JP2019524764A - 分子電子センサーのための修飾ヌクレオチド三リン酸 - Google Patents
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Abstract
Description
この出願は、「Modified Nucleotides for Molecular Sensors」との表題の2016年8月1日に出願された米国仮特許出願第62/369,696号、および「Modified Nucleotide Triphosphates for Molecular Electronic Sensors」との表題の2017年1月31日に出願された米国仮特許出願第62/452,466号(これらの開示は、それらの全体が参考として本明細書に援用される)に対する優先権を主張する。
から選択され、修飾ヌクレオチドは、DNA配列決定中のDNA鋳型の複製においてDNAポリメラーゼにより組み込まれる。様々な実施形態では、修飾dNTPは、天然三リン酸部分の代わりに、四リン酸または六リン酸部分を含み得る。
である、化合物[16]である。
式中、
Nucは、A、T、CおよびGから選択されるDNA塩基であり;
Yは、OH、SHまたはBH3から選択され;
nは、2〜5の整数であり;
R3は、Hまたはハロゲンから選択され;
R1は、H、任意選択でハロゲン、MeもしくはOMeもしくは−(CH2CH2O)xMe(式中、xは1〜20の整数である)で置換されている直鎖もしくは分岐鎖C1〜C5アルキル、C3〜C8シクロアルキルもしくはアリールから選択され;
L2は、−(CH2)q−(式中、qは1〜10の整数である)、−CH2CH2(OCH2CH2)y−(式中、yは1〜約8の整数である)、−(CH2)q−O−(CH2CH2O)y−CH2−(式中、qは1〜約10の整数であり、yは1〜約8の整数である)、−CO(CH2)r−(式中、rは1〜約10の整数である)、−COCH2CH2(OCH2CH2)z−(式中、zは1〜6の整数である)、−COCH2CH2CONH(CH2)m−(式中、mは1〜6の整数である)、−COCH2CH2CONH(CH2CH2O)pCH2CH2−(式中、pは1〜6の整数である)、1,4−ベンゼンジイル、1,3−ベンゼンジイルまたは1,2−ベンゼンジイル(炭素原子は任意選択で、かつ独立して、ハロゲン、Me、Et、OH、OMeもしくはCF3で置換されている)から選択され、または
R4およびR5は独立して、H、フェニル、
から選択される。
dNTPの4種の特定の形態は、DNAの4種の塩基/文字に対応し、これらは、塩基組成においてのみ異なる、dATP(アデノシン)、dCTP(シチジン)、dGTP(グアノシン)およびdTTP(チミジン)である。本明細書で、分子上の塩基は、文字(A、C、G、T)により、または一般的には「Nu」もしくは「Nuc」により示され得る。全ての天然dNTPは、三リン酸部分を有し、3つのリン酸基は、デオキシリボースの5’OHに結合したリン酸で始まるα、βおよびγとして示される。ポリメラーゼが触媒するDNA鎖伸長では、デオキシリボース上の3’OH基および5’α−リン酸部位が、組み込みおよび鎖伸長に参加する。4種の特定のdNTPは、DNAポリメラーゼが、鋳型鎖によりガイドされて伸長鎖に組み込む化学基質である。このプロセスの最も重要な特色は、伸長中の鎖の3’OH基が、入ってきたヌクレオチドの5’炭素−α−リン酸基とカップリングするとき、βおよびγ−リン酸基が、ポリメラーゼ酵素の作用によりピロリン酸基として共に放出されることである。
本明細書で使用されるとき、様々な化学化合物は、アラビア数字により標識および特定され得る(例えば、化合物[1]、[2]、[3]など)。他の化合物は、ローマ数字により標識および特定され得る(例えば、化合物[VI]、[VII]、[VIII]など)。アラビア数字で標識される化合物は、同等のローマ数字で標識される化合物とは異なる。一例として、化合物[16]および化合物[XVI]は、異なる化合物である。
図5Aは、センサーのポリメラーゼ周囲の溶液中の様々な標準のdNTPで作動するセンサーの図解を例示する。図5Aの右の模式図は、同じセンサーであるが、ポリメラーゼ周囲の溶液中に修飾dNTPを含むものを示す。図5Aの左で、分子電子DNA配列センサーの一実施形態は、電気回路を完成させるための架橋分子に取り付けられたポリメラーゼを含み、溶液中のdNTPを組み込むことによる鋳型の加工処理は、組み込み事象および組み込まれた塩基の正体を示すスパイクを生成する。
(1)置換基上の負電荷または正電荷と分子センサーの伝導部分との直接相互作用を通して。特定の実施形態を、限定ではなく、図30A〜30Dに示す;
(2)置換基の1つまたは複数により提供される芳香族環と分子センサーの伝導部分との直接π−πおよび疎水性相互作用を通して。特定の実施形態を、限定ではなく、図31A〜31Dに示す;
(3)例えば、N−アルキル−ピリジニウム(正の)置換基またはピレンスルホン酸(負の)置換基との、電荷およびπ−π相互作用の両方を通して。特定の実施形態を、限定ではなく、図32Aおよび32Bに示す;
(4)(例えば、フェロセンまたはヒドロキノンなどの可逆的に酸化可能な基についての)R1の電気化学的還元および酸化を通して。特定の実施形態を、限定ではなく、図33Aおよび33Bに示す;
(5)R1が、伝導性分子構成要素、例えばグラフェンナノリボン、ポリチオフェンポリマーまたは多環芳香族炭化水素環リボン構造を含有し、センサーが、2つの接続切断された伝導体(各々が異なる金属電極に連結している)を含有する場合、前記2つの伝導体間の伝導性連結を創出および破壊することを通して。特定の実施形態を、限定ではなく、図34に示す;
(6)R1が、リン酸末端の付近で狭く、他の末端で広い、長く硬い分子である場合、R1の長さに依存する様式でリンカーと伝導体との間の相互作用を変更する、ポリメラーゼから伝導体へリンカーを引き伸ばす伝導体と広い末端との立体相互作用を通して。様々な態様では、リンカーは、伝導体に結合し、会合または解離に際して伝導性を変更し得る複数の基、例えば芳香族環を含有し得る。リンカー上に複数の基があるので、リンカーが短い場合、伝導体からの基の解離がないこと、リンカーが中間の長さの場合、一部の基の部分解離、およびリンカーが十分に長い場合、基の完全解離を観察することが可能であり、各々は、別個の電気シグナルを有する。R1の硬さおよび広い末端は、十分に長いR1の場合、この分子が結合したときに、基の部分または完全解離が起こるように、伝導体がポリメラーゼに接触しポリメラーゼから突き離されることを確実にする。特定の実施形態を、限定ではなく、図35Aおよび35BでR1および伝導体とポリメラーゼとの間のリンカーについて示す;
(7)間接的に、修飾dNTPの組み込み中にポリメラーゼのコンフォメーション変化を変更することにより。様々な実施形態では、R1は、dNTPまたはDNA結合部位付近のポリメラーゼ上の特異的部位に結合し得るか、またはリンカーとポリメラーゼとの相互作用を変更し得る。また、置換基、nおよびYの変化は、ポリメラーゼにおけるコンフォメーション変化の時間依存性または動態に影響を及ぼす場合があり、これは、電極間の導電性がコンフォメーション変化に感受性である場合、シグナルを増幅し得る。dNTP誘導体構造の具体的な例を、限定ではなく、図36Aおよび36Bに示す。
図17は、ポリメラーゼ酵素を含む分子センサーにおけるシグナル増強に有用な、別の一般的なクラスの修飾dNTPを例示する。これらの化合物[17]は、DNA骨格への修飾としてのY、n≧1のポリリン酸鎖および連結/結合二価基L1およびL2を伴う一般基R1を許容し、置換基R3を介した追加の許容される修飾を伴う。化合物[17]では、R1は、H、アルキル(例えば、直鎖または分岐鎖C1〜C5)、シクロアルキル(例えば、C3〜C8)、−(CH2CH2O)xMe(xは1〜約20の整数である)またはアリールから選択され、任意のアルキルは、任意の程度まで分岐し、任意のアルキル、シクロアルキルまたはアリール置換基は任意選択で、ハロゲン、MeまたはOMeで置換されている。また、化合物[17]では、Y=OH、SHまたはBH3であり、Nucは、DNA塩基、例えば非修飾A、T、CまたはGである。さらに化合物[17]について、二価部分−L1−および−L2−は任意選択で、かつ独立して、共有結合、リンカー/スペーサー、例えば−(CH2)q−(qは1〜約10の整数である)、−CH2CH2(OCH2CH2)y−(yは1〜約8の整数である)、−(CH2)q−O−(CH2CH2O)y−CH2−(qは1〜約10の整数であり、yは1〜約8の整数である)、−CO(CH2)r−(rは1〜約10の整数である)、−COCH2CH2(OCH2CH2)z−(zは1〜約6の整数である)、−COCH2CH2CONH(CH2)m−(mは1〜約6の整数である)、−COCH2CH2CONH(CH2CH2O)pCH2CH2−(pは1〜約6の整数である)、1,4−ベンゼンジイル、1,3−ベンゼンジイルまたは1,2−ベンゼンジイル(炭素原子は任意選択で、かつ独立して、ハロゲン、Me、Et、OH、OMeまたはCF3で置換され、任意の炭素原子(複数可)は任意選択で、かつ独立して、窒素原子(複数可)で置き換えられている)である。
鋳型:プライマーをアニールした、1μMの一本鎖鋳型DNA;
鋳型配列:(70塩基、ポリACTG):5’−CGC CGC GGA GCC AAG ACTG ACTG ACTG ACTG ACTG ACTG ACTG ACTG ACTG ACTG TTG CAT GTC CTG TGA−3’(配列番号6);
プライマー配列:(15塩基):5’−TCA CAG GAC ATG CAA−3’(配列番号7)
緩衝液:10mM Tris、10mM MgCl2、50mM NaCl;
dNTP濃度:2.5mMの各ヌクレオチド、10μMの総dNTP濃度;
酵素:5ユニットのクレノウ exo−;
条件:37℃で30分間インキュベーション;
画像化:臭化エチジウム染料を含むTAE中の3.5%アガロースゲル。
ポリメラーゼ活性アッセイにおけるレーンについてのキーは、以下の通りである:
1−100塩基DNAサイズラダー
2−DNAのみ(ポリメラーゼもdNTPもなし)
3−DNA+クレノウポリメラーゼのみ(dNTPなし)
4−4種のdNTP(ネイティブ形態)
5−4種のddNTP(ジデオキシターミネーター)
6−4種の修飾dNTP
5−ブロモ−2’−デオキシシチジン−5’−三リン酸
7−デアザ−2’−デオキシグアノシン−5’−三リン酸
7−デアザ−2’−デオキシアデノシン−5’−三リン酸
2−チオチミジン−5’−三リン酸(2チオdTTP)
7−dC4P−DMA、他のdNTPネイティブ
8−dC4P−DBCP、他のdNTPネイティブ
9−dC4P−Cy7、他のdNTPネイティブ
10−dC4P−DMA+クレノウポリメラーゼのみ、鋳型DNAなし
11−dC4P−DMAのみ、ポリメラーゼなし
12−低分子量DNAサイズラダー
図20A〜20Fで示す修飾dNTPの合成を含む、本明細書中の様々な修飾dNTPを生成するために使用した化学合成を開示する。これらの分子のうちの3つの機能性を、図21で示す伸長アッセイ結果で例示し、これは、ポリメラーゼ酵素がこれらの分子を組み込み、伸長し得ることを示す。以下のこれらの分子は、最初の分子生成物に基を付加するためにDBCO媒介クリック化学のプロセスに由来するが、他のクリック化学は、かかる分子のファミリーの基礎として同様に利用され得ることがさらに留意される。
DBCO−PEG−OH(化合物[IV])の合成について図22を参照されたい。
1H NMR (499 MHz, クロロホルム-d) δ 7.65 (dd, J = 7.6, 1.3Hz, 1H), 7.53−7.42 (m, 1H), 7.42−7.17 (m, 6H), 6.41 (t, J = 5.7 Hz, 1H), 5.12 (d, J =13.9 Hz, 1H), 3.75−3.49 (m, 10H), 3.44 (dddd, J= 28.0, 10.0, 6.3, 4.0 Hz, 2H), 3.36−3.21 (m, 2H), 2.78(ddd, J = 16.8, 8.5, 6.2 Hz, 1H), 2.41 (ddd, J = 14.8, 8.5, 6.1Hz, 1H), 2.16 (dt, J = 15.1, 6.2 Hz, 1H), 2.01−1.86(m, 1H).
質量:C25H28N2O5の計算値、[M]:436.20、実測値:[M+23]459.5 陽イオン質量(positive mass)で。
HPLC:10分間HT−LC−MS法、生成物の保持時間:6.5分。
DBCO−PEG−一リン酸(化合物[V])の合成について図23を参照されたい。
HPLC:10分間HT−LC−MS法、出発物質DBCO−PEG−アルコールの保持時間:6.5分;生成物の保持時間:1群の3つのピーク:5.0分、5.2分および5.5分。
質量:C25H31N2O14P3の計算値、[M]:676.4、実測値:[M−1]675.3 陰イオン質量(negative mass)で。
dC−P4−クリック(化合物[VIII])の合成について図24A〜24Bを参照されたい。
HPLC:10分間HT−LC−MS法、出発物質の保持時間:1群の3つのピーク:5.0分、5.2分および5.5分。生成物CP4−クリックの保持時間:4.8および4.9分、2つのピーク。
1H NMR (500 MHz, 酸化ジュウテリウム) δ 7.96 (t, J = 8.5 Hz, 1H), 7.66(d, J = 7.4 Hz, 1H), 7.60−7.30 (m, 7H), 6.33 (t,J = 6.7 Hz, 1H), 6.15 (q, J = 7.8 Hz, 1H), 5.09 (d, J =14.4 Hz, 1H), 4.78 (s, 100H), 4.67−4.53 (m, 1H), 4.21(d, J = 5.0 Hz, 4H), 4.13 (d, J = 7.1 Hz, 2H), 3.83 (d, J= 14.4 Hz, 1H), 3.75 (q, J = 7.1, 6.0 Hz, 2H), 3.69 (q, J = 6.5,5.2 Hz, 2H), 3.63−3.54 (m, 2H), 3.47 (dt, J =10.6, 5.3 Hz, 1H), 3.38 (dq, J = 11.3, 5.9 Hz, 1H), 3.24−3.05 (m, 54H), 2.53 (dt, J = 15.5, 5.8 Hz, 1H), 2.44−2.32 (m, 1H), 2.24 (tdq, J = 20.8, 14.3, 7.0 Hz, 4H), 1.91(d, J = 1.2 Hz, 9H), 1.26 (td, J = 7.4, 1.0 Hz, 82H).
リンNMR:−11.0(m、積分100)、−22.4(m、積分100)。
質量分析。M=965 陰イオン:M−Hの計算値:964.6 実測値:964.3。
dC−P4−pip−DMA(化合物[X])の合成について図25A〜25Bを参照されたい。
1H NMR (500 MHz, メタノール-d4) δ 8.12 (d, J =7.3 Hz, 1H), 8.01 (dot, J = 8.7, 3.2 Hz, 3H), 7.60 (d, J = 7.5Hz, 1H), 7.51 (dd, J = 20.4, 11.8 Hz, 4H), 7.43−7.20(m, 2H), 7.16 (d, J = 8.1 Hz, 1H), 7.02 (d, J = 9.3 Hz, 1H), 6.38−6.19 (m, 1H), 6.02 (t, J = 16.7 Hz, 0H), 5.85 (d, J =16.2 Hz, 0H), 4.67−4.51 (m, 1H), 4.51−4.21 (m, 3H), 4.07 (s, 2H), 3.78 (t, J = 7.4 Hz, 1H), 3.73−3.32 (m, 9H), 3.27−3.07 (m, 25H), 3.09−2.70 (m, 6H), 2.66 (s, 1H), 2.33 (q, J = 9.4, 8.5 Hz, 1H),2.27−1.95 (m, 3H), 1.82−1.53(m, 2H), 1.54−1.35 (m, 18H).
リンNMR:−10.63(m、積分100)、−22.06(m、積分108)。
質量:M=1554.4 陰イオン:M−1の計算値:1553.4(M−1である)、実測値:1552.8 M+Na−2Hの計算値:1575.4 実測値:1574.8。
dCP4−Cy7(化合物[XII])の合成について図26A〜26Bを参照されたい。
HPLC:10分間HT−LC−MS法;出発物質dCP4−クリックの保持時間:4.8および4.9分、2つのピーク;Cy7−アジドの保持時間:4.59分;クリック付加物の保持時間:4.48分。
1H NMR (500 MHz, メタノール-d4) δ 7.96−7.76 (m, 1H), 7.74 (d, J = 1.7 Hz, 1H), 7.67−7.42 (m, 1H), 7.41−7.21 (m, 2H), 7.17−7.01 (m, 1H), 6.42 (d, J = 14.0 Hz, 1H), 4.53 (d, J =37.3 Hz, 1H), 4.38−3.99 (m, 3H), 3.80−3.40 (m, 3H), 3.28−3.11 (m, 17H), 3.08−2.97 (m, 1H), 2.94 (t, J = 6.8 Hz, 2H), 2.78 (t, J =6.4 Hz, 2H), 2.60−2.43 (m, 1H), 2.21 (p, J = 7.1Hz, 3H), 2.11−1.97 (m, 1H), 1.74 (p, J = 6.8 Hz,1H), 1.22 (t, J = 4.3 Hz, 6H).
リンNMR:妥当なリンNMRを得るために利用可能な物質が少なすぎた。シグナルは非常に弱かった。しかしながら、所望の生成物は、質量スペクトルデータから明らかであった。
質量:M=2021.9 陰イオン、M−6H+5Naの計算値:2130.9 実測値:2134 陰イオンで。陽イオン、M−3H+5Naの計算値:2132.9。実測値:2136 陽イオンで。(注釈:13Cおよび2Hは観測質量を増大させる)。
dCP4−TPMD(化合物[XIV])の合成について図27A〜27Bを参照されたい。
dCP4−ラクトース(化合物[XVI])の合成について図28A〜28Bを参照されたい。
dCP4−PEG9(化合物[XVIII])の合成について図29A〜29Bを参照されたい。
ここで、図30Aおよび図30Bを参照して、dNTPの末端に正電荷を提供するR1の例を示す。これらの例示的なR1部分のいずれかは、一般構造[17]、[18]または[19]で使用することができる(図16〜19を参照のこと)。これらのR1選択肢は、R1上の正電荷と分子センサーの伝導部分(例えば、架橋分子)との直接相互作用を通して、組み込み事象について独特な電気シグナル発生を提供する。図30Aでは、正電荷は、pH依存的であり、以下の部分構造:
本開示のさらなる実施形態は、分子センサーを通る電流に対するシグナリング基の影響をさらに増強させるための、センサー上に位置する対応するアフィニティ相補体(affinity complement)を伴う修飾dNTPのアフィニティ基の使用を含む。様々な実施形態では、アフィニティ基は、テザーのシグナリング基末端により近接して、ポリリン酸鎖とシグナリング基との間に提供される。この配置の目的は、センサーの分子複合体に対するシグナリング基の最も影響力のある位置決めを促進することおよびdNTPとセンサーの伝導性架橋分子との相互作用の持続期間を増大させることである。複合体上に存在するアフィニティ相補体は、修飾dNTP上の電荷基の位置決めおよび滞在時間(residence)が、架橋を通る電流に対してより大きな影響を有するように促進する。ある特定の例では、様々なアフィニティ基は、dNTPの各々の塩基(C、G、A、T)についてdNTP上で用いられ得る。アフィニティ基は、センサーの分子架橋として使用されるDNAオリゴの相補的部分にアフィニティを有し得る一本鎖DNA5merのように、非常に特異的であってもよく、またはそれは、架橋分子上の正電荷に引き付けられるdNTP上の負電荷のように、電荷アフィニティを単に示してもよい。
Claims (23)
- 化合物[16]、
式中、
Nucは、A、T、CおよびGから選択されるDNA塩基であり;
Yは、O、S、BまたはIから選択され;
nは、2〜5の整数であり;
R1は、
前記修飾ヌクレオチドが、DNA配列決定中のDNA鋳型の複製においてDNAポリメラーゼにより組み込まれる、修飾ヌクレオチド。 - Yが、Oであり;Nucが、シトシンであり;nが、3であり;R1が、
- Yが、Oであり;Nucが、シトシンであり;nが、3であり;R1が、
- Yが、Oであり;Nucが、シトシンであり;nが、3であり;R1が、
- Yが、Oであり;Nucが、シトシンであり;nが、3であり;R1が、
- Yが、Oであり;Nucが、シトシンであり;nが、3であり;R1が、
- Yが、Oであり;Nucが、シトシンであり;nが、5であり;R1が、
- Yが、Oであり;Nucが、シトシンであり;nが、5であり;R1が、
- Yが、Oであり;Nucが、シトシンであり;nが、5であり;R1が、
- Yが、Oであり;Nucが、シトシンであり;nが、5であり;R1が、
- Yが、Oであり;Nucが、シトシンであり;nが、5であり;R1が、
- Yが、Oであり;Nucが、シトシンであり;nが、5であり;R1が、
- Yが、Oであり;Nucが、アデノシンであり;nが、3であり;R1が、
- Yが、Oであり;Nucが、シトシンであり;nが、3であり;R1が、
- Yが、Oであり;Nucが、アデノシンであり;nが、3であり;R1が、
- Yが、Oであり;Nucが、アデノシンであり;nが、3であり;R1が、
- 化合物[18]、
式中、
Nucは、A、T、CおよびGから選択されるDNA塩基であり;
Yは、OH、SHまたはBH3から選択され;
nは、2〜5の整数であり;
R3は、Hまたはハロゲンから選択され;
R1は、H、任意選択でハロゲン、MeもしくはOMeもしくは−(CH2CH2O)xMe(式中、xは1〜20の整数である)で置換されている直鎖もしくは分岐鎖C1〜C5アルキル、C3〜C8シクロアルキルもしくはアリールから選択され;
L2は、−(CH2)q−(式中、qは1〜10の整数である)、−CH2CH2(OCH2CH2)y−(式中、yは1〜約8の整数である)、−(CH2)q−O−(CH2CH2O)y−CH2−(式中、qは1〜約10の整数であり、yは1〜約8の整数である)、−CO(CH2)r−(式中、rは1〜約10の整数である)、−COCH2CH2(OCH2CH2)z−(式中、zは1〜6の整数である)、−COCH2CH2CONH(CH2)m−(式中、mは1〜6の整数である)、−COCH2CH2CONH(CH2CH2O)pCH2CH2−(式中、pは1〜6の整数である)、1,4−ベンゼンジイル、1,3−ベンゼンジイルもしくは1,2−ベンゼンジイル(炭素原子は任意選択で、かつ独立して、ハロゲン、Me、Et、OH、OMeもしくはCF3で置換されている)または
R4およびR5は独立して、H、フェニル、
- Nucが、A、T、GまたはCであり;Yが、OHであり;n=3または5であり;R1が、Hであり;R3が、Hであり;L2が、−(CH2)4−O−(CH2CH2O)8−CH2−であり;R4が、フェニル、
- バイオセンサーから発生した電気シグナルを増強させる方法であって、
(a)ソース電極およびドレイン電極ならびに前記電極を架橋する架橋分子に結合したポリメラーゼを含むバイオセンサーを提供して、電気回路を完成させるステップと、
(b)配列決定されるヌクレオチド鋳型を前記ポリメラーゼと連通させるステップと、
(c)修飾dNTPを前記ポリメラーゼと連通させるステップと、
(d)前記ポリメラーゼにより前記ヌクレオチド鋳型を転写するステップ
を含み、ここで、
前記転写するステップは、前記ポリメラーゼにより前記修飾dNTPを組み込むことを含み、
前記修飾dNTPを組み込むことが、対応する非修飾dNTPを組み込むことと比較して増強された電気シグナルをもたらす、
方法。 - 前記修飾dNTPが、請求項1から18に記載の修飾ヌクレオチドのいずれか1つを含む、請求項19に記載の方法。
- 前記増強された電気シグナルが、前記ヌクレオチド鋳型におけるA、G、CおよびTを識別する、請求項19に記載の方法。
- 前記増強された電気シグナルが、修飾dATP、修飾dGTP、修飾dTTPおよび修飾dCTPの各々の組み込みについて独特である、請求項19に記載の方法。
- ヌクレオチド鋳型を転写する方法であって、
(a)前記ヌクレオチド鋳型を転写することができるポリメラーゼを提供するステップと、
(b)前記ヌクレオチド鋳型を前記ポリメラーゼと連通させるステップと、
(c)修飾dNTPを前記ポリメラーゼと連通させるステップと、
(d)前記修飾dNTPを組み込むことにより前記ヌクレオチド鋳型を前記ポリメラーゼで転写するステップと
を含み、前記修飾dNTPが、請求項1から18に記載の修飾ヌクレオチドのいずれか1つを含む、方法。
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