JP2019531264A - 特定のsiRNAを含むメラニン増進用組成物 - Google Patents
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Abstract
Description
#1の塩基配列(配列番号1):5’−CCAACCAGAACAAGCAGAACA−3’
#2の塩基配列(配列番号2):5’−GAACACGAAGGCUGUAACAAA−3’
細胞及び皮膚モデルの準備
正常ヒト表皮メラニン形成細胞(Normal human epidermal melanocytes、NHEMs、Cascade Biologics、Portland、OR、USA)を入手し、C57BL/6 J(black、a/a)マウス由来のメラニン形成細胞であるメラン−A(Melan−A)細胞株をDorothy C. Bennett博士(St. George’s Hospital Medical School、London、UK)から入手した。B16F1マウス黒色腫(melanoma)細胞株はATCC(Manassas、VA、USA)から入手した。
α−MSH、アルブチン(arbutin)、及びコウジ酸(kojic acid)はSigma−Aldrich社(St. Louis、MO、USA)から入手した。siRNAである#1(5’−CCAACCAGAACAAGCAGAACA−3’)、#2(5’−GAACACGAAGGCUGUAACAAA−3’)、及び陰性対照群siRNA(scrambled control siRNA、siNC)(5’−CCUACGCCACCAAUUUCGU−3’)はジェノリューション社(Genolution、ソウル、大韓民国)から入手した。Lipofectamine(登録商標) RNAi MAX(Invitrogen、Carlsbad、CA、USA)を用いて60mmディッシュで培養したメラン−a(Melan−a)及びB16F1細胞にsiRNAをトランスフェクションさせた。siRNAとともに24時間培養した後、細胞に対してそれぞれの化合物(試薬)で処理を施し、48時間維持した。
細胞をトリプシン/EDTAで処理後、1000xgで5分間遠心分離し、PBSで2回洗浄した。チューブ内の最終細胞ペレットを写真に撮り、細胞ペレットは1N NaOHに溶解させた。均質化させた細胞抽出物を96−ウェル(well)プレートに移載し、ELISAプレートリーダーを利用して吸光度405nmにおける相対的メラニン量を測定した。
すべての溶解物は2×Laemmliサンプルバッファー(2×Laemmli sample buffer、62.5mM Tris−HCl、pH6.8、25%[v/v]glycerol、2%[w/v]SDS、5%[v/v]β−mercaptoethanol、及び0.01%[w/v]bromophenol blue)(Bio−Rad、Hercules社、CA、USA)を用いて準備した。すべての細胞タンパク質はBradford solution(Bio−Rad)を用いて測定した。その後、前記試料はSDS−PAGEで分離し、PVDFメンブレイン(Bio−Rad)に移転した。TBST(25mM Tris、140mM NaCl、及び0.05%[v/v]Tween(登録商標) 20)中の4%(w/v)スキムミルク(skim milk)でブロッキングした後、メンブレインを特定の1次抗体とともにオーバーナイト(overnight)培養させた。
各データは少なくとも3回の独立した実験を施して得たものとし、平均±SE(標準誤差)で表した。結果の統計的評価は一元分散分析(1−way ANOVA)を用いて行った(*:p<0.05、**:p<0.01)。
メラン−a(Melan−a)細胞をsiRNA(#1、#2)、スクランブル対照群siRNA(scrambled control siRNA、siNC)にそれぞれトランスフェクションさせ、48時間後に、メラニンの生成を抑制させる特定の物質D(0.5μM)の処理又は無血清血清条件下で2日間培養した後、メラニンの含量を測定した。図1から分かるように、メラニンの生成を抑制させる特定の物質Dの処理又は無血清条件下におけるメラン−a細胞培養は、対照群(siNC)においてメラニンの生成を抑制したが、刺激(特定の物質D又は血清飢餓)で抑制されたメラニンの生成はsiRNA(#1、#2)によって顕著に増進した(図1)。
配列番号1又は配列番号2の塩基配列からなるsiRNA 2mgを含有するリポソーム10mg、L−カルニチン80〜140mg、大豆油180mg、パーム油2mg、植物性硬化油8mg、黄蝋4mg及びレシチン6mgを混合し、通常の方法に従って1カプセルに充填して軟質カプセル剤を製造した。
配列番号1又は配列番号2の塩基配列からなるsiRNA 2mgを含むリポソーム10mg、ガラクトオリゴ糖200mg、乳糖60mg及び麦芽糖140mgを混合し、流動層乾燥機を利用して顆粒した後、糖エステル(sugar ester)を6mgを添加して、打錠機で打錠して錠剤を製造した。
配列番号1又は配列番号2の塩基配列からなるsiRNA 2mgを含むリポソーム10mg、無水結晶ブドウ糖250mg及び澱粉550mgを混合し、流動層造粒機を使用して顆粒に成形した後、包に充填して顆粒剤を製造した。
配列番号1又は配列番号2の塩基配列からなるsiRNA 2mgを含むリポソーム10mg、ブドウ糖10g、クエン酸0.6g、及び液状オリゴ糖25gを混合した後、精製水300mlを加えて各瓶に200mlずつ充填する。瓶に充填した後、130℃で4〜5秒間殺菌してドリンク剤を製造した。
配列番号1又は配列番号2の塩基配列からなるsiRNA 5mgを含むリポソーム20mg、適量の注射用滅菌蒸留水、適量のpH調節剤を用いて通常の方法に従い注射剤を製造した。
配列番号1又は配列番号2の塩基配列からなるsiRNA 1.0質量%を含有するリポソーム10質量%、L−アスコルビン酸−2−リン酸マグネシウム塩1.00質量%、水溶性コラーゲン(1%水溶液)1.00質量%、クエン酸ナトリウム0.10質量%、クエン酸0.05質量%、甘草エキス0.20質量%、1,3−ブチレングリコール3.00質量%、残量として精製水を用いて柔軟化粧水(スキンローション)を製造した。
配列番号1又は配列番号2の塩基配列からなるsiRNA 1.00質量%を含有するリポソーム10質量%、ポリエチレングリコールモノステアレート2.00質量%、自己乳化型モノステアリン酸グリセリン5.00質量%、プロピレングリコール4.00質量%、スクアレン6.00質量%、トリ2−エチルヘキサングリセリル6.00質量%、スフィンゴ糖脂質1.00質量%、1,3−ブチレングリコール7.00質量%、蜜蝋5.00質量%、残量として精製水を用いてクリーム状製剤を製造した。
配列番号1又は配列番号2の塩基配列からなるsiRNA 1.00質量%を含有するリポソーム10質量%、ポリビニルアルコール13.00質量%、L−アスコルビン酸−2−リン酸マグネシウム塩1.00質量%、ラウロイルヒドロキシプロリン1.00質量%、水溶性コラーゲン(1%水溶液)2.00質量%、1,3−ブチレングリコール3.00質量%、エタノール5.00質量%、残量として精製水を用いてパックを製造した。
下記の表に記載された組成にて通常の方法に従い健康食品を製造した。
Claims (9)
- 配列番号1又は配列番号2の塩基配列からなるsiRNAを有効成分として含む毛髪の黒化用又は毛髪の白化防止用組成物。
- 配列番号1又は配列番号2の塩基配列からなるsiRNAを有効成分として含むメラニン低下性疾患の予防及び治療用組成物。
- 前記siRNAは、メラニンの生成又は沈着を増進させるものである、請求項1又は2に記載の組成物。
- 前記siRNAは、チロシナーゼ及びTRP1のうち一つ以上の発現を増進させるものである、請求項1又は2に記載の組成物。
- 前記組成物中のsiRNAの含量は、前記組成物の総質量に対し、0.000000001質量%〜20質量%の範囲である、請求項1又は2に記載の組成物。
- 前記siRNAの投与量は、0.000001mg/kg/日〜20mg/kg/日の範囲である、請求項1又は2に記載の組成物。
- 前記メラニン低下性疾患は、白化症、白斑、脱色素性母斑、白色粃糠疹、白癜、炎症後色素脱失症、斑状強皮症、部分白皮症、特発性滴状低メラニン症及び点状白皮症からなる群より選ばれた一つ以上である、請求項2に記載の組成物。
- 当該組成物は薬学組成物である、請求項1又は2に記載の組成物。
- 当該組成物は、毛髪の黒化用、毛髪の白化防止用、メラニン低下性疾患の予防及び改善用化粧料組成物である、請求項1又は2に記載の組成物。
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