CN111334508B - 一种抑制乳腺癌细胞的增殖侵袭转移的基因、表达载体 - Google Patents

一种抑制乳腺癌细胞的增殖侵袭转移的基因、表达载体 Download PDF

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Abstract

本发明属于基因工程技术领域，公开了一种抑制乳腺癌细胞的增殖侵袭转移的基因、表达载体，抑制乳腺癌细胞的增殖侵袭转移的基因为LncRNA‑AC024560.3，位于3号染色体，RNA长度为956bps，sequence name为ENST00000453454。本发明实验表明，与正常乳腺上皮细胞MCF‑10A相比，LncRNA‑AC024560.3在乳腺癌细胞中的表达明显上调，而且在高侵袭性细胞MDA‑MB‑231中的表达量最高，在低侵袭性细胞MCF‑7中的表达量最低。本发明对于乳腺癌的诊断和治疗具有重大意义。

Description

一种抑制乳腺癌细胞的增殖侵袭转移的基因、表达载体
技术领域
本发明属于基因工程技术领域，尤其涉及一种抑制乳腺癌细胞的增殖侵袭转移的基因、表达载体。
背景技术
目前，最接近的现有技术：长链非编码RNA是最近发现的一类不具有编码蛋白质能力的RNA，长度大于200nt，在肿瘤的发生发展中具有重要调控作用。
综上所述，现有技术存在的问题是：
(1)现有技术中，不能为乳腺癌细胞中的表达、高侵袭性细胞MDA-MB-231中的表达、低侵袭性细胞MCF-7中的表达提供理论依据。
(2)现有技术不能准确抑制乳腺癌的增殖、侵袭和转移。临床上对于乳腺癌的治疗达不到抑制增殖，侵袭和转移的效果，不能提高病人的生存率。我们的技术为临床靶基因的治疗提供理论依据。
(3)lncRNA可以调控编码蛋白，研究lncRNA对乳腺癌增殖，侵袭转移的影响有助于揭示乳腺癌侵袭和转移的分子机制从而有助于筛选用出乳腺癌诊断及判断预后的生物标记物，同时可以设计有效的抗乳腺癌增殖侵袭转移的分子靶向药物。
解决上述技术问题的难度：寻找一种能有效抑制乳腺癌细胞侵袭和转移的精准靶向药物。
解决上述技术问题的意义：
(1)提供一种筛选抑制乳腺癌侵袭转移的潜在的靶向药物，此药物可以通过抑制lncRNA调控的蛋白起到抑制乳腺癌侵袭转移的作用。
(2)提供一种治疗乳腺癌的药物，实现乳腺癌的精准分子治疗。
发明内容
针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种抑制乳腺癌细胞的增殖侵袭转移的基因、表达载体。
本发明是这样实现的，一种抑制抑制乳腺癌细胞的增殖、侵袭和转移的基因，所述抑制乳腺癌细胞的侵袭和转移的基因为LncRNA-AC024560.3，sequence name为ENST00000453454，序列为SEQ ID NO：1。
本发明的另一目的在于提供一种上述基因的乳腺癌细胞的表达载体。
本发明的另一目的在于提供一种上述基因构建的的乳腺癌检测试剂盒。
本发明的另一目的在于提供一种上述基因在抑制乳腺癌细胞的抑制乳腺癌细胞的增殖、侵袭和转移中的应用。
综上所述，本发明的优点及积极效果为：本发明实验表明，细胞中LncRNA-AC024560.3的表达：通过荧光定量PCR检测正常乳腺上皮细胞MCF-10A以及乳腺癌细胞MDA-MB-231，MCF-7中LncRNA-AC024560.3的表达情况，结果显示，与正常乳腺上皮细胞MCF-10A相比，LncRNA-AC024560.3在乳腺癌细胞中的表达明显上调，而且在高侵袭性细胞MDA-MB-231中的表达量最高，在低侵袭性细胞MCF-7中的表达量最低。本发明对于乳腺癌的诊断和治疗具有重大意义。
本发明的抑制乳腺癌细胞的侵袭和转移的基因，为临床设计有效的抗乳腺癌侵袭转移的分子靶向药物提供了一定的实验及理论依据。
附图说明
图1是本发明实施例提供的抑制乳腺癌细胞的增殖侵袭转移的基因表达载体构建方法流程图。
图2是本发明实施例提供的荧光定量PCR检测LncRNA-AC024560.3在正常乳腺上皮细胞MCF-10A以及乳腺癌细胞MDA-MB-231，MCF-7中的表达情况图。
图3是本发明实施例提供的HCS细胞增殖检测细胞增殖能力改变的典型图像。
图4是本发明实施例提供的感染LncRNA-AC024560.3后细胞增殖能力的改变图。
图5是本发明实施例提供的HCS细胞划痕检测实验检测感染前后细胞的侵袭能力的典型图像。
图6是本发明实施例提供的HCS细胞划痕检测实验检测感染前后细胞的侵袭率的比较图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
本发明提供了一种抑制乳腺癌细胞的增殖侵袭转移的基因，所述抑制乳腺癌细胞的增殖侵袭转移的基因为LncRNA-AC024560.3，位于3号染色体，RNA长度为956bps，sequence name为ENST00000453454。
本发明的另一目的在于提供一种利用所述抑制乳腺癌细胞的增殖侵袭转移的基因构建的表达载体。
本发明的另一目的在于提供一种所述表达载体的构建方法，所述表达载体的构建方法包括：
本发明的另一目的在于提供一种检测方法包括：
步骤一，通过荧光定量PCR检测正常乳腺上皮细胞MCF-10A以及乳腺癌细胞MDA-MB-231，MCF-7中LncRNA-AC024560.3的表达情况，进行LncRNA-AC024560.3在乳腺癌细胞中的表达量分析、在高侵袭性细胞MDA-MB-231中的表达量分析以及在低侵袭性细胞MCF-7中的表达量分析；
步骤二，慢病毒感染细胞：通过shRNA慢病毒感染乳腺癌细胞MDA-MB-231，敲除细胞中的LncRNA-AC024560.3，并筛选出稳转细胞株，感染RNAi慢病毒的MDA-MB-231细胞称为shLncRNA-AC024560.3，感染对照慢病毒MDA-MB-231细胞称为shCtrl；
步骤三，Celigo细胞计数检测细胞增殖：HCS细胞增殖实验检测感染前后细胞的增殖能力；
步骤四，HCS细胞划痕检测实验检测感染前后细胞的侵袭能力。
进一步，步骤一，荧光定量PCR的方法包括以下步骤：
1)、细胞中总RNA的提取：
2)、应用M-MLV逆转录酶合成第一链cDNA；
3)用Bio-Rad的SYBR Green荧光定量PCR试剂盒检测细胞中LncRNA-AC024560.3的表达量；用2–△△CT法计算LncRNA-AC024560.3的相对表达量。
进一步，步骤1)具体包括：
1.1)吸尽6孔板中正常乳腺上皮细胞MCF-10A或乳腺癌细胞MDA-MB-231，T47D，MCF-7细胞的培养液，每孔加入1mL TRIzol，使其覆盖细胞，再用吸管或加样器吹打3次，细胞应完全裂解，然后转移至离心管中；
1.2)在装有裂解物的离心管中加入0.2mL的氯仿，振荡器上充分振荡混匀20秒，室温放置5分钟；12000g 4℃离心10分钟，然后吸取含总RNA的上层水相至一新的离心管中，每毫升TRIzol约可吸取0.6mL上层水相；有机相和中间层含有DNA和蛋白质；
1.3)加入和上层水相等体积的异丙醇，颠倒数次混匀，室温沉淀5分钟；12000g 4℃离心10分钟，在管底见RNA沉淀；弃上清，按每毫升TRIzol加入1mL 75％乙醇，轻轻颠倒混匀，以清洗RNA沉淀；12000g 4℃离心2分钟，弃去液体，丢弃RNA沉淀；室温倒置晾干5-10分钟；
1.4)溶解：加入适量DEPC处理水使RNA沉淀溶解；存放于-80℃；
步骤3)中，LncRNA-AC024560.3引物序列如下：
forward primer：5’-GCAGCCACAGCCTCACATCG-3’；
reverse primer：5’-GCTAGAAGGCAAGGCTCAACTGG-3’；GAPDH作为内参照。
进一步，步骤二具体包括：
第一步、准备目的细胞：
1.1)细胞复苏：
1.1.1)从液氮罐中取出细胞冻存管；
1.1.2)迅速放入37℃水浴中，并不时摇动使其尽快解冻；
1.1.3)完全解冻后，1300rpm，离心3min；
1.1.4)75％酒精擦拭冻存管消毒后，移至生物安全柜；
1.1.5)吸去冻存液上清，加入1mL新鲜的完全培养基重悬细胞，将细胞悬液接种至含有3mL含完全培养基的6-cm dish中，轻轻晃匀后置于37℃、5％CO2培养箱培养；
1.1.6)次日更换一次培养液后再继续培养；
1.2)细胞传代：
1.2.1)将生长90％汇合的细胞进行传代；
1.2.2)弃去旧培养液，加入2mL灭菌的D-Hank’s溶液，洗涤细胞，然后弃去该溶液；
1.2.3)加入0.5mL胰酶消化液，37℃消化约1-2min，直到细胞完全消化；
1.2.4)加入完全培养基1mL，吹打数次，将壁上的细胞冲洗下；
1.2.5)混匀细胞后分至两个新的6-cm dish中，补足完全培养基至4mL，继续培养；
第二步、目的细胞慢病毒感染：
(1)处于对数生长期的目的细胞进行胰酶消化，制成细胞悬液；
(2)将细胞悬液(细胞数约为1500～2500)接种于96-well中，37℃、5％CO2培养箱培养待细胞融合度达到20～30％；
(3)根据细胞MOI值，加入病毒；
(4)12小时后更换培养基；
(5)感染2～3天后分析基因GFP的表达情况，荧光率达到70～90％以及将细胞继续培养至细胞融合度达到70～90％，收集细胞，备用。
进一步，步骤三具体包括：
3.1)将处于对数生长期的各实验组细胞胰酶消化后，完全培养基重悬成细胞悬液，计数；
3.2)根据细胞生长快慢决定铺板细胞密度；每组3复孔，培养体系为100μL/孔，铺板过程中需确保每孔加入细胞数目一致37℃、5％CO2培养箱培养；
3.3)从铺板后第二天开始，每天Celigo检测读板一次，连续检测读板5天；
3.4)通过调整analysis settings的输入参数，计算出每次扫描孔板中的带绿色荧光的细胞的数量；对数据进行统计绘图，绘出5天的细胞增殖曲线。
进一步，步骤四具体包括：
1)将处于对数生长期的各实验组细胞胰酶消化后，完全培养基重悬成液计数；
2)根据细胞大小决定铺板密度，以次日细胞达到90％以上汇合度为准；37℃、5％CO2培养箱培养，每组3复孔，培养体系为100μL/孔；
3)第二天换低浓度血清培养基，使用划痕仪对准96孔板的下端中央部位，向上轻孔板的下端中央部位，向上形成划痕；
4)使用无血清培养基轻漂洗2-3遍，加入含有0.5％FBS的血清培养基，0h拍照；
5)37℃、5％CO2培养箱培养，根据愈合程度选择适时间用Celigo扫板；
6)用Celigo分析迁移面积；
7)Celigo在0h、24h、32h对目标96孔板进行扫描读板，获得扫描图片；
8)针对划痕实验，根据迁移面积，判断对照组，敲减组细胞愈合能力的差异。
本发明的另一目的在于提供一种所述检测方法的检测装置。
现有技术中，不能为乳腺癌细胞中的表达、高侵袭性细胞MDA-MB-231中的表达、低侵袭性细胞MCF-7中的表达提供理论依据。
针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种抑制乳腺癌细胞的增殖侵袭转移的基因及应用，下面结合附图对本发明作详细的描述。
本发明实施例提供的抑制乳腺癌细胞的增殖侵袭转移的基因为LncRNA-AC024560.3，位于3号染色体，RNA长度为956bps，sequence name为ENST00000453454。
图1是本发明实施例提供的抑制乳腺癌细胞的增殖侵袭转移的基因表达载体构建方法。
S101：细胞中LncRNA-AC024560.3的表达。
S102：通过荧光定量PCR检测正常乳腺上皮细胞MCF-10A以及乳腺癌细胞MDA-MB-231，MCF-7中LncRNA-AC024560.3的表达情况。
S103：与正常乳腺上皮细胞MCF-10A相比，LncRNA-AC024560.3在乳腺癌细胞中的表达明显上调，而且在高侵袭性细胞MDA-MB-231中的表达量最高，在低侵袭性细胞MCF-7中的表达量最低。
下面结合具体实验对本发明作进一步描述。
(一)荧光定量PCR即Real-time PCR实验步骤：
1)、细胞中总RNA的提取(TRIzol法)。
1.1)吸尽6孔板中正常乳腺上皮细胞MCF-10A或乳腺癌细胞MDA-MB-231，T47D，MCF-7细胞的培养液，每孔加入1mL TRIzol，使其覆盖细胞，再用吸管或加样器吹打3次，细胞应完全裂解，然后转移至离心管中。
1.2)在装有裂解物的离心管中加入0.2mL的氯仿(1mL TRIzol加入0.2mL氯仿)，振荡器上充分振荡混匀20秒，室温放置5分钟。12000g 4℃离心10分钟，然后吸取含总RNA的上层水相至一新的离心管中，每毫升TRIzol约可吸取0.6mL上层水相。有机相和中间层含有DNA和蛋白质，应避免触及。
1.3)加入和上层水相等体积的异丙醇，颠倒数次混匀，室温沉淀5分钟。12000g 4℃离心10分钟，在管底可见RNA沉淀。弃上清，按每毫升TRIzol加入1mL 75％乙醇，轻轻颠倒混匀，以清洗RNA沉淀。12000g 4℃离心2分钟，弃去液体，小心勿丢弃RNA沉淀。室温倒置晾干5-10分钟。
1.4)溶解：加入适量DEPC处理水使RNA沉淀溶解。存放于-80℃。
2)、应用M-MLV逆转录酶合成第一链cDNA。合成用试剂及条件如下：
Figure GDA0003530687490000081
70℃5min冰上放置5min
Figure GDA0003530687490000082
37℃60min 95℃5min
3)、用Bio-Rad的SYBR Green荧光定量PCR试剂盒检测细胞中LncRNA-AC024560.3的表达量。用2–△△CT法计算LncRNA-AC024560.3的相对表达量。
LncRNA-AC024560.3引物序列如下：
SEQ ID NO：1forward primer：5’-GCAGCCACAGCCTCACATCG-3’。
SEQ ID NO：2reverse primer：5’-GCTAGAAGGCAAGGCTCAACTGG-3’。GAPDH作为内参照。
如图2所示，为荧光定量PCR检测LncRNA-AC024560.3在正常乳腺上皮细胞MCF-10A以及乳腺癌细胞MDA-MB-231，MCF-7中的表达情况图。
(二)、慢病毒感染细胞：通过shRNA慢病毒感染乳腺癌细胞MDA-MB-231，成功敲减细胞中的LncRNA-AC024560.3，并筛选出稳转细胞株，感染shRNA慢病毒的MDA-MB-231细胞称为shLncRNA-AC024560.3，感染对照慢病毒MDA-MB-231细胞称为shCtrl。
1)、主要试剂
Figure GDA0003530687490000091
2)、主要仪器
Figure GDA0003530687490000092
3)、实验步骤
(A)、准备目的细胞
1.1细胞复苏
(1)从液氮罐中取出细胞冻存管。
(2)迅速放入37℃水浴中，并不时摇动使其尽快解冻。
(3)完全解冻后，1300rpm，离心3min。
(4)75％酒精擦拭冻存管消毒后，移至生物安全柜。
(5)吸去冻存液上清，加入1mL新鲜的完全培养基重悬细胞，将细胞悬液接种至含有3mL含完全培养基的6-cm dish中，轻轻晃匀后置于37℃、5％CO2培养箱培养。
(6)次日更换一次培养液后再继续培养。
1.2细胞传代
(1)将生长90％汇合的细胞进行传代。
(2)弃去旧培养液，加入2mL灭菌的D-Hank’s溶液，洗涤细胞，然后弃去该溶液。
(3)加入0.5mL胰酶消化液，37℃消化约1-2min，直到细胞完全消化下来。
(4)加入完全培养基1mL，吹打数次，将壁上的细胞冲洗下来。
(5)混匀细胞后分至两个新的6-cm dish中，补足完全培养基至4mL，继续培养。
(B)、目的细胞慢病毒感染
(1)处于对数生长期的目的细胞进行胰酶消化，制成细胞悬液。
(2)将细胞悬液(细胞数约为1500～2500)接种于96-well中，37℃、5％CO2培养箱培养待细胞融合度达到约20～30％。
(3)根据细胞MOI值，加入适宜量的病毒。
(4)12小时后观察细胞状态，更换培养基。
(5)感染2～3天后观察慢病毒上报告基因GFP的表达情况，荧光率达到70～90％者，将细胞继续培养至细胞融合度达到70～90％时，收集细胞继续后续实验。
LncRNA-AC024560.3shRNA慢病毒为上海吉凯基因公司定制，载体名称为GV115。分别用了三个靶点，序列1为：ACGCAGCCATTCAAGGGATAA，SEQ ID NO：3。
序列2为：GACCACGAGAGATGCAGAAAT，SEQ ID NO：4。
序列3为：GGGCAGCTACACATCTTGAAA，SEQ ID NO：5。
三种病毒混合后感染细胞。
(三)、Celigo细胞计数检测细胞增殖：HCS细胞增殖实验检测感染前后细胞的增殖能力，结果显示敲除LncRNA-AC024560.3可抑制MDA-MB-231细胞的增殖能力(图2，图3)。
1)、主要试剂
Figure GDA0003530687490000101
Figure GDA0003530687490000111
2)、主要器材
Figure GDA0003530687490000112
3)、实验步骤
3.1)将处于对数生长期的各实验组细胞胰酶消化后，完全培养基重悬成细胞悬液，计数。
3.2)根据细胞生长快慢决定铺板细胞密度(大多数细胞铺板数设定为2000cell/well)。每组3复孔，培养体系为100μL/孔，铺板过程中需确保每孔加入细胞数目一致37℃、5％CO2培养箱培养。
3.3)从铺板后第二天开始，每天Celigo检测读板一次，连续检测读板5天。
3.4)通过调整analysis settings的输入参数，准确地计算出每次扫描孔板中的带绿色荧光的细胞的数量。对数据进行统计绘图，绘出5天的细胞增殖曲线。
如图3所示，为本发明提供的HCS细胞增殖检测细胞增殖能力改变的典型图像。
如图4所示，为本发明感染LncRNA-AC024560.3后细胞增殖能力的改变图。
(四)、HCS细胞划痕检测实验检测感染前后细胞的侵袭能力，结果显示，敲除LncRNA-AC024560.3可明显抑制MDA-MB-231细胞的侵袭能力(图5，图6)。
HCS细胞划痕检测实验步骤：
1)将处于对数生长期的各实验组细胞胰酶消化后，完全培养基重悬成液计数。
2)根据细胞大小决定铺板密度(大多数细胞铺板数设定为50000cell/well)，以次日细胞达到90％以上汇合度为准。37℃、5％CO2培养箱培养，每组3复孔，培养体系为100μL/孔。
3)第二天换低浓度血清培养基，使用划痕仪对准96孔板的下端中央部位，向上轻孔板的下端中央部位，向上轻推形成划痕。
4)使用无血清培养基轻漂洗2-3遍，加入含有0.5％FBS的血清培养基，0h拍照。
5)37℃、5％CO2培养箱培养，根据愈合程度选择适时间用Celigo扫板。
6)用Celigo分析迁移面积。
7)Celigo在0h、24h、32h对目标96孔板进行扫描读板，获得扫描图片。
8)针对划痕实验，根据迁移面积，判断对照组，敲减组细胞愈合能力的差异。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Figure GDA0003530687490000131
<110> 潍坊医学院
<120> 一种抑制乳腺癌细胞的增殖侵袭转移的基因、表达载体
<160> 5
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213>人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
gcagccacagcctcacatcg
<210> 2
<211> 23
<212> DNA
<213>人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
gctagaaggcaaggctcaactgg
<210> 3
<211> 21
<212> DNA
<213>人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
acgcagccattcaagggataa
<210> 4
<211> 21
<212> DNA
<213>人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
gaccacgagagatgcagaaat
<210> 5
<211> 21
<212> DNA
<213>人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
gggcagctacacatcttgaaa

Claims (2)

1.一种抑制基因表达的抑制剂在制备用于抑制乳腺癌细胞增殖、侵袭和转移的基因的药物中的应用，其特征在于，所述基因为LncRNA-AC024560.3，sequence name为ENST00000453454。
2.一种检测权利要求1中 所述基因表达的试剂在制备乳腺癌检测试剂盒中的应用。
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