JP2015166340A - フィラグリン遺伝子およびカスパーゼ−１４遺伝子の発現促進剤ならびに幹細胞因子の産生抑制剤 - Google Patents

Abstract

【課題】天然保湿因子の産生に関与しているフィラグリン遺伝子等の発現を促進することのできる新規な発現促進剤、および幹細胞因子（ＳＣＦ）の産生を抑制することのできる新規の産生抑制剤を提供する。
【解決手段】Ｄ−グルコピラノシルグリセロールを含有することを特徴とする、フィラグリン遺伝子および／またはカスパーゼ−１４遺伝子の発現促進剤、ならびにＳＣＦの産生抑制剤。これらの発現促進剤および産生抑制剤は、経口摂取されるもの、または塗布されるものとして調製することができる。
【選択図】図１

Description

本発明は、皮膚の角質層で水分を保持するための天然保湿因子（Natural Moisturizing Factors：ＮＭＦ）の産生に関与する、フィラグリン遺伝子およびカスパーゼ−１４遺伝子の発現促進剤に関する。また本発明は、異常産生がかゆみなどの原因となる、幹細胞因子（ＳＣＦ）の産生抑制剤に関する。換言すれば、本発明はそのような発現促進剤または産生抑制剤としての、Ｄ−グルコピラノシルグリセロールの用途に関する。

皮膚の最外層に存在する角質層は、外界からの刺激（紫外線、乾燥等）に対する防御壁として機能している。例えば、外環境の乾燥から身を守るため、角質層は体内からの水分の放出を抑制する作用と、角質層自身の水分を保持する作用を合わせ持つことが知られている。体内からの水分の放出を抑制するものとしては角質層の細胞間脂質が、角質層自身の水分を保持する作用を持つものとしては天然保湿因子が知られている。この天然保湿因子はアミノ酸及びその誘導体、ピロリドンカルボン酸、乳酸塩、無機塩、糖類等からなる角質層中に存在する水溶性成分である。これらの天然保湿因子の主要成分はアミノ酸やピロリドンカルボン酸等のアミノ酸代謝物であり、特にアミノ酸には、角質層における水分量と高い相関性が報告され、角質層の水分保持には極めて重要である。

しかしながら、角質層におけるアミノ酸の量は年齢、肌荒れ状態、アトピー性皮膚炎、花粉症等のアレルギー反応によって減少し、角質層の水分環境を悪化させることが知られている。角質層の水分量が低下することにより角質層がかたくなり、亀裂を生じさせ、小皺の原因となり、抗原等の外界因子の侵入を容易にし、皮膚炎症反応を誘起することもある。

これまで、油剤や、糖、アミノ酸、乳酸、ピロリドンカルボン酸塩等の天然保湿因子、コラーゲン等の蛋白質、ヒアルロン酸、コンドロイチン硫酸等の多糖類、グリセリン、1,3-ブチレングリコールなどの多価アルコールといった保湿剤を外用することで、水分量の減少した角質層を改善することが試みられてきた。しかしながら、上記のような保湿剤は、角質層に留まる間は有効であるが、角質層の水分保持機能を本質的に改善する作用までは期待できない。また、洗浄や発汗などによって容易に流されることも問題であった。

天然保湿因子の主成分であるアミノ酸は、フィラグリンが角質層内でカスパーゼ−１４の作用を受けて分解することによって供給される。フィラグリンの産生の過程ではまず、フィラグリン遺伝子が顆粒細胞（顆粒層に位置するケラチノサイト）において発現し、そのｍＲＮＡからの翻訳によって、１０〜１２個のフィラグリンユニットが短いリンカーペプチドを介して数珠つなぎに配列したプロフィラグリン（フィラグリン前駆体）が産生される。プロフィラグリンは直ちにリン酸化され、ケラトヒアリン顆粒に蓄積する。顆粒細胞が顆粒層上層から角質層に移行し、角質細胞（角化細胞、角質層に位置するケラチノサイト）に変化する際に、プロフィラグリンは脱リン酸化と、タンパク質分解酵素の作用を受けてフィラグリンへと分解される。このようにして産生されたフィラグリンは、角質細胞内でケラチンフィラメントに沈着しており、ケラチンフィラメント同士の凝集効率を高め、角質細胞の内部構築に関与する。そして、角質層上層で、フィラグリンは前述のようにカスパーゼ−１４の作用を受けて分解されて、アミノ酸およびその誘導体である天然保湿因子が生成する。

近年、このフィラグリンが皮膚の水分保持に非常に重要かつ必要不可欠であること、及び乾燥などの条件によりフィラグリンの合成力が低下し、角質層におけるアミノ酸量が低下することが明らかになった。そこで、フィラグリンの合成や分解を促進することによって角質層内のアミノ酸量を増大させ、角質層の水分環境を本質的に改善することが検討されている。

さらに、フィラグリン遺伝子の異常（欠損）によるフィラグリンの発現量の低下が、老人性乾皮症、アトピー性皮膚炎、尋常性魚鱗癬、気管支喘息等の疾患の発症に深く関与していることも明らかになってきている。そのため、フィラグリン遺伝子の発現を促進することによって、上記のような疾患を予防または治療することも検討されている。たとえば、非特許文献１には、ＪＴＣ８０１（N-(4-amino-2-methylquinolin-6-yl)-2-[(4-ethylphenoxy)methyl]benzamide）が、ヒトおよびマウスの培養表皮細胞（角質細胞）におけるフィラグリンの発現量を亢進する作用を有すること、そして当該化合物を経口で摂取することにより、アトピー性皮膚炎の動物モデルの皮膚におけるフィラグリンの発現を亢進し、炎症が改善されたことが記載されている。

上述したＪＴＣ８０１以外にも、フィラグリン遺伝子の発現を促進する作用を有する物質として、たとえば、ガイヨウ抽出物、クマザサ抽出物、ローズマリー抽出物、レイシ抽出物またはトウニン抽出物を有効成分として含有するプロフィラグリンｍＲＮＡ発現促進剤（特許文献１）、カキの葉抽出物からなるプロフィラグリン遺伝子発現促進剤（特許文献２）、メハジキ、アンズ、スイカズラ、サイシン、トウキ、ハトムギ、モモ、テンチャまたはシロキクラゲを含有するＮＭＦ産生促進剤（特許文献３）、リン脂質と糖アルコールが結合した構造を有する特定の一般式で示される糖脂質を有効成分として含有するフィラグリン合成促進剤（特許文献４）などが提案されている。

一方で、角質細胞によるＳＣＦ（Stem Cell Factor：幹細胞因子）の異常産生は、肥満細胞（マスト細胞）の異常増殖や異常脱顆粒化を引き起こし、ヒスタミン、セロトニン、ＬＴＢ４等のケミカルメディエーターの遊離を亢進させて、かゆみの原因となることも知られている。ＳＣＦには、タンパク質分解酵素の作用により切断された膜から遊離する分泌型（ＳＣＦ−１）と、膜結合型（ＳＣＦ−２）がある。このうちＳＣＦ−１はその切断部位において細胞膜から遊離して、色素細胞や肥満細胞のＳＣＦレセプターに結合し、色素細胞の増殖活性化や、肥満細胞の増殖活性化および脱顆粒化をもたらす。アトピー性皮膚炎では、皮膚炎の発症部位における肥満細胞の浸潤が病態に重要な働きを担っていると考えられており、ＳＣＦ（特にＳＣＦ−１）はそのような肥満細胞の増殖や、成熟・分化、ケモタキシスにとって必須の因子となっている。そのため、アトピー性皮膚炎の治療等においてＳＣＦの産生を抑制することが重要視されており、そのような作用効果を奏する物質がいくつか提案されている。たとえば、特許文献５には、α−グルコシルヘスペリジンを含有する経口投与・摂取用の、ＳＣＦ産生抑制剤およびかゆみ抑制剤などが記載されており、特許文献６には、関平鉱泉水からなるＳＣＦ遊離抑制剤およびそれを含む鎮痒剤および皮膚外用剤が記載されている。また、皮膚が乾燥、紫外線等の刺激を受けることでＳＣＦが産生されることも報告されており（特許文献７）、ＳＣＦの量は細胞の乾燥状態を示す一つの指標となる。ＳＣＦのＳＣＦレセプターへの結合も、皮膚が乾燥、紫外線等の刺激を受けることで促進される。

なお、ＳＣＦ−２は角質細胞等に結合したまま色素細胞（メラノサイト）のＳＣＦレセプターに結合して色素細胞の増殖を活性化し、メラノジェネシス（メラニン合成）の制御因子として働いている。

ところで、α−Ｄ−グルコピラノシルグリセロールは、清酒に０．５質量％程度含まれており、すっきりとした甘さを与えていることが知られている物質である。近年では、α−Ｄ−グルコピラノシルグリセロールが非う蝕性、難消化性、保湿性等の機能を有することが報告されており、その機能性材料としての有用性が注目されている。例えば、特許文献８には、そのような機能に着目して、α−Ｄ−グルコピラノシルグリセロールを甘味剤や保湿剤などとして利用し、各種飲食品、化粧品、医薬品などに添加することができることが記載されている。

また、特許文献９には、α−Ｄ−グルコピラノシルグリセロール（α−Ｄ−ジヒドロキシプロピルグルコピラノシド）とその立体異性体であるβ−Ｄ−グルコピラノシルグリセロール（β−Ｄ−ジヒドロキシプロピルグルコピラノシド）を特定の比率で含有する糖組成物を用いることにより、α−Ｄ−グルコピラノシルグリセロールを単独で用いる場合と比較して保湿性を向上させることができることが記載されている。

しかしながら、特許文献８および９では、保湿性とフィラグリン等の特定の遺伝子の発現との関係性については全く言及されておらず、α−および／またはβ−Ｄ−グルコピラノシルグリセロールを上記遺伝子の発現促進剤として利用することができることは記載されていない。

さらに、特許文献１０には、α−および／またはβ−Ｄ−グルコピラノシルグリセロール等を包含するグリセリルグリコシドが、皮膚におけるアクアポリンの発現を促進する作用を有することが記載されている。アクアポリンは植物および動物の細胞膜に存在する、分子量の小さな極性分子、特に水を透過させる細孔を形成しており、たとえば皮膚の深部から表層へ水を供給して潤いを保持するために重要な役割を担っている。

しかしながら、特許文献１０では、グリセリルグリコシドがアクアポリン以外のタンパク質の発現を促進する作用を有することは記載されていない。

特開２０１２−２１９０４７号公報 特開２０１３−１８０９６８号公報 特開２００６−１２４３５０号公報 特開２００６−２４１０９５号公報 特開２００９−００７３３６号公報 特開２０１０−１２６４９４号公報 特開２００３−１９４８０９号公報 特開平１１−２２２４９６号公報 特開２０１１−２３６１５２号公報 米国特許出願公開第２００９／０１３０２２３号明細書

Otsuka et al., Possible new therapeutic strategy to regulate atopic dermatitis through upregulating filaggrin expression. The Journal of Allergy and Clinical Immunology, 19 September 2013. (http://dx.doi.org/10.1016/j.jaci.2013.07.027)

本発明は、天然保湿因子の産生に関与しているケラチノサイト等によるフィラグリン遺伝子等の発現を促進することのできる、新規な発現促進剤を提供することを課題とする。本発明はさらに、ケラチノサイト等によるＳＣＦの産生を抑制することのできる、新規の産生抑制剤を提供することも課題とする。

本発明者らは、Ｄ−グルコピラノシルグリセロールが、天然保湿因子の原料ともいうべきフィラグリンの遺伝子の発現を促進するとともに、フィラグリンを分解して天然保湿因子に変換するタンパク質分解酵素であるカスパーゼ−１４の遺伝子の発現を促進する作用を有し、それらの遺伝子の発現促進剤として利用することができることを見出した。本発明者らはさらに、Ｄ−グルコピラノシルグリセロールはＳＣＦの産生抑制剤として利用できることも見出した。

すなわち、本発明は一つの側面において、Ｄ−グルコピラノシルグリセロールを含有することを特徴とする、フィラグリン遺伝子および／またはカスパーゼ−１４遺伝子の発現促進剤（以下、「本発明の発現促進剤」と称することがある。）を提供する。本発明はもう一つの側面において、Ｄ−グルコピラノシルグリセロールを含有することを特徴とする、ＳＣＦの産生抑制剤（以下、「本発明の産生抑制剤」と称することがある。）を提供する。本発明はさらなる側面において、経口摂取または塗布により利用される上記の発現促進剤または産生抑制剤や、それらを含有する飲食品、化粧品、医薬部外品または医薬品を提供する。

換言すれば、本発明は、Ｄ−グルコピラノシルグリセロールの、フィラグリン遺伝子および／またはカスパーゼ−１４遺伝子の発現を促進するための有効成分としての用途や、Ｄ−グルコピラノシルグリセロールを、インビトロまたはインビボで、ヒトおよびその他の動物の、フィラグリン遺伝子および／またはカスパーゼ−１４遺伝子を発現しうる細胞と接触させることにより、フィラグリン遺伝子および／またはカスパーゼ−１４遺伝子の発現を促進させる方法を提供する。同様に、本発明は、Ｄ−グルコピラノシルグリセロールの、ＳＣＦの産生を抑制するための有効成分としての用途や、Ｄ−グルコピラノシルグリセロールを、インビトロまたはインビボで、ヒトおよびその他の動物の、ＳＣＦを発現しうる細胞と接触させることにより、ＳＣＦの産生を抑制する方法を提供する。

Ｄ−グルコピラノシルグリセロールを含有する本発明の発現促進剤を用いることにより、フィラグリン遺伝子のみならずカスパーゼ−１４遺伝子のケラチノサイト等における発現を促進することができるため、角質層における天然保湿因子の産生量を相乗的に増加させることが期待できる。また、本発明の発現促進剤を用いることによりＳＣＦ発現細胞が産生するＳＣＦの量を抑制することができるため、ＳＣＦの異常産生に起因するかゆみを低減することなどが期待できる。このような本発明の発現促進剤または産生抑制剤を、食品、化粧品、医薬部外品、医薬品等に配合して利用することにより、フィラグリン遺伝子およびカスパーゼ−１４遺伝子の発現促進効果や、ＳＣＦの産生抑制効果を期待できる、食品、化粧品、医薬部外品、医薬品等を製造することが可能となる。

なお、後記実施例により示されている結果から、Ｄ−グルコピラノシルグリセロールは湿潤状態にある（培養液中で培養されている）ケラチノサイト等のＳＣＦ発現細胞に直接的に作用して、ＳＣＦの発現量を抑制する効果を有することが推定される。ただ、ケラチノサイトは乾燥刺激によってもＳＣＦの産生を促進するので、たとえば、本発明の発現促進剤としての作用によって生体の角質層の湿潤状態が保たれ、ケラチノサイトが乾燥刺激を受けないようにすることで、ＳＣＦの産生量を抑制するという間接的な作用機序も示唆されうる。本発明の産生抑制剤による作用効果は、少なくとも上記の直接的な作用機序に基づいており、上記の間接的な作用機序だけに基づくものではないが、これら両方の作用機序やさらなるその他の作用機序が働くことも排除されるものではない。

図１は、プロフィラグリン、フィラグリン、天然保湿因子（ＮＭＦ）およびカスパーゼ−１４の関係と、Ｄ−グルコピラノシルグリセロールがプロフィラグリンおよびカスパーゼ−１４の発現を促進する作用を表した模式図である。 図２は、実施例１における、ＣＯＳＡＲＴＥ−２Ｇ（Ｄ−グルコピラノシルグリセロール等を含有する組成物）のフィラグリン（Ａ）およびカスパーゼ−１４（Ｂ）それぞれの遺伝子の発現促進作用を示す結果のグラフである。 図３は、実施例２における、ＣＯＳＡＲＴＥ−２Ｇから精製したＤ−グルコピラノシルグリセロール（ＧＭＧ）を５０ｍＭまたは２００ｍＭの濃度で用いたときのフィラグリン遺伝子の発現促進作用を示す結果のグラフである。グリセリン（Glycerol）は対照物質である。 図４は、実施例３における、ＣＯＳＡＲＴＥ−２ＧによるＳＣＦの産生抑制作用を示す結果のグラフである。図の見出し［４−１］，［４−２］および［４−３］はそれぞれ、実施例中の見出し［３−１］，［３−２］および［３−３］に対応するものである。図中のカラムおよびバーはｎ＝３の平均値および標準偏差（ＳＤ）を示す。横軸下段は培養液に添加したＳＣＦ誘導剤（mediumは無添加）、横軸上段は培養液へのＣＯＳＡＲＴＥ−２Ｇ（３％）の添加の有無（mediumは無添加）を表す。縦軸は培養液中のＳＣＦの濃度、または吸光度（４５０ｎｍ−７５０ｎｍ）を表す。

− 発現促進剤 −
本発明のフィラグリン遺伝子およびカスパーゼ−１４遺伝子の発現促進剤およびＳＣＦの産生抑制剤は、Ｄ−グルコピラノシルグリセロールを含有する物質であればよく、たとえば他の成分を含む組成物として調製してもよいし、他の成分を極力減らした精製物として調製してもよい。すなわち、本発明において、実際にフィラグリン遺伝子およびカスパーゼ−１４遺伝子の発現を促進する作用、あるいは実際にＳＣＦの産生を抑制する作用を有する化合物はＤ−グルコピラノシルグリセロールであるが、本発明の発現促進剤および産生抑制剤は、そのような作用を阻害しない範囲で、Ｄ−グルコピラノシルグリセロール以外の物質（たとえば水、グリセリン）を含有していてもよい。このような作用効果に対する貢献の意味で、本発明の発現促進剤および産生抑制剤は、本質的にＤ−グルコピラノシルグリセロールからなるものということもできる。

（Ｄ−グルコピラノシルグリセロール）
Ｄ−グルコピラノシルグリセロールは、式（１）で表される化合物、すなわち１−Ｏ−（α−またはβ−）Ｄ−（モノまたはポリ）グルコピラノシルグリセロール（１−Ｏ−（α−またはβ−）Ｄ−ジヒドロキシプロピル（モノまたはポリ）グルコピラノシドと称されることもある。）および式（２）で表される化合物、すなわち２−Ｏ−（α−またはβ−）Ｄ−（モノまたはポリ）グルコピラノシルグリセロール（２−Ｏ−（α−またはβ−）Ｄ−ジヒドロキシプロピル（モノまたはポリ）グルコピラノシドと称されることもある。）の総称である。これらの化合物は互いに構造異性体の関係にある。本発明では、式（１）で表される化合物のみを用いても、式（２）で表される化合物のみを用いても、式（１）で表される化合物と式（２）で表される化合物との混合物を用いてもよい。

式（１）中の*印を付けた２位の炭素原子は不斉炭素原子であり、光学異性体、すなわち（２Ｒ）体および（２Ｓ）体が存在する。式（１）で表される化合物はどちらの光学異性体であってもよく、これらの光学異性体からなる混合物（ラセミ体）であってもよい。

式（１）および（２）中のｎは糖縮合度を示し、１以上の整数である。後述するような製造方法によって得られる糖組成物中の化合物については、ｎは通常１〜６の整数、ほとんどは１〜４の整数である。本発明では、ｎが１である化合物のみを用いても、ｎが１以上の化合物の混合物を用いてもよい。

式（１）および（２）中の波線は、括弧内のグルコース残基の１位の炭素原子とグリセリンの水酸基に由来する酸素原子が、ｎ＝２以上の場合はさらにグルコース残基の４位の水酸基に由来する酸素原子とグルコース残基の１位の炭素原子が単結合で結合していて、その結合はα結合であってもβ結合であってもよいことを表す。本発明では、波線部がα結合である化合物のみを用いても、波線部がβ結合である化合物のみを用いても、波線部がα結合である化合物とβ結合である化合物との混合物を用いてもよい。

式（１）によって表される化合物の具体例としては、式（１）においてｎ＝１で波線がα結合を表す場合に相当する、下記式（１Ａ）で表される化合物、すなわち１−Ｏ−α−Ｄ−グルコピラノシルグリセロールと、式（１）においてｎ＝１で波線がβ結合を表す場合に相当する、下記式（１Ｂ）で表される化合物、すなわち１−Ｏ−β−Ｄ−グルコピラノシルグリセロールが挙げられる。式（２）によって表される化合物の具体例としては、式（２）においてｎ＝１で波線がα結合を表す場合に相当する、下記式（２Ａ）で表される化合物、すなわち２−Ｏ−α−Ｄ−グルコピラノシルグリセロールが挙げられる。

本発明で用いるＤ−グルコピラノシルグリセロールの形態及び純度（含有率）は、本発明における作用効果が阻害されない範囲、すなわちフィラグリン遺伝子およびカスパーゼ−１４遺伝子の発現を促進する作用を発揮できる範囲であれば、特に限定されるものではない。Ｄ−グルコピラノシルグリセロールの形態としては、例えば、水溶液、水溶液を濃縮した水あめ状の高粘度溶液などが挙げられる。Ｄ−グルコピラノシルグリセロールの純度は１０重量％以上が好ましく、例えば、前記高粘度溶液中のＤ−グルコピラノシルグリセロールの純度は４０重量％程度またはそれ以上とすることができる。

また、Ｄ−グルコピラノシルグリセロールは、それを調製する際に残存または混入することのある未反応物または反応副生物（不純物）と混合した状態であってもよい。そのような不純物としては、Ｄ−グルコピラノシルグリセロールを有機合成法により合成するための一方の原料として配合されるグリセリンおよびそれに由来する反応副生物、たとえばエタノール、イソプロピルアルコール、エチレングリコール、ジエチレングリコール、トリエチレングリコール、プロピレングリコール、ジプロピレングリコール、１，３−ブチレングリコール、１，２−ペンタンジオール、ジグリセリン、ポリグリセリン等のアルコールが挙げられる。

なお、グリセリンは食品、化粧品、医薬部外品、医薬品等への配合量が制限される場合がある。そのため、有機合成法によって得られるＤ−グルコピラノシルグリセロールおよび上記の未反応物および反応副生物を含有する糖組成物を食品、化粧品、医薬品等の製造に用いる場合、その糖組成物中のグリセリンの割合は、糖組成物中の全固形分に対して、２０質量％以下が好ましく、１０質量％以下がより好ましい。一方、グリセリンの配合量が特に問題とならない場合は、糖組成物中の全固形分に対して、２０質量％以上であってもよい。

また、前記不純物としては、Ｄ−グルコピラノシルグリセロールを合成するためのもう一方の原料として配合されるグルコース源およびそれに由来する反応副生物、たとえば、グルコース源が二糖以上の糖である場合にその分解により生じた糖や、そのような糖同士が反応して副生した糖なども挙げられる。

Ｄ−グルコピラノシルグリセロールは、公知の手法により予め調製しておくこともできるし、商品として購入することもできる。たとえば、特開平１１−０２２２４９６号公報（特許文献７）に記載されているような酵素法を用いれば、α−Ｄ−グルコピラノシルグリセロールを主成分とする生成物が得られ、特開２０１１−２３６１５２号公報（特許文献８）に記載されているような有機合成法を用いれば、α−Ｄ−グルコピラノシルグリセロールとβ−Ｄ−グルコピラノシルグリセロールを所定の割合で含有する混合物が得られる。有機合成法の概略を説明すれば、この製造方法は、グルコース源とグリセリンとを酸性触媒を用いて反応させることによりＤ−グルコピラノシルグリセロールを合成する工程（グリコシル化工程）および酸性触媒の中和剤をグルコシル化工程の反応系内に添加して反応を停止させる工程（反応停止工程）を含み、必要に応じてさらに、残存グリセリン、残存グルコース源、副生物等を除去するための精製工程（蒸留工程、脱色工程等）や、粘度を低下させてハンドリング性を向上させるための水溶液調製工程などを含んでいてもよい。

また、たとえば東洋精糖(株)製の商品「コスアルテ２Ｇ」は、Ｄ−グルコピラノシルグリセロール（１−Ｏ−α−Ｄ−グルコピラノシルグリセロール、１−Ｏ−β−Ｄ−グルコピラノシルグリセロール、２−Ｏ−α−Ｄ−グルコピラノシルグリセロールおよび２−Ｏ−β−Ｄ−グルコピラノシルグリセロールの混合物）、グリセリン、その他の糖類および水を含有する組成物であり、この組成物中の、水およびグリセリンを除いたＤ−グルコピラノシルグリセロールの含有率は、約７０〜７８重量％、平均７３.５重量％である。また、上記商品は有機合成法により効率的に製造することができる。このような、Ｄ−グルコピラノシルグリセロールとして上記４種類の化合物を含有する上記商品を、本質的にＤ−グルコピラノシルグリセロールからなる本発明の発現促進剤または産生抑制剤として用いることが好ましい。

図１は、プロフィラグリン、フィラグリン、天然保湿因子（ＮＭＦ）およびカスパーゼ−１４の関係と、Ｄ−グルコピラノシルグリセロールがプロフィラグリンおよびカスパーゼ−１４の発現を促進する作用を表した模式図である。Ｄ−グルコピラノシルグリセロールが細胞に作用すると、後述する実施例１が示すとおり、フィラグリンおよびカスパーゼ−１４遺伝子の発現が促進される。発現したフィラグリン遺伝子は、プロフィラグリンに翻訳され、脱リン酸化などの分解反応によりフィラグリンになる。フィラグリンは、発現したカスパーゼ−１４によりさらに分解反応を受け、ＮＭＦ（Ｎａｔｕｒａｌ Ｍｏｉｓｔｕｒｉｚｉｎｇ Ｆａｃｔｏｒ）となる。

（用途）
Ｄ−グルコピラノシルグリセロールを含有する本発明の発現促進剤は、フィラグリン遺伝子および／またはカスパーゼ−１４遺伝子の発現を促進することによって目的とする効果が得られる用途において、特に限定されることなく使用することができる。本発明の発現促進剤は、フィラグリン遺伝子またはカスパーゼ−１４遺伝子のどちらかの発現を促進することを目的として使用してもよいし、これら両方の遺伝子の発現を同時に促進することを目的として使用してもよい。つまり、本発明の発現促進剤は、フィラグリン遺伝子およびカスパーゼ１４遺伝子の少なくとも一方の遺伝子の発現を促進することを目的として使用することができる。

たとえば、本発明の発現促進剤は、インビトロまたはインビボで、ヒトおよびその他の動物の、フィラグリン遺伝子および／またはカスパーゼ−１４遺伝子を発現しうる細胞、好ましくは顆粒細胞または角化細胞と接触させることにより、フィラグリン遺伝子および／またはカスパーゼ−１４遺伝子の発現を促進させるために使用することができる。

また、本発明の発現促進剤は、フィラグリン遺伝子および／またはカスパーゼ−１４遺伝子の発現を促進する作用を有するＤ−グルコピラノシルグリセロール以外の物質と混合して、さらにそのような作用を向上させた発現促進剤を調製するために利用することもできる。

Ｄ−グルコピラノシルグリセロールを含有する本発明の産生抑制剤は、ＳＣＦの産生を促進することによって目的とする効果が得られる用途において、特に限定されることなく使用することができる。

たとえば、本発明の産生抑制剤は、インビトロまたはインビボで、ヒトおよびその他の動物の、ＳＣＦを産生しうる細胞、たとえば角化細胞（サイトケラチン）と接触させることにより、ＳＣＦの産生を促進させるために使用することができる。なお、ＳＣＦを産生する細胞としては、角化細胞の他、線維芽細胞、内皮細胞、マスト細胞（肥満細胞）、ストローマ細胞（間質細胞）等も挙げられ、本発明の産生抑制剤は、ＳＣＦの産生を抑制することが所定の作用効果を奏する各種の細胞に対して適用することが可能である。

また、本発明の産生抑制剤は、ＳＣＦの産生を抑制する作用を有するＤ−グルコピラノシルグリセロール以外の物質と混合して、さらにそのような作用を向上させた産生抑制剤を調製するために利用することもできる。

本発明の発現促進剤および産生抑制剤は、経口摂取されるもの、または塗布されるものとして調製することができる。特に好適な実施形態として、本発明の発現促進剤は、フィグラリン遺伝子等の発現促進作用により角質層中の天然保湿因子の産生量を増加させるための有効成分として、また本発明の産生抑制剤は、角質層中のＳＣＦ産生細胞によるＳＣＦの産生量を抑制するための有効成分として、食品（栄養機能食品、特定保健用食品といった保健機能食品を含む。）、化粧品、医薬部外品（薬用化粧品、入浴剤等を含む）、医薬品、その他の製品に配合して利用することができる。このような実施形態において、Ｄ−グルコピラノシルグリセロールは、発現促進剤としての用途と産生抑制剤としての用途のどちらか一方のみを目的として配合してもよいし、両方の用途を目的として配合してもよい。

化粧品の場合、例えば、乾燥、紫外線等の外的ストレスによって引き起こされる、肌の乾燥、荒れ、シワ、老化等を予防（リスクの低減）または改善する効果を期待することのできる化粧品として製造することができる。また、本発明の産生抑制剤を有効成分とする化粧品は、ＳＣＦの異常産生によって色素細胞が異常増殖し、メラニン産生が亢進することによって引き起こされる、しみ、そばかす、くすみ等を予防または改善することも可能である。

医薬品の場合、例えば、アトピー性皮膚炎、乾皮症等に代表される乾燥性皮膚疾患のように、角質層の天然保湿因子の減少やＳＣＦの異常産生、遊離が直接的または間接的に症状に関与している疾患を治療または予防するための医薬品として製造することができる。医薬品の場合はさらに、上記の疾患に加えて尋常性魚鱗癬、気管支喘息等を含めた、フィラグリンおよび／またはカスパーゼ−１４の発現量の低下、あるいはそれらの遺伝子の異常が直接的または間接的に症状に関与している疾患を治療または予防するための医薬品として製造することができる可能性がある。また、本発明の産生抑制剤を有効成分とする医薬品は、乾燥性皮膚疾患が伴う掻痒（かゆみ）を効果的に抑制することのできる鎮痒剤として好適である。

食品（特に保健機能食品）の場合、または薬用化粧品、入浴剤等の医薬部外品の場合も、上述したような化粧品および／または医薬品の場合と同様である。

このような食品、化粧品、医薬部外品、医薬品等の形態（剤型）は、目的とする効果が得られる限り特に限定されるものではなく、適切な形態を選択すればよい。

例えば、化粧品、医薬部外品および医薬品については、所望の部位の皮膚に塗布することにより前述したような所定の効果を発揮することができる剤形のもの（皮膚外用剤）として製造することが可能である。そのような化粧品の具体例としては、オイル、クリーム、口紅、化粧水、ジェル、パック、口紅、リップクリーム、石鹸、ハンドソープ、ボディソープ、シャンプー、リンス、トリートメント、ヘアトニック、その他のエアゾール、ローション、スティック等が挙げられる。また、経皮投与型の医薬品の具体例としては、エアゾール剤、液剤、経皮吸収型製剤、懸濁剤・乳剤、貼付剤、軟膏剤、パップ剤、リニメント剤、ローション剤等が挙げられる。皮膚外用型の医薬部外品の具体例としては、上記の化粧品または医薬品と同様の剤形や、入浴剤等が挙げられる。

一方で、経口で摂取することにより前述したような所定の効果を発揮することができる医薬品および食品を製造することも可能である。

経口投与型の医薬品（内服薬）の具体例としては、液剤、エリキシル剤、カプセル剤、顆粒剤、丸剤、懸濁剤・乳剤、散剤、錠剤、シロップ剤、トローチ剤、リモナーデ剤等が挙げられる。経口投与型の医薬部外品の具体例としても、上記の医薬品と同様の剤形が挙げられる。

食品の具体例としては、乳製品、魚肉、畜肉、果実、野菜のビン詰、缶詰類、コーヒー、紅茶、ココア、緑茶、ジュース、炭酸飲料、乳酸飲料、乳酸菌飲料などの清涼飲料水、合成酒、洋酒などの酒類、パン、ビスケット、クラッカー、クッキー、パイ、プリン、バタークリーム、カスタードクリーム、シュークリーム、スポンジケーキ、ドーナツ、チョコレート、グミ、ガム、キャンデーなどの各種洋菓子、せんべい、あられ、餅類、あん類、羊羮、ゼリー、飴玉などの各種和菓子、フラワーペースト、ピーナッツペースト、フルーツペーストなどのペースト類、アイスクリーム、シャーベットなどの氷菓、果実のシロップ漬、氷蜜などのシロップ類、ジャム、マーマレード、シロップ漬、糖果などの果実、野菜の加工食品類、福神漬、べったら漬、千枚漬、らっきょう漬などの漬物類、ハム、ソーセージなどの畜肉製品類、魚肉ハム、魚肉ソーセージ、かまぼこ、ちくわ、天ぷらなどの魚肉製品、ウニ、イカの塩辛、さきするめ、酢コンブ、などの各種珍味類、のり、山菜、小魚、するめ、貝などで製造されるつくだ煮類、煮豆、ポテトサラダ、こんぶ巻などのそう菜食品、プリンミックス、ホットケーキミックス、即席しるこ、即席スープなどの即席食品、醤油、粉末醤油、味噌、粉末味噌、もろみ、ふりかけ、マヨネーズ、ドレッシング、食酢、三杯酢、中華の素、天つゆ、麺つゆ、ソース、ケチャップ、焼肉のタレ、カレールウ、シチューの素、スープの素、ダシの素、核酸系調味料、複合調味料、みりん、砂糖など各種調味料等が挙げられる。

このような形態の食品、化粧品、医薬部外品および医薬品は、本発明の発現促進剤および／または産生促進剤（すなわちＤ−グルコピラノシルグリセロール）と各形態に応じた各種の成分とを配合するようにして、各形態に応じた一般的な方法に従って製造することができる。それらの製品中のＤ−グルコピラノシルグリセロールの含有量は、目的とする効果が得られる限り特に限定されるものではなく、適切な含有量は通常行われるような試験を通じて、製品の形態（剤型）等を考慮しながら適切に調節すればよい。特に医薬品の場合は、患者の症状や年齢等の条件も考慮しながら、１日あたりの適切な投与量（有効成分量）を調節し、それに基づいて、１回あたりの医薬品中のＤ−グルコピラノシルグリセロールの含有量や、１日あたりの投与回数を設定することが適切である。

化粧品や経皮投与型の医薬部外品および医薬品のような皮膚外用剤の場合、Ｄ−グルコピラノシルグリセロールの含有量は、例えば、その皮膚外用剤の全量に対して、０．０１〜５０重量％、好ましくは０．１〜３０重量％、より好ましくは１〜２０重量％の範囲で調節することができる。含有量が高すぎる場合は、べたつきの原因となり、使用感が悪くなる。そのような化粧品、医薬部外品または医薬品は、例えば１日あたり１〜３回程度、１回につき０．０１〜１００ｍｇ／ｃｍ²程度、所望の部位の皮膚に塗布されるものとすることができる。入浴剤も、上記の皮膚外用剤と同程度の効果が得られるような態様で使用されるものとして調製することができる。

また、食品の場合、Ｄ−グルコピラノシルグリセロールの含有量は、例えば、その食品の全量に対して、通常０．０１〜４０重量％、好ましくは０．１〜２０重量％、より好ましくは０．５〜２０重量％の範囲で調節することができる。含有量が高すぎる場合は、食感が失われたり、成形することが困難となる。

［実施例１］
正常ヒト表皮角化細胞（Normal human epidermal keratinocyte: NHEK）を培養プレートに播種し、表皮角化細胞増殖培地（Keratinocyte-SFM）を用いて、サブコンフルエントになるまで培養した。続いて、「ＣＯＳＡＲＴＥ−２Ｇ」（東洋精糖株式会社）を２．５重量％含有する前記増殖培地で２４時間培養した（処理群）。

リアルタイムＲＴ−ＰＣＲによってｍＲＮＡ発現量を測定するためのキットとして「ライトサイクラ―」（ロシュダイアノスティック社製）を用いた。このキットのプロトコールに従って、処理群の培養細胞からＲＮＡを精製し、それを逆転写してｃＤＮＡを合成した。そこに含まれるフィラグリン遺伝子およびカスパーゼ−１４遺伝子を、SYBR Green I キット（ロシュダイアノスティック社製）を用いてリアルタイムＲＴ−ＰＣＲによって増幅し、各対象遺伝子のｍＲＮＡ発現量を定量した。また、内部標準とするＧＡＰＤＨ（Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase）についても、同様の手順でｍＲＮＡ発現量を定量した。

処理群について（対象遺伝子のｍＲＮＡ発現量）／（ＧＡＰＤＨのｍＲＮＡ発現量）の比率を求め、対象遺伝子に対する「発現促進率」とした。結果を図２に示す。フィラグリン遺伝子に対する発現促進率は２．６倍であり、カスパーゼ−１４遺伝子に対する発現促進率は５．０倍であった。

以上の結果は、Ｄ−グルコピラノシルグリセロールは、フィラグリン遺伝子及びカスパーゼ−１４遺伝子の発現を促進することができることを示している。このため、Ｄ−グルコピラノシルグリセロールを含有する発現促進剤は、角質層における天然保湿因子の産生量を相乗的に増加させることができる。したがって、本発明の発現促進剤を、食品、化粧品、医薬品等に配合して利用することにより、フィラグリン遺伝子およびカスパーゼ−１４遺伝子の発現促進効果を有する食品、化粧品、医薬品等を製造することが可能となる。

［実施例２］ＤＪＭ−１細胞を用いたＧＭＧによるフィラグリンの転写誘導試験
「ＣＯＳＡＲＴＥ−２Ｇ」（東洋精糖株式会社）を擬似移動層クロマト分離装置（オルガノ株式会社）に供し、ＧＭＧ（グリセリルモノグルコシド、分子量２５４。式（１）の糖縮合度ｎ＝１の化合物と、式（２）の糖縮合度ｎ＝１の化合物との混合物。）が全固形分の９９質量％以上になるまで精製した。本実施例では、この精製物を以下の実験におけるＧＭＧとして用いた。

ＤＪＭ−１細胞（ヒトケラチノサイト、毛包癌の一種malignant trichilemmal cyst由来細胞株、理研バイオリソースセンター）を、１．０×１０⁶ｃｆｕになるように６ウェルプレートに播種し、１０％ＦＢＳ（Cell Culture Bioscience）ならびにペニシリンおよびストレプトマイシン（Gibco）を添加したＭＥＭ培地（nacalai tesque）を用いて、３７℃、５％ＣＯ₂で２４時間培養した。続いて培養液を、５０ｍＭもしくは２００ｍＭのグリセリンまたは５０ｍＭもしくは２００ｍＭのＧＭＧを添加したＭＥＭ培地に交換し、上記培養条件でさらに２４時間培養した。

次に、上記培養細胞をＰＢＳで洗い、ISOGENE（ニッポン・ジーン）を用いてＲＮＡを単離した。このＲＮＡ１μｇをテンプレートとし、Transcriptor First Strand cDNA Synthesis Kit（Roche）を用いて逆転写ＰＣＲによりｃＤＮＡを合成した。そしてLight Cycler 480（Roche）を用いて、リアルタイムＰＣＲにより１８ｓｒＲＮＡとフィラグリンのｍＲＮＡ量を測定した。このリアルタイムＰＣＲで用いたプライマーの配列は下記の通りである。
hFLG1 Fw（フィラグリン遺伝子用フォワードプライマー）
ggcaaatcctgaagaatcca（配列番号１）
hFLG1 Rv（フィラグリン遺伝子用リバースプライマー）
tgctttctgtgcttgtgtcc（配列番号２）
18srRNA Fw（１８ｓｒＲＮＡ用フォワードプライマー）
actcaacacgggaaacctca（配列番号３）
18srRNA Rv（１８ｓｒＲＮＡ用リバースプライマー）
aaccagacaaatcgctccac（配列番号４）

上記の測定結果から、１８ｓｒＲＮＡの量で標準化した、フィラグリンの相対的なｍＲＮＡ量を求めた。結果を図３に示す。この結果によっても示されるように、Ｄ−グルコピラノシルグリセロール（ＧＭＧ）についてフィラグリン遺伝子等の発現促進効果が認められる一方、グリセリンにはそのような効果は認められない。ＣＯＳＡＲＴＥ−２Ｇを用いた実施例１の結果（および次に述べる実施例３の結果）は、当該製品に含まれるＤ−グルコピラノシルグリセロールが有効成分として作用したことに基づいていることは明らかである。

［実施例３］ＤＪＭ−１細胞を用いたＣＯＳＡＲＴＥ−２ＧによるＳＣＦの産生抑制試験
ＤＪＭ−１細胞を、１．０×１０⁵ｃｆｕになるように２４ウェルプレートに播種し、１０％ＦＢＳならびにペニシリンおよびストレプトマイシンを添加したＭＥＭ培地を用いて、３７℃、５％ＣＯ₂で２４時間培養した。続いて培養液を、ペニシリンおよびストレプトマイシンのみを含むＭＥＭ培地に交換し、上記培養条件でさらに１８時間培養した。１８時間後に、ペニシリンおよびストレプトマイシンに「ＣＯＳＡＲＴＥ−２Ｇ」（東洋精糖株式会社）を３質量％加えた培養液に交換した群（Ｉ）と、「ＣＯＳＡＲＴＥ−２Ｇ」を加えない培養液に交換した群（ＩＩ）に分け、さらに１２時間培養した。１２時間後にＳＣＦ誘導剤を添加しないＭＥＭ培地（ａ）と、ＳＣＦ誘導剤としてヒトＩＬ−４（１０ｎｇ／ｍＬ）を添加したＭＥＭ培地（ｂ）、ＶＩＰ（１μＭ）を添加したＭＥＭ培地（ｃ）、およびＩＬ−４（１０ｎｇ／ｍＬ）＋ＶＩＰ（１μＭ）を併用して添加したＭＥＭ培地（ｄ）に交換し、さらに１６時間培養した。１６時間後に培養上清を回収し、ＳＣＦの濃度をＥＬＩＳＡ法で測定した。なお、試験は各群について３反復行い（ｎ＝３）、ＳＣＦ濃度の測定値はその平均値±標準偏差である。

結果を図４に示す。まず、ＣＯＳＡＲＴＥ−２Ｇを添加しない場合（Ｉ）、培養液中のＳＣＦ濃度は、ＳＣＦ誘導剤無添加群（Ｉ−ａ；２８．５±７．３ｐｇ／ｍＬ）と比べて、ＩＬ−４添加群（Ｉ−ｂ；４９．６±３．６ｐｇ／ｍＬ）では、有意に高い値を示した（２群間のｔ−ｔｅｓｔ：Ｐ＜０．０５）。同じくＣＯＳＡＲＴＥ−２Ｇを添加しなかった場合、ＩＬ−４＋ＶＩＰ（Vasoactive Intestinal Peptide）添加群（Ｉ−ｄ）では、ＩＬ−４添加群（Ｉ−ｂ）と同程度のＳＣＦ値を示したが、ＳＣＦ誘導剤無添加群（Ｉ−ａ）との間で有意な差は認められなかった。ＶＩＰ添加群（Ｉ−ｃ）も、ＳＣＦ誘導剤無添加群（Ｉ−ａ）に比べて１０％程度高い値を示したが有意な差は認められなかった。

続いて、ＳＣＦ誘導剤無添加群（ａ）同士の間で、ＣＯＳＡＲＴＥ−２Ｇを添加しなかった場合（Ｉ）と添加した場合（ＩＩ）を比較すると、ＣＯＳＡＲＴＥ−２Ｇ添加群（ＩＩ−ａ）はＣＯＳＡＲＴＥ−２Ｇ無添加群（Ｉ−ａ）よりも約４０％程度低い値を示したが、有意な差は認められなかった。ところが、ＩＬ−４添加群（ｂ）同士の間で比較すると、ＣＯＳＡＲＴＥ−２Ｇ添加群（ＩＩ−ｂ）はＣＯＳＡＲＴＥ−２Ｇ無添加群（Ｉ−ｂ）に対して約３７％の有意に低い値を示した。ＶＩＰ添加群（ｃ）同士の間、ＩＬ−４＋ＶＩＰ添加群（ｄ）同士の間それぞれで比較しても、ＣＯＳＡＲＴＥ−２Ｇ添加群（Ｉ−ｃ，Ｉ−ｄ）は無添加群（ＩＩ−ｃ，ＩＩ−ｄ）よりも低い値を示したが有意な差は認められなかった。

［３−２］ＣＯＳＡＲＴＥ−２Ｇの添加による細胞増殖への影響を調べる目的で、ＷＳＴ−１試薬を用いて、生細胞に由来するＷＳＴ−１試薬の吸光度値を測定した。結果を図５に示す。ＩＬ−４添加群（ｂ）同士の間で比較すると、ＣＯＳＡＲＴＥ−２Ｇ添加群（Ｉ−ｂ；１．８２０±０．０５８）とＣＯＳＡＲＴＥ−２Ｇ無添加群（ＩＩ−ｂ；１．７９８±０．０３７）の比較でほぼ同程度であったであった。ＳＣＦ誘導剤無添加群（ａ）同士、ＶＩＰ添加群（ｃ）同士およびＩＬ−４＋ＶＩＰ添加群（ｄ）同士においては、ＣＯＳＡＲＴＥ−２Ｇ添加群（ＩＩ−ａ，ＩＩ−ｃ，ＩＩ−ｄ）はそれぞれのＣＯＳＡＲＴＥ−２Ｇ無添加群（Ｉ−ａ，Ｉ−ｃ，Ｉ−ｄ）に比べて５％から７．７％の低い値を示したが有意な差は認められなかった。

［３−３］前記［３−１］で測定したＳＣＦ濃度を前記［３−２］で測定したＷＳＴ−１の吸光度値で補正した値を算出した。結果を図６に示す。補正を行っていない図４と同様の傾向が見られ、ＩＬ−４添加群（ａ）同士の比較において、ＣＯＳＡＲＴＥ−２Ｇ添加群（ＩＩ−ａ）はＣＯＳＡＲＴＥ−２Ｇ無添加群（Ｉ−ａ）に比べて有意に低い値を示した。

以上の結果より、ＣＯＳＡＲＴＥ−２Ｇは、ＤＪＭ−１細胞（ヒトケラチノサイト培養細胞株）おいて、ＩＬ−４刺激により誘導されるＳＣＦの産生量の上昇を抑制する効果を示すことが明らかになった。また、ＶＩＰ刺激によるＳＣＦ産生上昇やＩＬ−４とＶＩＰの両方の刺激によるＳＣＦ産生上昇に対しても、それらを抑制し得ることが示唆された。さらに、ＤＪＭ−１細胞が無刺激のときにも、ＳＣＦの産生は抑制されうることが示唆された。

配列番号１：フィラグリン遺伝子用フォワードプライマー
配列番号２：フィラグリン遺伝子用リバースプライマー
配列番号３：１８ｓｒＲＮＡ用フォワードプライマー
配列番号４：１８ｓｒＲＮＡ用リバースプライマー

Claims (12)

1. Ｄ−グルコピラノシルグリセロールを含有することを特徴とする、フィラグリン遺伝子および／またはカスパーゼ−１４遺伝子の発現促進剤。
2. 前記Ｄ−グルコピラノシルグリセロールが、１−Ｏ−α−Ｄ−グルコピラノシルグリセロール、１−Ｏ−β−Ｄ−グルコピラノシルグリセロール、２−Ｏ−α−Ｄ−グルコピラノシルグリセロールおよび２−Ｏ−β−Ｄ−グルコピラノシルグリセロールの混合物である、請求項１に記載の発現促進剤。
3. 経口摂取されるものである、請求項１または２に記載の発現促進剤。
4. 塗布されるものである、請求項１または２に記載の発現促進剤。
5. 請求項３に記載の発現促進剤を含有することを特徴とする飲食品。
6. 請求項３または４に記載の発現促進剤を含有することを特徴とする、化粧品、医薬部外品または医薬品。
7. Ｄ−グルコピラノシルグリセロールを含有することを特徴とする、幹細胞因子（ＳＣＦ）の産生抑制剤。
8. 前記Ｄ−グルコピラノシルグリセロールが、１−Ｏ−α−Ｄ−グルコピラノシルグリセロール、１−Ｏ−β−Ｄ−グルコピラノシルグリセロール、２−Ｏ−α−Ｄ−グルコピラノシルグリセロールおよび２−Ｏ−β−Ｄ−グルコピラノシルグリセロールの混合物である、請求項１に記載の産生促成剤。
9. 経口摂取されるものである、請求項７または８に記載の産生抑制剤。
10. 塗布されるものである、請求項７または８に記載の産生抑制剤。
11. 請求項９に記載の産生抑制剤を含有することを特徴とする飲食品。
12. 請求項９または１０に記載の産生抑制剤を含有することを特徴とする、化粧品、医薬部外品または医薬品。