JP2019528762A5 - - Google Patents

Claims (34)

1. 複数の捕捉オリゴヌクレオチドを含む捕捉物体であって、前記複数のうちの各捕捉オリゴヌクレオチドが、
   プライミング配列と；
   捕捉配列と；
   ３つ以上のカセット化可能オリゴヌクレオチド配列を含むバーコード配列であって、各カセット化可能オリゴヌクレオチド配列が当該バーコード配列の他のカセット化可能オリゴヌクレオチド配列と同一でない、バーコード配列と、
   を含み、
   前記複数のうちの各捕捉オリゴヌクレオチドが同じバーコード配列を含む、
   捕捉物体。
2. 前記複数のうちの各捕捉オリゴヌクレオチドが最も５’側のヌクレオチドと最も３’側のヌクレオチドとを含み、
   前記プライミング配列が前記最も５’側のヌクレオチドに隣接するか、又はそれを含み、
   前記捕捉配列が前記最も３’側のヌクレオチドに隣接するか、又はそれを含み、
   前記バーコード配列が前記プライミング配列の３’側且つ前記捕捉配列の５’側に位置する、
   請求項１に記載の捕捉物体。
3. 前記３つ以上のカセット化可能オリゴヌクレオチド配列の各々が８〜１２ヌクレオチドを含む、請求項１に記載の捕捉物体。
4. 前記バーコード配列の前記３つ以上のカセット化可能オリゴヌクレオチド配列が、いかなる介在オリゴヌクレオチド配列もなしにタンデムで連結されている、請求項１から３のいずれか１項に記載の捕捉物体。
5. 前記バーコード配列の前記３つ以上のカセット化可能オリゴヌクレオチド配列の各々が、配列番号１〜４０のいずれか１つの配列を有する、請求項１から４のいずれか１項に記載の捕捉物体。
6. 前記バーコード配列が４つのカセット化可能オリゴヌクレオチド配列を含む、請求項１から５のいずれか１項に記載の捕捉物体。
7. 前記複数のうちの各捕捉オリゴヌクレオチドがunique molecule identifier（ＵＭＩ）配列を更に含む、請求項１から６のいずれか１項に記載の捕捉物体。
8. 前記ＵＭＩが前記プライミング配列の３’側且つ前記捕捉配列の５’側に位置する、請求項７に記載の捕捉物体。
9. 各捕捉オリゴヌクレオチドが、少なくとも８塩基対の認識配列を含む制限部位を更に含む、請求項１に記載の捕捉物体。
10. 前記捕捉配列が、ポリ−ｄＴ配列、ランダムヘキサマー配列、遺伝子特異的配列、又はモザイク末端配列を含む、請求項１から９のいずれか１項に記載の捕捉物体。
11. 複数の捕捉物体であって、前記複数のうちの各捕捉物体が請求項１に記載の捕捉物体であり、前記複数のうちの各捕捉物体の前記捕捉オリゴヌクレオチドの前記バーコード配列が、前記複数のうちの他のいずれの捕捉物体の前記捕捉オリゴヌクレオチドの前記バーコード配列とも異なる、複数の捕捉物体。
12. 配列番号４１〜８０のいずれか１つの配列を含むオリゴヌクレオチド配列と、
    蛍光標識と、
    を含む、ハイブリダイゼーションプローブ。
13. 複数のハイブリダイゼーションプローブを含む試薬であって、
    前記複数のうちの各ハイブリダイゼーションプローブが請求項１２に記載のハイブリダイゼーションプローブであり、
    前記複数のうちの各ハイブリダイゼーションプローブが、（ｉ）前記複数のうちの他のいずれのハイブリダイゼーションプローブの前記オリゴヌクレオチド配列とも同一でないオリゴヌクレオチド配列を含み、（ｉｉ）前記複数のうちの他のいずれのハイブリダイゼーションプローブの蛍光標識とも分光的に区別可能な蛍光標識を含む、
    試薬。
14. 前記複数のうちの第１のハイブリダイゼーションプローブが、配列番号４１〜８０の第１のサブセットから選択される配列と、第１の蛍光標識とを含み；
    前記複数のうちの第２のハイブリダイゼーションプローブが、配列番号４１〜８０の第２のサブセットから選択される配列と、前記第１の蛍光標識と分光的に区別可能な第２の蛍光標識とを含み、
    前記複数のうちの第３のハイブリダイゼーションプローブが、配列番号４１〜８０の第３のサブセットから選択される配列と、前記第１及び第２の蛍光標識の各々と分光的に区別可能な第３の蛍光標識とを含み、
    配列番号４１〜８０の前記第１、第２、及び第３のサブセットが重複のないサブセットである、
    請求項１３に記載の試薬。
15. マイクロ流体デバイス内での１つ以上の捕捉物体のインサイチュ同定方法であって、
    前記マイクロ流体デバイスのエンクロージャの中に位置する１つ以上の隔離ペンの各々の分離領域の中に前記１つ以上の捕捉物体のうちの単一の捕捉物体を配置することであって、各捕捉物体が複数の捕捉オリゴヌクレオチドを含み、前記複数のうちの各捕捉オリゴヌクレオチドが、
    プライミング配列と；
    捕捉配列と；
    バーコード配列であって、当該バーコード配列が３つ以上のカセット化可能オリゴヌクレオチド配列を含み、各カセット化可能オリゴヌクレオチド配列が前記バーコード配列の他のカセット化可能オリゴヌクレオチド配列と同一でない、バーコード配列と、
    を含むことと；
    第１のハイブリダイゼーションプローブセットを含む第１の試薬溶液を前記マイクロ流体デバイスの前記エンクロージャの中のフロー領域に流入させることであって、前記フロー領域が前記１つ以上の隔離ペンの各々に流体接続し、及び前記第１のセットの各ハイブリダイゼーションプローブが、
    前記１つ以上の捕捉物体のいずれかの前記捕捉オリゴヌクレオチドのいずれかの前記バーコード配列のいずれかに含まれるカセット化可能オリゴヌクレオチド配列と相補的なオリゴヌクレオチド配列であって、前記第１のセット中の各ハイブリダイゼーションプローブの前記相補的なオリゴヌクレオチド配列が前記第１のセット中の前記ハイブリダイゼーションプローブの他のいずれの相補的なオリゴヌクレオチド配列とも同一でない、相補的なオリゴヌクレオチド配列と；
    分光的に区別可能な蛍光標識のセットから選択される蛍光標識であって、前記第１のセット中の各ハイブリダイゼーションプローブの前記蛍光標識が前記第１のハイブリダイゼーションプローブセット中の他のいずれのハイブリダイゼーションプローブの前記蛍光標識とも異なる、蛍光標識と
    を含むことと；
    前記第１のセットの前記ハイブリダイゼーションプローブを前記１つ以上の捕捉物体のいずれかの前記捕捉オリゴヌクレオチドのいずれかの前記バーコード配列のいずれかにおける対応するカセット化可能オリゴヌクレオチド配列とハイブリダイズすることと；
    前記第１のハイブリダイゼーションプローブセットの各ハイブリダイゼーションプローブについて、前記１つ以上の捕捉物体のいずれかに関連する対応する蛍光シグナルを検出することと；
    前記１つ以上の隔離ペンのうちの１つの中に配置された各捕捉物体について、（ｉ）前記マイクロ流体デバイスの前記エンクロージャの中での前記隔離ペンの位置と、（ｉｉ）前記第１のハイブリダイゼーションプローブセットの各ハイブリダイゼーションプローブの前記対応する蛍光シグナルと前記捕捉物体との関連性又は非関連性と、を含むレコードを生成することであって、前記関連性及び非関連性のレコードが、前記捕捉物体を前記隔離ペンと関連付けるバーコードを構成することと、
    を含む方法。
16. 第ｎのハイブリダイゼーションプローブセットを含む第ｎの試薬溶液を前記マイクロ流体デバイスの前記フロー領域に流入させることであって、前記第ｎのセットの各ハイブリダイゼーションプローブが、
    前記１つ以上の捕捉物体のいずれかの前記捕捉オリゴヌクレオチドのいずれかの前記バーコード配列のいずれかに含まれるカセット化可能オリゴヌクレオチド配列と相補的なオリゴヌクレオチド配列であって、前記第ｎのセット中の各ハイブリダイゼーションプローブの前記相補的なオリゴヌクレオチド配列が前記第ｎのセット中及び前記マイクロ流体デバイスの前記フロー領域に流入させる任意の他のハイブリダイゼーションプローブセット中の前記ハイブリダイゼーションプローブの他のいずれの相補的なオリゴヌクレオチド配列とも同一でない、相補的なオリゴヌクレオチド配列と；
    分光的に区別可能な蛍光標識のセットから選択される蛍光標識であって、前記第ｎのセット中の各ハイブリダイゼーションプローブの前記蛍光標識が前記第ｎのハイブリダイゼーションプローブセット中の他のいずれのハイブリダイゼーションプローブの蛍光標識とも異なる、蛍光標識と を含むことと；
    前記第ｎのセットの前記ハイブリダイゼーションプローブを前記１つ以上の捕捉物体のいずれかの前記捕捉オリゴヌクレオチドのいずれかの前記バーコード配列のいずれかにおける対応するカセット化可能オリゴヌクレオチド配列にハイブリダイズすることと；
    前記第ｎのハイブリダイゼーションプローブセットの各ハイブリダイゼーションプローブについて、前記１つ以上の捕捉物体のいずれかに関連する対応する蛍光シグナルを検出することと；
    前記１つ以上の隔離ペンのうちの１つの中に配置された各捕捉物体について、前記レコードに、前記第ｎのハイブリダイゼーションプローブセットの各ハイブリダイゼーションプローブの前記対応する蛍光シグナルと前記捕捉物体との関連性又は非関連性を補足することと、
    を更に含む、請求項１５に記載の方法であって
    ｎが、｛２，．．．，ｍ｝の値を有する正の整数の集合であり、
    ｍが２以上の値を有する正の整数であり、
    前述の前記第ｎの試薬を流入させるステップ、前記第ｎのハイブリダイゼーションプローブセットをハイブリダイズするステップ、前記対応する蛍光シグナルを検出するステップ、及び前記レコードを補足するステップが、前記正の整数の集合｛２，．．．，ｍ｝中のｎの各値について繰り返され、
    ｍが３以上及び２０以下の値を有する、方法。
17. 各捕捉物体の各捕捉オリゴヌクレオチドの各バーコード配列が３又は４つのカセット化可能オリゴヌクレオチド配列を含む、請求項１５又は１６に記載の方法。
18. 前記第１のハイブリダイゼーションプローブセット及び前記第ｎのハイブリダイゼーションプローブセットの各々が３又は４つのハイブリダイゼーションプローブを含む、請求項１６に記載の方法。
19. 前記マイクロ流体デバイスの前記１つ以上の隔離ペンの中に１つ以上の生体細胞を配置することを更に含む、請求項１５から１８のいずれか１項に記載の方法であって、前記１つ以上の生体細胞の各１つずつが、前記１つ以上の隔離ペンのうちの異なる隔離ペンに配置される、方法。
20. 前記マイクロ流体デバイスの前記エンクロージャが誘電泳動（ＤＥＰ）構成を更に含み、前記１つ以上の捕捉物体を１つ以上の隔離ペン内に配置することが誘電泳動（ＤＥＰ）力を用いて実施される、請求項１５から１９のいずれか１項に記載の方法。
21. 前記マイクロ流体デバイスの前記エンクロージャが誘電泳動（ＤＥＰ）構成を更に含み、前記１つ以上の生体細胞を前記１つ以上の隔離ペンの中に前記配置することが誘電泳動（ＤＥＰ）力を用いて実施される、請求項１９から２０のいずれか１項に記載の方法。
22. ゲノムデータをマイクロ流体デバイス内の生体細胞と相互に関係付ける方法であって、
    捕捉物体をマイクロ流体デバイスの隔離ペン内に配置することであって、前記捕捉物体が複数の捕捉オリゴヌクレオチドを含み、前記複数のうちの各捕捉オリゴヌクレオチドが、
    プライミング配列と；
    捕捉配列と；
    バーコード配列であって、当該バーコード配列が３つ以上のカセット化可能オリゴヌクレオチド配列を含み、各カセット化可能オリゴヌクレオチド配列が前記バーコード配列の他のカセット化可能オリゴヌクレオチド配列と同一でない、バーコード配列と
    を含み；
    前記複数のうちの各捕捉オリゴヌクレオチドが前記同じバーコード配列を含むことと；
    前記複数の捕捉オリゴヌクレオチドの前記バーコード配列をインサイチュで同定すること及び前記同定されたバーコード配列と前記隔離ペンとの間の関連性を記録することと；
    前記生体細胞を前記隔離ペン内に配置することと；
    前記生体細胞を溶解させること及び前記溶解した生体細胞から放出される核酸を、前記捕捉物体に含まれる前記複数の捕捉オリゴヌクレオチドによって捕捉させることと；
    前記捕捉された核酸を転写することであって、それにより、各バーコード付きｃＤＮＡが前記捕捉オリゴヌクレオチドのうちの１つに共有結合的に結合した相補的な捕捉核酸配列を含む複数のバーコード付きｃＤＮＡを作製することと；
    前記転写核酸及び前記バーコード配列をシーケンシングすることであって、それにより前記バーコード配列のリード配列に関連する前記複数の転写核酸のリード配列を入手することと；
    前記リード配列に基づき前記バーコード配列を同定することと；
    前記リード配列によって同定されたバーコード配列及び前記インサイチュで同定されたバーコード配列を使用して前記複数の転写核酸の前記リード配列を前記隔離ペンと関連付けること、及びそれにより前記複数の転写核酸の前記リード配列を前記隔離ペン内に置かれた前記生体細胞と相互に関係付けることと、
    を含む方法。
23. 前記生体細胞の表現型を観察することと；
    前記複数の転写核酸の前記リード配列を前記生体細胞の前記表現型と相互に関係付けることと、
    を更に含む、請求項２２に記載の方法。
24. 前記複数の捕捉オリゴヌクレオチドの前記バーコード配列をインサイチュで同定することが、請求項１５に記載の方法を実施することを含む、請求項２２又は２３に記載の方法。
25. 複数の捕捉物体を前記マイクロ流体デバイスの対応する複数の隔離ペン内に配置することと；
    複数の生体細胞を前記対応する複数の隔離ペン内に配置することと、
    前記複数の捕捉物体及び複数の生体細胞の各々を前記方法の前記追加的なステップに従い処理することと、
    を更に含む、請求項２２から２４のいずれか１項に記載の方法。
26. 核酸ライブラリを作製するためのキットであって、
    マイクロ流体デバイスであって、
    エンクロージャであって、前記エンクロージャがフロー領域と前記フロー領域に通じる複数の隔離ペンとを含む、エンクロージャと；
    誘電泳動（ＤＥＰ）構成と、
    を含むマイクロ流体デバイスと；
    複数の捕捉物体であって、前記複数のうちの各捕捉物体が複数の捕捉オリゴヌクレオチドを含み、前記複数のうちの各捕捉オリゴヌクレオチドが、
    捕捉配列と；
    少なくとも３つのカセット化可能オリゴヌクレオチド配列を含むバーコード配列であって、当該バーコード配列の各カセット化可能オリゴヌクレオチド配列が当該バーコード配列の他のカセット化可能オリゴヌクレオチド配列と同一でない、バーコード配列と；
    を含み、
    前記複数のうちの各捕捉オリゴヌクレオチドが同じバーコード配列を含み、
    前記複数の捕捉物体が、請求項１１に記載の複数の捕捉物体である、
    キット。
27. 複数のハイブリダイゼーションプローブであって、各ハイブリダイゼーションプローブが、
    前記複数の捕捉物体のいずれか１つの前記複数の捕捉オリゴヌクレオチドの前記カセット化可能オリゴヌクレオチド配列のいずれか１つに相補的なオリゴヌクレオチド配列と；
    標識と
    を含む、複数のハイブリダイゼーションプローブを更に含む、請求項２６に記載のキットであって
    前記複数のうちの各ハイブリダイゼーションプローブの前記相補的な配列が異なるカセット化可能オリゴヌクレオチド配列に相補的であり；
    前記複数のうちの各ハイブリダイゼーションプローブの前記標識が分光的に区別可能な標識のセットから選択される、
    キット。
28. 生体細胞からバーコード付きｃＤＮＡライブラリを提供する方法であって、
    マイクロ流体デバイスのエンクロージャの中に位置する隔離ペンの中に前記生体細胞を配置することと；
    前記隔離ペンの中に捕捉物体を配置することであって、前記捕捉物体が複数の捕捉オリゴヌクレオチドを含み、前記複数のうちの各捕捉オリゴヌクレオチドが、
    プライマーに結合するプライミング配列と；
    捕捉配列と；
    バーコード配列であって、当該バーコード配列が３つ以上のカセット化可能オリゴヌクレオチド配列を含み、各カセット化可能オリゴヌクレオチド配列が当該バーコード配列の他のいずれのカセット化可能オリゴヌクレオチド配列とも同一でない、バーコード配列と、
    を含み；前記複数のうちの各捕捉オリゴヌクレオチドの前記バーコード配列が同じであることと；
    前記生体細胞を溶解させること及び前記溶解した生体細胞から放出される核酸を、前記捕捉物体に含まれる前記複数の捕捉オリゴヌクレオチドによって捕捉させることと；
    前記捕捉された核酸を転写することであって、それにより前記捕捉物体をデコレートする複数のバーコード付きｃＤＮＡを作製し、各バーコード付きｃＤＮＡが、（ｉ）前記捕捉された核酸のうちの対応する１つに相補的なオリゴヌクレオチド配列、それが共有結合的に結合した（ｉｉ）前記複数の捕捉オリゴヌクレオチドのうちの１つを含むことと、
    を含む方法。
29. 前記複数の捕捉オリゴヌクレオチドのうちの１つ以上の前記捕捉配列が遺伝子特異的プライマー配列を含み、
    前記遺伝子特異的プライマー配列が、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）又はＢ細胞受容体（ＢＣＲ）をコードするｍＲＮＡ配列を標的にする、
    請求項２８に記載の方法。
30. 前記捕捉物体が前記隔離ペンの中に位置する間に、前記捕捉物体の前記複数の捕捉オリゴヌクレオチドの前記バーコード配列をインサイチュで同定することを更に含み、
    前記バーコードを前記同定することが、請求項１５から２１のいずれか１項に記載の方法を用いて実施される、
    請求項２８又は２９に記載の方法。
31. 前記マイクロ流体デバイスの前記エンクロージャが誘電泳動（ＤＥＰ）構成を更に含み、前記生体細胞を配置すること及び／又は前記捕捉物体を配置することが、前記生体細胞及び／又は前記捕捉物体上に又はそれに近接して誘電泳動（ＤＥＰ）力を印加することによって実施される、請求項２８から３０のいずれか１項に記載の方法。
32. 生物学的微小物体からバーコード付きゲノムＤＮＡライブラリを提供する方法であって、
    ゲノムＤＮＡを含む生物学的微小物体をマイクロ流体デバイスのエンクロージャの中に位置する隔離ペンの中に配置することと；
    前記生物学的微小物体の核膜を破壊する能力を有する溶解試薬を前記生物学的微小物体に接触させることであって、それにより前記生物学的微小物体のゲノムＤＮＡを放出させることと；
    前記放出されたゲノムＤＮＡをタグメンテーションすることであって、それにより第１のタグメンテーション挿入配列によって定義される第１の末端と第２のタグメンテーション挿入配列によって定義される第２の末端とを有する複数のタグメント化ゲノムＤＮＡ断片を作製することと；
    前記隔離ペンの中に捕捉物体を配置することであって、前記捕捉物体が複数の捕捉オリゴヌクレオチドを含み、前記複数のうちの各捕捉オリゴヌクレオチドが、
    第１のプライミング配列と；
    第１のタグメンテーション挿入捕捉配列と；
    バーコード配列であって、当該バーコード配列が３つ以上のカセット化可能オリゴヌクレオチド配列を含み、各カセット化可能オリゴヌクレオチド配列が前記バーコード配列の他のいずれのカセット化可能オリゴヌクレオチド配列とも同一でない、バーコード配列と、
    を含み、前記複数のうちの各捕捉オリゴヌクレオチドの前記バーコード配列が同じであることと；
    前記複数のタグメント化ゲノムＤＮＡ断片のうちの１つを、（ｉ）前記捕捉物体の前記複数の捕捉オリゴヌクレオチドのうちの１つの前記第１のタグメンテーション挿入捕捉配列、（ｉｉ）第２のタグメンテーション挿入捕捉配列、ランダム化プライマー配列、又は遺伝子特異的プライマー配列に結合した第２のプライミング配列を含む増幅オリゴヌクレオチド、及び（ｉｉｉ）鎖置換酵素とポリメラーゼとを含む酵素混合物と接触させることと；
    前記接触させた複数のタグメント化ゲノムＤＮＡ断片をある期間インキュベートすることであって、それにより同時に前記複数のタグメント化ゲノムＤＮＡ断片のうちの前記１つを増幅するとともに前記捕捉オリゴヌクレオチド及び前記増幅オリゴヌクレオチドを前記複数のタグメント化ゲノムＤＮＡ断片のうちの前記１つの末端に付加して前記バーコード付きゲノムＤＮＡライブラリを作製することと；
    前記バーコード付きゲノムＤＮＡライブラリを前記マイクロ流体デバイスから搬出することと、
    を含む方法。
33. 前記捕捉物体が前記隔離ペンの中に位置する間に、前記捕捉物体の前記複数の捕捉オリゴヌクレオチドの前記バーコード配列をインサイチュで同定することを更に含み、
    前記バーコード配列を前記同定することが、請求項１５から２１のいずれか１項に記載の方法を用いて実施される、
    請求項３２に記載の方法。
34. 単一の生体細胞からバーコード付きｃＤＮＡライブラリ及びバーコード付きゲノムＤＮＡライブラリを提供する方法であって、
    マイクロ流体デバイスのエンクロージャの中に位置する隔離ペンの中に前記生体細胞を配置することと；
    前記隔離ペンの中に第１の捕捉物体を配置することであって、前記第１の捕捉物体が複数の捕捉オリゴヌクレオチドを含み、前記複数のうちの各捕捉オリゴヌクレオチドが、
    第１のプライミング配列と；
    第１の捕捉配列と；
    第１のバーコード配列であって、当該第１のバーコード配列が３つ以上のカセット化可能オリゴヌクレオチド配列を含み、各カセット化可能オリゴヌクレオチド配列が前記第１のバーコード配列の他のいずれのカセット化可能オリゴヌクレオチド配列とも同一でない、第１のバーコード配列と、
    を含み、前記複数のうちの各捕捉オリゴヌクレオチドの前記バーコード配列が同じであることと；
    請求項２８から３１のいずれか１項に記載の方法を実施することにより前記バーコード付きｃＤＮＡライブラリを入手することであって、前記生体細胞を溶解させることが、前記生体細胞の細胞膜が分解されて前記生体細胞から細胞質ＲＮＡが放出される一方で、前記生体細胞の核膜はインタクトなまま残るように実施され、それにより前記生体細胞の前記ＲＮＡからの前記バーコード付きｃＤＮＡライブラリでデコレートされた前記第１の捕捉物体が提供されることと；
    前記ｃＤＮＡライブラリでデコレートされた第１の捕捉物体を前記マイクロ流体デバイスから搬出することと；
    前記隔離ペンの中に第２の捕捉物体を配置することであって、前記第２の捕捉物体が複数の捕捉オリゴヌクレオチドを含み、各々が、
    第２のプライミング配列と；
    第１のタグメンテーション挿入捕捉配列と；
    第２のバーコード配列であって、当該第２のバーコード配列が３つ以上のカセット化可能オリゴヌクレオチド配列を含み、各カセット化可能オリゴヌクレオチド配列が前記第２のバーコード配列の他のいずれのカセット化可能オリゴヌクレオチド配列とも同一でない、第２のバーコード配列と、
    を含み、前記複数のうちの各捕捉オリゴヌクレオチドの前記バーコード配列が同じであることと；
    請求項３２又は３３に記載の方法を実施することにより前記バーコード付きゲノムＤＮＡライブラリを入手することであって、前記生体細胞からの複数のタグメント化ゲノムＤＮＡ断片が前記第２の捕捉物体の前記複数の捕捉オリゴヌクレオチドのうちの１つの前記第１のタグメンテーション挿入捕捉配列と接触し、それにより前記生体細胞の前記ゲノムＤＮＡからの前記バーコード付きゲノムＤＮＡライブラリが提供されることと；
    前記バーコード付きゲノムＤＮＡライブラリを前記マイクロ流体デバイスから搬出することと、
    を含む方法。