JP2005519630A - 異なるレドックス電位を有する標識を用いた核酸反応 - Google Patents

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Abstract

本発明は、核酸を電気的に検出するために、とりわけＤＮＡの塩基配列を電気化学的に検出するために、異なるレドックス電位を有する電子移動モイエティを使用する方法および組成物に関する。

Description

本出願は、２００１年４月３日付出願の６０／２８１，２７６号および２０００年７月２６日付出願の継続出願である。
本発明は、核酸を電気的に検出するために、とりわけＤＮＡの塩基配列を電気化学的に検出するために、異なるレドックス電位を有する電子移動モイエティ（ＥＴＭ：Electron Transfer Moieity）を使用する方法および組成物に関する。
ＤＮＡの塩基配列を決定する手法（ＤＮＡシーケンス）は、今日の生物学において極めて重要な技術であり、ヒトゲノムを含むゲノムの塩基配列が急速に確定されつつある中、意義深い目標であり、かつ非常に困難なものである。従来のＤＮＡ塩基配列決定手法のほとんどは、鎖伸長停止断片の集団を分解するために、ポリアクリルアミドゲル分別法に基づいている(Sanger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74:5463 (1977); Maxam & Gilbert)。ＤＮＡ塩基配列の各位置において伸長停止した断片の集団を、数多くの手法を用いて生成することができる。通常、ＤＮＡポリメラーゼ法を用いて、鎖の伸長を停止させるものとして機能するジデオキシヌクレオチドを取り込む。
迅速かつ容易にＤＮＡの塩基配列を決定するために、いくつかの択一的な手法が開発されてきた。例えば、ハイブリダイゼーションを用いて、塩基配列を決定する手法が開示されている（DrmanacらのGenomics 4:114 (1989)、 KosterらのNature Biotechnology 14:1123 (1996)、米国特許第5,525,464号、 米国特許第5,202,231号、および米国特許第5,695,940号)。同様に、合成物を用いた塩基配列決定方法は、ゲルを用いた塩基配列決定方法の択一例である。これらの方法によれば、次の塩基を重合化（ポリマライゼーション）する前に、ただ１種類の（あるいは多くとも２、３種類であって、通常同種の）塩基を加えて読み取る。これは、「ゲル分解された」塩基配列決定法とは対照的に、「時間分解された」塩基配列決定法と呼ぶことができる。合成物を用いた塩基配列決定方法は、米国特許第4,971,903号およびHymanのAnal. Biochem. 174:423 (1988)、RosenthalのInternational Patent Application Publication 761107 (1989)、MetzkerらのNucl. Acids Res. 22:4259 (1994)、JonesのBiotechniques 22:938 (1997)、RonaghiらのAnal. Biochem. 242:84 (1996)、NyrenらのAnal. Biochem. 151:504 (1985)に開示されている。ＡＴＰスルフリラーゼの挙動を検出することが、Karamohamed およびNyrenのAnal. Biochem. 271:81 (1999)に開示されている。反転可能な鎖伸長停止ヌクレオチドを用いた塩基配列決定法については、米国特許第5,902,723号および米国特許第5,547,839号、CanardおよびArzumanovのGene 11:1 (1994)、並びにDyatkinaおよびArzumanovのNucleic Acids Symp Ser 18:117 (1987)に開示されている。ＤＮＡリガーゼを用いた反転可能な鎖伸長停止については、米国特許第5,403,708号に開示されている。時間分解による塩基配列決定法は、JohnsonらのAnal. Biochem. 136:192 (1984)に開示されている。単分子による解析手法は、米国特許第5,795,782号およびElgenおよびRiglerのProc. Natl Acad Sci USA 91(13):5740 (1994)に開示されている。質量分光計技術を用いた塩基配列決定法は、KosterらのNature Biotechnology 14:1123 (1996)、KrahmerらのAnal. Chem., 72:4033 (2000)に開示されている。これらのすべては、参考としてここに一体のものとして統合される。
塩基配列決定を促進するための手法として、キャピラリ電気泳動法がある。キャピラリ電気泳動法（ＣＥ：Capillary Electrophoresis）は、試料を少量しか必要とせず、高効率で、かつ迅速に分離できるため、これまでの粘着性ゲル電気泳動法と比較して、ＤＮＡ塩基配列を決定し、断片の大きさを特定する上で、有用なツールとなる（Swerdlow, H. およびGesteland, R., (1990) Nucl. Acid. Res. 18, 1415-1419）（Kheterpal, I., Scherer, J.R., Clark, S.M., Radhakrishnan, A., Ju. J., Ginther, C.L., Sensabaugh, G.F. and Mathies, R.A., (1996) Electrophoresis 17, 1852-1859）。より最近になって、微細加工されたキャピラリ電気泳動法（ＣＥ）デバイスおよびキャピラリアレイ電気泳動（ＣＡＥ）マイクロプレートを用いると、ＤＮＡサイズの分離と試料の塩基配列決定を迅速に並行して実施できることが立証された（Woolley, A.T.およびMathies, R.A., (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 91, 11348-11352）（Woolley, A.T.およびMathies, R.A., Anal. Chem. 67, 3676-3680, 1995）（Woolley, A.T., Sensabaugh, G.F.,およびMathies, R.A., (1997) Anal. Chem. 69, 2256-2261）（Simpson, P.C., Roach, D., Woolley, A.T., Thorsen, T., Johnston, R., Sensabaugh, G.F.およびMathies, R.A., (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 95, 2256-2261)。
一連のＤＮＡ塩基配列を決定するために、蛍光性電気泳動検出システムをキャピラリ電気泳動法と組み合わせて用いることができる。GozelらのAnal. Chem., 59: 44 (1987)、WuらのJ. Chromatogr., 480: 141 (1989)、SmithらのNature, 321: 674 (1986)、SmithらのMethods Enzymol., 155: 260 (1987)、ParkらのAnal., Chem., 67: 911 (1995)、OsbournらのAnal. Chem., 73: 5961 (2001)、WoodsらのAnal. Chem., 73: 3687 (2001)、EwingらのAnal., Chem., 66: 52 (1994)、BrazillらのAnal Chem., 73: 4882 (2201)、および米国特許第5,244,560号を参照されたい。これらのすべては、参考にここに一体のものとして統合される。
Brazillらは、固有の正弦波周波数により電流電圧反応が生じるフェロセン誘導体を用いて、電気化学的にＤＮＡ塩基配列を決定する方法を教示している（BrazillらのAnal. Chem., 73: 4882 (2001）。しかし、フェロセン標識間のレドックス電位の差異が小さいため、このアプローチによる収量および感度を増大させるために必要な解像度を得ることが困難である。すなわち、収量および感度が向上した電気化学的な塩基配列決定システムに対する必要性が依然としてある。
したがって、本発明の目的は、核酸の塩基配列を電気化学的に決定する方法を提供することにある。
（発明の要約）
上述の目的に鑑みて、本発明は、固有のレドックス電位を有するＥＴＭを含む核酸からなる組成物を提供する。すなわち本発明は、第１のレドックス電位を有する第１のＥＴＭを含む第１の核酸と、第２のレドックス電位を有する第２のＥＴＭを含む第２の核酸と、第３のレドックス電位を有する第３のＥＴＭを含む第３の核酸と、第４のレドックス電位を有する第４のＥＴＭを含む第４の核酸と、を有する組成物を提供する。第１、第２、第３、および第４のレドックス電位は異なる。核酸の塩基配列は、同じあってもよいし、異なっていてもよいが、好適な実施形態においては、少なくとも１つの塩基は異なる。この組成物は、固有のレドックス電位を有する追加的な核酸をさらに含む。好適には、ＥＴＭは、固有の重複しないレドックス電位を有するように、化学的置換基により調製できる遷移金属錯体である。
本発明の別の態様によれば、標的塩基配列に相補的な複数のシーケンスプローブを提供するステップを有する塩基配列決定方法が提供される。このとき、各シーケンスプローブは、異なる長さを有し、異なるレドックス電位を有するＥＴＭを含む異なる鎖伸長停止核酸類似体を有する。シーケンスプローブの集団は、塩基の大きさ、および標的核酸の塩基配列を特定するために用いられるＥＴＭの検出に基づいて分離される。
さらに別の態様によれば、この方法は、標的塩基配列中の特定の検出位置におけるヌクレオチドを同定する方法に関する。標的塩基配列は、検出位置に隣接した第１標的５’末端を有する。この方法は、標的塩基配列を含むアッセイ複合体と、電極に共有結合した捕獲プローブと、標的塩基配列の第１標的末端に対してハイブリダイズされた伸長プライマと、を提供するステップを有する。ポリメラーゼ酵素、および固有のレドックス電位をそれぞれ有する共有結合ＥＴＭを含む複数のｄＮＴＰが環境内に提供され、このとき１つのｄＮＴＰ塩基が検出位置において塩基対を形成すると、伸長プライマが酵素により伸長して、ＥＴＭを有するｄＮＴＰが取り込まれる。こうして、検出位置における塩基の特定するように検出することができる。
追加的な態様によれば、異なるレドックス電位を有する共有結合ＥＴＭを含む複数の核酸を形成する方法は、第１のレドックス電位を有する第１の遷移金属錯体および第１の官能基を提供するステップと、第２の官能基で置換された第１のオリゴヌクレオチドを提供するステップと、第１のレドックス電位を有する第１の遷移金属錯体−オリゴヌクレオチド複合体を形成するために、第１の遷移金属錯体を第１のオリゴヌクレオチドに混合させるステップと、第２のレドックス電位を有する第２の遷移金属錯体および第１の官能基を提供するステップと、第２の官能基で置換された第２のオリゴヌクレオチドを提供するステップと、第２のレドックス電位を有する第２の遷移金属錯体−オリゴヌクレオチド複合体を形成するために、第２の遷移金属錯体を第２のオリゴヌクレオチドに混合させるステップと、有する。
図１は、誘導電流および静電容量を示す。 図２は、誘導電流信号の４次高調波の概略図を示す。 図３は、背景信号の概略図を示す。 図４は、ガウス分布の３次導関数を示す。 図５は、２ピーク反復法の９５％確度のＩｐ推定値に対する不確定性を示す。 図６は、合成ファイルを作成するために用いられる平均および標準偏差を示す。 図７は、１Ｐおよび４Ｐだけが存在するときに０％ノイズを有すると検出されるピークを示す。 図８は、１Ｐおよび４Ｐだけが存在するときに１０％ノイズを有すると検出されるピークを示す。 図９は、１Ｐおよび３Ｐだけが存在するときに検出されるピークを示す。 図１０は、１Ｐおよび３Ｐだけが存在するときに１０％ノイズを有すると検出されるピークを示す。 図１１は、ノイズレベルが０．１であるときのさまざまなＩｐに対する４つの可能性のあるシミュレーションを示す。 図１２は、実験ＷＳ１４５において検出されたＩｐを示す。 図１３は、コード内で用いられる初期推定値と制約パラメータを示す。 図１４は、アルコキシル基を有するアルコキシル・フェロセン誘導体の合成物を示す。 図１５は、ジアルコキシル基を有する合成物を示す。 図１６Ａは、モノハロゲン化フェロセン誘導体を示す。 図１６Ｂは、モノハロゲン化フェロセン誘導体を示す。 図１６Ｃは、モノハロゲン化フェロセン誘導体を示す。 図１７Ａは、非核酸フェロセンフォスフォアミダイトを示す。 図１７Ｂは、非核酸フェロセンフォスフォアミダイトを示す。 図１８Ａは、レドックス電位の強いフェロセンを示す。 図１８Ｂは、レドックス電位の強いフェロセンを示す。 図１８Ｃは、レドックス電位の強いフェロセンを示す。 図１８Ｄは、レドックス電位の強いフェロセンを示す。 図１８Ｅは、レドックス電位の強いフェロセンを示す。 図１９は、核酸を合成した後のフェロセン誘導体を示す。 図２０は、電気化学的な塩基配列決定法のための一般的な構造体を示す。 図２１は、電気化学的に反応するヌクレオチドの例示的な逆合成解析法を示す。 図２２は、これまでに提案された第１世代の合成ＤＮＡプライマの５’標識に適した蛍光アミダイトを示す。 図２３は、「本来の」相手方と比較したときのデオキシヌクレオチドおよびジデオキシヌクレオチドを取り込むために用いられた２つの主要な実験を示す。 図２４は、金属中心の好ましい電気化学的特性を変えることのない構造的変形物に対して好適なさまざまな位置を示す。 図２５は、電気化学的に異なる鎖伸長停止ジオキシヌクレオシド三リン酸を示す。 図２６は、改変ｄｄＮＴＰに連結可能なレドックス活性を有する調製可能中心に対する２つの変形設計例を示す。 図２７Ａは、Ｒｕ２+錯体の酸化電位およびその調製を示す。 図２７Ｂは、Ｒｕ２+錯体の酸化電位およびその調製を示す。 図２７Ｃは、Ｒｕ２+錯体の酸化電位およびその調製を示す。 図２８Ａは、複数のフェロセン類似体を形成する方法を示す。 図２８Ｂは、複数のフェロセン類似体を形成する方法を示す。 図２８Ｃは、複数のフェロセン類似体を形成する方法を示す。 図２８Ｄは、複数のフェロセン類似体を形成する方法を示す。 図２８Ｅは、複数のフェロセン類似体を形成する方法を示す。 図２８Ｆは、複数のフェロセン類似体を形成する方法を示す。 図２８Ｇは、複数のフェロセン類似体を形成する方法を示す。 図２８Ｈは、複数のフェロセン類似体を形成する方法を示す。 図２８Ｉは、複数のフェロセン類似体を形成する方法を示す。 図２９Ａは、所望の生成物を得るための、水溶液または水性ＤＭＦ（またはＤＭＳＯ）中にあるオリゴヌクレオチドを有するフェロセン誘導体の一般的な合成物を示す。 図２９Ｂは、所望の生成物を得るための、水溶液または水性ＤＭＦ（またはＤＭＳＯ）中にあるオリゴヌクレオチドを有するフェロセン誘導体の一般的な合成物を示す。 図３０は、本発明のいくつかのフェロセン誘導体およびそのレドックス電位を示す。 図３１は、ＤＮＡポリメラーゼ反応（クレノウ断片）によるｄＲｕＴＰの取り込みを示す。 図３２Ａは、ＤＮＡ塩基配列を決定するための電気的検出に関する概略図である。 図３２Ｂは、ＤＮＡ塩基配列を決定するための電気的検出に関する概略図である。 図３２Ｃは、ＤＮＡ塩基配列を決定するための電気的検出に関する概略図である。 図３２Ｄは、ＤＮＡ塩基配列を決定するための電気的検出に関する概略図である。
本発明は、電極上の電気化学的な検出手法を用いて、標的核酸の塩基配列を決定する方法に関する。本発明は、レドックス活性を有するＤＮＡ標識剤を用いて、核酸オリゴヌクレオチドを電気化学的に検出する。レドックス活性を有する標識剤は、１００ミリボルト以上異なるレドックス電位の範囲に適合するように調製できるレドックス特性を有する電子移動モイエティ（ＥＴＭ：Electron Transfer Moieties）に基づいている。
こうした標識は、サンガにより開発されたジデオキシ鎖伸長停止法において利用することができる。この方法において、ＤＮＡ断片に固有の４つの塩基群が形成され、これらの塩基の鎖長は、固有の塩基配列に関連付けることができる。単一の塩基溶液による断片サイジング法を用いて、塩基配列を読み取る。試料は、プライマ伸長プロトコルにより用意され、このとき短い一本鎖相補ＤＮＡオリゴヌクレオチド、すなわちプライマが標的塩基配列にハイブリダイズさせる。ＤＮＡポリメラーゼおよびＡ、Ｔ、Ｇ、Ｃの各塩基に対するデオキシヌクレオチド三リン酸（ｄＮＴＰ）の混合物を加えることにより、ニ本鎖領域を伸長させる。この混合物にジデオキシヌクレオチド三リン酸（ｄｄＮＴＰ）を添加することにより、特定の塩基において鎖伸長を停止させる。４つの塩基のそれぞれに対してｄｄＮＴＰの濃度を制御しながら、個別の反応を起こすことにより、特定の塩基において停止した核酸断片の混合物が形成される。４つの混合物のそれぞれにおいて合成されたオリゴヌクレオチドの鎖長に基づいて、標的核酸の塩基配列を決定することができる。
すなわち、本発明によれば、標的核酸の塩基配列を決定するための、ＥＴＭ標識された核酸を用いる組成物および方法を提供する。例えば、シーケンス反応時に、異なるレドックス電位を有するＥＴＭと共役するｄｄＮＴＰが酵素に取り込まれて、異なるレドックス電位を有するＥＴＭを含むシーケンスプローブを形成することができる。
好適には、電極に接続されたキャピラリ電気泳動チャンネルを用いて、ＥＴＭ標識されたオリゴヌクレオチドを検出して、同定することができる。当業者ならば理解されるように、４つの異なる電位を有する４つのシーケンス電極を用いて、標的核酸の塩基配列を決定することができる。択一的には、単一の電極を用いて、４つの塩基を同定してもよい。この方法によれば、ＥＴＭ標識の電位範囲をカバーするように変化させて、結果として得られる信号を走査して、標的核酸の塩基配列を決定することができる。
すなわち本発明は、試料中の標的核酸の塩基配列を決定するための組成物および方法を提供する。当業者ならば理解されるように、試料溶液は実質的に任意の数の物質を含み、これらに限定されるわけではないが、体液（これらに限定されるわけではないが、生物体に関する血液、尿、漿液、リンパ液、唾液、肛門分泌液、膣分泌液、汗、および精液であって、中でも哺乳類の試料が好ましく、人間の試料がとりわけ好ましい。）と、環境試料（これらに限定されるわけではないが、空気、農業用水および土壌試料）と、生物兵器試料と、研究試料（すなわち、核酸の場合、試料は、PCT/US99/01705に開示されたＰＣＲ増幅反応のように、標的および信号増幅を含む増幅反応による生成物であってもよい）と、精製されたゲノムＤＮＡ、ＲＮＡ、蛋白質、などの精製された試料と、未処理試料（バクテリア、ウィルス、ゲノムＤＮＡなど）と、を含む。当業者ならば理解されるように、これらの試料に対して、実質的に任意の実験処理を行うことができる。
「核酸」または「オリゴヌクレオチド」またはここでいう文法上の均等物は、互いに共有結合する少なくとも２つのヌクレオチドを意味する。本発明の核酸は、一般に、ホスホジエステル結合を有し、いくつかの場合においては、下記詳述するように、例えば、ホスホルアミド（BeaucageらのTetrahedron 49(10):1925 (1993)およびその参考文献、Letsinger, J.のOrg. Chem. 35:3800 (1970)、SprinzlらのEur. J. Biochem. 81:579 (1977)、LetsingerらのNucl. Acids Res. 14:3487 (1986)、SawaiらのChem. Lett. 805 (1984)、LetsingerらのJ. Am. Chem. Soc. 110:4470 (1988)、およびPauwelsらのChemica Scripta 26:141 91986）と、チオリン酸（MagらのNucleic Acids Res. 19:1437 (1991)および米国特許第5,644,048号）と、ジチオリン酸（BriuらのJ. Am. Chem. Soc. 111:2321 (1989)）、Ｏ−メチルホスホロアミダイト結合（Eckstein, オリゴヌクレオチドおよび類似体: A Practical Approach, Oxford University Pressを参照されたい。)と、ペプチド核酸骨格および結合（EgholmのJ. Am. Chem. Soc. 114:1895 (1992)、MeierらのChem. Int. Ed. Engl. 31:1008 (1992)、NielsenのNature, 365:566 (1993)、CarlssonらのNature 380:207 (1996)を参照されたい。)とを含み、置換骨格を有する核酸類似体がこれに含まれる。これらの文献は参考としてここに一体のものとして統合される。他の核酸類似体は、塩基性骨格（DenpcyらのProc. Natl. Acad. Sci. USA 92:6097 (1995)）と、非イオン性骨格(米国特許第5,386,023号、米国特許第5,637,684号、米国特許第5,602,240号、米国特許第5,216,141号、および米国特許第4,469,863号、KiedrowshiらのAngew. Chem. Intl. Ed. English 30:423 (1991)、LetsingerらのJ. Am. Chem. Soc. 110:4470 (1988)、Letsingerらのヌクレオチドおよびヌクレオシド 13:1597 (1994); Chapters 2 and 3, ASC シンポジウムSeries 580, "Carbohydrate Modifications in Antisense Research", Ed. Y.S. SanghuiおよびP. Dan Cook、MesmaekerらのBioorganic & Medicinal Chem. Lett. 4:395 (1994)、JeffsらのJ. Biomolecular NMR 34:17 (1994)、Tetrahedron Lett. 37:743 (1996)）と、を含む。１つ又はそれ以上の炭素環式多糖類を含む核酸は、この核酸の定義内に含まれる（JenkinsらのChem. Soc. Rev. (1995) pp169-176を参照されたい。）。いくつかの核酸類似体は、Rawls, C & E News June 2, 1997の35頁に開示されている。これらのすべての文献は参考としてここに一体のものとして統合される。リン酸リボース骨格に関する変形は、ＥＴＭを添加しやすくするか、物理的環境におけるこうした分子の安定性を改善し、半減期を改善するために行われる。
当業者ならば理解されるように、これらすべての核酸類似体は、本発明において利用され得る。加えて、自然発生的な核酸および類似体の混合物を形成することができ、例えば、伝導性オリゴマまたはＥＴＭ付属部の部位において、類似構造体を用いてもよい。択一的には、異なる核酸類似体の混合物、および自然発生的な核酸および類似体の混合物を形成してもよい。
とりわけ好適なのは、ペプチド核酸類似体を含むペプチド核酸（ＰＮＡ）である。これらの骨格は、自然発生的な核酸の極めて高い電荷を有するホスホジエステル骨格とは対照的に、中性状態で実質的に非イオン性である。これにより２つの利点がある。第１に、ペプチド核酸の骨格により、ハイブリダイゼーションの反応速度が改善される。ペプチド核酸は、完全に適合した塩基対に対する適合しなかった塩基対に関する溶融温度（Ｔｍ）の差異の変化がより大きい。ＤＮＡおよびＲＮＡは、本質的な不適合に関して、通常、溶融温度が２〜４℃下がる。非イオン性ペプチド核酸骨格に関して、溶融温度は、およそ７〜９℃近く下がる。これにより、不適合をより良好に検出できる。同様に、非イオン性であることから、これらの骨格に固定される塩基のハイブリダイゼーションが塩濃度に影響されにくい。低濃度ハイブリダイゼーション食塩水が生理食塩水よりも小さい誘導電流を有する（１５０ｍＭの範囲）ので、このことは、本発明のシステムにおいて、とりわけ好都合である。
核酸は、上述のように、一本鎖またはニ本鎖であっもよく、あるいはニ本鎖塩基配列または一本鎖塩基配列を含んでいてもよい。核酸は、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ＲＮＡ、またはハイブリッドであってもよい。このとき核酸は、デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、およびウラシル、アデニン、チミン、シトシン、グアニン、イノシン、キサニン、ハイポキサニン、イソシトシン、イソグアニンなどを含む塩基の任意の組み合わせであってもよい。好適な実施形態によれば、米国特許第5,681,702号に開示されているように、不特定のハイブリダイゼーションを低減するので、標的塩基配列ではなく、他のプローブに相補的となるように設計された核酸内のイソシトシンおよびイソグアニンが用いられる。ここで「ヌクレオシド」なる用語は、ヌクレオチドだけでなく、ヌクレオシドおよびヌクレオチド類似体と、アミノ変性ヌクレオシドなどの変性ヌクレオシドとを含む。さらに、「ヌクレオシド」は、自然発生的でない類似構造体を含む。すなわち、ペプチド核酸の個別の単位は、それぞれ塩基を含むが、ここではヌクレオシドと称する。
本発明の組成物および方法は、標的塩基配列を決定する方法に関する。「標的塩基配列」または「標的核酸」なる文言、またはその文法的な均等物は、一本鎖上の核酸における核酸塩基配列を意味する。標的塩基配列は、遺伝子、調節遺伝子、ゲノムＤＮＡ、ｍＲＮＡおよびｒＲＮＡを含むＲＮＡの一部であっもよい。概略するように、標的塩基配列は、試料からの塩基配列、またはＳＢＥ反応からの伸長プローブなどの反応物である副次的な塩基配列であってもよい。塩基配列の長さは、より長い塩基配列はより特長的であるという理解に基づき、任意であってもよい。当業者ならば理解されるように、相補的な標的塩基配列は、数多くの形態を取り得る。例えば、より大きな核酸塩基配列、すなわち遺伝子またはｍＲＮＡ、プラスミドＤＮＡまたはゲノムＤＮＡの制限断片などの全部または一部の中に標的塩基配列が含まれることがある。以下により詳しく説明するように、試料内の標的塩基配列の存在有無を決定するために、プローブは、標的塩基配列をハイブリダイズするように構成される。一般的に云えば、上記主旨は当業者ならば理解される。
標的塩基配列は、異なる標的ドメインから構成されていてもよく、例えば、試料の標的塩基配列の第１標的ドメインは、プライマなどをハイブリダイズしてもよい。標的ドメインは、記述されるように、隣接していてもよいし、離れていてもよい。特に説明しなければ、「第１」および「第２」なる用語は、標的塩基配列の５'−３'方向に関する塩基配列の方向性を意味するものではない。相補的な標的塩基配列の５'−３'方向を仮定して、第１標的ドメインは、第２標的ドメインに対して５'または３'に配置してもよい。
以下により十分に説明するように、標的塩基配列は、塩基配列情報が所望される位置を有し、これを一般に「検出位置」という。好適な実施形態において、検出位置は、複数のヌクレオチドを有し、各ヌクレオチドは、互いに隣接するか、１つまたはそれ以上のヌクレオチドで分離している。ここで「複数」とは、少なくとも２つであることを意味する。いくつかの実施形態においては、検出位置は単一のヌクレオチドである。ハイブリッドにおいて検出位置の塩基と結合する塩基は、「質問位置（interrogation position）」と呼ばれる。
一般に、現在の塩基配列決定法は、テンプレートストランド上の特定の塩基配列に相補的なオリゴヌクレオチドのプライマを利用している。当業者ならば理解されるように、テンプレートストランドは、標的核酸からさまざまな方法で得ることができる。例えば、標的核酸の塩基配列をバクテリオファージＭ１３ベクタまたはファージミドベクタにクローニングすることにより、一本鎖ＤＮＡ分子としてテンプレートストランドを得ることができる。加えて、標的核酸分子については、変性ニ本鎖核酸分子を用いて直接的に塩基配列を決定することができる。好適な実施形態において、ＰＣＲに基づいた方法を用いて、塩基配列決定のためにテンプレートとして利用できる標的ストランドを過剰に生成することができる。
当業者ならば理解されるように、これに限定されないが、標的ストランドを過剰に生成するために、非対称ポリメラーゼ連鎖反応（ＡＰＣＲ）などのさまざまなＰＣＲ法を用いることができる。
好適な実施形態において、非対称ポリメラーゼ連鎖反応（ＡＰＣＲ）を用いて、ここで説明するように、電気化学的に塩基配列を決定するためのテンプレート塩基配列として利用される一本鎖核酸断片の収量を増大させることができる。２：１ないし１００：１の範囲のさまざまな比でプライマを用いることにより一本鎖が生成されるが、従来式のＡＰＣＲ技術によれば、５：１の比でプライマを用いることにより一本鎖が生成される。ＡＰＣＲ法を開示した1999年7月27日付で出願された米国特許出願09/626,096を参照されたい。この出願は、参考としてここに一体のものとして統合される。
したがって、本発明の組成物および方法によれば、標的塩基配列を用いて、標的塩基配列の検出位置におけるヌクレオチドを同定することができる。
以下においてより十分に説明するが、本発明において、さまざまなＥＴＭを用いることができる。この実施形態によれば、用いられるアッセイ装置において異なるＥＴＭを区別できるように、異なるＥＴＭのレドックス電位が選択される。「レドックス電位」（ときどきＥ０と称する。）は、電極付近の溶液中における酸化ＥＴＭと還元ＥＴＭとの比が１となるように、（通常、水素電極などの標準的な基準電極に対して）電極に印加しなければならない電圧を意味する。好適な実施形態において、レドックス電位は、少なくとも１００ｍＶ異なるが、システムの感度、用いられる電気化学的な測定技術、および用いられる異なる標識の数に依存して、１００ｍＶより小さい、または大きい電位差であってもよい。とりわけ好適な実施形態によれば、フェロセン誘導体が用いられ、例えば、フェロセンを含み、環式置換基を含まず、あるいはアミン、アミド、カルボキシル基などを含むＥＴＭを用いてもよい。
好適な実施形態において、本発明は、それぞれが固有のレドックス電位を有する少なくとも１つのＥＴＭを含む複数のシーケンスプローブを提供する。ここで「シーケンスプローブ」とは、サンガの塩基配列決定反応により形成されたオリゴヌクレオチドの集合を意味する。好適には、各シーケンスプローブは、異なる塩基において停止し、異なる共有結合ＥＴＭを有する。すなわち、固有のレドックス電位を有するＥＴＭにより標識された４つの異なるｄｄＮＴＰを用いることにより、テンプレートストランドにおけるＡ、Ｃ、Ｇ、またはＴが占有する位置において停止したシーケンスプローブの集合が形成される。これらの集合は、電気泳動法を用いて分離し、ＥＴＭの電気化学的信号に基いて決定される各塩基を同定することができる。
好適な実施形態においては、酵素による塩基配列反応を用いて、検出位置でのヌクレオチドを同定することができる。好適には、サンガ−ジデオキシ法および単一塩基伸長に基づいた酵素による塩基配列反応を用いて、検出位置における塩基の同定を決定することができる。
好適な実施形態において、サンガ−ジデオキシ法を用いて、検出位置における塩基の同定を決定する。概略すると、サンガ法は、プライマ伸長プロトコルを用いる技術で、オリゴヌクレオチドプライマをアニール処理して、一本鎖ＤＮＡテンプレートを生成する。４つの異なる塩基配列反応が行われ、各反応はＤＮＡポリメラーゼおよびｄＮＴＰを含む。４つの反応は、ここで説明するように、ＥＴＭで標識されたｄｄＮＴＰを同様に有する。ｄｄＮＴＰ分子が成長するＤＮＡ側鎖に取り込まれると、ｄｄＮＴＰ分子の３'末端にＯＨ基が存在しないことから、次のｄＮＴＰとのホスホジエステル結合が阻止され、鎖の伸長が不可能となる。こうして、ＤＮＡ合成物の反応混合物内に、４つのｄＮＴＰとともに、１つの標識されたｄｄＮＴＰを少量加えることにより、鎖が伸長する部分と、所々で塩基により中断する部分との競合が生じる。反応生成物は、シーケンスプローブ、すなわちオリゴヌクレオチドの集合であって、その長さは、ＤＮＡ合成物を合成するために用いられるプライマの５'末端から鎖停止部までの距離である。例えば、ｄｄＡを含む塩基配列反応において、停止点は、デオキシアデノシル残基により通常占有されたすべての位置に対応する。４つの別個の酵素反応において、４つの異なるｄｄＮＴＰを用いることにより、テンプレートストランドにおいて、Ａ、Ｃ、Ｇ、またはＴのそれぞれが占有する位置において停止し、シーケンスプローブの集合が形成される。これらの集合は、電気泳動法により分離され、以下説明するように、ＥＴＭを検出することにより、新たに合成されたストランドの塩基配列が決定される。
４つの未識別のヌクレオチド類似体を含む溶液内に、テンプレートストランドを加え、固有のレドックス電位を有するＥＴＭを含むヌクレオチド類似体の鎖を停止させることにより、各塩基配列反応が開始される。この文脈における「ヌクレオチド類似体」とは、デオキシヌクレオシド三リン酸（同様に、デオキシヌクレオチドまたはｄＮＴＰ、すなわちｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＣＴＰ、およびｄＧＴＰ）を意味する。「鎖停止ヌクレオチド類似体」とは、ジデオキシヌクレオシド三リン酸ヌクレオチドｄｄＮＴＰ、すなわちｄｄＡＴＰ、ｄｄＴＴＰ、ｄｄＣＴＰ、およびｄｄＧＴＰ）を意味する。
ヌクレオチド類似体に加えて、溶液は同様に、通常ＤＮＡポリメラーゼである伸長酵素を含む。好適なＤＮＡポリメラーゼは、これらに限定されるわけではないが、ＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウ断片、Thermus aquaticusからのＤＮＡポリメラーゼ（すなわちTaqポリメラーゼ）、改変Ｔ７ポリメラーゼ（すなわち、SEQUENASE 1.0 and SEQUENASE 2.0 (U.S. Biochemical)）、Ｔ５ＤＮＡポリメラーゼ、およびPhi29ＤＮＡポリメラーゼを含む。
好適な実施形態においては、サンガのジデオキシ介在による塩基配列反応は、改変Ｔ７ＤＮＡポリメラーゼ（すなわち、Sequenase）を用いて行われる。この実施形態において、この反応は、鋳型塩基配列の相補的ストランドに対して伸長プライマをアニールさせ、プライマを伸長させるために重合反応させ、シーケンスプローブの種を形成するために、伸長および停止反応をおこす。テンプレートは、変性ニ本鎖ＤＮＡ分子であってもよいし、一本鎖分子であってもよい。ここに参考に一体のものとして統合される、SambrookおよびRussellの"Molecular Cloning: A Laboratory Manual"第３版CSHL Press, New York, 2001, Chapter 12を参照されたい。
好適な実施形態においては、サンガのジデオキシ介在による塩基配列反応は、大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウ断片を用いて行われる。この実施形態において、クレノウ酵素が用いられ、一本鎖ＤＮＡテンプレートの塩基配列を決定する。上述のように、この反応は、テンプレート塩基配列の相補的ストランドに対して伸長プライマをアニールし、シーケンスプローブの集合を形成するために、伸長および停止反応を引きおこす。ここに参考に一体のものとして統合される、SambrookおよびRussellの"Molecular Cloning: A Laboratory Manual"第３版CSHL Press, New York, 2001, Chapter 12を参照されたい。
好適な実施形態においては、サンガのジデオキシ介在による塩基配列反応は、Taq ＤＮＡポリメラーゼを用いて行われる。Taq ＤＮＡポリメラーゼを用いた塩基配列決定方法は、Sequenaseを用いた方法と類似している。ここに参考に一体のものとして統合される、SambrookおよびRussellの"Molecular Cloning: A Laboratory Manual"第３版CSHL Press, New York, 2001, Chapter 12を参照されたい。
好適な実施形態において、サイクルＤＮＡ塩基配列決定法（サーマルサイクルＤＮＡ塩基配列決定法またはリニア増幅ＤＮＡ塩基配列決定法とも呼ばれる。）を用いて、シーケンスプローブの集合を形成する。サイクルＤＮＡ塩基配列決定法は、上述のサンガのジデオキシ鎖停止法による塩基配列決定法のために、一本鎖テンプレートを形成する。この実施形態においては、４つの個別の増幅反応を行い、各反応は、同じヌクレオチドプライマと、異なる鎖停止ｄｄＮＴＰとを含む。通常、２つのサイクルプログラムを利用する。第１のプログラムでは、従来式のサーマルサイクルを１５ないし４０サイクル行う。各増幅サイクルは、３つのステップを有し、ニ本鎖ＤＮＡストランドを改変するステップと、伸長プライマをアニールするステップと、その後にアニールされたプライマの伸長ステップと、ｄｄＮＴＰ取り込みによる伸長ストランドの停止ステップとを含む。結果として得られるニ本鎖ハイブリッド、すなわち完全長を有するテンプレートストランドとその相補鎖停止生成物を含むハイブリッドは、次のサイクルの第１ステップにおいて改変され、次のサイクルにおける準備、伸長、および停止のための遊離させる。こうして、シーケンスプローブは、サイクル塩基配列反応の第１段階全体において、１次関数的に増幅される。第２のサイクルプログラムにおいて、プライマがこれ以上伸びることができないように、アニールステップが省略される。代わりに、「追跡」断片が、サーマルサイクルの最初のラウンドでｄｄＮＴＰを取り込むことにより停止されなかった反応生成物をさらに伸長させる機会を与える。ここに参考に一体のものとして統合されるSambrook and Russellの"Molecular Cloning: A Laboratory Manual", 第３版CSHL Press, New York, 2001, Chapter 12を参照されたい。
当業者ならば理解されるように、サンガ法のシーケンス装置の構成は、いくつかの形態を取り得る。以下に説明するＳＢＥ反応に関して、この反応は、溶液中で実現され、塩基固有のＥＴＭ標識を含む新たに合成されたストランドが検出される。例えば、新たに合成されるストランドは、電気泳動法を用いて分離され、ＥＴＭ標識されたシーケンスプローブは、以下詳述するように検出される。
好適な実施形態においては、電気泳動法は微小毛細管内で行われる（高性能毛細電気泳動法（ＨＰＣＥ：High Performance Capillary Electrophoresis）。ＨＰＣＥの１つの利点は、印加される電場により生じる熱が、大きな表面積に起因して効率的に消散して、迅速に分離できる点である。一般に、ここに参考に一体のものとして統合される米国特許第5,770,029号、米国特許第5,126,022号、米国特許第5,631,337号、米国特許第5,569,364号、米国特許第 5,750,015号、および米国特許第5,135,627号、並びに米国特許出願09/295,691に開示されているように、毛細管は、電気泳動モジュールの一部であってもよい。
サイズに依存する分離のためのゲル媒質として、これらに限定されるわけではないが、ポリアクリルアミドおよびアガロースが含まれる。１つの好適な電気泳動による分離基質は、ここに参考に一体のものとして統合される米国特許第5,135,627号に開示され、そこでは微小ドメインの分散（分散基）および重合基質を重合化して形成される「モザイク基質」を用いることが開示されている。本発明において、これに限定されるわけではないが、ポリアクリルアミド（Ruiz-Martinez, et al., Anal. Chem., 65: 2851 (1993); Zhang, et al., Anal. Chem., 67: 4589 (1995);およびCarriho, et al., Anal. Chem., 68: 3305 (1996) を参照されたい。）、ポリビニルピロリドン（Gao, et al., Anal. Chem., 70: 1382 (1998) を参照されたい。）、 ポリエチレンオキシド（Fung et al., Anal Chem., 67: 1913 (1995) を参照されたい。）、およびポリジメチルアクリルアミド（Rosenblum, et al., Nucleic Acids Res., 25: 39225 (1997)およびMadabhushi, et al., Electrophoresis, 19:224 (1998) を参照されたい。）の絡み合ったポリマを含む他のポリマ材料を利用することができる。これらの文献はここに参考に一体のものとして統合される。同様にここに一体のものとして統合される米国特許第5,569,364号によれば、微小流体システムに用いられ、１ミクロン前後の大きさを有する互いに関連するゲル粒子を有する電気泳動のための分離媒質が開示されている。ここに一体のものとして統合される米国特許第5,631,337号によれば、改善された電気泳動分離のために水素結合基を与えるように機能するＮ置換基を含むポリアクリルアミド骨格を有する熱可逆性ヒドロゲルを用いることが開示されている。同様に、毛細管内にゲルを形成する方法に関して、米国特許第5,061,336号および米国特許第5,071,531号を参照されたい。
好適な実施形態において、集積化された電気化学的検出を用いたキャピラリ電気泳動法により、シーケンスプローブが分離される。ここに参考に一体のものとして統合される、Voegel, P.D. およびBaldwin, R.PのElectrophoresis, 18: 2267-2278 (1997)、Gerhardt, G.C.らのAnal. Chem., 70: 2167-2173 (1998)、Wen, J.らのAnal., Chem., 70: 2504 (1998)、Qian, J.らのAnal. Chem., 71: 4468 (1999)、WoolleyらのAnal. Chem., 70: 684 (1998)、Matysik, F.-M.らのAnal. Chim. Acta., 385: 409 (1999)を参照されたい。好適には、末端コラム検出法を用いて、ＥＴＭ標識されたプローブが検出される。
好適な実施形態において、ＥＴＭ標識されたプローブは末端コラム検出法（ＥＣ：end column detection）を用いて検出される。ＥＣ検出法は、直径２μｍ程度の大きさを有する溶融シリカ製キャピラリ内におけるキャピラリ電気泳動による検出方法として、これまでうまく利用されており（Olefirowicz, T.M. and Ewing, A.G., (1990) Anal. Chem. 62, 1872-1876）、さまざまなアナライトに関して、フェムトモルからアトモルの質量範囲の検出限界を有する。より小さい直径を有する電気泳動キャピラリを用いると、より直径の小さい電極または微小電極を必要とする。背景に流れる電流が急激に低減するために、これらの微小電極における背景ノイズはより小さくなる（Bard, A.J.およびFaulkner, L.R., (1980) Electrochemical Methods:Fundamentals and Applications, New York, John Wiley and Sons）。これにより、信号／ノイズ比がより高くなるため、濃度感度がより良好となる。これらの微小感度電極における質量感度は、より大きな電極と比較して、より高い質量分析効果に起因して同様に改善される（Huang, X.H.らの上記文献）。
好適な実施形態において、キャピラリ電気泳動チャンネルの出口に配置された電極を用いた末端コラム検出法により、本発明のＥＴＭ標識されたプローブを検出する。
好適な実施形態において、キャピラリ電気泳動チャンネルの出口に設けられた４つの電極を用いて末端コラム検出を行って、ＥＴＭ標識されたプローブを検出する。この実施形態において、４つの電極は、ＥＴＭのレドックス電位に対応する異なる電位に設定される。例えば、１つの電極は、１つのＥＴＭだけを酸化するのに十分な程度の低い電位（例えば、−０．１Ｖ）に設定される。少しだけより高い電位（例えば０．１２Ｖ）に設定された次の電極は、２つの低電位ＥＴＭだけを酸化することができる。さらに高い電位（例えば０．２７Ｖ）に設定された次の電極は、３つの低電位ＥＴＭだけを酸化することができる。さらに高い電位（例えば０．５Ｖ）に設定された最後の電極は、４つのＥＴＭすべてを酸化することができる。このように、より電位の高い電極においては、複数の信号が検出される。適当なソフトウェアを用いてデコンヴォルーション処理を行い、正確な塩基配列を決定する。
好適な実施形態において、キャピラリ電気泳動チャンネルの出口に設けられた単一の電極を用いて末端コラム検出を行って、ＥＴＭ標識されたプローブを検出する。この実施形態によれば、単一電極の電位は変化する。例えば、４つのＥＴＭ標識の電位に及ぶような最小電位および最大電位を有する三角波が印加される。例えば、０．１Ｖ、０．１２Ｖ、０．２７Ｖ、および０．５ＶのＥＴＭが用いられた場合、電位は、−０．２５Ｖから＋０．６５Ｖまで変化する。適当なソフトウェアを用いてデコンヴォルーション処理を行い、正確な塩基配列を決定する。
好適な実施形態において、異なるレドックス電位を有するＥＴＭからの誘導電流は、非線型回帰曲線適合アルゴリズムを用いて定量化される。このアルゴリズムは、固定プロセス（実施例１を参照されたい。）により先に得られたボルタモグラム（voltammogram）または誘導電流の２つの位相を適合させる。誘導電流信号と同じ形状を有する任意の数のカスタムメイド関数および背景電流を記述する別の関数を合算することにより構成される関数を、ボルタモグラムの各位相に適合させる。こうしたカスタムメイド関数の一例を、方程式１として表記する。これは、誘導電流信号の４次高調波（図２）をシミュレートするための変形ガウス分布の第３次導関数、および背景電流（図３）を適合させるための５次多項式の組み合わせである（図４）。例えば、方程式１に記載のアルゴリズムは、誘導電流信号の４次高調波（図２）をシミュレートするための変形ガウス分布の第３次導関数、および背景電流（図３）を適合させるための５次多項式の組み合わせ（図４）を用いている。
Figure 2005519630
このアルゴリズムは、方程式２に定義される誤差係数を最小化するガウス導関数および多項式を定義するパラメータ（a10, a11, ..., an1, an2）の最適組を見出す。
Figure 2005519630
この誤差係数は、データおよび方程式１に示す適合曲線の各点間の差の二乗の合計値として定義される。さらに、誤差係数は、パラメータが想定範囲内のパラメータとはあまりにもかけ離れて異なる場合に増大する補償項を有する。「ｍ」個存在するガウス分布の「ｎ」は、３つのパラメータを有する（すなわちｊ＝０，１，２）。したがって、パラメータanjが想定範囲からあまりにも異なる場合、誤差係数がKnjおよびdnjにより規格化された実質的な寄与成分を与える。誤差係数をこのように変形することにより、ＥＴＭ標識を適合する関数を、信号出力する電位値付近に中央化させることができる。
誤差係数を最小化することにより、パラメータを求めることができる。これは、テーラ級数における誤差係数の傾きを展開し、最小値に対して、方程式３において誤差係数が零となるようにすることにより求めることができる。
Figure 2005519630
あるいは、方程式４のように変形する。
Figure 2005519630
マーカードルーチンにより、アルゴリズムが進むにつれ、収束度の如何に依存して変化する追加的な重みを対角項に与える。コードに用いられる初期推定値および制約パラメータが図１３に図示されている。実施例１ないし４は、２つおよび４つの電位標識を用いた「ピークファインダ」アルゴリズムおよびシミュレーションに関して詳細に説明する。
上述のすべての組成物および方法は、標的核酸の１つまたはそれ以上の検出位置における塩基同定を決定することに関する。本発明の検出装置は、１つまたはそれ以上の電極を通過させることにより、固有のレドックス電位を有するＥＴＭを含む個々のシーケンスプローブを電気化学的に検出することに関連して、シーケンスプローブの集合を分離するために、キャピラリ電気泳動法を用いる。
いくつかの実施形態において、電極は、通常、伝導性オリゴマを含む自己組織化単分子膜（ＳＡＭ：self-assembled monolayer）を有する。これらの実施形態において、選択性または信号増幅を改善するために、単分子膜組成物を他の装置と組み合わせてもよい。（ここに参考に一体のものとしてともに統合される、ＳＡＭの組成物、並びにＳＡＭの形成方法および使用方法に関し、2001年5月1日付で出願された米国特許出願09/626,096および09/847,113を参照されたい。）
そのため、好ましい実施態様では、当該組成物は、電極を含む。ここで“電極”は、電子デバイスに接続したとき電流および電荷を意味し得、それをシグナルへ変換し得る、組成物である。他に、電極は、溶液中のスピーシーズへ電位を適用し、および／またはスピーシーズからもしくはスピーシスへ電子を受け渡し得る組成物として定義され得る。そのため、電極は、ここに記載するようにＥＴＭである。好ましい電極は、当分野で既知であり、以下に限らないが、特定の金属およびその酸化物、金；プラチナ；パラジウム；シリコン；アルミニウム；酸化プラチナ、酸化チタン、酸化スズ、インジウムスズ酸化物、酸化パラジウム、酸化シリコン、酸化アルミニウム、酸化モリブデン(Ｍｏ２Ｏ６)、酸化タングステン(ＷＯ３)および酸化ルテニウムを含む金属酸化物電極；および炭素(ガラス状炭素電極、グラファイトおよび炭素ペーストを含む)を含む。好ましい電極は、金、シリコン、炭素、および金属酸化物電極を含み、金が特に好ましい。
ここで記載の電極は平らな表面として表記されているが、これは電極の可能な形態のひとつに過ぎず、図示の目的だけのためのものである。当該電極の形態は、使用する検出方法により変化する。例えば、平らな平面(flat planar)電極は、視覚性検出方法に好ましく、また核酸のアレイを形成するとき、合成および検出の両方でアドレス可能な位置を必要とするので好ましい。他に、単一のプローブ分析では、当該電極は、チューブ型であり、内側表面に結合した伝導性オリゴマーおよび核酸を含むＳＡＭを有する。これにより、少量のサンプルにさらされる核酸を含む表面積は最大となり得る。
好ましい実施態様では、当該検出電極は、サブストレート上で形成される。加えて、ここでの考察は、一般的に、金電極の形成を目的とするが、当業者に明らかなように、他の電極も使用し得る。当該サブストレートは、多種多様の物質を含み得、当業者に明らかなように、プリント配線基板(printed circuit board)(ＰＣＢ)物質が特に好ましい。そのため、一般的に、適当なサブストレートは、以下に限らないが、ファイバーガラス、テフロン(登録商標)、セラミック、ガラス、シリコン、ウンモ、プラスチック(アクリル、ポリスチレンおよびスチレンのコポリマーおよび他の物質、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリブチレン、ポリカーボネート、ポリウレタン、Teflon(商標)、およびそれらの誘導体を含む)、ＧＥＴＥＫ(ポリプロピレン酸化物およびファイバーガラスの混合物)などを含む。
一般的に、好ましい物質は、プリント配線基板物質を含む。プリント配線基板は、電導層で被覆され、リソグラフィー技術、特にフォトリソグラフィー技術を用い処理され、電極および相互接続のパターンを形成する(時折、当分野では、インターコネクションまたはリードという)絶縁物質を含むものである。その絶縁物質は、一般的に、いつもポリマーではない。当分野に既知のように、１つまたは複数の層を使用し、“二次元”(例えば、平面におけるすべての電極および相互接続)または“三次元”(ここでは、当該電極は、１つの表面上にあり、その相互接続は当該基板から他の側へと通じる)基板の何れかを形成し得る。３次元システムは、しばしば、ドリルまたはエッジングの使用により、その後の、銅のような金属で電気めっきし、それによって“基板を介する”相互接続が作成される。配線基板物質は、しばしば、必要に応じて(例えば、相互接続の場合)、例えば電気めっきすることにより更に銅が加えられる、当該サブストレートに既に結合した、銅ホイルのようなホイルに提供される。次いで、当該銅表面は、例えば、エッジングにより、粗くする必要があり得、接着層の結合を可能とする。
従って、好ましい実施態様では、本発明は、複数のキャピラリー電気泳動チューブおよび電極を含むサブストレートを含む“シーケンシングチップ”を提供する。好ましい実施態様では、１つまたはそれより多い電極が、当該チューブの出口に位置する(図３２AおよびB参照)。他の実施態様では、１つより多いキャピラリーチューブは、１つまたはそれより多い電極の上に位置する(図３２CおよびD)。
当該システムにかかわらず、各電極は、一端で電極に接続し、最終的には、当該電極をコントロールし得るデバイスに接続する、相互接続を有する。すなわち、各電極は、独立してアドレス可能である。
当該サブストレートは、キャピラリーまたはゲル電気泳動チャンバーおよび所定の量のサンプルを当該検出電極にさらす検出チャンバーまたは領域を含むより大きなデバイスの一部であり得る。実験状態およびアッセイに応じて、より少量が好ましい。
幾つかの実施態様では、当該電気泳動チャンバー、検出チャンバーおよび電極は、電子コンポーネント(AC／DC電圧源、アンメーター、プロセッサー、リードアウトディスプレ、温度コントローラー、光源など)を含むデバイス中に位置し得るカートリッジの一部である。この実施態様では、各電極からの相互接続は、当該装置の当該カートリッジの挿入において、当該電極と電子コンポーネントの間の接続を確立するように、位置する。
配線基板物質(または他のサブストレート)上の検出電極は、一般的に、多種多様な方法で作成される。一般的に、高純度の金が使用され、真空沈積法(vacuum deposition process)(スパッタリングおよびエバポレーション)または溶液沈積(電気めっきまたは非電着性金属析出法)により表面に沈積し得る。電気めっきを行うとき、当該サブストレートは、最初に、伝導性物質を含まなければならない；ファイバーガラス配線基板は、しばしば銅ホイルに提供される。しばしば、当該サブストレートに依存して、当該サブストレートと金との間の接着層が、良好な機構的安定性を確実とするため、使用される。そのため、好ましい実施態様は、上記のように金に沈積し得る、クロム、チタン、チタン／タングステン、タンタル、ニッケルまたはパラジウムのような接着金属の沈積層を利用する。電気めっきした金属(接着金属または電極金属の何れか)を使用すると、微量精製添加物(しばしば、光沢剤として取引で引き合いに出される)は、所望により、表面沈積特性を変化させるため加えられ得る。好ましい、光沢剤は、有機および無機スピーシーズの混合物であり、コバルトおよびニッケルが好ましい。
一般的に、接着層は、約１００Å厚から約２５ミクロン(１０００マイクロインチ)である。その接着金属が、電気化学的に活性であるならば、当該電極金属は、“ブリードスルー”（bleed-through）を防止する厚さで被覆しなければならない；接着金属が、電気化学的に活性でないならば、当該電極金属はより薄くし得る。一般的に当該電極金属(好ましくは金)は、約５００Åから約５ミクロン(２００マイクロインチ)の範囲の厚さで沈積され、約３０マイクロインチから約５０マイクロインチが好ましい。一般的に、当該金は、約５ミクロンから約５ｍｍの直径のサイズの範囲で電極を作製するように沈積され、１００から２５０ミクロンが好ましい。そのため、形成された当該検出電極は、好ましくは、きれいであり、以下で考察するように、ＳＡＭが加えられる。
そのため、本発明は、複数の金電極を含むサブストレートを作製する方法を提供する。本発明は、はじめに、当該サブストレート上にニッケルまたはパラジウムのような接着金属(所望により光沢剤を伴う)を被覆することを含む。電気めっきが好ましい。次いで、電極金属、好ましくは、金は、接着金属上に被覆される(再び、電気めっきが好ましい)。次いで、当該電極およびそれらの接続された相互接続を含むデバイスのパターンは、当分野に既知のようなリトグラフィー技術、特にフォトリトグラフィー技術および湿潤化学的エッチング(wet chemical etching)を用い作製される。しばしば、ソルダーマスクまたはプラスチックのような非伝導性化学的抵抗絶縁物質は、電極および露出されているリードへの接続点のみを残して、これらフォトリトグラフィー技術を用い敷設される(lay down)；当該リード自体は一般的に被覆されれるている。
そのため、好ましい実施態様では、結合ＥＴＭを有するシーケンシングプローブを提供する。ここで、用語“電子ドナー部分”、“電子アクセプター部分”、および“ＥＴＭ”(ＥＴＭｓ)または文法的に同等のものは、特定条件下の電子移動可能な分子をいう。電子ドナーおよびアクセプターキャピラリーは関係する；すなわち、特定実験条件下で電子を失い得る分子は、異なる実験条件下では電子を受け入れ得ることを理解すべきである。可能な電子ドナー部分および電子アクセプター部分の数は非常に大きく、電子移動化合物の分野の当業者は本発明の多くの化合物を利用し得ると理解すべきである。好ましいＥＴＭは、以下に限らないが、遷移金属錯体、有機性ＥＴＭおよび電極を含む。
好ましい実施態様では、ＥＴＭは遷移金属錯体である。遷移金属は、原子がｄ殻の電子を部分的または完全に有するものである。本発明で使用の適当な遷移金属には、以下に限らないが、カドミウム(Ｃｄ)、銅(Ｃｕ)、コバルト(Ｃｏ)、パラジウム(Ｐｄ)、亜鉛(Ｚｎ)、鉄(Ｆｅ)、ルテニウム(Ｒｕ)、ロジウム(Ｒｈ)、オスミウム(Ｏｓ)、レニウム(Ｒｅ)、白金(Ｐｔ)、スカンジウム(Ｓｃ)、チタン(Ｔｉ)、バナジウム(Ｖ)、クロム(Ｃｒ)、マンガン(Ｍｎ)、ニッケル(Ｎｉ)、モリブデン(Ｍｏ)、テクネチウム(Ｔｃ)、タングステン(Ｗ)およびイリジウム(Ｉｒ)を含む。すなわち、Ｆｅ、Ｒｅ、Ｗ、ＷｏおよびＴｃに加えて、最初のシリーズの遷移金属、白金金属(Ｒｕ、Ｒｈ、Ｐｄ、Ｏｓ、ＩｒおよびＰｔ)が好ましい。特に、好ましいのは、ルテニウム、レニウム、オスミウム、白金、コバルトおよび鉄である。
遷移金属は、当分野に既知のように、種々のリガンド(以下で定義したＬ)と複合体となり、適当な金属錯体を形成する。
遷移金属錯体に加えて、他の有機性電極ドナーおよびアクセプターは、本発明での使用のため核酸に共有結合し得る。これらの有機性分子は、以下に限らないが、リボフラビン、キサンテン色素、アジン色素、アクリジンオレンジ、Ｎ,Ｎ'−ジメチル−２,７−ジアザピレニウムジクロリド(ＤＡＰ２＋)、メチルビオロゲン、エチジウムブロミド、Ｎ,Ｎ'−ジメチルアントラ(2,1,9-def.6,5,10-d'e'f')ジイソキノリンジクロリド(ＡＤＩＱ２＋)のようなキノリン；ポリフィン([メソ−テトラキス(Ｎ−メチル−ｘ−ピリジニウム)ポルフィリンテトラクロリド])、バルラミン(varlamine)ブルーＢヒドロクロリド、Bindschedler'sグリーン；２,６−ジクロロインドフェノール、２,６−ジブロモフェノールインドフェノール；ブリリアントクレストブルー(３−アミノ−９−ジメチル−アミノ−１０−メチルフェノキシアジンクロリド)、メチレンブルー；ナイルブルーＡ(アミノナフトジエチルアミノフェノキシアジンサルフェ)、インジゴ−５,５’,７,７'−テトラスルホン酸、インジゴ−５,５',７’トリスルホン酸；フェノサフラニン、インジゴ−５−模のスルホン酸；サファラニンＴ；ビス(ジメチルグリオキシマト)−鉄(II)クロリド；インジュリンスカーレット、ニュートラルレッド、アントラセン、コロネン、ピレン、９−フェニルアントラセン、ルブレン、ビナフチル、ＤＰＡ、フェノチアゼン、フルオロアンテン、フェナンテレン、クリセン、１,８−ジフェニル−１,３,５,７−オクタテトラセン、ナフタレン、アセナフタレン、ペリレン、ＴＭＰＤおよび類似体およびこれらの化合物の置換誘導体を含む。
ある実施態様では、電極ドナーおよびアクセプターは、当分野に既知のレドックスタンパク質である。しかし、多くの実施態様でのレドックスタンパク質は好ましくない。
特定ＥＴＭの選択は、以下に一般的に概略するように、使用する電子移動検出の型に影響される。好ましいＥＴＭは、メタロセンであり、フェロセンが特に好ましい。
サンガーに基づく配列決定での使用のため、ＥＴＭは、幾つかの特性を示す。第一に、ＥＴＭのレドックス電位(すなわち、Ｅ１／２値)は、低いバックグラウンドのノイズを提供し、アーチファクトを除く天然のヘテロ環塩基の酸化または還元電位からはずれる(fall out)。第二に、ＥＴＭの酸化または還元の波は可逆的であり、再現性を確実とする。第三に、ＥＴＭは、化学的に安定であり、ポリメラーゼ反応条件、ＰＣＲ増幅および電気泳動分離に適合する。第４に、ＥＴＭは、“調節可能(tunable)”となる。ここで“調節可能”とは、ＥＴＭが、修飾すべきＥＴＭのレドックス電位を許容する置換を含み、それによって、本発明で使用するＥＴＭは、電気化学的に、互いから区別されることを意味する。
好ましい実施態様では、ＥＴＭは、特有の可逆性レドックス電位を示すフェロセン誘導体である。核酸で見られるヘテロ環ベースの酸化および還元電位に基づき(Seidel, et al., J. Phys. Chem., 100: 4451 (1996); Steenken, et al., J. Am. Chem. Soc., 114: 4701, (1992); Steenken & Jovanovic, J. Am. Chem. Soc., 119: 617, (1997)、フェロセン誘導体のレドックス電位は、０から５２０ｍＶである。
当業者に理解されるように、ここで示すフェロセン誘導体のすべては、更なる原子または構造を有し得、すなわち、構造１のフェロセン誘導体は核酸などに結合され得る。他に特記しない限り、ここで示すフェロセン誘導体は、Ｙを介しこれらの更なる構造に結合する。例えば、フェロセン誘導体が、核酸(すなわち、ヌクレオシド、核酸類似体)、またはホスホラミダイトのような他の部分に結合するならば、Ｙは、構造１に示すようなリンカー(Ｌ)の使用を介するか、または直接の何れかで結合する。加えて、本発明のフェロセン誘導体は、ここでは一般的にＲとして示す１つまたはそれより多い置換基で置換され得る。Ｒ基およびリンカーの両方が使用され、フェロセン誘導体のレドックス電位が調節され得る。
構造１
Figure 2005519630
適当なＲ基は、以下に限らないが、水素、アルキル、アルコール、芳香族、アミノ、アミド、ニトロ、エーテル、エステル、アルデヒド、スルホニル、シリコン部分、ハロゲン、含硫黄部分、含燐部分、およびエチレングリコールを含む。ここで示す構造では、Ｒは、その位置で非置換であるときは水素である。幾つかの位置では、２つの置換基Ｒおよび
Ｒ’を許容し得、その場合、ＲおよびＲ’基は同じかまたは異なるか何れかであり得る。
ここで“アルキル基”または文法的に同等なものは、直鎖状または分枝状のアルキル基を意味し、直鎖アルキル基が好ましい。分枝状ならば、１つまたはそれより多い位置で分岐し得、特定しない限り、任意の位置である。アルキル基は、約１から約３０炭素原子(Ｃ１−Ｃ３０)の範囲であり得、好ましい実施態様では、約１から約２０の炭素原子(Ｃ１−Ｃ２０)を利用し、約Ｃ１から約Ｃ１２からＣ１５が好ましく、Ｃ１からＣ５が特に好ましいが、ある実施態様では、アルキル基は、より大きくなり得る。また、Ｃ５およびＣ６環のようなシクロアルキル基、および窒素、酸素、硫黄または燐を有するヘテロ環もまた、アルキル基の定義内に含まれる。アルキルはまた、ヘテロアルキルを含み、硫黄、酸素、窒素およびシリコンのヘテロ原子が好ましい。アルキルは、置換アルキル基を含む。ここで、“置換アルキル基”は、上記するように、１つまたはそれより多い置換部分“Ｒ”を更に含むアルキル基を意味する。
ここで“アミノ基”または文法的に同等なものは、−ＮＨ２、−ＮＨＲおよび−ＮＲ２基を意味し、Ｒは、上記の通りである。
ここで“窒素原子”は、−ＮＯ２基を示す。
ここで“含硫黄部分”は、以下に限らないが、チア−、チオ−、およびスルホ−化合物、チオール(−ＳＨおよび−ＳＲ)、およびスルフィド(−ＲＳＲ−)を含む硫黄原子を含む化合物を意味する。ここで“含燐部分”は、以下に限らないが、ホスフィンおよびホスフェートを含む燐を含む化合物を意味する。ここで“含シリコン部分”は、シリコンを含む化合物を意味する。
ここで“エーテル”は、−Ｏ−Ｒ基を意味する。好ましいエーテルは、アルコキシ基を含み、−Ｏ−(ＣＨ２)２ＣＨ３および−Ｏ−(ＣＨ２)４ＣＨ３が好ましい。
ここで“エステル”は、−ＣＯＯＲ基を意味する。
ここで“ハロゲン”は、臭素、ヨウ素、塩素、またはフッ素である。好ましい置換アルキルは、ＣＦ３などのような部分的または完全にハロゲン化されたアルキルである。
ここで“アルデヒド”は、−ＲＣＨＯ基を意味する。
ここで“アルコール”は、−ＯＨ基、およびアルキルアルコール−ＲＯＨを意味する。
ここで“アミド”は、−ＲＣＯＮＨまたはＲＣＯＮＲ基を意味する。
ここで“エチレングリコール”または“(ポリ)エチレングリコール”は、−（Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２)ｎ−基を意味するが、エチレン基の各炭素原子はまた、上記のようにＲで単一でまたは二重に置換され得、すなわち、−(Ｏ−ＣＲ２−ＣＲ２)ｎとなり得る。酸素の代わりに他のヘテロ原子によるエチレングリコール誘導体(すなわち、−(Ｎ−ＣＨ２−ＣＨ２)ｎ−または−(Ｓ−ＣＨ２−ＣＨ２)ｎ−または置換基)もまた好ましい。
好ましい置換基は、以下に限らないが、−Ｏ−(ＣＨ２)２ＣＨ３および−Ｏ−(ＣＨ２)４ＣＨ３のようなメチル、エチル、プロピル、アルコキシ基およびエチレングリコールおよびそれらの誘導体を含む。
好ましい実施態様では、Ｙは、リンカー(Ｌ)の使用を介し核酸または他の部分に結合する。好ましくは、Ｌは、約１から約１０原子の短いリンカーであり、１から５原子が好ましく、アルケン、アルキニル、アミン、アミド、アゾ、イミン、オキソなどの結合を含み得るか含み得ない。リンカーは、当分野で既知であり、よく知られているように、例えば、ホモ−またはヘテロ−二機能リンカーである(1994 Pierce Chemical Company catalog, technical section on cross-linker, page 155-200引用により含める)。好ましいＬリンカーは、以下に限らないが、アルコキシ基(モノアルコキシ基およびジアルコキシ基)を含み、短いアルキル基が好ましく、アルキル基(置換アルキル基およびヘテロ原子部分を含むアルキル基を含む)を含み、短いアルキル基、エステル、アミド、アミン、エポキシ基およびエチレングリコールおよび誘導体が好ましく、プロピル、アセチレン、およびＣ２アルケンが特に好ましい。Ｚはまた、スルホン基であり、スルホンアミド連結を形成する。
この実施態様の特に好ましいフェロセン誘導体を図に示す。例えば、好ましいフェロセン誘導体は、以下に限らないが、ＣＴ１７０、Ｎ２３０、ＳＪ９、ＳＪ６３、Ｋ１６１、Ｎ２０４、ＳＪ４２、Ｎ２２１、ＣＴ１７１、ＣＴ１８６およびＳＪ２１を含む(列挙した化合物の化学的構造の図面参照)。
好ましい実施態様では、ＥＴＭは、特有のレドックス電位を示すフェロセンホスホラミダイトである。フェロセンホスホラミダイト誘導体の好ましい構造は、図に示し、構造Ｋ１６１およびＮ２０４を含む。
好ましい実施態様では、ＥＴＭは、図２０に示すようにフェロセン標識ジデオキシヌクレオチドトリホスフェートである。図２０に示す実施態様では、ＥＴＭは、リボース環または塩基から離れて結合し得る。
好ましい実施態様では、ＥＴＭは、特有の可逆性レドックス電位を示すポリピリジンＲｕ２＋誘導体である。核酸で見られるヘテロ環塩基の酸化および還元電位に基づき(Seidel, et al., J. Phys. Chem., 100: 4451 (1996); Steenken, et al., J. Am. Chem. Soc., 114: 4701, (1992); Steenken & Jovanovic, J. Am. Chem. Soc., 119: 617, (1997))、ポリピリジンＲｕ２＋誘導体は−６００ｍＶから６００ｍＶの範囲である。
好ましい実施態様では、[ｂｐｙ)３Ｒｕ]２＋および[(ｐｈｅ)３Ｒｕ]２＋(すなわち、１．２５Ｖ，)の高い酸化電位は、ポリピリジンリガンドの１つを陰性荷電リガンド(例えば、ヒドロキサメート、アセトアセテート)と置換することにより低下する(図参照)。金属イオンの結合のための同等原子を提供する。当業者が評価するように、コ−リガンドの数および性質は、同等数の金属イオンに依存する。モノ−、ジ−またはポリデンテートコ−リガンドを任意の位置で使用し得る。
レドックス電位の更なる良好な調節(fine-tuning)は、同等のリガンドの選択を介して行われ得る。ヒドロキサム酸の置換は、置換ビピリジンと組合せ、“調節した”レドックス電位との新規錯体を形成し得る。
アセチルアセトナトのような他のリガンドもまた、ポリピリジンＲｕ２＋誘導体のレドックス電位を調節するのに使用し得る。
適当なリガンドの他の例は、以下に限らないが、２つのカテゴリーに入るリガンド：同等原子(文献では一般的にシグマ(σ)ドナーと呼ばれる)として窒素、酸素、硫黄、炭素または燐原子を使用する(金属イオンに依存する)リガンドおよびメタロセンリガンド(文献では一般的にパイ(Π)ドナーと呼ばれ、ここではＬｍと示す)のような有機金属リガンドを含む。適当な窒素ドネーティングリガンドが当分野で既知であり、以下に限らないが、ＮＨ２；ＮＨＲ；ＮＲＲ’；ピリジン；ピラジン；イソニコチンアミド；イミダゾール；ビピリジンおよびビピリジンの置換誘導体；ターピリジンおよび置換誘導体；フェナントロリン、特に１,１０−フェナントロリン(ｐｈｅｎと略す)および４,７−ジメチルフェナントロリンおよびジピリドール[３,２−ａ：２',３'−ｃ]フェナジン(ｄｐｐｚと略す)のようなフェナントロリンの置換誘導体；ジピリドフェナジン；１,４,５,８,９,１２−ヘキサアザトリフェニレン(ｈａｔと略す)；９,１０−フェナントレンキノリンジイミン(ｐｈｉと略す)；１,４,５,８−テトラアザフェナントレン(ｔａｐと略す)；１,４,８,１１−テトラ−アザシクロテトラデカン(ｃｙｃｌａｍと略す)、ＥＤＴＡ、ＥＧＴＡおよびイソシアニドを含む。融合誘導体を含む置換誘導体もまた使用され得る。幾つかの実施態様では、ポルフィリンおよびポルフィリンファミリーの置換誘導体もまた使用し得る。例えば、Comprehensive Coordination Chemistry, Ed. Wilkinson et al., Pergammon Press, 1987, Chapters 13.2 (pp73-98), 21.1 (pp.813-898)および21.3(pp915-957)参照(引用により全て本明細書に含める)。
炭素、酸素、硫黄および燐を使用する適当なシグマドネーティングリガンドは当分野で知られる。例えば、適当なシグマ炭素ドナーは、Cotton and Wilkenson, Advanced Organic Chemistry 5th Edition, John Wiley & Sons, 1988(引用により本明細書に含める)；例えば、３８頁参照。同様に、適当な酸素リガンドは、クラウンエーテル、水および当分野に既知の他のものを含む。ホスフィンおよび置換ホスフィンもまた適当である；Cotton and Wilkensonの３８頁参照。
酸素、硫黄、燐および窒素ドネーティングリガンドは、ヘテロ原子が同等原子としての役割をするような方法で結合する。
好ましい実施態様では、有機金属リガンドを使用する。レドックス部分として使用の純粋の有機性化合物、およびヘテロ環状またはエキソ環状置換基のようなドナー原子とのδ結合有機性リガンドとの種々の遷移金属同等錯体に加えて、Π−結合有機リガンドを有する利用可能な多種多様の遷移金属有機金属化合物が存在する(Advance Inorganic Chemistry, 5th Ed., Cotton & Wilkinson, John Wiley & Sons, 1988, chapter26; Organometallics, A Concise Introduction, Elschenbroich et al., 2nd Ed., 1992, VCH; and Comprehensive Organometallic Chemistry II, A Review of the Literature 1982-1994, Abel et al. Ed., Vol. 7, chapters 7,8,10 & 11, Pergamon Press、引用により本明細書に含める)。その有機金属リガンドは、シクロペンタジエニドイオンのような環状芳香属化合物[Ｃ５Ｈ５(−１)]、およびビス(シクロペンタジエイル)金属化合物(すなわち、メタロセン)のクラスを生ずる、インデニリデ(−１)イオンのような種々の環置換および環融合誘導体を含む(例えば、Robins et al., J. Am. Chem. Soc. 104: 1882-1893 (1982); およびGassman et al., J. Am. Chem. Soc. 108: 4228-4229(1986)(引用により本明細書に含める))。もちろん、フェロセン[(Ｃ５Ｈ５)２Ｆｅ]およびその誘導体は、多種多様の化学的(Connelly et al., Chem. Rev. 96: 877-910 (1996)(引用により本明細書に含める))および電気化学的(Geiger et al., Advances in Organometallic Chemistry 23: 1-93; およびGeiger et al., Advances in Organometallic Chemistry 24: 87(引用により本明細書に含める))電極移動または“レドックス”反応で使用される原型的な例である。第一、第二および第三列遷移金属のメタロセン誘導体は、核酸のリボース環またはヌクレオシド塩基の何れかに共有結合されるレドックス部分として可能性ある候補である。他の可能性ある適当な有機金属リガンドは、ビス(アレーン)金属化合物を生ずるベンゼンのような環状アレーンを含み、ビス(ベンゼン)クロミウムのその環置換および環融合誘導体は、原型的な例である。アリル(−１)イオンまたはブタジエンのような他の非環状Π−結合リガンドは、可能性ある適当な有機金属化合物を生じ、他のΠ−結合およびδ−結合リガンドと関連するそのようなリガンド全ては、炭素結合に対し金属が存在する一般クラスの有機金属化合物を構成する。架橋有機リガンドおよび更なる非架橋リガンドを有し、ならびに金属−金属結合を有しおよび有さない種々のダイマーおよびオリゴマーのその化合物の電気化学的研究が、核酸分析での可能性ある候補レドックス部分である。
１つまたはそれより多いコ−リガンドが有機金属リガンドであるとき、当該リガンドは、一般的に、有機金属リガンドの１つの炭素原子を介し結合するが、結合は、ヘテロ環リガンドで他の原子を介し得る。好ましい有機金属リガンドは、置換誘導体およびメタロセンオーファンを含むメタロセンリガンドを含む(Cotton and Wilkensonの１１７４頁参照、上記)。例えば、メチルシクロペンタジエニルのようなメタロセンリガンドの誘導体(ペンタメチルシクロペンタジエニルのような複数のメチル基が好ましい)を使用し、メタロセンの安定性が増大し得る。好ましい実施態様では、メタロセンの２つのメタロセンリガンドのうちの１つのみが誘導される。
ここで記載するように、リガンドの任意の組合せが使用され得る。好ましい組合せは、ａ)すべてのリガンドが窒素ドネーティングリガンドである；ｂ)すべてのリガンドが有機金属リガンドである；およびｃ)伝導性オリゴマーの末端でのリガンドがメタロセンリガンドである；を含み、核酸により提供される当該リガンドは、窒素ドネーティングリガンドであり、必要ならば他のリガンドは窒素ドネーティングリガンドもしくはメタロセンリガンドか、または混合物の何れかである。
加えて、他の金属イオンは、Ｏｓ２＋ポリピリジン錯体のように使用し得る。
ここで記載のサンガーシーケンシング法で使用され得る４つのポリピリジンＲｕ２＋誘導体の好ましい実施態様が、図に示されている。ヘテロ環塩基にレドックス活性化Ｒｕ２＋錯体を結合するために使用するリンカーの長さの修飾は、ポリメラーゼ認識および電気泳動的移動性の最適化に使用し得る。
ポリピリジンＲｕ２＋ホスホラミダイト誘導体の好ましい構造体は、図に示される。
当業者に評価されるように、多くの方法が、本発明のＥＴＭを作成するように使用され得る。複数レドックス電位を有するフェロセン誘導体を作製する方法が図に示され、実施例中に記載される。一般的に、実質的な電子回収(electron withdrawing)である基がフェロセン部分のレドックス電位を増大させるために使用し得、その一方、実質的電子ドネーティングである基はレドックス電位を減少させるため使用され得る。
好ましい実施態様では、核酸およびＥＴＭの結合は、核酸のバックボーンへの結合を介して行われる。これは、リボース−ホスフェートバックボーンのリボース、またはバックボーンのホスフェート、または類似バックボーンの他の基への結合を含む多くの方法で行われ得る。
予備的な事項として、この実施態様での結合部分は、以下により十分に記載するように、３’または５’末端ヌクレオチド、内部ヌクレオチドに対するものであることを理解すべきである。
好ましい実施態様では、ＥＴＭは、リボース−ホスフェートバックボーンのリボースに結合する。これは、幾つかの方法で行い得る。当分野に知られるように、アミノ基、硫黄基、シリコン基、燐基およびオキソ基を有するリボースの２’または３’の何れかで修飾されるヌクレオシドが作製され得る(Imazawa et al., J. Org. Chem. 44: 2039(1979); Hobbes et al., J. Org. Chem. 42(4): 714 (1977); Verheyden et al., J. Orrg. Chem. 36(2):250 (1971); McGee et al., J. Org. Chem. 61: 781-785(1996); Mikhailopulo et al., Liebigs. Ann. Chem. 513-519 (1993); McGee et al., Nucleosides & nucleotides 14(6): 1329 (1995)(すべて引用により本明細書に含める))。次いで、これらの修飾ヌクレオシドはＥＴＭの付加に使用される。
好ましい実施態様は、アミノ修飾ヌクレオシドを利用する。次いで、これらアミノ修飾リボースは、ＥＴＭへのアミドまたはアミン連結を形成するために使用され得る。好ましい実施態様では、アミノ基は、直接、リボースに結合されるが、当業者に評価されるように、“Ｌ”としてここで記載されるもののような短いリンカーが、アミノ基およびリボースとの間に存在し得る。
好ましい実施態様では、アミド結合は、リボースへの結合に使用される。
好ましい実施態様では、複数電位を有するフェロセン誘導体は、ポスト合成法を用いる核酸に結合する。この実施態様では、ヌクレオシドは、ＮＨ２、ＯＨ、ホスフェートなどのような反応基で上記のように修飾される。好ましくは、修飾ヌクレオシド上の反応基は、共有結合を形成するリンカーを介するフェロセンに結合する活性基と反応し、それによって、修飾ヌクレオシドはリンカーを介してフェロセンに結合する。
好ましいポスト合成法は実施例および図に示される。
複数レドックス電位を有するポリピリジンＲｕ２＋誘導体を調製する方法は図に示され、実施例に記載されている。一般的に、モジューラーアプローチは、種々のコンポーネントが修飾され、相互に置き換わり得るため、ポリピリジンＲｕ２＋誘導体を合成するために使用する。例えば、以下のコンポーネントは、本発明のポリピリジンＲｕ２＋誘導体：(ａ)ビス置換Ｒｕ２＋前駆体(Ｒ２ｂｐｙ)２ＲｕＣｌ２；(ｂ)本明細書で記載されるような機能性リンカーを生ずる置換ヒドロキサム酸；および(ｃ)修飾ジデオキシヌクレオシド(チド）を合成するため使用する。
当業者が評価するように、特有レドックス電位を有するＥＴＭもまた、遺伝子型決定反応、特にＳＮＰ検出のために使用し得る。遺伝子型を決定する実施態様では、複数の細くプローブが特有レドックス電位を有する少なくとも１つのＥＴＭをそれぞれ用い作製する。これは、“二色”または“四色”の概念の競争ハイブリダイゼーションに類似し、ハイブリダイゼーションによるシーケンシングにまた類似する。例えば、ハイブリダイゼーションによるシーケンシングが、特に(Drmanc et al., Genomics 4: 114 (1989); Koster et al., Nature Biotechnology 14:1123(1996); 米国特許番号5,525,464; 5,202,231および5,695,940、に記載されており、それらは引用することによりすべて本明細書中に含まれる)。
好ましい実施態様では、複数のＥＴＭを有するプローブが、より感受性の検出限界を許容するように提供される。従って、複数のＥＴＭが好ましく、プローブあたり少なくとも約２つのＥＴＭが好ましく、少なくとも約１０が特に好ましく、少なくとも２０から５０が特に好ましく、ある例では、変化しえる多数のＥＴＭ(１００から１０００)が使用され得る。
好ましい実施態様では、ＥＴＭＳはフェロセンである。そのため、“マルチフェロセンプローブ”または“ポリフェロセンプローブ”を提供する。当業者が評価するように、当該プローブは本明細書で記載するような捕捉プローブであり得るか、または標識プローブ、アンプリファイアープローブ、充填リンカーまたはシグナルキャリアーを含む標識プローブを本発明に使用し得る。標識プローブ、アンプリファイアープローブなどの場合、例えば、１９９９年７月２７日出願のＵ.Ｓ.Ｓ.Ｎ.参照(引用によりすべて本明細書に含める)。
複数のＥＴＭを提供するプローブの他の配置は、１９９９年７月２７日出願のＵ.Ｓ.Ｓ.Ｎ.０９／６２６，０９６に開示する(引用によりすべて含める)。
好ましくは、水溶性マルチまたはポリフェロセンプローブが作製される。マルチフェロセンプローブを調製する方法は図２８Ａ−Ｉに示す。
好ましい実施態様では、単一塩基伸張(ＳＢＥ：時折、“ミニシーケンシング”という)は、検出位置での塩基の同定を決定するために使用される。簡単には、ＳＢＥは、検出位置に直接隣接する標的核酸にハイブリダイズする伸張プライマーを使用する技術である。ポリメラーゼ(一般的にはＤＮＡポリメラーゼ)は、ここで記載するようなＥＴＭで標識されるヌクレオチド類似体により３’末端プライマーを伸張するのに使用する。ヌクレオチドは、それが、検出位置で標的鎖中の塩基と相補的であるならば、増大する核酸鎖へ組み込まれるのみである。ヌクレオチドは、更なる伸張が生じえ、単一ヌクレオチドを付加するように、誘導される。一旦、標識ヌクレオチドが付加されると、ＥＴＭの検出は本明細書に記載のように行われる。
当業者が評価するように、検出位置の塩基の決定は、幾つかの方法で行い得る。好ましい実施態様では、当該反応は、本明細書で一般的に概略するように、それぞれ異なる標識、例えば、異なるレドックス電位を有するＥＴＭにより、すべての４つのヌクレオチドで行われる。他に、上記のような４つの電極パッドを用いることによりまたは連続反応により、単一標識が使用される；例えば、ｄＡＴＰはアッセイ複合体に加えられ得、評価するシグナルが生じる；ｄＡＴＰは除かれ、ｄＴＴＰを加えるなど。
当該反応は、標的配列を含むアッセイ複合体(すなわち、アレイ)を第一のヌクレオチド類似体を含む溶液に導入することにより開始される。本明細書中の“ヌクレオチド類似体”は、鎖を終止するように更に誘導される、デオキシヌクレオシド−トリホスフェート(デオキシヌクレオチドまたはｄＮＴＰ、すなわち、ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＣＴＰおよびｄＧＴＰ)を意味する。当該ヌクレオチドは、デオキシヌクレオチドのように天然に生じえるかまたは天然には生じ得ない。好ましい実施態様は、ジデオキシ−トリホスフェートヌクレオチド(ｄｄＮＴＰ)を利用する。一般的に、ｄｄＡＴＰ、ｄｄＣＴＰ、ｄｄＧＴＰおよびｄｄＴＴＰを含むヌクレオチドのセットを用いる。好ましい実施態様では、各類似体は、伸張産物のレドックス電位の検出がどの標識が含まれているかを示すように、異なるレドックス電位のＥＴＭで標識される。
加えて、当業者が評価するように、本発明の単一塩基伸張反応は、増加中の核酸鎖中へ修飾塩基の正確な組み込みを許容する。そのため、任意の数の修飾ヌクレオチドが、構造−機能関係(例えばＤＮＡ：ＤＮＡまたはＤＮＡ：タンパク質相互作用)のプロービング、核酸の切断、核酸の架橋、ミスマッチの組み込みなどを含む多くの理由のために組み込まれ得る。
最初のヌクレオチドに加えて、当該溶液はまた、伸張酵素、一般的にＤＮＡを含む。適当なＤＮＡポリメラーゼは、以下に限らないが、ＤＮＡポリメラーゼＩ、SEQUENASE 1.0およびSEQUENASE 2.0のKlenowフラグメント(U.S. Biochemical)、Ｔ５ ＤＮＡポリメラーゼおよびＰｈｉ２９ ＤＮＡポリメラーゼを含む。ＮＴＰが、伸張プライマーに隣接する標的配列の検出位置の塩基に相補的であるならば、当該伸張酵素は、それを、インターロゲーション(interrogation)位置で伸張プライマーに加えられる。そのため、当該伸張プライマーは、修飾プライマー(時折、“新規合成鎖”と呼ぶ)を形成するように修飾、すなわち、伸張される。望ましいならば、反応温度は、増幅が生じ、複数の修飾プライマーを生ずるように調節し得る(またはサイクルする)。
当業者に評価されるように、ＳＢＥシステムの配置は、幾つかの形態となり得るが、当該表面上の捕捉プローブに対する標的配列(当該サンプルの標的配列または当該アッセイで生ずる配列の何れか)のハイブリダイゼーションの結果として、表面上のアッセイ複合体、しばしば電極の形成を生じる。ここでより十分に概略するように、これは、１９９９年７月２６日に出願のＵ.Ｓ.Ｓ.Ｎ.０９／６２６，０９６に記載のような、直接または間接的(例えば、サンドイッチ型システムの使用を介する)なハイブリダイゼーションとなり得る。一旦、アッセイ複合体が形成されると、ＥＴＭの存在または非存在は、以下に記載および米国特許番号5,591,578; 5,824,473; 5,770,369; 5,705,348および5,780,234; Ｕ.Ｓ.Ｓ.Ｎ.08/911,589; 09/135,183; 09/306,653; 09/134,058; 09/295,691; 09/238,351; 09/245,105および09/338,726およびＰＣＴ出願WO98/20162; WO00/16089; PCT/US99/01705; PCT/US99/01703; PCT/US00/10903およびPCT/US99/10104(引用によりすべて本明細書に加える)に記載のように検出される。
一般的に、２つの基本的な検出機構が存在する。好ましい実施態様では、ＥＴＭの検出は、二重鎖核酸のスタック化Π−オービタルを介する電子移動に基づく。この基本的な機構は、米国特許番号5,591,578、5,770,369、5,705,348およびPCT/US97/20014に記載されており、ここでは“機構−１”と呼ぶ。簡単には、従前の働きにより、電子移動は二本鎖核酸のスタック化Π-オービタルを介し迅速に進み、有意には、一本鎖核酸を介しよりゆっくりと進み得ることが示された。そのため、電導オリゴマーを介する検出電極に結合する核酸にＥＴＭを付加(以下に記載する、ハイブリダイゼーションインディケーターの使用を介するハイブリダイゼーション複合体に、鎖の１つに共有結合的または非共有結合的の何れかで)することにより、核酸および伝導性オリゴマーを介する、ＥＴＭと電極との間の電極移動が検出され得る。
他に、ＥＴＭは、核酸を介する電子移動による必要なく、検出し得るが、むしろ、自己アセンブル化単層(ＳＡＭ)を含む電極で直接検出され得る；すなわち、ＥＴＭの電極は、シグナルを生ずるためスタック化Πオービタルを介して移動する必要はない。上記のように、この実施態様では、当該検出電極は、好ましくは、サンプル中のレドックス活性スピーシーズから電極を保護する役割をする自己アセンブル化単層(ＳＡＭ)を含む。この実施態様では、わずかな“欠損”を含むように調整されたＳＡＭの表面上のＥＴＭの存在(ここでは、時折、“マイクロコンデット”、“ナノコンデット”または“エレクトロコンデット”と呼ぶ)が直接検出され得る。この基本的な概念は、“機構−２”と呼ぶ。本質的に、エレクトロコンデットは、当該表面に特定のＥＴＭをアクセスさせ得る。この理論による結合なしでは、エレクトロコンデットの配置は、選択されたＥＴＭに一部依存することに注意すべきである。例えば、比較的疎水性のＥＴＭの使用は、効率的に親水性または荷電性のＥＴＭを排除するスピーシーズを形成する疎水性エレクトロコンデットの使用を許容する。同様に、ＳＡＭ中のより親水性または荷電性のスピーシーズの使用は、疎水性ＥＴＭを排除する役割をし得る。組成物、遺伝子型アッセイにおける使用のためのＳＡＭを作製および使用する方法は、１９９９年７月２６日出願のＵ.Ｓ.Ｓ.Ｎ.０９／６２６，０９６に記載されている(引用により本明細書に組み込む)。
上記システムは、アレイ型で特定の利用を見つける。すなわち、アドレス可能検出電極のマトリクスが存在する(一般的に、ここでは“パッド”、“アドレス”または“マイクロロケーション”と呼ぶ)。１９９９年７月２６日出願のＵ.Ｓ.Ｓ.Ｎ.０９／６２６，０９６参照(引用により本明細書に含める)。
ハイブリダイゼーション条件、反応条件の考察の場合、プローブを用いる標的配列を検出する方法は、固体サブストレート上にＥＴＭを含む。１９９９年７月２７日出願のＵ.Ｓ.Ｓ.Ｎ.０９／６２６，０９６参照(引用によりすべて本明細書に含める)。
ハイブリダイズ化ＳＢＥ生成物のアッセイ複合体を一旦作成すると、検出は、電子的開始により進む。ここで“アッセイ複合体”は、サンガーシーケンシング反応またはＳＢＥ遺伝子型決定反応から生ずるハイブリダイゼーション複合体から生ずるシーケンシングプローブの群を意味する。機構または理論により制限されることなく、検出は、ＥＴＭから電極へ電子の移動に基づく。
電子移動の検出、すなわち、ＥＴＭの存在は、一般的に、好ましい電圧により電子的に開始される。電位はアッセイ複合体に適用される。適用される電位の正確なコントロールおよび変化は、ポテンシオスタットおよび３つの電極システム(１つの参照、１つのサンプル(または作業)および１つのカウンター電極)または２つの電極システム(１つのサンプルおよび１つのカウンター電極)の何れかを介し得る。これは、ＥＴＭの選択に一部におよび使用する伝導性オリゴマーの一部に依存するシステムのピーク電位、単層の組成物および純度、およびどの型の電極を使用するか、に適用電位を適合させ得る。ここで記載の通り、フェロセンは好ましいＥＴＭである。
好ましい実施態様では、共還元剤または共酸化剤(集合的に、共酸化還元剤)を、更なる電子ソースまたはシンクとして使用する。一般的には、Sato et al., Bull. Chem. Soc. Jpn 66: 1032(1993); Uosaki et al., Electorchimica Acta 36: 1799 (1991); および Alleman et al.,J. Phys. Chem 100: 17050 (1996)参照(すべて引用により本明細書に含める)。
好ましい実施態様では、溶液中の入力電子ソースは、好ましくは、開始および検出が、ＤＣ電流を用いるかＡＣ周波数で行われるとき(拡散は制限されない)、電子移動の開始に使用され得る。一般的に、当業者が評価するように、好ましい実施態様は、最小の“ホール”を含む単層を利用し、それにより、当該システムの短回路(short-circuiting)が避けられる。これは、幾つかの一般的な方法で行い得る。好ましい実施態様では、入力電子ソースは、標識プローブのＥＴＭより低いかまたは同様のレドックス電位を有するように使用する。そのため、入力電子ソースのレドックス電位を越える電圧で、ＥＴＭおよび入力電子ソースは、酸化され、そのため、電子を付与(donate)し得る；ＥＴＭは電極に電子を付与し、入力ソースはＥＴＭに付与する。例えば、実施例に記載するような本発明の組成物に結合するＥＴＭは、水溶液(フェロセンが結合するもの、連結の手法および任意の置換基の存在に有意に依存して変化し得る)中でおおよそ２００ｍＶのレドックス電位を有する。フェロシアニド、電子ソースは、同様におおよそ２００ｍＶのレドックス電位を有する(水溶液中)。従って、おおよそ２００ｍＶの電圧またはそれを超える電圧では、フェロセンは、フェリセニウムに変換され、次いで、電子を電極へ移動する。現在、フェリシアニドは、ＥＴＭに電子を移動するように酸化され得る。この方法で、電子ソース(または共還元剤)は、電子ソース分子が迅速にそして繰返して電子を、核酸に結合するＥＴＭに付与するため、当該システム中で生ずるシグナルを増幅する役割をする。電子付与または受容(acceptance)の割合は、共還元剤の拡散の割合、共還元剤とＥＴＭとの間の電子移動(次に、濃度およびサイズによって影響される)などにより制限される。
他には、ＥＴＭより低いレドックス電位を有する入力電子ソースが用いられる。ＥＴＭのレドックス電位より低いが、電子ソースのレドックス電位よりも高い電圧で、フェロシアニドのような入力ソースは、酸化されることができず、そのため、ＥＴＭへ電子を扶養することができない；すなわち、電子移動は生じない。フェロセンが一旦酸化されると、電子移動の経路が存在する。
他の好ましい実施態様では、入力電子ソースは、標識プローブのＥＴＭよりも高いレドックス電位を有するように使用される。例えば、ルミノール、電子ソースは、おおよそ７２０ｍＶのレドックス電位を有する。ＥＴＭのレドックス電位より高いが、電子ソースのレドックス電位よりも低い電圧、すなわち、２００−７２０ｍＶでは、フェロセンは酸化され、単一の電子は、伝導性オリゴマーを介して電極に移動される。しかし、ＥＴＭは、電圧が、ルミノールのレドックス電位よりも低いため、ルミノール電子ソースから全く電子を受け取ることができない。しかし、次いで、ルミノールのレドックス電位でまたはそれより上の電位で、ルミノールは、電子をＥＴＭへ移動し、迅速および繰り返しの電子移動を許容する。この方法で、電子ソース(または共還元剤)は、電子ソース分子が電子を標識プローブのＥＴＭへ迅速および繰り返し付与するため、当該システムで生ずるシグナルを増幅する役割をする。
ルミノールは、酸化における化学ルミネセンススピーシーズとなる更なる利点を有し(Jirka et al., Analytica Chimica Acta 284: 345(1993)参照)、そのため、ＥＴＭから電極への電子移動の光検出を許容する。そのため、ルミノールが電極に直接接触できない限り、すなわち、電極への効率的な電子移動経路が存在しないようなＳＡＭの存在下で、ルミノールは、標識プローブ上でＥＴＭへ電子を移動することにより、酸化され得る。ＥＴＭが存在しないとき、すなわち、標的配列が本発明の組成物にハイブリダイズしないとき、ルミノールは有意に参加されず、光子放出は低くなり、そのため、ルミノールからのシグナルは(あるとしても)低くなる。標的の存在下では、多くの大きなシグナルが生ずる。そのため、光子放出によるルミノール酸化の測定は、電子を電極に付与するＥＴＭの能力の間接的な測定である。更に、光子検出は、一般的に、電子検出よりも感受性であるため、当該システムの感度が増大し得る。最初の結果は、ルミネセンスが過酸化水素濃度、ｐＨおよびルミノール濃度に依存し、その後者は非直線的となることを示す。
適当な電子ソース分子は、当分野に既知であり、以下に限らないが、フェリシアニドおよびルミノールを含む。
他に、出力電子アクセプターまたはシンクが使用され得、すなわち、電子を電極から受け取り、迅速および繰り返し電子を受け取る出力電子アクセプターにより、メタリセニウム(metallicenium)へ変換する、メタロセンのようなＥＴＭで、上記反応は逆に実施され得る。
単層の表面でＥＴＭの存在は、種々の方法で検出され得る。種々の検出方法が使用され得、以下に限らないが、蛍光、燐光、ルミネセンス、化学ルミネセンス、電子化学ルミネセンス、および屈折率を含む視覚検出(レドックス状態での変化におけるスペクトル変化の結果として)；以下に限らないが、アンペロメトリー、ボルタメトリー、キャパシタンスおよびインピーダンスを含む電子検出を含む。これらの方法は、ＡＣまたはＤＣ電流、パルス化方法、ロックイン技術、フィルタリング(ハイパス、ローパス、バンドパス)および時間分解蛍光を含む時間分解技術に基づく時間または周波数依存方法を含む。
１つの実施態様では、ＥＴＭから電極への電子の効率的移動は、ＥＴＭのレドックス状態でのステレオタイプ化変化を生ずる。ビピリジン、ピリジンおよびイミダゾール環を含むルテニウムの錯体を含む多くのＥＴＭにより、レドックス状態のこれらの変化は、スペクトル特性の変化と結びついている。吸収における有意な相違は、これらの分子の酸化状態と還元状態との間で観察される。例えば、Fabbrizzi et al., Chem. Soc. Rev. 1995 pp197-202参照。これらの相違は、スペクトロフォトメーターまたは単一のフォトマルチプライアーチューブデバイスを使用しモニターし得る。
この実施態様では、可能な電子ドナーおよびアクセプターは、光活性化または開始として上記列挙のすべての誘導体を含む。好ましい電子ドナーおよびアクセプターは、酸化および還元における巨大なスペクトル変化を特徴として有しており、電子移動の高度な感受性モニタリングを生ずる。その例は、好ましい例としてＲｕ(ＮＨ３)４ｐｙおよびＲｕ(ｂｐｙ)２ｉｍを含む。吸収によりモニターするドナーまたはアクセプターのみが理想的なスペクトル特性を有することを必要とする。
好ましい実施態様では、電子移動は、蛍光定量的検出される。ルテニウムによるものを含む多くの遷移金属錯体は、明確な蛍光特性を有する。そのため、核酸に結合する電子ドナーおよび電子アクセプターのレドックス状態の変化は、蛍光を用い、例えば、Ｒｕ(４,７−ビフェニル２−フェナントロリン)３ ２＋により、非常に感受性的にモニターし得る。この化合物の生産物は、標準的な蛍光アッセイ技術を用い容易に測定され得る。例えば、レーザー誘導性蛍光は、標準的シングルセル蛍光計、フロースルー“オンライン”蛍光計(クロマトグラフィーシステムに結合するようなもの)または９６−ウェルイムノアッセイとして市場に出ているものと同様なマルチサンプル“プレートリーダー”に記録され得る。
他に、蛍光は、溶液中の核酸プローブを伴うか、または光ファイバーへ連結する光ファイバーセンサーを用い測定され得る。蛍光は、フォトマルチプライアーチューブまたは光ファイバーに連結する他の光検出装置を用いモニターされる。このシステムの利点は、アッセイし得るサンプルの量が極端に少ないことである。
加えて、Molecular Dynamicsにより販売されているFluorImagerのようなスキャンニング蛍光ディテクターは、固体表面にアレイした修飾核酸分子の蛍光のモニタリングに理想的に適する。このシステムの利点は、数千の明確な核酸プローブで覆われたチップを一度に用いスキャンし得る、大多数の電子移動プローブである。
多くの遷移金属錯体が大きなストークシフトを有する蛍光を示す。適当な例は、ルテニウムのような遷移金属のビスおよびトリフェナントロリン錯体およびビスおよびトリスビピリジル錯体を含む(Juris, A., Balzani, V., et al., Coord. Chem. Rev., V. 84, p.85-277, 1988)。好ましい例は、効率的な蛍光(合理的に高量生ずる)および低い再編成エネルギーを示す。これらは、Ｒｕ(４,７-ビフェニル２-フェナントロリン)３ ２＋、Ｒｕ(４,４’−ジフェニル−２,２’−ビピリジン)３ ２＋および白金錯体を含む(Cummings et al., J. Am. Chem. Soc. 118: 1949-1960 (1996)(引用により本明細書に含める))。他に、ハイブリダイゼーションと関連する蛍光の還元は、これらのシステムを用い測定され得る。
更なる実施態様では、電子化学ルミネセンスは、電子移動検出に基づき使用される。Ｒｕ２＋(ｂｐｙ)３のような幾つかのＥＴＭを用い、直接のルミネセンスは、励起状態衰退（excited state decay）を付随する。この特性における変化は、核酸ハイブリダイゼーションとつながり、シンプルフォトマルチプライアーチューブアレンジメントでモニターされ得る(Blackburn, G.F. Clin. Chem. 37: 1534-1539(1991)およびJuris et al., 上記、参照)。
好適な実施形態においては、アンペロメトリ、ボルタメトリ、静電容量、およびインピーダンスを含む電子検出が行われる。好ましい技術として、これに限定されるわけではないが、エレクトログラヴィメトリ、クーロメトリ（制御電位クーロメトリおよび定電流クーロメトリを含む）、ボルタメトリ（周期ボルタメトリ、パルスボルタメトリ（正規パルスボルタメトリ、矩形波ボルタメトリ、差動パルスボルタメトリ、オステルヤング矩形波ボルタメトリ）、およびクーロン静電パルス技術））、ストリッピング分析（陽極ストリッピング分析、陰極ストリッピング分析、矩形波ストリッピングボルタメトリ）、導電性測定（電界による導電、直接的分析）、時間依存性電気化学的分析（クロノアンペロメトリ、クロノポテンショメトリ、周期クロノポテンショメトリ−アンペロメトリ、ＡＣポログラフィ、クロノガルバメトリ、クロノクーロメトリ）、ＡＣインピーダンス測定、静電容量測定、ＡＣボルタメトリ、および光電気化学が含まれる。
好適な実施形態においては、アンペロメトリ検出法を用いて、電子移動をモニタする。この検出方法は、件の標的遺伝子を含む試料において、核酸共役電極と基準（カウンタ）電極との間に電位を印加するステップを有する。試料内において標的核酸が存在するかしないかにより、電子移動に異なる影響が生じる。すなわち、標的核酸の有無、ひいては標識プローブの有無により、電流が変化し得る。
アンペロメトリ検出法を用いて電子移動を検出する装置は、通常ポテンショスタットである電圧電位制御手段を有する。この電圧は、標識プローブ上の電子供与錯体の電位に対して最適化される。可能性のある電子供与錯体は、好適には、鉄、オスミウム、プラチナ、コバルト、レニウム、およびルテニウムの錯体であり、最も好適には、鉄錯体である。
好適な実施形態においては、択一的な電子検出法が用いられる。例えば、ポテンショメトリ（またはボルタメトリ）測定法は、非誘導電流式の（正味電流でない）プロセスを含み、ｐＨおよび他のイオン検出において用いられている。同様のセンサを用いて、ＥＴＭと電極の間の電子移動をモニタする。さらに、絶縁体（抵抗）および導電体（導電性、インピーダンス、および静電容量）の他の特性を用いて、ＥＴＭおよび電極の電子移動を検出することができる。最後に、電流（電子移動など）を形成する任意の系は、同様に、微小磁場を形成し、いくつかの実施形態においては、この磁場をモニタしてもよい。
本発明の組成物において確認される高速の電子移動による１つの利点は、吸収、蛍光、および電流に基づいてモニタされた結果の信号ノイズ比を格段に改善できる点にある。本発明による高速電子移動に起因して、大きな信号、および電子移動の始まりと終わりの間の型通りの遅延が得られる。電子移動のパルス伝搬、「ロックイン」検出増幅器、フーリエ変換を用いることにより、特定の遅延信号を増幅する。
好適な実施形態において、交流法（ＡＣ）を用いて電子移動を励起させることができる。理論に拘束されることなく、電極に固着したＥＴＭは、一般に、抵抗器およびコンデンサを含む回路に印加されるＡＣ電圧に対して同様に反応する。抵抗器およびコンデンサとして振舞うこれらの錯体の特性を決定できる任意の方法を、検出根拠として用いることができる。驚くべきことに、ここに参考に一体のものとして統合されるLavironらのJ. Electroanal. Chem. 97:135 (1979)、およびLavironらのJ. Electroanal. Chem. 105:35 (1979)に具現化されたような従来式の電気化学理論によれば、ＥＡＣが極めて小さく（１０ｍＶ未満）、分子量が比較的に大きい場合を除いて、ここに開示される系は正確にモデル化されることはない。すなわち、ＡＣ電流（Ｉ）はLaviron方程式により正確に記述されない。これは、部分的には、この理論が電子の無限のソースとシンクを仮定しているという事実に起因しており、この系では当てはまらない。
これらの系をうまくモデル化するＡＣボルタメトリ理論は、ここに参考に一体のものとして統合されるO'ConnorらのJ. Electroanal. Chem. 466(2):197-202 (1999)に概説されている。これらの系を予見する方程式は、以下の方程式１で表される。
Figure 2005519630
 方程式１において、ｎはレドックス分子当たりの酸化電子数または還元電子数、ｆは印加周波数、Ｆはファラデ定数、Ｎtotalはレドックス分子の合計値、Ｅ0はレドックス分子の名目上の電位、Ｒは気体定数、Ｔはケルビン度で示す温度、ＥDCは電極電位を示す。このモデルは、実験データを非常にうまく適合させる。いくつかのケースにおいて、電流値が予想値より低いが、これはフェロセンの減成に起因することが分かっており、いくつかの手法により解消することができる。
加えて、誘導電流は、同様に、時間の関数として方程式２に示すように記述される。
Figure 2005519630
 ＩFは誘導電流、ｑeは単位電荷を示す。
しかし、方程式１は、電子移動速度および機器ファクタによる影響を考慮していない。電子移動速度は、印加された周波数に近いか、それより小さいとき、重要となる。したがって、真のｉACは、方程式３に示すように、３つすべての関数とする必要がある。
方程式３
ｉAC＝ｆ（ネルンストファクタ）ｆ（ＫET）ｆ（機器ファクタ）
これらの方程式を用いて、ＡＣ成分およびＤＣ成分の両方を有する入力信号を利用する系において、予想ＡＣ電流をモデル化し、推定することができる。上述のように、驚くことに、従来式の理論は、極めて低い電圧を除いて、これらの系をまったくモデル化しない。
一般に、不特定に拘束された標識プローブ／ＥＴＭは、ＥＴＭを含む標識プローブが正確な方位で固有に拘束された場合と比較して、インピーダンスにける差異（より高いインピーダンス）を示す。好適な実施形態において、不特定拘束材料は洗い流され、無限大の実効インピーダンスを与える。すなわち、ＡＣ検出法によれば、一般に以下に説明するように、感度の向上、および背景ノイズの排除機能を含むいくつかの利点が得られる。とりわけ、ＥＴＭを含む標識プローブの不特定拘束と、標的特定アッセイ複合体形成との間に生じるインピーダンス（例えば、バルクインピーダンスを含む）の変化をモニタすることができる。
したがって、ＡＣ励起検出法を用いたとき、この系の周波数反応は、ＥＴＭの存在の有無に応じて変化する。ここで「周波数反応」とは、電極およびＥＴＭの間に電子が移動した結果としての信号変化を意味する。この変化は、信号周波数に依存して異なる。周波数反応は、１つまたはそれ以上の周波数におけるＡＣ電流、位相シフト、ＤＣずれ電圧、および誘導電流インピーダンスなどを含む。
標的塩基配列および標識プローブを含むアッセイ複合体が生成されると、好適には、少なくとも（本発明の複合体を含む）試料電極およびカウンタ電極を介して、第１の入力電気信号が系に印加され、電極およびＥＴＭ間の電子移動を励起する。また三電極システムを用いることができ、このとき基準電極と作用電極に電圧が印加される。第１の入力信号は、少なくともＡＣ成分を有する。ＡＣ成分は、可変的な振幅および周波数を有する。一般的に、この方法に用いられる場合、ＡＣ振幅は、約１ｍＶから約１．１Ｖの範囲、好適には約１０ｍＶから約８００ｍＶの範囲、さらに好適には約１０ｍＶから約５００ｍＶの範囲で変化する。ＡＣ周波数は、約０．０１Ｈｚから約１００ＭＨｚの範囲、好適には約１０Ｈｚから約１０ＭＨｚの範囲、さらに好適には約１００Ｈｚから約２０ＭＨｚの範囲で変化する。
ＡＣ信号およびＤＣ信号を組み合わせて用いると、驚異的な感度および信号最大化を含むさまざまな利点が得られる。
好適な実施形態において、第１の入力信号は、ＤＣ成分およびＡＣ成分を含む。すなわち、試料電極および対抗電極の間のＤＣオフセット電圧は、ＥＴＭの電気化学的電位により掃引される（例えば、フェロセンが用いられた場合、スウィープ電圧は一般に０から５００ｍＶである。）。あるいは、作用電極が接地され、基準電極が０から−５００ｍＶに掃引される。スウィープ電圧を用いて、系の最大の反応が確認された時点でのＤＣ電圧を特定する。これは、一般に、ＥＴＭの電気化学的電位またはその付近である。この電圧が特定されると、スウィープ電圧または１つまたはそれ以上の均一のＤＣオフセット電圧のいずれか一方を用いることができる。約−１Ｖから約＋１．１ＶのＤＣオフセット電圧が好ましく、約−５００ｍＶから約＋８００ｍＶのＤＣオフセット電圧がさらに好ましく、約−３００ｍＶから約＋５００ｍＶのＤＣオフセット電圧がとりわけ好ましい。好適な実施形態においては、ＤＣオフセット電圧は零でない。ＤＣオフセット電圧の上に、可変振幅および可変振動数を有するＡＣ信号成分を付加する。ＥＴＭが存在し、ＡＣ振動に反応できる場合、電極およびＥＴＭ間における電子移動に起因したＡＣ電流が生じる。
定義された系に対して、単一の入力信号を印加することにより、ＥＴＭ核酸の存在（すなわち、標的塩基配列の存在）の有無を明確にすることができる。択一的には、複数の入力信号が印加される。ここで概説するように、これは、複数の周波数、複数のＤＣオフセット電圧、複数のＡＣ振幅、またはこれらのすべての組み合わせを含むさまざまな形態を取り得る。
すなわち、好適な実施形態においては、上述のようにＤＣ電圧により掃引することが好ましいが、複数のＤＣオフセット値が用いられる。これは、単一の周波数、または２つ以上の周波数で実施できる。
好適な実施形態において、ＡＣ振幅が変化する。理論に拘束されることなく、振幅を大きくすることは、駆動力を増大させることになると考えられる。すなわち、より高い過剰電位をもたらす大きな振幅により、電子移動速度がより速くなる。すなわち、一般に、任意の単一周波数におけるより高い過剰電位を用いることにより、同じ装置を使っても改善された反応（より強い出力信号）が得られる。系の電子移動速度を上げるために、高い振動数における振幅を増大させて、より良好な感度を得るようにしてもよい。さらに、これを用いて、例えば、最適な空間構成を有さないより遅い系における反応を誘導してもよい。
好適な実施形態において、少なくとも２種類の異なる振幅または過剰電位で、好適には複数の振幅で、この系を測定する。上述のように、振幅変化の結果として変化する反応により、塩基を同定し、系の較正および定量化を行うことができる。さらに、１種類またはそれ以上のＡＣ周波数を同様に用いることができる。
好適な実施形態において、ＡＣ周波数は変化する。異なる周波数において、異なる分子が異なる方法で反応する。当業者ならば理解されるように、周波数を上げると、一般に、出力電流が増大する。しかし、電子が電極およびＥＴＭの間を移動する速度より、周波数が速い場合、さらに高い周波数は、出力信号を喪失または低減する結果を生む。いくつかの点において、周波数がＥＴＭおよび電極の間の電子移動速度より高い場合、出力信号は同様に弱くなる。
１つの実施形態によれば、単一周波数における単一信号を１回測定して検出を行う。すなわち、標的塩基配列が存在せず、ＥＴＭを含む標識プローブが存在しない系の周波数反応は、とりわけ高い周波数で極めて低いものであると事前に判断することができる。この情報を用いると、特定の周波数における任意の反応は、アッセイ複合体の存在を示すことになる。すなわち、特定の周波数における任意の反応は、アッセイ複合体の特性である。つまり、単一の高周波入力を用いることだけが必要で、周波数反応における任意の変化は、ＥＴＭが存在し、標的塩基配列が存在することの指標となる。
さらにＡＣ技術を用いることにより、ＥＴＭ以外の存在に起因して、すなわち不必要な信号を「排除（locking out）」または「フィルタ処理（filtering）」することに起因して、任意の単一の周波数における背景信号を実質的に低減することができる。すなわち、溶液中の電荷キャリアまたはレドックス活性分子の周波数反応が、拡散係数および電荷移動係数により制限される。したがって、電荷キャリアは、電荷を電極に移動させるのに十分迅速に拡散することができず、そして／または電荷移動速度は十分に速くなることはない。良好な単分子膜が形成されず、部分的または不十分な単分子膜が形成され、溶媒が電極に影響されやすい実施形態において、これはとりわけ有用である。上述のように、ＤＣ技術においては、電極が溶媒に影響を受けやすい場合に「ホール（hole）」が存在すると、溶媒電荷キャリアがこの系を「短絡（short circuiting）」して電極に達し、背景信号を形成する。しかし、ＡＣ技術を用いると、溶液中の１つまたはそれ以上の電荷キャリアの周波数反応（単分子膜が存在するかどうか）を防止するように、１種類またはそれ以上の周波数を選択することができる。血液などの数多くの生物学的流体は、アンペロメトリ検出法と干渉し得る相当量のレドックス活性分子を含んでいるので、このことはとりわけ有用である。
好適な実施形態においては、少なくとも別個の２つの周波数、好適には複数の周波数で系を測定する。複数の周波数とは走査する場合を含む。例えば、ＡＣ電流である出力信号を、例えば１ないし２０Ｈｚの低周波入力信号で測定し、例えば１０ないし１００のｋＨｚにおける出力信号の反応と比較すると、ＥＴＭの存在の有無による周波数反応の差異が分かる。好適な実施形態において、周波数反応は、少なくとも２種類、好適には少なくとも約５種類、さらに好適には少なくとも約１０種類の周波数で特定される。
電子移動を励起する入力信号を伝播させた後、出力信号が受信または検出される。出力信号の存在および振幅は、入力信号の過剰電位／振幅、入力ＡＣ信号の周波数、介在する媒質の組成物、ＤＣオフセット値、系の環境、ＥＴＭの特性、溶液、および塩の種類と濃度を含む数多くのファクタに依存する。所与の入力信号において、出力信号の存在および振幅は、一般に、ＥＴＭの存在の有無、単分子膜の表面からのＥＴＭの配置位置および距離、および入力信号の特長に依存する。いくつかの実施形態においては、インピーダンスに基づいて、標識ラベルの不特定な拘束と、標識ラベルを含む標的特定アッセイ複合体の形成とを区別することができる。
好適な実施形態において、出力信号はＡＣ電流を含む。上述のように、出力電流の振幅は数多くのパラメータに依存する。これらのパラメータを変えることにより、数多くの手法で系を最適化することができる。
一般に、本発明において形成されるＡＣ電流は、約１フェムトアンペアから約１ミリアンペアの範囲、好適には約５０フェムトアンペアから約５００マイクロアンペアの範囲、とりわけ好適には約１ピコアンペアから約１マイクロアンペアの範囲にある。
好適な実施形態において、出力信号は、入力信号に対してＡＣ成分において位相のずれが生じる。理論に拘束されることなく、本発明の系は、十分に均一で位相のずれに基づく検出を行うことができる。電子移動が生じる本発明の生体分子複合体は、標準的な電子部品と同様、ＡＣ入力に対して均質に反応するので、位相のずれを特定することができる。これは、ＥＴＭの存在の有無、および／または標的特定アッセイ複合体の存在および系の構成要素に対する標識ラベルの不特定な拘束の間の差異を検出するための根拠として利用できる。
出力信号は、ＥＴＭの存在に関して特徴的であり、すなわち、出力信号は、標的プローブおよびＥＴＭを含む標的特定アッセイ複合体の存在に関して特徴的である。好適な実施形態において、検出の根拠は、アッセイ複合体が形成されることに起因する系の誘導電流インピーダンスにおける差異である。誘導電流インピーダンスは、電極とＥＴＭとの間の系が有するインピーダンスである。誘導電流インピーダンスは、２つの電極間のバルク溶液のインビーダンスであるバルクインピーダンスまたは誘電インピーダンスとはまったく異なる。バルクインピーダンスを変化させることのない数多くのファクタが誘導電流インピーダンスを変化させる。逆も成り立つ。すなわち、系の中に核酸を含むアッセイ複合体は、ＥＴＭおよび電極間の距離、それらの電気特性、介在する媒質の組成物などに依存する特定の誘導電流インピーダンスを有する。本発明の重要な点は、ＥＴＭを含む標識プローブが電極に特定して、または不特定に拘束されるかどうか依存して、ＥＴＭおよび電極間の誘導電流インピーダンスが実質的に異なるという点である。
したがって、本発明は、さらに、ＡＣ検出法を用いて核酸を検出する装置を提供する。この装置は、少なくとも第１の測定電極または試料電極と、第２の測定電極またはカウンタ電極とを有するテストチャンバを備える。同様に、三電極装置が有用である。第１および第２の測定電極は、テスト試料受容領域に接触し、液体テストサンプルが存在するとき、２つの電極は電気的に接触していてもよい。
好適な実施形態において、第１の測定電極は、固着リンカを介して共有結合した一本鎖拡散捕獲プローブと、ここで開示するような伝導性オリゴマを含む単分子膜とを有する。
この装置は、テストチャンバ、すなわち測定電極に電気的に接続されたＡＣ電源をさらに有する。好適には、このＡＶ電源は、ＤＣオフセット電圧も同様に供給することができる。
好適な実施形態において、この装置は、入力信号と出力信号を比較できるプロセッサをさらに有する。このプロセッサは、電極と接続され、出力信号を受信して、標的核酸の存在を検出できるように構成されている。
本発明の組成物は、さまざまな研究装置、医療装置、品質管理装置、またはフィールドテスト装置において利用することができる。
好適な実施形態において、このプローブを遺伝子診断において用いることができる。例えば、非ポリポシス性結腸癌の遺伝子、ＢＲＣＡ１肺がん遺伝子、さまざまな癌に関連する遺伝子であるＰ５３、アルツハイマ病のより高いリスクを示すＡｐｏＥ４遺伝子などの標的核酸を検出するために、ここに開示された技術を用いて、プローブを形成することができ、その結果、患者、嚢胞性繊維症遺伝子における突然変異、または当業者に広く知られた他の症状に対して発症前スクリーニングを容易に行うことができる。
別の実施形態において、本発明の複合体を用いて、ウィルスおよびバクテリアを検出することができる。この実施形態において、プローブは、さまざまなバクテリアおよびウィルスからの標的塩基配列を検出するように設計される。例えば、現在ある血液スクリーニング技術は、抗ＨＩＶ抗体の検出に基づいている。ここで開示される方法によれば、臨床試料を直接的にスクリーニングして、ＨＩＶ核酸塩基配列、とりわけ良好に保存されたＨＩＶ塩基配列を検出することができる。加えて、この方法によれば、抗ウィルス治療の効果を評価する改善された方法として、患者内を循環するウィルスを直接的にモニタすることができる。同様に、ヒトＴ細胞白血病ウイルスＩ型およびヒトＴ細胞白血病ウイルスII型に関連するウィルスをこのようにして検出することができる。同様に、リボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）を標的塩基配列として用いて、結核症、クリミジア、および他の性感染症などのバクテリア性伝染病を検出することができる。
好適な実施形態において、本発明の核酸は、水および食品の試料をスクリーニングする際、毒性バクテリアのためのプローブとして用いることができる。例えば、バクテリアを溶解して、核酸（特にｒＲＮＡ）を放出させるように試料を処理した後、これに限定されるわけではないが、病原性バクテリアサルモネラ菌、カンピロバクタ菌、ビブリオコレラ菌、リーシュマニア、大腸菌の腸毒素ストレイン、レジオネア症バクテリアなどを含むバクテリアストレインを認識するようにプローブを設計してもよい。同様に、本発明の組成物を用いて、生物学的治療を評価することができる。
さらなる実施形態において、プローブを法医学的な「ＤＮＡ指紋」として用い、被害者と被疑者から採取された試料に対する犯罪現場のＤＮＡを照合することができる。
さらなる実施形態においては、アレイ状のプローブを用いて、塩基配列を決定する。
以下の実施例は、上述の発明を利用する手法をより十分に説明するためのものであって、本発明のさまざまな態様を実施するための最善の形態を開示するためのものである。これらの実施例は、本発明の真の範囲を制限するためのものではなく、説明する目的で開示されたものであると理解されたい。ここに引用されたすべての文献は、ここに参考に一体のものとして統合される。
（実施例１）
（ピーク検出アルゴリズムの導出）
この検出システムにより生成される時間依存性の電流Ｉ（ｔ）は、ロックインアンプを用いて処理される。入力電圧（入力電圧は、ＤＣ傾き成分とｃシヌソイド成分とを含み、関数Ｖin(t)＝Ｖ0＋ｒｔ＋Ｅacsin(ω,t)で表される。）の４次高調波と同じ周波数を有する時間依存性の電流Ｉ（ｔ）が分析され(この方法は、ピーク検出のための強力なアルゴリズムを構成するブリックとしての役割をする。)、Ｒ(V)および位相ｅ(V)の項を用いて表現される。これらは、次の関係式により、Ｘ(V)成分およびＹ(V)成分に変形することができる。
Figure 2005519630
ここで、Ｒは電流ベクトルの振幅、φはＶの関数としての位相のずれ、そしてφは基準位相である。誘電信号がＸまたはＹとほぼ直交する場合のファイルにおいて、位相ずらすと、より良好な信号が得られることを我々は確認した。
明瞭なＸ(V)成分の典型例を示す概略図が図１に示されている。それは、静電容量性の背景電流の上に重畳された誘導電流信号としてモデル化される。図２は信号成分の概略図であり、図３は静電容量成分の概略図である。
電流のＸ(V)成分およびＹ(V)成分は、２つの適合曲線に近似させるように推定され、各成分は２つの関数の合計値として構成される。
Figure 2005519630
適合曲線（Ｆ1i(V)）の第１項は、変形ガウス分布（図４）の３次導関数である。これは、誘導電流信号（図２）の４次高調波をシミュレート（近似）する。第２項（Ｆ2i(V)）は、５次多項式であって、背景ノイズ（図３）を適合するために用いられる。（我々は、当初、３次多項式を用いたが、５次元の方が背景をはるかに良好に近似する。）
駆動振幅Ｅac＝１００ｍＶで測定された誘導電流ピークの４次高調波に対する良好な近似は、変形ガウス分布の３次導関数により与えられる。我々が利用する変形ガウス分布は、積分値を１とすることにより正規化条件を緩和する。
Figure 2005519630
方程式７の３次導関数は、次式で与えられる。
Figure 2005519630
変形ガウス分布の３次導関数（方程式８）は、３つのパラメータに依存する。Ａ０は信号の振幅を制御する。方程式８から分かるように、曲線の振幅はＡ１にも依存する。Ａ１は、振幅にも影響を与えるが、曲線の幅にも影響を与える。方程式９は、振幅に与えるＡ１の効果を示す。最後に、Ａ２は信号の中心または平均を示す。
我々はネルンスト分布の３次導関数を用いようとしたが、この分布の衛星ピークが「真の（実際の）」信号に見られるようなピークほど尖っていないという事実に起因して、この３次導関数による適合はあまりよくなかったということに留意する必要がある。
この式によれば、変形ガウス分布の３次導関数の中央ピークの最大振幅は、Ａ'の関数となり、次式で表される。
Figure 2005519630
この値は、変形ガウス分布の４次導関数が零となる点において、変形ガウス分布の３次導関数を解析することにより得られる。変形ガウス分布の４次導関数の零点は、次式で与えられる。
Figure 2005519630
 （これらは、変形ガウス分布の３次導関数の極値を与える位置である。）変形ガウス分布の４次導関数が図４に図示されている。
（実施例２）
（非線形レーベンベルク・マルカート（Levenberg-Marquardt）最適化法）
ピークファインダアルゴリズムは、方程式２により電流ベクトルのＸ(V)成分およびＹ(V)成分を適合させるＡxおよびＡyの最適組を検出する反復的手法である。Labviewは、「非線形レーベンベルク・マルカート最適化法」と呼ばれる最適化法を有し、所与のデータに対して、Ａの最適組を与える。この最適化法は、アルゴリズムを構成する基礎となる。
Ｘ(V)成分およびＹ(V)成分、並びに（２）に示す最適化曲線が与えられたとき、２つの誤差係数が次式で与えられる。
Figure 2005519630
標準偏差σは、データ組の点の重み付けを与え、通常は１に設定される。誤差係数が最小となるように、パラメータ（Ａ）の組が最適化される。これは、誤差係数の勾配が零となるときである。
Figure 2005519630
（１２）の勾配をテイラ級数に展開すると、我々は次の行列方程式を得る。
Figure 2005519630
 これは次式に表現できる。
Figure 2005519630
レーベンベルク・マルカート最適法は、収束を促進するために、行列の対角に対する無次元パラメータλを採用している。新しい行列は、次式で定義される。
Figure 2005519630
この方程式の系を、ニュートン・ラフソン（Newton-Raphson）反復法を用いて解く。この方法によれば、良好な初期推定値が与えられたとき、Ａの最適組に収束させることができる。これは、我々のアルゴリズムの基本ステップである。この方法に関するより詳細な説明は、「Ｃのための数値的処方」において参照できる。
（アルゴリズム）
このソフトウェアアプリケーションを用いて、任意のバージョンのDAQ-o-Maticにより生成された任意の４次高調波スキャンを読み取り、分析する。このアプリケーションは、スキャンが４次高調波スキャンでなければ、エラーコード(-111)を出力し、さらなる分析を行わない。ユーザは、アプリケーションにより分析できるように、定数画面において、スキャンの位置を（ミリボルト単位で）定義してもよいが、デフォルト値ですべてのスキャンを分析することができる。
データが読み込まれた後、アプリケーションは、Ｘに対する「良好な適合」を見出すように試みる。これに限定されるわけではないが、「真の」スキャンと「最適」スキャンの間の最小平均自乗誤差（ＭＳＥ）を含む数多くのパラメータにより、「良好な適合」であると判断される（弁別手法を参照されたい。）。現在のところ、アプリケーションは、最初に、Ｘを０度において適合することを試みる。これが「悪い」適合であれば（例えば、ＭＳＥが大きい）、アプリケーションは、Ｘを４５度において適合することを試みる。これも同様に「悪い」適合であれば、アプリケーションは、現在のところ、Ｘにおいて信号（ピーク）を検出することができず、ＩｐおよびＥ0を解くことができない。こうした状況において、アプリケーションは、エラーコード(-999)を出力し、さらなる分析を行わない。
Ｘに対する「良好な適合」が得られた場合、アプリケーションは、次に、Ｙに対する「良好な適合」を見出そうとする。そして、アプリケーションがＸおよびＹに対する「良好な適合」を同じ角度で見出すことができた場合に限って、ＩｐおよびＥ0を解くように処理を続行する。現在のところ、アプリケーションは、ＸおよびＹに対する「良好な適合」を同じ角度で見出すことができなかった場合、エラーコード(-999)を出力し、さらなる分析を行わない。
ＸまたはＹのいずれか一方に対して「良好な適合」であることを判断するためには、アプリケーションは、まず、適合アルゴリズムに用いられる９つの係数に対する初期推定値を定義する必要がある。初期推定値は、ＸおよびＹに対して、それぞれの角度で定義しなければならない。さらに、初期「推定値」は、元々のデータおよびガウス３次導関数の上述の特長に基づかなければならない。
（各位相におけるＸまたはＹの初期推定値）
特異値分解法（ＳＶＤ：Singular Value Decomposition）として知られる技術を用いて、初期５次多項式をデータに適合させる。「元々の」データ（すなわち、ＸまたはＹ）から多項式を差し引いた後、最初の点および最後の１０点をこの結果から取り除く。この曲線の最大値および最小値がガウス分布の中央ピークに対応し、この中央ピークが（１０）のＶ２およびＶ３で与えられると我々が推定したとき、変形ガウス分布の３次導関数の適合に対する初期推定値を得ることができる。
Figure 2005519630
 このアプリケーションの前のバージョンにおいては、我々は次の定数パラメータ値を用いたことに留意されたい。
Figure 2005519630
しかし、これらの定数の多項式係数は、あまりにも大きいことが証明され、この方法による収束を困難にしていることが分かった。さらに、こうした定数の初期パラメータを用いた場合、衛星ピークの１つを中央ピークと認識するという事実により、この方法はしばしば失敗した。この失敗は、次式を確認することにより検出することができる。
Figure 2005519630
（１８）を満足する場合、これは、最適化曲線の衛星ピークがガウス最適化曲線の振幅の４分の１以上、真のデータから離れていることを示す。これらの条件において、我々は次の２つのパラメータを定義した。
Figure 2005519630
 ここで、Ｄは（１０）から得られたものであって、変形ガウス３次導関数の２つの中央ピークの間の距離である。このとき、我々は、同一の初期条件で、次の新しい適合を得ようとした。
Figure 2005519630
この第２の適合が失敗するか、（１８）を満足しない場合、データに適合させるために第３組の初期条件が設定された。この第３組の初期条件は、Ａ0＝−１であること以外、第１組と同じものである。
上述の試みを行い、相当量の調査を行った後、５次元多項式を差し引いた「真の」データに基づいて初期「推定値」を定義する新しい技術（１６）は、（収束の速度および正確性の観点から）定数パラメータを用いた場合より格段に優れていることを、我々は確認した。
（弁別処理）
上述のように、数多くの判断基準が用いられ、計算された係数がＸまたはＹのいずれかに対して「良好な適合」を与えるかどうか判断する。この判断基準は、ＸおよびＹに対する特定の次元において適用されるが、（アプリケーションの次元において）次の通りである。
１）良好な適合のためには、「真の」データおよび最適値の間の差異が最小となるようにしなければならない。したがって、平均自乗誤差（ＭＳＥ）の項がデータ組のガウス成分の振幅（この値は、データから初期の５次多項式最適値を差し引いたときの最大値と最小値の間の差異を計算することにより得られる。）により重み付けされる場合、我々は重み付けが与えられたＭＳＥの項を計算する。
Figure 2005519630
 この重み付けされたＭＳＥ誤差は、０．００１未満である必要がある。そうでなければ、我々は、上述のように（１５および１６）、いくつかの係数をあらためて定義し、データを再度適合させる。
２）良好な適合のためには、ガウス項（Ａ1）の幅は、通常、１９および２０の間である。例えば、AB106(may99)から２９９のポジティブファイルを用いて実施された実験から、我々はＡ1に対する次の統計値を得た。
Figure 2005519630
 ここで、任意の適合が良好な適合として分類されるためには、Ａ1は１０より大きく、２０より小さいことが必要である。
３）適合が上記２つのテストに合格した場合、重み付けされたＭＳＥは、０．０１未満である必要がある。条件２または３のいずれか一方が不合格であれば、アプリケーションは、角度を（０°から４５°に）変えて、あらためて３つの判断基準を満足するかどうか試みる。上述のように、アプリケーションが０°および４５°において３つすべての判断基準を満足させることができなければ、ＩｐおよびＥ0を解くことはできない（エラーコード＝-999）。
４）ＸおよびＹに対して良好な適合が検出された場合（すなわち、ＸおよびＹに対する最適値が判断条件１ないし３を合格した場合）、アプリケーションは、２つの最終的な判断条件を与え、すなわち、Ｘに対する最適値とＹに対する最適値とを比較し、そしてＲに対する最適値と「真の」Ｒ（スキャン）とを比較する。Ｘに対する最適値とＹに対する最適値とを比較するために、アプリケーションは、ＸおよびＹに対する計算された（Ａ２xおよびＡ２ｙ）Ｅ0位置の差異を調べる。これら２つの値の差異の絶対値は、５０ｍＶより小さくなることが必要である。この値により、最適化アルゴリズムがＸまたはＹのいずれか一方において、データの中央ピークを衛星ピークに最適化していないことを保証するものである。変形ガウス曲線（４）の３次導関数の極値を有する位置により、ピーク間距離が与えられる。零点は（６）にある。留意すべきことに、平均Ａ1の値として１４．５が与えられたとき、中央ピーク間の通常の距離は７０ｍＶとなるので、Ｅ0間の差異の絶対値は５０ｍＶより大きくなることはない。
いくつかの実験を行った後、アプリケーションがＸまたはＹのいずれか一方において、「間違った」ピークに適合（「ロックイン」）させた場合、Ｅ0間の絶対的差異は５０ｍＶより大きくなることに我々は気付いた。例えば、Ｘが１８０ｍＶおよび２５０ｍＶでピークを有する場合、アプリケーションは、２２５ｍＶにおけるピークを最適化（検出）すると、Ｙに対するＥ0が１８０ｍＶであると検出したならば、Ｅ0間の絶対的差異が５０ｍＶより大きくなる。こういったケースに対処すべく、Ｅ0間の絶対的差異が５０ｍＶより大きくなった場合、我々は、（Ａ2だけ）シフト移動させ、反転させ（Ａ０＝−Ａ０）、そしてユーザ定義された予想されるＥ0から最も遠い信号（ＸまたはＹ）をあらためて適合させる。こうしたシフト移動は、予想されるＥ0の方向に行われる。移動および反転が最適化（重み付けされたＭＳＥ）を改善する場合、我々は、新たに検出された係数を用いる。さもなければ、先の係数に戻って、Ｅ0分離エラー（エラーコード＝-777）を報告する。
５）真のＲ（スキャン）とＲの最適値を比較するために、最適化に関するＲＭＳから求められるＩｐを計算する。
Figure 2005519630
 経験的分析から、我々は、この値が３．７０より大きくなければならないことを突き止めた。Ｉｐ／ＲＭＳが３．７０未満であるとき、アプリケーションはエラーコード-888を出す。
（ＩｐおよびＥ0の解法）
上述のように、このバージョンのアプリケーションは、ＩｐおよびＥ0（正の結果）を解くためには、ＸおよびＹの両方を最適化しなければならない。その理由は、Ｒの振幅が次式で定義されるためである。
Figure 2005519630
我々は、次式を用いて、ただ一方の成分（ＸまたはＹのみ）からＲの振幅を求めようとした。
Figure 2005519630
 しかし、位相シフトは極めてノイズが多く、我々の試み（２４）はうまくいかなかった。ＸおよびＹの両方を最適化すると、ピーク高さ（ＩｐまたはＧ'''max）および信号中心（Ｅ0またはＡ2）が次式で与えられる。
Figure 2005519630
アプリケーションがエラーなくＩｐおよびＥ0を計算することができる場合、交通信号は緑色となる。一方、アプリケーションがユーザ定義された「設定」（定数制御による緑色／黄色または黄色／赤色）の範囲内でこれらの値を計算することができない場合、交通信号は黄色または赤色となる。最終バージョンのアプリケーション（LevMar.exe,Version 1.00a1）は、自己インストール実行可能であるZ:/Shared/New Peak Finderに格納されている。
（出力ファイル）
このアプリケーションを用いて複数のファイルを解析する場合（バッチモード）、アプリケーションは、タブで境界設定されたスプレッドファイルシートに書き込む。見本のスプレッドファイルを図２に示す。このアプリケーションで処理された各ファイルのために、１つの列が設けられている。このスプレッドシートの各行は、ファイル名、スキャン日、サンプル説明、Ｉｐ、Ｅ0、エラーカラー、およびエラーコードとラベル付けされている。最初の３行は、ファイルヘッダから直接的に得られる。ＩｐおよびＥ0は、最適化曲線から背景曲線を差し引いて計算される。残りのものに関して、アプリケーションがスキャンを最適化できない場合、これらの値はＯおよびＮ／Ａとなる。エラーカラーとは、エラー交通信号指示器の色であって、エラーがなければ、常に緑色である。エラーが生じた場合（すなわち、アプリケーションがスキャンを最適化できない場合）、エラーカラーは、黄色または赤色である。最後に、エラーコードは、スキャンを処理している間に生じるエラーの種類を示す。現在のところ、可能性のあるエラーコードおよびその解釈は、次の通りである。
Figure 2005519630
エラーカラーが緑色である場合、エラーコードは常に零であり、その逆も成り立つことに留意されたい。さらに、エラーカラーが黄色または赤色である場合、エラーコードは常に零でない値である。最後に、任意のスキャンに対して、エラーカラーおよびエラーコードが形成された場合、ユーザはファイル毎にこれらのスキャンを再調査する必要がある。
Figure 2005519630
（実施例３）
（エラー解析、最適パラメータの統計的分布）
我々は、レーベンベルク・マルカート最適化プログラム4p-4th.viを用い、パラメータを制約することなく、プロトコルDc800-Cyp2dチップ(40c) 100hzからのデータを解析した。最適パラメータに関して統計的に説明する目的は、実際の信号と同様のランダムな特長を有する合成信号を形成するためである。
Figure 2005519630
（実施例４）
（ピークファインダアルゴリズムを用いた２電位シミュレーション）
我々は、一方がW97位置上に、他方がW97ピークの右側にある２つのピークを有する合成データファイルを作成した。第２のピークを「他方」という。dc800上のホモw97で確認された分布の後に、既知のＩｐ、ａ1、およびｅＯとともに、両方のピークが形成される（表１）。合成ピークは、ピークファインダを用いて形成され、計算されたＩｐを用いて、ピークファインダ構成の不確定性を推定する。各ピーク間隔および計算された他方のピークの標準偏差に対して、１００ファイルが無作為に作成された。ただ２つの電位だけが、レーベンベルク・マルカート最適化プログラム4p-4th.viに適用された。
我々は、９５％の確度の不確定性（２標準偏差）、および「他の」ピーク位置（w97 ｅＯ＝０．３８ｖとして）の関数としてのＩｐを示す。我々は、９つの場合分けを行った。
１）両方のＩｐが１に等しかった。ノイズレベル＝０
２）両方のＩｐが１に等しかった。ノイズレベル＝０．１
３）両方のＩｐが１に等しかった。ノイズレベル＝０．２
４）他方のＩｐ＝０．２，W97のＩｐ＝１，ノイズレベル＝０
５）他方のＩｐ＝１，W97のＩｐ＝０．２，ノイズレベル＝０
６）他方のＩｐ＝０．２，W97のＩｐ＝１，ノイズレベル＝０．１
７）他方のＩｐ＝１，W97のＩｐ＝０．２，ノイズレベル＝０．１
８）他方のＩｐ＝０．２，W97のＩｐ＝１，ノイズレベル＝０．２
９）他方のＩｐ＝１，W97のＩｐ＝０．２，ノイズレベル＝０．２
（結論）
２電位シミュレーションに関して
１）９０ｍＶの分離の後、両方のピークの不確定性は、はるかに小さくなる。９０ｍＶの分離において、不確定性は最小となる。これは、２電位間のとりわけ良好な分離である。また９０ｍＶは、信号の中央ピークおよび衛星ピークの間の距離でもある。これが、不確定性が最小となる理由かも知れない。
２）ノイズを有する信号は、より多くの不確定性を有する。
３）大きい信号の中にある小さい信号は、より多くの不確定性を有する。
４）他方の信号がより小さいとき、大きい信号はよりいっそう小さい不確定性を有する。
（実施例３）
（ピークファインダアルゴリズムを用いた４電位シミュレーション）
我々は、４つのピークを有する合成データファイルを１００の組作成した、このときパラメータは、平均および標準偏差を有するランダム正規分布に続く（図６参照）。
可能な時にいつでも、dc800実験上で検出された分布の後に、ａ１およびｅＯに関して、ランダムガウス分布を用いてすべてのピークが形成された。我々は、０ｍＶおよび５００ｍＶにおける電位に対する統計的データを有していないので、我々は、図６に示す値を用いた。Ｉｐの値はケースにより変化した。合成ピークはピークファインダを用いて検出され、計算されたＩｐを用いて、４つのピークのそれぞれに対してピークファインダ構成に対する不確定性を推定した。３つのシミュレーションを実行した。
１）４電位シミュレーション。このシミュレーションにおいて、０ｍＶおよび５００ｍＶにおけるピークがＩｐ＝１として形成された。形成されたＮ６およびＷ９７は、Ｉｐ＝０であった。我々は、プログラムが、実際にはそこにないが、どれほど大きいピークを呼び出すことができるかを推定することに最も興味を持った。
２）４電位シミュレーション、１ｐおよび３ｐをオンとし、２ｐおよび４ｐをオフとする。このシミュレーションにおいて、０ｍＶにおけるピークおよびＷ９７は、Ｉｐ＝１であった。形成されたＮ６および（５００ｍＶ）は、Ｉｐ＝０であった。我々は、プログラムが、実際にはそこにないが、どれほど大きいピークを呼び出すことができるかを推定することに最も興味を持った。
３）ピークサイズを増大させるための４電位シミュレーション。このシミュレーションにおいて、０ｍＶにおけるピークおよびＷ９７は、Ｉｐ＝１であった。形成されたＮ６および（５００ｍＶ）は、Ｉｐの範囲が０．１から１の間であった。我々は、Ｎ６および（５００ｍＶ）に対する絶対的な不確定性を推定することに最も興味を持った。
（１ｐおよび４ｐをオンとし、２ｐおよび３ｐをオフとする４電位シミュレーション）
我々は、Ｉｐ＝１であるピーク１およびピーク４、並びにＩｐ＝０であるピーク２およびピーク３を有する合成データファイルを形成した。４電位ピークファインダを実行させ、検出されたピークサイズは、図７および図８に図示されている。用いられたノイズレベルは、０％および１０％であった。不確定性を表３および表３Ａに示す。
Figure 2005519630
Figure 2005519630
我々は、Ｉｐ＝１であるピーク１およびピーク３、並びにＩｐ＝０であるピーク２およびピーク４を有する合成データファイルを形成した。４電位ピークファインダを実行させ、検出されたピークサイズは、図９および図１０に図示されている。用いられたノイズレベルは０％であった。不確定性を表４および表５に示す。
Figure 2005519630
Figure 2005519630
（結論）
４電位に対して実施されたシミュレーションから得られた結果が表６に要約されている。これらのシミュレーションは、２つのノイズレベル（０％および１０％）を示す。同様に、２つの構成がシミュレーションされた。第１には（１００１）、第１および第４電位のＩｐが１に等しく、第２および第３電位のＩｐが０に等しい。第２には（１０１０）、第１および第３電位のＩｐが１に等しく、第２および第４電位のＩｐが０に等しい。シミュレーションによれば、２つしか存在しないときに、最適化ルーチンを用いて、４電位を調整できるようにする場合に直面しがちなエラーを推定できる。
Figure 2005519630
主要な結論は以下のとおりである。
１）我々は、ノイズがなく、サイズが「１」である２つのピークを形成し、４つを検出しようと試みたとき、存在するピークは、元のピークサイズの１．４％までの９５％の確度に対する不確定性を有する。この不確定性は、それぞれの場合分けに対して、平均誤差および２標準偏差をＲＭＳ処理することにより計算される。
Figure 2005519630
２）我々は、ノイズがなく、サイズが「１」である２つのピークを形成し、４つを検出しようと試みたとき、存在しないピークは、元のピークサイズの４％（４％×１＝０．０４）までの９５％の確度に対する不確定性を有する。この不確定性は、それぞれの場合分けに対して、平均の平均および２標準偏差をＲＭＳ処理することにより計算される。
Figure 2005519630
２つのピークしかない実際のケースでは、それらが同じサイズとなることはほとんどない。９５％確度の不確定性を推定するために、存在する２つのピークの平均を取って、計算することができる。
３）我々は、（２ｎＡの信号のノイズレベルと同様の）ノイズレベルが０．１で、サイズが「１」である２つのピークを形成し、４つを検出しようと試みたとき、存在するピークは、元のピークサイズの５．３％までの９５％の確度に対する不確定性を有する。この不確定性は、それぞれの場合分けに対して、平均誤差の平均および２標準偏差をＲＭＳ処理することにより計算される。
Figure 2005519630
４）我々は、ノイズレベルが０．１で、サイズが「１」である２つのピークを形成し、４つを検出しようと試みたとき、存在しないピークは、元のピークサイズの７．８％（７．８％×１＝０．０７８）までの９５％の確度に対する不確定性を有する。この不確定性は、それぞれの場合分けに対して、平均の幾何学的平均および２標準偏差を取ることにより計算される。
Figure 2005519630
（ピークサイズを増大させるための４電位シミュレーション）
我々は、Ｉｐ＝１であるピーク１（０ｍＶ）およびピーク３（ｗ０７）、並びにＩｐが０．１ないし１の範囲にあるピーク２（Ｎ６）およびピーク４（５００ｍＶ）を有する合成データファイルを作成した。４電位ピークファインダを実行して、検出されたピークサイズを図１１に示す。用いられたノイズレベルは、１０％であった。ランダムパラメータに対する分布は、先のシミュレーションで用いられたものと同じである（図６）。
Ｎ６および５００ｍＶ電位の実際のピークはＸ軸上に表され、検出された平均ピークはＹ軸上に表される。エラーバーは、１００組の２標準偏差または９５％確度の不確定性を表す。このシミュレーションにおいて、（０ｍＶ）およびＷ９７は、実際にはＩｐ＝１である。そして検出されたピークは、常に１に近かった。（０ｍＶ）電位の不確定性は、常に０．０５に近かった。同様に、Ｎ６、ｗ９７、（５００ｍＶ）電位の不確定性は、それぞれ０．０６、０．０４３、および０．０３９であった。表７は、図１１と同じ情報を示す。
Figure 2005519630
同様に図１１において、プロトコルcf-dc844-93Hzに関するＷＳ１４５からの実験データが示されている。表８上のチップ情報は次のとおりである。
低電位を有するＳｐのテスト方法
ＷＳ１４５：チッププラン
ハイブリダイゼーション（ＨＹＢ）緩衝液：
Figure 2005519630
 各管にハイブリダイゼーション緩衝液を８０μｌ加え、対応する各管にTM_H20を４０μｌ加える。
使用機器：esensor 4800 (ID#103026)
Data/hydra/cf-dc844-93HzR117h/Into8/Ex10/R560/G551d/Feb/05/02/wenmeishi Chip DC857に記録されたデータを用いて、Javierの手助けにより、１次高調波、２次高調波、３次高調波、および４次高調波においてスキャンされた。
Figure 2005519630
我々は、実験WS145からの陽性パッドを、存在する電位に依存して、５つのカテゴリに分類した。図１２は、実際のピークと比較した、プログラムにより導かれた実際的でないピークの相対的サイズを示す。式２で計算される９５％の確度に対する相対的な不確定性を表９に示す。
Figure 2005519630
（結論）
１）シミュレーション（図１１上のエラーバー）に対する絶対的不確定性は、特定の標識に関して極めて類似しており、実際のＩｐとはほとんど無関係である。
２）シミュレーションによれば、Ｎ６は、おそらくは２つの理由により、５００ｍＶにおける電位よりも不確定性が大きい。Ｎ６が２つの他方のピークに挟まれているのに対し、５００ｍＶにおける電位は、一方に接近しているだけに過ぎない。第２に、５００ｍＶにおける電位は、Ｎ６がＷ９７から離れている以上に、Ｗ９７または０ｍＶにおける電位から離れているためである。
３）４つの標識に対するシミュレーションの絶対的な不確定性は、一貫して、０．０６または６％以下である。
４）実験WS145はシミュレーションと一致しており、プログラムがそこにはないピークを検出したとき、検出されたＩｐは、一貫して、現実のピーク７．５％（６％に近い）の平均と一致する。
実施例４
複数レドックス電位によるフェロセン誘導体の調製
モノアルコキシ基を伴うアルコキシフェロセン誘導体
図１４は、ＣＴ１７０を合成するためのスキームを示す。
ＣＴ１７０の合成。ジクロロメタン(３０ｍＬ)中のＣＴ１６９(０．８６ｇ、１．３５ｍｍｏｌ)の溶液中にＣ９６(２３０ｍｇ、１．３５ｍｍｏｌ)を加えた。当該混合物を０℃に冷却し、Ｎ,Ｎ,Ｎ'Ｎ'−テトライソプロピルアミノ、２−シアノエトキシホスファン(１．３ｍＬ、１．２２ｇ、４．０５ｍｍｏｌ)を加えた。当該反応混合物を室温にまで温め、２時間室温で攪拌した。当該混合物をジクロロメタン６０ｍＬ中に希釈し、ウェイスターで３回抽出し、硫酸ナトリウムで乾燥させ、濃縮した。粗生成物を、ヘキサン中の１％ＴＥＡを充填したシリカゲルカラムで精製し、ヘキサン中の１％ＴＥＡおよび５−１５％酢酸エチルで抽出し、黄色の粘着性オイルとして望ましい産物ＣＴ１７０を得た(０．９２ｇ、８１％)。当該産物をアセトニトリル中に溶解させ、０．２５μｍフィルターでろ過し、次いで、濃縮した。元素分析。Ｃ４６Ｈ５７Ｎ２Ｏ７ＰＦｅの計算値：８３６．３３。実測値：８３６。
ジアルコキシ基を伴うアルコキシフェロセン誘導体
図１５は、ジアルコキシ基で置換された幾つかのアルコキシフェロセン誘導体の合成の合成スキームを示す。
Ｎ２２５の合成。水(６００ｍＬ)中のトルエンスルフィン酸(１７５．０ｇ、０．９８ｍｏｌ)の溶液に、冷メタノール中の臭素をゆっくりと、オレンジ色が持続するまで加えた。よりトルエンスルフィン酸溶液を加えると、その色はオレンジ色からわずかに黄色く変化した。当該沈殿をろ過し、水で洗浄した。当該固体を、ジクロロメタンを伴う短いシリカゲルカラムに通した。当該粗生成物を、シリカゲル３００ｇのカラムで精製し、ジクロロメタンで溶出させ、Ｎ２２５(６９％)１３４．６ｇを生じた。1H NMR (300 MHz, CDCl3) 7.87 (d, 2H), 7.30 (d, 2H), 2.49 (s, 3H)
Ｋ１６４の合成。エチルエーテル(１Ｌ)中のフェロセン(３０．０ｇ、０．１６ｍｏｌ)の溶液に、ｎ−ブチルリチウム(ヘキサン中、１．６Ｍ ２２０ｍＬ)およびテトラメチルエチレンジアミン(２７．０ｍＬ、０．１８ｍｏｌ)を加え、当該溶液を、１０分間アルゴンで浄化し、次いで、室温で一夜攪拌した。当該混合物を−７８℃に冷却し、Ｎ２２５(９０．０ｇ、０．３８ｍｏｌ)を加えた。当該反応混合物をこの温度で１時間維持し、次いで、ゆっくりと室温まで温め、更に３０分攪拌し、その後、水３０ｍＬでクエンチした。当該混合物をろ過し、当該固体をヘキサンで数回抽出した。合わせた有機層を水で抽出し、硫酸ナトリウムで乾燥させ、濃縮した。当該粗生成物を、シリカゲル４００ｇのカラムで精製し、ヘキサンで抽出し、望ましい生成物Ｋ１６４(４０．０ｇ、７２％)が提供された。当該生成物は、更に、メタノールによる再結晶により精製し得る。GC/MS: m/e 346 (30), 344 (63), 342 (36), 128 (100), 102 (13)
ＣＴ４６の合成。エタノール(１Ｌ)中のＫ１６４(２０．０ｇ、５９．２ｍｍｏｌ)の溶液に、酢酸銅(II)(５８．０ｇ、０．２９ｍｏｌ)を加え、当該混合物をアルゴンにより１０分間浄化した。当該反応物は、４０分間還流で加熱し、次いで、室温に冷却した。当該混合物をエチルエーテルで数回抽出した。有機層を水、ブラインで洗浄し、乾燥させ(ＮａＳＯ４)、濃縮した。当該粗生成物を、ヘキサン中の１％ＴＥＡ中で充填したシリカゲル２００ｇのカラムで精製し、ヘキサン中の５−１０％酢酸エチルで抽出し、ＣＴ４６(８．２ｇ、４６％)を生じた。GC/MS: m/e 348 (100), 311 (10), 183 (26), 128 (46)
Ｎ２２７の合成。ジクロロメタン(１５ｍＬ)中のＣＴ４６(１．０ｇ、３．３ｍｍｏｌ)の溶液に、塩化ブロモブチリル(０．５６ｍＬ、５．０ｍｍｏｌ)および塩化アルミニウム(１．３２ｇ、１０．０ｍｍｏｌ)を加え、当該反応物を室温に３０分間維持させ、次いで、水中の５％冷ＮａＯＨ中にクエンチした。当該混合物はエチルエーテルで抽出し、合わせた有機層を水で抽出し、硫酸ナトリウムで乾燥させ、濃縮した。当該産物を、更に精製することなく次の反応に使用した。GC/MS: m/e 370 (39), 328 (19), 286 (100), 207 (42), 179 (12)
Ｎ２２４の合成。トルエン中のＮ２２７(１２．０ｇ、２６．７ｍｍｏｌ)の溶液に、亜鉛(１８０ｇ)、塩化水銀(１８ｇ)および水(３５０ｍＬ)を加え、次いで、濃ＨＣｌ３５０ｍＬをゆっくりと加えた。当該混合物を室温で３５分間攪拌し、次いでろ過した。当該水層をヘキサンで３回抽出し、合わせた有機層を水、ブラインで洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥させ、濃縮した。粗生成物を、ヘキサンの１％ＴＥＡ中で充填したシリカゲル２００ｇのカラムで精製し、ヘキサン中の５−１０％酢酸エチルにより抽出し、望ましい生成物Ｎ２２４(８．０ｇ、７７％)を生じた。GC/MS: m/e 438 (25), 436 (26), 396 (27), 394 (29), 354 (93), 352 (100), 272 (20), 179 (25)
Ｎ２１９の合成。ジオキサン(９０ｍＬ)およびメタノール(１０ｍＬ)の混合物中のＮ２２４(８．０ｇ、１８．３ｍｍｏｌ)の溶液をアルゴンで１０分間浄化した。次いで、当該混合物に、水(２１ｍＬ)中のＮａＯＨ(３．６８ｇ、９２．０ｍｍｏｌ)の溶液を暗闇で加えた。当該混合物を室温で１０分間攪拌し、次いで、ヨー化メチル(１１．２ｍＬ)を加え、当該反応混合物を３時間室温で攪拌した。そして更なる水５０ｍｌを当該混合物中に加え、それをヘキサンで数回抽出した。合わせた有機層を水で抽出し、硫酸ナトリウムで乾燥し、濃縮した。粗生成物を、ヘキサン中の１％ＴＥＡ中に充填したシリカゲル２００ｇのカラムで精製し、１−２％酢酸エチル／ヘキサンで抽出し、望ましい生成物Ｎ２１９(５．０ｇ、７２％)を得た。1H NMR (300 MHz, CDCl3) 4.08 (m, 4H), 3.81 (m, 3H), 3.64 (d, 6H), 3.40 (t, 2H), 2.23 (t, 2H), 1.87 (m, 2H), 1.62 (m, 2H). GC/MS: m/e 382 (92), 380 (100), 300 (64), 149 (23), 121 (26)
Ｎ２２８の合成。ＤＭＦ(８０ｍＬ)中の１,３−ｄｉＤＭＴグリセロール(１７．７６ｇ、２５．５ｍｍｏｌ)の溶液に、ＮａＨ(ミネラルオイル中６０％、１．０２ｇ、２５．５ｍｍｏｌ)を加えた。当該混合物を室温で１５分間攪拌した後、ＤＭＦ(２０ｍＬ)中のＮ２１９(４．８４ｇ、１２．７４ｍｍｏｌ)の溶液を加え、反応混合物を室温で一夜攪拌した。当該混合物を酢酸エチル７００ｍＬで希釈し、次いで、水で抽出した。有機層を硫酸ナトリウムで乾燥させ、濃縮した。粗生成物を、ヘキサン中の１％ＴＥＡ中で充填したシリカゲル２５０ｇのカラムで精製し、ヘキサン中の１％ＴＥＡおよび１０−２０％ジクロロメタンにより溶出し、望ましい生成物Ｎ２２８(７．０ｇ、５４％)を生じた。1H NMR (300 MHz, CDCl3) 6.76-7.30 (m, 26H), 4.08 (broad, 4H), 3.80 (m, 15H), 3.61 (m, 7H), 3.50 (t, 2H), 3.22 (m. 4H), 2.20 (broad, 2H), 1.58 (m, 4H); 元素分析。C61H64FeO9の計算値: 996 実測値: 996
Ｎ２２９の合成。ジクロロメタン(４００ｍＬ)中のＮ２２８(７．０ｇ、７．０３ｍｍｏｌ)の溶液に、ジクロロメタン(１００ｍＬ)中のトリクロロ酢酸(１．１５ｇ、７．０３ｍｍｏｌ)を加え、当該混合物を室温で３分間攪拌し、ＴＥＡ１０ｍＬおよびメタノール４０ｍＬでクエンチした。当該混合物を水で抽出し、硫酸ナトリウムで乾燥させ、濃縮した。粗生成物を、ヘキサン中の１％ＴＥＡ中に充填したシリカゲル２５０ｇのカラムで精製し、ヘキサン中の１％ＴＥＡおよび１０−３０％酢酸エチルで溶出させ、望ましい生成物Ｎ２２９(１．７ｇ、消費した出発物質に基づき７１％)および回収した出発物質(３．３ｇ)を生じた。1H NMR (300 MHz, CDCl3) 6.76-7.30 (m, 13H), 4.05 (broad, 4H), 3.30-3.81 (m, 18H), 3.22 (m, 4H), 2.01 (m, 2H), 1.58 (m, 4H); 元素分析。C40H46FeO7の計算値: 694. 実測値: 694
Ｎ２３０の合成。ジクロロメタン(２０ｍＬ)中のＮ２２９(１．７ｇ、２．６２ｍｍｏｌ)の溶液に、ＤＩＰＥＡ(２．２７ｍＬ、１３．１０ｍｍｏｌ)およびＣ９６(０．９０ｇ、５．２４ｍｍｏｌ)を加えた。当該混合物を０℃に冷却し、Ｎ,Ｎ,Ｎ'Ｎ'−テトライソプロピルアミノ、２−シアノエトキシホスファン(２．１６ｍＬ、６．５４ｍｍｏｌ)を加えた。当該反応混合物を室温にまで温め、２時間室温で攪拌した。当該混合物をジクロロメタン８０ｍＬで希釈し、ウェイスターで３回抽出し、硫酸ナトリウムで乾燥させ、濃縮した。当該粗生成物をヘキサン中の１％ＴＥＡ中に充填したシリカゲル８０ｇのカラムで精製し、ヘキサン中の１％ＴＥＡおよび５−１５％酢酸エチルにより抽出し、望ましい生成物Ｎ２３０(１．５ｇ、７５％)を生じた。当該生成物をアセトニトリル中に溶解し、０．２５ｕｍフィルターでろ過し、次いで濃縮した。ＤＮＡシンセサイザーからのＮ２３０の結合効率は９６％であった。1H NMR (300 MHz, CDCl3) 6.70-7.30 (m, 13H), 4.18 (broad, 4H), 3.50-3.80 (m, 24H), 3.16 (d, 2H), 2.50 (m, 4H), 1.58 (m, 4H), 1.10 (m, 12H). 元素分析。C49H63N2O8Pfeの計算値: 894. 実測値: 894
モノハロゲン化フェロセン誘導体
図１６ＡからＣは、下記のモノハロゲン化フェロセン誘導体の合成の種々の合成スキームを示す。
ＣＫ７１の合成。乾燥ＴＨＦ３６０ｍＬ中のフェロセン７１．１ｇ(０．３８モル)の溶液を０℃に冷却した。ペンタン(２２５ｍＬ、０．３８モル)中のtert-ブチルリチウムの１．７Ｍ溶液を滴下し、当該混合物を１０分間０℃で攪拌し、４０分間に渡り室温にまで温めた。当該混合物を−７８℃に冷却し、ホウ酸トリブチル１２３ｍＬ(１０５ｇ、０．４５モル)を滴下した。−７８℃で１０分後、当該反応混合物を室温にまで温め、２時間攪拌した。次いで、当該溶液を０℃に冷却し、当該反応物を、水中の５％(v/v)濃ＨＣｌ１８０ｍＬの添加によりクエンチした。エーテル(２５０ｍＬ)を加え、当該混合物をセライトでろ過した。有機層を分離し、水層をエーテルで抽出した。合わせた有機層をブラインで洗浄し、褐色オイルに濃縮した。粗生成物をシリカゲルパッドのパッドろ過で精製し、ヘキサンで抽出し、非反応のフェロセンのみを生成し、その後、ヘキサン中の５０％酢酸エチルで溶出し、フェロセンボロン酸エステルの混合物としてＣＫ７１ ４０．６ｇを得た。
ＣＴ４５の合成。５０℃に加熱した、トルエン１００ｍＬ、メタノール２５０ｍＬ、および水５００ｍＬの混合物に、臭化銅(II)３７．９ｇ(０．１８モル)を加えた。エーテル中のCK７１(１３．４ｇ)の溶液を加え、当該混合物を、５０℃と７０℃との間の温度で維持しつつ、３０分間激しく攪拌した。３０分間後、当該混合物を室温まで冷却し、エーテルで抽出した。当該粗生成物を濃縮し、シリカゲルのパッドでろ過し、ＧＣ−ＭＳで１％フェロセン未満を含む精製CT４５(６．１ｇ、０．１０モル)を生成した。GC-MS: m/e 266.9 (13), 265.9 (89), 264.9 (15), 263.9 (100), 185.0 (12), 184.0 (74), 136.8 (11), 134.8 (12), 128.1 (69), 127.1 (14), 121.0 (15), 56.0 (36)
ＣＴ１６０の合成。乾燥ＤＣＭ２５０ｍＬ中のＣＴ４５ １０．７ｇ(４０．５ｍｍｏｌ)の溶液に、４−ブロモブチリルクロリド７．０ｍＬ(１１．３ｇ、６０．８ｍｍｏｌ)を加えた。当該溶液を０℃に冷却し、塩化アルミニウム８．１ｇ(６０．８ｍｍｏｌ)を一度に加えた。当該混合物を０℃で攪拌し、ＧＣ−ＭＳでモニターした。２５分後、出発物質は消え、その反応物を、冷および５％水性ＮａＨＣＯ３ ４００ｍＬ中に注ぐことによりクエンチした。水層のｐＨを４Ｍ水性ＮａＯＨで約７に調節し、ＤＣＭ層を分液漏斗で除去した。水層を、２５％酢酸エチル／７５％ヘキサン ２×２００ｍＬで抽出した。合わせた有機層を５％水性ＮａＨＣＯ３ １００ｍＬおよび水１００ｍＬで抽出し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥し、ろ過し、濃縮した。粗生成物をシリカパットでろ過し、濃縮し、精製ＣＴ１６０ １６．６ｇ(４０ｍｍｏｌ；９９％収率)を生じた。1H NMR (CDCl3): δ 4.83 (t, 2H), 4.55 (t, 2H), 4.46 (t, 2H), 4.16 (t, 2H), 3.57 (t, 2H), 2.97 (t, 2H), 2.28 (m, 2H). GC-MS: m/e 334.9 (14), 333.9 (85), 332.9 (18), 331.9 (100), 329.9 (15), 254.0 (11), 252.0 (11), 167.0 (11), 166.1 (14), 165.1 (23), 152.1 (10), 128.1 (12), 77.1 (10), 69.1 (23), 56.0 (12).
ＳＪ６の合成。乾燥ＤＣＭ２００ｍＬ中のＣＴ１６０ １２．０ｇ(２９ｍｍｏｌ)の溶液をアルゴン下で０℃に冷却した。ＤＣＭ中の四塩化チタンの１．０Ｍ溶液２９ｍＬ(２９ｍｍｏｌ)をシリンジでゆっくりと添加した。この添加後、トリエチルシラン１９ｍＬ(１１６ｍｍｏｌ)をシリンジでゆっくりと添加した。氷冷水浴を取り除き、当該反応物を室温で一夜続行させ得た。１８時間後、当該反応物はＴＬＣで完成させ、当該反応物は、氷および５％水性ＮａＨＣＯ３ ２００ｍＬ中に注ぐことによりクエンチした。ＤＣＭ層を分離し、水層のｐＨを４Ｍ水性ＮａＯＨで＞７に調節した。水層をヘキサン ２×１００ｍＬで抽出し、合わせた有機層を５％水性ＮａＨＣＯ３ １００ｍＬおよび水１００ｍＬで洗浄した。有機層をＮａ２ＳＯ４で乾燥させ、ろ過し、および褐色オイルに濃縮した。粗生成物をフラッシュカラムクロマトグラフィーで精製し、精製ＳＪ６ ９．２ｇ(２３ｍｍｏｌ、８０％収率)を生じた。1H-NMR (CDCl3): δ 4.31 (t, 2H), 4.13 (t, 2H), 4.07 (t, 2H), 4.05 (t, 2H), 3.42 (t, 2H), 2.39 (t, 2H), 1.90 (m, 2H), 1.67 (m, 2H). GC-MS: m/e 401.9 (47), 400.9 (17), 399.9 (100), 398.9 (10), 397.9 (58), 278.9 (18), 276.9 (19), 240.1 (11), 214.9 (10), 212.9 (11), 175.0 (11), 141.1 (24), 134.9 (11), 91.1 (18)
上記化合物の合成は、図１６Ａに示す。
Ｋ１５８の合成。無水ピリジン５００ｍＬ中のグリセロール７．７ｇ(８４ｍｍｏｌ)の溶液に、４,４'−ジメトキシトリチルクロリド５０．０ｇ(１４７ｍｍｏｌ)およびＮ,Ｎ−ジメチル−４−アミノピリジン０．４ｇ(４ｍｏｌ％)を加えた。黄色溶液を室温で一夜攪拌した。１６時間後、ピリジンを真空で取り除き、残りの黄色固体をジクロロメタン５００ｍＬ中に溶解した。粗生成物を５％(w/v)水性ＮａＨＣＯ３２５０ｍＬで２回抽出し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させ、ろ過し、黄色の泡に濃縮した。粗生成物は、フラッシュクロマトグラフィー(溶出液中１％ＴＥＡを用いる)で精製し、精製Ｋ１５８ ４９．３ｇ(７１ｍｍｏｌ、８４％)を生じた。これを、ヘキサン／ジクロロメタンからの再結晶により更に精製し得る。1H-NMR (DMSO-d6): δ 7.4 (dd, 4H), 7.1-7.3 (m, 14H), 6.8 (dd, 8H), 4.9 (d, 1H), 3.8 (m, 1H), 3.7 (s, 12H), 3.1 (m, 2H), 3.0 (m, 2H)
ＳＪ７の合成。乾燥ＤＭＦ２００ｍＬ中のＫ１５８ １９．６ｇ(２８ｍｍｏｌ)の溶液に、ミネラルオイル中の６０％分散として水素化ナトリウム１．１ｇ(２８ｍｍｏｌ)を加えた。当該懸濁液を１時間室温で攪拌し、次いで、乾燥ＤＭＦ５０ｍＬ中のＳＪ６ ７．５ｇ(１９ｍｍｏｌ)の溶液を滴下した。当該懸濁液を一夜室温で攪拌した。１５時間後、当該反応物をＴＬＣで完了させ、その反応混合物を水３００ｍＬおよび酢酸エチル３００ｍＬに分配した。当該水層を酢酸エチル２×３００ｍＬで抽出し、合わせた有機層を５％水性ＮａＨＣＯ３および水で洗浄した。次いで、有機層をＮａ２ＳＯ４で乾燥させ、ろ過し、および褐色オイルに濃縮した。粗生成物をフラッシュクロマトグラフィーで精製し、精製ＳＪ７ ９．４ｇ(９．２ｍｍｏｌ、４５％)を生じた。1H-NMR (CDCl3): δ 7.43 (dd, 4H), 7.1-7.3 (m, 14H), 6.8 (dd, 8H), 4.28 (t, 2H), 4.09 (t, 2H), 4.02 (t, 2H), 4.01 (t, 2H), 3.77 (s, 12H), 3.55 (t, 1 H), 3.4 (m, 4H), 3.1-3.2 (ddd, 2H) 2.3 (m, 2H), 1.5 (m, 4H).
ＳＪ８の合成。ＤＣＭ４００ｍＬ中のＳＪ７ １２．３ｇ(１２．１ｍｍｏｌ)の溶液に、トリクロロ酢酸２．５ｇ(１５ｍｍｏｌ)を添加した。室温で１５分後、当該反応物を、メタノール２０ｍＬ中のトリエチルアミン３．５ｍＬの添加によりクエンチした。当該反応混合物を、５％水性ＮａＨＣＯ３で抽出し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させ、ろ過し、濃縮した。粗物質をフラッシュクロマトグラフィーで精製し、ＳＪ８ ４．５ｇ(６．３ｍｍｏｌ、５２％)を生じ、ＳＪ７ ５．５ｇ(５．４ｍｍｏｌ、４５％)を回収した。1H-NMR (CDCl3): δ 7.43 (dd, 2H), 7.1-7.3 (m, 7H), 6.8 (dd, 4H), 4.28 (t, 2H), 4.09 (t, 2H), 4.02 (m, 2H), 4.01 (t, 2H), 3.77 (s, 6H), 3.5 (m, 1H), 3.6 (m, 2H), 3.5 (m, 2H), 3.1-3.2 (ddd, 2H), 2.3 (m, 2H), 1.6 (m, 4H).
ＳＪ９の合成。無水ＤＣＭ２００ｍＬ中のＳＪ８ ５．０ｇ(６．８ｍｍｏｌ)の溶液に、ジイソプロピルエチルアミン４．７ｍＬ(３．５ｇ、２７ｍｍｏｌ)を加え、当該溶液をアルゴン下、０℃に冷却した。この溶液に、シリンジでＮ,Ｎ−ジイソプロピルアミノ−シアノエチル−ホスホンアミディッククロライド１．８ｍＬ(１．９ｇ、８．２ｍｍｏｌ)を加えた。氷水浴を取り除き、当該溶液を室温で攪拌した。１．５時間後、当該反応物をＴＬＣで完了した。当該反応物をＤＣＭ２５０ｍＬで希釈し、５％水性ＮａＨＣＯ３２５０ｍＬで洗浄した。粗生成物をＮａ２ＳＯ４で乾燥させ、ろ過し、黄色オイルに濃縮した。粗生成物をフラッシュクロマトグラフィーで精製し、真空で濃縮し、次いで、乾燥ＡＣＮ５ｍＬに溶解させ、０．４５μ ＰＴＦＥシリンジチップフィルターでろ過した。当該溶媒を真空で除去し、精製産物を無水ＤＣＭ中に再溶解し、バイアルに移し、真空で再乾燥した。当該反応物の収率は５．３ｇ(５．８ｍｍｏｌ、８５％収率)であった。ＤＮＡシンセサイザーのＳＪ９の結合効率は９９％であった。1H-NMR (CDCl3): δ 7.46 (dd, 2H), 7.1-7.3 (m, 7H), 6.8 (d, 4H), 4.28 (t, 2H), 4.11 (t, 2H), 4.06 (m, 2H), 4.03 (t, 2H), 3.79 (s, 6H), 3.5-3.7 (m, 7H), 3.2 (d, 2H), 2.5 (m, 2H), 2.4 (m, 2H), 2.3 (m, 2H), 1.6 (bs, 4H), 1.1 (dd, 12H). 31P-NMR (CDCl3): δ 149.3, 149.2. ES-MS: m/z 937 (M+Na+)
上記化合物の合成を図１６Ｂに示す。
ＣＫ７１の合成。乾燥ＴＨＦ(２００ｍｌ)中のフェロセン(２５．１ｇ、１３５ｍｍｏｌ)のプレ−冷却溶液(−５℃)に、ペンタン(１４５ｍｍｏｌ)中のtert-ブチルリチウム８５．０ｍＬを４５分間にわたり滴下し、その間、当該反応物を激しく攪拌した。tert-ブチルリチウムの添加後、当該反応混合物を１０分間にわたり室温にまで温めた。次いで、反応混合物を−７８℃にまで冷却し、ホウ酸トリブチル(４０．０ｍＬ、１４８．２ｍｍｏｌ)を４５分間にわたり液化した。当該反応物を室温にまで温め、２時間攪拌し、その時間、当該反応混合物はスラリーから透明な溶液に変化した。当該反応物は、５％水性ＨＣｌ１００ｍＬの添加によりクエンチした。当該水層を有機層から分離し、酢酸エチル(２×１００ｍＬ)で抽出した。次いで、合わせた有機層をブラインで洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、濃縮し、赤色固体を生じた。粗生成物を、シリカゲルを介するパッドろ過を用い精製した。当該サンプルをＤＣＭ溶液としてロードし、ヘキサン／１％ＴＥＡ、ヘキサン／ＤＣＭ(８０／２０)、およびＤＣＭ／メタノール(９７／３)で溶出した。これは、黄色固体としてＣＫ７１(１３．５ｇ)を生じ、更に精製および特性解析することなく次の反応に使用した。
ＣＫ７３の合成。粗フェロセニルボロネートＣＫ７１(１３．５ｇ)および塩化銅(３６．６ｇ、２１４ｍｍｏｌ)を水５００ｍＬ中に懸濁した。当該反応混合物を６５−７０℃に加熱し、４時間攪拌した。当該反応をＴＬＣでモニターした。出発物質を消費すると、当該混合物を室温に冷却し、ヘキサン(３×１５０ｍＬ)で抽出し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させた。粗生成物をシリカゲルパッドろ過で精製し、ヘキサンで溶出させた。溶媒の除去後、黄色固体を得た。ＧＣ／ＭＳ分析は、〜１５％フェロセンがまだ存在することを示し、その生成物は更に部分的ヨウ素酸化により精製した。カラム精製ＣＫ７３(７．９ｇ)をヘキサン２００ｍＬ中に溶解し、０℃に冷却した。ヘキサン中のヨウ素(３．４２ｇ)の溶液を少しずつ加え、黒い沈殿(おそらくヨウ化フェロセニウム)が観察された。上清の組成物をＧＣ／ＭＳでモニターした。ＧＣ／ＭＳが、フェロセンの完全消費を示すとき、当該溶液をデカントし、シリカゲルパットでろ過し、濃縮した。この処置後、ＣＫ７３(３０．８ｍｍｏｌ、２段階以上で２３％)６．８ｇを９９％純度で観察された。GC/MS: m/e 222 (37), 220 (100), 184 (63), 128 (63)
Ｎ２４７の合成。０℃に冷却した、ジクロロメタン(１２０ｍＬ)中のＣＫ７３(１１．５ｇ、５２．４ｍｍｏｌ)の溶液に、塩化ブロモブチリル(７．３ｍＬ、６２．８ｍｍｏｌ)および塩化アルミニウム(８．４ｇ、６２．８ｍｍｏｌ)を加えた。当該反応物を室温で４０分間攪拌し、次いで、冷５％水性ＮａＯＨ２００ｍＬへ反応混合物を添加することによりクエンチした。当該混合物を、エチルエーテルで抽出し、合わせた有機層を水で抽出し、硫酸ナトリウムで乾燥させ、濃縮した。粗Ｎ２４７を更なる精製をすることなく次の反応に使用した。
Ｎ２４８の合成。トルエン中の粗Ｎ２４７(１２．０ｇ、２６．７ｍｍｏｌ)の溶液に、粉末化亜鉛(５０．０ｇ、０．７６ｍｏｌ)、塩化水銀(１．５ｇ、５．５ｍｍｏｌ)および水(１０ｍＬ)を加え、その後、３０ｍＬの濃ＨＣｌをゆっくりと加えた。当該混合物を室温で２時間激しく攪拌し、次いでろ過した。水層をヘキサンで３回抽出し、合わせた有機層を水およびブラインで洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥させ、濃縮した。粗生成物をヘキサン／１％ＴＥＡで充填したシリカゲル７５ｇのカラムで精製し、ヘキサン中の５−１０％酢酸エチルで溶出し、望ましい産物Ｎ２４８(１．６ｇ、７４％)を生じた。GC/MS: m/e 356 (100), 233 (33), 213 (17), 175 (18), 141 (17), 91 (18).
Ｋ１５８の合成。無水ピリジン５００ｍＬ中のグリセロール７．７ｇ(８４ｍｍｏｌ)の溶液に、４,４'−ジメトキシトリチルクロリド５０．０ｇ(１４７ｍｍｏｌ)およびＮ,Ｎ−ジメチル−４−アミノピリジン０．４ｇ(４ｍｏｌ％)を加えた。黄色溶液を室温で一夜攪拌した。１６時間後、ピリジンを真空で取り除き、残りの黄色固体をジクロロメタン５００ｍＬ中に溶解した。粗生成物を５％(w/v)水性重炭酸ナトリウム２５０ｍＬで２回抽出し、硫酸ナトリウムで乾燥させ、ろ過し、黄色の泡に濃縮した。粗生成物は、フラッシュクロマトグラフィー(溶出液中１％ＴＥＡを用いる)で精製し、精製Ｋ１５８ ４９．３ｇ(７１ｍｍｏｌ、８４％)を生じた。これを、ヘキサン／ジクロロメタンからの再結晶により更に精製し得る。1H-NMR (DMSO-d6): δ 7.4 (dd, 4H), 7.1-7.3 (m, 14H), 6.8 (dd, 8H), 4.9 (d, 1H), 3.8 (m, 1H), 3.7 (s, 12H), 3.1 (m, 2H), 3.0 (m, 2H)
ＳＪ５９の合成。乾燥ＤＭＦ２５０ｍＬ中のＫ１５８(３３ｍｍｏｌ)２３．０ｇの溶液に、ミネラルオイル中の６０％分散として水素化ナトリウム１．３ｇ(３３ｍｍｏｌ)を加えた。当該懸濁液を１時間室温で攪拌し、次いで、乾燥ＤＭＦ５０ｍＬ中のＮ２４８ １０．６ｇ(３０ｍｍｏｌ)の溶液を滴下した。当該懸濁液を一夜室温で攪拌した。１５時間後、当該反応物をＴＬＣで完了させ、その反応混合物を水５００ｍＬおよび２：１(v/v)酢酸エチル／ヘキサン５００ｍＬの間に分配した。当該水層を２：１(v/v)酢酸エチル／ヘキサン２×３００ｍＬで抽出し、合わせた有機層を硫酸ナトリウムで乾燥させ、ろ過し、褐色オイルに濃縮した。粗生成物をフラッシュクロマトグラフィーで精製し、精製ＳＪ５９ ９．３ｇ(９．５ｍｍｏｌ、３１％)を生じた。加えて、非反応Ｎ２４８ １．８ｇ(５．０ｍｍｏｌ、１７％)および排除生成物ＳＪ６０ ２．４ｇ(８．８ｍｍｏｌ、３０％)を精製後単離した。1H-NMR (CDCl3): δ 7.43 (dd, 4H), 7.1-7.3 (m, 14H), 6.8 (dd, 8H), 4.27 (t, 2H), 4.12 (t, 2H), 4.08 (t, 2H), 3.98 (t, 2H), 3.79 (s, 12H), 3.62 (t, 1 H), 3.55 (m, 4H), 3.2-3.3 (ddd, 2H) 2.38 (m, 2H), 1.6 (m, 4H).
ＳＪ６１の合成。ＤＣＭ３００ｍＬ中のＳＪ５９ ９．２ｇ(９．５ｍｍｏｌ)の溶液に、トリクロロ酢酸１．５ｇ(９．５ｍｍｏｌ)を添加した。室温で３０分後、当該反応物を、メタノール２０ｍＬ中のトリエチルアミン５ｍＬの添加によりクエンチした。当該反応混合物を、５％水性重炭酸ナトリウム３００ｍＬで抽出し、硫酸ナトリウムで乾燥させ、ろ過し、濃縮した。粗物質をフラッシュクロマトグラフィーで精製し、ＳＪ６１ ３．１ｇ(４．６ｍｍｏｌ、４９％)を生じ、ＳＪ５９ ４．６ｇ(４．８ｍｍｏｌ、５０％)を回収した。1H-NMR (DMSO-d6): δ 7.48 (dd, 2H), 7.2-7.4 (m, 7H), 6.9 (dd, 4H), 4.6 (t, 1H), 4.44 (t, 2H), 4.2 (t, 2H), 4.17 (m, 2H), 4.14 (t, 2H), 3.81 (s, 6H), 3.6 (m, 1H), 3.48 (m, 2H), 3.38 (m, 2H), 3.1-3.2 (ddd, 2H), 2.4 (m, 2H), 1.6 (m, 4H).
ＳＪ６３の合成。無水ＤＣＭ１００ｍＬ中のＳＪ６１ ３．４ｇ(５．０ｍｍｏｌ)の溶液に、Ｎ,Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン３．５ｍＬ(２．６ｇ、２０ｍｍｏｌ)およびＮ,Ｎ−ジメチルアミノピリジン６０ｍｇ(０．５ｍｍｏｌ)を加え、当該溶液をアルゴン下、０℃に冷却した。この溶液に、シリンジでＮ,Ｎ−ジイソプロピルアミノ−シアノエチル−ホスホンアミディッククロライド１．４ｍＬ(１．４ｇ、６．０ｍｍｏｌ)を加えた。氷水浴を取り除き、当該溶液を室温で攪拌した。当該反応はＴＬＣでモニターした。２時間後、当該混合物をＤＣＭ１００ｍＬで希釈し、５％水性重炭酸ナトリウム１００ｍＬで洗浄した。ＤＣＭ溶液を硫酸ナトリウムで乾燥させ、ろ過し、濃縮した。粗生成物をフラッシュクロマトグラフィーで精製し、真空で濃縮し、黄色オイルとして望ましい生成物ＳＪ６３(３．７ｇ、４．４ｍｍｏｌ、８７％)を生じた。
次いで、精製したＳＪ６３を乾燥ＡＣＮ１０ｍＬに溶解し、０．４５−μＰＴＦＥシリンジチップフィルターでろ過した。溶媒を真空で除き、精製生成物を無水ＤＣＭに再溶解し、バイアルに移し、真空で再乾燥させた。ＤＮＡシンセサイザーのＳＪ６３の結合効率は９９．８％であった。1H-NMR (DMSO-d6): δ 7.38 (dd, 2H), 7.1-7.3 (m, 7H), 6.8 (d, 4H), 4.34 (t, 2H), 4.10 (t, 2H), 4.07 (m, 2H), 4.04 (t, 2H), 3.71 (s, 6H), 3.4-3.7 (m, 7H), 3.3 (m, 2H), 3.0 (m, 2H), 2.6-2.7 (dt, 2H), 2.3 (m, 2H), 1.5 (bs, 4H), 1.0-1.1 (m, 12H). 31P-NMR (DMSO-d6): δ 148.3, 148.2. ES-MS: m/z C47H58ClFeN2O6Pの計算値, 868; 実測値, 868 (M+H+) および 891 (M+Na+).
図１６Ｃは、上記化合物の合成を示す。
非ヌクレオシド性フェロセンホスホラミダイト
非ヌクレオシド性フェロセンホスホラミダイトの合成を図１７ＡおよびＢに示す。
図１７Ａは、以下の化合物の合成を示す：
Ｎ１の合成。乾燥ジクロロメタン(７５０ｍｌ)中のフェロセン(４１．５０ｇ、２２３．１０ｍｍｏｌ)の溶液に、４−ブロモブチリルクロリド(２６．００ｍＬ、２２４．５９ｍｍｏｌ)を室温で添加し、０℃に冷却した。塩化アルミニウム(３２．００ｇ、２３４．００ｍｍｏｌ)を、０℃でアルゴン下で上記溶液に添加し、その間、当該反応物は攪拌し得る。当該反応物を室温にまで温め、フェロセンがなくなるまで(約１．５ｈ)ＴＬＣでモニターした。当該反応混合物を氷水にゆっくりと注ぎ、分離し、その後、ジクロロメタン(３×２００ｍＬ)で水層を抽出した。次いで、合わせた有機層を水(４００ｍＬ)、５％ＮａＨＣＯ３で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させた。当該溶媒の除去後、その残渣を更に高真空下で２から３時間で乾燥させ、濃いオレンジ色オイルとしてＮ１(７３．９６ｇ、９９％)を生じ、それは、更に精製することなく、次のステップ反応に使用した(ＧＣ／ＭＳは精製化合物を示す)。元素分析。(C14H15BrFeO)の計算値: 335, 実測値 (GC-MS) 255 (18, M-Br) 254 (100), 186 (27), 121(27), 56 (18).
Ｎ２の合成。水(５００ｍｌ)中の亜鉛粉末(３９８ｇ、４７１０ｍｍｏｌ)のスラリーに、塩化水銀(１０．３６ｇ、３８．１６ｍｍｏｌ)を添加し、完全に混合した。当該固体を完全に処理した後、水をデカントした。Ｎ１(７３．９６ｇ、２２０．７８ｍｍｏｌ)をトルエン(１８００ｍＬ)中に溶解し、上記Ｚｎ(Ｈｇ)コンテナーへ移した。濃ＨＣｌ(４４０ｍＬ)を少しずつ加え、その間、当該混合物を、機械的なスターラーを用い激しく攪拌した。当該反応物を、Ｎ１がなくなるまで(１から２ｈ)ＴＬＣでモニターした。次いで、反応混合物をCelite(登録商標)の２−インチベッドでろ過し、ヘキサンで洗浄した。水層を分離した後、有機層を水(５００ｍＬ)、５％重炭酸ナトリウム(５００ｍＬ)、および水(５００ｍＬ)で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させた。溶媒の除去後、粗生成物を、溶出溶媒としてヘキサンを使用するシリカゲルのカラムクロマトグラフィーで精製した。一部のみを回収し、濃縮し、Ｎ２(５２．２５ｇ、７４％)のオレンジオイルを得、分解することなく０−４℃で保存し得る。当該構造は、ＧＣ／ＭＳで確認した。元素分析。(C14H17BrFe)の計算値: 321, 実測値 (GC-MS) m/z 321(15) 320 (100), 199 (80), 121(50).
Ｋ１５８の合成。無水ピリジン５００ｍＬ中のグリセロール(７．７ｇ、８４ｍｍｏｌ)の溶液に、ジメトキシトリチルクロリド(５０ｇ、１４７ｍｍｏｌ)およびＮ,Ｎ−ジメチル−４−アミノピリジン(０．４ｇ、４ｍｏｌ％)を加えた。黄色溶液を室温で一夜攪拌した。１６時間後、ピリジンを真空で取り除き、残りの黄色固体をジクロロメタン５００ｍＬ中に溶解した。粗生成物を５％(w/v)水性ＮａＨＣＯ３２５０ｍＬで２回抽出し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させ、ろ過し、黄色の泡に濃縮した。粗生成物は、フラッシュクロマトグラフィー(溶出液中１％ＴＥＡを用いる)で精製し、精製Ｋ１５８ ４９ｇ(７１ｍｍｏｌ、８４％)を生じた。これを、ヘキサン／ジクロロメタンからの再結晶により更に精製し得る。1H-NMR (300 MHz, DMSO-d6): δ 7.4 (dd, 4H), 7.1-7.3 (m, 14H), 6.8 (dd, 8H), 4.9 (d, 1 H), 3.8 (m, 1 H), 3.7 (s, 12H), 3.1 (m, 2H), 3.0 (m, 2H).
Ｋ１５９の合成。ＤＭＦ(３００ｍＬ)中のＫ１５８(３３．５３ｇ、４８．１０ｍｍｏｌ)の溶液に、水素化ナトリウムを一度に加え、当該反応物を１時間アルゴン下で攪拌した。次いで、ＤＭＦ(５０ｍＬ)中のＮ２(１１．３１ｇ、３５．２３ｍｍｏｌ)の溶液を反応フラスコに加え、当該反応物を一夜室温でアルゴン下、攪拌した。ＴＬＣはＮ２の消費を示した。当該反応物を水(２００ｍＬ)でクエンチし、有機層の色が消えるまで酢酸エチル／ヘキサン(３００／１００、７５／２５、７５／２５)で抽出した。次いで、合わせた有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、溶媒を減少圧で除去した。更に残りのＤＭＦをエタノールと共蒸発させ、粗生成物(５３．５２ｇ)のオレンジ色残渣を生じた。粗生成物をシリカゲルのカラムクロマトグラフィーで精製した。当該カラムは、１％トリエチルアミン／ヘキサンが充填されており、５％、１０％、２０％酢酸エチル／ヘキサン、１：１酢酸エチル／ヘキサン、２：１酢酸エチル／ヘキサン(すべて１％トリエチルアミンを含む)で溶出させた。最初の画分は除去生成物であった。第二の画分は、Ｋ１５９の望ましい生成物であり、それは、回収され、真空で濃縮され、オレンジ色オイルを生じた(１５．６２ｇ、３５％)。第三の画分は、回収されたＫ１５８であった。
Ｋ１６０の合成。ジクロロメタン(２００ｍＬ)中のＫ１５９(１１．７９ｇ、１２．６１ｍｍｏｌ)の溶液に、ジクロロメタン(１００ｍＬ)中のトリクロロ酢酸(２．５０ｇ、１５．２９ｍｍｏｌ)を添加し、当該反応物を３０分間攪拌した。メタノール(１０ｍＬ)中のトリエチルアミン(２．３１ｍＬ、１６．４５ｍｍｏｌ)の溶液を反応フラスコに加え、５分間以上攪拌した。次いで、反応混合物を５％重炭酸ナトリウム(２×２００ｍＬ)で洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥させた。溶媒の除去後、粗生成物をシリカゲルのカラムクロマトグラフィーで精製した。当該カラムは、１％トリエチルアミン／ヘキサンで充填され、１０％、２０％酢酸エチル／ヘキサン(すべて１％トリエチルアミンを含む)で溶出した。最初の画分は、回収された出発物質Ｋ１５９であり、第二の画分はＫ１６０の望ましい生成物であった。回収されたＫ１５９の出発物質は再び反応を繰返すために使用し、よりＫ１６０を生成した。合わせたＫ１６０を高真空ラインにおき、すべて残りの溶媒を除き、オレンジ色のオイル(５．０４ｇ、消費した出発物質に基づく合わせた収率は６４％)を生じた。
Ｋ１６１の合成。ジクロロメタン(１００ｍｌ)中のＫ１６０のプレ−冷却溶液(５．０４ｇ、７．９７ｍｍｏｌ)に、Ｃ９６(１．３６ｇ、７．９７ｍｍｏｌ)を０℃で添加し、その後、２−シアノエチルＮ,Ｎ,Ｎ',Ｎ'−テトライソプロピルホスファン(５．２５ｍＬ、１５．９４ｍｍｏｌ)を加えた。当該反応物を室温にまで温め、２時間攪拌した。ＴＬＣを用い、Ｋ１６０の出発物質のすべてを消費するまで当該反応物をモニターした。当該反応混合物を、蒸留水で洗浄し、次に、水層をジクロロメタン(２×１０ｍＬ)で抽出した。合わせた有機層を硫酸ナトリウムで乾燥させ、溶媒を取り除いた。精製は、シリカゲルのカラムクロマトグラフィーで行い、０−３０％酢酸エチル／ヘキサン(１％トリエチルアミン)で溶出させ、最終産物Ｋ１６１(４．６７ｇ、７２％)を得た。結合効率：９８％ 1H NMR (300 MHz, CDCl3): δ 7.35-7.25 (m, 9 H, Ph), 6.81 (d, J= 8.7 Hz, 4 H, Ph-OMe), 4.07 (s, 5H, Fc), 4.02 (m, 4 H, Fc), 3.78 (s, 6 H, 2 MeO), 3.77-3.50 (m, 11 H), 3.15 (d, 2 H), 2.50 (m, 2 H), 2.35 (t, 2 H), 1.58 (m, 2H), 1.17-1.08 (m, 12 H, 2 (CH3)2CH). 元素分析。(C47H59FeN2O6P)の計算値: 834, 実測値: MS 834 (M+), 857 (MNa+).
図１７Ｂは、以下の化合物の合成を示す：
Ｎ２００の合成。１当量のＥＫ５を、ＣＨ２Ｃｌ２中の中の２．５当量のｎＢｕＬｉと−７８℃で反応させた。次いで、温度を室温にまで温め、２．１当量のＦｅＣｌ２を添加した。当該反応物は一夜攪拌した。飽和ＮａＨＣＯ３を添加し、当該反応物をクエンチした。ろ過後にＣＨ２Ｃｌ２でろ液を抽出することにより、オレンジ色のオイルの残渣を提供した。カラム分離後、Ｎ２００を６０％収率で得た。
Ｎ２０３の合成。１当量のＮ２００を、ＣＨ２Ｃｌ２中のＴＥＡ(１．２当量)の存在下０．６当量のＤＭＴＣｌと３時間反応させた。ＴＬＣを使用し、反応の終了を示すＤＭＴＣｌの消失をモニターした。Ｎ２０３の収率は、消費した出発物質に基づき約６５％である。
Ｎ２０４の合成。１当量のＮ２０３を、ＣＨ２Ｃｌ２中のＣ９６(０．７当量)の存在下、１．５当量のビス−(Ｎ,Ｎ)−ジイソプロピルアミノ−２−シアノエトキシホスフィンと３時間反応させた。カラム分離後、８５％のＮ２０４を得た。分析元素。(C46H56FeN205P)の計算値: 803, 実測値: MS 803 (M+), 826 (Mna+).
高レドックス電位を有するフェロセン
図１８Ａ−Ｅは、高レドックス電位を有するフェロセンの合成を示す。
図１８Ａは、以下の化合物の合成を示す：
ＣＴ１８４の合成。乾燥エーテル(５００ｍｌ)中のフェロセン(４０．０ｇ、２１５ｍｍｏｌ)の溶液に、テトラメチルエチレンジアミン(７１ｍｌ、５５．０ｇ、４７３ｍｍｏｌ)およびｎＢｕＬｉ(ヘキサン中１．６Ｍ、２９８ｍｌ、４７３ｍｍｏｌ)を室温で加えた。当該混合物を１６時間室温で攪拌し、−７８℃に冷却し、次いで、トルエンスルホニルクロライド(１０２．５ｇ、５３７．５ｍｍｏｌ)を添加した。当該混合物を１時間、−７８℃で攪拌し、室温にまで温め、更に、時間攪拌した。当該混合物をヘキサン３００ｍｌで希釈し、水、ブラインで洗浄し、乾燥(Ｎａ２ＳＯ４)し、濃縮した。当該残渣をシリカゲルカラムに通し、ヘキサンおよびジクロロメタン(９０／１０)で溶出した。溶媒を除去した後、４５ｇ黄色固体を得た(８０％の望ましい生成物により示すＧＳ／ＭＳ)。当該固体を、ヘキサンから一度に再結晶し、明るいオレンジ色の結晶としてＣＴ１８４(ＧＣ／ＭＳより９９％を超える純度を有する２１ｇ)を得た。GC/MS: m/e 256 (48), 254 (78), 128 (100), 127 (27), 102 (13).
ＣＴ１８５の合成。乾燥ジクロロメタン(１００ｍｌ)中のＣＴ１８４(５．００ｇ、１９．６１ｍｍｏｌ)および４−ブロモブチリルクロリド(４．０ｇ、２．５ｍｌ、２１．５８ｍｍｏｌ)の溶液に、塩化アルミニウム(２．８８ｇ、２１．５８ｍｍｏｌ)を０℃で添加した。出発物質の添加後、冷却水浴を取り除き、混合物を３０分間攪拌した。ＴＬＣは、反応の完了を示した。当該混合物を、氷水中に注ぎ、ヘキサンで抽出した。有機層を、水、５％ＮａＨＣＯ３、およびブラインで洗浄し、乾燥(Ｎａ２ＳＯ４)し、濃縮した。当該残渣をシリカゲルクロマトグラフィーで精製し、ヘキサン、１０％酢酸エチル／ヘキサンで抽出し、〜４：５混合物であるαおよびβ異性体を有する赤色がかったオイル(７．６０ｇ、９５％)として望ましい生成物ＣＴ１８５を得た。GC/MS: m/e 異性体Ｉ(持続時間 13.618 min): 324 (59), 322 (100), 165 (47), 155 (95); 異性体II (持続時間 13.687 min): 324 (66), 322 (100), 195 (35), 167 (24), 65 (62), 102 (23).
ＣＴ１８６の合成。乾燥ＴＨＦ(１５０ｍｌ)中の亜鉛(１１．６０ｇ、１７８．２０ｍｍｏｌ)の懸濁液に、ジヨードメタン(７．２ｍｌ、２３．９ｇ、８９．１３ｍｍｏｌ)を室温で添加した。３０分間攪拌した後、暗く濃い混合物を０℃に冷却し、四塩化チタン(１８．０ｍＬ、１．０Ｍ／ＣＨ２Ｃｌ２、１７．８２ｍｍｏｌ)を滴下した。暗い暗緑色混合物を更に室温で３０分間攪拌した。当該混合物に、乾燥ＴＨＦ(３５ｍＬ)中のＣＴ１８５(７．２０ｇ、１７．８２ｍｍｏｌ)を滴下した。当該混合物を７時間、室温で攪拌した。反応混合物中に、ヘキサン／エーテル(３００ｍＬ、９：１)の混合物を添加した。次いで、当該混合物を５％ＮａＨＣＯ３およびブラインで洗浄し、乾燥(Ｎａ２ＳＯ４)し、濃縮した。当該残渣をシリカゲルクロマトグラフィーで精製(２％ＴＥＡ／ヘキサンで充填)し、ヘキサン、および１０％ジクロロメタン／ヘキサンで溶出し、望ましい生成物ＣＴ１８６(３．６５ｇ、消費した出発物質ＣＴ１８５に基づき６５％、１：３ α：β領域異性体)を生じ、出発物質ＣＴ１８５(１．６０ｇ、２２％)を回収した。GC/MS: m/e for CT186: 異性体α (維持時間 15.385 min): 404 (45), 402 (100), 400 (66), 320 (18), 178 (26), 165 (41), 152 (34), 129 (40), 115 (43); 異性体β (維持時間 15.413 min): 404 (45), 402 (100), 400 (68), 320 (15), 178 (18), 165 (29), 152 (23), 129 (26), 115 (29), 91 (28).
ＣＴ１８７の合成。ジオキサン(２ｍＬ)およびメタノール(２ｍＬ)中のＣＴ１８６(６０ｍｇ、０．１４ｍｍｏｌ)の溶液に、水(３ｍＬ)中の硫酸ナトリウム(２２０ｍｇ、２．８２ｍｍｏｌ)を加えた。当該混合物を一夜７０℃で攪拌した。出発物質は消え、単一のスポットをＴＬＣ(１０％ＭｅＯＨ／ＣＨ２Ｃｌ２)上に形成した。室温に冷却した後、固体をろ過した。有機溶媒を除去した後、黄色水性溶液を得、それを更に精製することなくゴールドボール(gold ball)実験に使用した。
ＳＪ３０の合成。トルエン(２００ｍＬ)中の１−(４−ブロモブチリル)−１,１'−ジクロロフェロセン(５．４０ｇ、１３．４ｍｍｏｌ)の溶液に、Ｚｎ粉末(８０．００ｇ)、ＨｇＣｌ２(８．００ｇ)、脱イオン水(１１５ｍＬ)、および濃塩酸(１１５ｍＬ)を加えた。３相混合物を室温で激しく攪拌し、金属が凝集するのを防止した。２時間後、液体をデカントし、金属アマルガムをヘキサン５０ｍＬで４回洗浄した。トルエン溶液を水層から分離し、ヘキサン洗浄液とあわせ、乾燥(Ｎａ２ＳＯ４)し、ろ過し、濃縮し、褐色オイルを得た。粗生成物をフラッシュクロマトグラフィーで精製し、〜２：１混合物であるαおよびβ異性体として精製生成物ＳＪ３０ ４．１０ｇ(１０．５ｍｍｏｌ、７９％)を生じた。GC-MS: m/e (主な異性体) 392 (45), 390 (100), 388 (65), 310 (10), 308 (11), 269 (14), 267 (22), 155 (17), 141 (32), 117 (28), 115 (45), 91 (46).
Ｋ１５８の合成。無水ピリジン５００ｍＬ中のグリセロール(７．７ｇ、８４ｍｍｏｌ)の溶液に、ジメトキシトリチルクロリド(５０．０ｇ、１４７ｍｍｏｌ)およびＮ,Ｎ−ジメチル−４−アミノピリジン(０．４ｇ、４ｍｏｌ％)を加えた。黄色溶液を室温で一夜攪拌した。１６時間後、ピリジンを真空で取り除き、残りの黄色固体をジクロロメタン５００ｍＬ中に溶解した。粗生成物を５％(w/v)水性ＮａＨＣＯ３２５０ｍＬで２回抽出し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させ、ろ過し、黄色の泡に濃縮した。粗生成物は、フラッシュクロマトグラフィー(溶出液中１％ＴＥＡを用いる)で精製し、精製Ｋ１５８ ４９．０ｇ(７１ｍｍｏｌ、８４％)を生じた。これを、ヘキサン／ジクロロメタンからの再結晶により更に精製し得る。1H-NMR (300 MHz, DMSO-d6): δ 7.4 (dd, 4H), 7.1-7.3 (m, 14H), 6.8 (dd, 8H), 4.9 (d, 1 H), 3.8 (m, 1 H), 3.7 (s, 12H), 3.1 (m, 2H), 3.0 (m, 2H).
ＳＪ３４の合成。無水ＤＭＦ２００ｍＬ中のＫ１５８(２５．７ｇ、３７ｍｍｏｌ)の溶液に、ミネラルオイル中の６０％分散としてＮａＨ(１．５ｇ、３７ｍｍｏｌ)を加えた。当該懸濁液を１時間室温で攪拌し、次いで、１００ｍＬ中のＳＪ３０(７．２ｇ、１８．５ｍｍｏｌ)の溶液をシリンジで加えた。当該懸濁液を一夜室温で攪拌した。２１時間後、当該反応物を２．５％(w/v)水性ＮａＨＣＯ３３００ｍＬの添加によりクエンチし、２：１(v/v)酢酸エチル−ヘキサン３００ｍＬで二回抽出した。合わせた有機層を水１００ｍＬで洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥し、ろ過し、暗褐色オイルに濃縮した。粗ＳＪ３４を、フラッシュクロマトグラフィー(溶出液中１％ＴＥＡによる)により精製し、〜２：１混合物であるａおよびｂ異性体として望ましい生成物１０．５ｇ(１０．４ｍｍｏｌ、５６％収率)を得た。1H-NMR (300 MHz, CDCl3): d 7.4 (dd, 4H), 7.1-7.3 (m, 14H), 6.7 (dd, 8H), 4.3 (m, 3H), 3.9-4.1 (m, 4H), 3.8 (s, 12H), 3.5 (m, 2H), 3.3 (m, 2H), 2.5 (m, 2H), 2.2 (m, 2H), 1.5 (m, 4H).
ＳＪ４０の合成。ジクロロメタン２００ｍＬ中のＳＪ３４(９．７ｇ、９．７ｍｍｏｌ)の溶液に、ジクロロメタン１００ｍＬ中のトリクロロ酢酸(１．７ｇ、１０ｍｍｏｌ)の溶液を加えた。室温で１５分間攪拌した後、当該反応物を、メタノール２０ｍＬ中のトリエチルアミン(１．６ｍＬ、１．２ｇ、１２ｍｍｏｌ)の溶液の添加によりクエンチした。５分間室温で攪拌した後、当該混合物は、５％(w/v)水性ＮａＨＣＯ３２００ｍＬで二回抽出し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥し、ろ過し、濃縮し、褐色オイルを生じた。粗生成物を、フラッシュクロマトグラフィーで精製(溶出液中１％ＴＥＡによる)し、望ましい生成物ＳＪ４０ １．３ｇ(１．９ｍｍｏｌ、２０％収率)および回収される出発物質ＳＪ３４ ６．８ｇ(６．８ｍｍｏｌ、７０％)を生じた。1H-NMR (300 MHz, DMSO-d6): d 7.4 (dd, 2H), 7.1-7.3 (m, 7H), 6.9 (dd, 4H), 4.4 (m, 3H), 4.1-4.2 (m, 4H), 3.7 (s, 6H), 3.5 (bm, 2H), 3.4 (m, 2H), 2.4 (m, 2H), 2.2 (m, 2H), 1.5 (m, 4H).
ＳＪ４２の合成。乾燥ジクロロメタン６０ｍＬ中のＳＪ４０(１．３３ｇ、１．９ｍｍｏｌ)の溶液に、Ｎ,Ｎ−ジメチル−４−アミノピリジン(１０ｍｇ、４ｍｏｌ％)およびジイソプロピルエチルアミン(１．３ｍＬ、０．９８ｇ、７．６ｍｍｏｌ)を加えた。黄色溶液を、氷−水浴中で０℃に冷却し、２−シアノエチルジイソプロピルクロロホスホラミダイト(０．５１ｍＬ、０．５４ｇ、２．３ｍｍｏｌ)を、シリンジを介し攪拌しながら添加した。氷水浴を取り除き、当該溶液を室温にまで温めることができた。２時間後、反応混合物を、ジクロロメタン１００ｍＬで希釈し、５％(w/v)水性ＮａＨＣＯ３５０ｍＬおよび水５０ｍＬで抽出した。ジクロロメタン層をＮａ２ＳＯ４で乾燥させ、ろ過し、濃縮し、褐色オイルを得た。粗生成物をフラッシュクロマトグラフィーで精製し、望ましい生成物ＳＪ４２ １．４ｇ(１．６ｍｍｏｌ、８２％)を生じた。精製ホスホラミダイトを乾燥アセトニトリル５ｍＬに溶解し、０．４５−ｍＰＴＦＥシリンジチップフィルターでろ過し、真空で乾燥させた。次いで、黄色オイルを無水ジクロロメタン７ｍＬ中に再溶解し、アリコートをＤＮＡシンセサイザーバイアルに移し、一夜真空で再乾燥させた。1H-NMR (300 MHz, DMSO-d6): d 7.4 (dd, 2H), 7.1-7.3 (m, 7H), 6.9 (dd, 4H), 4.4 (m, 3H), 4.1-4.2 (m, 4H), 3.7 (s, 6H), 3.4-3.7 (bm, 6H), 3.1 (m, 2H), 2.7 (m, 4H), 2.4 (m, 2H), 2.2 (m, 2H), 1.6 (m, 4H), 1.1 (m, 12H). 分析元素。C47H57FeN2O6Pの計算値: 904. 実測値: 904 および 927 (M+Na+).
図１８Ｂは、以下の化合物の合成を示す：
Ｎ２２５の合成。水(６００ｍＬ)中のトルエンスルフィン酸(１７５．０ｇ、０．９８ｍｏｌ)の溶液に、冷メタノール中の臭素を、オレンジ色が持続するまでゆっくり添加した。よりトルエンスルフィン酸溶液を加えると、オレンジから淡黄色に変化した。沈殿をろ過し、水で洗浄した。固体を、ジクロロメタンを有する短いシリカゲルカラムに通した。粗生成物を、シリカゲル３００ｇのカラムで精製し、ジクロロメタンで溶出し、Ｎ２２５ １３４．６ｇ(６９％)を生じた。1H NMR (300 MHz, CDCl3) 7.87 (d, 2H), 7.30 (d, 2H), 2.49 (s, 3H).
Ｋ１６４の合成。エチルエーテル(１Ｌ)中のフェロセン(３０．００ｇ、０．１６ｍｏｌ)の溶液に、ｎ−ブチルリチウム(ヘキサン中、１．６Ｍ ２２０ｍＬ)およびテトラメチルエチレンジアミン(２７．０ｍＬ、０．１８ｍｏｌ)を加えた。当該溶液を、１０分間アルゴンで浄化し、次いで、室温で一夜攪拌した。当該混合物を−７８℃に冷却し、Ｎ２２５(９０．０ｇ、０．３８ｍｏｌ)を加えた。当該反応混合物をこの温度で１時間維持し、次いで、ゆっくりと室温まで温め、更に３０分攪拌し、その後、水３０ｍＬでクエンチした。当該混合物をろ過し、当該固体をヘキサンで数回抽出した。合わせた有機層を水で抽出し、硫酸ナトリウムで乾燥させ、濃縮した。当該粗生成物を、シリカゲル４００ｇのカラムで精製し、ヘキサンで抽出し、望ましい生成物Ｋ１６４(４０．０ｇ、７２％)が提供された。当該生成物は、更に、メタノールによる再結晶により精製し得る。GC/MS: m/e 346 (30), 344 (63), 342 (36), 128 (100), 102 (13)
ＣＴ１７６の合成。乾燥ジクロロメタン(７０ｍｌ)中のＫ１６４(３．４４ｇ、１０．１２ｍｍｏｌ)および４−ブロモブチリルクロリド(２．７９ｇ、１．７ｍｌ、１５．００ｍｍｏｌ)の溶液に、塩化アルミニウム(２．００ｇ、１５．００ｍｍｏｌ)を０℃で添加した。出発物質の添加後、冷却水浴を取り除き、混合物を更に３０分間攪拌した。ＴＬＣは、反応の完了を示した。当該混合物を、氷水中に注ぎ、ヘキサン／エーテルで抽出した。有機層を、水、５％ＮａＨＣＯ３、およびブラインで洗浄し、乾燥(Ｎａ２ＳＯ４)し、濃縮した。当該残渣をシリカゲルクロマトグラフィーで精製し、ヘキサン、１０％酢酸エチル／ヘキサンで抽出し、２：５混合物であるａおよびｂ異性体を有する赤色がかったオイル(４．３０ｇ、８７％)として望ましい生成物ＣＴ１７６を得た。GC/MS: m/e 異性体a (持続時間 14.733 min): 414 (29), 412 (64), 410 (40), 195 (20), 165 (40), 155 (100); 異性体 b (持続時間 14.767 min): 414 (47), 412 (100), 410 (61), 195 (51), 165 (63), 153 (31), 152 (29), 139 (23), 102 (26).
Ｎ２２１の合成。トルエン(７５ｍＬ)中の１−(４−ブロモブチリル)−１,１'−ジブロモフェロセン(１．００ｇ、２．０４ｍｍｏｌ)の溶液に、Ｚｎ粉末(１５．００ｇ)、ＨｇＣｌ２(１．５０ｇ)、脱イオン水(３０ｍＬ)、および濃塩酸(３０ｍＬ)を加えた。３相混合物を室温で激しく攪拌し、金属が凝集するのを防止した。１．５時間後、液体をデカントし、金属アマルガムをヘキサン５０ｍＬで４回洗浄した。合わせた有機層を水、５％ＮａＨＣＯ３で洗浄し、乾燥(Ｎａ２ＳＯ４)し、濃縮した。粗生成物をフラッシュクロマトグラフィーで精製し、１：２混合物であるａおよびｂ領域異性体を有する黄色オイルとしてＮ２２１(８３０ｍｇ、８５％)を生じた。GC/MS: m/e 異性体a (持続時間 15.939 min): 480 (91), 478 (100), 476 (39), 141 (89), 115 (90), 91 (65), 77 (46); 異性体b (持続時間 16.070 min): 482 (29), 480 (90), 478 (100), 476 (39), 141 (26), 115 (19).
手元にあるＮ２２１により、ジブロモ官能性を有するホスホロアミダイトの調製は、スキーム８の同様の方法により容易に理解される。
図１８Ｃは以下の化合物の合成を示す：
ＣＴ１５１の合成。ジクロロメタン(２０ｍＬ)中のフェロセンカルボン酸(１．００ｇ、４．３５ｍｍｏｌ)の懸濁溶液に、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド(１．００ｇ、８．６９ｍｍｏｌ)および１,３−ジシクロヘキシルカルボジイミド(１．７９ｇ、８．６９ｍｍｏｌ)を加えた。当該混合物を室温で３時間攪拌した。当該混合物に、ジクロロメタン(２０ｍＬ)中の３−アミノプロパノール(１．６３ｇ、１．６７ｍＬ、２１．７５ｍｍｏｌ)を加えた。次いで、当該混合物を更に３時間攪拌した。当該混合物を減圧で濃縮し、シリカゲルカラムで精製し、酢酸エチルで溶出し、望ましい生成物ＣＴ１５１(０．９２ｇ、７４％)が得られた。元素分析。計算値 (for C14H17FeNO2) 287. 実測値 287.
ＣＴ１７１の合成。ジクロロメタン(３０ｍＬ)中のＣＴ１５１(０．９５ｇ、３．３１ｍｍｏｌ)の溶液に、Ｃ９６(５６６ｍｇ、３．３１ｍｍｏｌ)を加えた。当該混合物を０℃に冷却し、Ｎ,Ｎ,Ｎ'Ｎ'−テトライソプロピルアミノ、２−シアノエトキシホスファン(３．２ｍＬ、２．９８ｇ、９．９３ｍｍｏｌ)を加えた。当該反応混合物を室温にまで温め、３時間室温で攪拌した。当該混合物をジクロロメタン１００ｍＬ中に希釈し、ウェイスターで３回抽出し、硫酸ナトリウムで乾燥させ、濃縮した。粗生成物を、ヘキサン中の１％ＴＥＡを充填したシリカゲルカラムで精製し、ヘキサン中の１％ＴＥＡおよび１０−３０％酢酸エチルで抽出し、黄色の粘着性オイルとして望ましい産物ＣＴ１７１を得た(０．９４ｇ、５８％)。分析元素。C23H34FeN3O3Pの計算値: 487.35. 実測値: 487.
図１８Ｄは、以下の化合物の合成を示す：
ＣＴ１８６の合成。乾燥ＴＨＦ(１５０ｍｌ)中の亜鉛(１１．６０ｇ、１７８．２０ｍｍｏｌ)の懸濁液に、ジヨードメタン(７．２ｍｌ、２３．９ｇ、８９．１３ｍｍｏｌ)を室温で添加した。３０分間攪拌した後、暗く濃い混合物を０℃に冷却し、次いで四塩化チタン(１８．０ｍＬ、１．０Ｍ／ＣＨ２Ｃｌ２、１７．８２ｍｍｏｌ)を滴下した。暗い暗緑色混合物を更に室温で３０分間攪拌した。当該混合物に、乾燥ＴＨＦ(３５ｍＬ)中のＣＴ１８５(７．２０ｇ、１７．８２ｍｍｏｌ)を滴下した。当該混合物を７時間、室温で攪拌した。反応混合物に、ヘキサン／エーテル(３００ｍＬ、９：１)の混合物を添加した。次いで、当該混合物を５％ＮａＨＣＯ３およびブラインで洗浄し、乾燥(Ｎａ２ＳＯ４)し、濃縮した。当該残渣をシリカゲルクロマトグラフィーで精製(２％ＴＥＡ／ヘキサンで充填)し、ヘキサン、および１０％ジクロロメタン／ヘキサンで溶出し、望ましい生成物ＣＴ１８６(３．６５ｇ、消費した出発物質ＣＴ１８５に基づき６５％、１：３ α：β領域異性体)を生じ、出発物質ＣＴ１８５(１．６０ｇ、２２％)を回収した。GC/MS: m/e for CT186: 異性体α (持続時間 15.385 min). 404 (45), 402 (100), 400 (66), 320 (18), 178 (26), 165 (41), 152 (34), 129 (40), 115 (43); 異性体β (持続時間 15.413 min). 404 (45), 402 (100), 400 (68), 320 (15), 178 (18), 165 (29), 152 (23), 129 (26), 115 (29), 91 (28).
手元にあるＣＴ１８６により、アルケニルジクロロフェロセンのホスホロアミダイトの調製は、スキーム８の方法により容易に行われる。
図１８Ｅは、以下の化合物の合成を示す：
ＳＪ２１の合成。ジクロロメタン(２０ｍＬ)中のＳＪ１８(１．１５ｇ、１．７９ｍｍｏｌ)の溶液に、Ｃ９６(６２０ｍｇ、３．６０ｍｍｏｌ)を加えた。当該混合物を０℃に冷却し、Ｎ,Ｎ,Ｎ'Ｎ'−テトライソプロピルアミノ、２−シアノエトキシホスファン(１．４８ｍＬ、１．３６ｇ、４．５０ｍｍｏｌ)を加えた。当該反応混合物を室温にまで温め、２時間室温で攪拌した。当該混合物をジクロロメタン６０ｍＬで希釈し、ウェスターで３回抽出した。有機層を硫酸ナトリウムで乾燥させ、濃縮した。当該粗生成物をヘキサン中の１％ＴＥＡ中に充填したシリカゲルカラムで精製し、ヘキサン中の１％ＴＥＡおよび５−１５％酢酸エチルにより抽出し、黄色オイルとして望ましい生成物ＳＪ２１(１．２７ｇ、８６％)を生じた。元素分析。C48H57FeN2O6P: 844.33. 実測値: 844.
核酸プローブのポスト合成のためのフェロセン誘導体
図１９は、フェロセンを含む核酸プローブのポスト合成のための１つの手段を示す。
Ｎ２３５の合成。Ｎ,Ｎ−ジメチルホルムアミド(ＤＭＦ、１０ｍＬ)中のＮ２１９(０．５０ｇ、１．３ｍｍｏｌ)の溶液に、酢酸カリウム(０．６４ｇ、６．６ｍｍｏｌ)を添加し、当該反応物を７５℃で２時間加熱した。当該混合物を室温に冷却し、エチルエーテル１２０ｍＬ中に希釈した。有機層を水で抽出し、硫酸ナトリウムで乾燥させ、濃縮した。粗生成物１,４−ジオキサン５ｍＬおよびメタノール１ｍＬ中に溶解した。当該溶液にＮａＯＨ溶液(４．０Ｍ)１．６ｍＬを加え、当該混合物を室温で３０分間攪拌した。通常の処理後、粗生成物をシリカゲル２５ｇのカラムで精製した。当該カラムをヘキサン中の１％ＴＥＡで充填し、ヘキサン中の１０−５０％酢酸エチルで溶出させ、望ましい生成物(０．４２ｇ、８８％)を得た。
Ｎ２４１の合成。ＤＭＦ(１０ｍＬ)中のＮ２３５(０．５ｇ、１．６ｍｍｏｌ)の溶液に、ＮａＨ(ミネラルオイルで６０％、１３０ｍｇ、３．２ｍｍｏｌ)を加え、当該混合物を室温で１０分間攪拌した。ＤＭＦ(１０ｍＬ)中のジスクシンイミジルカーボネート(０．６ｇ、２．４ｍｍｏｌ)の溶液を当該反応物に加えた。当該反応物を室温で一夜維持した。当該混合物を濃縮し、エチルエーテル中に希釈した。有機層を水で抽出し、硫酸ナトリウムで乾燥させ、濃縮した。粗生成物を、シリカゲル２５ｇのクイックカラムで精製した。当該カラムはジクロロメタン(ＤＣＭ)中の１％ＴＥＡで充填し、ＤＣＭで溶出させ、望ましい生成物を生じた。当該画分を濃縮し、アセトニトリル中で共蒸発させ、ＴＥＡを取り除き、望ましい生成物(０．３６ｇ、５０％)を生じた。1H NMR (300 MHZ, CDCl3) 4.31 (t, 2H), 4.03 (broad, 2H), 3.80 (broad, 1H), 3.64 (broad, 4H), 2.95 (s, 3H), 2.87 (s, 3H), 2.83 (s, 4H), 2.26 (m, 2H), 1.74 (m, 2H), 1.56 (m, 2H); MS C21H25FeNO7は459と予測された, 実測値 460 (MH+).
ＣＴ１９３の合成。Ｎ,Ｎ−ジメチルホルムアミド(ＤＭＦ、８０ｍＬ)中のＮ２(４．５０ｇ、１４．００ｍｍｏｌ)の溶液に、酢酸カリウム(４．１４ｇ、４２．２０ｍｍｏｌ)を添加し、当該反応物を８０℃で１時間加熱した。ＴＬＣ(ＣＨ２Ｃｌ２／ヘキサン(２５／７５))でモニターされる出発物質は残っていなかった。当該混合物をヘキサン／ジクロロメタン(７／３)で希釈し、ブラインで洗浄し、乾燥(ＮａＳＯ４)させ、濃縮し、望ましい生成物を得た。ＴＬＣおよびＧＣ／ＭＳの両方で、精製生産物ＣＴ１９５の形成が示された。当該生産物を更なる精製をすることなく次のステップの反応に使用した。GC/MS: m/e 310 (20), 300 (100), 199 (28), 175 (26), 121 (31).
ＣＴ１９４の合成。１,４−ジオキサン４０ｍＬおよびメタノール８ｍＬ中の、上記で示したように調製したＣＴ１９５溶液に、ＮａＯＨ溶液(４．０Ｍ、１８．２０ｍｍｏｌ)４．５ｍＬを添加し、当該混合物を室温で３０分間攪拌した。当該混合物をヘキサン／ジクロロメタン(７／３)で希釈し、ブラインで洗浄し、乾燥(ＮａＳＯ４)し、濃縮した。粗生成物をシリカゲルカラム(１％ＴＥＡ／ヘキサンで充填)で精製し、ヘキサン中の１０−３０％酢酸エチルで溶出し、黄色オイル(３．２６ｇ、２ステップで９０％)として望ましい生成物を得た。GC/MS: m/e 258 (100), 199 (44), 172 (27), 121 (46).
Ｎ２３８の合成。ＤＭＦ(１０ｍＬ)中のＣＴ１９４(０．５ｇ、１．９ｍｍｏｌ)の溶液に、ＮａＨ(ミネラルオイルで６０％、１４０ｍｇ、３．４ｍｍｏｌ)を加え、当該混合物を室温で１０分間攪拌した。ＤＭＦ(１０ｍＬ)中のジスクシンイミジルカーボネート(０．６ｇ、２．４ｍｍｏｌ)の溶液を当該反応物に加えた。当該反応物を室温で一夜維持した。当該混合物を濃縮し、エチルエーテル中に希釈した。有機層を水で抽出し、硫酸ナトリウムで乾燥させ、濃縮した。粗生成物を、シリカゲル２５ｇのクイックカラムで精製した。当該カラムはジクロロメタン(ＤＣＭ)中の１％ＴＥＡで充填し、ＤＣＭで溶出させ、望ましい生成物を生じた。当該画分を濃縮し、アセトニトリル中で共蒸発させ、ＴＥＡを取り除き、望ましい生成物(０．４０ｇ、５０％)を生じた。1H NMR (300 MHZ, CDCl3) 4.30 (t, 2H), 4.10 (broad, 9H), 2.92 (s, 4H), 2.36 (m, 2H), 1.78 (m, 2H), 1.61 (m, 2H); MS C19H21FeNO5 予測値 399, 実測値 399 (M+).
ＣＴ１９５の合成。Ｎ,Ｎ−ジメチルホルムアミド(ＤＭＦ、１０ｍＬ)中のＣＴ１８６ (０．４５ｇ、１．１４ｍｍｏｌ)の溶液に、酢酸カリウム(０．５６ｇ、５．７２ｍｍｏｌ)を添加し、当該反応物を６０℃で１時間加熱した。ＴＬＣ(ＣＨ２Ｃｌ２／ヘキサン(２５／７５))でモニターされる出発物質は残っていなかった。当該混合物をヘキサン／ジクロロメタン(７／３)で希釈し、ブラインで洗浄し、乾燥(ＮａＳＯ４)させ、濃縮し、望ましい生成物(０．４５ｇ)を得た。ＴＬＣおよびＧＣ／ＭＳの両方で、精製生産物ＣＴ１９５の形成が示された。当該生産物を更なる精製をすることなく次のステップの反応に使用した。GC/MS: m/e 382 (65), 380 (100), 221 (33), 131 (33), 129 (39), 115 (32), 91 (37).
ＣＴ１９６の合成。１,４−ジオキサン５ｍＬおよびメタノール１ｍＬ中の、上記で示したように調製したＣＴ１９５溶液に、ＮａＯＨ溶液(４．０Ｍ)０．４ｍＬを添加し、当該混合物を室温で３０分間攪拌した。当該混合物をヘキサン／ジクロロメタン(７／３)で希釈し、ブラインで洗浄し、乾燥(ＮａＳＯ４)し、濃縮した。粗生成物をシリカゲルカラム(１％ＴＥＡ／ヘキサンで充填)で精製し、ヘキサン中の１０−３０％酢酸エチルで溶出し、黄色オイル(０．３７ｇ、２ステップで９５％、ａ：ｂの領域異性体で約１：５)として望ましい生成物を得た。GC/MS: m/e 340 (63), 338 (100), 324 (25), 322 (40), 294 (21), 165 (18), 155 (16), 115 (20), 91 (21).
Ｎ２４４の合成。ＤＭＦ(３０ｍＬ)中のＣＴ１９６(１．０ｇ、２．１ｍｍｏｌ)の溶液に、ＮａＨ(ミネラルオイルで６０％、１６８ｍｇ、４．２ｍｍｏｌ)を加え、当該混合物を室温で１０分間攪拌した。ＤＭＦ(２０ｍＬ)中のジスクシンイミジルカーボネート(１．６ｇ、４．２ｍｍｏｌ)の溶液を当該反応物に加えた。当該反応物を室温で一夜維持した。当該混合物を濃縮し、エチルエーテル中に希釈した。有機層を水で抽出し、硫酸ナトリウムで乾燥させ、濃縮した。粗生成物を、シリカゲル５０ｇのクイックカラムで精製した。当該カラムはジクロロメタン(ＤＣＭ)中の１％ＴＥＡで充填し、ＤＣＭで溶出させ、望ましい生成物を生じた。当該画分を濃縮し、アセトニトリル中で共蒸発させ、ＴＥＡを取り除き、望ましい生成物(０．５０ｇ、３６％)を生じた。当該生成物は、出発物質がまた、αおよびβ置換物の混合物であるため、２つの異性体の混合物である。1H NMR (300 MHZ, CDCl3) 5.28 (s, 1 H), 4.98 (s, 1 H), 4.63 (m, 1 H), 4.49 (m, 2H), 4.40 (m, 2H), 4.30 (m, 4H), 4.08 (m, 2H), 2.43 (m, 2H), 2.02 (m, 2H); MS C20H19Cl2FeNO5 予測値 479, 実測値 480 (MH+).
Ｎ２５３の合成。ＤＭＦ(３０ｍＬ)中のＮ２５１(１．０ｇ、３．４ｍｍｏｌ)の溶液に、ＮａＨ(ミネラルオイルで６０％、２７４ｍｇ、６．８４ｍｍｏｌ)を加え、当該混合物を室温で１０分間攪拌した。ＤＭＦ(２０ｍＬ)中のジスクシンイミジルカーボネート(２．６３ｇ、１０．２７ｍｍｏｌ)の溶液を当該反応物に加えた。当該反応物を室温で一夜維持した。当該混合物を濃縮し、エチルエーテル中に希釈した。有機層を水で抽出し、硫酸ナトリウムで乾燥させ、濃縮した。粗生成物を、シリカゲル５０ｇのクイックカラムで精製した。当該カラムはジクロロメタン(ＤＣＭ)中の１％ＴＥＡで充填し、ヘキサン中の５０％ＤＣＭで溶出させ、望ましい生成物を生じた。当該画分を濃縮し、アセトニトリル中で共蒸発させ、ＴＥＡを取り除き、望ましい生成物(０．７９ｇ、５３％)を生じた。1H NMR (300 MHZ, CDCl3) 4.33 (t, 2H), 4.29 (m, 2H), 4.14 (m, 2H), 4.09 (m, 2H), 4.00 (m, 2H), 2.84 (s, 4H), 2.40(t, 2H), 1.76 (m, 2H), 1.60 (m, 2H); MS C19H2OClFeNO3 予測値 433, 実測値 433.
フェロセンＤＮＡ複合体の合成のための一般的方法
ＤＮＡをＤＩ水中に溶解し、当該濃度を約８００μＭとした。フェロセン誘導体をＤＭＦ中に溶解した。ＤＮＡ溶液(１００μＬ)に、ＤＭＦ溶液中のフェロセン２００μｌ(５０当量)を添加した。当該混合物を室温で８時間以上維持した。当該サンプルを分析し、ＨＰＬＣで精製した。精製ＤＮＡフェロセン錯体をＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析に移した。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦデータ：N239の予測値, 3261, 実測値 3260; N242の予測値: 3321, 実測値 3317; N245の予測値: 3341, 実測値 3363 (M+Na+); N254の予測値: 3295, 実測値 3293.
実施例５
ＤＮＡシーケンシング
実施例１−４で調整したフェロセン誘導体でフェロセン標識したジデオキシヌクレオチドを、鎖停止シーケンシングにおいてＤＮＡフラグメントを標識するのに使用した。
以下の実験条件は、お決まりの鎖停止化シーケンシング手順による解説のみのために構成したものであり、最適の条件が調査される。Ｍ１３ユニバーサルプライマーを用いる。以下の溶液を調製する：5×Taq Mg Buffer (50 mM Tris Cl pH 8.5, 50 mM MgCl2, 250 mM NaCl); Ferrocene-Terminator Mix (10-50 uM dGTP-Fc2, 10-50 uM dATP-Fc1, 10-50 uM dTTP-Fc4, および 10-50 uM dCTP-Fc3); ならびに DNTP Mix (100 uM dGTP, 100 uM dATP, 100 uM dTTP, および 100 uM dCTP)。アニーリング反応は、微量遠心分離チューブ中に、5×Taq Mg Buffer, 0.4 pmol DNA鋳型, 0.8 pmol プライマー, および水を合わせ、体積12.0 ulとすることにより行う。当該混合物を５５−６５℃で５−１０分間インキュベーションし、２０−３０分間かけてゆっくりと４−２０℃の間にまで冷却し、次いで、一旦、遠心分離し、凝縮物を回収し、ミックスし、氷上におく。次いで、当該混合物に、1.0 ul dNTP Mix, 2.0 ul Ferrocene-Terminator Mix, 4 unitsのTaqポリメラーゼおよび水を加え、体積18.0 ulとする。当該混合物を６０℃で３０分間インキュベーションし、次いで、氷上に置き、10 mM EDTA pH 8.0 25.0 ulと合わし、当該反応をクエンチする。次いで、当該混合物中のDNAをスピンカラム(例えば、5 Prime から 3 PrimeのSelect-Dのような、1 ml Sephadex G-50 カラム, West Chester, Pa.)で精製し、エタノール沈殿する(4 ul 3M 酢酸ナトリウム pH 5.2 および 120 ul 95% エタノールを加え、氷上で１０分間インキュベーションし、１５分間遠心分離し、上清をデカントおよび廃棄し、７０％エタノールで再懸濁し、激しく攪拌し、１５分間遠心分離し、上清をデカントおよび廃棄し、そして５分間遠心しながら真空で乾燥することにより)。次いで、その沈殿したDNAを、５部脱イオンホルムアミドおよび１部50mM EDTA pH8.0からなる溶液3ul中に再懸濁し、激しく攪拌する。カラムにロードする前に、当該混合物を９０℃で２分間インキュベーションし、ＤＮＡを変性させる。
実施例６
複数レドックス電位を有する、Ｒｕ２＋に基づくＥＴＭ
電気化学的に活性なヌクレオチドおよびタグの合成
電気化学的活性ＤＮＡタグの作成に使用される合成アプローチが十分に確立されている。図２１は、一般的レトロ合成スキームを解説する。このスキームは高度に収束性があり、各フラグメントを別々に合成する機会を提供する。そのため、我々のアプローチは、以下の化合物の合成を含む：(ａ)ビス−置換Ｒｕ２＋前駆体(Ｒ２ｂｐｙ)２ＲｕＣｌ２、(ｂ)官能性リンカーを生ずる置換ヒドロキサム酸、および(ｃ)修飾ジデオキシヌクレオシド(チド)。そのアプローチは、フラグメントが容易に修飾され相互に置き換わり得るため、高度にモジューラーであることが明らかである。
Ｒｕ２＋前駆体の合成は、ＲｕＣｌ３を、望ましい置換２,２'−ビピリジンまたは１,１０−フェナントルリンリガンド(Lay, P.A.; et al., Im Inorg. Synth. 1986, 24, 291-306, Shreeve, J.M. (Ed); John-Wiley & Sons, NY.; Bridgewater, et al., Inorg Chim. Acta 1993, 208, 179-188;. Struse, et al., Inorg. Chem. 1992, 31, 3004-3006)と反応させることにより、容易に行う。ｃｉｓ−(ｂｐｙ)２は、この反応の熱力学的生成物である。我々は、我々の研究室でそのビルディングブロックを日常的に合成する(Tzalis, D.; et al., Inorg Chem., 1998, 37, 1121-1123)。置換ヒドロキサム酸は、商業的に利用可能な保護ヒドロキシルアミンと置換安息香酸との縮合反応を介し、容易に合成され得る(Tor, Y.et al, J. Am. Chem. Soc. 1987,109, 6518-6519;. Libman, J.; et al., J. Am. Chem. Soc. 1987, 109, 5880-5881)。多くの安息香酸が商業的に利用可能であるか、またはアクセス可能なビルディングブロックから容易に合成される。伸張ヌクレオチドは、末端アルキン(例えば、Ｎ−Ｂｏｃ−プロパジルアミン)と５−ハロ−ピリジンまたは７−ハロ−アザプリンとの間のＰｄ(０)仲介交差結合反応により典型的に生じる。そのハロゲン化ヌクレオシドは、商業的に利用可能であるか、または商業的に利用可能な前駆体から１ステップで合成され得るか何れかである(Yoshikawa, M.; et al., J. Org. Chem. 1969, 34, 1547-1550; Tzalis, D.; et al., Chem. Commun. 1996, 1043-1044; Tzalis, D.; et al., Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 1997, 36, 2666-2668; Hurley, D.J.;et al., Chem. Commun. 1999, 993-994)。最後のステップでは、修飾ヌクレオシドは、確立された前駆体を使用する相当するトリホスフェートに変換される(Moffatt, I.G. Can. J. Chem. 1964, 42, 599-604; Slotin, L.A. Synthesis 1977, 737-75; Hutchinson, D.W. In Chemistry of Nucleosides and Nucleotides, L.B. Townsend, Ed., 1991, vol. 2, pp. 81-160)。複雑となるならば、ヌクレオシド前駆体は、更なる合成ステップを行うそのモノホスフェートに変換され得(Yoshikawa, M.;et al., Bull. Chem. Soc. Jpn 1969, 42, 3505-3508; Imai, K.-I.;et al., J. Org. Chem. 1969, 34, 1547-1550)、最後のステップでの相当するトリホスフェートに変換され得る(Tor, Y.; et al. J. Am. Chem. Soc. 1993, 115, 4461-4467)。Sephadex A-25および(Et3Nh)+(HCO3)緩衝液を使用するイオン交換クロマトグラフィーは望ましい新規ヌクレオチドを提供する。
図２１に示されるホスホラミダイトは、リンカーの末端にヒドロキシル基を含むＲｕ２＋前駆体および同様のヒドロキサム酸から合成され得る。１Ｈ−テトラゾールの存在下、(２−シアノエトキシ)−ビス(ジイソプロピルアミノ)ホスフィンを使用するホスフィチレーションは、相当する金属修飾ホスホラミダイトを提供する(Hurley, D.J.; et al., J. Am. Chem. Soc. 1998, 120, 2194-2195)。
図２０は、電気化学活性ヌクレオチドの典型的なレトロ合成を示す。各フラグメント：金属錯体、リンカー含有ヒドロキサム酸、および修飾ヌクレオシド(チド)は、別々に合成され得ることに注意すべきである。これは、非常にモジューラーでありバーサチルな、提供されたアプローチを形成し、我々は、レドックス活性ヌクレオチドの特性を調節し得る。
電気化学的ヌクレオチドの酵素学的組み込み
新規金属含有ヌクレオチド、の酵素学的組み込みを評価するため、２つの主な実験を最初に構成する：(ａ)修飾ｄＮＴＰの酵素学的組み込み、および(ｂ)相当するｄｄＮＴＰの酵素学的組み込み(図２２)。最初のセットの実験の目的は、種々のポリメラーゼが、修飾デオキシヌクレオチドを組み込み得るかどうか、修飾部位を通過して伸張を続け得るかどうかを決定する。この方法で、我々は、基質として修飾ｄＮＴＰを受け取ることができないポリメラーゼの能力に誘因する鎖停止と、修飾塩基の組み込み後の右で生ずる可能な停止とを区別し得る。後者の場合、我々は、“天然”のジデオキシヌクレオチドにより生ずるシーケンシングレーンを、レドックス活性化ジデオキシヌクレオチドと比較する。両方の実験は、より長いＤＮＡ鋳型にアニーリングする、短い、末端標識プライマーを使用し得る。
最初の実験では、単一部位での組成物が相違する４つの各鋳型が合成される(図２２ａ)。この鋳型は、特定ヌクレオチドの組み込みが生ずるかどうか、および全長産物が得られるかどうかを明確に決定するように設計される。例えば、図６ａの実験１)は、５'−標識１３−ｍｅｒプライマーで構成され得る。４つすべてのｄＮＴＰの存在下のプライマー伸張は、全長産物を生ずる。ｄＡＴＰが除かれるならば、成熟前の停止が、１８−ｍｅｒ産物を生ずるＣＧＧＣ部位の後の右で生ずる。より短い産物は、ＰＡＧＥにより、全長の対照産物と容易に分離される。当該酵素が、修飾デアザ−Ａトリホスフェートおよび生じた伸張プライマーを認識するならば、ｄＡＴＰ(＋０．５５)の追加により、全長２２−ｍｅｒ産物を生じる(heneration)。酵素が修飾塩基を組み込むが、組み込み後の右で停止するならば、１９−ｍｅｒ産物が得られる。修飾トリホスフェートは、基質として役割をすることができないならば、非修飾１８−ｍｅｒが得られる。５'−標識プライマーを用いる代わりに、全長産物の作成に関する情報もまた、適当な放射標識化ｄＮＴＰを用いることにより得られ得る。例えば、実験１(図２２ａ)では、全長の放射活性バンドは、特有のＴを通過するプライマー伸張が生じるかどうか、３２Ｐ−ｄＴＴＰが当該反応混合物中に存在するかどうかを観察されるのみである。ｄＡＴＰがｄＡＴＰ(＋０．５５)で置換されるならば、全長産物が観察され、我々は、当該酵素が修飾トリホスフェートを認識し当該修飾部位を通過して重合し続け得ると、結論付けることができる。我々の観察は、第二番目の作成のレドックス活性ヌクレオチドのデザインおよび合成にフィードバックされる。
第二の実験では、ジデオキシサンガーシーケンシングが調べられ、修飾トリホスフェートの挙動が“天然ｄｄＮＴＰ(図２２ｂ)”と比較される。この場合、より長いＤＮＡ鋳型を用いる(典型的にプラスミドフラグメント)。Ｔ７ ＤＮＡポリメラーゼは、最初に、開示の条件を用い、サンガーシーケンシング実験に使用される。他の酵素(例えば、ThermosequenanceまたはAmpliTaq DNAポリメラーゼ)および修飾条件が、進展した段階で探索される。
レドックス活性化ヌクレオチドの電気泳動の挙動の最適化
２つの最適化した手順は、(ａ)上記のような修飾ヌクレオチドの酵素学的組み込みを最適化すること、および(ｂ)修飾ヌクレオチドの電気泳動の移動度の最適化することをアドレスする。これらは２つの別の方法として見ることができる一方、それらは相互に関係する。ヌクレオベースに束縛される、構造(質量)および電気活性部分の荷電は、酵素によるその認識およびその電気泳動の挙動の両方に影響する。修飾ヌクレオチドは、構造的に関連する蛍光的タグしたヌクレオチドが十分に動くため、種々のポリメラーゼにより他の基質として、大いに受け入れられるようである。ここで、電気泳動の移動の良好な調節は、電気泳動のバンドの位置づけと塩基同定と間の信頼のおける相関関係を確実とするようにアドレスされなければならない。
図２３は、種々の位置が、金属中心に好都合な電気化学性を変えない構造的修飾に適当であることを示す。
ＤＮＡ鎖中の金属含有ヌクレオチドの組み込みは、相当する天然フラグメントと比較して、より遅い電気泳動の移動を示すフラグメントを示す。これは、増大した質量および金属中心での更なる単一陽性荷電によるものである。我々は、構造的に関連するレドックス活性部分(図２４参照)を使用することを目的とするため、我々は、リンカーおよび“シクレント(siclent)”置換の導入を変化させることにより(図２３に示すように)、我々は、非常に類似の電気泳動挙動を示す種々のヌクレオチドをもたらすことができる。同様の考えが、現在の自動化ＤＮＡシーケンシングのための“電気泳動的に均一”な蛍光色素の発生に適用される。
実験的に、種々のｄｄＮＴＰの電気泳動の挙動は、図２２Ｂに示される一般的スキームを用い調べる。長いＤＮＡ鋳型のサンガーシーケンシングは伝導性があり、すべての修飾ｄｄＮＴＰの相対的移動は相関する。観察された相対的移動に基づき、合成修飾は、我々の第二世代レドックス活性ヌクレオチドのデザインに組み込まれる。
他の設計
レドックス活性のための他の構造が、存在することが示され、複雑が上記システムで生ずるかどうか考えられることを強調することが重要である。２つの選択された例は、図８に示され、ここで、他の陰性荷電リガンドは、[(ｂｐｙ)２Ｒｕ]２＋コアに合わされる(coordinate)。親非置換誘導体は、我々が上記で定義した操作範囲に近いかまたはその範囲内の何れかである、可逆性金属−中心化Ｒｕ２＋／３＋波を示す(Juris, A.; et al., Coord. Chem. Rev. 1988, 84, 85-277; Tabor, S.; et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1987, 84, 4767-4771)。殆どの融通のきくシステムのうちの１つは、陰イオンにおける電子密度が隣接置換基により調節され得るため、アセチルアセトナトリガンドである。そのため、適当な置換基の導入により、我々は、これらのレドックス電位を調節することが可能となる。合成的に、種々の連結鎖(tether)は、２−位に容易に結合し得る。塩基による１,３−ジケトン前駆体を処理することにより、適当な官能性親電子物質(例えば、保護された６−ブロモヘキサン酸)で容易にアルキル化され得る安定なエノラートが提供される。上記示すような類似性のレトロ合成分析により、これらの錯体は、伸張ヌクレオシドと結合し、他のｄｄＮＴＰを提供し得る。同様に、ヒドロキシフェニル−ピリジルシステムから誘導される錯体のレドックス電位は、適当なサブステーションにより調節され得る。図２５は、修飾ｄｄＮＴＰに連結し得る調節可能レドックス活性中心としての２つの他の設計が示されている(電子化学的情報としてｒｅｆ．３０および４０参照)。
レドックス活性オリゴヌクレオチドの電気化学的検出
調製されるすべてのレドックス活性化合物は、環状および四角状波ボルタンメトリーを用い我々の研究室において分析される。我々は、これらの技術を日常的に使用し、金属錯体を特性解析する。我々は、第一に、新規[(ｂｙｐ)２Ｒｕ(Ｌ−)]＋錯体の電気化学的特徴を特性解析する(図２６ｃ)。これは、結合がレドックス挙動を変化しないことを証明する金属含有ヌクレオシド(図２４)の電気化学的特長に従う。次いで、我々は、図２１で示したホスホラミダイトを使用することにより５'−末端にレドックス活性部分でタグ化する短いオリゴヌクレオチドを調製する。次いで、ボルタンメトリー技術は、表面上に電気化学的に活性なオリゴヌクレオチドの存在を検出するのに適用される。このシステムは、検出のより低い限界を定義し、感度を促進し検出の限界を低くし得る可能性ある電気化学的技術を探索するのに使用する。
すべての引用文献は、引用することにより本明細書に含め、２０００年７月２６日付け米国特許番号０９／６２６，０９６およびＷＯ０１／０７６６５も本明細書に含める。

Claims (10)

  1. 標的核酸の塩基配列決定方法であって、
    ａ）標的塩基配列に対して相補的な複数のシーケンスプローブを提供するステップと、
    各シーケンスプローブのそれぞれは、異なる長さを有し、異なるレドックス電位を含むＥＴＭを含む異なる鎖停止ＮＴＰを有し、
    ｂ）塩基の大きさに応じて前記核酸を分離するステップと、
    ｃ）標的核酸の少なくとも一部分の塩基配列を特定するために、各ＥＴＭを検出するステップと、を有することを特徴とする方法。
  2. 異なるレドックス電位を有するＥＴＭと共有結合する複数のシーケンスプローブを生成する方法であって、
    ａ）第１の５’保護デオキシヌクレオチドで置換された第１のオリゴヌクレオチドを提供するステップと、
    ｂ）第１のレドックス電位を有する第１のＥＴＭ誘導体を提供するステップと、
    ｃ）該第１のオリゴヌクレオチドを該第１のＥＴＭ誘導体に混合して、第１のレドックス電位を有する第１のＥＴＭを含む第１のデオキシヌクレオチド三リン酸を含む第１のシーケンスプローブを形成するステップと、
    ｄ）第２の５’保護デオキシヌクレオチドと置換された第２のオリゴヌクレオチドを提供するステップと、
    ｅ）第２のレドックス電位を有する第２のＥＴＭ誘導体を提供するステップと、
    ｆ）該第２のオリゴヌクレオチドを該第２のＥＴＭ誘導体に混合して、第２のレドックス電位を有する第２のＥＴＭを含む第２のデオキシヌクレオチド三リン酸を含む第２のシーケンスプローブを形成するステップと、を有することを特徴とする方法。
  3. 請求項２に記載の方法であって、
    ａ）第３の５’保護デオキシヌクレオチドと置換された第３のオリゴヌクレオチドを提供するステップと、
    ｂ）第３のレドックス電位を有する第３のＥＴＭ誘導体を提供するステップと、
    ｃ）該第３のオリゴヌクレオチドを該第３のＥＴＭ誘導体に混合して、第３のレドックス電位を有する第３のＥＴＭを含む第３のデオキシヌクレオチド三リン酸を含む第３のシーケンスプローブを形成するステップと、を有することを特徴とする方法。
  4. 請求項３に記載の方法であって、
    ａ）第４の５’保護デオキシヌクレオチドと置換された第４のオリゴヌクレオチドを提供するステップと、
    ｂ）第４のレドックス電位を有する第４のＥＴＭ誘導体を提供するステップと、
    ｃ）該第４のオリゴヌクレオチドを該第４のＥＴＭ誘導体に混合して、第４のレドックス電位を有する第４のＥＴＭを含む第４のデオキシヌクレオチド三リン酸を含む第４のシーケンスプローブを形成するステップと、を有することを特徴とする方法。
  5. 請求項２、３、または４に記載の方法であって、
    第１、第２、第３、および第４のデオキシヌクレオチド三リン酸が異なることを特徴とする方法。
  6. 請求項２、３、または４に記載の方法であって、
    ＥＴＭの少なくとも１つは、遷移金属錯体であることを特徴とする方法。
  7. 請求項６に記載の方法であって、
    遷移金属錯体はフェロセンであることを特徴とする方法。
  8. 請求項１に記載の方法であって、
    検出ステップは、シーケンスプローブを、異なる電位を有する４つのシーケンス電極上に通過させるステップを有することを特徴とする方法。
  9. 請求項１に記載の方法であって、
    検出ステップは、シーケンスプローブを単一の電極上に通過させるステップを有することを特徴とする方法。
  10. 異なるレドックス電位を有するＥＴＭと共有結合する複数の核酸を生成する方法であって、
    ａ）第１のレドックス電位を有し、第１の官能基を含む第１の遷移金属錯体を提供するステップと、
    ｂ）第２の官能基で置換された第１のオリゴヌクレオチドを提供するステップと、
    ｃ）該第１の遷移金属錯体を該第１のオリゴヌクレオチドに混合して、第１のレドックス電位を有する第１の遷移金属錯体−オリゴヌクレオチドの複合体を形成するステップと、
    ｄ）第２のレドックス電位を有し、第１の官能基を含む第２の遷移金属錯体を提供するステップと、
    ｂ）第２の官能基で置換された第２のオリゴヌクレオチドを提供するステップと、
    ｃ）該第２の遷移金属錯体を該第２のオリゴヌクレオチドに混合して、第２のレドックス電位を有する第２の遷移金属錯体−オリゴヌクレオチドの複合体を形成するステップと、を有することを特徴とする方法。
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