CN115867674A - 用于分子电子学的工程化改造的dna - Google Patents
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Abstract
本发明涉及工程化改造的核酸碱基，其用于分子电子学，例如纳米传感器、分子级晶体管、FET装置、分子马达、逻辑和储存装置和纳米间隙电子测量装置，用于生物聚合物的鉴定和/或测序。
Description
本申请要求2019年11月20日提交的第62/938,084号美国临时申请的优先权，该临时申请通过引用全文纳入本文。
技术领域
本发明涉及工程化改造的核酸碱基，其用于分子电子学，例如纳米传感器、分子级晶体管、FET装置、分子马达、逻辑和储存装置、纳米间隙电子测量装置，用于生物聚合物的鉴定和/或测序等。
背景
下一代光刻(NGL)技术，例如极紫外光(EVL)，允许大批量制造的亚-10nm工艺。1通过为7nm节点准备的EVL，它使工艺比现有最先进的193-nm浸没式光刻(immersionlithography)更便宜、更快速。使用NGL，5nm节点的工艺也是可行的。传统的微芯片制造是能源和资源密集型的。因此，发现任何能减少这些支出的新制造方法对半导体工业都是高度有益的。
上述半导体工业的发展为‘自下而上’的从单有机分子组装亚-10nm的电子部件，例如晶体管，铺平了道路。2DNA是单分子电子学最有吸引力的分子之一，因为它具有均匀的一维结构(直径约2nm)，通过Watson-Crick碱基配对规则(G碱基与C配对，A与T配对)进行可编程的自我组装，以及从纳米到微米的可调长度，精度为埃级。因此，DNA已被研究为用于构建分子电子学的理想纳米材料。然而，对DNA中电荷传输的早期测量表明，DNA作为绝缘体，3-6半导体，7，8或类似金属的导体。9，10这些矛盾的观察可能是由被测样品(DNA的结构、序列、长度等)、测量环境和方法引起的，11已知DNA结构是多态的，其随着环境的变化而变化。在过去的15年中，单分子技术的发展促进了单分子电导率的测量。例如，单分子断裂结(single molecule break junction)技术允许人们在水性溶液中重复测量单分子的电导率。TG8C8A的DNA双链体在30至50mV的偏压下测得的电导约为72nS。12共识认为短DNA是一维半导体，DNA在长度尺度超过40nm时是绝缘的6，13。DNA的电导可以通过电化学门控14和嵌入剂(intercalator)整流(rectified)。15本质上说，在DNA分子中，T-A碱基对的导电性比G-C碱基对的导电性差，错配的碱基对也会改变DNA的电导率16。DNA的电导率随其AT碱基对的长度呈指数下降，而随其G-C碱基对的长度以1/L下降。17因此，当使用贵金属电极(如金和铂)测量电导率时，AT碱基对在通过DNA的电子传输中起到了障碍作用。这些金属电极具有比核碱基的LUMO能更接近HOMO能的功函数，作为空穴注入(hole injection)的阳极(anode)。18在天然存在的核碱基中碱基G具有最低的电离电位，它是一个明确的强空穴受体(holeacceptor)。18在跳跃模型(hopping model)中，G是DNA传导的跳跃位点(hopping site)。19，20注意，这种动态无序可能对空穴转移(hole transfer)是有利的。它有助于电荷运载体克服由传播的空穴和空穴供体阴离子之间的静电相互作用形成的障碍。21
DNA与电极的接触也对其测量的电导有显著影响。22Wagner和同事用富勒烯(C60)作为锚以将DNA连接至金电极。23他们观察到包含66.7％的GC碱基对的DNA分子在大于20nm的范围内进行长程电荷传输，在0到1V的偏压下，电流强度在纳米安培范围内。然而，富勒烯通过C6烷基链被偶联至DNA，这带来了一个高隧穿障碍，每个亚甲基基团的衰减常数(β)为1.0。24
通常，DNA是由四种脱氧核苷组成的大分子，脱氧腺苷(dA)、脱氧胞苷(dC)、和脱氧鸟苷(dG)和胸苷(T)，其通过磷酸二酯键连接在一起。它可以通过化学或酶促的方式合成，这允许用多种修饰工程化改造DNA。尽管只含有鸟嘌呤-胞嘧啶(G：C)碱基对的同质序列在电荷传输方面表现出相对较高的空穴迁移率，但其长链和高纯度的合成是困难的。此外，富含GC的DNA易于形成不期望的二级甚至四级结构。
附图简要说明
图1说明了本发明中工程化改造的DNA的一般结构。
图2显示了通过DFT计算确定的5-丙烯基脱氧尿苷(101)和其天然对应物，胸苷的HOMO和LUMO结构。
图3显示了通过DFT计算确定的8-(3-巯基丙炔基)-脱氧鸟苷(201)和其母体脱氧鸟苷核苷的HOMO和LUMO结构。
图4显示了通过DFT计算确定的7-丙烯基-7-脱氮-脱氧腺苷(301)和其母体脱氧鸟苷核苷的HOMO和LUMO结构。
图5显示了经典DNA碱基和修饰碱基之间的碱基对的氢键合模式，以及它们的HOMO和LUMO结构。
图6显示了(a)连接到金属电极的DNA双链体-1的构型及其透射谱(transmissionspectra)(列于表5)，(b)连接到金属电极的DNA双链体-2的构型及其透射谱(列于表5)。
图7显示了DNA双链体-1和双链体-2的I-V曲线及其微分电导谱(differentialconductance spectra)。
图8显示了连接到金属电极的DNA双链体-3的构型(列于表5)(a)，其透射谱(b)，DNA双链体-1和双链体-3的I-V曲线(c)，以及其微分电导谱(d)。
图9显示了连接到金属电极的DNA双链体-4的构型(列于表5)(a)，其透射谱(b)，DNA双链体-1和双链体-4的I-V曲线(c)，以及其微分电导谱(d)。
图10显示了连接到金属电极的DNA双链体-5的构型(列于表5)(a)，其透射谱(b)，DNA双链体-1和双链体-2以及双链体-5的I-V曲线(c)，以及其微分电导谱(d)。
图11显示了连接到金属电极的DNA双链体-6的构型(a)，其透射谱(b)，DNA双链体-6和双链体-2的I-V曲线(c)，以及其微分电导谱(d)。
图12显示了连接到金属电极的DNA双链体-7的构型(a)，其透射谱(b)，DNA双链体-7和双链体-5的I-V曲线(c)，以及其微分电导谱(d)。
发明内容
本发明提供了用修饰的核碱基工程化改造的DNA，如图1a所示，修饰的核碱基出现在DNA双链体的任何一条或两条链上。修饰的碱基改进了DNA的电导，并保留了其碱基配对特异性。工程化改造的DNA可以用作分子电子线路、纳米传感器和其他纳米级电子装置的构建元件。工程化改造的DNA在其两端包括分子锚(图1b中的B1)，用于附接至电极，以桥接纳米间隙和/或官能团(图1c中的B点击)，用于与其他化学和生物传感所用的化学和生物分子偶联。这些修饰可以很容易地通过化学或酶促合成纳入DNA中。
工程化改造的DNA可用于纳米间隙电子测量装置，用于鉴定和/或测序生物聚合物，例如但不限于专利申请US20170044605A1、US20180305727A1以及临时专利申请US62794096、US62812736、US62833870、US62890251、US62861675和US62853119中公开的装置，包括纳米结构或纳米间隙装置，以鉴定和/或测序DNA、RNA、蛋白质、多肽、寡核苷酸、多糖及其类似物等，无论是天然的、合成的或修饰的。上述专利申请中公开的这些装置中的化学或传感探针选自但不限于：天然的、突变的、表达的或合成的核酸探针、分子镊子、酶、受体、配体、抗原和抗体及其组合。酶包括但限于天然的、突变的或合成的DNA聚合酶、RNA聚合酶、DNA解旋酶、DNA连接酶、DNA外切核酸酶、逆转录酶、RNA引物酶、核糖体、蔗糖酶、乳糖酶等。
具体实施方式
本发明首先提供了修饰的核苷和其亚磷酰胺、5-烯基-2'-脱氧尿苷，用于DNA的工程化改造。如方案1所示，这些化合物是通过按照文献中发表的过程合成的，25其中R是烷基基团，例如甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基、叔丁基、环丙基、环己基，但不限于这些，或卤代烷基，例如三氟甲基，还有芳环，例如苯、五元杂环及其衍生物。
方案1
在本发明的一些实施方式中，通过用修饰的尿苷101(表示为Um)替换胸苷工程化改造DNA，其具有如下所示的化学结构：
具体地，核苷101是具有丙烯基基团附接至其碳5的2’-脱氧尿苷，其中丙烯基基团的双键具有E构型。核苷101被转化为亚磷酰胺102，为了通过化学合成将其纳入DNA(方案2)。
方案2
过程(i)：核苷101被干燥，通过用干吡啶重复共蒸发和溶于无水吡啶，随后添加4，4′-二甲氧基三苯甲基氯、4-二甲基氨基吡啶和新鲜蒸馏的三乙胺。在氮气气氛下搅拌溶液，通过TLC(CHCl3/乙醇 10∶1)分析粗反应混合物进行监测，直到游离核苷不存在。通过逐滴加水淬灭反应混合物，并用乙醚萃取(3×40ml)。合并有机层，通过Na2SO4干燥、过滤并在减压下蒸发成油状残留物。使用硅胶柱色谱将产物101-DMTr从残留物中分离出来。
过程(ii)：核苷101-DMTr通过在真空下重复用乙腈共蒸发三次被干燥，并溶于无水CH2Cl2。向溶液中加入二异丙基铵盐四氮唑与2-氰基乙基N，N，N′，N′-四异丙基亚磷酰二胺。溶液被允许在氮气下在室温下放置，偶尔轻轻搅拌，通过TLC监测直到完全没有起始材料。反应混合物被冷却至0℃并通过逐滴加入甲醇/0.5％TEA淬灭。溶液在减压下蒸发成油状残留物。残留物溶于CH2Cl2并用NaHCO3的饱和溶液洗涤两次，通过Na2SO4干燥，并在减压下蒸发成油状残留物。通过用己烷/乙酸乙酯/TEA(1％)的色谱洗脱纯化产物102。
通过密度泛函理论(density functional theory)(DFT)计算表明，与其母体核苷脱氧胸苷相比，以0eV参考为最高点，修饰的脱氧尿苷101(Um)具有更高的HOMO和更低的LUMO能，导致HOMO和LUMO之间更小的能隙(表1)。图2显示这些核苷的HOMO和LUMO都位于他们的核碱基中。修饰的碱基Um具有比天然碱基T更高的HOMO和更低的LUMO。
表1.通过DFT计算核苷101的结构性质
(B3LYP/6-311+G(2df，2p))
在一个实施方式中，Um通过自动DNA合成仪被化学纳入DNA。一个示例性序列为5’-CGCGUmCGCG201，其还包括在其3’-端的修饰的鸟苷201(表示为G201或201G)，用于其附接至金属电极。修饰的G201可以通过其亚磷酰胺衍生物(202)被纳入DNA，其是按照现有技术方法合成的26。
在本发明的一个实施方式中，核苷201和其母体脱氧鸟苷核苷的HOMO和LUMO是通过DFT计算确定的，列于表2。图3显示了这些核苷的HOMO和LUMO，其都位于他们各自的核碱基中。此外，该修饰不能改变HOMO能级。但，它降低了LUMO能级，这意味着对于来自电极的空穴注入，修饰的鸟嘌呤应当具有与天然鸟嘌呤相同的效率，或有更好的效率。
表2.通过DFT计算核苷201的结构性质(B3LYP/6-311+G(2df，2p))
在本发明的一些实施方式中，通过用修饰的脱氧腺苷301(表示为Am)替换脱氧腺苷工程化改造DNA，其具有如下所示的化学结构：如方案3所示，通过首先运行铃木偶联反应(Suzuki coupling reaction)(反应i)，27然后用苯甲酰基基团保护301的氨基基团(反应ii)，28其，进而，以[0020]段所述的相同的方式，被转化为其对应的亚磷酰胺(反应iii)，合成核苷301。结构中的甲基(CH3)基团可以被另一烷基基团取代，例如乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基、叔丁基、环丙基、环己基，但不限于这些，或卤代烷基，例如三氟甲基，或芳环，例如苯、五元杂环及其衍生物，但不限于它们。
DFT计算表明修饰的脱氧腺苷301(Am)具有更高的HOMO和更低的LUMO能，导致相较于天然存在的母体脱氧腺苷，其HOMO和LUMO之间有更小的能隙(表2)。图4显示了这些核苷的HOMO和LUMO，其都位于他们各自的核碱基中。
表3.通过DFT计算核苷301的结构性质(B3LYP/6-311+G(2df，2p))
图4列出了通过DFT计算确定的氢键合碱基对的分子轨道能，其包括天然存在的沃森-克里克碱基对以及与T碱基配对的修饰的A(Am)和与修饰的U(Um)配对的A。由于所述核苷的HOMO和LUMO位于其各自核碱基中，其糖环被甲基基团(图5)替换以减少这些碱基对的DFT计算的CPU时间。如图5所示，对于这些所述的碱基对，所有的HOMO都位于嘌呤环中，LUMO位于嘧啶环中。它们的HOMO和LUMO能级列于表4。与A:T碱基对相比，Am:T具有更高的HOMO能级和相当的LUMO能级；相反，A:Um具有更低的LUMO能和相似的HOMO能级。相较之下，Am:Um具有比A:T碱基对更高的HOMO和更低的LUMO能级。与C:G碱基对相比，Am:T具有更高的LUMO能级和相当的LUMO能级；A:Um具有更低的HOMO和更低的LUMO能级；Am:Um具有更低的LUMO和相似的HOMO能级。此外，与天然A:T碱基对相比，这些碱基对的偶极矩增加了，这可能会增加近邻碱基对之间的碱基堆叠相互作用。
表4.通过DFT计算碱基对的结构性质(B3LYP/6-311+G(2df，2p))
在本发明中，DNA的电导是使用非平衡格林函数形式体系(Non-EquilibriumGreen′s Functions formalism)(NEGF)确定的，其为用于模拟电子通过纳米级装置传输的理论框架29-33。首先，计算透射函数T(E)，其描述了能量为E的电荷通过散射区从左电极传输到右电极的概率。用透射函数，在电极之间施加给定的电偏压时，使用Landauer-Buttiker形式体系(S.Datta，介观系统中的电子传输，剑桥大学出版社，剑桥，1995)计算电流
其中f(E)是对于给定电子温度的狄拉克分布函数(the Fermi-Diracdistribution function)，化学势能μS，μD分别为Ef+V和Ef。Ef是对应的电极的费米能级(Fermi level)(对于源极和漏极通常相等)。
在一些实施方式中，DNA双链体包括在其中间具有碱基对X的回文序列5’-CGCG-X-CGCG(表5)。对于双链体-1和2，X分别是经典的A:T和C:G碱基对。在双链体的其余部分，X是Am:T、Am:Um或Um:A。这些修饰碱基可以与天然存在的碱基对和在它们之间形成经典的沃森-克里克氢键合碱基对，如图5所示。在这些碱基对中，它们的HOMO主要位于嘌呤碱基，LUMO位于嘧啶碱基。这些双链体在3’-端各自携带修饰的G(201G，在本情况中)用于其附接至金属电极(金，在本情况中)。对于电流，空穴通过其被连接至的电极被注入鸟嘌呤；然后，电荷通过该DNA线被传输至另一电极。
表5.包括含有修饰的单个Tm和Am的序列的DNA双链体
在一个实施方式中，双链体-1和双链体-2分别地通过其末端的鸟嘌呤被附接至两个电极，如图6所示。通过双链体-1和双链体-2的电子传输的透射谱是通过上述计算确定的。进而，其电导也是由上述方法衍生自透射谱。这些双链体的I-V曲线是在0-3V的范围内产生的，如图7a所示。首先，双链体-1和双链体-2仅包括天然核碱基，它们之间唯一的区别是他们序列中间的碱基对。结果显示在接近零的偏压下(约0至0.25v)，双链体-2是比双链体-1导电性略好，这与文献中报道的一致，因为AT碱基对降低DNA分子的电导率。在0.5-2.0V的偏压范围内，双链体-2变得比双链体-1导电性低。随着偏压进一步增加，双链体-2又变得比双链体-1导电性更好。图7b显示了双链体-1和双链体-2的微分电导曲线。它们的转变位于不同的偏压下，这反应了它们具有不同的局域态密度(local density of state)(LDOS)。
在另一个实施方式中，通过[0027]段中所述方法确定双链体-3的电导，其中Am(301)替代了双链体-1的核碱基A。双链体-3以与双链体-1和双链体-2相同的方式被连接至金电极(图8a)，其透射谱被计算，如图8b所示。如图8c所示，对核碱基A的修饰在低偏压范围内显著降低了DNA双链体的电导率。随着偏压的增加，双链体-1和双链体-3的电导以类似的速率增加，以达到它们的第一个平台。很快，双链体-3的电导率以与前一个相同的速率增加以达到第二个平台。相反，双链体-1在1-2V的范围内保持其电导不变，然后以与前一个相似的速率增加以达到第二个平台。因此，在两个DNA双链体之间电导差异在较高的偏压下比较低的偏压下变得小得多。这些结果也都反映在它们的微分电导上(图8d)，其中双链体-3具有双链体-1大得多的动态范围。
在一个实施方式中，通过[0027]段中所述方法确定双链体-4的电导，其中Am:Um替代了双链体-1的A：T碱基对。双链体-4以与双链体-1相同的方式连接至金电极(图9a)。基于构型，计算双链体-4的透射谱示于图9b，I-V曲线于图9c。为了比较，双链体-1的I-V曲线也包括于图9c中。总体上，双链体-4比双链体-1更具导电性。特别地，在低偏压下，双链体-4具有比双链体-1高5.8x102倍的电导。从它们的微分电导而言(图9d)，两个双链体的电导都随着偏压增加；然而，在低偏压范围内双链体-4比双链体-1更早达到峰值。在更高的偏压范围内，然后，双链体-1比双链体-4更早达到高峰。这些结果表明碱基对修饰增加DNA的电导。
在一个实施方式中，通过[0027]段中所述方法确定双链体-5的电导，其中Um:A碱基对替代了双链体-2的C:G碱基对。双链体-5以与双链体-2相同的方式连接至金电极(图10a)。基于构型，计算双链体-5的透射谱示于图10b，I-V曲线于图10c。为了比较，双链体-1和双链体-2的I-V曲线也包括于图10c中。数据显示，在0-2V的偏压范围内，双链体-5的电导可以比双链体-1高一个数量级，比双链体-2高四倍，表明相较于天然存在的A:T和C:G碱基对，Um:A碱基对增加DNA的电导率。在更高的偏压下(＞2V)，天然存在的碱基对变得比修饰的Um:A碱基对更具导电性。因此，修饰的碱基可以用于低压操作以增加DNA的电导率。另外，双链体-5的电导在0.3V时变化最大(图10d)，在这种情况下它可能提供更高的传感灵敏度。
在一个实施方式中，双链体-2的内部C:G碱基对完全被A:Um碱基对所替换，这构成了双链体-6，其形式如下：
5’-C-A-Um-A-Um-A-Um-A-G201
201G-Um-A-Um-A-Um-A-Um-C-5′
其以与双链体-2相同的方式连接至金电极(图11a)。基于构型，通过[0027]段中所述方法计算其电导。首先，计算其透射谱，示于图11b，和其I-V曲线于图11c。为了比较，双链体-2的I-V曲线也包括于图11c中。该数据显示在0-2V的偏压范围内，双链体-6的导电性比双链体-2强30-70倍。相较于双链体-5，其中一个Um:A碱基对取代双链体-2的中间C:G碱基，多个Um:A取代创造了一定程度的协同效应。然而，在高偏压下(＞2.0)双链体-2比双链体-6更具导电性。因此，可以通过用修饰的Um:A碱基对替换G:C碱基对改变DNA分子的电导。图11d显示这两个双链体具有不同的转变状态，其第一个转变发生在相似的位置(～0.2V)。Um:A碱基对通过形成两个氢键彼此相互作用，而G：C碱基对通过三个氢键。结果，双链体-6应当比双链体-2更具柔性，对传感的外部刺激更敏感。然而，双链体-2具有比双链体-6更多的不同的转变状态，如其差分电导所示(图11d)。
在一些实施方式中，发明还提供了修饰的鸟苷401(表示为G401或401G)以将DNA附接至金属电极。与Gm相同，修饰的G401可以通过其二硫化(with a disulfide)的亚磷酰胺衍生物形式(402)被纳入DNA，其是按照现有技术方法合成的。该二硫化物可以被还原成硫醇，以在使用前附接至金属电极上。
在一个实施方式中，双链体-7是通过用G401替换双链体-5的G201合成的，其形成如下所示的双链体：
5’-CGCG-Am-CGCG401
401GCGC-T-GCGC-5′
其以与双链体-5相同的方式连接至金电极(图12a)。基于构型，通过[0027]段中所述方法计算其电导。首先，计算其透射谱，示于图12b，和其I-V曲线于图12c。在低偏压下(0-1V)，双链体-5比双链体-7的导电性高两个数量级。然而，在高偏压下，双链体-7比双链体-5的导电性高5倍。此外，当电压高于0.7V时，双链体-7具有比双链体-5更高的微分电导。
本发明提供了5-烯基-2’-脱氧胞苷及其亚磷酰胺，用于DNA的工程化改造。合成这些化合物，如方案4所示，其中R是烷基，例如，甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基、叔丁基、环丙基、环己基，但不限于它们，或卤代烷基，例如三氟甲基。另外，R是芳环，例如苯、五元杂环及其衍生物。
方案4
本发明提供了7-脱氮-7-烯基-2′-脱氧鸟苷，以互补5-烯基-2′-脱氧胞苷在DNA中用于碱基配对，如下所示，其中R是甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基、叔丁基、环丙基、环己基，但不限于它们，或卤代烷基例如三氟甲基。另外，R是芳环，例如苯、五元杂环及其衍生物。这些化合物是按照[0024]段中提到的方法合成的。
本发明提供了如下所示的三磷酸核苷，其中B是上面提到的修饰的核碱基，用于以酶促方式将修饰纳入DNA。该酶是DNA聚合酶，可以在有或没有模板的情况下延长DNA链。
在一些实施方式中，具有用本发明的所述方法或方案的修饰的一个或多个核碱基的工程化改造的DNA可用于纳米间隙电子测量装置，用于生物聚合物
本发明的实施方式是导电性或半导电性的分子线的系统，其包括包含一个或多个核酸碱基对的纳米结构，其中纳米结构内的至少一个核酸碱基是修饰的，相较于相同位置的经典核酸碱基，修饰的核酸碱基的存在改进了该纳米结构的电导。
一种用于生物聚合物鉴定、表征或测序的系统，其包括，第一电极和第二电极彼此相邻放置在非导电性基材上或被非导电性层分离地相互重叠放置形成的纳米间隙；包括一个或多个核酸碱基对的纳米结构，其通过化学键将一端附接至第一电极且另一端附接至第二电极，桥接所述纳米间隙，其中纳米结构内的至少一个核酸碱基是修饰的，相对于相同位置的经典核酸碱基，修饰的核酸碱基的存在改进了纳米结构的电导；附接至纳米结构的传感探针，其能够与生物聚合物相互作用或进行化学或生物化学反应。进一步包括施加于第一电极和第二电极之间的偏压；提供记录通过纳米结构的电流波动的装置，电流波动是由传感探针和生物聚合物之间相互作用导致的；和配置为用于数据分析从而鉴定或表征生物聚合物或生物聚合物的亚单位的软件。在其他实施方式中，其中纳米结构选自下组：核酸双链体、核酸三链体、核酸四链体、核酸折纸结构及其组合。在其他实施方式中，其中相较于无修饰的相同位置的经典核酸碱基，核酸碱基修饰减少HOMO和LUMO之间的能隙。在其他实施方式中，纳米结构包括修饰的尿嘧啶(Um)，其中Um是5-烯基-尿嘧啶；或修饰的胸腺嘧啶(Tm)，其中Tm是5-烯基-胸腺嘧啶；或修饰的腺嘌呤(Am)，其中Am是7-脱氮-7-烯基-腺嘌呤或7-丙烯基-7-脱氮-腺嘌呤；或修饰的鸟嘌呤(Gm)，其中Gm是7-脱氮-7-烯基-2’-鸟嘌呤；或修饰的胞嘧啶(Cm)，其中Cm是5-烯基-胞嘧啶；或修饰的鸟嘌呤用于电极附接(Gs)，其中Gs是二硫化的7-脱氮-7-(3-巯基丙炔基)-2’-脱氧鸟苷或8-(3-巯基丙炔基)-脱氧鸟苷；或Um和Am的碱基对，或Tm和Am的碱基对，或Gm和Cm的碱基对或其组合；或上述的组合。在其他实施方式中，生物聚合物选自下组：天然的、合成的或修饰的DNA、RNA、蛋白质、多肽、寡核苷酸、多糖和其类似物。在其他实施方式中，传感探针选自下组：天然的、突变的、表达的或合成的核酸探针、分子镊子、酶、受体、配体、抗原和抗体，及其组合。在其他实施方式中，酶选自下组：天然的、突变的或合成的DNA聚合酶，RNA聚合酶，DNA解旋酶，DNA连接酶，DNA外切核酸酶，逆转录酶，RNA引物酶，核糖体，蔗糖酶，乳糖酶。在其他实施方式中，两个电极之间的纳米间隙大小或距离为约3-1000nm，优选约5-100nm，最优选约5-30nm。在其他实施方式中，电极使用选自下组的贵金属制作：铂(Pt)、金(Au)、银(Ag)、钯(Pd)、铑(Rd)、钌(Ru)、锇(Os)、和铱(Ir)，或另一种选自下组的金属制作：铜(Cu)、铼(Re)、钛(Ti)、铌(Nb)、钽(Ta)及其衍生物，例如TiN和TaN或合金，及其组合。
实施方式涉及一种改进分子线电导的方法，其包括，修饰至少一个核酸碱基，使得相较于相同位置的经典核酸碱基，修饰的核酸碱基的存在改进分子线的电导，其中分子线是包括一个或多个核碱基对的纳米结构。
另一个实施方式涉及用于生物聚合物的鉴定、表征或测序方法，其包括，通过将第一电极和第二电极彼此相邻放置在非导电性基材上或被非导电性层分离地相互重叠放置形成纳米间隙；提供长度与纳米间隙相当的包括一个或多个核酸碱基对的纳米结构，其中纳米结构内的至少一个核酸碱基是修饰的，相对于相同位置的经典核酸碱基，修饰的核酸碱基的存在改进了纳米结构的电导；通过化学键将纳米结构的一端附接到第一电极，另一端附接到第二电极；并将传感探针附接至可与生物聚合物相互作用或进行化学或生物化学反应的纳米结构。在其他实施方式中，该实施方式进一步包括在第一电极和第二电极之间施加偏压；提供记录通过所述纳米结构的电流波动的装置，所述电流波动是由所述传感探针和生物聚合物之间相互作用导致的；和提供用于数据分析鉴定或表征所述生物聚合物或所述生物聚合物的亚单位的软件。在其他实施方式中，其中所述纳米结构选自下组：核酸双链体、核酸三链体、核酸四链体、核酸折纸结构及其组合。在其他实施方式中，其中相较于无修饰的相同位置的经典核酸碱基，所述核酸碱基修饰减少HOMO和LUMO之间的能隙。在其他实施方式中，纳米结构包括，修饰的尿嘧啶(Um)，其中Um是5-烯基-尿嘧啶；或修饰的胸腺嘧啶(Tm)，其中Tm是5-烯基-胸腺嘧啶；或修饰的腺嘌呤(Am)，其中Am是7-脱氮-7-烯基-腺嘌呤或7-丙烯基-7-脱氮-腺嘌呤；或修饰的鸟嘌呤(Gm)，其中Gm是7-脱氮-7-烯基-2’-鸟嘌呤；或修饰的胞嘧啶(Cm)，其中Cm是5-烯基-胞嘧啶；或修饰的鸟嘌呤用于电极附接(Gs)，其中Gs是二硫化的7-脱氮-7-(3-巯基丙炔基)-2’-脱氧鸟苷或8-(3-巯基丙炔基)-脱氧鸟苷；或Um和Am的碱基对，或Tm和Am的碱基对，或Gm和Cm的碱基对或其组合；或上述的组合。在其他实施方式中，生物聚合物选自下组：天然的、合成的或修饰的DNA、RNA、蛋白质、多肽、寡核苷酸、多糖和其类似物。在其他实施方式中，传感探针选自下组：天然的、突变的、表达的或合成的核酸探针、分子镊子、酶、受体、配体、抗原和抗体，及其组合。在其他实施方式中，酶选自下组：天然的、突变的或合成的DNA聚合酶，RNA聚合酶，DNA解旋酶，DNA连接酶，DNA外切核酸酶，逆转录酶，RNA引物酶，核糖体，蔗糖酶，乳糖酶。在其他实施方式中，两个电极之间的纳米间隙大小或距离为约3-1000um，优选约5-100nm，最优选约5-30nm。在其他实施方式中，电极使用选自下组的贵金属制作：铂(Pt)、金(Au)、银(Ag)、钯(Pd)、铑(Rd)、钌(Ru)、锇(Os)、和铱(Ir)，或另一种选自下组的金属制作：铜(Cu)、铼(Re)、钛(Ti)、铌(Nb)、钽(Ta)及其衍生物，例如TiN和TaN或合金，及其组合。在其他实施方式中，本发明涉及提供一个或多个选自下组的核苷三磷酸：5-烯基-2’-脱氧胞苷三磷酸、5-烯基-2’-脱氧尿苷三磷酸、三磷酸、5-烯基-2’-脱氧胸苷三磷酸、7-脱氮-7-烯基-2’-脱氧腺苷三磷酸、7-脱氮-7-烯基-2’-脱氧鸟苷三磷酸、8-(3-巯基丙炔基)-脱氧鸟苷三磷酸及其组合；和使用提供的核苷三磷酸通过酶促将修饰的核酸碱基纳入纳米结构内的核酸链。
一般性说明：
本发明描述了用于DNA工程化改造的核碱基的修饰。同样的原则或概念和程序也适用于RNA工程化改造。
本文中述及的所有出版物、专利申请、专利和其他文件都通过引用全文纳入本文。
除非另外定义，否则，本文中所使用的所有技术和科学术语都具有本发明所属领域普通技术人员通常所理解的同样含义。虽然通过本发明实施方式介绍本发明，并且相当详细地描述了这些实施方式，但它们不应局限或以任何方式限制所附权利要求书的范围。本领域的技术人员将容易地明白另外的优点和修改。因此，本发明在其更广泛的方面不限于所示和描述的具体细节、代表性装置、设备和方法以及说明性示例。因此，与这些细节有差异也仍然符合本发明的总体构思。
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13 Slinker，J.D.，Muren，N.B.，Renfrew，S.E.和Barton，J.K.DNA电荷在34nm上的传输(DNA charge transport over 34nm.)Nature Chemistry 3，228，(2011)。
14 Xiang，L.等DNA中的门控电导转换(Gate-controlled conductanceswitching in DNA.)Nat Commun 8，14471，(2017)。
15 Guo，C.等由DNA构成的分子整流器，通过嵌入实现高整流率(Molecularrectifier composed of DNA with high rectification ratio enabled byintercalation.)NATURE CHEMISTRY8，484-490，doi：10.1038/nchem.2480(2016)。
16 Hihath，J.，Xu，B.，Zhang，P.和Tao，N.通过电导率测量研究单核苷酸多态性(Study of single-nucleotide polymorphisms by means of electrical conductancemeasurements.)Proceedings of the National Academy of Sciences of the UnitedStates of America 102，16979-16983，(2005)。
17 Xu，B.，Zhang，P.，Li，X.和Tao，N.水溶液中单个DNA分子的直接电导测量(Direct Conductance Measurement of Single DNA Molecules in Aqueous Solution.)Nano Lett.4，1105-1108(2004)。
18 Gomez，E.F.和Steckl，A.J.于Green Materials for Electronics，(编：MihaiIrimia-Vladu，Eric D.Glowacki，Niyazi S.Sariciftci和Siegfried Bauer)191-230(2018)。
19 Bixon，M.等DNA中的长程电荷跳跃(Long-range charge hopping in DNA.)PNAS 96，11713-11716(1999)。
20 Xiang，L.等DNA电荷传输中的中间隧穿-跳跃制度(Intermediatetunnelling-hopping regime in DNA charge transport.)Nat Chem 7，221-226，(2015)。
21 Renaud，N.，Berlin，Y.A.，Lewis，F.D.和Ratner，M.A.超交换和跳跃之间：多聚(A)-多聚(T)DNA发夹中的中间电荷转移机制(Between Superexchange and Hopping：AnIntermediate Charge-Transfer Mechanism in Poly(A)-Poly(T)DNA Hairpins.)Journal of the American Chemical Society 135，3953-3963，(2013)。
22 Heim，T.，Deresmes，D.和Vuillaume，D.用导电原子力显微镜探测DNA的电导率：接触电极、DNA结构和表面相互作用的影响(Conductivity of DNA probed byconducting-atomic force microscopy：Effects of contact electrode，DNAstructure，and surface interactions.)Journal of Applied Physics 96，2927-2936，(2004)。
23 Jimenez-Monroy，K.L.等通过带有富勒烯锚定基团的双螺旋DNA分子的高电子电导(High Electronic Conductance through Double-Helix DNA Molecules withFullerene Anchoring Groups.)The journal of physical chemistry.A121，1182-1188，(2017)。
24 Wang，Y.-H.等烷二羧酸的隧穿衰减常数：空气和电化学之间对金属电极的不同依赖性(Tunneling Decay Constant of Alkanedicarboxylic Acids：DifferentDependence on the Metal Electrodes between Air and Electrochemistry.)TheJournal of Physical Chemistry C 118，18756-18761，(2014)。
25 Ogino，M.，Taya，Y.和Fujimoto，K.通过烷基基团的疏水相互作用通过DNA光连接检测甲基胞嘧啶(Detection of methylcytosine by DNA photoligation viahydrophobic interaction of the alkyl group.)Organic&Biomolecular Chemistry 7，3163-3167，(2009)。
26 Hanawa，K.，Matsumoto，Y.，Saito，R.和Saito，Y.具有氢键合取代基的8-取代的鸟苷衍生物和含有其的寡核苷酸(8-substituted guanosine derivative havinghydrogen-bonding substituent and oligonucleotide containing the same.)日本专利(2008)。
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28 Zhu，X.-F.，Jr.，H.J.W.和Scott，A.I.用于合成N-苯甲酰化核苷的改进的瞬时法(An Improved Transient Method for the Synthesis of N-BenzoylatedNucleosides.)SYNTHETIC COMMUNICATIONS 33，1233-1243(2003)。
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33 https://www.dftbplus.org/fileadmin/DFTBPLUS/public/dftbplus/ latest/manual.pdf.
Claims (23)
1.一个导电性或半导电性分子线的系统，其包括
包括一个或多个核酸碱基对的纳米结构，其中所述纳米结构内的至少一个核酸碱基是修饰的，相较于相同位置的经典核酸碱基，所述修饰的核酸碱基的存在改进了所述纳米结构的电导。
2.一种用于生物聚合物的鉴定、表征或测序的系统，其包括，
a.第一电极和第二电极彼此相邻放置在所述非导电性基材上或被非导电性层分离地相互重叠放置形成的纳米间隙；
b.包括一个或多个核酸碱基对的纳米结构，其通过化学键将一端附接至所述第一电极且另一端附接至所述第二电极，桥接所述纳米间隙，其中所述纳米结构内的至少一个核酸碱基是修饰的，相对于相同位置的经典核酸碱基，所述修饰的核酸碱基的存在改进了所述纳米结构的电导；和
c.附接至所述纳米结构的传感探针，其能够与所述生物聚合物相互作用或进行化学或生物化学反应。
3.如权利要求2所述的系统，其进一步包括，
a.施加在所述第一电极和所述第二电极之间的偏压；
b.记录通过所述纳米结构的电流波动的装置，所述电流波动是由所述传感探针和生物聚合物之间相互作用导致的；和
c.用于数据分析鉴定或表征所述生物聚合物或所述生
物聚合物的亚单位的软件。
4.如权利要求1或权利要求2所述的系统，其中所述纳米结构选自下组：核酸双链体、核酸三链体、核酸四链体、核酸折纸结构及其组合。
5.如权利要求1或权利要求2所述的系统，其中相较于无修饰的相同位置的经典核酸碱基，所述核酸碱基修饰减少HOMO和LUMO之间的能隙。
6.如权利要求1或2所述的系统，其中，所述纳米结构包括，
a.修饰的尿嘧啶(Um)，其中Um是5-烯基-尿嘧啶；或
b.修饰的胸腺嘧啶(Tm)，其中Tm是5-烯基-胸腺嘧啶；或
c.修饰的腺嘌呤(Am)，其中Am是7-脱氮-7-烯基-腺嘌呤或7-丙烯基-7-脱氮-腺嘌呤；或
d.修饰的鸟嘌呤(Gm)，其中Gm是7-脱氮-7-烯基-2’-鸟嘌呤；或
e.修饰的胞嘧啶(Cm)，其中Cm是5-烯基-胞嘧啶；或
f.用于电极附接的修饰的鸟嘌呤(Gs)，其中Gs是二硫化的7-脱氮-7-(3-巯基丙炔基)-2’-脱氧鸟苷或8-(3-巯基丙炔基)-脱氧鸟苷；或
g.Um和Am的碱基对或Tm和Am的碱基对，或Gm和Cm的碱基对，或其组合；或
h.上述的组合。
7.如权利要求2所述的系统，其中所述生物聚合物选自下组：天然的、合成的或修饰的DNA、RNA、蛋白质、多肽、寡核苷酸、多糖和其类似物。
8.如权利要求2所述的系统，其中所述传感探针选自下组：天然的、突变的、表达的或合成的核酸探针、分子镊子、酶、受体、配体、抗原和抗体，及其组合。
9.如权利要求8所述的系统，其中所述酶选自下组：天然的、突变的或合成的DNA聚合酶，RNA聚合酶，DNA解旋酶，DNA连接酶，DNA外切核酸酶，逆转录酶，RNA引物酶，核糖体，蔗糖酶，乳糖酶。
10.如权利要求2所述的系统，其中所述两个电极之间的纳米间隙大小或距离为约3-1000nm，优选约5-100nm，最优选约5-30nm。
11.如权利要求2所述的系统，其中所述电极使用选自下组的贵金属制作：铂(Pt)、金(Au)、银(Ag)、钯(Pd)、铑(Rd)、钌(Ru)、锇(Os)、和铱(Ir)，或另一种选自下组的金属制作：铜(Cu)、铼(Re)、钛(Ti)、铌(Nb)、钽(Ta)及其衍生物，例如TiN和TaN或合金，及其组合。
12.一种改进分子线的电导的方法，其包括，
修饰至少一个核酸碱基，使得所述修饰的核酸碱基的存在相较于相同位置的经典核酸碱基改进分子线的电导，其中所述分子线是包含一个或多个核碱基对的纳米结构。
13.一种用于生物聚合物的鉴定、表征或测序的方法，包括，
a.通过将第一电极和第二电极彼此相邻放置在所述非导电性基材上或被非导电性层分离地相互重叠放置形成纳米间隙；
b.提供长度与所述纳米间隙相当的包括一个或多个核酸碱基对的纳米结构，其中所述纳米结构内的至少一个核酸碱基是修饰的，相对于相同位置的经典核酸碱基，所述修饰的核酸碱基的存在改进了所述纳米结构的电导；
c.通过化学键将所述纳米结构的一端附接至所述第一电极，另一端附接至所述第二电极；和
d.将传感探针附接至能够与所述生物聚合物相互作用或进行化学或生物化学反应的所述纳米结构。
14.如权利要求13所述的方法，其进一步包括，
a.在所述第一电极和第二电极之间施加偏压；
b.提供记录通过所述纳米结构的电流波动的装置，所述电流波动是由所述传感探针和生物聚合物之间相互作用导致的；和
c.提供用于数据分析鉴定或表征所述生物聚合物或所述生物聚合物的亚单位的软件。
15.如权利要求12或权利要求13所述的方法，其中所述纳米结构选自下组：核酸双链体、核酸三链体、核酸四链体、核酸折纸结构及其组合。
16.如权利要求12或权利要求13所述的方法，其中相较于无修饰的相同位置的所述经典核酸碱基，所述核酸碱基修饰减少HOMO和LUMO之间的能隙。
17.如权利要求12或13所述的方法，其中所述纳米结构包括，
a.修饰的尿嘧啶(Um)，其中Um是5-烯基-尿嘧啶，或
b.修饰的胸腺嘧啶(Tm)，其中Tm是5-烯基-胸腺嘧啶；或
c.修饰的腺嘌呤(Am)，其中Am是7-脱氮-7-烯基-腺嘌呤或7-丙烯基-7-脱氮-腺嘌呤；或
d.修饰的鸟嘌呤(Gm)，其中Gm是7-脱氮-7-烯基-2’-鸟嘌呤；或
e.修饰的胞嘧啶(Cm)，其中Cm是5-烯基-胞嘧啶；或
f.用于电极附接的修饰的鸟嘌呤(Gs)，其中Gs是二硫化的7-脱氮-7-(3-巯基丙炔基)-2’-脱氧鸟苷或8-(3-巯基丙炔基)-脱氧鸟苷；或
g.Um和Am的碱基对或Tm和Am的碱基对，或Gm和Cm的碱基对，或其组合；或
h.上述的组合。
18.如权利要求13所述的方法，其中所述生物聚合物选自下组：天然的、合成的或修饰的DNA、RNA、蛋白质、多肽、寡核苷酸、多糖和其类似物。
19.如权利要求13所述的方法，其中所述传感探针选自下组：天然的、突变的、表达的或合成的核酸探针、分子镊子、酶、受体、配体、抗原和抗体，及其组合。
20.如权利要求19所述的方法，其中所述酶选自下组：天然的、突变的或合成的DNA聚合酶，RNA聚合酶，DNA解旋酶，DNA连接酶，DNA外切核酸酶，逆转录酶，RNA引物酶，核糖体，蔗糖酶，乳糖酶。
21.如权利要求13所述的方法，其中所述两个电极之间的纳米间隙大小或距离为约3-1000nm，优选约5-100nm，最优选约5-30nm。
22.如权利要求13所述的方法，其中所述电极使用选自下组的贵金属制作：铂(Pt)、金(Au)、银(Ag)、钯(Pd)、铑(Rd)、钌(Ru)、锇(Os)、和铱(Ir)，或另一种选自下组的金属制作：铜(Cu)、铼(Re)、钛(Ti)、铌(Nb)、钽(Ta)及其衍生物，例如TiN和TaN或合金，及其组合。
23.如权利要求12或权利要求13所述的方法，其还包括，
a.提供一个或多个选自下组的核苷三磷酸：5-烯基-2’-脱氧胞苷三磷酸、5-烯基-2’-脱氧尿苷三磷酸、5-烯基-2’-脱氧胸苷三磷酸、7-脱氮-7-烯基-2’-脱氧腺苷三磷酸、7-脱氮-7-烯基-2’-脱氧鸟苷三磷酸、8-(3-巯基丙炔基)-脱氧鸟苷三磷酸及其组合；和
b.使用提供的所述核苷三磷酸以酶促方式将所述修饰的核酸碱基纳入所述纳米结构内的核酸链。
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