KR20230035531A

KR20230035531A - 적어도 전기적 특성을 사용하여 서열분석하기 위한 조성물 및 방법

Info

Publication number: KR20230035531A
Application number: KR1020227045157A
Authority: KR
Inventors: 제프리 맨델; 마리아 칸델라리아 로저트 바치가루포
Original assignee: 일루미나, 인코포레이티드
Priority date: 2020-06-30
Filing date: 2021-06-24
Publication date: 2023-03-14
Also published as: CA3182087A1; EP4172365A1; AU2021301180A1; WO2022005868A1; JP2023532494A; US20230295711A1; CN115843316A

Abstract

적어도 중합체 브리지의 전기적 특성을 변경하는 것을 사용하여 서열분석하기 위한 조성물 및 방법이 본원에서 제공된다. 일부 예에서, 브리지는 제1 전극과 제2 전극 사이의 공간에 걸쳐있을 수 있고 서로 혼성화되는 제1 및 제2 중합체 사슬을 포함할 수 있다. 복수의 뉴클레오티드는 상응하는 표지에 결합될 수 있다. 폴리머라제는 브리지에 결합될 수 있고 적어도 제2 폴리뉴클레오티드의 서열을 사용하여 뉴클레오티드를 제1 폴리뉴클레오티드에 부가할 수 있다. 이들 뉴클레오티드 각각에 상응하는 표지는 제1 중합체 사슬과 제2 중합체 사슬 사이의 혼성화를 변경할 수 있다. 검출 회로는 브리지를 통해 적어도 전기적 신호의 변화를 사용하여 폴리머라제가 뉴클레오티드를 제1 폴리뉴클레오티드에 부가하는 서열을 검출할 수 있으며, 변화는 이들 뉴클레오티드에 상응하는 표지를 사용하여 각각의 혼성화의 변경에 반응한다.

Description

적어도 전기적 특성을 사용하여 서열분석하기 위한 조성물 및 방법

관련 출원의 교차 참조

본 출원은 2020년 6월 30일에 출원되었고 발명의 명칭이 "적어도 전기적 특성을 사용하여 서열분석하기 위한 조성물 및 방법(Compositions and Methods for Sequencing Using at Least Electrical Characteristics)"인 미국 임시 특허 출원 제63/046,618호의 이익을 주장하며, 이의 전체 내용은 본원에 인용되어 포함된다.

서열 목록

본 출원은 ASCII 형식으로 전자적으로 제출된 서열 목록을 포함하며 이는 본원에 그 전체가 인용되어 포함된다. 2021년 6월 11일에 생성된 상기 ASCII 사본은 명칭이 IP_1969_PCT_SL.txt이고 크기가 3,590 바이트이다.

DNA와 같은 폴리뉴클레오티드를 서열분석하는데 학술 및 기업의 많은 시간과 에너지가 투자되었다. 일부 서열분석 시스템은 "합성에 의한 서열분석(SBS: sequencing by synthesis)" 기술과 형광-기반 검출을 사용한다. 그러나 형광-기반 검출은 여기 광원, 이미지화 장치 등과 같은 광학 구성요소를 필요로 할 수 있으며, 이는 복잡하고 작동하는데 시간이 많이 걸리고 비용이 많이 들 수 있다.

본원에 제공된 예는 적어도 전극 사이의 브리지의 전기적 특성을 변경하는 것을 사용하는 서열분석에 관한 것이다. 이러한 서열분석을 수행하기 위한 조성물 및 방법이 개시된다.

일부 예에서, 브리지는 제1 전극과 제2 전극 사이의 공간에 걸쳐 있을 수 있고 단일 중합체 사슬을 포함할 수 있거나, 서로 혼성화된 제1 및 제2 중합체 사슬을 포함할 수 있거나, 2개 초과의 중합체 사슬을 포함할 수 있다. 복수의 뉴클레오티드가 상응하는 표지에 결합될 수 있다. 폴리머라제는 브리지에 또는 그 부근에서 결합될 수 있고 적어도 제2 폴리뉴클레오티드의 서열을 사용하여 제1 폴리뉴클레오티드에 뉴클레오티드를 부가할 수 있다. 이들 뉴클레오티드에 각각 상응하는 표지는 브리지의 전기적 특성을 변경할 수 있다. 검출 회로는 적어도 브리지를 통한 전기 신호, 예를 들어 전류 또는 전압의 변화를 사용하여 폴리머라제가 제1 폴리뉴클레오티드에 뉴클레오티드를 부가하는 서열을 검출할 수 있으며, 이러한 변화는 이들 뉴클레오티드에 상응하는 표지를 사용하여 전기적 특성의 각각의 변경에 반응한다.

본원의 일부 예에서는 공간에 의해 서로 분리된 제1 전극과 제2 전극, 및 제1 전극과 제2 전극 사이의 공간에 걸쳐 있는 브리지를 포함하는 조성물이 제공된다. 브리지는 서로 혼성화된 제1 및 제2 중합체 사슬을 포함할 수 있다. 조성물은 또한 제1 및 제2 폴리뉴클레오티드, 및 복수의 뉴클레오티드를 포함할 수 있으며, 각각의 뉴클레오티드는 상응하는 표지에 결합된다. 조성물은 또한 적어도 제2 폴리뉴클레오티드의 서열을 사용하여 제1 폴리뉴클레오티드에 복수의 뉴클레오티드의 뉴클레오티드를 부가하기 위한 폴리머라제를 포함할 수 있다. 이들 뉴클레오티드에 각각 상응하는 표지는 제1 및 제2 중합체 사슬 중 적어도 하나의 전기적 특성을 변경할 수 있다. 조성물은 폴리머라제가 적어도 브리지를 통한 전기 신호의 변화를 사용하여 제1 폴리뉴클레오티드에 뉴클레오티드를 부가하는 서열을 검출하기 위한 검출 회로를 포함할 수 있다. 이러한 변화는 이들 뉴클레오티드에 상응하는 표지를 사용하여 전기적 특성의 변경에 반응할 수 있다.

일부 예에서, 제1 및 제2 중합체 사슬은 각각 서로 혼성화된 제1 및 제2 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 일부 예에서, 표지는 제1 폴리뉴클레오티드와 제2 폴리뉴클레오티드 사이의 혼성화를 변경하는 각각의 올리고뉴클레오티드를 포함한다. 일부 예에서, 올리고뉴클레오티드는 서로 다른 위치에서 혼성화를 변경한다. 일부 예에서, 올리고뉴클레오티드는 길이가 다른 영역에서 혼성화를 변경한다.

일부 예에서, 제1 및 제2 중합체 사슬의 폴리뉴클레오티드 및 표지의 올리고뉴클레오티드는 비-천연 발생 DNA를 포함한다. 일부 예에서, 비-천연 발생 DNA는 거울상 이성질체 DNA를 포함한다. 일부 예에서, 올리고뉴클레오티드는 변형된 뉴클레오티드를 포함한다. 일부 예에서, 변형된 뉴클레오티드는 변형된 백본, 변형된 당 또는 변형된 염기를 갖는다. 일부 예에서, 올리고뉴클레오티드는 PNA 및 LNA로 이루어진 군으로부터 선택된 핵산 유사체를 포함한다.

일부 예에서, 제1 및 제2 폴리뉴클레오티드는 DNA를 포함하고, 표지는 DNA와 상호작용하는 단백질을 포함한다. 일부 예에서, 표지는 DNA 인터칼레이터(intercalator)를 포함한다. 일부 예에서, 표지는 작은 홈 결합제(minor groove binder)를 포함한다. 일부 예에서, 표지는 펩티드 인터칼레이터를 포함한다. 일부 예에서, 표지는 서로 얽힌(intertwining) 알파 나선을 포함한다.

일부 예에서, 제1 및 제2 중합체 사슬은 각각 서로 혼성화된 제1 및 제2 폴리펩티드를 포함한다. 일부 예에서, 각각의 표지는 단백질, 펩티드, 또는 제1 폴리펩티드와 제2 폴리펩티드 사이의 혼성화를 변경하는 인터칼레이터를 포함한다.

본 명세서의 일부 예에서 방법이 제공된다. 상기 방법은 폴리머라제를 사용하여, 뉴클레오티드를 적어도 제2 폴리뉴클레오티드의 서열을 사용하여 제1 폴리뉴클레오티드에 부가하는 단계를 포함할 수 있다. 상기 방법은 뉴클레오티드에 각각 결합된 표지를 사용하여, 제1 전극과 제2 전극 사이의 공간에 걸쳐 있는 브리지의 제1 중합체 사슬 및 제2 중합체 사슬 중 적어도 하나의 전기적 특성을 변경하는 단계를 포함할 수 있다. 상기 방법은 이러한 뉴클레오티드에 상응하는 표지를 사용하여 전기적 특성의 각각의 변경에 반응하는 브리지를 통한 적어도 전기 신호의 변화를 사용하여 폴리머라제가 제1 폴리뉴클레오티드에 뉴클레오티드를 부가하는 서열을 검출하는 단계를 포함할 수 있다.

일부 예에서, 제1 및 제2 중합체 사슬은 각각 서로 혼성화된 제1 및 제2 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 일부 예에서, 표지는 제1 폴리뉴클레오티드와 제2 폴리뉴클레오티드 사이의 혼성화를 변경하는 각각의 올리고뉴클레오티드를 포함한다. 일부 예에서, 표지는 서로 다른 위치에서 혼성화를 변경한다. 일부 예에서, 표지는 길이가 다른 영역에서 혼성화를 변경한다. 일부 예에서, 제1 및 제2 중합체 사슬의 폴리뉴클레오티드 및 표지의 올리고뉴클레오티드는 비-천연 발생 DNA를 포함한다. 일부 예에서, 비-천연 발생 DNA는 거울상 이성질체 DNA를 포함한다. 일부 예에서, 올리고뉴클레오티드는 변형된 뉴클레오티드를 포함한다. 일부 예에서, 변형된 뉴클레오티드는 변형된 백본, 변형된 당 또는 변형된 염기를 갖는다. 일부 예에서, 올리고뉴클레오티드는 PNA 및 LNA로 이루어진 군으로부터 선택된 핵산 유사체를 포함한다.

일부 예에서, 제1 및 제2 폴리뉴클레오티드는 DNA를 포함하고, 여기서 표지는 DNA와 상호작용하는 단백질을 포함한다. 일부 예에서, 표지는 DNA 인터칼레이터(intercalator)를 포함한다. 일부 예에서, 표지는 작은 홈 결합제(minor groove binder)를 포함한다. 일부 예에서, 표지는 펩티드 인터칼레이터를 포함한다. 일부 예에서, 표지는 서로 얽힌(intertwining) 알파 나선을 포함한다.

일부 예에서, 제1 및 제2 중합체 사슬은 각각 서로 혼성화된 제1 및 제2 폴리펩티드 사슬을 포함한다. 일부 예에서, 각각의 표지는 단백질, 펩티드, 또는 제1 폴리펩티드와 제2 폴리펩티드 사이의 혼성화를 변경하는 인터칼레이터를 포함한다.

본원의 일부 예에서는 공간에 의해 서로 분리된 제1 전극과 제2 전극, 및 제1 전극과 제2 전극 사이의 공간에 걸쳐 있는 브리지를 포함하는 조성물이 제공된다. 브리지는 중합체 사슬을 포함할 수 있다. 조성물은 제1 및 제2 폴리뉴클레오티드, 및 복수의 뉴클레오티드를 포함할 수 있으며, 각각의 뉴클레오티드는 상응하는 표지에 결합된다. 조성물은 적어도 제2 폴리뉴클레오티드의 서열을 사용하여 제1 폴리뉴클레오티드에 복수의 뉴클레오티드의 뉴클레오티드를 부가하기 위한 폴리머라제를 포함할 수 있다. 이들 뉴클레오티드에 각각 상응하는 표지는 중합체 사슬의 전기적 특성을 변경할 수 있다. 조성물은 폴리머라제가 적어도 브리지를 통한 전기 신호의 변화를 사용하여 제1 폴리뉴클레오티드에 뉴클레오티드를 부가하는 서열을 검출하기 위한 검출 회로를 포함할 수 있다. 이러한 변화는 이들 뉴클레오티드에 상응하는 표지를 사용하여 전기적 특성의 변경에 반응할 수 있다.

일부 예에서, 중합체 사슬은 폴리펩티드 사슬을 포함한다. 일부 예에서, 표지는 펩티드 인터칼레이터를 포함한다. 일부 예에서, 표지는 서로 얽힌(intertwining) 알파 나선을 포함한다.

본 명세서의 일부 예에서 폴리머라제를 사용하여, 뉴클레오티드를 적어도 제2 폴리뉴클레오티드의 서열을 사용하여 제1 폴리뉴클레오티드에 부가하는 단계를 포함하는 서열분석 방법이 제공된다. 상기 방법은 뉴클레오티드에 각각 결합된 표지를 사용하여, 제1 전극과 제2 전극 사이의 공간에 걸쳐 있는 브리지의 중합체 사슬의 전기적 특성을 변경하는 단계를 포함할 수 있다. 방법은 이러한 뉴클레오티드에 상응하는 표지를 사용하여 전기적 특성의 각각의 변경에 반응하는 브리지를 통한 적어도 전기 신호의 변화를 사용하여 폴리머라제가 제1 폴리뉴클레오티드에 뉴클레오티드를 부가하는 서열을 검출하는 단계를 포함할 수 있다.

본원에 기술된 것과 같은 본 개시내용의 각각의 양태의 임의의 각각의 특징/예는 임의의 적절한 조합으로 함께 구현될 수 있고, 이들 양태 중 임의의 하나 이상으로부터의 임의의 특징/예는 본원에 기술된 것과 같은 이점을 달성하기 위해 임의의 적절한 조합으로 본원에 기술된 것과 같은 다른 양태(들)의 임의의 특징과 함께 구현될 수 있음을 이해해야 한다.

도 1a 내지 도 1b는 이중-가닥 중합체 브리지 및 브리지의 중합체 가닥 중 적어도 하나의 전기적 특성을 변경하는 뉴클레오티드 표지를 포함하는 서열분석을 위한 예시적 조성물을 개략적으로 도시한다.
도 2a 내지 도 2c는 이중-가닥 중합체 브리지의 중합체 가닥 중 적어도 하나의 전기적 특성을 변경하는 표지를 갖는 뉴클레오티드의 예를 개략적으로 도시한다.
도 3은 이중-가닥 폴리뉴클레오티드 브리지 및 브리지의 폴리뉴클레오티드 사이의 혼성화를 변경하는 뉴클레오티드 표지를 포함하는 서열분석을 위한 예시적인 조성물을 개략적으로 도시한다. 도면은 SEQ ID NO: 11을 개시한다.
도 4는 이중-가닥 중합체 브리지 및 브리지의 중합체 가닥 중 적어도 하나의 전기적 특성을 변경하는 뉴클레오티드 표지를 사용하여 서열분석하는 방법에서의 작업 흐름의 예를 도시한다.
도 5a 내지 도 5b는 단일-가닥 중합체 브리지 및 브리지의 전기적 특성을 변경하는 뉴클레오티드 표지를 포함하는 서열분석을 위한 예시적인 조성물을 개략적으로 도시한다.
도 6은 단일-가닥 중합체 브리지 및 브리지의 전기적 특성을 변경하는 뉴클레오티드 표지를 사용하여 서열분석하는 방법에서 작업의 예시적인 흐름을 도시한다.
도 7a 내지 도 7c는 2개 초과의 중합체 사슬을 포함하는 예시적인 중합체 브리지를 도시한다.

본원에 제공된 예는 적어도 중합체 사슬의 전기적 특성을 변경하는 것을 사용하는 서열분석에 관한 것이다. 이러한 서열분석을 수행하기 위한 조성물 및 방법이 개시된다.

보다 구체적으로, 본 발명의 조성물 및 방법은 강력하고, 재현가능하고, 민감하고, 정확하고, 실시간으로 작동하고, 단일 분자를 검출하고, 높은 처리량을 갖는 방식으로 폴리뉴클레오티드를 서열분석하는데 사용되는 이점을 적절하게 가질 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 조성물은 제1 및 제2 전극 및 전극 사이의 공간에 걸쳐 있는 브리지를 포함할 수 있다. 브리지는 이중-가닥 중합체를 포함할 수 있고, 예를 들어 전류가 브리지를 통해 하나의 전극에서 다른 전극으로 흐르도록 하는 방식으로 서로 혼성화되는 제1 및 제2 중합체 사슬을 포함할 수 있거나, 2개 초과의 중합체 사슬을 포함할 수 있거나, 브리지를 통해 한 전극에서 다른 전극으로 전류가 흐르도록 하는 단일 중합체 사슬을 포함할 수 있다. 각각의 뉴클레오티드에 결합될 수 있는 표지는 브리지의 하나 이상의 전기적 특성, 예를 들어 브리지의 전기 전도도 또는 전기 임피던스를 변경할 수 있으며 적어도 이러한 변경을 사용하여 각각의 뉴클레오티드가 식별될 수 있다.

먼저, 본원에서 사용되는 일부 용어에 대해 간략히 설명된다. 이어서, 폴리뉴클레오티드를 전자적으로 서열분석하기 위한 일부 예시적인 조성물 및 예시적 방법이 기술될 것이다.

용어

달리 정의되지 않는 한, 본원에서 사용되는 모든 기술 및 과학 용어는 당업자가 일반적으로 이해하는 것과 동일한 의미를 갖는다. "포함하는(including)"이라는 용어와 "포함하다(include)", "포함하다(includes)" 및 "포함하였다(included)"와 같은 다른 형태의 사용은 제한되지 않는다. "갖는(having)"이라는 용어와 "갖다(have)", "갖다(has)" 및 "가졌다(had)"와 같은 다른 형태의 사용은 제한되지 않는다. 본 명세서에서 사용된 바와 같이, 연결구에서든 청구범위의 본문에서든, 용어 "포함하다(comprise)" 및 "포함하는(comprising)"은 개방형 의미를 갖는 것으로 해석되어야 한다. 즉, 위의 용어들은 "적어도 갖는" 또는 "적어도 포함하는"이라는 문구와 동의어로 해석되어야 한다. 예를 들어, 공정과 관련하여 사용되는 경우, "포함하는(comprising)"이라는 용어는 공정이 적어도 인용된 단계를 포함하지만 추가 단계를 포함할 수 있음을 의미한다. 화합물, 조성물 또는 장치와 관련하여 사용되는 경우, "포함하는(comprising)"이라는 용어는 화합물, 조성물 또는 장치가 적어도 인용된 특징 또는 구성요소를 포함하지만, 추가 특징 또는 구성요소도 포함할 수 있음을 의미한다.

본 명세서 전반에 걸쳐 사용되는 "실질적으로(substantially)", "대략(approximately)" 및 "약(about)"이라는 용어는 처리의 변화로 인한 것과 같은 작은 변동을 기술하고 설명하기 위해 사용된다. 예를 들어, 이는 ±5% 이하, 예를 들어 ±2% 이하, 예를 들어 ±1% 이하, 예를 들어 ±0.5% 이하, 예를 들어 ±0.2% 이하, 예를 들어 ±0.1% 이하, 예를 들어 ±0.05% 이하를 지칭할 수 있다.

본원에서 사용되는 바와 같이, "전극"이라는 용어는 전기를 전도하는 고체 구조물을 의미하는 것으로 의도된다. 전극은 금, 팔라듐, 또는 백금, 또는 이들의 조합과 같은 임의의 적합한 전기 전도성 재료를 포함할 수 있다.

본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "브리지"라는 용어는 2개의 다른 구조물 사이에서 연장되고 결합되는 구조를 의미하도록 의도된다. 브리지는 두 전극 사이와 같은 다른 구조 사이의 공간에 걸쳐 있을 수 있다. 브리지의 모든 요소가 두 구조 모두에 직접 연결될 필요는 없다. 예를 들어, 서로 결합된 제1 및 제2 중합체 사슬을 포함하고 두 전극 사이의 공간에 걸쳐 있는 브리지에서, 중합체 사슬 중 하나의 적어도 하나의 말단은 전극 중 하나에 결합되고, 중합체 사슬 중 하나의 적어도 하나의 말단은 다른 전극에 결합된다. 그러나, 두 개의 중합체 사슬이 두 전극 모두에 결합될 필요는 없으며, 실제로 중합체 사슬 중 하나가 두 전극 중 하나에 결합될 필요는 없다. 브리지는 다른 구조물 사이에서 확장되고 집합적으로 다른 구조에 연결되는 방식으로 서로 연결되는 여러 구성요소를 포함할 수 있다. 브리지는 화학 결합, 예를 들어 공유 결합, 수소 결합, 이온 결합, 쌍극자-쌍극자 결합, 런던 분산력 또는 이들의 임의의 적절한 조합을 통해 전극과 같은 다른 구조물에 결합될 수 있다.

본원에서 사용되는 바와 같이, "중합체"는 서로 결합되는, 단량체로 지칭될 수 있는 많은 서브유닛의 사슬을 포함하는 분자를 지칭한다. 서브유닛은 반복되거나 서로 상이할 수 있다. 중합체 및 이의 서브유닛은 생물학적 또는 합성일 수 있다. 브리지 또는 표지 내에 적합하게 포함될 수 있는 예시적인 생물학적 중합체는 폴리뉴클레오티드(뉴클레오티드 서브유닛으로 만들어짐), 폴리펩티드(아미노산 서브유닛으로 만들어짐), 폴리사카라이드, 폴리뉴클레오티드 유사체 및 폴리펩티드 유사체를 포함한다. 브리지 또는 표지에 사용하기에 적합한 예시적인 폴리뉴클레오티드 및 폴리뉴클레오티드 유사체는 DNA, 거울상 이성질체 DNA, RNA, PNA(펩티드-핵산), 모폴리노, 및 LNA(잠긴 핵산)를 포함한다. 중합체는 Glen Research(Sterling, VA)로부터 상업적으로 이용가능한 것과 같은 폴리뉴클레오티드에 결합될 수 있지만 핵염기가 결여된 포스포라미다이트로부터 유도된, 예를 들어 스페이서 포스포라미다이트 18(18-O-디메톡시트리틸헥사에틸렌글리콜,1-[(2-시아노에틸)-(N,N-디이소프로필)]-포스포라미다이트)와 같은 스페이서 서브유닛을 포함할 수 있다. 예시적인 합성 폴리펩티드는 모든 천연 아미노산, 예컨대 하전된 아미노산, 친수성, 소수성, 및 중성 아미노산 잔기를 포함할 수 있다. 브리지 또는 표지 내에 적합하게 포함될 수 있는 예시적인 합성 중합체는 PEG(폴리에틸렌 글리콜), PPG(폴리프로필렌 글리콜), PVA(폴리비닐 알코올), PE(폴리에틸렌), LDPE(저밀도 폴리에틸렌), HDPE(고밀도 폴리에틸렌), 폴리프로필렌, PVC(폴리비닐 클로라이드), PS(폴리스티렌), NYLON(지방족 폴리아미드), TEFLON®(테트라플루오로에틸렌), 열가소성 폴리우레탄, 폴리알데히드, 폴리올레핀, 폴리(에틸렌 옥시드), 폴리(ω-알케논산 에스터), 폴리(알킬 메타크릴레이트), 및 기타 중합체성 화학적 및 생물학적 링커 예컨대 문헌[Hermanson, Bioconjugate Techniques, third edition, Academic Press, London (2013)]에 기술된 것들을 포함한다.

본원에 사용된 바와 같이, "혼성화하다"는 이들 중합체의 길이를 따라 제1 중합체를 제2 중합체에 비공유적으로 결합시키는 것을 의미하는 것으로 의도된다. 예를 들어, 2개의 DNA 폴리뉴클레오티드 가닥은 상보적인 염기쌍을 통해 결합될 수 있다. 제1 중합체와 제2 중합체 사이의 결합 강도는 이들 중합체 내의 단량체 단위 서열 사이의 상보성과 함께 증가한다. 예를 들어, 제1 폴리뉴클레오티드와 제2 폴리뉴클레오티드 사이의 결합 강도는 이들 폴리뉴클레오티드 내의 뉴클레오티드 서열 사이의 상보성과 함께 증가한다.

본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "뉴클레오티드"는 당 및 적어도 하나의 인산기를 포함하는 분자를 의미하는 것으로 의도되며, 일부 예는 또한 핵염기를 포함한다. 핵염기가 결여된 뉴클레오티드는 "무염기성(abasic)"으로 지칭될 수 있다. 뉴클레오티드는 데옥시리보뉴클레오티드, 변형된 데옥시리보뉴클레오티드, 리보뉴클레오티드, 변형된 리보뉴클레오티드, 펩티드 뉴클레오티드, 변형된 펩티드 뉴클레오티드, 변형된 인산염 당 백본 뉴클레오티드, 및 이들의 혼합물을 포함한다. 뉴클레오티드의 예는 아데노신 모노포스페이트(AMP), 아데노신 디포스페이트(ADP), 아데노신 트리포스페이트(ATP), 티미딘 모노포스페이트(TMP), 티미딘 디포스페이트(TDP), 티미딘 트리포스페이트(TTP), 시티딘 모노포스페이트(CMP), 시티딘 디포스페이트(CDP), 시티딘 트리포스페이트(CTP), 구아노신 모노포스페이트(GMP), 구아노신 디포스페이트(GDP), 구아노신 트리포스페이트(GTP), 우리딘 모노포스페이트(UMP), 우리딘 디포스페이트(UDP), 우리딘 트리포스페이트(UTP), 데옥시아데노신 모노포스페이트(dAMP), 데옥시아데노신 디포스페이트(dADP), 데옥시아데노신 트리포스페이트(dATP), 데옥시티미딘 모노포스페이트(dTMP), 데옥시티미딘 디포스페이트(dTDP), 데옥시티미딘 트리포스페이트(dTTP), 데옥시시티딘 디포스페이트(dCDP), 데옥시시티딘 트리포스페이트(dCTP), 데옥시구아노신 모노포스페이트(dGMP), 데옥시구아노신 디포스페이트(dGDP), 데옥시구아노신 트리포스페이트(dGTP), 데옥시우리딘 모노포스페이트(dUMP), 데옥시우리딘 디포스페이트(dUDP), 및 데옥시우리딘 트리포스페이트(dUTP)를 포함한다.

본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "뉴클레오티드"는 또한 천연 발생 뉴클레오티드와 비교하여 변형된 핵염기, 당 및/또는 포스페이트 모이어티를 포함하는 뉴클레오티드 유형인 임의의 뉴클레오티드 유사체를 포함하는 것으로 의도된다. 예시적인 변형된 핵염기는 이노신, 잔틴, 하이포잔틴, 이소시토신, 이소구아닌, 2-아미노퓨린, 5-메틸시토신, 5-히드록시메틸 시토신, 2-아미노아데닌, 6-메틸 아데닌, 6-메틸 구아닌, 2-프로필 구아닌, 2-프로필 아데닌, 2-티오우라실, 2-티오티민, 2-티오시토신, 15-할로우라실, 15-할로시토신, 5-프로피닐 우라실, 5-프로피닐 시토신, 6-아조 우라실, 6-아조 시토신, 6-아조 티민, 5-우라실, 4-티오우라실, 8-할로 아데닌 또는 구아닌, 8-아미노 아데닌 또는 구아닌, 8-티올 아데닌 또는 구아닌, 8-티오알킬 아데닌 또는 구아닌, 8-히드록실 아데닌 또는 구아닌, 5-할로 치환된 우라실 또는 시토신, 7-메틸구아닌, 7-메틸아데닌, 8-아자구아닌, 8-아자아데닌, 7-디아자구아닌, 7-디아자아데닌, 3-디아자구아닌, 3-디아자아데닌 등을 포함한다. 당업계에 공지된 바와 같이, 특정 뉴클레오티드 유사체, 예를 들어 아데노신 5'-포스포설페이트와 같은 뉴클레오티드 유사체는 폴리뉴클레오티드로 혼입될 수 없다. 뉴클레오티드는 임의의 적절한 수의 포스페이트, 예를 들어 3개, 4개, 5개, 6개 또는 6개 초과의 포스페이트를 포함할 수 있다.

본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "폴리뉴클레오티드"는 서로 결합된 뉴클레오티드 서열을 포함하는 분자를 지칭한다. 폴리뉴클레오티드는 중합체의 비제한적인 일례이다. 폴리뉴클레오티드의 예는 데옥시리보핵산(DNA), 리보핵산(RNA), 및 이들의 유사체를 포함한다. 폴리뉴클레오티드는 RNA 또는 단일 가닥 DNA와 같은 뉴클레오티드의 단일 가닥 서열, 이중 가닥 DNA와 같은 뉴클레오티드의 이중 가닥 서열일 수 있거나, 단일 가닥 및 이중 가닥 뉴클레오티드 서열의 혼합물을 포함할 수 있다. 이중 가닥 DNA(dsDNA)는 게놈 DNA, 및 PCR 및 증폭 산물을 포함한다. 단일 가닥 DNA(ssDNA)는 dsDNA로 변환될 수 있으며 그 반대도 가능하다. 폴리뉴클레오티드는 거울상 이성질체 DNA와 같은 비-천연 발생 DNA를 포함할 수 있다. 폴리뉴클레오티드의 정확한 뉴클레오티드 서열은 알려지거나 알려지지 않을 수 있다. 다음은 폴리뉴클레오티드의 예이다: 유전자 또는 유전자 단편(예를 들어, 프로브, 프라이머, 발현 서열 태그(EST: expressed sequence tag) 또는 유전자 발현의 연속 분석(SAGE: serial analysis of gene expression) 태그), 게놈 DNA, 게놈 DNA 단편, 엑손, 인트론, 메신저 RNA(mRNA), 전달 RNA, 리보솜 RNA, 리보자임, cDNA, 재조합 폴리뉴클레오티드, 합성 폴리뉴클레오티드, 분지형 폴리뉴클레오티드, 플라스미드, 벡터, 임의의 서열의 단리된 DNA, 임의의 서열의 단리된 RNA, 핵산 프로브, 프라이머 또는 임의의 전술된 것의 증폭된 사본.

본원에서 사용된 바와 같이, "폴리머라제"는 뉴클레오티드를 폴리뉴클레오티드로 중합함으로써 폴리뉴클레오티드를 조립하는 활성 부위를 갖는 효소를 의미하는 것으로 의도된다. 폴리머라제는 프라이밍된 단일 가닥 폴리뉴클레오티드 주형에 결합할 수 있으며, 성장하는 프라이머에 뉴클레오티드를 순차적으로 부가하여 주형의 서열에 상보적인 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드를 형성할 수 있다.

본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "프라이머"는 뉴클레오티드가 유리 3' OH 기를 통해 부가되는 폴리뉴클레오티드로 정의된다. 프라이머는 블록이 제거될 때까지 중합을 방지하는 3' 블록을 가질 수 있다. 프라이머는 또한 결합 반응을 허용하거나 프라이머를 다른 모이어티에 결합하기 위해 5' 말단에 변형을 가질 수 있다. 프라이머 길이는 임의 개수의 염기 길이일 수 있으며 다양한 비-천연 뉴클레오티드를 포함할 수 있다.

본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "표지"는 전기 임피던스 또는 전기 전도도와 같은 브리지의 전기적 특성에 변화를 일으키는 방식으로 브리지에 결합되며 이러한 변화에 기초하여 뉴클레오티드가 식별될 수 있는 구조물을 의미하는 것으로 의도된다. 예를 들어, 표지는 이러한 브리지 내에서 중합체 사슬에 혼성화될 수 있으며, 혼성화는 브리지의 전기 전도도 또는 전기 임피던스 변화를 유발할 수 있다. 또는, 예를 들어, 이러한 브리지 내의 중합체 사슬 사이에 표지가 인터칼레이팅될 수 있고, 인터칼레이팅은 브리지의 전기 전도도 또는 전기 임피던스 변화를 야기할 수 있다. 그러나, 표지는 브리지 내에서 중합체 사슬의 임의의 적절한 전기적 특성을 변경할 수 있음을 이해해야 한다. 본원에 제공된 예에서, 표지는 뉴클레오티드에 결합될 수 있다.

본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "기판"은 본원에 기술된 조성물에 대한 지지체로 사용되는 물질을 지칭한다. 예시적인 기판 재료는 유리, 실리카, 플라스틱, 석영, 금속, 금속 산화물, 유기-규산염(예를 들어, 다면체 유기 실세스퀴옥산(POSS: polyhedral organic silsesquioxanes)), 폴리아크릴레이트, 산화 탄탈륨, CMOS(complementary metal oxide semiconductor, 상보적 금속 산화막 반도체) 또는 이들의 조합을 포함할 수 있다. POSS의 예는 문헌[Kehagias et al., Microelectronic Engineering 86 (2009), pp. 776-778]에 기술되어 있는 것들일 수 있으며, 이 문헌은 그 전체가 인용되어 본원에 포함된다. 일부 예에서, 본 출원에서 사용된 기판은 실리카-기반 기판, 예컨대 유리, 용융 실리카 또는 기타 실리카-함유 물질을 포함한다. 일부 예에서, 기판은 실리콘, 실리콘 질화물 또는 실리콘 수소화물을 포함할 수 있다. 일부 예에서, 본 출원에서 사용되는 기판은 플라스틱 물질 또는 구성성분, 예컨대 폴리에틸렌, 폴리스티렌, 폴리(비닐 클로라이드), 폴리프로필렌, 나일론, 폴리에스터, 폴리카보네이트, 및 폴리(메틸 메타크릴레이트)를 포함한다. 예시적인 플라스틱 물질은 폴리(메틸 메타크릴레이트), 폴리스티렌, 및 환형 올리펜 중합체 기판을 포함한다. 일부 예에서, 기판은 실리카-기반 물질 또는 플라스틱 물질 또는 이들의 조합을 포함한다. 특정 예에서, 기판은 유리 또는 실리콘-기반 중합체를 포함하는 적어도 하나의 표면을 갖는다. 일부 예에서, 기판은 금속을 포함할 수 있다. 일부 이러한 예에서, 금속은 금이다. 일부 예에서, 기판은 금속 산화물을 포함하는 적어도 하나의 표면을 갖는다. 하나의 예에서, 표면은 탄탈륨 산화물 또는 주석 산화물을 포함한다. 아크릴아미드, 에논, 또는 아크릴레이트가 또한 기판 물질 또는 구성성분으로서 이용될 수 있다. 다른 기판 물질은 비제한적으로 갈륨 비소, 인듐 인화물, 알루미늄, 세라믹, 폴리이미드, 석영, 수지, 중합체 및 공중합체를 포함할 수 있다. 일부 예에서, 기판 및/또는 기판 표면은 석영일 수 있거나 이를 포함할 수 있다. 일부 다른 예에서, 기판 및/또는 기판 표면은 GaAs 또는 ITO와 같은 반도체일 수 있거나 이를 포함할 수 있다. 전술한 목록은 본 출원을 예시하기 위한 것이지만 이에 제한되지 않는다. 기판은 단일 물질 또는 복수의 상이한 물질을 포함할 수 있다. 기판은 복합재 또는 라미네이트일 수 있다. 일부 예에서, 기판은 유기-실리케이트 물질을 포함한다.

기판은 편평하거나, 원형이거나, 구형이거나, 막대형이거나, 임의의 다른 적합한 형상일 수 있다. 기판은 단단하거나 유연할 수 있다. 일부 예에서, 기판은 비드 또는 유동 셀이다.

기판은 기판의 하나 이상의 표면 상에 패턴화되지 않거나, 텍스처화되거나, 패턴화될 수 있다. 일부 예에서, 기판은 패턴화된다. 이러한 패턴은 포스트, 패드, 웰, 융기부, 채널 또는 기타 3차원 오목 또는 볼록 구조를 포함할 수 있다. 패턴은 기판 표면 전체에 걸쳐 규칙적이거나 불규칙적일 수 있다. 패턴은 예를 들어 나노임프린트 리소그래피에 의해 또는 예를 들어 비-금속 표면에 특징을 형성하는 금속 패드를 사용하여 형성될 수 있다.

일부 예에서, 본원에 기술된 기판은 유동 셀의 적어도 일부를 형성하거나 유동 셀에 위치하거나 유동 셀에 결합된다. 유동 셀은 복수의 레인 또는 복수의 섹터로 구분되는 플로우 챔버를 포함할 수 있다. 본원에 기재된 방법 및 조성물에 사용될 수 있는 유동 셀 및 유동 셀의 제조를 위한 기판의 예는 Illumina, Inc.(San Diego, CA)에서 상업적으로 이용가능한 것을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.

폴리뉴클레오티드를 서열분석하기 위한 예시적인 조성물 및 방법

도 1a 내지 도 1b는 이중-가닥 중합체 브리지를 포함하는 서열분석을 위한 예시적인 조성물(100)을 도시한다. 이제 도 1a를 참조하면, 조성물(100)은 기판(101), 제1 전극(102), 제2 전극(103), 폴리머라제(104), 브리지(110), 뉴클레오티드(121, 122, 123 및 124), 이들 뉴클레오티드에 각각 결합된 표지(131, 132, 133 및 134), 제1 폴리뉴클레오티드(140), 제2 폴리뉴클레오티드(150), 및 검출 회로(160)를 포함한다. 폴리머라제(105)는 브리지(110) 근처에 있으며, 일부 예에서는 당업계에 알려진 방식으로 링커(106)을 통해 브리지(110)에 결합될 수 있다. 이러한 링커 화학은 예를 들어 시스테인 잔기 상의 반응성 티올에 대한 말레이미드 화학, 리신 잔기 상의 반응성 아민에 대한 NHS 에스터 화학, 비오틴-스트렙타비딘 및 Spytag-SpyCatcher를 포함한다. 도 1a 내지 도 1b에 도시된 예에서, 조성물(100)의 구성요소는 유체(120)로 채워진 유동 셀(예를 들어, 벽(161, 162, 162)을 가짐) 내에 둘러싸일 수 있으며, 여기서 뉴클레오티드(121, 122, 123 및 124)(관련 표지 포함), 폴리뉴클레오티드(140, 150), 및 적합한 시약이 운반될 수 있다.

기판(101)은 제 1 전극(102) 및 제 2 전극(103)을 지지할 수 있다. 제 1 전극(102) 및 제 2 전극(103)은 공간, 예를 들어 도 1a에 도시된 바와 같이 길이(L)의 공간에 의해 서로 분리될 수 있다. L의 값은, 일부 예에서, 약 1 nm 내지 약 1 μm, 예를 들어, 약 1 nm 내지 약 100 nm, 예를 들어, 약 1 nm 내지 약 10 nm, 예를 들어, 약 10 nm 내지 약 25 nm, 예를 들어, 약 25 nm 내지 약 50 nm일 수 있다. 제1 전극(102) 및 제2 전극(103)은 임의의 적합한 형상 및 배열을 가질 수 있으며, 도 1a에 제안된 대략적인 직사각형 형상에 제한되지 않는다. 도 1a에 도시된 제1 전극(102) 및 제2 전극(103)의 측벽은 서로 수직이거나 평행할 수 있지만 반드시 그럴 필요는 없으며, 이러한 전극의 상부 표면을 직각으로 반드시 만날 필요는 없다. 예를 들어, 제1 전극(102) 및 제2 전극(103)은 불규칙한 형태일 수 있거나, 곡선일 수 있거나, 임의의 적절한 수의 둔각 또는 예각을 포함할 수 있다. 일부 예에서, 제1 전극(102) 및 제2 전극(103)은 서로에 대해 수직으로 배열될 수 있다. L 값은 제1 전극(102)과 제2 전극(103)의 서로에 대한 가장 가까운 지점 사이의 간격을 나타낼 수 있다.

브리지(110)는 제1 전극(102)과 제2 전극(103) 사이의 공간에 걸쳐 있을 수 있고, 서로 혼성화된 제1 중합체 사슬(111)과 제2 중합체 사슬(112)을 포함할 수 있다(각각의 중합체 사슬 내의 원은 중합체 사슬의 길이를 따라 서로 결합되는 단량체 단위를 암시하기 위한 것임). 제1 중합체 사슬(111)과 제2 중합체 사슬(112)은 동일한 종류의 중합체를 포함할 수 있지만, 각 중합체 사슬의 단량체 단위의 서열은 반드시 서로 동일할 필요는 없다. 예를 들어, 제1 중합체 사슬(111)은 제2 중합체 사슬(112)의 서열과 상보적인 서열을 가질 수 있다. 제1 및 제2 중합체 사슬(111, 112) 각각은 제1 전극(102)과 제2 전극(103) 사이의 공간의 길이(L)와 대략 동일한 길이를 가질 수 있거나 그렇지 않으면 중합체 사슬(111, 112)이 제1 전극(102)과 제2 전극(103) 사이의 공간에 걸쳐 있도록 허용하여, 예를 들어 제1 중합체 사슬(111)과 제2 중합체 사슬(112)이 각각 제1 전극(102) 및 제2 전극(103)에 직접 연결될 수 있도록 할 수 있다(예를 들어, 각각의 결합을 통해). 일부 구성에서, 제1 중합체 사슬(111)과 제2 중합체 사슬(112) 모두 반드시 제1 전극(102)과 제2 전극(103) 중 하나 또는 둘 다에 직접 연결되지 않는다는 것을 이해해야 한다. 대신에, 제1 중합체 사슬(111)과 제2 중합체 사슬(112) 중 하나 또는 둘 다 제1 전극(102) 및 제2 전극(103) 중 하나 또는 둘 다에 각각, 직접 또는 간접적으로, 결합되는 하나 이상의 다른 구조에 직접 결합될 수 있다.

본원에서 보다 상세히 기술되는 바와 같이, 표지(131, 132, 133 및 134) 각각은, 상응하는 뉴클레오티드(121, 122, 123 및 124)의 정체가 결정될 수 있는 변조에 기초하여, 브리지(110)의 전기 전도도 또는 임피던스를 변조하는 방식으로 제1 중합체 사슬(111) 및 제2 중합체 사슬 중 적어도 하나의 전기적 특성을 변경할 수 있다. 예를 들어, 도 1b를 참조하여 더 자세히 기술되는 바와 같이, 표지(131, 132, 133, 및 134) 각각은, 상응하는 뉴클레오티드(121, 122, 123 및 124)의 정체가 결정될 수 있는 변조에 기초하여, 브리지(110)의 전기 전도도 또는 임피던스를 변조하는 방식으로 변경 영역(113) 내의 제1 중합체 사슬(111)과 제2 중합체 사슬 사이의 혼성화를 변경할 수 있다.

도 1a에 도시된 조성물(100)은 상응하는 표지에 결합된 임의의 적합한 수의 뉴클레오티드, 예를 들어 하나 이상의 뉴클레오티드, 2개 이상의 뉴클레오티드, 3개 이상의 뉴클레오티드, 또는 4개의 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 예를 들어, 뉴클레오티드(121)(예시적으로 G)는 일부 예에서 링커(135)를 통해 상응하는 표지(131)에 결합될 수 있다. 뉴클레오티드(122)(예시적으로 T)는 일부 예에서 링커(136)를 통해 상응하는 표지(132)에 결합될 수 있다. 뉴클레오티드(123)(예시적으로 A)는 일부 예에서 링커(137)를 통해 상응하는 표지(133)에 결합될 수 있다. 뉴클레오티드(124)(예시적으로 C)는 일부 예에서 링커(138)를 통해 상응하는 표지(134)에 결합될 수 있다. 일부 예에서 표지와 동일하거나 상이한 중합체를 포함할 수 있는 링커를 통한 뉴클레오티드와 표지 사이의 결합은 n-히드록시숙신이미드(NHS) 에스터 화학 또는 클릭 화학과 같은 당업계에 공지된 임의의 적합한 방법을 사용하여 제공될 수 있다. 일부 예에서 표지(131, 132, 133 및 134)는 서로 동일한 유형의 재료를 포함할 수 있지만, 적어도 하나의 측면에서 서로 다를 수 있으며, 예를 들어 도 1a에 제안된 바와 같이 서로 다른 길이를 가질 수 있다. 대안적으로, 도 2a를 참조하여 후술하는 바와 같이, 일부 예에서 표지(131, 132, 133, 및 134)는 서로 다른 재료를 포함할 수 있다. 또 다른 대안으로서, 일부 예에서 표지(131, 132, 133 및 134)는 서로 동일한 유형의 중합체를 포함할 수 있지만, 적어도 하나의 측면에서 서로 상이할 수 있으며, 예를 들어 도 2b를 참조하여 기술된 특정 예에서와 같이 서로 상이한 단량체 단위의 서열을 가질 수 있거나, 도 2c를 참조하여 기술된 특정 예에서와 같이 서로 다른 수의 단량체 단위를 가질 수 있다. 일부 예에서, 표지(131, 132, 133, 및 134)는 변경 영역(113)과 동일한 유형의 중합체를 포함할 수 있고, 일부 예에서는 중합체 사슬(111, 112) 중 하나 또는 둘 모두의 나머지에서와 동일한 유형의 중합체를 포함할 수 있다. 도 1b를 참조하여 더 상세히 기술되는 바와 같은 방식으로, 표지(131, 132, 133, 및 134)의 특정 특성은 이들 표지가 각각 제1 중합체 사슬(111) 및 제2 중합체 사슬(112) 중 적어도 하나의 전기적 특성을 변경할 때 브리지(110)를 통해 전류 또는 전압과 같은 구별가능한 전기 신호의 생성을 용이하게 하도록 각각 선택될 수 있다. 표지는 반드시 그럴 필요는 없지만 서로 동일한 전기적 특성을 변경할 수 있다. 표지는 반드시 그럴 필요는 없지만 동일한 중합체 사슬의 전기적 특성을 서로 변경할 수 있다. 예를 들어, 표지는 서로 다른 중합체 사슬의 서로 다른 전기적 특성을 변경할 수 있거나, 동일한 중합체 사슬의 서로 다른 전기적 특성을 변경할 수 있거나, 서로 다른 중합체 사슬의 동일한 전기적 특성을 변경할 수 있거나, 동일한 중합체 사슬의 동일한 전기적 특성을 변경할 수 있다.

도 1a에 예시된 조성물(100)은 제1 폴리뉴클레오티드(140) 및 제2 폴리뉴클레오티드(150), 및 적어도 제2 폴리뉴클레오티드(150)의 서열을 사용하여 복수의 뉴클레오티드(121, 122, 123 및 124)의 뉴클레오티드를 제1 폴리뉴클레오티드(140)에 부가할 수 있는 폴리머라제(105)를 포함한다. 이러한 뉴클레오티드 각각에 상응하는 표지(131, 132, 133, 및 134)는 제1 및 제2 중합체 사슬(111, 112) 중 적어도 하나의 전기적 특성을 변경할 수 있으며, 예를 들어, 도 1b를 참조하여 하기 보다 상세하게 기술되는 바와 같은 방식으로, 제1 중합체 사슬(111)과 제2 중합체 사슬(112) 사이의 혼성화를 변경할 수 있다. 검출 회로(160)는 적어도 브리지(110)를 통한 전류 또는 임피던스의 변화를 사용하여 폴리머라제(105)가 제1 폴리뉴클레오티드(140)에 뉴클레오티드(121, 122, 123 및 124)(반드시 이러한 순서일 필요는 없음)를 각각 부가하는 서열을 검출할 수 있으며, 변화는 이들 뉴클레오티드에 상응하는 표지(131, 132, 133 및 134)를 사용하여 전기적 특성의 변경에 응답한다. 예를 들어, 검출 회로(160)는 제1 전극(102)과 제2 전극(103)을 가로질러 전압을 인가할 수 있고, 이러한 전압에 응답하여 브리지(110)를 통해 흐르는 임의의 전류를 검출할 수 있다. 또는, 예를 들어, 검출 회로(560)는 브리지(510)를 통해 정전류를 흐르게 할 수 있고, 제1 전극(502)과 제2 전극(503) 사이의 전압 차이를 검출할 수 있다.

도 1a에 도시된 특정 시간에, 표지(131, 132, 133 및 134) 중 어느 것도 브리지(110)와 접촉하지 않으므로, 상대적으로 높은 전류가 브리지(110)를 통해 흐를 수 있다. 뉴클레오티드(121, 122, 123, 124)가 유체(120)를 통해 자유롭게 확산될 수 있고 각각의 표지(131, 132, 133, 134)가 그러한 확산의 결과로서 브리지(110)에 잠깐 접촉할 수 있지만, 표지는 비교적 빠르게 탈혼성화될 수 있고 따라서 브리지(110)의 전기 전도도 또는 임피던스에 대한 임의의 생성된 변화는 너무 짧아서 검출할 수 없거나, 제1 폴리뉴클레오티드(140)에 뉴클레오티드를 부가한 것과 상응하지 않는 것으로 명확하게 식별할 수 있을 것으로 예상된다. 예를 들어, 확산의 결과로서 또는 폴리머라제-지시된 뉴클레오티드 통합으로 인해 혼성화되는 표지는 동일한 혼성화 수명(통계적으로 말해서)을 가질 수 있다. 수명은 상호작용의 오프 속도(off rate)에 의해 결정된다. 오프 속도(off rate)는 상호작용의 특성, 온도, 염분, 완충액 및 기타 요인에 의해 지배되는 상수이다. 실제 신호와 확산 신호를 구별하는 것은 표지가 결합되는 시간의 퍼센트이며, 온 속도(on rate)에 의해 결정된다. 온 속도는 표지의 농도에 따라 증가한다(오프 속도와는 대조적으로). 예를 들어, 농도는 주어진 부피에서 분자를 찾을 확률에 해당한다. 뉴클레오티드가 활성 부위에 유지되기 때문에, 확산성 뉴클레오티드에 비해 결합된 뉴클레오티드의 경우 표지의 농도가 훨씬 더 높을 수 있다. 따라서, 온 속도가 훨씬 더 높다. 표지는 확산 및 특정 상태에서 똑같이 빠르게 탈혼성화될 수 있지만, 특정 상태에서는 표지는 매우 빠르게 재결합된다. 뉴클레오티드가 통합된 후, 표지와 뉴클레오티드 사이의 링커가 절단된다. 그 결과, 다음에 표지가 탈혼성화되면, 확산 표지와 같은 확률로 떠내려간다.

이에 비해, 도 1b는 폴리머라제(105)가 적어도 제2 폴리뉴클레오티드(150)의 서열을 사용하여(예를 들어, 그 서열에서 C에 상보적이 되도록) 제1 폴리뉴클레오티드(140)에 뉴클레오티드(121)(예시적으로, G)를 부가하는 시간을 예시한다. 폴리머라제(105)는 표지(131)가 결합된(일부 예에서 링커(137)를 통해) 뉴클레오티드(121)에 작용하기 때문에, 이러한 작용은 제1 및 제2 중합체 사슬(111, 112) 중 적어도 하나의 전기적 특성을 변경하기 위해, 예를 들어 변경 영역(113) 내에서 제1 중합체 사슬(111)과 제2 중합체 사슬(112) 사이의 혼성화를 변경하기 위해 충분한 시간 동안 브리지(110)에 충분히 가까운 위치에 표지(131)를 유지하여, 검출 회로(160)를 사용하여 검출가능하도록 브리지(110)의 전기 전도도 또는 임피던스와 같은 전기적 특성에 충분히 긴 변화를 야기하여, 뉴클레오티드(121)가 제1 폴리뉴클레오티드(140)에 부가되는 것으로 식별할 수 있게 한다. 또한, 표지(131)는 제1 및 제2 중합체 사슬(111, 112) 중 적어도 하나의 전기적 특성을 변경할 때, 예를 들어 제1 중합체 사슬(111)과 제2 중합체 사슬(112) 사이의 혼성화를 변경할 때, 브리지(110)에 전기 전도도 또는 임피던스와 같은 전기적 특성을 부여하는 특성을 가질 수 있으며, 이를 통해 검출 회로(160)는 부가된 뉴클레오티드(121)(예시적으로 G)를 임의의 다른 뉴클레오티드와 비교하여 고유하게 식별할 수 있다.

유사하게, 표지(132)는 제1 및 제2 중합체 사슬(111, 112) 중 적어도 하나의 전기적 특성을 변경할 때, 예를 들어 제1 중합체 사슬(111)과 제2 중합체 사슬(112) 사이의 혼성화를 변경할 때, 브리지(110)의 전기 전도도 또는 임피던스와 같은 전기적 특성을 변경하는 특성을 가질 수 있으며, 이를 통해 검출 회로(160)는 부가된 뉴클레오티드(122)(예시적으로 T)를 임의의 다른 뉴클레오티드와 비교하여 고유하게 식별할 수 있다. 유사하게, 표지(133)는 제1 및 제2 중합체 사슬(111, 112) 중 적어도 하나의 전기적 특성을 변경할 때, 예를 들어 제1 중합체 사슬(111)과 제2 중합체 사슬(112) 사이의 혼성화를 변경할 때, 브리지(110)의 전기 전도도 또는 임피던스와 같은 전기적 특성을 변경하는 특성을 가질 수 있으며 이를 통해 검출 회로(160)는 부가된 뉴클레오티드(123)(예시적으로 C)를 임의의 다른 뉴클레오티드와 비교하여 고유하게 식별할 수 있다. 유사하게, 표지(134)는 제1 및 제2 중합체 사슬(111, 112) 중 적어도 하나의 전기적 특성을 변경할 때, 예를 들어 제1 중합체 사슬(111)과 제2 중합체 사슬(112) 사이의 혼성화를 변경할 때, 브리지(110)의 전기 전도도 또는 임피던스와 같은 전기적 특성을 변경하는 특성을 가질 수 있으며 이를 통해 검출 회로(160)는 부가된 뉴클레오티드(124)(예시적으로 C)를 임의의 다른 뉴클레오티드와 비교하여 고유하게 식별할 수 있다.

도 1a 내지 도 1b에 도시된 비제한적인 예에서, 표지(131, 132, 133, 및 134)의 상이한 길이는 각각 변경 영역(113)이 상이한 길이를 갖도록 하고, 이에 기초하여 제1 전극(102)과 제2 전극(103) 사이의 전기 신호는 검출 회로(160)가 이들 표지에 각각 결합된 뉴클레오티드(121, 122, 123, 124)를 식별할 수 있는 방식으로 변할 수 있다. 그러나, 표지(131, 132, 133, 및 134)는 검출 회로(160)가 이들 표지에 각각 결합된 뉴클레오티드(121, 122, 123, 124)를 식별할 수 있는 방식으로 제1 전극(102)과 제2 전극(103) 사이의 전기 신호가 변할 수 있는 것에 기초하여 임의의 적합한 각각의 특성을 가질 수 있음을 이해해야 한다.

예를 들어, 도 2a 내지 도 2c는 이중-가닥 중합체 브리지 내에서 혼성화를 변경하는 다른 표지를 갖는 뉴클레오티드의 예를 개략적으로 예시한다. 도 2a에 도시된 비제한적인 예에서, 표지(231)는 제1 중합체 사슬(111)과 제2 중합체 사슬(112) 사이의 혼성화를 변경하는 제1 물질(특정 채우기를 갖는 직사각형으로 제안됨)을 포함한다. 각각의 표지(232, 233, 및 234)는 유사하게 상이한 재료를 포함한다(구체적으로 표지되지는 않았지만, 서로 다른 채우기를 갖는 직사각형으로 표시됨). 이러한 표지 물질의 변화는, 이러한 물질이 제1 중합체 사슬(111)과 제2 중합체 사슬(112) 사이의 혼성화를 변경할 때, 상응하는 뉴클레오티드가 식별될 수 있는 브리지(110)를 통해 상이하고 구별가능한 신호, 예를 들어 전류 또는 전압을 제공한다.

도 2b에 도시된 비제한적인 예에서, 표지(231')는 제1 중합체 사슬(111)과 제2 중합체 사슬(112) 사이의 혼성화를 변경하는 방식으로 브리지(110) 내의 선택된 단량체와 각각 혼성화하는 2개 이상의 신호 단량체(서로 다른 채우기를 갖는 원으로 제안됨)의 서열을 포함한다. 표지(231')의 신호 단량체는 표지 내의 임의의 적합한 위치에 위치할 수 있다. 각각의 표지(232', 233' 및 234')는 유사하게 2개 이상의 신호 단량체(구체적으로 표지되지는 않았지만, 서로 다른 채우기를 갖는 원으로 표시됨)를 포함하지만, 이러한 단량체의 특정 유형 및 서열은 단량체를 나타내는 원의 상이한 채우기에 의해 제안되도록 의도된 바와 같이 표지 간에 다양하다. 표지의 신호 단량체 유형 및 서열의 이러한 변화는, 이러한 단량체가 브리지(110) 내에서 선택된 단량체와 혼성화할 때, 상응하는 뉴클레오티드가 식별될 수 있는 브리지(110)를 통해 상이하고 구별가능한 전기 신호, 예를 들어, 전류 또는 전압을 제공한다.

하나의 비제한적인 예에서, 표지(231', 232', 233', 234')는 적어도 부분적으로 서로 다른 서열을 갖는 각각의 올리고뉴클레오티드를 포함한다. 이들 서열은 변경 영역(113) 내의 브리지(110)에 혼성화하여 변경 영역(113) 내의 3가닥 "삼중체(triplex)" 폴리뉴클레오티드를 제공할 수 있다. 표지의 각각의 올리고뉴클레오티드 서열은 변경 영역(113) 내의 브리지(110)와 서로 상이하게 혼성화할 수 있다. 예를 들어, 표지(231')의 신호 단량체(서로 다른 채우기를 갖는 원으로 제안됨)는 서로 동일하거나 다른 뉴클레오티드일 수 있다. 다른 표지의 신호 단량체는 다른 표지의 제1 및 제2 신호 단량체와 서열이나 유형, 또는 둘 모두가 다른 뉴클레오티드일 수 있으며, 각각의 표지(231', 232', 233', 234')가 제1 및 신호 단량체의 고유한 서열을 갖도록 한다. 각각의 표지 및 브리지(110)에 대한 제1 및 제2 신호 단량체 간의 각각의 혼성화는 브리지(110)를 통해 특정 전류 또는 임피던스를 제공할 수 있다. 예를 들어, 표지(231')는 브리지(110)의 전기 전도도 또는 임피던스를 첫 번째 수준으로 변조하기 위해 브리지(110)에서 염기와 혼성화하는 특정 염기 쌍을 갖는 서열을 가질 수 있다; 표지(232')는 브리지(110)의 전기 전도도 또는 임피던스를 첫 번째 수준과 상이한 두 번째 수준으로 변조하기 위해 브리지(110)에서 염기와 혼성화하는 특정 염기 쌍을 갖는 서열을 가질 수 있다; 표지(233')는 브리지(110)의 전기 전도도 또는 임피던스를 첫 번째 수준 및 두 번째 수준과 상이한 세 번째 수준으로 변조하기 위해 브리지(110)에서 염기와 혼성화하는 특정 염기 쌍을 갖는 서열을 가질 수 있다; 그리고 표지(234')는 브리지(110)의 전기 전도도 또는 임피던스를 첫 번째, 두 번째, 및 수준과 상이한 네 번째 수준으로 변조하기 위해 브리지(110)에서 염기와 혼성화하는 특정 염기 쌍을 갖는 서열을 가질 수 있다. 표지(231', 232', 233', 및 243')는 일부 예에서 도 3을 참조하여 기술된 것과 유사한 방식으로, 브리지(110)의 서로 다른 부분과 혼성화할 수 있다.

유사하게, 표지(231', 232', 233', 및 234') 각각은 상이한 표지로부터의 전기 신호가 검출되고 서로 구별될 수 있게 하는 임의의 적합한 조합, 수, 순서, 및 유형의 단량체 단위(예를 들어, 뉴클레오티드)를 포함할 수 있다. 예를 들어, 도 2c에서 표지(231", 232", 233" 및 243")는 서로 다른 길이를 가질 수 있으며, 예를 들어 변경 영역(113) 내에서 브리지(110)의 혼성화에 의해, 예를 들어 제1 중합체 사슬(111)과 제2 중합체 사슬(112) 사이의 혼성화를 변경할 수 있는 임의의 적합한 수의 단량체를 포함할 수 있다. 예를 들어, 표지는 임의의 적합한 수의 단량체(예를 들어, 뉴클레오티드), 예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개, 또는 10개 이상의 단량체를 포함할 수 있다. 일부 예에서 표지(231", 232", 233" 및 243")는 도 2b를 참조하여 기술된 것과 같은 방식으로, 서로 다른 서열을 또한 가질 수 있음을 이해해야 한다. 또한, 도 2a 내지 2c에 예시된 표지는 제1 중합체 사슬과 제2 중합체 사슬(111, 112) 사이의 혼성화를 변경하는 것으로 기술되어 있지만, 이러한 표지는 임의의 적합한 전기적 특성 또는 제1 중합체 사슬 및 제2 중합체 사슬 중 하나 또는 둘 모두의 특성을 변경할 수 있다. 또한, 이러한 표지는 정확히 2개의 중합체 사슬을 포함하는 브리지와 함께 사용하는 것으로 제한되지 않으며, 실제로 단일 중합체 사슬, 또는 2개 이상의 중합체 사슬을 포함하는 브리지와 함께 사용될 수 있다.

도 3은 이중-가닥 폴리뉴클레오티드 브리지 및 브리지의 폴리뉴클레오티드 사이의 혼성화를 변경하는 뉴클레오티드 표지를 포함하는 서열분석을 위한 예시적인 조성물을 개략적으로 예시한다. 도 3에 도시된 예에서, 조성물(300)은 도 1a 내지 도 1b를 참조하여 기술된 조성물(100)과 유사할 수 있으며, 예를 들어 기판(구체적으로 도시되지 않음), 제1 전극(302), 제2 전극(303), 폴리머라제(305), 제1 중합체 사슬(311) 및 제2 중합체 사슬(312)을 포함하는 브리지(310), 표지(331)에 결합된 뉴클레오티드(321)를 포함한다. 폴리머라제(305)는 링커(306)를 통해 제1 폴리뉴클레오티드 사슬(311)에 결합될 수 있으며, 이는 강성일 수 있고, 적어도 제2 폴리뉴클레오티드(350)의 서열을 사용하여 제1 폴리뉴클레오티드(340)에 뉴클레오티드(321)와 같은 뉴클레오티드를 부가할 수 있다. 조성물(300)은 여기서 생략된 도 1a 내지 1b를 참조하여 기술된 것과 같은 다른 구성요소를 포함할 수 있다. 도 3에 예시된 특정 뉴클레오티드 서열은 순전히 예일 뿐이며 제한하려는 의도가 아님을 이해할 것이다.

도 3에 도시된 예에서, 제1 폴리뉴클레오티드 사슬(311)은 삼각형으로 표시된 지점에서 제1 및 제2 전극(302, 303)에 결합될 수 있고, 제2 폴리뉴클레오티드 사슬(312)은 브리지(310)의 길이를 따라 제1 폴리뉴클레오티드 사슬(311)에 혼성화될 수 있다. 뉴클레오티드(321)의 표지(331)는 브리지(310)와 혼성화하여 브리지(310)를 통해 첫 번째 전기 신호를 제공하는 서열(예시적으로, TTTTTT)을 가질 수 있다. 다른 뉴클레오티드(구체적으로 도시되지 않은 뉴클레오티드)의 다른 표지(332, 333)는 브리지(310)의 다른 부분과 혼성화하여, 브리지(310)를 통해 상이한 전기적 신호를 제공하는 상이한 서열을 가질 수 있다. 상이한 표지의 상이한 서열은 도 1a 내지 1b를 참조하여 기술된 것과 같은 방식으로 서로 구별가능한 브리지(310)를 통한 각각의 전기적 신호를 제공하도록 선택될 수 있다.

일부 예에서, 도 2b를 참조하여 기술된 표지(231', 232', 233' 및 243')의 올리고뉴클레오티드, 도 2c를 참조하여 기술된 표지(231", 232", 233" 및 243"), 또는 도 3을 참조하여 기술된 표지(331, 332, 333)는 변형된 뉴클레오티드, 예를 들어 변형된 백본을 갖는 뉴클레오티드(예를 들어, 포스포로티오에이트 DNA), 변형된 당(예를 들어, 2'o-메틸 또는 2'OH(RNA)), 변형된 염기(예를 들어, 메틸화된 염기), 또는 펩티드-핵산(PNA) 또는 잠긴 핵산(LNA)과 같은 핵산 유사체를 포함할 수 있다. 이러한 표지는, 폴리뉴클레오티드 사슬(311, 312)(예를 들어 DNA, 또는 거울상 이성질체 DNA)과 함께 사용되는 경우, 이러한 폴리뉴클레오티드 사슬을 포함하는 브리지를 통해 전류 또는 임피던스의 흐름을 검출가능하게 변경하는 방식으로 폴리뉴클레오티드 사슬 간의 혼성화를 변경할 수 있다. 변형된 뉴클레오티드는 폴리뉴클레오티드 사슬(311, 312)이 서로 혼성화하는 방식을 변경할 수 있다. 예를 들어, 표지에서 부피가 큰 염기 변형은 311과 312 사이의 기하학적 구조를 변경하여 전기 전도 특성에 영향을 줄 수 있다. 유사한 메커니즘에 의해, 당 또는 백본에 대한 변형은 유사한 효과를 가질 수 있다. 본원에서 제공되는 임의의 뉴클레오티드 기반 브리지 또는 표지는 도 2b, 2c, 및 3를 참조하여 기술된 바와 같은 변형된 뉴클레오티드 또는 핵산 유사체를 포함할 수 있다.

다른 예에서, 도 1a 내지 도 1b를 참조하여 기술된 표지(131, 132, 133, 134) 또는 도 2a를 참조하여 기술된 표지(231, 232, 233, 234)는 각각의 DNA-결합 단백질을 포함할 수 있다. 이러한 표지는, 폴리뉴클레오티드 사슬(111, 112)(예컨대 DNA, 또는 거울상 이성질체 DNA)과 함께 사용되는 경우, 이러한 폴리뉴클레오티드 사슬을 포함하는 브리지를 통해 전류 또는 임피던스의 흐름을 검출가능하게 변경하는 방식으로 폴리뉴클레오티드 사슬 간의 혼성화, 또는 폴리뉴클레오티드의 전기 전도 특성을 변경할 수 있다. 본 표지에 사용될 수 있는 DNA-결합 단백질의 비-제한적 예는 분자 슬레드, 전사 인자, 디자이너 징크 핑거 및 류신 지퍼와 같은 전사 인자의 결합 도메인으로서 기능하는 단백질, 촉매 불활성 뉴클레아제(예를 들어, Hind III, Eco RI), 히스톤, RecA(및 기타 재조합효소), 촉매 불활성 Crispr-Cas9 및 이의 유사체를 포함한다.

또 다른 예에서, 도 1a 내지 도 1b를 참조하여 기술된 표지(131, 132, 133, 134) 또는 도 2a를 참조하여 기술된 표지(231, 232, 233, 234)는 각각의 인터칼레이터, 예컨대 작은 홈 결합제(MGB), DNA 인터칼레이터, 또는 펩티드 인터칼레이터를 포함할 수 있다. MGB의 비제한적 예는 디스타마이신, 네트롭신, 비스벤즈마다졸, 비스아미딘, 미트라마이신 및 크로모마이신, 및 이들의 유사체 및 유도체를 포함한다. DNA 인터칼레이터는 인접한 DNA 염기쌍 사이에 쌓일 수 있는 평면 방향족 또는 헤테로방향족기를 가진 분자를 포함할 수 있다. 본 표지에 사용될 수 있는 DNA 인터칼레이터의 예는 다우노마이신, 독소루비신, 에피루비신, 닥티노마이신, 디테르칼리늄, 블레오마이신, 엘사미신 A, m-AMSA, 미톡산트론, 아크리딘 및 에티디움 브로마이드를 포함한다. 예를 들어, 에티디움 브로마이드는 DNA 나선을 길게 하여 DNA 나선의 전기 전도도를 변경하는 것으로 여겨진다. 펩티드 기반 DNA 인터칼레이터는 펩티드 백본을 포함할 수 있다. 펩티드 기반 DNA 인터칼레이터의 예는 PNA이다.

일부 예에서, 도 1a 내지 도 1b를 참조하여 기술된 표지(131, 132, 133, 134) 또는 도 2a를 참조하여 기술된 표지(231, 232, 233, 234)는 각각의 서로 얽힌(intertwining) 알파 나선을 포함할 수 있다. 이러한 알파 나선-기반 표지는, 이중-가닥 중합체 브리지(예를 들어, DNA)와 함께 사용되는 경우, 브리지를 통해 전류 또는 임피던스의 흐름을 검출가능하게 변경하는 방식으로 이중-가닥 사슬 사이의 혼성화를 변경할 수 있다. 본 표지에서 사용될 수 있는 알파 나선의 예는 펩티드 코일형 코일(coiled coil) 및 류신 지퍼, 예컨대 본원의 다른 곳에서 보다 상세하게 기술된 것들을 포함한다.

일부 예에서, 도 1a 내지 도 1b를 참조하여 기술된 브리지(110)는 임의의 적합한 수의 폴리펩티드 사슬, 예를 들어, 2개 이상의 폴리펩티드 사슬을 포함할 수 있다. 예를 들어, 브리지(110)의 제1 및 제2 중합체 사슬(111, 112)은 각각 적어도 서로 혼성화된 제1 및 제2 폴리펩티드 사슬을 포함할 수 있다. 도 1a 내지 도 1b를 참조하여 기술된 표지(131, 132, 133, 134), 도 2a를 참조하여 기술된 표지(231, 232, 233, 234), 또는 도 7a 내지 도 7c를 참조하여 기술된 표지(731)는 제1 및 제2 폴리펩티드의 전기적 특성을 변경하는 각각의 단백질, 펩티드, 또는 인터칼레이터를 포함할 수 있다. 예를 들어, 브리지(110)의 폴리펩티드 사슬(111, 112) 중 하나 이상, 및 일부 예에서 브리지(110)의 폴리펩티드 사슬 각각은 제1 전극(102)과 제2 전극(103) 사이의 전자 전달에 직접적으로 기여할 수 있다. 임의의 이론에 얽매이지 않고, 이러한 전자 전달은 예를 들어 각각의 사슬에서 방향족 아미노산 측쇄(예를 들어, 각 사슬의 티로신, 트립토판 또는 페닐알라닌)의 파이-스태킹(pi-stacking)을 사용하여 가능하게 할 수 있는 것으로 여겨진다. 그러나, 파이-스태킹 이외의 다른 수송 메커니즘이 단독으로 또는 파이-스태킹과 조합하여 사용될 수 있다. 표지는 각각 예를 들어 이량체, 삼량체 또는 더 높은 량체(mer)와 같은 복합체의 형성을 사용하여 브리지(110)의 폴리펩티드 사슬(111, 112) 중 하나 이상에 전기 전도도(예시적 전기적 특성)의 변화를 부여할 수 있다. 이와 같이, 브리지(110)의 각각의 표지 및 하나 이상의 폴리펩티드 사슬은 일부 예에서 함께 작용하여 전자를 제1 전극(102)에서 제2 전극(103)으로 전달할 수 있다. 표지는 표지-폴리펩티드 사슬 복합체의 전기 전도도를 서로 다르게 변경하여 뉴클레오티드가 식별될 수 있는 다른 전기 신호를 제공하도록 (예를 들어, 펩티드 기반 표지의 아미노산 치환을 통해) 변경될 수 있다.

도 1a 내지 도 1b를 참조하여 기술된 것과 같은 예는 이중-가닥 중합체 브리지를 포함하지만, 브리지는 단일-가닥 중합체일 수 있거나 또한 이를 포함할 수 있거나, 2개 초과의 중합체 사슬을 포함할 수 있음을 이해해야 한다. 도 5a 내지 5b는 단일-가닥 중합체 브리지를 포함하는 서열분석을 위한 예시적 조성물(500)을 예시한다. 이제 도 5a를 참조하면, 조성물(500)은 기판(501), 제1 전극(502), 제2 전극(503), 폴리머라제(504), 브리지(510), 뉴클레오티드(521, 522, 523 및 524), 이들 뉴클레오티드에 각각 결합된 표지(531, 532, 533 및 534), 제1 폴리뉴클레오티드(540), 제2 폴리뉴클레오티드(550), 및 검출 회로(560)를 포함한다. 폴리머라제(505)는 브리지(510)에 인접해 있으며, 기판(501)은 제1 전극(502) 및 제2 전극(503)을 지지할 수 있고, 조성물(500)의 구성요소는 유체(520)로 채워진 유동 셀(예를 들어, 벽(561, 562, 562)을 가짐) 내에 둘러싸일 수 있으며 여기서 뉴클레오티드(521, 522, 523, 및 524)(표지와 결합되어 있음), 폴리뉴클레오티드(540, 550), 및 적합한 시약은 도 1a 내지 1b를 참조하여 기술된 것과 유사한 방식으로 운반될 수 있다.

브리지(510)는 제1 전극(502)과 제2 전극(503) 사이의 공간에 걸쳐 있을 수 있고, 중합체 사슬(511)을 포함할 수 있다(중합체 사슬 내의 원은 중합체 사슬의 길이를 따라 서로 결합되는 단량체 단위를 암시하도록 의도됨). 중합체 사슬(511)은 제1 전극(502)과 제2 전극(503) 사이의 공간의 길이(L)와 거의 동일한 길이를 가질 수 있거나 그렇지 않으면 중합체 사슬(511)이 제1 전극(502)과 제2 전극(503) 사이의 공간에 걸쳐 있도록, 예를 들어 중합체 사슬(511)이 제1 전극(502) 및 제2 전극(503) 각각에 직접 결합될 수 있도록(예를 들어, 각각의 결합을 통해) 허용한다. 일부 예에서, 중합체 사슬(511)은 폴리펩티드 사슬을 포함할 수 있다. 폴리펩티드 사슬은 일부 예에서 나선형일 수 있다. 예를 들어, 나선형 폴리펩티드는 상대적으로 먼 거리에 걸쳐 전자를 전달할 수 있는 우수한 전자 매개체로 여겨진다. 임의의 이론에 얽매이지 않고, 폴리펩티드는 전자 터널링 메커니즘, 도약(hopping) 메커니즘 또는 둘 모두를 사용하여 전도할 수 있다고 여겨진다. 전자 터널링 메커니즘에서, 전자는 예를 들어 티로신, 트립토판 또는 페닐알라닌과 같은 방향족 아미노산을 통해 폴리펩티드 사슬의 분자 오비탈을 통해 이동할 수 있다. 도약(hopping) 메커니즘에서, 하전된 입자(양성 또는 음성)는 폴리펩티드 사슬을 통해 도약할 수 있다. 폴리펩티드 사슬은 베타 가닥을 포함하여 논의된 것 이외에 다양한 구조를 형성할 수 있다. 폴리펩티드 사슬은 천연 아미노산과 비-천연 아미노산의 임의의 적합한 조합을 포함할 수 있다. 큰 방향족 잔기(티로신, 페닐알라닌, 트립토판) 및 β-분지형 아미노산(트레오닌, 발린, 이소류신)은 β-시트의 중간에 있는 β-가닥에서 발견되는 것이 선호되며, 특히 방향족 잔기는 위에서 논의한 메커니즘을 통해 전도성에 기여할 것으로 예상된다.

또 다른 구체적이고 비제한적인 예에서, 폴리펩티드 사슬은 전자가 흐를 수 있는 파이-파이 접합을 제공하기 위해 연장된 F 방향족기 스태킹을 허용하는 좌선형(left-handed) 나선 백본 형태를 갖는 것으로 여겨지는 서열 GFPRFAGFP(SEQ ID NO: 1)를 포함한다. 방향족 잔기의 다른 조합 및 순서는 특히 코일형 코일(coiled coil)을 형성하기 위해 제2 펩티드와 복합화될 때 상이한 크기의 전도도를 가질 수 있는 펩티드를 생성하는데 사용될 수 있다. 일부 예에서, 이러한 사슬과 함께 사용하기 위한 표지는 동일한 서열의 두 번째 동일하거나 거의 동일한 사본, 또는 F가 결여되거나 F를 F와 다르게 전기를 전도하는 Y와 같은 다른 방향족 잔기로 대체하는 유사한 폴리펩티드를 포함할 수 있다. 이러한 방식으로, 코일형 코일(coiled coil)을 형성하기 위해 동일한 두 개를 결합하거나, 코일형 코일(coiled coil)을 형성하기 위해 두 개의 상이한 나선을 결합하면, 단량체 와이어에 대해 상이한 전도도가 발생할 수 있으므로, 제2 표지, 및 궁극적으로 표지에 연결된 뉴클레오티드의 실체를 식별할 수 있게 한다. 전술한 원리는 4개의 뉴클레오티드가 코딩될 수 있도록 2개 이상의 표지로 확장된다.

또 다른 구체적이고 비제한적인 예에서, 하나 이상의 폴리펩티드 사슬은 서열 FKEFAKL FKEFAKL FHKFAKL(SEQ ID NO: 2)을 포함하며, 이는 이러한 서열의 다중 사본을 포함하는 피브릴로 자가-조립되는 것으로 여겨지며, 이러한 피브릴은 유사하게 전기 전도성이다. 이러한 서열의 한 예는 브리지(510)에 제공될 수 있고, 이러한 서열의 또 다른 예는 이러한 브리지와 함께 사용하기 위한 제1 표지에 제공될 수 있으며 예를 들어, 브리지의 전기 전도도를 증가시킴으로써, 브리지의 전기 전도도를 변경하는 방식으로 브리지의 서열과 함께 자가-조립될 것으로 예상될 수 있다. 이러한 브리지와 함께 사용하기 위한 제2 표지는 서열 LKELAKL LKELAKL LHELAKL(SEQ ID NO: 3)을 포함할 수 있으며, 이는 이러한 서열의 다중 사본을 포함하는 피브릴로 자가-조립되는 것으로 여겨지며, 이러한 피브릴은 전기적으로 비-전도성이다. 제2 표지의 이러한 서열은 예를 들어 제1 표지 서열 FKEFAKL FKEFAKL FHKFAKL(SEQ ID NO: 2)에 의해 제공되는 것보다 더 적은 브리지의 전기 전도도를 제공함으로써, 브리지의 전기 전도도를 변경하는 방식으로 브리지의 서열 FKEFAKL FKEFAKL FHKFAKL(SEQ ID NO: 2)과 함께 자가-조립될 것으로 예상될 수 있다. 와이어와 표지 모두에서 방향족 잔기의 다른 조합과 순서는 특히 코일형 코일(coiled coil)을 형성하기 위해 복합화될 때 상이한 크기의 전도도를 가질 수 있는 펩티드를 생성하는데 사용될 수 있다. 이러한 방식으로, 두 개의 동일한 또는 두 개의 상이한 나선을 조합하여 코일형 코일(coiled coil)을 형성하면 단량체 와이어에 비해 전도도가 다를 수 있으므로, 제2 표지, 및 궁극적으로 표지에 연결된 뉴클레오티드의 실체를 식별할 수 있게 한다. 전술한 원리는 4개의 뉴클레오티드가 코딩될 수 있도록 2개 이상의 표지로 확장된다.

또 다른 구체적이고 비제한적인 예에서, 브리지(510)는 전기 전도성인 것으로 여겨지는 천연 미생물 선모(pillus)에서 발생할 수 있는 것과 같은 PilA 단백질을 포함할 수 있다. G. sulfurreducens의 PilA 단백질은 전기 전도성 나노와이어를 형성하는 코일형 코일(coiled coil) 모티프를 포함하는 것으로 여겨진다.

도 5b를 참조하여 아래에서 더 자세히 설명하는 바와 같이, 표지(531, 532, 533, 및 534)는 각각 브리지(510)의 전기 전도도 또는 임피던스를 변조하는 방식으로 변경 영역(513) 내의 중합체 사슬(511)의 전기적 특성을 변경할 수 있으며, 이는 상응하는 뉴클레오티드(521, 522, 523 및 524)의 실체가 결정될 수 있는 변조를 기초로 한다. 도 5a에 예시된 조성물(500)은 도 1a 내지 1b를 참조하여 기술된 것과 유사한 방식으로, 상응하는 표지에 결합된 임의의 적합한 수의 뉴클레오티드, 예를 들어, 1개 이상의 뉴클레오티드, 2개 이상의 뉴클레오티드, 3개 이상의 뉴클레오티드, 또는 4개의 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 예를 들어, 뉴클레오티드(521)(예시적으로, G)는 일부 예에서 링커(535)를 통해 상응하는 표지(531)에 결합될 수 있다. 뉴클레오티드(522)(예시적으로, T)는 일부 예에서 링커(536)를 통해 상응하는 표지(532)에 결합될 수 있다. 뉴클레오티드(523)(예시적으로, A)는 일부 예에서 링커(537)를 통해 상응하는 표지(533)에 결합될 수 있다. 뉴클레오티드(524)(예시적으로, C)는 일부 예에서 링커(538)를 통해 상응하는 표지(534)에 결합될 수 있다. 도 5b를 참조하여 보다 상세하게 기술되는 것과 같은 방식으로, 표지(531, 532, 533, 및 534)의 특정 특성은 이러한 표지가 중합체 사슬(511) 내에서 전기적 특성을 변경할 때 브리지(510)를 통해 구별가능한 전기적 신호, 예컨대 전류 또는 전압의 생성을 용이하게 하도록 각각 선택될 수 있다.

도 5a에 예시된 조성물(500)은 제1 폴리뉴클레오티드(540) 및 제2 폴리뉴클레오티드(550), 및 적어도 제2 폴리뉴클레오티드(550)의 서열을 사용하여 복수의 뉴클레오티드(521, 522, 523, 및 524)의 뉴클레오티드를 제1 폴리뉴클레오티드(540)에 부가할 수 있는 폴리머라제(505)를 포함한다. 이러한 뉴클레오티드 각각에 상응하는 표지(531, 532, 533, 및 534)는 도 5b를 참조하여 아래 보다 더 상세하게 기술되는 것과 같은 방식으로 중합체 사슬(511)의 전기적 특성을 변경할 수 있다. 검출 회로(560)는 적어도 브리지(510)를 통한 전류 또는 임피던스의 변화를 사용하여 폴리머라제(505)가 제1 폴리뉴클레오티드(540)에 각각 뉴클레오티드(521, 522, 523 및 524)(반드시 그 순서일 필요는 없음)를 부가하는 서열을 검출할 수 있으며, 변화는 이러한 뉴클레오티드에 상응하는 표지(531, 532, 533, 및 534)를 사용하여 중합체 사슬의 전기적 특성의 변경에 반응한다. 예를 들어, 검출 회로(560)는 제1 전극(502)과 제2 전극(503)을 가로질러 전압을 인가할 수 있고, 이러한 전압에 반응하여 브리지(510)를 통해 흐르는 임의의 전류를 검출할 수 있다. 또는, 예를 들어, 검출 회로(560)는 브리지(510)를 통해 정전류를 흐르게 하고, 제1 전극(502)과 제2 전극(503) 사이의 전압 차이를 검출할 수 있다.

도 5a에 예시된 특정 시간에서, 표지(531, 532, 533, 및 534) 중 어느 것도 브리지(510)와 접촉하지 않으므로, 상대적으로 높은(또는 낮은) 전류가 브리지(510)를 통해 흐를 수 있다. 이에 비해, 도 5b는 폴리머라제(505)가 적어도 제2 폴리뉴클레오티드(550)의 서열을 사용하여(예를 들어, 그 서열에서 C에 상보적이 되도록) 제1 폴리뉴클레오티드(540)에 뉴클레오티드(521)(예시적으로, G)를 부가하는 시간을 예시한다. 폴리머라제(505)는 표지(531)가 결합된(일부 예에서 링커(537)를 통해) 뉴클레오티드(521)에 작용하기 때문에, 이러한 작용은 검출 회로(560)를 사용하여 검출될 수 있도록 브리지(510)의 전기 전도도 또는 임피던스와 같은 전기적 특성의 충분히 긴 변화를 유발하기에 충분한 시간 동안 브리지(510)에 충분히 가까운 위치에 표지(531)를 유지하며, 이는 뉴클레오티드(521)가 제1 폴리뉴클레오티드(540)에 부가되는 것으로 식별할 수 있게 한다. 예를 들어, 표지(531)는 도 5b에 예시된 것과 같은 방식으로 중합체 사슬(511)의 변형을 일으킬 수 있거나(예를 들어, 비틀림, 뒤틀림, 신장 또는 기타 형태 변화를 유발할 수 있음), 중합체 사슬(511)의 전기 전도 상태를 변경할 수 있고, 이에 따라 더 낮은(또는 더 높은) 전류가 브리지(510)를 통해 흐르도록 한다. 하나의 구체적인 예에서, 중합체 사슬(511)은 제1 나선형 폴리펩티드를 포함하고 표지(531)는 브리지(510)의 전기적 특성을 변화시키는 제1 나선형 폴리펩티드와 이량체를 형성하는 제2 나선형 폴리펩티드를 포함한다. 예를 들어, 제2 나선형 폴리펩티드는 제1 폴리펩티드의 전기 전도도를 변화시키거나 제1 폴리펩티드 내의 아미노산의 전기적 환경을 변화시키는 방식으로 제1 폴리펩티드의 형태를 변화시킬 수 있다. 예시적으로, 폴리펩티드 사슬의 전기 전도도는 트립토판 잔기(들)의 위치(들)를 사용하여 조정가능할 것으로 예상될 수 있다. 예를 들어, 폴리펩티드 사슬의 전기 전도도는 트립토판 잔기가 폴리펩티드 사슬의 양쪽 말단 근처에 위치할 때 더 높을 것으로 예상될 수 있고, 트립토판 잔기가 폴리펩티드 사슬의 중간 근처에 위치할 때 더 낮을 것으로 예상될 수 있다. 이러한 방식으로, 제1 및 제2 나선형 폴리펩티드의 각각의 전기 전도도는 구별가능한 전기 신호를 제공하고, 브리지와 결합될 때 상이한 표지로서 기능하여, 이러한 표지에 결합된 뉴클레오티드의 식별을 허용하도록 조정될 수 있다. 대안적으로, 이러한 조정가능한 펩티드는 브리지에서 사용하기 위해 조정될 수 있으며, 표지를 사용하여 전기 전도도를 변조할 수 있다.

표지(531, 532 및 533)는 유사하게 제1 중합체 사슬(511)의 전기적 특성을 변경할 때 브리지(510)의 전기 전도도 또는 임피던스를 변경하는 각각의 특성을 가질 수 있으며, 이를 통해 검출 회로(560)는 임의의 다른 뉴클레오티드와 비교하여 부가된 뉴클레오티드를 고유하게 식별할 수 있다. 도 5a 내지 5b에 예시된 비제한적 예에서, 상이한 길이의 표지(531, 532, 533 및 534)는 각각 변경 영역(513)이 상이한 길이를 갖도록 하고, 이에 기초하여 제1 전극(502)과 제2 전극(503) 사이의 전기 신호는 검출 회로(560)가 이러한 표지에 각각 결합된 뉴클레오티드(521, 522, 523, 524)를 식별할 수 있는 방식으로 다양할 수 있다. 그러나, 표지(531, 532, 533, 및 534)는 검출 회로(560)가 이러한 표지에 각각 결합된 뉴클레오티드(521, 522, 523, 524)를 식별할 수 있는 방식으로 제1 전극(502)과 제2 전극(503) 사이의 전기 신호가 변할 수 있는 것에 기초하여 임의의 적합한 각각의 특성을 가질 수 있음을 이해해야 한다.

일부 예에서, 도 1a 내지 도 1b, 도 2a, 도 5a 내지 도 5b, 또는 도 7a 내지 도 7c를 참조하여 기술된 하나 이상의 표지는 각각의 인터칼레이터, 예를 들어 DNA에 인터칼레이터 되는 펩티드를 포함할 수 있다. 일부 예에서 폴리뉴클레오티드 사슬 또는 폴리펩티드 사슬과 함께 사용될 수 있는 이러한 펩티드-기반 표지는 이러한 사슬을 포함하는 브리지를 통해 전류 또는 임피던스의 흐름을 검출가능하게 변경하는 방식으로 사슬 간의 혼성화를 변경할 수 있거나, 그렇지 않으면 해당 사슬을 포함하는 브리지를 통해 전류의 흐름을 검출가능하게 변rud시키는 방식으로 하나 이상의 사슬의 전기적 특성을 변경할 수 있다. ssDNA 또는 다중-가닥 DNA(예를 들어, dsDNA 또는 삼중-가닥 DNA)와 함께 사용하기 위한 표지에 포함될 수 있는 펩티드의 비제한적인 한 예는 DNA 서열 폴리(dG-d5meC)에 결합하는 헵타펩티드 KGKGKGK(SEQ ID NO: 4)이며 해당 DNA 서열을 B 형태에서 Z 형태로 전환할 수 있다. 이러한 구조적 변화는 DNA 브리지의 전도도 변화와 함께 수반되는 것으로 예상될 수 있다. 또한, 위에서 언급한 바와 같이, PNA가 본 표지에 포함될 수 있다. 예를 들어, PNA는 dsDNA 브리지와 삼중체를 형성할 수 있다. dsDNA 브리지와 삼중체를 형성할 수 있는 다른 예시적인 표지는 LNA, 2'-O-메틸 리보뉴클레오티드 및 RNA를 포함한다. 이중-가닥 RNA 브리지와 함께 삼중체를 형성할 수 있는 예시적인 표지는 단일-가닥 RNA를 포함한다.

일부 예에서, 도 1a 내지 도 1b, 도 2a, 도 5a 내지 도 5b, 또는 도 7a 내지 도 7c를 참조하여 기술된 하나 이상의 표지는 각각의 서로 얽힌(intertwining) 알파 나선을 포함할 수 있다. 이러한 알파 나선-기반 표지는, 다중-가닥(예를 들어, 이중-가닥) 중합체 브리지(예를 들어, 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드)와 함께 사용되는 경우, 브리지를 통해 전류의 임피던스 또는 흐름을 검출가능하게 변경시키는 방식으로 중합체 사슬 간의 혼성화를 변경할 수 있다. 또는, 이러한 표지가 단일-가닥 중합체 사슬(예를 들어, 단일 폴리펩티드 사슬)을 포함하는 브리지와 함께 사용되는 경우, 해당 사슬을 포함하는 브리지를 통해 전류의 흐름을 검출가능하게 변경시키는 방식으로 해당 사슬의 전기적 특성을 변경할 수 있다. 본 표지에서 사용될 수 있는 알파 나선의 예는 펩티드 코일형 코일(coiled coil) 및 류신 지퍼를 포함한다. 예를 들어, 상이한 길이 및 조성물의 펩티드 세트는 다양한 조합으로 서로 상호작용하여 예를 들어 다양한 안정성의 약 21개 잔기, 약 24개 잔기 또는 약 28개 잔기의 코일형 코일(coiled coil) 이종이량체 영역을 형성하도록 적합하게 설계될 수 있다. 생성된 코일형 코일(coiled coil)은 마이크로몰에서 나노몰 이하 범위의 해리 상수를 가질 수 있으므로, 광범위한 조정가능한 안정성을 나타낸다.

일부 예에서, 도 1a 내지 도 1b, 도 2a, 도 5a 내지 도 5b, 또는 도 7a 내지 도 7c를 참조하여 기술된 하나 이상의 표지는 각각의 펩티드 또는 단백질을 포함할 수 있다. 이러한 펩티드-기반 또는 단백질-기반 표지는, 폴리펩티드 사슬과 함께 사용되는 경우, 해당 사슬을 포함하는 브리지를 통해 전류의 흐름 또는 임피던스를 검출가능하게 변화시키는 방식으로 사슬의 전기적 특성을 변경할 수 있다. 예를 들어, 하나 이상의 표지는, 폴리펩티드 사슬과 함께 류신 지퍼를 형성하는 펩티드의 서열을 포함할 수 있으며, 여기서 지퍼의 하나의 알파 나선 사슬은 폴리펩티드 사슬에 의해 제공되고 지퍼의 다른 절반은 표지에 의해 제공된다. dsDNA 또는 tsDNA(삼중 가닥 DNA)와 상호작용할 것으로 예상될 수 있는 예시적인 펩티드는 알파-나선 펩티드 예컨대 Ac-(LRAL)3-OH(SEQ ID NO: 5), B-회전 펩티드 예컨대 그라미시딘, 역평행 B-시트 펩티드 예컨대 Ac-(KL)7-OH(SEQ ID NO: 6), 및 베타-헤어핀 펩티드 예컨대 Ac-(LR)5LFPV(RL)5-OH(SEQ ID NO: 7)를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 예를 들어, Ac-(LRAL)3-OH(SEQ ID NO: 5) 및 Ac-(LR)5LFPV(RL)5-OH(SEQ ID NO: 7)가 dsDNA 단편과 상호작용할 것으로 예상된다:

5'-GCTAAAAAGAGAGAGAGATCG-3'(SEQ ID NO: 8)

3'-CGATTTTTCTCTCTCTCTAGC-5'(SEQ ID NO: 9)

반면 그라미시딘 및 Ac-(LRAL)3-OH(SEQ ID NO: 5)는 tdDNA와 결합하여 안정화시킬 것으로 예상된다. 이러한 단백질-DNA 상호작용은 예를 들어, DNA의 형상을 변화시킴으로써 DNA-기반 브리지의 전도도를 변경할 것으로 예상될 수 있다.

또 다른 예에서, 도 1a 내지 1b, 도 2a, 도 5a 내지 5b, 또는 도 7a 내지 7c를 참조하여 기술된 하나 이상의 표지는, 폴리펩티드 사슬과 함께 코일형 코일(coiled coil)을 형성하는 펩티드의 서열을 포함할 수 있으며, 여기서 하나의 코일은 폴리펩티드 사슬에 의해 제공되고 다른 코일은 표지에 의해 제공된다. 예를 들어, 코일형 코일(coiled coil)은 2개 이상의 α-나선이 서로를 감아 자가-조립되어 좌선형 수퍼코일을 형성할 때 형성될 수 있다. 이량체, 삼량체, 및 사량체가 용이하게 설계될 수 있으며, 최대 7개의 나선으로 구성된 더 큰 코일형 코일(coiled-coils)이 용이하게 설계될 수 있다. 코일형 코일(coiled coils)은 소수성 잔기의 측쇄가 "매듭(knobs)" 역할을 하고 인접한 나선으로부터의 4개의 잔기에 의해 형성된 "구멍(holes)"으로 패킹되는 "놉-인투-홀(KIH: knobs-into-holes)"로 알려진 특정 패킹 구조를 포함할 수 있다. 일부 코일형 코일(coiled coils)은 반복할 수 있는 헵타드(heptad) 반복 서열 패턴을 또한 함유할 수 있다. 헵타드는 "abcdefg"로 표지될 수 있는 7개의 아미노산을 포함할 수 있으며, 여기서 소수성 잔기는 "a" 및 "d" 위치에 존재하여 "(HPPPPP)n" 형태의 소수성/친수성 패턴을 생성한다. 3개 및 4개의 잔기 만큼 떨어져 소수성 아미노산을 국소화하면 나선의 동일한 면에 존재하는 소수성 아미노산이 생성될 수 있으므로, 이러한 소수성 면의 매몰(burial)이 코일형 코일(coiled-coil) 형성의 원동력이 될 수 있다.

폴리펩티드 사슬과 함께 사용하기 위한 표지로서 사용될 수 있는 요소의 다른 예는 dsDNA 또는 ssDNA(음으로 하전되므로 양으로 하전된 펩티드 와이어에 결합할 수 있음); 또는 항-펩티드 핵산 압타머를 포함한다. 예를 들어, 항-펩티드 핵산 압타머는 약 5개 잔기 내지 약 20개 잔기 범위의 작은 펩티드 표적에 대해 용이하게 선택될 수 있다. 이러한 펩티드는 예를 들어 전기 전도성 브리지로서 제공될 수 있는 반면, 항-펩티드 핵산 압타머는 이러한 브리지의 전기 전도도를 변화시킬 것으로 예상될 수 있는 표지로서 제공될 수 있다. 일부 예에서, 압타머는 펩티드 에피토프를 인식하는 핵산 서열의 무작위 풀로부터 선택될 수 있다. 한 예로서, 하나의 이러한 에피토프는 HIV-1의 Rev 단백질의 잔기 34-50에 상응하는 펩티드를 포함할 수 있다. 선택된 압타머는 예를 들어 19-36 nM의 Kd 값으로 펩티드 에피토프에 안정적이고 특이적으로 결합할 수 있다.

위에서 추가로 언급한 바와 같이, 또 다른 예에서, 본 브리지는 2개 초과의 중합체 사슬을 포함할 수 있으며, 예를 들어 3개, 4개, 5개 또는 5개 초과의 중합체 사슬을 포함할 수 있다. 도 7a 내지 7c는 2개 초과의 중합체 사슬을 포함하는 예시적인 중합체 브리지를 도시한다. 도 7a는 제1 전극과 제2 전극(702, 703) 사이에서 연장되고 제1 중합체 사슬(711), 제2 중합체 사슬(712), 및 제3 중합체 사슬(713)을 포함하는 중합체 브리지(710)를 예시한다. 도 7b는 제1 전극과 제2 전극(702', 703') 사이에서 연장되고 제1 중합체 사슬(711'), 제2 중합체 사슬(712'), 제3 중합체 사슬(713)', 및 제4 중합체 사슬(714')을 포함하는 중합체 브리지(710')를 예시한다. 도 7c는 제1 전극과 제2 전극(702", 703") 사이에서 연장되고 제1 중합체 사슬(711"), 제2 중합체 사슬(712"), 제3 중합체 사슬(713"), 및 제4 중합체 사슬(714")을 포함하는 중합체 브리지(710")를 예시한다. 일부 예에서, 도 7a 내지 7c 각각에 예시된 중합체 사슬 중 1개 이상, 2개 이상, 또는 모두는 폴리펩티드를 포함할 수 있다. 일부 예에서, 중합체 사슬 중 1개 이상, 2개 이상, 또는 모두, 예를 들어, 폴리펩티드 중 1개 이상, 2개 이상, 또는 모두는 나선형일 수 있거나, 베타-가닥을 형성할 수 있다. 예를 들어, 도 5a를 참조하여 전술된 바와 같은 방식으로, 나선형 폴리펩티드는 우수한 전자 매개체로 여겨지며 상대적으로 먼 거리에 걸쳐 전자를 전달할 수 있다. 도 7a 내지 7c에 예시된 각각의 중합체(예를 들어, 폴리펩티드) 사슬은 천연 아미노산과 비-천연 아미노산의 임의의 적합한 조합을 포함할 수 있다.

하나의 구체적이고 비제한적인 예에서, 길이가 8량체 내지 16량체 내지 24량체 범위인 Ala-Aib(알라닌-2-아미노이소부티르산) 서열의 교대 아미노산 서열을 갖는 나선형 펩티드는 본 브리지 하나에서 폴리펩티드 사슬로서 사용될 수 있다. 임의의 이론에 얽매이지 않고, 도약 메커니즘은 이러한 폴리펩티드 사슬에서 장거리 전자 전달을 담당할 수 있다.

또 다른 구체적이고 비제한적인 예에서, 하나 이상의 폴리펩티드 사슬은 서열 GFPRFAGFP(SEQ ID NO: 1)을 포함하며, 이는 연장된 F 방향족기 스태킹을 허용하여 전자가 흐를 수 있는 파이-파이 접합을 제공하는 좌선형 나선형 백본 형태를 갖는 것으로 여겨진다. 일부 예에서, 이러한 사슬과 함께 사용하기 위한 표지는 동일한 서열의 두 번째 동일하거나 거의 동일한 사본, 또는 F가 결여되거나 F를, F와는 다르게 전기적으로 전도하는 Y와 같은 다른 방향족 잔기로 대체하는 유사한 폴리펩티드를 포함할 수 있다.

또 다른 구체적이고 비제한적인 예에서, 하나 이상의 폴리펩티드 사슬은 서열 FKEFAKL FKEFAKL FHKFAKL(SEQ ID NO: 2)을 포함하며, 이는 이러한 서열의 여러 사본을 포함하는 피브릴로 자가-조립되는 것으로 여겨지며, 이러한 피브릴은 유사하게 전기적으로 전도성이다. 이러한 서열의 하나 이상의 예가 브리지(710, 710', 710")에서 제공될 수 있으며, 이러한 서열의 또 다른 예가 이러한 브리지와 함께 사용하기 위한 제1 표지에서 제공될 수 있으며 브리지의 전기 전도도를 변경하는 방식으로, 예를 들어 브리지의 전기 전도도를 증가시킴으로써 브리지에서 서열과 함께 자가-조립되는 것으로 예상될 수 있다. 이러한 브리지와 함께 사용하기 위한 제2 표지는 서열 LKELAKL LKELAKL LHELAKL(SEQ ID NO: 3)을 포함할 수 있으며, 이는 이러한 서열의 다수의 사본을 포함하는 피브릴로 자가-조립되는 것으로 여겨지며, 이러한 피브릴은 전기적으로 비전도성이다. 제2 표지의 이러한 서열은 브리지의 전기 전도도를 변경하는 방식으로, 예를 들어, 제1 표지 서열 FKEFAKL FKEFAKL FHKFAKL(SEQ ID NO: 2)을 사용하여 제공되는 것보다 더 적은 브리지의 전기 전도도를 제공함으로써 브리지의 서열 FKEFAKL FKEFAKL FHKFAKL(SEQ ID NO: 2) 중 하나 이상과 함께 자가-조립되는 것으로 예상될 수 있다.

또 다른 구체적이고 비제한적인 예에서, 하나 이상의 폴리펩티드 사슬은 서열 ELKAIAQEFKAIAKEFKAIAFEFKAIAQK(SEQ ID NO: 10)을 포함하며, 이는 전기적으로 전도성인 육량체 코일로 자가-조립되는 것으로 여겨지며 여기서 방향족 측쇄의 간격 및 배열은 전자 전달을 위한 메커니즘으로서 파이-스태킹을 배제하는 것으로 여겨진다.

도 1a 내지 도 1b 또는 도 2a 내지 도 2c 각각을 참조하여 기술된 바와 같은 표지는 브리지(710, 710', 또는 710")의 전기적 특성을 변경할 수 있다. 예를 들어, 도 7a에 예시된 표지(731)는 하나의 폴리펩티드 사슬과 함께 이량체를 형성함으로써, 2개의 폴리펩티드 사슬과 함께 삼량체를 형성함으로써, 또는 3개 모두의 폴리펩티드 사슬과 함께 사량체를 형성함으로써 브리지(710)의 폴리펩티드 사슬 중 적어도 하나에 변경된 전기 전도도를 부여할 수 있다. 또는, 예를 들어, 도 7b에 예시된 표지(731')는 하나의 폴리펩티드 사슬과 함께 이량체를 형성함으로써, 2개의 폴리펩티드 사슬과 함께 삼량체를 형성함으로써, 3개의 폴리펩티드 사슬과 함께 사량체를 형성함으로써, 또는 4개 모두의 폴리펩티드 사슬과 함께 오량체를 형성함으로써 브리지(710')의 폴리펩티드 사슬 중 적어도 하나에 변경된 전기 전도도를 부여할 수 있다. 또는, 예를 들어, 도 7c에 예시된 표지(731")는 하나의 폴리펩티드 사슬과 함께 이량체를 형성함으로써, 2개의 폴리펩티드 사슬과 함께 삼량체를 형성함으로써, 3개의 폴리펩티드 사슬과 함께 사량체를 형성함으로써, 4개 모두의 폴리펩티드 사슬과 함께 오량체를 형서함으로써, 또는 5개 모두의 폴리펩티드 사슬과 함께 육량체를 형성함으로써 브리지(710")의 폴리펩티드 사슬의 적어도 하나에 변경된 전기 전도도를 부여할 수 있다.

표지(731, 731', 731")는 각각 브리지(710, 710', 710")의 전기적 특성을 검출가능하게 변경하는 임의의 적합한 요소를 포함할 수 있다. 일부 예에서, 표지(731, 731', 731")는 펩티드 인터칼레이터이다. 표지에서 사용될 수 있는 펩티드 인터칼레이터의 한 예는 코일이며, 이는 예를 들어 그 자체가 코일형 코일(coiled coil)을 형성하는 2개 이상의 폴리펩티드 사슬을 포함하는 폴리펩티드 기반 브리지와 함께 사용될 수 있다. 표지의 코일은 폴리펩티드 브리지의 코일형 코일(coiled coil)과 다발(예를 들어, 삼중체)을 형성할 수 있으므로, 브리지의 전기적 특성을 검출가능하게 변경할 수 있다.

도 1a 내지 도 1b, 도 2a 내지 도 2c, 도 3, 및 도 7a 내지 도 7c를 참조하여 기술된 바와 같은 조성물은 서열분석을 위한 임의의 적합한 방법에서 사용될 수 있다. 도 4는 이중-가닥 중합체 브리지 및 브리지의 적어도 하나의 중합체 가닥의 전기적 특성을 변경하는 뉴클레오티드 표지를 사용하여 서열분석하기 위한 방법(400)에서의 작업 흐름의 예를 도시한다. 방법(400)은 폴리머라제를 사용하여, 적어도 제2 폴리뉴클레오티드의 서열을 사용하여 제1 폴리뉴클레오티드에 뉴클레오티드를 부가하는 단계(작업 410)를 포함한다. 예를 들어, 도 1a 내지 도 1b를 참조하여 기술된 폴리머라제(105)는 적어도 제2 폴리뉴클레오티드(150)의 서열을 사용하여 뉴클레오티드(121, 122, 123, 및 124) 각각을 제1 폴리뉴클레오티드(140)에 부가할 수 있다. 또는, 예를 들어, 도 3을 참조하여 기술된 폴리머라제(305)는 적어도 제2 폴리뉴클레오티드(350)의 서열을 사용하여 뉴클레오티드(321) 및 다른 뉴클레오티드를 제1 폴리뉴클레오티드(340)에 부가할 수 있다(다른 뉴클레오티드는 구체적으로 도시되지 않음). 도 7a 내지 도 7c에 예시된 조성물은 적어도 제2 폴리뉴클레오티드의 서열을 사용하여 뉴클레오티드를 제1 폴리뉴클레오티드에 유사하게 부가할 수 있는 폴리머라제(구체적이지 않음)를 포함할 수 있다.

도 4에 예시된 방법(400)은 뉴클레오티드에 각각 결합된 표지를 사용하여, 제1 전극과 제2 전극 사이의 공간에 걸쳐있는 브리지의 제1 및 제2 중합체 사슬 중 적어도 하나의 전기적 특성을 변경하는 단계(작업 420)를 포함할 수 있다. 예를 들어, 도 1a 내지 도 1b를 참조하여 기술된 표지(131, 132, 133, 134), 도 2a를 참조하여 기술된 표지(231, 232, 233, 234), 도 2b를 참조하여 기술된 표지(231', 232', 233', 234'), 도 2c를 참조하여 기술된 표지(231", 232", 233", 234") 각각 중 임의의 것은 뉴클레오티드(121, 122, 123, 및 124)와 결합할 수 있다. 폴리머라제(105)가 제1 폴리뉴클레오티드(140)에 이들 뉴클레오티드를 각각 부가함에 따라, 이들 뉴클레오티드에 각각 결합된 표지는 제1 전극(102)과 제1 전극(102) 사이의 공간에 걸쳐 있는 브리지(110) 내의 제1 중합체 사슬(111) 및 제2 중합체 사슬(112) 중 적어도 하나의 전기적 특성을 변경할 수 있다. 또는, 예를 들어, 도 3을 참조하여 기술된 표지(331)는 뉴클레오티드(321)에 결합될 수 있고, 표지(332, 333)와 같은 다른 표지는 다른 뉴클레오티드에 결합될 수 있다(다른 뉴클레오티드는 구체적으로 표시되지 않음). 폴리머라제(305)가 제1 폴리뉴클레오티드(340)에 이들 뉴클레오티드를 각각 부가함에 따라, 이들 뉴클레오티드 각각에 결합된 표지는 제1 전극(302)과 제2 전극(303) 사이의 공간에 걸쳐있는 브리지(310)의 제1 폴리뉴클레오티드 사슬(311)과 제2 폴리뉴클레오티드 사슬(312) 사이의 혼성화를 변경하도록 브리지(310)를 혼성화할 수 있다. 도 7a 내지 7c에 예시된 조성물의 경우, 뉴클레오티드에 결합된 표지는 유사하게 이러한 조성물의 하나 이상의 중합체 사슬의 전기적 특성을 변경할 수 있다.

도 4를 다시 참조하면, 방법(400)은 이들 뉴클레오티드에 상응하는 표지를 사용하여 각각의 전기적 특성의 변경에 반응하는 브리지를 통해, 적어도 전기적 신호, 예를 들어, 전류 또는 전압에서 변화를 사용하여 폴리머라제가 뉴클레오티드를 제1 폴리뉴클레오티드에 부가하는 서열을 검출하는 단계(작업 440)를 포함할 수 있다. 예를 들어, 도 1a 내지 도 1b를 참조하여 기술된 검출 회로(160)는 표지(131, 132, 133, 및 134)를 사용하여, 또는 도 2a를 참조하여 기술된 표지(231, 232, 233, 234)를 사용하여, 또는 도 2b를 참조하여 기술된 표지(231', 232', 233', 234')를 사용하여, 또는 도 2c를 참조하여 기술된 표지(231", 232", 233", 234")를 사용하여, 각각의 변경에 반응하는 브리지(110)를 통해 전기적 신호의 변화를 검출할 수 있다. 유사한 검출 회로(구체적으로 도시되지 않음)는 표지(331, 332, 333)(및 다른 유사한 표지)와 브리지(310) 사이의 각각의 혼성화에 반응하는, 도 3에 예시된 브리지(310)를 통해 전기적 신호의 변화를 검출할 수 있다. 유사한 검출 회로(구체적으로 도시되지 않음)는 표지(731, 731', 731")(및 다른 유사한 표지)와 각각의 브리지 사이의 각각의 혼성화에 반응하는, 도 7a 내지 도 7c에 예시된 브리지(710, 710', 710")를 통해 전기적 신호의 변화를 검출할 수 있다.

추가로, 도 5a 내지 도 5b를 참조하여 기술된 바와 같은 조성물은 서열분석을 위한 임의의 적합한 방법에서 사용될 수 있다. 도 6은 단일-가닥 중합체 브리지 및 브리지의 중합체 가닥의 전기적 특성을 변경하는 뉴클레오티드 표지를 사용하여 서열분석하기 위한 방법(600)의 작업 흐름의 예를 도시한다. 방법(600)은, 폴리머라제를 사용하여, 적어도 제2 폴리뉴클레오티드의 서열을 사용하여 뉴클레오티드를 제1 폴리뉴클레오티드에 부가하는 단계(작업 610)를 포함한다. 예를 들어, 도 5a 내지 5b를 참조하여 기술된 폴리머라제(505)는 적어도 제2 폴리뉴클레오티드(550)의 서열을 사용하여 뉴클레오티드(521, 522, 523, 및 526) 각각을 제1 폴리뉴클레오티드(560)에 부가할 수 있다.

도 6에 도시된 방법(600)은 뉴클레오티드에 각각 결합된 표지를 사용하여, 제1 전극과 제2 전극 사이의 공간에 걸쳐있는 브리지의 중합체 사슬의 전기적 특성을 변경하는 단계(작업 620)를 포함할 수 있다. 예를 들어, 도 5a 내지 5b를 참조하여 기술된 임의의 표지(531, 532, 533, 534)는 각각 뉴클레오티드(521, 522, 523 및 524)에 결합될 수 있다. 폴리머라제(505)가 이들 뉴클레오티드를 제1 폴리뉴클레오티드(540)에 각각 부가함에 따라, 이들 뉴클레오티드에 각각 결합된 표지는 제1 전극(502)과 제2 전극(503) 사이의 공간에 걸쳐 있는 브리지(510) 내의 중합체 사슬(511)의 전기적 특성을 변경할 수 있다.

도 6을 다시 참조하면, 방법(600)은 이들 뉴클레오티드에 상응하는 표지를 사용하여 각각의 전기적 특성의 변경에 반응하는 브리지를 통해, 적어도 전기적 신호, 예를 들어, 전류 또는 전압을 사용하여 폴리머라제가 뉴클레오티드를 제1 폴리뉴클레오티드에 부가하는 서열을 검출하는 단계(작업 640)를 포함할 수 있다. 예를 들어, 도 5a 내지 5b를 참조하여 설명된 검출 회로(560)는 표지(531, 532, 533, 및 534)를 사용하여 각각의 변경에 대해 반응하는 브리지(510)를 통해 전기적 신호의 변화를 검출할 수 있다.

본원에 제공된 임의의 조성물 및 방법에 대해 임의의 적합한 변형이 이루어질 수 있다. 일부 예에서, 조성물(100, 300, 또는 500)은 그 안의 임의의 적합한 중합체(예를 들어, 제1 및 제2 중합체 사슬의 폴리뉴클레오티드 또는 표지의 올리고뉴클레오티드, 또는 둘 모두)가 비-천연 발생 폴리뉴클레오티드, 예를 들어 비-천연 발생 DNA, 예를 들어, 거울상 이성질체 DNA를 포함하도록 변형될 수 있다. 이러한 비-천연 발생 폴리뉴클레오티드는 조성물에서 임의의 천연 발생 폴리뉴클레오티드와 혼성화하지 않을 수 있으며, 예를 들어 제1 및 제2 폴리뉴클레오티드는 폴리머라제를 사용하여 작용함으로써, 그렇지 않으면 이러한 혼성화에서 발생할 수 있는 임의의 간섭을 최소화하고, 일부 경우에는 심지어는 억제한다.

위에서 다양한 예시적인 예가 기술되었지만, 본 발명을 벗어나지 않고 다양한 변경 및 수정이 이루어질 수 있음이 당업자에게 명백할 것이다. 첨부된 청구범위는 본 발명의 진정한 사상 및 범주 내에 속하는 이러한 모든 변경 및 수정을 포함하도록 의도된다.

본원에서 기술된 본 개시내용의 각 양태의 임의의 각각의 특징/예는 임의의 적절한 조합으로 함께 구현될 수 있고, 이러한 양태 중 임의의 하나 이상으로부터의 임의의 특징/예는 본원에 기술된 이점을 달성하기 위해 임의의 적절한 조합으로 본원에 기술된 다른 양태의 임의의 특징과 함께 구현될 수 있음을 이해해야 한다.

SEQUENCE LISTING <110> ILLUMINA, INC. <120> COMPOSITIONS AND METHODS FOR SEQUENCING USING AT LEAST ELECTRICAL CHARACTERISTICS <130> IP-1969-PCT <140> <141> <150> 63/046,618 <151> 2020-06-30 <160> 11 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 1 Gly Phe Pro Arg Phe Ala Gly Phe Pro 1 5 <210> 2 <211> 21 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 2 Phe Lys Glu Phe Ala Lys Leu Phe Lys Glu Phe Ala Lys Leu Phe His 1 5 10 15 Lys Phe Ala Lys Leu 20 <210> 3 <211> 21 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 3 Leu Lys Glu Leu Ala Lys Leu Leu Lys Glu Leu Ala Lys Leu Leu His 1 5 10 15 Glu Leu Ala Lys Leu 20 <210> 4 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 4 Lys Gly Lys Gly Lys Gly Lys 1 5 <210> 5 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 5 Leu Arg Ala Leu Leu Arg Ala Leu Leu Arg Ala Leu 1 5 10 <210> 6 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 6 Lys Leu Lys Leu Lys Leu Lys Leu Lys Leu Lys Leu Lys Leu 1 5 10 <210> 7 <211> 24 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 7 Leu Arg Leu Arg Leu Arg Leu Arg Leu Arg Leu Phe Pro Val Arg Leu 1 5 10 15 Arg Leu Arg Leu Arg Leu Arg Leu 20 <210> 8 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 8 gctaaaaaga gagagagatc g 21 <210> 9 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 9 cgatctctct ctctttttag c 21 <210> 10 <211> 29 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 10 Glu Leu Lys Ala Ile Ala Gln Glu Phe Lys Ala Ile Ala Lys Glu Phe 1 5 10 15 Lys Ala Ile Ala Phe Glu Phe Lys Ala Ile Ala Gln Lys 20 25 <210> 11 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 11 gggaaaggaa acttaaaaaa aaggg 25

Claims

조성물로서,
공간에 의해 서로 분리된 제1 전극 및 제2 전극;
상기 제1 전극 및 상기 제2 전극 사이의 상기 공간에 걸쳐 있는 브리지로서,
서로 혼성화된 제1 및 제2 중합체 사슬을 포함하는 상기 브리지;
제1 및 제2 폴리뉴클레오티드;
각각의 뉴클레오티드가 상응하는 표지와 결합된, 복수의 뉴클레오티드;
적어도 상기 제2 폴리뉴클레오티드의 서열을 사용하여 상기 복수의 뉴클레오티드의 뉴클레오티드를 상기 제1 폴리뉴클레오티드에 부가하는 폴리머라제,
상기 제1 및 제2 중합체 사슬 중 적어도 하나의 전기적 특성을 변경하는 이러한 뉴클레오티드 각각에 상응하는 상기 표지; 및
상기 브리지를 통해 적어도 전기적 신호의 변화를 사용하여 상기 폴리머라제가 상기 뉴클레오티드를 상기 제1 폴리뉴클레오티드에 부가하는 서열을 검출하기 위한 검출 회로로서, 상기 변화는 이러한 뉴클레오티드에 상응하는 상기 표지를 사용하여 상기 전기적 특성의 변화에 반응하는 것인 검출 회로를 포함하는, 조성물.
제1항에 있어서, 상기 제1 및 제2 중합체 사슬 각각이 서로 혼성화된 제1 및 제2 폴리뉴클레오티드를 포함하는, 조성물.
제2항에 있어서, 상기 표지가 상기 제1 및 제2 폴리뉴클레오티드 사이의 상기 혼성화를 변경하는 각각의 올리고뉴클레오티드를 포함하는, 조성물.
제3항에 있어서, 상기 올리고뉴클레오티드가 서로 상이한 위치에서 상기 혼성화를 변경하는, 조성물.
제3항 또는 제4항에 있어서, 상기 올리고뉴클레오티드가 상이한 길이의 영역에서 상기 혼성화를 변경하는, 조성물.
제2항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 및 제2 중합체 사슬의 폴리뉴클레오티드 및 상기 표지의 올리고뉴클레오티드가 비-천연 발생 DNA를 포함하는, 조성물.
제6항에 있어서, 상기 비-천연 발생 DNA가 거울상 이성질체 DNA를 포함하는, 조성물.
제3항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 올리고뉴클레오티드가 변형된 뉴클레오티드를 포함하는, 조성물.
제8항에 있어서, 상기 변형된 뉴클레오티드는 변형된 백본, 변형된 당, 또는 변형된 염기를 갖는, 조성물.
제3항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 올리고뉴클레오티드가 PNA 및 LNA로 이루어진 군으로부터 선택되는 핵산 유사체를 포함하는, 조성물.
제2항에 있어서, 상기 제1 폴리뉴클레오티드 및 제2 폴리뉴클레오티드는 DNA를 포함하고, 상기 표지가 상기 DNA와 상호작용하는 단백질을 포함하는, 조성물.
제1항에 있어서, 상기 표지가 DNA 인터칼레이터를 포함하는, 조성물.
제1항에 있어서, 상기 표지가 작은 홈 결합제(minor groove binder)를 포함하는, 조성물.
제1항에 있어서, 상기 표지가 펩티드 인터칼레이터를 포함하는, 조성물.
제1항에 있어서, 상기 표지가 서로 얽힌(intertwining) 알파 나선을 포함하는, 조성물.
제1항에 있어서, 상기 제1 및 제2 중합체 사슬 각각이 서로 혼성화된 제1 및 제2 폴리펩티드를 포함하는, 조성물.
제16항에 있어서, 상기 각각의 표지가 상기 제1 및 제2 폴리펩티드 중 적어도 하나의 전기적 특성을 변경하는 단백질, 펩티드, 또는 인터칼레이터를 포함하는, 조성물.
방법으로서,
폴리머라제를 사용하여, 적어도 제2 폴리뉴클레오티드의 서열을 사용하여 뉴클레오티드를 제1 폴리뉴클레오티드에 부가하는 단계;
뉴클레오티드에 각각 결합된 표지를 사용하여, 제1 전극과 제2 전극 사이의 공간에 걸쳐 있는 브리지의 제1 중합체 사슬 및 제2 중합체 사슬 중 적어도 하나의 전기적 특성을 변경하는 단계; 및
이들 뉴클레오티드에 상응하는 상기 표지를 사용하여 상기 전기적 특성의 각각의 변경에 반응하는 상기 브리지를 통해 적어도 전기적 신호의 변화를 사용하여 폴리머라제가 뉴클레오티드를 상기 제1 폴리뉴클레오티드에 부가하는 서열을 검출하는 단계를 포함하는, 방법.
제18항에 있어서, 상기 제1 및 제2 중합체 사슬 각각이 서로 혼성화된 제1 및 제2 폴리뉴클레오티드를 포함하는, 방법.
제19항에 있어서, 상기 표지가 상기 제1 폴리뉴클레오티드와 상기 제2 폴리뉴클레오티드 사이의 상기 혼성화를 변경하는 각각의 올리고뉴클레오티드를 포함하는, 방법.
제20항에 있어서, 상기 표지가 서로 상이한 위치에서 상기 혼성화를 변경하는, 방법.
제20항 또는 제21항에 있어서, 상기 표지가 상이한 길이의 영역에서 상기 혼성화를 변경하는, 방법.
제20항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 및 제2 중합체 사슬의 폴리뉴클레오티드 및 상기 표지의 올리고뉴클레오티드가 비-천연 발생 DNA를 포함하는, 방법.
제23항에 있어서, 상기 비-천연 발생 DNA가 거울상 이성질체 DNA를 포함하는, 방법.
제20항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 올리고뉴클레오티드가 변형된 뉴클레오티드를 포함하는, 방법.
제25항에 있어서, 상기 변형된 뉴클레오티드가 변형된 백본, 변형된 당, 또는 변형된 염기를 갖는, 방법.
제20항에 있어서, 상기 올리고뉴클레오티드가 PNA 및 LNA로 이루어진 군으로부터 선택되는 핵산 유사체를 포함하는, 방법.
제19항에 있어서, 상기 제1 및 제2 폴리뉴클레오티드가 DNA를 포함하고, 상기 표지가 상기 DNA와 상호작용하는 단백질을 포함하는, 방법.
제18항에 있어서, 상기 표지가 DNA 인터칼레이터를 포함하는, 방법.
제18항에 있어서, 상기 표지가 작은 홈 결합제(minor groove binder)를 포함하는, 방법.
제18항에 있어서, 상기 표지가 펩티드 인터칼레이터를 포함하는, 방법.
제18항에 있어서, 상기 표지가 서로 얽힌(intertwining) 알파 나선을 포함하는, 방법.
제18항에 있어서, 상기 제1 및 제2 중합체 사슬 각각이 서로 혼성화된 제1 및 제2 폴리펩티드 사슬을 포함하는, 방법.
제33항에 있어서, 상기 각각의 표지가 상기 제1 및 제2 폴리펩티드 중 적어도 하나의 전기적 특성을 변경하는 단백질, 펩티드, 또는 인터칼레이터를 포함하는, 방법.
조성물로서,
공간에 의해 서로 분리된 제1 전극 및 제2 전극;
상기 제1 전극과 제2 전극 사이의 상기 공간에 걸쳐 있는 브리지로서, 중합체 사슬을 포함하는 상기 브리지;
제1 및 제2 폴리뉴클레오티드;
각각의 뉴클레오티드가 상응하는 표지와 결합된, 복수의 뉴클레오티드;
적어도 상기 제2 폴리뉴클레오티드의 서열을 사용하여 상기 복수의 뉴클레오티드의 뉴클레오티드를 상기 제1 폴리뉴클레오티드에 부가하는 폴리머라제,
상기 중합체 사슬의 전기적 특성을 변경하는 이러한 뉴클레오티드 각각에 상응하는 상기 표지; 및
상기 브리지를 통해 적어도 전기적 신호의 변화를 사용하여 상기 폴리머라제가 상기 뉴클레오티드를 상기 제1 폴리뉴클레오티드에 부가하는 서열을 검출하기 위한 검출 회로로서, 상기 변화는 이러한 뉴클레오티드에 상응하는 상기 표지를 사용하여 상기 전기적 특성의 변화에 반응하는 것인 검출 회로를 포함하는, 조성물.
제35항에 있어서, 상기 중합체 사슬이 폴리펩티드 사슬을 포함하는, 조성물.
제35항 또는 제36항에 있어서, 상기 표지가 펩티드 인터칼레이터를 포함하는, 조성물.
제35항 또는 제36항에 있어서, 상기 표지가 서로 얽힌(intertwining) 알파 나선을 포함하는, 조성물.
방법으로서,
폴리머라제를 사용하여, 적어도 제2 폴리뉴클레오티드의 서열을 사용하여 뉴클레오티드를 제1 폴리뉴클레오티드에 부가하는 단계;
뉴클레오티드에 각각 결합된 표지를 사용하여, 제1 전극과 제2 전극 사이의 공간에 걸쳐 있는 브리지의 중합체 사슬의 전기적 특성을 변경하는 단계; 및
이들 뉴클레오티드에 상응하는 상기 표지를 사용하여 상기 전기적 특성의 각각의 변경에 반응하는 상기 브리지를 통해 적어도 전기적 신호의 변화를 사용하여 폴리머라제가 뉴클레오티드를 상기 제1 폴리뉴클레오티드에 부가하는 서열을 검출하는 단계를 포함하는, 방법.
제39항에 있어서, 상기 중합체 사슬이 폴리펩티드 사슬을 포함하는, 방법.
제39항 또는 제40항에 있어서, 상기 표지가 펩티드 인터칼레이터를 포함하는, 방법.
제39항 또는 제40항에 있어서, 상기 표지가 서로 얽힌(intertwining) 알파 나선을 포함하는, 방법.