結果を読み取る。
遺伝子編集により強いプロモーターを初代ヒトT細胞に導入することによって、Foxp3の発現を増強することができ、安定なTreg表現型を得ることができる。CD4+T細胞における遺伝子編集は効率的に行うことができ、Foxp3を安定に高発現させることができる。遺伝子発現は、内在性遺伝子座に制限されることも示された。遺伝子編集細胞は、Tregの機能特性(pSTAT5および細胞内サイトカイン産生)、Tregの表面表現型およびインビトロにおけるTregの機能性(エフェクターT細胞の抑制)を示した。抗原特異的T細胞を使用して、FOXP3発現を誘導するための遺伝子編集を行うこともできる。GvHDマウスモデルを確立することができれば、FOXP3発現遺伝子編集T細胞のインビボにおける機能性試験を行うことが可能であろう。
図21に示すように、FOXP3を安定に発現するT細胞は、表現型の変化(CD25+、CD45RO+、CCR7、CD38/CTLA-4/LAP)を示した。また、このFOXP3安定発現T細胞は、Tregと同様の細胞内サイトカイン発現プロファイル(IL-2、IFN-γおよびIL-4)を示す。さらに、10ng〜100ngのIL-2を投与したところ、pSTAT5シグナル伝達はIL-2に感受性を示した。したがって、FOXP3安定発現T細胞は、Tregと同様の細胞内サイトカイン発現プロファイルを示す。
インビボGvHD実験を実施するためのスケジュールを図22に示す。まず、マウスに放射線を照射し、骨髄細胞を破壊する。次に、FOXP3を安定に発現するTreg表現型遺伝子組換え細胞をマウスに輸注し、次いでTeff細胞を輸注する。輸注の1〜50日後に、マウスの体重をモニタリングし、末梢血および様々な臓器におけるT細胞の割合(%)を調べる。
遺伝子編集T細胞の胸腺特異的脱メチル化領域(TSDR)におけるCpGメチル化の概要を図24に示す。FOXP3遺伝子は、第1のコーディングエクソン(エクソン2)の上流の制御領域のメチル化によって制御される。
いくつかの実施形態において、タンパク質の発現に対するエピジェネティックな制御をバイパスすることができる核酸を作製する方法を提供する。いくつかの実施形態において、前記タンパク質はFOXP3である。いくつかの実施形態において、FOXP3を発現させるための核酸を作製する方法を提供する。該方法は、1つ以上の制御因子とFOXP3遺伝子またはその一部とを含むコード鎖を含む第1のヌクレオチド配列を提供すること;ヌクレアーゼを提供すること;および前記1つ以上の制御因子を編集し、かつ任意でFOXP3遺伝子またはその一部を編集することにより、前記第1のヌクレオチド配列の遺伝子編集を行うことを含む。いくつかの実施形態において、前記第1のヌクレオチド配列は標的遺伝子座を含む。いくつかの実施形態において、第1の標的遺伝子座は、第1のコーディングエクソンを含む。いくつかの実施形態において、前記遺伝子編集を行った後の前記標的遺伝子座は、第1のコーディングエクソンを含む。いくつかの実施形態において、前記標的遺伝子座は、前記1つ以上の制御因子に存在する。いくつかの実施形態において、前記標的遺伝子座は、前記FOXP3遺伝子またはその一部に存在し、前記FOXP3遺伝子またはその一部は、第1のコーディングエクソンを含む。いくつかの実施形態において、前記ヌクレアーゼは、Cas9、ジンクフィンガーヌクレアーゼまたはTALENである。いくつかの実施形態において、前記遺伝子編集は、異種プロモーター、異種転写エンハンサー領域、またはこれらの両方を挿入するための遺伝子ノックインである。いくつかの実施形態において、前記異種プロモーターは構成的プロモーターである。いくつかの実施形態において、前記プロモーターは、EF1αプロモーター、PGKプロモーターまたはMNDプロモーターである。いくつかの実施形態において、前記プロモーターは、弱い異種プロモーター(たとえば、内在性プロモーターおよび/または構成的プロモーターよりも活性または転写効率が低いプロモーター)である。いくつかの実施形態において、前記プロモーターは誘導型プロモーターである。いくつかの実施形態において、前記誘導型プロモーターは、薬物またはステロイドによって誘導可能である。いくつかの実施形態において、前記方法は、1つ以上の異種転写エンハンサー領域を挿入することをさらに含む。いくつかの実施形態において、前記方法は、1つ以上の異種転写活性化領域を挿入することをさらに含む。いくつかの実施形態において、前記方法は、遍在性クロマチンオープニングエレメント(UCOE)を挿入することをさらに含む。いくつかの実施形態において、前記方法は、誘導型エフェクターを挿入することをさらに含む。いくつかの実施形態において、前記誘導型エフェクターは、ステロイドまたは薬物によって誘導可能である。いくつかの実施形態において、前記コード鎖上の前記第1のコーディングエクソンの上流の任意の位置に前記異種プロモーターを挿入し、該遺伝子編集によって該第1のコーディングエクソンがエクソンを生じ、該コード鎖は、FOXP3遺伝子の開始コドンをさらに含む。いくつかの実施形態において、前記コード鎖上の前記1つ以上の制御因子の下流に前記異種プロモーターを挿入する。いくつかの実施形態において、前記方法は、前記1つ以上の制御因子を遺伝子組換えすることをさらに含む。
いくつかの実施形態において、タンパク質の発現に対するエピジェネティックな制御をバイパスするための核酸を提供する。いくつかの実施形態において、前記タンパク質はFOXP3である。いくつかの実施形態において、第1のコーディングエクソンを含むFOXP3遺伝子またはその一部に作動可能に連結された異種制御因子および異種プロモーターを含むコード鎖を含む核酸を提供する。いくつかの実施形態において、前記異種プロモーターは構成的プロモーターである。いくつかの実施形態において、前記構成的プロモーターは、EF1αプロモーター、PGKプロモーターまたはMNDプロモーターである。いくつかの実施形態において、前記異種プロモーターは、弱いプロモーター(たとえば、内在性プロモーターおよび/または構成的プロモーターよりも活性または転写効率が低いプロモーター)である。いくつかの実施形態において、前記プロモーターは誘導型プロモーターである。いくつかの実施形態において、前記誘導型プロモーターは、薬物またはステロイドによって誘導可能である。いくつかの実施形態において、前記異種プロモーターは、前記第1のコーディングエクソンの上流に挿入されている。いくつかの実施形態において、前記核酸は、1つ以上の異種転写エンハンサー領域をさらに含む。いくつかの実施形態において、前記核酸は、1つ以上の異種転写活性化領域をさらに含む。いくつかの実施形態において、前記核酸は、遍在性クロマチンオープニングエレメント(UCOE)をさらに含む。いくつかの実施形態において、前記コード鎖上の前記1つ以上の制御因子の下流に前記異種プロモーターを挿入する。いくつかの実施形態において、前記1つ以上の制御因子は、遺伝子組換えされている。
いくつかの実施形態において、エピジェネティックな制御をバイパスすることができる遺伝子組換え細胞を作製する方法を提供する。いくつかの実施形態において、遺伝子組換え細胞を作製する方法であって、1つ以上の制御因子とFOXP3遺伝子またはその一部とを含むコード鎖を含む第1のヌクレオチド配列を含む細胞を提供すること;ヌクレアーゼをコードする第2のヌクレオチド配列またはヌクレアーゼタンパク質を提供すること;および前記第2のオリゴヌクレオチドまたは前記ヌクレアーゼタンパク質を前記細胞に導入することにより遺伝子組換えを行うことを含む方法を提供する。いくつかの実施形態において、前記遺伝子組換えは、前記第1のヌクレオチド配列に異種プロモーターを挿入するための遺伝子ノックインである。いくつかの実施形態において、前記コード鎖は、第1のコーディングエクソンを含む。いくつかの実施形態において、前記第1のヌクレオチド配列は標的遺伝子座を含む。いくつかの実施形態において、前記標的遺伝子座は、第1のコーディングエクソンに存在する。いくつかの実施形態において、前記標的遺伝子座は、前記第1のコーディングエクソンの上流の10塩基対以内に存在するか、20塩基対以内に存在するか、30塩基対以内に存在するか、40塩基対以内に存在するか、50塩基対以内に存在するか、60塩基対以内に存在するか、70塩基対以内に存在するか、80塩基対以内に存在するか、90塩基対以内に存在するか、100塩基対以内に存在するか、もしくは110塩基対以内に存在するか、またはこれらの数値のいずれか2つによって定義される範囲内の数の塩基対以内に存在する。いくつかの実施形態において、前記遺伝子編集は、合成された第1のコーディングエクソンを生成することをさらに含む。いくつかの実施形態において、前記ヌクレアーゼは、Cas9、ジンクフィンガーヌクレアーゼまたはTALENである。いくつかの実施形態において、前記異種プロモーターは構成的プロモーターである。いくつかの実施形態において、前記異種プロモーターは、EF1αプロモーター、PGKプロモーターまたはMNDプロモーターである。いくつかの実施形態において、前記異種プロモーターは、弱いプロモーター(たとえば、内在性プロモーターおよび/または構成的プロモーターよりも活性または転写効率が低いプロモーター)である。いくつかの実施形態において、前記異種プロモーターは、誘導型プロモーターである。いくつかの実施形態において、前記誘導型プロモーターは、薬物またはステロイドによって誘導可能である。いくつかの実施形態において、前記方法は、前記第1のヌクレオチド配列に1つ以上の異種エンハンサー領域を挿入することをさらに含む。いくつかの実施形態において、前記方法は、前記第1のヌクレオチド配列に1つ以上の異種転写活性化領域を挿入することをさらに含む。いくつかの実施形態において、前記方法は、前記第1のヌクレオチド配列に遍在性クロマチンオープニングエレメント(UCOE)を挿入することをさらに含む。いくつかの実施形態において、前記コード鎖上の第1のコーディングエクソンの上流、または前記遺伝子編集によって作製された合成の第1のコーディングエクソンの上流に、前記異種プロモーターを挿入する。いくつかの実施形態において、前記コード鎖上の前記1つ以上の制御因子の下流に前記異種プロモーターを挿入する。いくつかの実施形態において、前記方法は、前記1つ以上の制御因子を遺伝子組換えすることをさらに含む。いくつかの実施形態において、前記細胞は前駆・幹細胞である。いくつかの実施形態において、前記細胞は造血幹細胞である。いくつかの実施形態において、前記細胞はCD4+発現細胞である。いくつかの実施形態において、前記細胞はCD8+発現細胞である。いくつかの実施形態において、前記細胞は制御性T細胞である。
いくつかの実施形態において、タンパク質の発現に対するエピジェネティックな制御をバイパスするための遺伝子組換え細胞を提供する。いくつかの実施形態において、前記タンパク質はFOXP3である。いくつかの実施形態において、本発明に記載の方法のいずれか1つによって作製された、FOXP3を発現させるための遺伝子組換え細胞を提供する。前記方法は、1つ以上の制御因子とFOXP3遺伝子またはその一部とを含むコード鎖を含む第1のヌクレオチド配列を含む細胞を提供すること;ヌクレアーゼをコードする第2のヌクレオチド配列またはヌクレアーゼタンパク質を提供すること;および前記第2のオリゴヌクレオチドまたは前記ヌクレアーゼタンパク質を前記細胞に導入することにより遺伝子組換えを行うことを含む。いくつかの実施形態において、前記遺伝子組換えは、前記第1のヌクレオチド配列に異種プロモーターを挿入するための遺伝子ノックインである。いくつかの実施形態において、前記コード鎖は、第1のコーディングエクソンを含む。いくつかの実施形態において、前記第1のヌクレオチド配列は標的遺伝子座を含む。いくつかの実施形態において、前記標的遺伝子座は、第1のコーディングエクソンに存在する。いくつかの実施形態において、前記標的遺伝子座は、前記第1のコーディングエクソンの上流の10塩基対以内に存在するか、20塩基対以内に存在するか、30塩基対以内に存在するか、40塩基対以内に存在するか、50塩基対以内に存在するか、60塩基対以内に存在するか、70塩基対以内に存在するか、80塩基対以内に存在するか、90塩基対以内に存在するか、100塩基対以内に存在するか、もしくは110塩基対以内に存在するか、またはこれらの数値のいずれか2つによって定義される範囲内の数の塩基対以内に存在する。いくつかの実施形態において、前記遺伝子編集は、合成された第1のコーディングエクソンを生成することをさらに含む。いくつかの実施形態において、前記ヌクレアーゼは、Cas9、ジンクフィンガーヌクレアーゼまたはTALENである。いくつかの実施形態において、前記異種プロモーターは構成的プロモーターである。いくつかの実施形態において、前記異種プロモーターは、EF1αプロモーター、PGKプロモーターまたはMNDプロモーターである。いくつかの実施形態において、前記異種プロモーターは、弱いプロモーター(たとえば、内在性プロモーターおよび/または構成的プロモーターよりも活性または転写効率が低いプロモーター)である。いくつかの実施形態において、前記異種プロモーターは、誘導型プロモーターである。いくつかの実施形態において、前記誘導型プロモーターは、薬物またはステロイドによって誘導可能である。いくつかの実施形態において、前記方法は、前記第1のヌクレオチド配列に1つ以上の異種エンハンサー領域を挿入することをさらに含む。いくつかの実施形態において、前記方法は、前記第1のヌクレオチド配列に1つ以上の異種転写活性化領域を挿入することをさらに含む。いくつかの実施形態において、前記方法は、前記第1のヌクレオチド配列に遍在性クロマチンオープニングエレメント(UCOE)を挿入することをさらに含む。いくつかの実施形態において、前記コード鎖上の第1のコーディングエクソンの上流、または前記遺伝子編集によって作製された合成の第1のコーディングエクソンの上流に、前記異種プロモーターを挿入する。いくつかの実施形態において、前記コード鎖上の前記1つ以上の制御因子の下流に前記異種プロモーターを挿入する。いくつかの実施形態において、前記方法は、前記1つ以上の制御因子を遺伝子組換えすることをさらに含む。いくつかの実施形態において、前記細胞は前駆・幹細胞である。いくつかの実施形態において、前記細胞は造血幹細胞である。いくつかの実施形態において、前記細胞はCD4+発現細胞である。いくつかの実施形態において、前記細胞はCD8+発現細胞である。いくつかの実施形態において、前記細胞は制御性T細胞である。
本発明の開示は、疾患または障害を有する対象において細胞免疫療法を行うための組成物を利用または使用する方法を提供する。いくつかの実施形態において、前記組成物は、本発明の実施形態のいずれか1つに記載の遺伝子組換え細胞と、医薬賦形剤とを含む。前記細胞は、本発明に記載の方法のいずれか1つによって作製された、FOXP3を発現させるための遺伝子組換え細胞である。前記方法は、1つ以上の制御因子とFOXP3遺伝子またはその一部とを含むコード鎖を含む第1のヌクレオチド配列を含む細胞を提供すること;ヌクレアーゼをコードする第2のヌクレオチド配列またはヌクレアーゼタンパク質を提供すること;および前記第2のオリゴヌクレオチドまたは前記ヌクレアーゼタンパク質を前記細胞に導入することにより遺伝子組換えを行うことを含む。いくつかの実施形態において、前記遺伝子組換えは、前記第1のヌクレオチド配列に異種プロモーターを挿入するための遺伝子ノックインである。いくつかの実施形態において、前記コード鎖は、第1のコーディングエクソンを含む。いくつかの実施形態において、前記第1のヌクレオチド配列は標的遺伝子座を含む。いくつかの実施形態において、前記標的遺伝子座は、第1のコーディングエクソンに存在する。いくつかの実施形態において、前記標的遺伝子座は、前記第1のコーディングエクソンの上流の10塩基対以内に存在するか、20塩基対以内に存在するか、30塩基対以内に存在するか、40塩基対以内に存在するか、50塩基対以内に存在するか、60塩基対以内に存在するか、70塩基対以内に存在するか、80塩基対以内に存在するか、90塩基対以内に存在するか、100塩基対以内に存在するか、もしくは110塩基対以内に存在するか、またはこれらの数値のいずれか2つによって定義される範囲内の数の塩基対以内に存在する。いくつかの実施形態において、前記遺伝子編集は、合成された第1のコーディングエクソンを生成することをさらに含む。いくつかの実施形態において、前記ヌクレアーゼは、Cas9、ジンクフィンガーヌクレアーゼまたはTALENである。いくつかの実施形態において、前記異種プロモーターは構成的プロモーターである。いくつかの実施形態において、前記異種プロモーターは、EF1αプロモーター、PGKプロモーターまたはMNDプロモーターである。いくつかの実施形態において、前記異種プロモーターは、弱いプロモーター(たとえば、内在性プロモーターおよび/または構成的プロモーターよりも活性または転写効率が低いプロモーター)である。いくつかの実施形態において、前記異種プロモーターは、誘導型プロモーターである。いくつかの実施形態において、前記誘導型プロモーターは、薬物またはステロイドによって誘導可能である。いくつかの実施形態において、前記方法は、前記第1のヌクレオチド配列に1つ以上の異種エンハンサー領域を挿入することをさらに含む。いくつかの実施形態において、前記方法は、前記第1のヌクレオチド配列に1つ以上の異種転写活性化領域を挿入することをさらに含む。いくつかの実施形態において、前記方法は、前記第1のヌクレオチド配列に遍在性クロマチンオープニングエレメント(UCOE)を挿入することをさらに含む。いくつかの実施形態において、前記コード鎖上の第1のコーディングエクソンの上流、または前記遺伝子編集によって作製された合成の第1のコーディングエクソンの上流に、前記異種プロモーターを挿入する。いくつかの実施形態において、前記コード鎖上の前記1つ以上の制御因子の下流に前記異種プロモーターを挿入する。いくつかの実施形態において、前記方法は、前記1つ以上の制御因子を遺伝子組換えすることをさらに含む。いくつかの実施形態において、前記細胞は前駆・幹細胞である。いくつかの実施形態において、前記細胞は造血幹細胞である。いくつかの実施形態において、前記細胞はCD4+発現細胞である。いくつかの実施形態において、前記細胞はCD8+発現細胞である。いくつかの実施形態において、前記細胞は制御性T細胞である。
いくつかの実施形態において、対象における自己免疫疾患を治療、抑制または緩和する方法であって、本明細書において提供する実施形態のいずれか1つに記載の遺伝子組換え細胞、または本明細書において提供する実施形態のいずれか1つに記載の組成物を対象に投与することを含む方法を提供する。いくつかの実施形態において、前記組成物は、本発明の実施形態のいずれか1つに記載の遺伝子組換え細胞と、医薬賦形剤とを含む。前記細胞は、本発明に記載の方法のいずれか1つによって作製された、FOXP3を発現させるための遺伝子組換え細胞である。前記方法は、1つ以上の制御因子とFOXP3遺伝子またはその一部とを含むコード鎖を含む第1のヌクレオチド配列を含む細胞を提供すること;ヌクレアーゼをコードする第2のヌクレオチド配列またはヌクレアーゼタンパク質を提供すること;および前記第2のオリゴヌクレオチドまたは前記ヌクレアーゼタンパク質を前記細胞に導入することにより遺伝子組換えを行うことを含む。いくつかの実施形態において、前記遺伝子組換えは、前記第1のヌクレオチド配列に異種プロモーターを挿入するための遺伝子ノックインである。いくつかの実施形態において、前記コード鎖は、第1のコーディングエクソンを含む。いくつかの実施形態において、前記第1のヌクレオチド配列は標的遺伝子座を含む。いくつかの実施形態において、前記標的遺伝子座は、第1のコーディングエクソンに存在する。いくつかの実施形態において、前記標的遺伝子座は、前記第1のコーディングエクソンの上流の10塩基対以内に存在するか、20塩基対以内に存在するか、30塩基対以内に存在するか、40塩基対以内に存在するか、50塩基対以内に存在するか、60塩基対以内に存在するか、70塩基対以内に存在するか、80塩基対以内に存在するか、90塩基対以内に存在するか、100塩基対以内に存在するか、もしくは110塩基対以内に存在するか、またはこれらの数値のいずれか2つによって定義される範囲内の数の塩基対以内に存在する。いくつかの実施形態において、前記遺伝子編集は、合成された第1のコーディングエクソンを生成することをさらに含む。いくつかの実施形態において、前記ヌクレアーゼは、Cas9、ジンクフィンガーヌクレアーゼまたはTALENである。いくつかの実施形態において、前記異種プロモーターは構成的プロモーターである。いくつかの実施形態において、前記異種プロモーターは、EF1αプロモーター、PGKプロモーターまたはMNDプロモーターである。いくつかの実施形態において、前記異種プロモーターは、弱いプロモーター(たとえば、内在性プロモーターおよび/または構成的プロモーターよりも活性または転写効率が低いプロモーター)である。いくつかの実施形態において、前記異種プロモーターは、誘導型プロモーターである。いくつかの実施形態において、前記誘導型プロモーターは、薬物またはステロイドによって誘導可能である。いくつかの実施形態において、前記方法は、前記第1のヌクレオチド配列に1つ以上の異種エンハンサー領域を挿入することをさらに含む。いくつかの実施形態において、前記方法は、前記第1のヌクレオチド配列に1つ以上の異種転写活性化領域を挿入することをさらに含む。いくつかの実施形態において、前記方法は、前記第1のヌクレオチド配列に遍在性クロマチンオープニングエレメント(UCOE)を挿入することをさらに含む。いくつかの実施形態において、前記コード鎖上の第1のコーディングエクソンの上流、または前記遺伝子編集によって作製された合成の第1のコーディングエクソンの上流に、前記異種プロモーターを挿入する。いくつかの実施形態において、前記コード鎖上の前記1つ以上の制御因子の下流に前記異種プロモーターを挿入する。いくつかの実施形態において、前記方法は、前記1つ以上の制御因子を遺伝子組換えすることをさらに含む。いくつかの実施形態において、前記細胞は前駆・幹細胞である。いくつかの実施形態において、前記細胞は造血幹細胞である。いくつかの実施形態において、前記細胞はCD4+発現細胞である。いくつかの実施形態において、前記細胞はCD8+発現細胞である。いくつかの実施形態において、前記細胞は制御性T細胞である。
いくつかの実施形態において、FOXP3を発現させるための核酸を作製する方法であって、1つ以上の制御因子とFOXP3遺伝子またはその一部とを含むコード鎖を含む第1のヌクレオチド配列を提供すること;ヌクレアーゼを提供すること;および前記1つ以上の制御因子を編集し、かつ任意でFOXP3遺伝子またはその一部を編集することにより、前記第1のヌクレオチド配列の遺伝子編集を行うことを含む方法を提供する。いくつかの実施形態において、前記第1のヌクレオチド配列は標的遺伝子座を含む。いくつかの実施形態において、前記標的遺伝子座は、内在性の第1のコーディングエクソンを含む。いくつかの実施形態において、前記遺伝子編集を行うことにより、前記標的遺伝子座において第1のコーディングエクソンが生じる。いくつかの実施形態において、前記標的遺伝子座は、前記1つ以上の制御因子に存在する。いくつかの実施形態において、前記標的遺伝子座は、前記FOXP3遺伝子またはその一部に存在する。いくつかの実施形態において、前記FOXP3遺伝子またはその一部は、内在性の第1のコーディングエクソンを含む。いくつかの実施形態において、前記ヌクレアーゼは、Cas9、ジンクフィンガーヌクレアーゼまたはTALENである。いくつかの実施形態において、前記遺伝子編集は、異種プロモーター、異種転写エンハンサー領域、またはこれらの両方を挿入するための遺伝子ノックインである。いくつかの実施形態において、前記異種プロモーターは構成的プロモーターである。いくつかの実施形態において、前記プロモーターは、EF1αプロモーター、PGKプロモーターまたはMNDプロモーターである。いくつかの実施形態において、前記プロモーターは、弱い異種プロモーター(たとえば、内在性プロモーターおよび/または構成的プロモーターよりも発現が低くなるプロモーター)である。いくつかの実施形態において、前記プロモーターは誘導型プロモーターである。いくつかの実施形態において、前記誘導型プロモーターは、薬物またはステロイドによって誘導可能である。いくつかの実施形態において、前記方法は、前記1つ以上の制御配列の上流または下流に異種転写エンハンサー領域を挿入することをさらに含む。いくつかの実施形態において、前記方法は、異種転写活性化領域を挿入することをさらに含む。いくつかの実施形態において、前記方法は、遍在性クロマチンオープニングエレメント(UCOE)を挿入することをさらに含む。いくつかの実施形態において、前記方法は、誘導型エフェクターを挿入することをさらに含む。いくつかの実施形態において、前記誘導型エフェクターは、ステロイドまたは薬物によって誘導可能である。いくつかの実施形態において、前記異種プロモーターを挿入することにより、第1のコーディングエクソンが生じ、該異種プロモーターは、前記コード鎖上の該第1のコーディングエクソンの上流の任意の位置に存在し、該コード鎖は、FOXP3遺伝子の開始コドンをさらに含む。いくつかの実施形態において、前記コード鎖上の内在性の第1のコーディングエクソンの上流の任意の位置に前記異種プロモーターを挿入し、該コード鎖は、FOXP3遺伝子の開始コドンをさらに含む。いくつかの実施形態において、前記コード鎖上の前記1つ以上の制御因子の下流に前記異種プロモーターを挿入する。いくつかの実施形態において、前記方法は、前記1つ以上の制御因子を遺伝子組換えすることをさらに含む。
Claims (95)
- FOXP3を発現させるための核酸を作製する方法であって、
1つ以上の制御因子とFOXP3遺伝子またはその一部とを含むコード鎖を含む第1のヌクレオチド配列を提供すること;
ヌクレアーゼを提供すること;および
前記1つ以上の制御因子を編集し、かつ任意でFOXP3遺伝子またはその一部を編集することにより、前記第1のヌクレオチド配列の遺伝子編集を行うこと
を含む方法。 - 前記第1のヌクレオチド配列が標的遺伝子座を含む、請求項1に記載の方法。
- 前記標的遺伝子座が、内在性の第1のコーディングエクソンを含む、請求項2に記載の方法。
- 前記遺伝子編集を行うことにより、前記標的遺伝子座において第1のコーディングエクソンが生じる、請求項2に記載の方法。
- 前記標的遺伝子座が、前記1つ以上の制御因子に存在する、請求項2〜4のいずれか1項に記載の方法。
- 前記標的遺伝子座が、前記FOXP3遺伝子またはその一部に存在する、請求項2〜4のいずれか1項に記載の方法。
- 前記FOXP3遺伝子またはその一部が、内在性の第1のコーディングエクソンを含む、請求項3、5および6のいずれか1項に記載の方法。
- 前記ヌクレアーゼが、Cas9、ジンクフィンガーヌクレアーゼまたはTALENである、請求項1〜7のいずれか1項に記載の方法。
- 前記遺伝子編集が、異種プロモーター、異種転写エンハンサー領域、またはこれらの両方を挿入するための遺伝子ノックインである、請求項1〜8のいずれか1項に記載の方法。
- 前記異種プロモーターが、構成的プロモーターである、請求項9に記載の方法。
- 前記プロモーターが、EF1αプロモーター、PGKプロモーターまたはMNDプロモーターである、請求項10に記載の方法。
- 前記プロモーターが、弱い異種プロモーター(たとえば、内在性プロモーターおよび/または構成的プロモーターよりも発現が低くなるプロモーター)である、請求項9に記載の方法。
- 前記プロモーターが、誘導型プロモーターである、請求項9に記載の方法。
- 前記誘導型プロモーターが、薬物またはステロイドによって誘導可能である、請求項13に記載の方法。
- 前記1つ以上の制御配列の上流または下流に異種転写エンハンサー領域を挿入することをさらに含む、請求項1〜14のいずれか1項に記載の方法。
- 異種転写活性化領域を挿入することをさらに含む、請求項1〜15のいずれか1項に記載の方法。
- 遍在性クロマチンオープニングエレメント(UCOE)を挿入することをさらに含む、請求項1〜16のいずれか1項に記載の方法。
- 誘導型エフェクターを挿入することをさらに含む、請求項1〜17のいずれか1項に記載の方法。
- 前記誘導型エフェクターが、ステロイドまたは薬物によって誘導可能である、請求項18に記載の方法。
- 前記異種プロモーターを挿入することにより、第1のコーディングエクソンが生じ、該異種プロモーターが、前記コード鎖上の該第1のコーディングエクソンの上流の任意の位置に存在し、該コード鎖が、FOXP3遺伝子の開始コドンをさらに含む、請求項9〜19のいずれか1項に記載の方法。
- 前記コード鎖上の内在性の第1のコーディングエクソンの上流の任意の位置に前記異種プロモーターを挿入し、該コード鎖が、FOXP3遺伝子の開始コドンをさらに含む、請求項9〜19のいずれか1項に記載の方法。
- 前記コード鎖上の前記1つ以上の制御因子の下流に前記異種プロモーターを挿入する、請求項9〜21のいずれか1項に記載の方法。
- 前記1つ以上の制御因子を遺伝子組換えすることをさらに含む、請求項1〜22のいずれか1項に記載の方法。
- 請求項1〜23のいずれか1項に記載の方法で作製された、FOXP3を発現させるための核酸。
- 異種制御因子を含むコード鎖;および
第1のコーディングエクソンを含むFOXP3遺伝子またはその一部に作動可能に連結された異種プロモーター
を含む核酸。 - 前記異種プロモーターが、構成的プロモーターである、請求項25に記載の核酸。
- 前記構成的プロモーターが、EF1αプロモーター、PGKプロモーターまたはMNDプロモーターである、請求項26に記載の核酸。
- 前記異種プロモーターが、弱いプロモーター(たとえば、内在性プロモーターおよび/または構成的プロモーターよりも発現が低くなるプロモーター)である、請求項26に記載の核酸。
- 前記プロモーターが、誘導型プロモーターである、請求項26に記載の核酸。
- 前記誘導型プロモーターが、薬物またはステロイドによって誘導可能である、請求項29に記載の核酸。
- 前記異種プロモーターが、前記第1のコーディングエクソンの上流に存在する、請求項25〜30のいずれか一項に記載の核酸。
- 異種転写エンハンサー領域をさらに含む、請求項25〜31のいずれか1項に記載の核酸。
- 異種転写活性化領域をさらに含む、請求項25〜32のいずれか1項に記載の核酸。
- 遍在性クロマチンオープニングエレメント(UCOE)をさらに含む、請求項25〜33のいずれか1項に記載の核酸。
- 前記コード鎖上の1つ以上の制御因子の下流に前記異種プロモーターが挿入されている、請求項25〜34のいずれか1項に記載の核酸。
- 前記1つ以上の制御因子が遺伝子組換えされている、請求項25〜35のいずれか1項に記載の核酸。
- 遺伝子組換え細胞を作製する方法であって、
1つ以上の制御因子とFOXP3遺伝子またはその一部とを含むコード鎖を含む第1のヌクレオチド配列を含む細胞を提供すること;
ヌクレアーゼをコードする第2のヌクレオチド配列またはヌクレアーゼタンパク質を提供すること;および
前記第2のオリゴヌクレオチドまたは前記ヌクレアーゼタンパク質を前記細胞に導入することにより遺伝子編集を行うこと
を含む方法。 - 前記遺伝子編集が、前記第1のヌクレオチド配列に異種プロモーターを挿入するための遺伝子ノックインである、請求項37に記載の方法。
- 前記コード鎖が第1のコーディングエクソンを含む、請求項37または38に記載の方法。
- 前記第1のヌクレオチド配列が標的遺伝子座を含む、請求項36〜38のいずれか1項に記載の方法。
- 前記標的遺伝子座が、内在性コーディングエクソンまたは前記第1のコーディングエクソンを含む、請求項39に記載の方法。
- 前記遺伝子編集を行うことにより、前記標的遺伝子座において第1のコーディングエクソンが生じる、請求項37または38に記載の方法。
- 前記標的遺伝子座が、前記第1のコーディングエクソンの上流の10塩基対以内に存在するか、20塩基対以内に存在するか、30塩基対以内に存在するか、40塩基対以内に存在するか、50塩基対以内に存在するか、60塩基対以内に存在するか、70塩基対以内に存在するか、80塩基対以内に存在するか、90塩基対以内に存在するか、100塩基対以内に存在するか、もしくは110塩基対以内に存在するか、またはこれらの数値のいずれか2つによって定義される範囲内の数の塩基対以内に存在する、請求項40〜42のいずれか1項に記載の方法。
- 前記遺伝子編集が、合成された第1のコーディングエクソンを生成することをさらに含む、請求項37〜43のいずれか1項に記載の方法。
- 前記ヌクレアーゼが、Cas9、ジンクフィンガーヌクレアーゼまたはTALENである、請求項37〜44のいずれか1項に記載の方法。
- 前記異種プロモーターが構成的プロモーターである、請求項37〜45のいずれか1項に記載の方法。
- 前記異種プロモーターが、EF1αプロモーター、PGKプロモーターまたはMNDプロモーターである、請求項46に記載の方法。
- 前記異種プロモーターが、弱いプロモーター(たとえば、内在性プロモーターおよび/または構成的プロモーターよりも発現が低くなるプロモーター)である、請求項37〜45のいずれか1項に記載の方法。
- 前記異種プロモーターが誘導型プロモーターである、請求項37〜45のいずれか1項に記載の方法。
- 前記誘導型プロモーターが、薬物またはステロイドによって誘導可能である、請求項49に記載の方法。
- 前記第1のヌクレオチド配列中の前記1つ以上の制御配列の上流または下流に異種エンハンサー領域(たとえばTCRαエンハンサー)を挿入することをさらに含む、請求項37〜50のいずれか1項に記載の方法。
- 前記第1のヌクレオチド配列に異種転写活性化領域を挿入することをさらに含む、請求項37〜50のいずれか1項に記載の方法。
- 前記第1のヌクレオチド配列に遍在性クロマチンオープニングエレメント(UCOE)を挿入することをさらに含む、請求項37〜52のいずれか1項に記載の方法。
- 遺伝子組換えによって、前記コード鎖上の前記第1のコーディングエクソンの上流に前記異種プロモーターを挿入するか、または遺伝子組換えにおいて遺伝子編集を行うことによって、合成された第1のコーディングエクソンを生成させ、前記異種プロモーターが、該合成された第1のコーディングエクソンの上流に位置する、請求項38〜53のいずれか1項に記載の方法。
- 前記コード鎖上の前記1つ以上の制御因子の下流に前記異種プロモーターを挿入する、請求項37〜54のいずれか1項に記載の方法。
- 前記1つ以上の制御因子を遺伝子組換えすることをさらに含む、請求項37〜55のいずれか1項に記載の方法。
- 前記細胞が前駆・幹細胞である、請求項37〜556のいずれか1項に記載の方法。
- 前記細胞が造血幹細胞である、請求項37〜57のいずれか1項に記載の方法。
- 前記細胞がCD4+発現細胞である、請求項37〜58のいずれか1項に記載の方法。
- 前記細胞がCD8+発現細胞である、請求項37〜58のいずれか1項に記載の方法。
- 前記細胞が制御性T細胞である、請求項37〜60のいずれか1項に記載の方法。
- 請求項37〜61のいずれか1項に記載の方法によって作製された、FOXP3を発現させるための遺伝子組換え細胞。
- 第1のコーディングエクソンを含むFOXP3遺伝子に作動可能に連結された1つ以上の制御因子および異種プロモーターを含むコード鎖を含む核酸を含む、FOXP3を発現させるための遺伝子組換え細胞。
- 前記異種プロモーターが、構成的プロモーターである、請求項63に記載の遺伝子組換え細胞。
- 前記構成的プロモーターが、EF1αプロモーター、PGKプロモーターまたはMNDプロモーターである、請求項64に記載の遺伝子組換え細胞。
- 前記異種プロモーターが、弱いプロモーター(たとえば、内在性プロモーターおよび/または構成的プロモーターよりも発現が低くなるプロモーター)である、請求項63に記載の遺伝子組換え細胞。
- 前記異種プロモーターが、誘導型プロモーターである、請求項63に記載の遺伝子組換え細胞。
- 前記誘導型プロモーターが、薬物またはステロイドによって誘導可能である、請求項67に記載の遺伝子組換え細胞。
- 前記異種プロモーターが、前記第1のコーディングエクソンの上流に挿入されている、請求項63〜68のいずれか1項に記載の遺伝子組換え細胞。
- 前記核酸が異種転写エンハンサー領域をさらに含む、請求項63〜69のいずれか1項に記載の遺伝子組換え細胞。
- 前記核酸が異種転写活性化領域をさらに含む、請求項63〜70のいずれか1項に記載の遺伝子組換え細胞。
- 前記核酸が遍在性クロマチンオープニングエレメント(UCOE)をさらに含む、請求項63〜71のいずれか1項に記載の遺伝子組換え細胞。
- 前記コード鎖上の1つ以上の制御因子の下流に前記異種プロモーターが挿入されている、請求項63〜72のいずれか1項に記載の遺伝子組換え細胞。
- 前記1つ以上の制御因子が遺伝子組換えされている、請求項63〜73のいずれか1項に記載の遺伝子組換え細胞。
- 前駆・幹細胞である、請求項63〜74のいずれか1項に記載の遺伝子組換え細胞。
- 造血幹細胞である、請求項63〜75のいずれか1項に記載の遺伝子組換え細胞。
- CD4+発現細胞である、請求項63〜76のいずれか1項に記載の遺伝子組換え細胞。
- CD8+発現細胞である、請求項63〜76のいずれか1項に記載の遺伝子組換え細胞。
- 制御性T細胞である、請求項63〜78のいずれか1項に記載の遺伝子組換え細胞。
- 請求項62〜79のいずれか1項に記載の遺伝子組換え細胞と、医薬賦形剤とを含む組成物。
- 対象における自己免疫疾患を治療、抑制または緩和する方法であって、
請求項62〜79のいずれか1項に記載の遺伝子組換え細胞または請求項80に記載の組成物を対象に投与することを含む方法。 - 前記自己免疫疾患が、関節リウマチ、糖尿病、炎症性腸疾患、IPEX、免疫制御異常、多内分泌腺症、腸疾患、X連鎖(IPEX)症候群、クローン病、多発性硬化症、特発性エリテマトーデスまたは全身性エリテマトーデスである、請求項80に記載の方法。
- 前記対象が、自己免疫疾患の治療を受けるべき対象として特定または選択された対象である、請求項81または82に記載の方法。
- 対象における臓器移植の副作用を治療、抑制または緩和する方法であって、
請求項62〜79のいずれか1項に記載の遺伝子組換え細胞または請求項80に記載の組成物を対象に投与することを含む方法。 - 対象における臓器拒絶などの臓器移植の副作用を治療、抑制または緩和する方法であって、
請求項62〜79のいずれか1項に記載の遺伝子組換え細胞または請求項80に記載の組成物を対象に投与することを含む方法。 - 対象における自己免疫疾患を治療、抑制または緩和する方法であって、
自己免疫疾患の治療、抑制または緩和を必要とする対象から、第1のコーディングエクソンを含むFOXP3遺伝子またはその一部と1つ以上の制御因子とを含むコード鎖を含む第1のヌクレオチド配列を含む細胞を採取すること;
ヌクレアーゼをコードする第2のヌクレオチド配列またはヌクレアーゼタンパク質を提供すること;
前記第2のヌクレオチド配列またはヌクレアーゼタンパク質を前記細胞に導入することによって、前記第1のヌクレオチド配列にプロモーターを挿入する遺伝子ノックインによる遺伝子組換えを行うこと;および
前記対象に前記細胞を導入して、治療、抑制または緩和を行うこと
を含む方法。 - 前記自己免疫疾患が、関節リウマチ、糖尿病、炎症性腸疾患、IPEX、免疫制御異常、多内分泌腺症、腸疾患、X連鎖(IPEX)症候群、クローン病、多発性硬化症、特発性エリテマトーデスまたは全身性エリテマトーデスである、請求項86に記載の方法。
- 前記対象が、自己免疫疾患の治療を受けるべき対象として特定または選択された対象である、請求項86または87に記載の方法。
- 対象における臓器移植の副作用を治療、抑制または緩和する方法であって、
臓器移植の副作用の治療、抑制または緩和を必要とする対象から、第1のコーディングエクソンを含むFOXP3遺伝子またはその一部と1つ以上の制御因子とを含むコード鎖を含む第1のヌクレオチド配列を含む細胞を採取すること;
ヌクレアーゼをコードする第2のヌクレオチド配列またはヌクレアーゼタンパク質を提供すること;
前記第2のヌクレオチド配列またはヌクレアーゼタンパク質を前記細胞に導入することによって、前記第1のヌクレオチド配列にプロモーターを挿入する遺伝子ノックインによる遺伝子組換えを行うこと;および
前記対象に前記細胞を導入して、治療、抑制または緩和を行うこと
を含む方法。 - 対象における臓器拒絶などの臓器移植の副作用を治療、抑制または緩和する方法であって、
臓器移植の副作用の治療、抑制または緩和を必要とする対象から、第1のコーディングエクソンを含むFOXP3遺伝子またはその一部と1つ以上の制御因子とを含むコード鎖を含む第1のヌクレオチド配列を含む細胞を採取すること;
ヌクレアーゼをコードする第2のヌクレオチド配列またはヌクレアーゼタンパク質を提供すること;
前記第2のヌクレオチド配列またはヌクレアーゼタンパク質を前記細胞に導入することによって、前記第1のヌクレオチド配列にプロモーターを挿入する遺伝子ノックインによる遺伝子組換えを行うこと;および
前記対象に前記細胞を導入して、治療、抑制または緩和を行うこと
を含む方法。 - 前記細胞が前駆・幹細胞である、請求項81〜90のいずれか1項に記載の方法。
- 前記細胞が造血幹細胞である、請求項81〜91のいずれか1項に記載の方法。
- 前記細胞がCD4+発現細胞である、請求項81〜92のいずれか1項に記載の方法。
- 前記細胞がCD8+発現細胞である、請求項81〜92のいずれか1項に記載の方法。
- 前記細胞が制御性T細胞である、請求項81〜94のいずれか1項に記載の方法。
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