JP2019521701A - 乳がんに関連する染色体相互作用の検出 - Google Patents
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Abstract
Description
本発明のプロセスは、乳がんに関連する染色体相互作用を検出するための型付けシステムを含む。この型付けは、染色体相互作用において一体となる染色体の架橋領域に基づく、本明細書に記載のEpiSwitch(商標)システムを使用して実施することができ、染色体DNAに切断を施し、次いで架橋体に存在する核酸を連結して、染色体相互作用を形成した両方の領域からの配列を有する連結核酸を得る。この連結核酸の検出は、特定の染色体相互作用の有無の判定を可能にする。
本明細書中で使用される場合、「エピジェネティック」相互作用および「染色体」相互作用という用語は、典型的には染色体の遠位領域間の相互作用を指し、前記相互作用は染色体の領域の状態に依存して動的であり、改変、形成または破壊される。
特定のマーカーが本明細書において開示され、そのいずれも本発明において使用することができる。さらにマーカーのセット、例えば、本明細書に開示される組み合わせまたは数を使用することができる。マーカーセット1、2および3が好ましい。これらは、qPCR法を含む任意の適切な方法、例えば、本明細書に開示されるPCRまたはプローブに基づく方法によって型付けすることができる。マーカーは、本明細書において、位置またはプローブおよび/またはプライマー配列によって定義される。
エピジェネティック染色体相互作用は、関連する遺伝子または記載されていない遺伝子をコードすることが示されている染色体の領域に重複していてもよく、これを含み得るが、同様に遺伝子間領域に存在することもある。さらに、本発明者らが、すべての領域におけるエピジェネティック相互作用が、染色体座の状態を判定する上で等しく重要であることを発見したことに留意すべきである。これらの相互作用は、必ずしも遺伝子座に位置する特定の遺伝子のコード領域に存在するものではなく、遺伝子間領域に存在してもよい。
本発明の目的は、乳がんサブグループに関連する染色体相互作用の検出を可能にすることである。したがって、このプロセスは、乳がんの診断に使用されても、または使用されなくてもよい。本発明のプロセスは、悪性乳がんの診断に使用することができ、好ましくはマーカーセット3からのマーカーがこのような実施形態に使用される。
本発明の特定の実施形態は、連結された核酸、特に連結されたDNAを利用する。これらは、染色体相互作用において一体となる両方の領域からの配列を含み、したがって相互作用に関する情報を提供する。本明細書に記載のEpiSwitch(商標)法は、そのような連結核酸の生成を使用して、染色体相互作用を検出する。
(i)染色体座に存在するエピジェネティック染色体相互作用を、好ましくはインビトロで架橋する工程;
(ii)任意に架橋DNAを前記染色体座から単離する工程;
(iii)前記架橋DNAに、例えば少なくとも1回切断する酵素(特に、前記染色体座内で少なくとも1回切断する酵素)による制限消化によって切断を施す工程;
(iv)前記架橋切断DNA末端を、(特にDNAループを形成するために)連結する工程;ならびに
(v)任意に、前記連結DNAおよび/または前記DNAループの存在を、特にPCR(ポリメラーゼ連鎖反応)のような技術を用いて同定して、特異的な染色体相互作用の存在を同定する工程、
によって、連結核酸(例えば、DNA)を生成する工程を含むことができる。
EpiSwitch(商標)技術はまた、表現型に特異的なエピジェネティックな染色体コンフォメーションシグネチャーの検出におけるマイクロアレイEpiSwitch(商標)マーカーデータの使用に関連する。本明細書に記載の様式で連結核酸を利用するEpiSwitch(商標)などの実施形態は、いくつかの利点を有する。例えば、本発明の第1の核酸セットからの核酸配列は、第2の核酸セットとハイブリダイズするか、またはハイブリダイズできないかのいずれかであるため、それらは確率的雑音のレベルが低い。これは、エピジェネティックレベルで複雑な機序を測定する比較的簡単な方法を可能にするバイナリ結果を提供する。EpiSwitch(商標)技術はまた、処理時間が短く、コストが低い。一実施形態では、処理時間は3時間〜6時間である。
本発明のプロセスは、通常、サンプルに対して実施される。サンプルは通常、個体由来のDNAを含む。それには通常細胞が含まれる。一実施形態では、サンプルは最小の侵襲的手段によって得られ、例えば血液サンプルであり得る。DNAを抽出し、標準的な制限酵素で切断することができる。これにより、EpiSwitch(商標)プラットフォームでどの染色体コンフォメーションが保持され、検出されるかを事前に判定できる。水平伝播を含む組織と血液との間の染色体相互作用の同調により、血液サンプルを使用して、疾患に関連する組織などの組織における染色体相互作用を検出することができる。癌などの特定の状態では、突然変異による遺伝的雑音は、関連する組織における染色体相互作用「シグナル」に影響を及ぼすことがあり、したがって、血液を用いることが有利である。
本発明は、本発明のプロセスにおいて使用または生成されるものとして本明細書に記載される連結核酸などの特定の核酸に関する。これらは、本明細書に記載の第1および第2の核酸と同じであっても、またはそれらの特性のいずれかを有してもよい。本発明の核酸は、典型的には、染色体相互作用において一体となる染色体の2つの領域のうちの一方に由来する配列をそれぞれが含む2つの部分を含む。典型的には、各部分は、長さが少なくとも8、10、15、20、30または40ヌクレオチド長、例えば10〜40ヌクレオチド長である。好ましい核酸は、いずれかの表に記載のいずれかの遺伝子に由来する配列を含む。典型的には、好ましい核酸は、表9に記載の特異的プローブ配列、またはそのような配列の断片および/またはホモログを含む。典型的には、好ましい核酸は、マーカーセット2もしくは3に関連する、および/またはこれらについて記載される特異的プローブ配列、またはそのような配列の断片および/またはホモログを含む。好ましくは、核酸はDNAである。特異的配列が提供される場合、本発明は、特定の実施形態において必要に応じて相補的配列を使用し得ることは理解されよう。
第2の核酸配列セットは、指標配列のセットであるという機能を有し、本質的に、サブグループ特異的配列を同定するのに適した核酸配列のセットである。それらは、「バックグラウンド」染色体相互作用を表すことができ、何らかの方法で選択することができ、または選択されなくてもよい。それらは一般的にすべての染色体相互作用候補のサブセットである。
特定の一実施形態では、第2の核酸セットには少なくとも100種の異なる核酸配列、好ましくは少なくとも1000、2000または5000種の異なる核酸配列、最大100,000、1,000,000または10,000,000種の異なる核酸配列が存在する。典型的な数は、100〜1,000,000種、例えば1,000〜100,000種の異なる核酸配列がある。すべてまたは少なくとも90%または少なくとも50%またはこれらが異なる染色体相互作用に対応すると思われる。
第1の核酸セットは、通常、乳がんを有する個体由来である。第1の核酸は、本明細書に記載の第2の核酸セットの特徴および特性のいずれかを有することができる。第1の核酸セットは、通常、本明細書に記載の治療および処理、特にEpiSwitch(商標)の架橋および切断工程を受けた個体由来のサンプルである。典型的には、第1の核酸セットは、個体から採取されたサンプル中に存在する染色体相互作用のすべて、または少なくとも80%もしくは50%を表す。
本明細書に記載の核酸集団のタイプのいずれかは、そのタイプ、例えば「第1」または「第2」の核酸の少なくとも200、少なくとも500、少なくとも1000、少なくとも5000または少なくとも10000の異なる核酸を含むライブラリーの形態で存在し得る。そのようなライブラリーは、アレイに結合された形態であり得る。
本発明は、第1の核酸セットおよび第2の核酸セットからの全体的または部分的に相補的な核酸配列がハイブリダイズ可能となる手段を必要とする。一実施形態では、第1の核酸セットのすべてを第2の核酸セットのすべてと、単一のアッセイ、すなわち単一のハイブリダイゼーション工程において接触させる。しかしながら、任意の適切なアッセイを使用することができる。
本明細書に記載の核酸は、好ましくは、成功したハイブリダイゼーションの検出を補助するフルオロフォア(蛍光分子)または放射性標識のような独立した標識を用いて標識することができる。特定の標識は、UV光の下で検出することができる。例えば本明細書に記載のアレイ上のハイブリダイゼーションのパターンは、2つのサブグループ間のエピジェネティック染色体相互作用の差異を表し、したがって、エピジェネティック染色体相互作用を比較し、どのエピジェネティック染色体相互作用が本発明の集団のサブグループに特異的であるかを判定するプロセスを提供する。
本発明は、個体において乳がんに関連する特徴の有無を判定するために、典型的には5〜20または5〜500種のそのような相互作用、好ましくは20〜300または50〜100種の相互作用の有無を検出する工程を含むプロセスを提供する。好ましくは、染色体相互作用は、本明細書に記載の遺伝子のいずれかにおけるものである。一実施形態では、型付けされる染色体相互作用は、表9の核酸によって表されるものである。表9の「検出されたループ」と題された列は、各プローブによってどのサブグループ(乳がんまたは対照)が検出されたかを示す。図からわかるように、本発明のプロセスは、試験の一部として、乳がんサブグループおよび/または対照サブグループ(非乳がん)のいずれかを検出することができる。
被験個体が由来する種の例は、本明細書に記載されている。さらに、本発明の方法における被験個体は、何らかのプロセスで選択されていてよい。例えば、個体は女性であってよい。
本発明のすべての態様のための、好ましい遺伝子領域、遺伝子座、遺伝子および染色体相互作用が表9に記載されている。典型的には、本発明のプロセスでは、染色体相互作用は、表9に列挙された関連遺伝子の少なくとも1、2、3、4、5、6、7または8種から検出される。好ましくは、表9のプローブ配列によって表される関連する特異的染色体相互作用の少なくとも1、2、3、4、5、6、7または8種の有無が検出される。疾患関連領域は、本明細書に記載の遺伝子のいずれかの上流または下流、例えば、コード配列から50kb上流または20kb下流にあり得る。
表9は、乳がんに関連する染色体相互作用を表すプローブ(Episwitch(商標)マーカー)データおよび遺伝子データを示す。他のプローブおよび遺伝子データは、例えばマーカーセット2または3についての他の表に示されている。プローブ配列は、染色体相互作用において一体となる遺伝子領域の両部位から生成された連結産物を検出するために使用できる配列を示し、すなわち、このプローブは、連結産物中の配列に相補的な配列を含む。第1の2セットの開始−終結位置はプローブ位置を示し、第2の2セットの開始−終結位置は関連する4kb領域を示す。プローブデータの表には、以下の情報が提供される。
−HyperG_Stats:超幾何濃縮のパラメータに基づいて、遺伝子座における有意なEpiSwitch(商標)マーカーの数を見出す確率についてのp値
−総プローブ数:遺伝子座において試験されたEpiSwitch(商標)コンフォメーションの総数
−有意なプローブ数:遺伝子座において統計的に有意であることが判明したEpiSwitch(商標)コンフォメーションの数
−FDR HyperG:多重検定(偽発見率)により補正された超幾何P値
−有意パーセント:遺伝子座において試験されたマーカーの数に対する有意なEpiSwitch(商標)マーカーのパーセンテージ
−logFC:エピジェネティック比(FC)の底を2とする対数
−平均発現:すべてのアレイとチャネルにわたるプローブの平均log2発現
−T:調整t統計量
−p値:生p値
−調整p値:調整されたp値またはq値
−B−B統計量(ロッズ(lods)またはB)は、その遺伝子が差次的に発現される対数オッズ(log−odds)である。
−FC−非対数倍数変化
−FC_1−ゼロを中心とした非対数倍数変化
−LS−FC_1値に関連するバイナリ値。FC_1の値が−1.1より小さい場合は−1に設定され、FC_1の値が1.1より大きい場合は1に設定される。それらの値の間ではこの値は0である。
開始1−断片1のTaqI部位の30塩基上流
終結1−断片1のTaqI制限部位
開始2−断片2のTaqI制限部位
終結2−断片2のTaqI部位の30塩基下流
4kb配列の位置:
開始1−断片1のTaqI部位の4000塩基上流
終結1−断片1のTaqI制限部位
開始2−断片2のTaqI制限部位
終結2−断片2のTaqI部位の4000塩基下流
表10および他の表は、上位PCRマーカーそれぞれについて示す:GLMNET−lasso全体またはelastic−net正則化をフィッティングするための手順。ラムダを0.5に設定(elastic−net)
サンプルを調製し、染色体コンフォメーションを検出する方法を、本明細書に記載する。これらの方法の最適化された(非従来的な)バージョンを、例えばこの節に記載のように使用することができる。
本発明のプロセスは、さまざまなやり方で記載することができる。本発明の方法は、連結核酸を作製する方法であって、(i)染色体相互作用において一体となる染色体領域をインビトロで架橋する工程、(ii)前記架橋DNAに切断または制限消化切断を施す工程、および(iii)前記架橋、切断されたDNA末端を連結して、連結核酸を形成する工程を含み、連結核酸の検出が遺伝子座における染色体の状態の判定に使用することができ、好ましくは、
−前記遺伝子座が、表9に記載の遺伝子座、領域または遺伝子のいずれかであり得、
−および/または前記染色体相互作用が、本明細書中に記載の、または表9に開示のプローブのいずれかに対応する染色体相互作用のいずれかであり得、および/または
−前記連結産物が、(i)表9に開示のプローブ配列のいずれかと同一であるか、または相同である配列;または(ii)(ii)に相補的な配列を有するか、または含む方法として記載することができる。
−前記サブグループが、乳がんの有無によって規定され、および/または
−前記染色体状態が、表9に記載の任意の遺伝子座、領域または遺伝子におけるものであり得、および/または
−前記染色体相互作用が、表9に記載のもの、またはその表に開示のプローブのいずれかに対応するもののいずれかであり得る方法として記載することができる。
−遺伝子座は、例えば、マーカーセット2または3についての任意の表に記載の遺伝子座、領域または遺伝子のいずれかであり得、
−および/または染色体相互作用は、本明細書に記載の染色体相互作用、または例えばマーカーセット2または3についての任意の表に開示のプローブのいずれかに対応するものであり得、および/または
−連結産物は、(i)例えばマーカーセット2または3についての任意の表に開示のプローブ配列のいずれかと同一もしくは相同である配列、;または(ii)(ii)に相補的な配列、を有するか、または含み得る。
−前記サブグループが、乳がんの有無によって規定され、および/または
−前記染色体状態が、例えばマーカーセット2または3についての任意の表に記載の任意の遺伝子座、領域または遺伝子におけるものであり得、および/または
−前記染色体相互作用が、例えばマーカーセット2または3についての任意の表に記載のもの、またはその表に開示のプローブのいずれかに対応するもののいずれかであり得る方法として記載することができる。
染色体相互作用に関する知識は、状態の新しい治療法を同定するために使用することができる。本発明は、乳がんのための新しい治療剤を同定または設計するために、本明細書で定義される染色体相互作用の方法および使用を提供する。
ポリヌクレオチド/核酸(例えば、DNA)配列のホモログを、本明細書において言及する。そのようなホモログは、典型的には、少なくとも70%の相同性、好ましくは少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも97%、少なくとも98%または少なくとも99%の相同性を、例えば、少なくとも10、15、20、30、100またはそれ以上の連続したヌクレオチドの領域にわたって、または染色体相互作用に関与する染色体領域に由来する核酸部分にわたって有する。相同性は、ヌクレオチド同一性(時に「ハードホモロジー(hard homology)」と称される)に基づいて計算することができる。
第2の核酸セットはアレイに結合されていてもよく、一実施形態では、アレイに結合された少なくとも15,000、45,000、100,000または250,000個の異なる第2の核酸があり、これらは好ましくは少なくとも300、900、2000または5000の遺伝子座において表される。一実施形態では、第2の核酸の異なる集団のうちの1または複数、またはすべてが、アレイの2以上の異なる領域に結合され、アレイ上で実質的に繰り返され、エラー検出を可能にする。アレイは、Agilent SurePrint G3 Custom CGHマイクロアレイプラットフォームに基づいていてよい。アレイへの第1の核酸の結合の検出は、二色システムによって行うことができる。
治療剤が本明細書に記載される。本発明は、特定の個体、例えば本発明のプロセスによって同定された個体において、乳がんの予防または治療に使用するための薬剤を提供する。これは、治療有効量の薬剤を必要とする個体に投与する工程を含み得る。本発明は、特定の個体において乳がんを予防または治療するための薬剤の製造における前記薬剤の使用を提供する。
本明細書に記載の核酸または治療剤などの物質のいずれかは、精製または単離された形態であり得る。それらは、自然界に見出されるものとは異なる形態であってもよく、例えば、他の物質との天然には生じない組み合わせで存在してもよい。核酸(本明細書で規定される配列の部分を含む)は、天然に見出される配列とは異なる、例えば、相同性に関する節に記載されるように配列中に少なくとも1、2、3、4つまたはそれ以上のヌクレオチド変化を有する配列を有してもよい。核酸は、5’または3’末端に異種配列を有することができる。核酸は、天然に見出されるものと化学的に異なるものであってもよく、例えば、何らかの方法で修飾されてもよいが、ワトソン−クリック塩基対形成が依然として可能であることが好ましい。適切な場合、核酸は、二本鎖または一本鎖形態で提供される。本発明は、本明細書において言及される特異的核酸配列のすべてを一本鎖または二本鎖形態で提供し、したがって、開示される任意の配列に対する相補鎖を含む。
一実施形態では、染色体相互作用に関連する連結配列の定量的検出は、PCR反応中に活性化すると検出可能なプローブを用いて行われ、前記連結配列は、エピジェネティック染色体相互作用において一体となる2つの染色体領域からの配列を含み、前記方法は、PCR反応の間に前記連結配列を前記プローブと接触させ、前記プローブの活性化の程度を検出する工程を含み、前記プローブは前記連結部位に結合する。この方法は、典型的には、二重標識蛍光加水分解プローブを使用して、MIQEに準拠した様式で特定の相互作用の検出を可能にする。
本発明の加水分解プローブは、典型的には濃度が一致する陰性対照により温度勾配最適化される。好ましくは、単一工程PCR反応が最適化される。より好ましくは、標準曲線が計算される。連結配列の接合部をまたいで結合する特異的プローブを用いる利点は、連結配列に対する特異性が、ネステッドPCRアプローチを使用することなく達成され得ることである。本明細書に記載の方法は、低コピー数標的の正確かつ的確な定量化を可能にする。標的連結配列は、温度勾配最適化の前に精製、例えばゲル精製することができる。標的連結配列を配列決定することができる。好ましくは、PCR反応は、約10ng、または5〜15ng、または10〜20ng、または10〜50ng、または10〜200ngの鋳型DNAを用いて行われる。フォワードプライマーおよびリバースプライマーは、一方のプライマーが連結DNA配列中に表される染色体領域の1つの配列に結合し、他方のプライマーが連結DNA配列中に表される他の染色体領域に、例えば、前記配列に相補的であることによって結合するように設計される。
本発明は、本明細書で定義されるPCR法で使用するためのプライマーおよびプローブを選択する工程であって、連結配列に結合して増幅するそれらの能力に基づいてプライマーを選択すること、および結合する標的配列の特性、特に、標的配列の湾曲に基づきプローブ配列を選択することを含む工程を含む。
特定の実施形態では、IGFBP3における染色体相互作用は、型付け/検出されない。
BCAS1、ZNF217、TSHZ2、SUMO1P1、MIR4756、BCAS3、TBX2、C17orf82、TBX4、BCA54、LINC00651、UBE2V1、TMEM189、CEBPB、LOC284751、PTPNI、MIR645、FAM65C PARD68、ADNP、LINC00494、PREX1、ARFGEF2、CSE1L、PDE4DIP、SEC22B、NOTCH2NL NBP10、HFE2,TXNIP、POLR3GL、ANKRD34A、LIX1L、RBM8A、GNRHR2、PEX11B、ITGA10、ANKRD35、PIAS3、NUDTI7、POLR3C、RNF115、CD160、PDZK1、GPR89A、ZNF334。OCSTAMP、SLC13A3、TP53RK、SLC2A10、EYA2、MIR3616、ZMYND8、L0C100131496、DLG1、MIR4797、DLG1−AS1、BDH1、LOC22072;9、KIAA0226、MIR922、FYTTDl、LRCH3、IQCG、RPL35A、LMLN、ANKRD18DP、DDX59、CAMSAP2、GPR25、C1orf106、KIF21B、CACNA15、ASCLS、TMEM9、IGFN1、PKP1、TNN2、LAD1、TNNI1、PHLDA3、NCOA1、PTRHD1、CENPO、ADCY3、DNAJC27、DNAJC27−AS1、EFR3B。POMC、DNMT3A、MIR1301、DTNB、SPON2、LOC100130872、CTBP1、CTBP1−AS1、MAEA、UVSSA、CRIPAK、FAM53A、SLBP、TMEM129、TACC3、FGFR3、LETM1、WHSC1、SCARNA22、WHSC2、MIR943、C4orf48、NAT8L、POLN、HAUS3、MXD4、MIR4800、ZFYVE28、LOC402160、RNF4、LOC1OO506190、C9orf50、NTMT1、ASB6、PRRX2、PTGES、TOR1B、TOR1A、C9orf78、USP20、FNBP1、GPR107、NC51、ASS1。
本明細書に記載のすべての刊行物の内容は、参照により本明細書中に組み込まれ、本発明に関連する特徴をさらに規定するために使用することができる。
EpiSwitch(商標)プラットフォーム技術は、遺伝子座における正常状態と異常状態との間の調節変化のエピジェネティックな調節シグネチャーを検出する。EpiSwitch(商標)プラットフォームは、染色体コンフォメーションシグネチャーとしても知られているヒト染色体の調節的高次構造に関連する遺伝子調節の基本的なエピジェネティックレベルを同定およびモニターする。染色体シグネチャーは、遺伝子調節解除のカスケードにおける明確な主要工程である。それらは、DNAメチル化およびRNAプロファイリングのような後期エピジェネティックバイオマーカー、および遺伝子発現バイオマーカーを利用するバイオマーカープラットフォームに対して、独特の利点のセットを有する高次バイオマーカーである。
カスタムEpiSwitch(商標)アレイスクリーニングプラットフォームは、15K、45K、100K、および250Kの4種の密度で独自の染色体コンフォメーションを持ち、各キメラ断片がアレイ上で4回反復され、有効密度はそれぞれ60K、180K、400K、および100万になる。
15KのEpiSwitch(商標)アレイは、EpiSwitch(商標)バイオマーカーディスカバリー技術を使用して調べた約300の遺伝子座を含む全ゲノムをスクリーニングすることができる。EpiSwitch(商標)アレイは、Agilent SurePrint G3 Custom CGH マイクロアレイプラットフォーム上に構築されており、この技術は、4種の密度、60K、180K、400K、および100万のプローブを提供する。各EpiSwitch(商標)プローブは4連で表示されるため、アレイ当たりの密度は15K、45K、100K、250Kに減少し、再現性の統計的評価が可能になる。遺伝子座当たりの調べるEpiSwitch(商標)マーカー候補の平均数は50であり、調査できる遺伝子座の数は300、900、2000、および5000である。
EpiSwitch(商標)アレイは、EpiSwitch(商標)ライブラリー生成後にCy5で標識されたサンプルの1つのセットと、Cy3で標識された比較/分析されるサンプル(対照)のもう1つのセットとの2色システムである。アレイは、Agilent SureScanスキャナーを使用してスキャンされ、得られた特徴はAgilent Feature Extractionソフトウェアを使用して抽出される。その後、データはRでEpiSwitch(商標)アレイ処理スクリプトを使用して処理される。このアレイは、RでのBioconductor:Limma*の標準2色パッケージを使用して処理される。アレイの正規化は、Limma*のアレイ内正規化機能を使用して行い、これは、オンチップのAgilent陽性対照およびEpiSwitch(商標)陽性対照に対して行われる。データはAgilent Flagコールに基づいてフィルタリングされ、Agilent対照プローブは削除され、技術的複製プローブはLimma*を使用して解析するために平均化される。プローブは、比較される2つのシナリオの間の差異に基づいてモデル化され、偽発見率を使用して補正される。さらなるスクリーニングのために、変動係数(CV)≦30%で、≦−1.1または≧1.1であり、p≦0.1FDRのp値を有するプローブが使用される。プローブセットを減らすために、RでFactorMineRパッケージを使用して、多因子分析がさらに実行される。
*注:LIMMAは、マイクロアレイ実験における差次的発現を評価するための線形モデルおよび経験ベイズ法である。Limmaは、マイクロアレイまたはRNA−Seqから生じる遺伝子発現データの解析用のRパッケージである。
TSPYL5−TSPY様5
SRD5A1−ステロイド5α−レダクターゼ1
MAP3K1−マイトジェン活性化プロテインキナーゼキナーゼキナーゼ1
VAV3−vavグアニンヌクレオチド交換因子3
ATM−ATMセリン/スレオニンキナーゼ
SLC16A10−溶質輸送体ファミリー16メンバー10
ME3−リンゴ酸酵素3
統計的パイプライン
EpiSwitch(商標)スクリーニングアレイを、EpiSwitch(商標)PCRプラットフォームに転換するための高い値のEpiSwitch(商標)マーカーを選択するために、RのEpiSwitch(商標)解析パッケージを使用して処理する。
プローブは、修正線形回帰モデルの産物である補正p値(偽発見率、FDR)に基づいて選択される。p値≦0.1より下のプローブが選択され、その後、それらのエピジェネティック比(ER)によってさらに縮小され、プローブERは、さらなる解析のために≦−1.1または≧1.1で選択されなければならない。最後のフィルターは変動係数(CV)であり、プローブは≦0.3より下でなければならない。
統計リストの上位40種のマーカーは、PCR翻訳のためのマーカーとして選択するために、それらのERに基づいて選択される。最も高い負のER負荷を有する上位20種のマーカーおよび最も高い正のER負荷を有する上位20種のマーカーによりリストを形成する。
工程1から得られたマーカーである統計的に有意なプローブは、超幾何濃縮(HE)を用いた濃縮解析のベースを形成する。この解析は、有意なプローブリストからのマーカーの縮小を可能にし、工程2のマーカーと併せて、EpiSwitch(商標)PCRプラットフォームに転換されるプローブのリストを形成する。
アレイ設計
1.遺伝子座を、SIIソフトウェア(現在v3.2)を使用して次のように処理する:
a.これらの特異的遺伝子座においてゲノムの配列(50kb上流および20kb下流の遺伝子配列)を抜き出す。
b.この領域内の配列がCCsに関与する確率を規定する
c.特異的REを使用して配列を切断する。
d.どのような制限断片が特定の方向に相互作用する可能性が高いかを判定する
e.異なるCCsが相互に作用する可能性をランク付けする。
2.アレイのサイズ、したがって利用可能なプローブ位置の数(x)を決定する
3.x/4の相互作用を抜き出す。
4.各相互作用に対して、パート1の制限部位まで30bpの配列を、パート2の制限部位まで30bpの配列を規定する。これらの領域が繰り返しではないことを確認し、繰り返しであれば除外してリスト上の次の相互作用を選ぶ。両方の30bpを接合して、プロ−ブを規定する。
5.x/4プローブと規定された対照プローブのリストを作成し、4回複製してアレイ上に作り出されるリストを作成する
6.カスタムCGHアレイのAgilent Sure designウェブサイトにプローブリストをアップロードする。
7.プローブ群を使用して、AgilentカスタムCGHアレイを設計する。
1.鋳型作製のためにEpiSwitch(商標)Standard Operating Procedure(SOP)を使用してサンプルを処理する。
2.アレイ処理ラボでエタノール沈殿によりクリーンアップを行う。
3.Agilent SureTag complete DNA標識キットによるサンプルの処理−血液、細胞または組織のゲノムDNA解析酵素標識のためのAgilent Oligonucleotide Arrayに基づくCGH
4.Agilent C Scannerを使用し、Agilentの特徴抽出ソフトウェアを使用したスキャン。
年齢別の発生率は、浸潤性乳がんの年齢効果がアジア系人口と西洋系人口間で同様であることを示している。実際、最近の世代のアジアの乳がん率は、米国での歴史的に高い率を上回っており、アジア系人口の間の効率的な予防と治療戦略の緊急な必要性が強調されている。しかし、大規模な25年の調査の結果、マンモグラフィーは乳がん関連死亡率を低下させなかったことが示された。腫瘍が巨視的になる前の乳がんの早期発見は、がんがより治療可能なステージで医学的介入の開始を可能にすることを意味する。
EpiSwitch(商標)プラットフォームは、異常および応答性の遺伝子発現に関連する主要な疾患のスクリーニング、早期発見、コンパニオン診断、モニタリングおよび予後分析の非常に有効な手段を提供する。このアプローチの主な利点は、非侵襲性で迅速であり、不安定なタンパク質/RNA分子ではなく、染色体シグネチャーの一部として非常に安定したDNAベースの標的に依存することである。
EpiSwitch(商標)プラットフォーム技術は、調節の主要なエピジェネティックフレームワークの一部として、ヒト染色体の高次構造の変化を検出する。染色体の遠隔部位を並置すると、特異的なタイプのバイオマーカー−調節性染色体コンフォメーションシグネチャーが形成される。このプロセスにおける最大の課題の1つは、高次構造の一部を形成する染色体の遺伝子/遺伝子座における潜在的部位を同定することである。これは、所与の配列内の潜在的部位を同定する独自のパターン認識ソフトウェアの使用によって行われる。機械学習アルゴリズムを含むEpiSwitch(商標)解析パッケージソフトウェアは、CCSの高次構造を形成する可能性が高いDNAのパターンを特定する。
ゲノムにわたるCCS部位は、すべての関連する層別化リードバイオマーカーの同定のために、試験コホートからの臨床サンプルについて、EpiSwitch(商標)アレイによって直接評価される。EpiSwitch(商標)アレイプラットフォームは、ハイスループット能力と多数の遺伝子座を迅速にスクリーニングする能力とのために、マーカーの同定に使用される。使用したアレイは、AgilentのカスタムCGHアレイであり、インシリコソフトウェアを介して調べるべきマーカーを同定することができる。
次いで、EpiSwitch(商標)アレイによって同定されたマーカー候補は、EpiSwitch(商標)のPCRまたはDNAシーケンサー(すなわち、Roche 454、Nanopore Minionなど)のいずれかによって検証される。統計的に有意であり、最良の再現性を示す上位のPCRマーカーは、最終的なEpiSwitch(商標)シグネチャーセットにさらに縮小されるように選択され、サンプルの独立したコホートについて検証される。EpiSwitch(商標)PCRは、確立された標準化操作手順プロトコルに従って、熟練した技術者によって実施することができる。すべてのプロトコルおよび試薬の製造は、作業の質およびプロトコルの移行能力を保証するために、ISO 13485および9001の認定に基づいて実施される。EpiSwitch(商標)PCRおよびEpiSwitch(商標)アレイバイオマーカープラットフォームは、全血および細胞株の両方の分析に適合している。この試験は、少量の血液を使用して非常に少ないコピー数における異常を検出するのに十分な感度を有する。
本発明者らは、乳がん診断におけるコンパニオン診断法として使用されるバイオマーカーを同定するための基礎として、エピジェネティック染色体相互作用を使用した。EpiSwitch(商標)バイオマーカー発見プラットフォームは、乳がんに関与する表現型変化を引き起こすようなエピジェネティックな調節シグネチャーの変化を検出するために発明者らによって開発された。EpiSwitch(商標)バイオマーカー発見プラットフォームは、エピジェネティックな転写機構に環境的きっかけを統合する際の初期調節プロセスを規定するCCSを同定する。したがって、CCSは、遺伝子調節のカスケードにおける初期工程である。EpiSwitch(商標)バイオマーカー発見プラットフォームによって単離されたCCSは、いくつかの十分に文書化された利点:厳しい生化学的および生理学的安定性;それらのバイナリ特性および読出し;ならびに遺伝子調節の真核生物カスケードにおけるそれらの初期位置;を有する。
1.乳がん患者と健常個体を識別するEpiSwitch(商標)マーカーの同定;
2.現行の臨床実務に関連して、感度、特異度または陽性予測値(PPV)の基準を提供する試験に発展させることができるEpiSwitch(商標)マーカーの同定;
を果たした。
この研究で使用したサンプルはマレーシア由来であった。EpiSwitch(商標)アッセイに適した血液サンプルの生化学的品質は、ヘモグロビンによって例示されるように、サンプルの酸化およびタンパク質変性の程度によって直接影響を受ける。これらの2つのパラメータは、サンプル処理の前に血液の品質を評価する標準的な手段である。簡単に言えば、酸素化ヘモグロビン(オキシヘモグロビン)が酸化されると、メトヘモグロビンが形成され、グロビンドメインが変性するとメトヘモグロビンはヘミクロムに変換される。スペクトル変化を使用して、Winterbourn(1990)、Oxidative reactions of hemoglobin.Methods Enzymol.1990;186:265−72によって記述された、各ヘモグロビン画分の吸光係数に基づく品質管理方法によって各画分の存在量を計算した。この文書に従って、各サンプルの品質管理の一部として、血液をPBSで希釈し、分光光度計(Epoch Microplate(BioTek))で560、577および630nmにおいて分析した。3つのヘモグロビン画分のそれぞれのマイクロモル濃度を標準的な計算に従ってモニターした:μMオキシヘモグロビン=119*A577−39*A630−89*A560、μMメトヘモグロビン=28*A577+307*A630−55*A560、μMヘミクロム=−133*A577−114*A630+233*A560。オキシヘモグロビン:メトヘモグロビン比が0.75以上であることを示すサンプルが、品質管理を通過し、EpiSwitch(商標)処理に適していると考えられた。11種のサンプルは、ヘモグロビンQCを通過できず(サンプルBrCaMa132、BrCaMa136、BrCaMa137、BrCaMa147、BrCaMa164、BrCaMa165、BrCaMa166、BrCaMa167、BrCaMa168、BrCaMa169、およびBrCaMa170)、酸化および変性のそれらの生化学的状態に基づいて除外した。
・両方のデータセットは、多くの有意なプローブを生成した;
・アレイ1、BCa1 4185個の有意なEpiSwitch(商標)マーカーを、乳がん対健常対照の分析において同定した;
・アレイ2、BCa2 4856個の有意なEpiSwitch(商標)マーカーを、乳がん対健常対照の分析において同定した;
・2つの研究の間で一致した2116個の有意なプローブが、両方の分析の間で重複していた(図1参照)。
プライマーは、マイクロアレイ上で同定されたマーカーからIntegrated DNA Technologies(IDT)ソフトウェア(および必要に応じてPrimer3ウェブバージョン4.0.0ソフトウェア)を用いて設計した。各プライマーセットについてプライマー試験を行った。適切なプライマーが潜在的な相互作用を研究できるように、各セットをサンプルのプールされたサブセットで試験した。プライマー試験が成功した場合、プライマーセットをスクリーニングに取り入れた。
この試験を使用して、非特異的プライマーを除外し、プライマーが3Cコンフォメーションループの検出を可能にしているかどうかを判定した。すべての抽出血液サンプルを1:2〜1:64に希釈した。初期結果は、バイナリ形式、すなわち、「1」−はい、バンドが正しいサイズで存在する、または「0」−いいえ、バンドが正しいサイズで存在しない、で生成した。EpiSwitch(商標)PCRによるすべての読出しは、陽性対照および陰性対照の両方の検出を>95%の精度で行った。
51種のプライマーセットがプライマー試験段階に首尾よく合格し、8種のBrCaおよび8種の対照の血液サンプルについて試験した。最初のスクリーニングでは、サンプルはアレイ上で使用されたものと一致した。
識別を示すプライマーセットを、さらに12種のBrCaおよび12種の対照の血液サンプルでスクリーニングした。アッセイ感度の範囲を同定するために、1:2〜1:64希釈系列を使用した。スクリーニング1および2の結果を併合して、使用した20種のサンプルすべての完全な表示を得た。さらに24種のBrCaおよび24種の対照および最後に残りのサンプルを試験した。
最終的な20種のBrCaおよび20種の対照サンプルを、各プライマーセットに対するアッセイの検出感度範囲に及ぶ最も有益な3つの希釈液を用いてスクリーニングした。最終的な20のサンプルのスクリーニングに合計13種のマーカーを使用した。スクリーニング3の結果を90種のBrCaおよび90の種の対照のサンプルと併合して、BrCaおよび対照の両方に使用された100種のサンプルの完全な表示を得た。次いで、BrCa患者と対照サンプルとの識別の有効性について試験した。カイ2乗検定(フィッシャーの正確検定)を作成し、最終的なマーカーを得た。
最終的に選択された13の位置および39種のマーカーを作業分類モデルに縮小するために、R統計的言語を用いるGLMNETパッケージを使用した。GLMNETは、リッジまたはlasso回帰(マーカーの共直線性を省略)を可能にするペナルティ付(elastic−netペナルティ)回帰モデルを実行する。lasso回帰を用いた多変量ロジスティック回帰分析を患者セット1について行った。[図3を参照]
Waikato to Knowledge Analysis(WEKA)ソフトウェアバージョン3.6.12を使用してロジスティック回帰分析を行った。この分析を用いて、患者セット1(118種の患者、68種のBrCaおよび50種の対照)について、感度および特異度の分類関数が確立され、GLMNET分析によって8つのマーカーを同定した。
次いで、8つのマーカーのロジスティックモデルを患者セット2(31種のBrCaおよび19種の対照)で試験したが、これらの患者はマーカーを縮小させるために使用しない、独立したデータセットである。
品質管理手順により、他の部位およびシップメントからの他のすべてのサンプルとプロファイルおよび品質が根本的に異なるサンプルとして、シップメント122(部位2 対照)を同定し、除外した。EpiSwitch(商標)方法論による結果の染色体コンフォメーション分析およびロジスティック回帰は、85.7%の感度、80%の特異度、85.7%のPPVおよび80%のNPVの交差検定結果を有する乳がん患者および健常対照の118種のサンプルを層別化した8つのバイオマーカーのシグネチャーを開発した。50種のサンプルの独立コホート検証は、83.3%の感度、100%の特異度、100%のPPVおよび80%のNPVのバイオマーカーを示した。
オックスフォードバイオダイナミックス(OBD)は異常な遺伝子発現およびエピジェネティクスの分野における特許取得済みのプラットフォーム技術を提供するヘルスケアサービス会社である。特許取得済みのEpiSwitch(商標)プラットフォーム技術は、エピジェネティックな調節シグネチャーの変化を検出する。EpiSwitch(商標)バイオマーカー発見プラットフォームは、エピジェネティックおよび転写機構に環境的きっかけを組み込む際の初期調節プロセスを定義する染色体コンフォメーションシグネチャー(CCS)を同定する。したがって、CCSは、遺伝子調節のカスケードにおける初期工程である。
→厳しい生化学的および生理学的安定性;
→それらのバイナリ特性および読出し;
→遺伝子調節の真核生物カスケードにおけるそれらの初期位置;
を有する。
CCSは、エピジェネティックな制御の安定した調節フレームワークを形成し、細胞の全ゲノムにわたる遺伝情報にアクセスする。CCSの変化は、結果が明らかな異常として現れる前に、調節様式および遺伝子発現の早期変化を反映する。CCSの簡単な考え方は、DNAの異なる遠隔調節部分が、近接して互いの機能に影響を与えるトポロジカルな配置であることである。これらの接続はランダムに行われるわけではなく、それらは高度に調節され、有意なバイオマーカー層別化力を有する高レベルの調節機構として十分に認識されている。適用されたエピジェネティクスの急速に発展している分野では、CCSは代替のバイオマーカープラットフォームに対して大きな利点を提供する。新しいバイオマーカーの実体として、CCSの発見、モニタリングおよび検証は、品質、安定性、感度、再現性、コストおよび操作回転率の性能に関して業界が許容する技術を必要とする。
臨床サンプルの独自の生化学処理によりエピジェネティックCCSバイオマーカーの配列ベースの分析物への迅速かつ効果的な(4時間未満)変換が得られ、次いでこれがEpiSwitch(商標)アレイ(Agilent CGHアレイプラットフォームの改訂バージョン)、EpiSwitch(商標)PCRまたはDNAシーケンサー、すなわちRoche 454、Nanopore Minionなどにより読み出される。
EpiSwitch(商標)アレイプラットフォームは、ハイスループットで多数の遺伝子座を迅速にスクリーニングできる能力のため、マーカーの同定に使用される。このプロジェクトで使用されているアレイは、Agilentのカスタム−CGHアレイであり、これによりOBDはインシリコソフトウェアで同定されたマーカーを調べることができる。
・両方のデータセットは、多くの有意なプローブを生成した;
・アレイ1、BrCa1 4185個の有意なEpiSwitch(商標)マーカーを、乳がん対健常対照の分析において同定した;
・アレイ2、BrCa2 4856個の有意なEpiSwitch(商標)マーカーを、乳がん対健常対照の分析において同定した;
・2つの研究の間で一致した2116種の有意なプローブが、両方の分析の間で重複していた;
であった。
EpiSwitch(商標)PCRアッセイは、標準化された操作手順プロトコルに従って、熟練した技術者によって実施することができる分子生物学的試験である。すべてのプロトコルおよび試薬製造は、作業の質およびプロトコルの伝達能力を保証するために、ISO 13485および9001の仕様書に従って実施される。
スクリーニングは、50のGliwiceサンプルおよび22の対照サンプルについて13の良好なマーカーを用い、1:2〜1:64の希釈系列を用いて行った。バイナリデータの結果については、付録の表18を参照されたい。スクリーニング実施後、最終マーカーを得るために、カイ2乗検定(フィッシャーの正確検定)の使用によって対照サンプルからBrCaを識別する有効性についてバイナリ結果を試験した。
最終段階では、ロジスティックモデリングおよび5分割交差検証を使用して、25のサンプルの独立したコホートについてマーカーの層別化を試験した。
この研究の目的は、乳がんを有する、または乳がんの素因がある女性の全血におけるエピジェネティックな変化を判定し、次にバイオマーカーを診断的層別化に使用することであった。
この例に記載された研究は、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)およびqPCRによって型付けされた13個のネステッドマーカーに関する(下記の表19を参照)。これらのマーカーは、非悪性個体から乳がん患者を識別するために開発した。
−ネステッドPCRプライマー
−単一工程SYBR PCR(温度勾配最適化)
−ゲル精製
−蛍光光度計の測定、配列決定、相同性およびゲノムマッピングチェック
−加水分解プローブの最適化
−患者サンプルを用いた標準曲線試験。
1.特異度:予測されたPCRアンプリコンを配列決定で検証した。
2.線形標準曲線(R2>0.98)。
3.効率(E)、E>90%。
4.すべてのアッセイにゲノム非特異的交差反応対照を使用。
CCSバイオマーカーをネステッドPCRによって確認した。すべての開発PCRはQIAgilityを使用して作製した。ウェル当たり10ngの3Cサンプル鋳型を、単一工程温度勾配PCRおよびSYBRに基づく検出を用いて、濃度が一致した陰性対照を用いてスクリーニングした。10種の相互作用を同定し、配列決定した。配列データをENSEMBLに提出し、予測された3C相互作用のそれぞれのゲノム位置をENSEMBL BlatおよびNeedleman−Wunschアルゴリズムを用いて確認した。加水分解プローブを、確認された各相互作用の接合領域に対して設計し、温度勾配によって最適化した。すべてのサンプルは、安定な独立した3C相互作用(MMP1)について陽性であった。すべてのアッセイは、患者サンプルn=8(4=乳がん、4=非悪性)、標準曲線および濃度一致陰性対照で試験した。
ATM_11_108118137_108126372_108155279_108156687_RF
i.3Cの鋳型を単一工程で増幅した。
ii.ラボチップ画像。コメント:アンプリコンは、パラホルムアルデヒド固定サンプル(テンプレート10ng)でだけ見ることができる。単一工程PCR産物の予想サイズは472bpである。
iii.サンプルPCR産物の直接配列決定の後の、ENSEMBL BLAT(図1)。コメント:良質の配列決定(フォワードおよびリバースプライマー)は、予測される3C相互作用との100%の相同性を有する。
iv.定量的PCRアッセイ標準曲線の性能。標準曲線は102〜106コピーから線形である。R2=0.996。
v.1つのアンプリコンが倍増し、2つを生み出すことが効率100%である。アッセイの効率=91.7%(MIQEガイドラインは>90%)。
vi.このアッセイにより、患者(n=8)のサブセット(C01〜C12=乳がん、D01〜D12=非悪性)の間に大きなコピー数の差が示される(表20)。SQ=開始量、20ngの鋳型のコピー。NaN=0コピー。
このPCR産物を配列決定し、染色体11q22.3にマッピングした。2つの3C断片をTaq I(TCGA)において連結する。配列トレースの上は、ENSEMBL BLATマッピングデータ(配列相同性は赤色)である。
i.3Cの鋳型を単一工程で増幅した。
ii.ラボチップ画像。コメント:バンドは、パラホルムアルデヒド固定サンプル(テンプレート10ng)でだけ見ることができる。単一工程PCR産物の予想サイズは428bpである。
iii.サンプルPCR産物の直接配列決定後の、ENSEMBL BLAT。コメント:良質の配列決定(フォワードおよびリバースプライマー)は、予測される3C相互作用との100%の相同性を有する。
iv.定量的PCRアッセイ標準曲線の性能。標準曲線は101〜106コピーから線形である。R2=0.99。
v.1つのアンプリコンが倍増し、2つを生み出すことが効率100%である。効率90.7%(MIQEガイドラインは>90%)。
vi.このアッセイにより、患者(n=8)のサブセット(C01〜C12=乳がん、D01〜D12=非悪性)の間に大きなコピー数の差が示される(表2)。SQ=開始量、20ngの鋳型のコピー。NaN=0コピー。
i.3Cの鋳型を単一工程で増幅した。
ii.ラボチップ画像。コメント:バンドは、パラホルムアルデヒド固定サンプル(テンプレート10ng)でだけ見ることができる。単一工程PCR産物の予想サイズは208bpである。
iii.サンプルPCR産物の直接配列決定後の、ENSEMBL BLAT。コメント:良質の配列決定(フォワードおよびリバースプライマー)は、予測される3C相互作用との100%の相同性を有する。
iv.定量的PCRアッセイ標準曲線の性能。標準曲線は101〜106コピーから線形である。R2=0.992。
v.1つのアンプリコンが倍増し、2つを生み出すことが効率100%である。このアッセイの効率は101.6%であった(MIQEガイドラインは>90%)。
vi.このアッセイにより、患者(n=8)のサブセット(C01〜C12=乳がん、D01〜D12=非悪性)の間に大きなコピー数の差が示される(表21)。SQ=開始量、20ngの鋳型のコピー。NaN=0コピー。
FOXC1 ウェルB7 208bpの単一工程増幅(内部プライマー)のラボチップ画像。このPCR産物を配列決定し、染色体6pにマッピングした。
i.3Cの鋳型を単一工程で増幅した。
ii.ラボチップ画像。コメント:アンプリコンは、パラホルムアルデヒド固定サンプル(テンプレート10ng)でだけ見ることができる。単一工程PCR産物の予想サイズは495bpである。
iii.サンプルPCR産物の直接配列決定後の、ENSEMBL BLAT。コメント:良質の配列決定(フォワードおよびリバースプライマー)は、予測される3C相互作用との100%の相同性を有する。
iv.定量的PCRアッセイ標準曲線の性能。標準曲線は102〜106コピーから線形である。R2=0.999。
v.1つのアンプリコンが倍増し、2つを生み出すことが効率100%である。アッセイの効率=91.9%(MIQEガイドラインは>90%)。
vi.患者(n=8)のサブセット(C01〜C12=乳がん、D01〜D12=非悪性)の間のコピー数の差(表22)。SQ=開始量、20ngの鋳型のコピー。NaN=0コピー。
このPCR産物を配列決定し、染色体5q11.2にマッピングした。
i.3Cの鋳型を単一工程で増幅した。
ii.ラボチップ画像。コメント:アンプリコンは、パラホルムアルデヒド固定サンプル(テンプレート10ng)でだけ見ることができる。単一工程PCR産物の予想サイズは291bpである。
iii.サンプルPCR産物の直接配列決定後の、ENSEMBL BLAT。コメント:良質の配列決定(フォワードおよびリバースプライマー)は、予測される3C相互作用との100%の相同性を有する。
iv.定量的PCRアッセイ標準曲線の性能。標準曲線は102〜106コピーから線形である。R2=0.998。
v.1つのアンプリコンが倍増し、2つを生み出すことが効率100%である。アッセイの効率=96.8%(MIQEガイドラインは>90%)。
vi.患者(n=8)サブセット(C01〜C12=乳がん、D01〜D12=非悪性)間のアッセイの差異(表5)。SQ=開始量、20ngの鋳型のコピー。NaN=0コピー。
i.3Cの鋳型を単一工程で増幅した。
ii.ラボチップ画像。コメント:アンプリコンは、パラホルムアルデヒド固定サンプル(テンプレート10ng)でだけ見ることができる。単一工程PCR産物の予想サイズは265bpである。
iii.サンプルPCR産物の直接配列決定後の、ENSEMBL BLAT。コメント:良質の配列決定(フォワードおよびリバースプライマー)は、予測される3C相互作用との100%の相同性を有する。
iv.定量的PCRアッセイ標準曲線の性能。標準曲線は102〜106コピーから線形である。R2=0.995。
v.1つのアンプリコンが倍増し、2つを生み出すことが効率100%である。アッセイの効率=91.3%(MIQEガイドラインは>90%)。
vi.患者(n=8)サブセット(C01〜C12=乳がん、D01〜D12=非悪性)間のアッセイの差異(表24)。SQ=開始量、20ngの鋳型のコピー。NaN=0コピー。
このPCR産物を配列決定し、染色体9p13.2にマッピングした。
i.3Cの鋳型を単一工程で増幅した。
ii.ラボチップ画像。コメント:アンプリコンは、パラホルムアルデヒド固定サンプル(テンプレート10ng)でだけ見ることができる。単一工程PCR産物の予想サイズは207bpである。
iii.サンプルPCR産物の直接配列決定後の、ENSEMBL BLAT。コメント:良質の配列決定(フォワードおよびリバースプライマー)は、予測される3C相互作用との100%の相同性を有する。
iv.定量的PCRアッセイ標準曲線の性能。標準曲線は102〜106コピーから線形である。R2=0.99。
v.1つのアンプリコンが倍増し、2つを生み出すことが効率100%である。アッセイの効率=97.1%(MIQEガイドラインは>90%)。
vi.患者(n=8)サブセット(C01〜C12=乳がん、D01〜D12=非悪性)間のアッセイの差異(表25)。SQ=開始量、20ngの鋳型のコピー。NaN=0コピー。
このPCR産物を配列決定し、染色体5q14.1にマッピングした。
i.3Cの鋳型を単一工程で増幅した。
ii.ラボチップ画像。コメント:期待されるサイズのアンプリコンは、パラホルムアルデヒド固定サンプル(テンプレート10ng)でだけ見ることができる。単一工程PCR産物の予想サイズは401bpである。
iii.サンプルPCR産物の直接配列決定後の、ENSEMBL BLAT。コメント:良質の配列決定(フォワードおよびリバースプライマー)は、予測される3C相互作用との100%の相同性を有する。
iv.定量的PCRアッセイ標準曲線の性能。標準曲線は102〜106コピーから線形である。R2=0.987。
v.1つのアンプリコンが倍増し、2つを生み出すことが効率100%である。アッセイの効率=99%(MIQEガイドラインは>90%)。
vi.このアッセイにより、患者(n=8)サブセット(C01〜C12=乳がん、D01〜D12=非悪性)間の差異(表26)が示される。SQ=開始量、20ngの鋳型のコピー。NaN=0コピー。
i.3Cの鋳型を単一工程で増幅した。
ii.ラボチップ画像。コメント:アンプリコンは、パラホルムアルデヒド固定サンプル(テンプレート10ng)でだけ見ることができる。単一工程PCR産物の予想サイズは219bpである。
iii.サンプルPCR産物の直接配列決定後の、ENSEMBL BLAT。コメント:良質の配列決定(フォワードおよびリバースプライマー)は、予測される3C相互作用との100%の相同性を有する。
iv.定量的PCRアッセイ標準曲線の性能。標準曲線は102〜106コピーから線形である。R2=0.997。
v.1つのアンプリコンが倍増し、2つを生み出すことが効率100%である。アッセイの効率=95.5%(MIQEガイドラインは>90%)。
i.3Cの鋳型を単一工程で増幅した。
ii.ラボチップ画像。コメント:アンプリコンは、パラホルムアルデヒド固定サンプル(テンプレート10ng)でだけ見ることができる。単一工程PCR産物の予想サイズは507bpである。
iii.サンプルPCR産物の直接配列決定後の、ENSEMBL BLAT。コメント:良質の配列決定(フォワードおよびリバースプライマー)は、予測される3C相互作用との100%の相同性を有する。
iv.定量的PCRアッセイ標準曲線の性能。標準曲線は102〜106コピーから線形である。R2=0.998。
v.1つのアンプリコンが倍増し、2つを生み出すことが効率100%である。アッセイの効率=94.2%(MIQEガイドラインは>90%)。
1.3CマーカーATM、FOXC1およびTSPYL1により、両方のプライマーセットについての単一工程産物が生成された。
2.ATMコピー数は乳がんにおいて増加する(n=4、表1)。C行(悪性末期疾患乳がん)のサンプルは、p−値0.009037772でD行(非悪性早期)とは異なる。
3.CDC6_FFのコピー数は乳がんにおいて減少する(n=4、表2)。
4.FOXC1_FRのコピー数は乳がんにおいて減少する。行Cは、行Dと異なり、p値が0.004112668である。
下線=フォワード、二重下線=リバース、点線下線=Taq I。
AAGGGATAAGTAACCAAACTTGGTCAATATTAGATAAACTTCAAGGGACCTTTTTTTTTTTTAGTTTCCTAGTTATCTATATTGAACCAAGAAATGGAACAGCAAGTTCCTTAGTTGCTTAGGTGGACCTATTCAGAACTGGTTGTAAGTCTGCAGTCTGAAGGGAAATGGTGAGCAGAGGACTCCTTTCCCAAAGACAGCTGGAACAGAAATAGGCACTCCAGAGGTTATGGAATTTGAGAGAGATACTCAGCCTCTAGCCACTCCCATTCAATCTCCCAGCTTAGTCTTCTGAGCATTCTTAATCTTACTATTCTTTTCTTAATGTATTCAAACCAAAAGACAGCAATTTTTAGAGCCTGAATAGGTTTTGGAGGGAAAAGTAATTACGTTCAACTTCGACTGTATTCTACAAAGTGCTGGGATTACAGGCATGAGCCACCAAGCCCAGTCTGTTTCTTTTTTGCAATTAAGCTAGAGTTCACATAGCATAAAATTCACGATTTTGAGTTGTACATTTCAGTGGTTTTTAGTATTTTTACTATGTTGTACAACCATCATCACTAATTCTGGAAACTTTTTTTATTTTATTTTTATTTTTTTGAGATGGAGTCTTGCTCTGTCACCCAGGCTGGAGTGCAGTGGCACAATCTCCGCTCACTGCAACCTCCCTTTCCCGGGTTCAAGTGATTCTCCTGCATCAGCCTCCCGAGTAGCTGGGACTACAGGTGCCTGCCACCACGCCCAGCTAATTTTTGTTTTTTTAGTAGAGACTGGGTTTCACCATATTGGCCAGCCTA
AGGTAAGTTAAAGACCAAGAACTGGCATTGGTCTTAGTATCATGGGACCCTTTTGAGTAGTTTCAGTGGAGTGGTGGAGGGTGAAAGTGAAAGCTTAATTGGAGTGGGTTCAAGAATGCAGGAATAGGAGGAGAGAAATTGGAGATAGCAATATAGAAATCTCTTAAAGAGTTCGCTGTAAAGTCCAGGAGAGAGGGGTGAAGATAAGTGAAGTGATTGTTGGACGAAGATGTGGGGTTGAGAGTTGTTTTTTTCCCATCCCAAGATGGGAGACCTATTTGTATGCTGATGGAATGAGTAGCATGAAACTTAGGAGAGAGGGAAAAAATTGAATCAGAAGAGAGGGAACAGATTGCCTGAATAATGACCTGGAGGAGGCCAGAGAAAAGAGAATGTGATCGATTTCTAAAATACTGTGTGTGTGTATGTATGATGAGACAGATGATACTAAGTTTGAGCTAAAGGAAATTCAAGTATAGTCACATGGTGGCAAAGCAGAGGTTTTAAATCTCTAACCAGAGGCCAAAGGATGAGAGATAATGCTATTCTCTTAAGGATGTCAAAATAATGTGGGATGACTTGAAAAGTAGGGTTACCCTTTCTCTGGGCCAAATAGTGAGCTGTTTTGTCCTATGGAATGTAATTTAATGTCAGAGGAACAAAACCCACCTCATGAAAGGACCAGAGAACTACTGTATTTTTTTTTGGGACAGGATCTCTGTCACTCAGGCTGGAGTACAGTGGCACTATCATGGCTCACTGCAGCCTTGGCTTCCTGGGTTCAAGTGATCCTCCTGCCT
CGCCGTCCCAGCAGCGCCCCATCTCACCAACTCCCACCTTCATGTGTGGCCGCCCACCTAGAGCCATGCCTGAAGCCACTGTCCCTGACCACAAAGCTTTTGGCTGATAGGAAGCATGACAGCACTGGGGCCCTACACTGGAAGCGGGACCGTCCAGAGAAGAAGACTGCGCACAGGGATCGGGAGCTGGGACACACGTTAGTCAAGGTGTACGAGGGAGGAATCACCGCCATGTGGAGCCACTACTCGGGGAGGACGTGGGCCACCCGGAGCTCAGTGACAGTACTCCCGGGAGTGTACATCGTTGGTAATGTCCACGACAGTGTCCCTGCCTGTGACCCAATAATTTCCCATCCAGGGACACACTTCACAGAAATGCACGCACAGGCACAACAGCATCGAAACCGGTTCTTTGGAGGCTCAGTTTTTGGTAATTAAGACTAAGGAGTGTTTAAAAAACAGAAGTACATTTTCCTGGAAACCAGCAGTCTTTATTTGCAACTTTTATTGGCAAACCTGGCTGCCAGTAAATACATTCCTTGGCATCTCCCACAATGTAATTCACTGGATGGAGCGGCCTTGCTTTTTCTGTAACGTGTACGTCAATTAAAAGGGCCGCCTGGAAGGAATGCGTAGCGGTGGCTGAAAGCCCCAGTCTCGGGTCACCTCCCTCCACTCCAGGAACAAAAGCGTCCGTGGTCTGTGCCTGGAAGTCTGAGAGGGTCTCCCCGATGGGGCTGTTCCCGCCCGGACCCTGAGGGATGAGAGTTGCAGCCTAGAAAACCAGGTGCCAGGCCCTG
AAACCAGCTGGAGGAAAGGAAAGGAAGGAAGAAATAAACGCAACACAGAAGTTCTCCTCAGTTGACAAAAGGTCAAAAATCATTAACGTGTAAATGTTGCTTTTTCCATCCCAAAGCACCTTCTCACGTAGAGTCCAGGGACTAGGAGGACTCACAACGCAGCGATGGGCAGCCAGGCCCTGCAGGAGTGGGGACAGAGGGAACCCGGCCGGTGGCCCGACCCTGCAGGGAAGAAGGACGTGCGGCGAGAAGCATCGGATTCGGGGAGGGCCGGGACCTGGCCGAGGGTGACATTACCGAGCACTTCCTGGCACAGCGCTGGTCCCCTCCCCAAACGCGCTATATGTGGTTCTGTACGGGACTGCCTTTCCCAAAGACAGCCAAGGAAAAACTAAAGATCGAAAGTTTTTATTACTTCCAAATTAGTAAATTTGTAACAATCATCAGGCAACTAACTATAATAAGAGGGAATTTACAAAAGACAGAGAGCTACTAGTCAGTATCAAATCATTCTTAAAAGTGGCAACTCTGTATCAATTTTTTTTTTGCAGTCAATTACCTTTGACTCAGTCTATAAAGTACATGCCCAAATCTCCCTTTAGAGAAGAAAAGTGAATCAAAAAGAAAAATGTATATTAACTGTACAGTTCTCCTATACTAAATGTTCTTACATGCTCAAAATGTATGAATATATTTAAAGCAACTGATCCTCTATTGAATACTGAATAAACTTGAAGGGATTTCTAAGTAAATTATTACTGGTAACTCAAACTCAGTGTGCTATAAATTTCAGACACCAC
TAACCTTCCATAGGCCTCAGCTCCCTTATCTATTAACCTGGTGAAATGCAGACCCCTCTGCATGGGGTTACAAGGTTTCAGCATGACTGGGTATGAAAAGAGAACAAAGAAGCTTCCTGGAGATGACTGTGGCCTTGGCTCACTGCCAGGAAAATGACTCATTTCTGTATGCCAGGGTTATAGTTCACTGTTACCCTGACAAATGAATGTGGAAGACCCATGATTTCCTCCACCCTCCTTCACTCACATAGTAAAAGTTAGCTACTGCCTGCAACATACCAGGCACCGTACAACACGAAACTGTAGGCTCCCCCTCCAGGAAGTGACAATGTCATTCCTAACCTGTTGGAATTTTAACACCTGTCATAAAAGGATCTCATGATGCTTTGAATACTTTCTCGATACCTTATTATAAAATCAGCTTTGTGTTGAATGATTTTTCCCAGCTGTAGACTAATGTAAATGTTCTGAGCATGTTTAAGGTAGGCTAGTCTAAGCTGTGATGTTAGGTAGATTAGGTGCATTTAAATGCATTTTCAATGATATTTTAAATTTGCAGTGGGTTTATCAGGATGTTACTCCAAGATGCTCCTCCAAGGTGAGGGGCATCTGTGTTTTAGTCAGTGAAAATGTCTTGCAAAACTGAAGATAAAATAAATACAGTTAGTCACACTTCACTTGCACTATAAGAAATTCTAAAGAAAAATTCTTCAAATTGAAGGAATATAATAACATAAATTTATATCTACAGGAAGGAATAAAGAGCAAAGAAATGATAAACAAATCGCTTAAAGTGTTTA
AGTAGAGATGGGGTTTCACCATGCTGGCCAGGCCAGTCTCAAACTCCTGACCTCAGGTGATCTGCCCGCCCCAGCCTCCCAAAATGCTAGAATTACAGGTGTGAACTATTGTGCCCGGCATTGTACAACCGAACTTTAACAACAGTTGCTCAGATGATGATGGGGATAAAGAGTTGGGAAAGAGCACATCTTCTTGAAATGCTTGCTGGAATATGCTTACTTCTTAAAAGATTATAGAGAATATTGATTCTTCCCCAAGAAATTGACAGATTCATGTTTTACATAATGATATTTGATTGTATAAAGTAATTATGCTGATTTTAAAATGTGAAAACATTGAATATATTTGTAATTTTTTGTTAATAAAGTGCATAATTTTTTTTTGTAGTTTATTCACCTCGACTAGATTTTAATTTTTAATTTTTATTTATTTTTTTGAGACACAGCTTCGCTTGTTACCCAGGCTGGAGTGCAGTGGCATGATCTCGGCTCACCGCAACCTCTGCTTCCCGGGTTCAAGTGATTCTCCTGCCTCAGCCTCCCTAGTAGCTGGGATTACAGGCATGGGCCACCACGCCTGGCTAATTTTTTATATTTTTAGTAGAGACGGGGTTTCTCCATGTTGGTCAGGCTGGTCTTGAACTCCCGACCTCAGGTGATCCGCCTGCCTCAGCCTCCCAAAGTGCCGGGATTACAAGTGTGAGCCACTGCGCCTGGCTGTTTTTTATTTTTAGTAGAGACAAGGTCTTGCTATATTGTCCTGGCTTGTCTTGAACTCCAGGCCTCAAGCAATCCTCCTG
TAACAAAAATAAACTTTAAAATGGTGGAGGTGAGTGGGGAAAAGTGAAACCTCTGCTTTACAGAATACCAACGAATAAATGTAGGAAGAATTTTTTAATCAACATTTAATAACGACTATAATAATAACTGATTCAGACAGCAATGATCAATAGATTATAAAACCTTTGGATGAAAGATTGTTGGAGAAAAGGATATTCATATATCTCAAAGTGTCATGCCACAGGTTATTTATTAATTACAAAGGGAAAAGGTATAGTGAAGAAATCTAGTGGGTACCCTCTTCAACCAGATAATCAAATTTGGCATCCCCAGTTATGTAAAACTGATATCACGTCCCACCTGATGTGATGCACTGGGAAGGACCCATCACCTACATATACATGGAATATTCCTGGTATCGAAATATTTTAGGTAATCATTATTTGTCTAATTCACATGTCCACAATCAGGCATTAATGTTTACTTTCATTTGTACCTCACATTCCTGCCAGTCCAGCTTATGTTAGGGTCCATTTTGTGGATGGTGAGGTGAATAGACATTTTCCCTCTTGGCATAAACTTGGCTTCACTCTAATCTTCATCCTACTCCATATGGAGGAAATTTATCTCTGTCACATGCTAGAGAGTGTTCATCATCAGCTCCCCATCACTGCTCCATTTAAGCATCAGTGTCTAGTTAGCATTTCCTTGCATCTAGGCATCAGTGTCTTGTTAGCATGTCTCTTTAATTTCATGATGCCTTGGTCAAATAAAGTGTCTGAGCGTGTATCCCACTTCTTTTTATTTTTTTCTGTAAGGT
ACTTTCATTTTAATTTATTATTTCCCTTAGAAACATCTCCTATCTTTTGTGACCATGTCTCCTTTTCCAGTATGTTTCTTGAATTAGGATTTCATAGAGCTTTTGTGGCCTACACGAATTGACCACAGTAATCCATTACACATATTTTTCTTTAGCATCTTGTTTGAATTTACTTACGGTTGTCCCAGCCCTAAGTAGATGATAAAATATGATCTCATAGTCCTAAAATGTGGATTGATTTTTTTATGAAGATATGTGTTTTTTCTTCCTTCTGTAACCTGTGACAGATTCTGTAGTAGTTACCCTGTTGTTGAAACAGTTTTTCTCAAATACCAGTTTCATCAAATAATTCCACTGTTAAAAGCTCATAATTTCTTTCTTCTTCCCATTTTCTAAAATCGATTTTTAAATTAAAGGTACAAGTTAAGGCACACAGAAGATTATAGGCAGCTGACCTAGGAGAAAACACAAATGAAGTTGTTTTAAAACGTATTTTTCCTTATAGTTCCAAAATTTTTTCATAACATACAATTTGTGATTCTGTTACAAAGTATGATCAACTATTTTTAAATTTTATGATCAGTTAGAAATAAGATGTTATAATTCTACAGTAAAACCAAAATACCCCTTAATCATTTAGGGATTTTATAAAAAGGGACACACTTGATATAACCATAAGAGCACTGTGAGGCTCCTATGACAGAGGGGCGGGGTATAGGCTTTCCTAAAATACATCTCACTGAGACATAAAATATGAGAGGACTTATGGTCCTAATGTGGATCAATAGAAATTAAGTCAG
ACCACTTTTTAAGATTTATCCTGTTTGTTCTTTGTTGATTGAAACATAATAATTGTTAAAATTCTCTACAGCCTTCTTTTTCTTCCATAGCTAATCTTCCTTCTAATAGTTTTTGCTTTCTGTTTTGCTGTTGTTGCTTTGCAAAGCTTTCCCCTCATAGCCTGTACCTGTTATCAATATAAAATAATCTTCCTGTTGAATGCTTCATGACTTGAATTCTACTTTGATAAAAACATTGCCATACTGCTTTTTATCTTGATGAATTCATCTGGCATTGCTTTGCCTTATCATCTCATCTGGAGTTTTTAAATGCCATTTGTTTCAGTTGTCTTTAACAACATAATAAATAGACTTTGCCATTTAACAAGGTAGCTCAAATTCTTTTACTAATTGTTACATCGAAAGTTCAAAATTAAATTTTAAACGTTTTCATTCAGGCTCTGGAAAGCTTCACAGTTAAAAAGGATGTCTCTACACCCAAGGAAGTTGAACTCACTGGCTGTGTGACTATGGGCAGTTTACCCAACCTTTCTGATTTGGGGTCCCACCTTAAAACACTCACTTCCCAGAGAGACAGGAAGAACTCAGTGTGTGTTTATAAGCCTCTCTTCTTTCTCCTGGTGTCATGCATTCCAGCGAAGAGAAAGTACACAGCTCCACTACTTGGAACCAGTGTTGTACCCAGCACAGTTTTTGGTACCTGAGTTCCCTGAAAACCAGCACCTTACCCTGTAACTGGTGCAGTCTGTGTCCTCAGTGTGCTTTGATGACTTGCACTTTAAACAAGGGCAAGTCAACAT
TAAAGAAGTTTCACATTCATATGCCAACTCAGATTGATGGGCAGCAACTGGATAATCCGCTGTGCAGAAAGTTAAATACAGGTTCTGTGCAAAGAAGTGTCTAGATTCATAGTGCCAGACATCTGCCCTGGGCCACATGCTTACCGTCCCATGGATGGATGGAACTTGGAATCAGAAGACCCAAGTTTGAGTCCTGGCTCTACTACTTTTGTGATTTTGGTCATTTAACCTCTTTGAGCCTTCTTATGGCATAGTAGTTATAATCAAGATAATATAAGTGAATGTGCTTTGTAAACCATGAAGTGTTGGTCACACAGATGATAGCTACTGTCTTATATTTGTCAAACCTCAGCTGAGGACCAGGTTGACAGGATGGAGGAAGAGGAGGAATTCAAGACTCGAACTAAACAAAAAGGAGATGATCCTGGGTGGGCTTGACTTAATCAAGTGAAAGCCTTAAAAGCAAGAGTCTCCTGCTAGTCTAGGAAAAGCAAACAGCCCTGCTATGAATGGCCTATAGAAAGGGGCAGCCTCTAGGAGCATGGGCCTCAGTCATATGCCCACGAGGAACTGAATATTGCCAGCAACCATGTGAGCATGGAAGAGGACTCTAAGCCTCTGATGAGACCACAGCCCTGGCCAATGCTTTGATTGTGGCTCTGTGAGGCCTTGAACAAAGGACCAAGTATAGCTATGCCAGGACTTCTGAACCACGGGAATGGTGAGATAATAAATGTTTGGTGTTTTAAGCCACTAAGTTTGTGTTAATTTTTTATGCCGCAATAGAAAGCGAATACTAC
AGGTAAGTTAAAGACCAAGAACTGGCATTGGTCTTAGTATCATGGGACCCTTTTGAGTAGTTTCAGTGGAGTGGTGGAGGGTGAAAGTGAAAGCTTAATTGGAGTGGGTTCAAGAATGCAGGAATAGGAGGAGAGAAATTGGAGATAGCAATATAGAAATCTCTTAAAGAGTTCGCTGTAAAGTCCAGGAGAGAGGGGTGAAGATAAGTGAAGTGATTGTTGGACGAAGATGTGGGGTTGAGAGTTGTTTTTTTCCCATCCCAAGATGGGAGACCTATTTGTATGCTGATGGAATGAGTAGCATGAAACTTAGGAGAGAGGGAAAAAATTGAATCAGAAGAGAGGGAACAGATTGCCTGAATAATGACCTGGAGGAGGCCAGAGAAAAGAGAATGTGATCGATGACCTTAATGTCAGTGTCACTGACTCTGACAAGGAGGAAAGGACAGCGATGAGCCAGGCTGACCCCCGCCACCCCATTCCCATAGCCCCACTTTCTTCTCTCTTCTTGTTCAGAAATGTTTCACTTTGCCTCATCTAGCCCCTTTGGCCAGTAGGTCACATCTGGGAGCTTCTGGGGGTGCCACATGTCTGCCTCAATCTGGGCTGTTTCCTCCCCTCCAAGATATTTCACTGTCTCTGGGCTGGGCGCCAGGACTCCTGGGTTTCCCTGCCTGTGGTGCAGGGCTCCCCTGCAGGGCTCCAGAGAGTCGCTTAGCTGGTTTCCTTCCTCCTTTGTGGGGAGGGCCTTCCCCTAGGGCTGGGAGGTGTCAGGAATCCCAGGTGGGACAGGGGTGGGG
TTCAATTGCTATATAAAAAATGTAAAGTCTGTTTACTGCCTTAAACCTTCTGGTGTATTTTTATATAAAGTAACACCCTTAATTCTAACTTGGCCAACAGGTAGGATGGTATTATTATTATCTTCATTGTACAGATAAGGAAACTGAGGCTCAGATTGACTAGATCAAACAGGAGTTTTCTGGAAAACCTAGGACACAAGCCTAAATCTTTGAACTCAAATACTGCTCTACACTGAATTACAGTTATATACTGATTTCTGTTGTAAATTCTTAGAGAAGACAGACATAGAAATTAGTAACTTGAGTCAGTAGCGGCTTTGTTCAAACACAGGCACATGCATATTTTATGGTATATGTTTATATCTGTGTAATACTCATCATAAATGTCAGATTTATAATCGAGATCACAGTGAGCTGAGATTGCACCACTGCACTCCAGCCTGGGCAGCGGAGTGAGACCTTTTCTCAAAAAAAAAAAAAAAAAAAGGCAAAAAATTAAATTATTAGTATGGTAAAGTTTCGTTTGGACTTAATATGAAACTCATTTCTAGAAATGATGATCATTTGCATAGGGCTTAACTTCCTTTGCTAAGAAAATAGAGTAGTATACTAGGAGACTTCCAGAGCTGCATAGAGCTTCAGGGTCATCTACCAAGACAGACAATTTGTTGTCATCATCAGTGTTAAACTCTAAATTATTAAGTGCTTATGTGCCAGATACTGAAGTTTATATACACTTTCTCTAATCTTTAATAATTCTAGAAAGGTATGTGTTTGATCCATTTTCAAGATAAGAAAAC
ATGAGGTTTTTTTCCAGCCTTCCTAAGGGCCTCAAAGTCATATCCAGCAGACTTGCAGGGTTCTCAGGTGAAAGCAAATTGGAGAAATTTTTAAAATGTAATTTTGGTTTTTACTCCAACTACTTTCAACATGGATTTGTAAAAGACTGCTAGGATCATTAAAATCAGCATTGAAGCTATGTTGAGCAAGATGGATAGCTGCACTAGAAAAGCTGTAACAAGAGTCATTGTGAATGAAAGGAAAATTTTGCTCTAGATTTGTTGGTAGCCAAGGCACAAAAATTGGAAGCATAATGAGTTACAGACTCATGTCTGATAATATGAAAGAACACTAATTTAAAGAAAAAATCTTTTCTGTCTGAAATTTTATAATTTAGAGGAACTCTATATAAACAACATCGAAACTTTGCTTCATGCACAAAATTTAAAATATTACATAAAATTACCTTCAGGCTTTGTGTATAAGATATATATAAAACATAAATAAATTTTGTGTTTACACTTGGGTTCCATCCTGAATATATCTCATGATGTTTATGCAAATATTCCAAAATCTGAAAAAATCTGAAATTCAAAACACTTCCGGTCCCAAGCATTTTGAATAAGGGATACTCAACCTATAGCTGCATTAATTGAATTAAGACAACCACATAATCTACCTGTTAATTTTCTCTGGAGCCTTTTCTTCTGAGCCCTCCACGCTCTTCTAATTGATACTGCTTGCTCTACTAAGCCTGTTGAATTACTGTAGTCCTGGGACTTCTCTTTGCTCCCCTTTCCTGGCTTCTATATCTCCCTCT
MMP 1−4 2F 5’−GGGGAGTGGATGGGATAAGGTG−3’
MPP 1F 5’−TGGGCCTGGTTGAAAAGCAT−3’
MMP1F1b2プローブ 5’−FAM−ATCCAGCATCGAAGAGGGAAACTGCATCA−BHQ1−3’
Claims (18)
- 集団内のサブグループを表す染色体状態を検出するプロセスであって、ゲノムの規定された乳がん疾患関連領域内における前記染色体状態に関連する染色体相互作用の有無を判定する工程を含み、前記染色体相互作用が、どの染色体相互作用が前記集団の乳がんサブグループに対応する染色体状態に関連するかを判定する方法であって、前記染色体の状態が異なるサブグループ由来の第1の核酸セットと、指標となる第2の核酸セットとを接触させる工程、および相補的配列をハイブリダイズさせる工程を含み、前記第1および第2の核酸セット中の核酸が、染色体相互作用において一体となる両方の染色体領域からの配列を含む連結産物を表し、前記第1の核酸セットと第2の核酸セットとの間のハイブリダイゼーションのパターンが、どの染色体相互作用が乳がんサブグループに特異的であるかの判定を可能にする方法によって、任意に同定されているプロセス。
- (i)表9(マーカーセット1)のプローブによって表される染色体相互作用のすべてを含むか、または
(ii)表9(マーカーセット1)のプローブによって表される染色体相互作用の少なくとも4、5、6、7種を含む、
染色体相互作用の特異的な組み合わせが型付けされるか請求項1に記載のプロセス。 - (i)マーカーセット2のプローブによって表される染色体相互作用のすべてを含むか、または
(ii)マーカーセット2のプローブによって表される染色体相互作用の少なくとも4、5、6、7種を含む、
染色体相互作用の特異的な組み合わせが型付けされる、および/または
(a)マーカーセット3のプローブによって表される染色体相互作用のすべてを含むか、または
(b)マーカーセット3のプローブによって表される染色体相互作用の少なくとも4、5、6、7種を含む、
染色体相互作用の特異的な組み合わせが型付けされる、請求項1または2に記載のプロセス。 - 前記染色体相互作用が、
−個体由来のサンプルにおいて、および/または
−前記染色体相互作用の部位におけるDNAループの有無を検出する工程によって、および/または
−染色体コンホーメーョンにおいて接合される染色体の遠位領域の有無を検出する工程によって、および/または
−前記型付けの間に生成され、その配列が、前記染色体相互作用において一体となる染色体の領域にそれぞれ対応する2つの領域を含む連結核酸の存在を検出する工程によって、
型付けされ、
前記連結核酸の検出が好ましくはPCRによって、任意に表10または本明細書中の任意の表に列挙された少なくとも1個のプライマーを用いて実施される、請求項1から3のいずれか一項に記載のプロセス。 - −乳がんを診断するために実施される、および/または
−前記第2の核酸セットが、前記第1の核酸セットよりも大きな個体群に由来する、および/または
−前記第1の核酸セットが、少なくとも8個体に由来する、および/または
−前記第1の核酸セットが、第1のサブグループからの少なくとも4個体、および好ましくは前記第1のサブグループと重複しない第2のサブグループからの少なくとも4個体に由来する、および/または
−医療のための個体を選択するために実行される、および/または
−性別または別の身体的特徴に基づいて選択された個体に対して実行される、
請求項1から4のいずれか一項に記載のプロセス。 - 好ましくは本明細書の表または図のいずれか1つに規定されるマーカーを用いて、悪性乳がんを検出するために実行される、請求項1から5のいずれか一項に記載のプロセス。
- 前記疾患関連領域が、
(i)表9に列挙された遺伝子のいずれか1つに対応する、および/または
(ii)表9に示される任意のプローブによって表される染色体相互作用のいずれか1つに対応する、および/または
(iii)(i)または(ii)を含むか、またはそれらに隣接する4000塩基領域に対応する、および/または
(a)マーカーセット2もしくは3に関連する遺伝子のいずれか1つに対応する、および/または
(b)染色体相互作用マーカーセット2もしくは3のいずれか1つに対応する、および/または
(c)(a)または(b)を含むか、またはそれらに隣接する4000塩基領域に対応する、
請求項1から6のいずれか一項に記載のプロセス。 - −前記第2の核酸セットが選択されていない群を表す、および/または
−前記第2の核酸セットが、規定された位置でアレイに結合されている、および/または
−前記第2の核酸セットが、少なくとも100の異なる遺伝子における染色体相互作用を表す、および/または
−前記第2の核酸セットが、少なくとも1,000の異なる染色体相互作用を表す少なくとも1,000の異なる核酸を含む、および/または
−前記第1の核酸セットおよび前記第2の核酸セットが、10〜100ヌクレオチド長の塩基を有する少なくとも100個の核酸を含む、
請求項1から7のいずれか一項に記載のプロセス。 - 前記第1の核酸セットが:
(i)染色体相互作用において一体となる染色体領域を架橋する工程、
(ii)任意に酵素による制限消化切断によって前記架橋領域に切断を施す工程、および
(iii)前記架橋、切断されたDNA末端を連結して、(特に連結DNAを含む)前記第1の核酸セットを形成する工程、
を含む方法において得ることができる、請求項1から8のいずれか一項に記載のプロセス。 - 少なくとも5〜20の異なる染色体相互作用が型付けされ、好ましくは5〜20の異なる領域または遺伝子が型付けされる、請求項1から9のいずれか一項記載のプロセス。
- 前記疾患関連領域が、
(i)一塩基多型(SNP)を含む、および/または
(ii)マイクロRNA(miRNA)を発現する、および/または
(iii)非コードRNA(ncRNA)を発現する、および/または
(iv)少なくとも10個の連続したアミノ酸残基をコードする核酸配列を発現する、および/または
(v)調節要素を発現する、および/または
(vii)はCTCF結合部位を含む、
請求項1から10のいずれか一項に記載のプロセス。 - 染色体相互作用の変化を引き起こすことができ、それにより治療効果を引き起こすことができる薬剤を選択することによって、乳がんを治療するための治療剤を同定または設計する方法であって、
前記染色体相互作用が、表9のマーカーセット2もしくはマーカーセット3で規定されるものである、および/または
前記染色体相互作用が、表9に記載されるか、またはマーカーセット2もしくは3に関連する任意の領域または遺伝子に存在し、
任意に:
−前記染色体相互作用が、どの染色体相互作用が請求項1で規定された染色体状態に関連するかを判定する方法によって同定され、および/または
−染色体相互作用の前記変化が、(i)前記本明細書の表に記載された特異的プローブ配列のいずれかと少なくとも70%の同一性を有するプローブを用いて、または(ii)前記本明細書の表のいずれか1つにおいて規定されるプライマー対、または前記表のいずれか1つにおいて同定される任意のプライマー対と少なくとも70%の同一性を有するプライマー対によってモニターされる方法。 - (a)候補薬剤を投与する工程、
(b)染色体状態に変化があるかどうかを検出し、それによって前記候補薬剤が治療剤であるかどうかを判定する工程、
を含み、
前記検出が、前記ゲノムの規定された領域内における染色体相互作用の有無を判定する工程を含み、好ましくは、
(i)前記染色体状態が、表9に記載される、またはマーカーセット2もしくは3に関連する任意の遺伝子座、領域または遺伝子におけるものであり得、および/または
(ii)前記染色体相互作用が、本明細書に記載のもののいずれかであり得るか、または(a)表10に開示される、もしくは(b)前記表のいずれかに開示され、マーカーセット2もしくは3に関連するプローブまたはプライマー対のいずれかに対応し、
前記スクリーニングが、任意にインビトロ、好ましくは細胞中で実施される、請求項12に記載の方法。 - 乳がんのための治療剤を同定または設計するための
(i)染色体相互作用の検出であって、
−染色体相互作用が表9またはマーカーセット2もしくは3に規定される、および/または
−染色体相互作用が、どの染色体相互作用が請求項1で定義される染色体状態に関連するかを判定する方法によって同定される、および/または
−染色体相互作用が、表9に記載される、またはマーカーセット2もしくは3に関連する任意の領域または遺伝子に存在する、
染色体相互作用の検出、または
(ii)表9に記載される、またはマーカーセット2もしくは3に関連する特異的プローブ配列のいずれかと少なくとも70%の同一性を有するプローブ、または
(iii)前記本明細書の表のいずれか1つに規定されるプライマー対、または表10に同定されるか、もしくはマーカーセット2もしくは3に関連する任意のプライマー対と少なくとも70%の同一性を有するプライマー対、
の使用。 - 候補薬剤を投与する工程、および染色体相互作用の前記検出、前記プローブまたは前記プライマー対を使用して、染色体状態の変化が存在するかどうかを検出し、それにより候補薬剤が治療剤であるかどうかを判定する工程を含み、任意にインビトロ、好ましくは細胞内で実施される、治療剤を同定するための請求項14に記載の使用。
- 請求項1から11のいずれか一項に記載のプロセスによって治療剤が必要であると同定された個体において、乳がんを予防または治療する方法に使用するための乳がん治療剤。
- 個体において乳がんの予防または治療に用いる治療剤を選択する方法であって、請求項1から11のいずれか一項に記載のプロセスで検出される染色体状態に基づいて前記治療剤を選択する工程を含む方法。
- 前記型付けまたは検出が、前記連結産物を増幅することができるプライマー、およびPCR反応の間に前記連結部位に結合するプローブを使用する定量的PCR(qPCR)による前記連結産物の特異的検出を含み、前記プローブが、前記染色体相互作用において一体となる染色体領域のそれぞれからの配列に相補的な配列を含み、任意に前記プローブが、
前記連結産物に特異的に結合するオリゴヌクレオチド、および/または
前記オリゴヌクレオチドの5’末端に共有結合したフルオロフォア、および/または
前記オリゴヌクレオチドの3’末端に共有結合したクエンチャー、
を含み、ならびに
任意に
前記フルオロフォアが、HEX、テキサスレッドおよびFAMから選択され、および/または
前記プローブが、10〜40ヌクレオチド塩基長、好ましくは20〜30ヌクレオチド塩基長の核酸配列を含む、請求項1から17のいずれかに記載のプロセス、方法または使用。
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