JPWO2020225551A5 - - Google Patents
Download PDFInfo
- Publication number
- JPWO2020225551A5 JPWO2020225551A5 JP2021566070A JP2021566070A JPWO2020225551A5 JP WO2020225551 A5 JPWO2020225551 A5 JP WO2020225551A5 JP 2021566070 A JP2021566070 A JP 2021566070A JP 2021566070 A JP2021566070 A JP 2021566070A JP WO2020225551 A5 JPWO2020225551 A5 JP WO2020225551A5
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- chromosomal
- dlbcl
- interactions
- markers
- samples
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Description
本発明は疾患プロセスに関する。
がんの疾患プロセスの規制および原因となる側面は複雑であり、利用可能なＤＮＡおよびタンパク質の分類方法を使用して容易に解明することはできない。
びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）は、抗体産生に関与する白血球の一種であるＢ細胞のがんである。これは成人の間で最も一般的なタイプの非ホジキンリンパ腫であり、米国および英国では年間１０万人当たり７～８例の発症率がある。しかし、疾患プロセスの帰結についての理解は不十分である。
前立腺がんは、前立腺の細胞の異常で制御されていない成長によって引き起こされる。前立腺がんの生存率は１０年ごとに改善しているが、当該疾患は依然として大部分が不治であると考えられている。米国がん協会（American Cancer Society）によると、前立腺がんのすべてのステージを合わせて、１年の相対生存率は２０％であり、５年の相対生存率は７％である。
本発明者らは、前立腺がん、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）およびリンパ腫の染色体コンフォメーションシグネチャによって定義される患者のサブグループを特定している。
本発明によれば、集団内のサブグループを表す染色体状態を検出するためのプロセスが提供され、当該プロセスは、その染色体状態に関連する染色体相互作用がゲノムの定義された領域内に存在するか否かを判定する工程を含み；かつ
－ 上記染色体相互作用は、随意に、どの染色体相互作用が集団のサブグループに対応する染色体状態に関連するかを判定する方法によって特定されており、当該方法は、染色体の異なる状態を有するサブグループ由来の核酸の第１のセットをインデックス核酸の第２のセットと接触させる工程、および相補的配列のハイブリダイズを可能にする工程を含み、核酸の第１および第２のセットにおける核酸は、染色体相互作用で一緒になった両方の染色体領域由来の配列を含むライゲートされた産物を表し、核酸の第１のセットと第２のセットとの間のハイブリダイゼーションのパターンにより、どの染色体相互作用がサブグループに特異的であるかの判定が可能になり；および
－ サブグループは前立腺がんの予後に関連し、染色体相互作用は、
（ｉ）表６に挙げられる領域または遺伝子のいずれかに存在する、および／または
（ii）表６に示される任意のプローブによって表される染色体相互作用のいずれかに対応する、および／または
（iii）（ｉ）または（ii）を含むまたは（ｉ）または（ii）に隣接する４，０００塩基領域に存在する；
または、
－ サブグループはＤＬＢＣＬの予後に関連し、染色体相互作用は、
ａ）表５に挙げられる領域または遺伝子のいずれかに存在する、および／または
ｂ）表５に示される任意のプローブによって表される染色体相互作用のいずれかに対応する、および／または
ｃ）（ａ）または（ｂ）を含むまたは（ａ）または（ｂ）に隣接する４，０００塩基領域に存在する；
または、
－ サブグループはリンパ腫の予後に関連し、染色体相互作用は、
（iv）表８に挙げられる領域または遺伝子のいずれかに存在する、および／または
（ｖ）表８に示される染色体相互作用のいずれかに対応する、および／または
（vi）（iv）または（ｖ）を含むまたは（iv）または（ｖ）に隣接する４，０００塩基領域に存在する。
－ 上記染色体相互作用は、随意に、どの染色体相互作用が集団のサブグループに対応する染色体状態に関連するかを判定する方法によって特定されており、当該方法は、染色体の異なる状態を有するサブグループ由来の核酸の第１のセットをインデックス核酸の第２のセットと接触させる工程、および相補的配列のハイブリダイズを可能にする工程を含み、核酸の第１および第２のセットにおける核酸は、染色体相互作用で一緒になった両方の染色体領域由来の配列を含むライゲートされた産物を表し、核酸の第１のセットと第２のセットとの間のハイブリダイゼーションのパターンにより、どの染色体相互作用がサブグループに特異的であるかの判定が可能になり；および
－ サブグループは前立腺がんの予後に関連し、染色体相互作用は、
（ｉ）表６に挙げられる領域または遺伝子のいずれかに存在する、および／または
（ii）表６に示される任意のプローブによって表される染色体相互作用のいずれかに対応する、および／または
（iii）（ｉ）または（ii）を含むまたは（ｉ）または（ii）に隣接する４，０００塩基領域に存在する；
または、
－ サブグループはＤＬＢＣＬの予後に関連し、染色体相互作用は、
ａ）表５に挙げられる領域または遺伝子のいずれかに存在する、および／または
ｂ）表５に示される任意のプローブによって表される染色体相互作用のいずれかに対応する、および／または
ｃ）（ａ）または（ｂ）を含むまたは（ａ）または（ｂ）に隣接する４，０００塩基領域に存在する；
または、
－ サブグループはリンパ腫の予後に関連し、染色体相互作用は、
（iv）表８に挙げられる領域または遺伝子のいずれかに存在する、および／または
（ｖ）表８に示される染色体相互作用のいずれかに対応する、および／または
（vi）（iv）または（ｖ）を含むまたは（iv）または（ｖ）に隣接する４，０００塩基領域に存在する。
発明の態様
本発明は、前立腺がんの予後の判定、特に前立腺がんが侵攻性であるか緩慢性であるかの判定に関する。この判定は、本明細書、例えば表６に開示される関連マーカーのいずれか、またはマーカーの好ましい組み合わせ、または本明細書に開示される定義された特異的な領域のマーカーを分類することによって行われる。したがって、本発明は、前立腺がんを有する患者を分類して、前立腺がんが侵攻性であるか緩慢性であるかを特定する方法に関する。
本発明は、前立腺がんの予後の判定、特に前立腺がんが侵攻性であるか緩慢性であるかの判定に関する。この判定は、本明細書、例えば表６に開示される関連マーカーのいずれか、またはマーカーの好ましい組み合わせ、または本明細書に開示される定義された特異的な領域のマーカーを分類することによって行われる。したがって、本発明は、前立腺がんを有する患者を分類して、前立腺がんが侵攻性であるか緩慢性であるかを特定する方法に関する。
本発明はまた、ＤＬＢＣＬにおける予後の判定、特に予後が生存に関して良好であるか不良であるかの判定に関する。この判定は、本明細書、例えば表５に開示される関連マーカーのいずれか、またはマーカーの好ましい組み合わせ、または本明細書に開示される定義された特異的な領域のマーカーを分類することによって行われる。したがって、本発明は、ＤＬＢＣＬを有する患者を分類して、患者が生存に関して良好または不良の予後を有するかどうかを特定する、例えば、疾患の予想される発症率および／または死亡までの時間を判定する方法に関する。
本質的に、本発明の方法において、前立腺がんまたはＤＬＢＣＬの亜集団はマーカーの分類によって特定される。したがって、本発明は、例えば、これらの疾病における予後に関連するエピジェネティックマーカーのパネルに関する。本発明は、それゆえ、患者のニーズを正確に反映する個別化された治療を患者に施すことを可能にする。
本発明はまた、表８または９によって定義される染色体相互作用の分類に基づくリンパ腫の予後の判定に関する。
表５～７は、好ましくは、ヒトの予後の判定に関する。表８および９は、好ましくは、イヌの予後の判定に関する。
本明細書で言及される任意の治療薬、例えば薬物が、当該方法の結果に基づいて個体に投与され得る。
表および図面にはマーカーセットが開示されている。一実施形態では、任意の開示されたマーカーセットからの少なくとも１０のマーカーが本発明で使用される。別の実施形態では、任意の開示されたマーカーセットからのマーカーの少なくとも２０％が本発明で使用される。
発明のプロセス
本発明のプロセスは、予後に関連する染色体相互作用を検出するための分類システムを含む。この分類は、染色体相互作用で一緒になった染色体の架橋領域に基づく本明細書で言及されるＥｐｉＳｗｉｔｃｈ（商標）システムを使用して実施され得、染色体ＤＮＡを切断し、その後、架橋実体に存在する核酸をライゲートして、染色体相互作用を形成した両方の領域から配列を有するライゲートされた核酸を誘導する。このライゲートされた核酸の検出は、特定の染色体相互作用の有無の判定を可能にする。
本発明のプロセスは、予後に関連する染色体相互作用を検出するための分類システムを含む。この分類は、染色体相互作用で一緒になった染色体の架橋領域に基づく本明細書で言及されるＥｐｉＳｗｉｔｃｈ（商標）システムを使用して実施され得、染色体ＤＮＡを切断し、その後、架橋実体に存在する核酸をライゲートして、染色体相互作用を形成した両方の領域から配列を有するライゲートされた核酸を誘導する。このライゲートされた核酸の検出は、特定の染色体相互作用の有無の判定を可能にする。
染色体相互作用は、第１および第２の核酸の集団が使用される上記の方法を使用して同定され得る。これらの核酸は、ＥｐｉＳｗｉｔｃｈ（商標）の技術を使用して生成することもできる。
本発明に関連するエピジェネティックな相互作用
本明細書で使用されるように、「エピジェネティック」および「染色体」相互作用という用語は、典型的に、染色体の遠位領域間の相互作用を指し、上記相互作用は動的であり、染色体の領域の状態に応じて変化、形成または破壊する。
本明細書で使用されるように、「エピジェネティック」および「染色体」相互作用という用語は、典型的に、染色体の遠位領域間の相互作用を指し、上記相互作用は動的であり、染色体の領域の状態に応じて変化、形成または破壊する。
本発明の特定のプロセスでは、染色体相互作用は、典型的に、最初に相互作用の一部である染色体の両方の領域からの配列を含むライゲートされた核酸を生成することによって検出される。そのようなプロセスでは、領域は、任意の適切な手段によって架橋することができる。好ましい態様では、相互作用は、ホルムアルデヒドを使用して架橋されるが、任意のアルデヒド、またはＤ－ビオチノイル－ｅ－アミノカプロン酸－Ｎ－ヒドロキシスクシンイミドエステルまたはジゴキシゲニン－３－Ｏ－メチルカルボニル－ｅ－アミノカプロン酸－Ｎ－ヒドロキシスクシンイミドエステルによっても架橋され得る。パラホルムアルデヒドは、４オングストローム離れたＤＮＡ鎖を架橋することができる。好ましくは、染色体相互作用は同じ染色体上にあり、随意に２～１０オングストローム離れている。
染色体相互作用は、例えば、生理学的状態の変化に応答して転写または抑圧されている場合、染色体の領域の状態を反映し得る。本明細書で定義されるサブグループに特異的な染色体相互作用は安定していることがわかっており、したがって、２つのサブグループ間の差を測定する信頼性の高い手段が提供される。
さらに、特性（予後など）に特異的な染色体相互作用は、通常、例えば、メチル化やヒストンタンパク質の結合の変化などの他のエピジェネティックマーカーと比較して、生物学的プロセスの初期に発生する。したがって、本発明のプロセスは、生物学的プロセスの初期段階を検出することができる。これにより、早期介入（例えば治療）が可能になり、これは結果としてより効果的になり得る。染色体相互作用はまた、個体の現在の状態を反映しているため、予後の変化を評価するために使用することができる。さらに、同じサブグループ内の個体間には関連する染色体相互作用にほとんど変化がない。染色体相互作用の検出は、遺伝子ごとに最大５０の異なる考えられ得る相互作用で非常に有益であるため、本発明のプロセスでは、５００，０００の異なる相互作用を照合することができる。
好ましいマーカーセット
本明細書において、「マーカー」または「バイオマーカー」という用語は、本発明において検出（分類）することができる特異的な染色体相互作用を指す。特異的なマーカーが本明細書に開示されており、それらはいずれも本発明で使用され得る。マーカーのさらなるセットが、例えば、本明細書に開示される組み合わせまたは数で使用され得る。本明細書の表に開示されている特異的なマーカーが好ましいだけでなく、本明細書の表に言及されている遺伝子および領域に存在するマーカーも好ましい。これらは、任意の適切な方法、例えば、ｑＰＣＲ法を含む、本明細書に開示されるＰＣＲまたはプローブベースの方法によって分類され得る。マーカーは、本明細書では、位置によって、またはプローブおよび／またはプライマー配列によって定義される。
本明細書において、「マーカー」または「バイオマーカー」という用語は、本発明において検出（分類）することができる特異的な染色体相互作用を指す。特異的なマーカーが本明細書に開示されており、それらはいずれも本発明で使用され得る。マーカーのさらなるセットが、例えば、本明細書に開示される組み合わせまたは数で使用され得る。本明細書の表に開示されている特異的なマーカーが好ましいだけでなく、本明細書の表に言及されている遺伝子および領域に存在するマーカーも好ましい。これらは、任意の適切な方法、例えば、ｑＰＣＲ法を含む、本明細書に開示されるＰＣＲまたはプローブベースの方法によって分類され得る。マーカーは、本明細書では、位置によって、またはプローブおよび／またはプライマー配列によって定義される。
エピジェネティックな相互作用の位置および原因
エピジェネティックな染色体相互作用は重複し、関連する遺伝子または記述されていない遺伝子をコードすることが示されている染色体の領域を含み得るが、等しく遺伝子間領域に存在し得る。本発明者らが、すべての領域におけるエピジェネティックな相互作用が、染色体遺伝子座の状態を判定する上で等しく重要であることを発見したことにさらに留意されたい。これらの相互作用は、必ずしも遺伝子座に位置する特定の遺伝子のコード領域に存在するとは限らず、遺伝子間領域に存在し得る。
エピジェネティックな染色体相互作用は重複し、関連する遺伝子または記述されていない遺伝子をコードすることが示されている染色体の領域を含み得るが、等しく遺伝子間領域に存在し得る。本発明者らが、すべての領域におけるエピジェネティックな相互作用が、染色体遺伝子座の状態を判定する上で等しく重要であることを発見したことにさらに留意されたい。これらの相互作用は、必ずしも遺伝子座に位置する特定の遺伝子のコード領域に存在するとは限らず、遺伝子間領域に存在し得る。
本発明で検出される染色体相互作用は、環境要因、ＤＮＡメチル化、非コードアンチセンスＲＮＡ転写物、非変異原性発癌物質、ヒストン修飾、クロマチンリモデリング、および特異的な局所ＤＮＡ相互作用による、基礎となるＤＮＡ配列に対する変化によって引き起こされ得る。染色体相互作用につながる変化は、基礎となる核酸配列に対する変化によって引き起こされ得、それら自体は遺伝子産物または遺伝子発現のモードに直接影響しない。そのような変化は、例えば、遺伝子内および／または遺伝子外のＳＮＰ、遺伝子融合および／または遺伝子間ＤＮＡ、マイクロＲＮＡ、および非コードＲＮＡの欠失であり得る。例えば、ＳＮＰのおよそ２０％が非コード領域に存在することが知られているため、記載されるプロセスは非コード状況でも有益である。一態様では、相互作用を形成するために一緒になる染色体の領域は、同じ染色体上で５ｋｂ、３ｋｂ、１ｋｂ、５００塩基対または２００塩基対未満離れている。
検出される染色体相互作用は、好ましくは、表５に言及されている遺伝子のいずれか内に存在する。しかし、それはまた、遺伝子の上流または下流、例えば、遺伝子またはコード配列から最大５０，０００、最大３０，０００、最大２０，０００、最大１０，０００、または最大５０００塩基上流または下流であり得る。
検出される染色体相互作用は、好ましくは、表６に言及されている遺伝子のいずれか内に存在する。しかし、それはまた、遺伝子の上流または下流、例えば、遺伝子またはコード配列から最大５０，０００、最大３０，０００、最大２０，０００、最大１０，０００、または最大５０００塩基上流または下流であり得る。
検出される染色体相互作用は、好ましくは、表９に言及されている遺伝子のいずれか内に存在する。しかし、それはまた、遺伝子の上流または下流、例えば、遺伝子またはコード配列から最大５０，０００、最大３０，０００、最大２０，０００、最大１０，０００、または最大５０００塩基上流または下流であり得る。
サブグループ、時点および個別化された治療
本発明の目的は予後を判定することである。これは、１つまたは複数の定義された時点、例えば、少なくとも１、２、５、８または１０の異なる時点で行われ得る。少なくとも１、２、５または８の時点間の期間は、少なくとも５、１０、２０、５０、８０または１００日であり得る。
本発明の目的は予後を判定することである。これは、１つまたは複数の定義された時点、例えば、少なくとも１、２、５、８または１０の異なる時点で行われ得る。少なくとも１、２、５または８の時点間の期間は、少なくとも５、１０、２０、５０、８０または１００日であり得る。
本明細書で使用されるように、「サブグループ」は、好ましくは集団サブグループ（集団内のサブグループ）、より好ましくは特定の真核生物などの特定の動物の集団内のサブグループ、または哺乳動物（例えば、ヒト、非ヒト、非ヒト霊長類、またはげっ歯類、例えばマウスまたはラット）を指す。最も好ましくは、「サブグループ」は、ヒト集団内のサブグループを指す。サブグループは、犬などのイヌのサブグループであり得る。
本発明は、集団内の特定のサブグループを検出および処置することを含む。本発明者らは、染色体相互作用が、所与の集団内のサブセット（例えば、少なくとも２つのサブセット）間で異なることを発見した。これらの違いを識別することで、医師は、プロセスで記載されているように、患者を集団の１つのサブセットの一部として分類することができる。したがって、本発明は、エピジェネティックな染色体相互作用に基づいて患者用に薬剤を個人化するプロセスを医師に提供する。
一態様では、本発明は、個体が、
速いまたは遅い「発症者」である、および／または
侵攻性または緩慢性の疾患を患っている、
かどうかを試験することに関する。
速いまたは遅い「発症者」である、および／または
侵攻性または緩慢性の疾患を患っている、
かどうかを試験することに関する。
本発明はまた、個体の予想される生存時間を判定し得る。
そのような試験は、その後の患者の治療方法、例えば、薬物の種類および／またはその用量および／またはその投与頻度を選択するために使用され得る。
ライゲートされた核酸の生成
本発明の特定の態様は、ライゲートされた核酸、特にライゲートされたＤＮＡを利用する。これらは、染色体相互作用で一緒になる領域の両方からの配列を含み、したがって相互作用に関する情報を提供する。本明細書に記載されるＥｐｉＳｗｉｔｃｈ（商標）法は、染色体相互作用を検出するためにそのようなライゲートされた核酸の生成を使用する。
本発明の特定の態様は、ライゲートされた核酸、特にライゲートされたＤＮＡを利用する。これらは、染色体相互作用で一緒になる領域の両方からの配列を含み、したがって相互作用に関する情報を提供する。本明細書に記載されるＥｐｉＳｗｉｔｃｈ（商標）法は、染色体相互作用を検出するためにそのようなライゲートされた核酸の生成を使用する。
したがって、本発明のプロセスは、以下の工程（これらの工程を含む方法を含む）によってライゲートされた核酸（例えばＤＮＡ）を生成する工程を含み得る：
（ｉ）好ましくはインビトロで、染色体遺伝子座に存在するエピジェネティックな染色体相互作用を架橋する工程；
（ii）随意に、架橋されたＤＮＡを上記染色体遺伝子座から単離する工程；
（iii）上記架橋されたＤＮＡを、例えば、少なくとも１回切断する酵素（特に、上記染色体遺伝子座内で少なくとも１回切断する酵素）を用いる制限分解によって切断にさらす工程；
（iv）（特にＤＮＡループを形成するために）上記架橋された切断したＤＮＡ末端をライゲートする工程；および
（ｖ）随意に、特異的な染色体相互作用の存在を同定するために、特にＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）などの技術を使用して、上記ライゲートされたＤＮＡおよび／または上記ＤＮＡループの存在を同定する工程。
（ｉ）好ましくはインビトロで、染色体遺伝子座に存在するエピジェネティックな染色体相互作用を架橋する工程；
（ii）随意に、架橋されたＤＮＡを上記染色体遺伝子座から単離する工程；
（iii）上記架橋されたＤＮＡを、例えば、少なくとも１回切断する酵素（特に、上記染色体遺伝子座内で少なくとも１回切断する酵素）を用いる制限分解によって切断にさらす工程；
（iv）（特にＤＮＡループを形成するために）上記架橋された切断したＤＮＡ末端をライゲートする工程；および
（ｖ）随意に、特異的な染色体相互作用の存在を同定するために、特にＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）などの技術を使用して、上記ライゲートされたＤＮＡおよび／または上記ＤＮＡループの存在を同定する工程。
これらの工程は、本明細書に言及される任意の態様に関する染色体相互作用を検出するために実行され得る。これらの工程はまた、本明細書に言及される第１および／または核酸の第２のセットを生成するために実行され得る。
ＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）は、ライゲートされた核酸を検出または識別するために使用され得、例えば、生成されるＰＣＲ産物のサイズが、存在する特異的な染色体相互作用を示唆し得るため、遺伝子座の状態を同定するために使用され得る。好ましい態様では、表５に示される少なくとも１つ、２つ、または３つのプライマーまたはプライマー対が、ＰＣＲ反応において使用される。他の態様では、少なくとも１、１０、２０、３０、５０もしくは８０のプライマーまたはプライマー対、または表６に示されるプライマーまたはプライマー対が、ＰＣＲ反応において使用される。当業者は、対象の染色体遺伝子座内のＤＮＡを切断するために使用することができる多数の制限酵素を認識する。使用される特定の酵素が、研究される遺伝子座およびそこに位置するＤＮＡの配列に依存することは明らかであろう。本発明に記載されるようにＤＮＡを切断するために使用することができる制限酵素の非限定的な例は、ＴａｑＩである。
ＥｐｉＳｗｉｔｃｈ（商標）の技術
ＥｐｉＳｗｉｔｃｈ（商標）の技術はまた、表現型に特異的なエピジェネティックな染色体コンフォメーションシグネチャの検出におけるマイクロアレイＥｐｉＳｗｉｔｃｈ（商標）マーカーデータの使用に関する。本明細書に記載される方法でライゲートされた核酸を利用するＥｐｉＳｗｉｔｃｈ（商標）などの態様には、いくつかの利点がある。それらは、例えば、本発明の核酸の第１のセットからの核酸配列が核酸の第２のセットとハイブリダイズするかまたはハイブリダイズしないために、低レベルの確率的ノイズを有する。これにより、エピジェネティックレベルで複雑なメカニズムを測定する比較的簡単な方法を可能にするバイナリ結果が提供される。ＥｐｉＳｗｉｔｃｈ（商標）の技術はまた、処理時間が速く、コストも低い。一態様では、処理時間は３時間から６時間である。
ＥｐｉＳｗｉｔｃｈ（商標）の技術はまた、表現型に特異的なエピジェネティックな染色体コンフォメーションシグネチャの検出におけるマイクロアレイＥｐｉＳｗｉｔｃｈ（商標）マーカーデータの使用に関する。本明細書に記載される方法でライゲートされた核酸を利用するＥｐｉＳｗｉｔｃｈ（商標）などの態様には、いくつかの利点がある。それらは、例えば、本発明の核酸の第１のセットからの核酸配列が核酸の第２のセットとハイブリダイズするかまたはハイブリダイズしないために、低レベルの確率的ノイズを有する。これにより、エピジェネティックレベルで複雑なメカニズムを測定する比較的簡単な方法を可能にするバイナリ結果が提供される。ＥｐｉＳｗｉｔｃｈ（商標）の技術はまた、処理時間が速く、コストも低い。一態様では、処理時間は３時間から６時間である。
サンプルおよびサンプル処理
本発明のプロセスは、通常、サンプル上で実行される。サンプルは、定義された時点で、例えば、本明細書で定義された任意の時点で取得され得る。サンプルは、通常、個体からのＤＮＡを含む。それは、通常、細胞を含む。一態様では、サンプルは、低侵襲的手段によって得られ、例えば、血液サンプルであり得る。ＤＮＡが抽出され、標準的な制限酵素で切断され得る。これにより、どの染色体コンフォメーションが保持され、ＥｐｉＳｗｉｔｃｈ（商標）プラットフォームで検出されるかを予め判定することができる。水平伝播を含む、組織と血液との間の染色体相互作用の同期により、血液サンプルを使用して、疾患に関連する組織などの組織内の染色体相互作用を検出することができる。癌などの特定の疾病に関して、突然変異による遺伝的ノイズが関連組織における染色体相互作用の「シグナル」に影響を与えかねないため、血液を使用することに利点がある。
本発明のプロセスは、通常、サンプル上で実行される。サンプルは、定義された時点で、例えば、本明細書で定義された任意の時点で取得され得る。サンプルは、通常、個体からのＤＮＡを含む。それは、通常、細胞を含む。一態様では、サンプルは、低侵襲的手段によって得られ、例えば、血液サンプルであり得る。ＤＮＡが抽出され、標準的な制限酵素で切断され得る。これにより、どの染色体コンフォメーションが保持され、ＥｐｉＳｗｉｔｃｈ（商標）プラットフォームで検出されるかを予め判定することができる。水平伝播を含む、組織と血液との間の染色体相互作用の同期により、血液サンプルを使用して、疾患に関連する組織などの組織内の染色体相互作用を検出することができる。癌などの特定の疾病に関して、突然変異による遺伝的ノイズが関連組織における染色体相互作用の「シグナル」に影響を与えかねないため、血液を使用することに利点がある。
本発明の核酸の性質
本発明は、本発明のプロセスで使用または生成されるものとして本明細書に記載されているライゲートされた核酸などの特定の核酸に関する。これらは、本明細書に言及される第１および第２の核酸と同じであり得るか、またはそれらの特性のいずれかを有し得る。本発明の核酸は、典型的に、２つの部分を含み、その各々は、染色体相互作用で一緒になる染色体の２つの領域のうちの１つからの配列を含む。典型的に、各部分は、少なくとも８、１０、１５、２０、３０または４０ヌクレオチドの長さ、例えば１０～４０ヌクレオチドの長さである。好ましい核酸は、表のいずれかに言及される遺伝子のいずれかからの配列を含む。典型的に、好ましい核酸は、表５に言及される特異的なプローブ配列を含むか、またはそのような配列の断片および／または相同体を含む。典型的に、好ましい核酸は、表６に言及される特異的なプローブ配列を含み得るか、またはそのような配列の断片および／または相同体を含み得る。
本発明は、本発明のプロセスで使用または生成されるものとして本明細書に記載されているライゲートされた核酸などの特定の核酸に関する。これらは、本明細書に言及される第１および第２の核酸と同じであり得るか、またはそれらの特性のいずれかを有し得る。本発明の核酸は、典型的に、２つの部分を含み、その各々は、染色体相互作用で一緒になる染色体の２つの領域のうちの１つからの配列を含む。典型的に、各部分は、少なくとも８、１０、１５、２０、３０または４０ヌクレオチドの長さ、例えば１０～４０ヌクレオチドの長さである。好ましい核酸は、表のいずれかに言及される遺伝子のいずれかからの配列を含む。典型的に、好ましい核酸は、表５に言及される特異的なプローブ配列を含むか、またはそのような配列の断片および／または相同体を含む。典型的に、好ましい核酸は、表６に言及される特異的なプローブ配列を含み得るか、またはそのような配列の断片および／または相同体を含み得る。
好ましくは、核酸はＤＮＡである。特異的な配列が提供される場合、本発明が、特定の態様で必要とされるように相補的配列を使用し得ることが理解される。好ましくは、核酸はＤＮＡである。特異的な配列が提供される場合、本発明が、特定の態様で必要とされるように相補的配列を使用し得ることが理解される。
表５に示されるプライマーはまた、本明細書に記載されるように本発明において使用され得る。一態様では、表５に示される配列、または表５に示される任意の配列の断片および／または相同体のいずれかを含むプライマーが使用される。表６に示されるプライマーはまた、本明細書に言及されるように本発明において使用され得る。一態様では、表６に示される配列、または表６に示される任意の配列の断片および／または相同体のいずれかを含むプライマーが使用される。表８に示されるプライマーはまた、本明細書に記載されるように本発明において使用され得る。一態様では、表８に示される配列、または表８に示される任意の配列の断片および／または相同体のいずれかを含むプライマーが使用される。
核酸の第２のセット－「インデックス」配列
核酸配列の第２のセットは、インデックス配列のセットであるという機能を有し、本質的に、サブグループの特異的配列を同定するのに適した核酸配列のセットである。それらは「バックグラウンド」染色体相互作用を表すことができ、何らかの方法で選択され得るか、または選択され得ない。それらは概して、考えられるすべての染色体相互作用のサブセットである。
核酸配列の第２のセットは、インデックス配列のセットであるという機能を有し、本質的に、サブグループの特異的配列を同定するのに適した核酸配列のセットである。それらは「バックグラウンド」染色体相互作用を表すことができ、何らかの方法で選択され得るか、または選択され得ない。それらは概して、考えられるすべての染色体相互作用のサブセットである。
核酸の第２のセットは、任意の適切なプロセスによって導き出され得る。それらは、計算によって導き出すことができるか、または個体の染色体相互作用に基づき得る。それらは典型的に、核酸の第１のセットよりも大きな集団群を表す。１つの特定の態様では、核酸の第２のセットは、特異的なセットの遺伝子における考えられるすべてのエピジェネティックな染色体相互作用を表す。別の特定の態様では、核酸の第２のセットは、本明細書に記載される集団に存在する考えられるすべてのエピジェネティックな染色体相互作用の大部分を表す。１つの特定の態様では、核酸の第２のセットは、少なくとも２０、５０、１００または５００の遺伝子、例えば２０～１００または５０～５００の遺伝子におけるエピジェネティックな染色体相互作用の少なくとも５０％または少なくとも８０％を表す。
核酸の第２のセットは、典型的に、集団における表現型を変更、調節、または何らかの方法で媒介する、少なくとも１００の考えられるエピジェネティックな染色体相互作用を表す。核酸の第２のセットは、種における病状（典型的に診断または予後に関連する）に影響を与える染色体相互作用を表し得る。核酸の第２のセットは、典型的に、予後のサブグループに関連するおよび関連しないという両方のエピジェネティックな相互作用を表す配列を含む。
１つの特定の態様では、核酸の第２のセットは、少なくとも部分的に集団における自然起源の配列に由来し、典型的に、インシリコのプロセスによって得られる。上記核酸は、自然起源の核酸に存在する核酸の対応する部分と比較して、単一または複数の突然変異をさらに含み得る。突然変異には、１つまたは複数のヌクレオチド塩基対の欠失、置換、および／または付加が含まれる。１つの特定の態様では、核酸の第２のセットは、自然起源の種に存在する核酸の対応する部分に対して少なくとも７０％の配列同一性を有する相同体および／またはオルソログを表す配列を含み得る。別の特定の態様では、自然起源の種に存在する核酸の対応する部分に対する少なくとも８０％の配列同一性または少なくとも９０％の配列同一性が提供される。
核酸の第２のセットの特性
１つの特定の態様では、核酸の第２のセットには少なくとも１００の異なる核酸配列、好ましくは少なくとも１０００、２０００または５０００の異なる核酸配列があり、最大で１００，０００、１，０００，０００または１０，０００，０００の異なる核酸配列がある。典型的な数は、１，０００～１００，０００の異なる核酸配列など、１００～１，０００，０００である。これらのすべてまたは少なくとも９０％または少なくとも５０％は異なる染色体相互作用に対応する。
１つの特定の態様では、核酸の第２のセットには少なくとも１００の異なる核酸配列、好ましくは少なくとも１０００、２０００または５０００の異なる核酸配列があり、最大で１００，０００、１，０００，０００または１０，０００，０００の異なる核酸配列がある。典型的な数は、１，０００～１００，０００の異なる核酸配列など、１００～１，０００，０００である。これらのすべてまたは少なくとも９０％または少なくとも５０％は異なる染色体相互作用に対応する。
１つの特定の態様では、核酸の第２のセットは、少なくとも２０の異なる遺伝子座または遺伝子、好ましくは少なくとも４０の異なる遺伝子座または遺伝子、より好ましくは、１００～１０，０００の異なる遺伝子座または遺伝子など、少なくとも１００、少なくとも５００、少なくとも１０００または少なくとも５０００の異なる遺伝子座または遺伝子における染色体相互作用を表す。第２のセットの核酸の長さは、サブグループに特異的な染色体相互作用の同定を可能にするために、ワトソン・クリック塩基対に従って第１のセットの核酸に特異的にハイブリダイズするのに適している。典型的には、核酸の第２のセットは、染色体相互作用で一緒になる２つの染色体領域に配列で対応する２つの部分を含む。核酸の第２のセットは、典型的に、少なくとも１０塩基（ヌクレオチド）長、好ましくは２０塩基長、好ましくはまた３０塩基長である核酸配列を含む。別の態様では、核酸配列は、長さにおいて最大で５００塩基対、好ましくは最大で１００塩基対、好ましくはまた最大で５０塩基対であり得る。好ましい態様では、核酸の第２のセットは、１７塩基対～２５塩基対の間の核酸配列を含む。一態様では、核酸配列の第２のセットの少なくとも１００％、８０％または５０％が、上記のような長さを有する。好ましくは、異なる核酸は、重複する配列を有さず、例えば、核酸の少なくとも１００％、９０％、８０％、または５０％は、少なくとも５つの連続するヌクレオチドにわたって同じ配列を有さない。
核酸の第２のセットが「インデックス」として作用することを考慮すると、第２の核酸の同一のセットが、種々の特性に対するサブグループを表す第１の核酸の種々のセットと共に使用され得る、すなわち、核酸の第２のセットは、種々の特性に関連する染色体相互作用を同定するために使用することができる核酸の「普遍的」集合を表し得る。
核酸の第１のセット
核酸の第１のセットは、典型的に、予後に関連するサブグループからのものである。第１の核酸は、本明細書に言及される核酸の第２のセットの特徴および特性のいずれかを有し得る。核酸の第１のセットは、通常、本明細書に記載される処置および処理、特にＥｐｉＳｗｉｔｃｈ（商標）の架橋および切断工程を受けた個体からのサンプルに由来する。典型的に、核酸の第１のセットは、個体から採取されたサンプルに存在する染色体相互作用のすべてまたは少なくとも８０％または５０％を表す。
核酸の第１のセットは、典型的に、予後に関連するサブグループからのものである。第１の核酸は、本明細書に言及される核酸の第２のセットの特徴および特性のいずれかを有し得る。核酸の第１のセットは、通常、本明細書に記載される処置および処理、特にＥｐｉＳｗｉｔｃｈ（商標）の架橋および切断工程を受けた個体からのサンプルに由来する。典型的に、核酸の第１のセットは、個体から採取されたサンプルに存在する染色体相互作用のすべてまたは少なくとも８０％または５０％を表す。
典型的に、核酸の第１のセットは、核酸の第２のセットによって表される染色体相互作用と比較して、核酸の第２のセットによって表される遺伝子座または遺伝子にわたる染色体相互作用のより小さな集団を表す、すなわち、核酸の第２のセットは、定義されたセットの遺伝子座または遺伝子における相互作用のバックグラウンドまたはインデックスのセットを表している。
核酸のライブラリ
本明細書に言及される核酸集団のタイプはいずれも、「第１」または「第２」の核酸などの、そのタイプの少なくとも２００、少なくとも５００、少なくとも１０００、少なくとも５０００、または少なくとも１００００の異なる核酸を含むライブラリの形態で存在し得る。このようなライブラリは、アレイに結合されている形態であり得る。ライブラリは、表５または６に示されるプローブまたはプライマー対のいくつかまたはすべてを含み得る。ライブラリは、本明細書に開示される表のいずれかからのプローブ配列のすべてを含み得る。
本明細書に言及される核酸集団のタイプはいずれも、「第１」または「第２」の核酸などの、そのタイプの少なくとも２００、少なくとも５００、少なくとも１０００、少なくとも５０００、または少なくとも１００００の異なる核酸を含むライブラリの形態で存在し得る。このようなライブラリは、アレイに結合されている形態であり得る。ライブラリは、表５または６に示されるプローブまたはプライマー対のいくつかまたはすべてを含み得る。ライブラリは、本明細書に開示される表のいずれかからのプローブ配列のすべてを含み得る。
ハイブリダイゼーション
本発明は、核酸の第１のセットおよび核酸の第２のセットからの完全にまたは部分的に相補的な核酸配列がハイブリダイズすることを可能にするための手段を必要とする。一態様では、核酸の第１のセットのすべてが、単一のアッセイにおいて、すなわち単一のハイブリダイゼーション工程において、核酸の第２のセットのすべてと接触させられる。しかし、任意の適切なアッセイを使用することができる。
本発明は、核酸の第１のセットおよび核酸の第２のセットからの完全にまたは部分的に相補的な核酸配列がハイブリダイズすることを可能にするための手段を必要とする。一態様では、核酸の第１のセットのすべてが、単一のアッセイにおいて、すなわち単一のハイブリダイゼーション工程において、核酸の第２のセットのすべてと接触させられる。しかし、任意の適切なアッセイを使用することができる。
標識核酸およびハイブリダイゼーションのパターン
本明細書に言及される核酸は、好ましくは、成功したハイブリダイゼーションの検出を支援するフルオロフォア（蛍光分子）または放射性標識などの独立した標識を使用して標識化され得る。特定の標識はＵＶ光の下で検出することができる。ハイブリダイゼーションのパターンは、例えば本明細書に記載されるアレイ上で、２つのサブグループ間のエピジェネティックな染色体相互作用の差を表し、したがって、エピジェネティックな染色体相互作用を比較するプロセスおよびどのエピジェネティックな染色体相互作用が本発明の集団におけるサブグループに特異的であるかの判定を提供する。
本明細書に言及される核酸は、好ましくは、成功したハイブリダイゼーションの検出を支援するフルオロフォア（蛍光分子）または放射性標識などの独立した標識を使用して標識化され得る。特定の標識はＵＶ光の下で検出することができる。ハイブリダイゼーションのパターンは、例えば本明細書に記載されるアレイ上で、２つのサブグループ間のエピジェネティックな染色体相互作用の差を表し、したがって、エピジェネティックな染色体相互作用を比較するプロセスおよびどのエピジェネティックな染色体相互作用が本発明の集団におけるサブグループに特異的であるかの判定を提供する。
「ハイブリダイゼーションのパターン」という用語は、核酸の第１のセットと核酸の第２のセットとの間のハイブリダイゼーションの有無、すなわち、第１のセットからのどの特異的な核酸が第２のセットからのどの特異的な核酸とハイブリダイズするかを広くカバーし、そのため、任意の特定のアッセイもしくは技術、または「パターン」を検出することができる表面もしくはアレイを有する必要性に限定されない。
特定の特徴を有するサブグループの選択
本発明は、個体の予後に関連する特徴の有無を判定するために、染色体相互作用、典型的には５～２０または５～５００のそのような相互作用、好ましくは２０～３００または５０～１００の相互作用の有無を検出する工程を含むプロセスを提供する。好ましくは、染色体相互作用は、本明細書に言及される遺伝子のいずれかにおけるものである。一態様では、分類されている染色体相互作用は、表５の核酸によって表されるものである。別の態様では、染色体相互作用は表６に表されるものである。さらなる態様では、分類されている染色体相互作用は、表８の核酸によって表されるものである。表における「検出されたループ」というタイトルの列は、どのサブグループが各プローブによって検出されるかを示している。検出は、そのサブグループ内の染色体相互作用の有無の検出であり得、これは「１」と「－１」で示すものである。
本発明は、個体の予後に関連する特徴の有無を判定するために、染色体相互作用、典型的には５～２０または５～５００のそのような相互作用、好ましくは２０～３００または５０～１００の相互作用の有無を検出する工程を含むプロセスを提供する。好ましくは、染色体相互作用は、本明細書に言及される遺伝子のいずれかにおけるものである。一態様では、分類されている染色体相互作用は、表５の核酸によって表されるものである。別の態様では、染色体相互作用は表６に表されるものである。さらなる態様では、分類されている染色体相互作用は、表８の核酸によって表されるものである。表における「検出されたループ」というタイトルの列は、どのサブグループが各プローブによって検出されるかを示している。検出は、そのサブグループ内の染色体相互作用の有無の検出であり得、これは「１」と「－１」で示すものである。
試験される個体
試験される個体が由来する種の例は、本明細書に言及されている。加えて、本発明のプロセスで試験される個体は、何らかの方法で選択され得る。個体は、本明細書に言及される任意の疾病に感受性であり得、および／または言及される任意の治療を必要としている可能性がある。個体は、本明細書に言及される任意の治療を受けている可能性がある。特に、個体は、前立腺がんまたはＤＬＢＣＬを患っている、または患っている疑いがある。個体は、リンパ腫を患っているか、患っている疑いがある。
試験される個体が由来する種の例は、本明細書に言及されている。加えて、本発明のプロセスで試験される個体は、何らかの方法で選択され得る。個体は、本明細書に言及される任意の疾病に感受性であり得、および／または言及される任意の治療を必要としている可能性がある。個体は、本明細書に言及される任意の治療を受けている可能性がある。特に、個体は、前立腺がんまたはＤＬＢＣＬを患っている、または患っている疑いがある。個体は、リンパ腫を患っているか、患っている疑いがある。
前立腺がんに対する好ましい遺伝子領域、遺伝子座、遺伝子および染色体相互作用
本発明のすべての態様に関して、好ましい遺伝子領域、遺伝子座、遺伝子、および染色体相互作用は、表、例えば表６に言及されている。典型的には、本発明のプロセスでは、染色体相互作用は、表６にリストされた関連遺伝子の少なくとも１、２、３、４または５から検出される。好ましくは、表６のプローブ配列によって表される関連する特異的な染色体相互作用の少なくとも１、２、３、４または５の存在または不在が検出される。染色体相互作用は、本明細書に言及される遺伝子のいずれかの上流または下流、例えばコード配列から、例えば５０ｋｂ上流または２０ｋｂ下流であり得る。
本発明のすべての態様に関して、好ましい遺伝子領域、遺伝子座、遺伝子、および染色体相互作用は、表、例えば表６に言及されている。典型的には、本発明のプロセスでは、染色体相互作用は、表６にリストされた関連遺伝子の少なくとも１、２、３、４または５から検出される。好ましくは、表６のプローブ配列によって表される関連する特異的な染色体相互作用の少なくとも１、２、３、４または５の存在または不在が検出される。染色体相互作用は、本明細書に言及される遺伝子のいずれかの上流または下流、例えばコード配列から、例えば５０ｋｂ上流または２０ｋｂ下流であり得る。
本発明のすべての態様に関して、好ましい遺伝子領域、遺伝子座、遺伝子、および染色体相互作用が表２５に言及されている。典型的には、本発明のプロセスでは、染色体相互作用は、表２５にリストされた関連遺伝子の少なくとも２、４、８、１０、１４またはすべてから検出される。好ましくは、表２５に示される関連する特異的な染色体相互作用の少なくとも２、４、８、１０、１４またはすべての存在または不在が検出される。染色体相互作用は、本明細書に言及される遺伝子のいずれかの上流または下流、例えばコード配列から、例えば５０ｋｂ上流または２０ｋｂ下流であり得る。
一実施形態では、本明細書に開示され、以下の遺伝子の組み合わせによって表される（同定される）特異的なマーカーの組み合わせが分類される：ＥＴＳ１、ＭＡＰ３Ｋ１４、ＳＬＣ２２Ａ３およびＣＡＳＰ２。これは診断を判定するためであってもよい。好ましくは、これらのマーカーの少なくとも２つまたは３つが分類される。
別の実施形態では、以下の遺伝子の組み合わせによって表される（同定される）本明細書に開示される特異的なマーカーの組み合わせが分類される：ＢＭＰ６、ＥＲＧ、ＭＳＲ１、ＭＵＣ１、ＡＣＡＴ１およびＤＡＰＫ１。これは予後を判定するためであってもよい（ネステッドＰＣＲマーカーによる、高リスクカテゴリ３対低リスクカテゴリ１）。好ましくは、これらのマーカーの少なくとも２つまたは３つが分類される。
さらなる実施形態では、以下の遺伝子の組み合わせによって表される（同定される）本明細書に開示される特異的なマーカーの組み合わせが分類される：ＨＳＤ３Ｂ２、ＶＥＧＦＣ、ＡＰＡＦ１、ＭＵＣ１、ＡＣＡＴ１およびＤＡＰＫ１。これは予後を判断するためであってもよい（高リスクカテゴリ３対中リスクカテゴリ２）。好ましくは、これらのマーカーの少なくとも２つまたは３つが分類される。
ＤＬＢＣＬに対する好ましい遺伝子領域、遺伝子座、遺伝子、および染色体相互作用
典型的には、少なくとも１０、２０、３０、５０または８０の染色体相互作用は、本明細書の表、または本明細書に開示された表の一部に開示された遺伝子または領域のいずれかから分類される。好ましくは、少なくとも１０、２０、３０、５０または８０の染色体相互作用は、表５に開示された遺伝子または領域のいずれかから分類される。
典型的には、少なくとも１０、２０、３０、５０または８０の染色体相互作用は、本明細書の表、または本明細書に開示された表の一部に開示された遺伝子または領域のいずれかから分類される。好ましくは、少なくとも１０、２０、３０、５０または８０の染色体相互作用は、表５に開示された遺伝子または領域のいずれかから分類される。
好ましくは、表７のマーカーのうちの少なくとも２、３、５、８が分類される。
好ましくは、表５のプローブ配列によって表される少なくとも１０、２０、３０、５０または８０の染色体相互作用の存在または不在が検出される。染色体相互作用は、本明細書に言及される遺伝子のいずれかの上流または下流、例えばコード配列から、例えば５０ｋｂ上流または２０ｋｂ下流であり得る。
好ましくは、表５に示される第１の１０のマーカーの少なくとも１、２、５、８またはすべてが分類される。一実施形態では、表５からの少なくとも１、２、３または６のマーカーが分類され、その各々は、ＳＴＡＴ３、ＴＮＦＲＳＦ１３Ｂ、ＡＮＸＡ１１、ＭＡＰ３Ｋ７、ＭＥＦ２ＢおよびＩＦＮＡＲ１から選択される異なる遺伝子に対応している。
リンパ腫に対する好ましい遺伝子領域、遺伝子座、遺伝子および染色体相互作用
典型的には、少なくとも１０、２０、３０または５０の染色体相互作用は、本明細書の表、または本明細書に開示された表の一部に開示された遺伝子または領域のいずれかから分類される。好ましくは、少なくとも１０、２０、３０または５０の染色体相互作用は、表８に開示された遺伝子または領域のいずれかから分類される。
典型的には、少なくとも１０、２０、３０または５０の染色体相互作用は、本明細書の表、または本明細書に開示された表の一部に開示された遺伝子または領域のいずれかから分類される。好ましくは、少なくとも１０、２０、３０または５０の染色体相互作用は、表８に開示された遺伝子または領域のいずれかから分類される。
好ましくは、表９のマーカーのうちの少なくとも５、１０または１５が分類される。
染色体相互作用は、本明細書に言及される遺伝子のいずれかの上流または下流、例えばコード配列から、例えば５０ｋｂ上流または２０ｋｂ下流であり得る。
一実施形態では、図６に示される第１の１１のマーカーのうちの少なくとも１つが分類される。別の実施形態では、表８からの少なくとも１、２、３または６のマーカーが分類され、その各々は、以下から選択される異なる遺伝子に対応している：ＳＴＡＴ３、ＴＮＦＲＳＦ１３Ｂ、ＡＮＸＡ１１、ＭＡＰ３Ｋ７、ＭＥＦ２ＢおよびＩＦＮＡＲ１。
染色体相互作用の種類
一態様では、遺伝子座（染色体相互作用が検出される遺伝子および／または場所を含む）は、ＣＴＣＦ結合部位を含み得る。これは、転写抑制因子ＣＴＣＦに結合することができる任意の配列である。その配列は、遺伝子座に１、２、または３のコピーで存在し得る配列ＣＣＣＴＣからなり得るか、またはそれを含み得る。ＣＴＣＦ結合部位配列は、配列ＣＣＧＣＧＮＧＧＮＧＧＣＡＧ（ＩＵＰＡＣ表記）を含み得る。ＣＴＣＦ結合部位は、染色体相互作用の少なくとも１００、５００、１０００または４０００塩基内、または表５または６に示される染色体領域のいずれか内にあり得る。ＣＴＣＦ結合部位は、染色体相互作用の少なくとも１００、５００、１０００または４０００塩基内、または表５または６に示される染色体領域のいずれか内にあり得る。
一態様では、遺伝子座（染色体相互作用が検出される遺伝子および／または場所を含む）は、ＣＴＣＦ結合部位を含み得る。これは、転写抑制因子ＣＴＣＦに結合することができる任意の配列である。その配列は、遺伝子座に１、２、または３のコピーで存在し得る配列ＣＣＣＴＣからなり得るか、またはそれを含み得る。ＣＴＣＦ結合部位配列は、配列ＣＣＧＣＧＮＧＧＮＧＧＣＡＧ（ＩＵＰＡＣ表記）を含み得る。ＣＴＣＦ結合部位は、染色体相互作用の少なくとも１００、５００、１０００または４０００塩基内、または表５または６に示される染色体領域のいずれか内にあり得る。ＣＴＣＦ結合部位は、染色体相互作用の少なくとも１００、５００、１０００または４０００塩基内、または表５または６に示される染色体領域のいずれか内にあり得る。
一態様では、検出される染色体相互作用は、表５または６に示される遺伝子領域のいずれかに存在する。ライゲートされた核酸がそのプロセスで検出された場合、表５または６のプローブ配列のいずれかに示される配列が検出され得る。
したがって、典型的に、プローブの両方の領域からの（すなわち、染色体相互作用の両方の部位からの）配列が検出され得る。好ましい態様では、任意の表に示されるプローブと同じまたは相補的な配列を含むか、またはそれからなるプローブがそのプロセスで使用される。いくつかの態様では、表に示されるプローブ配列のいずれかに相同である配列を含むプローブが使用される。
本明細書で提供される表
表５および６は、プローブ（ＥｐｉＳｗｉｔｃｈ（商標）マーカー）データおよび予後に関連する染色体相互作用を表す遺伝子データを示している。プローブ配列は、染色体相互作用で一緒になった遺伝子領域の両方の部位から生成されたライゲートされた産物を検出するために使用することができる配列を示す、すなわち、プローブは、ライゲートされた産物における配列に相補的な配列を含む。第１の２セットの開始－終了位置はプローブ位置を示し、第２の２セットの開始－終了位置は関連する４ｋｂ領域を示す。以下の情報がプローブデータの表に提供されている：
－ ＨｙｐｅｒＧ＿Ｓｔａｔｓ：超幾何学的エンリッチメントのパラメータに基づいて遺伝子座内でその数の有意なＥｐｉＳｗｉｔｃｈ（商標）マーカーを見つける確率に対するｐ値
－ 総プローブ数：遺伝子座で試験されたＥｐｉＳｗｉｔｃｈ（商標）コンフォメーションの総数
－ 有意なプローブ数：遺伝子座で統計的に有意であることがわかったＥｐｉＳｗｉｔｃｈ（商標）コンフォメーションの数
－ ＦＤＲ ＨｙｐｅｒＧ：マルチ試験（Ｆｉｍｍｕｎｏｒｅｓｐｏｓｉｖｅｎｅｓｓｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ Ｒａｔｅ）で修正された超幾何学的ｐ値
－ パーセント有意性：遺伝子座で試験されたマーカーの数に対する有意なＥｐｉＳｗｉｔｃｈ（商標）マーカーのパーセンテージ
－ ｌｏｇＦＣ：エピジェネティック比（ＦＣ）の２を底とする対数
－ ＡｖｅＥｘｐｒ：すべてのアレイおよびチャネルにわたるプローブに対する平均ｌｏｇ２式
－ Ｔ：モデレートされたｔ統計
－ ｐ値：生のｐ値
－ ａｄｊ．ｐ値：調整されたｐ値またはｑ値
－ Ｂ－Ｂ統計（ロッドまたはＢ）は、その遺伝子が差次的に発現される対数オッズである。
－ ＦＣ－非ログ倍率変化
－ ＦＣ＿１－ゼロを中心とした非ログ倍率変化
－ ＬＳ－バイナリ値、これはＦＣ＿１値に関連する。－１．１未満のＦＣ＿１値、これは－１に設定され、ＦＣ＿１値が１．１を超える場合は、これは１に設定される。これらの値の間の値は０である。
表５および６は、プローブ（ＥｐｉＳｗｉｔｃｈ（商標）マーカー）データおよび予後に関連する染色体相互作用を表す遺伝子データを示している。プローブ配列は、染色体相互作用で一緒になった遺伝子領域の両方の部位から生成されたライゲートされた産物を検出するために使用することができる配列を示す、すなわち、プローブは、ライゲートされた産物における配列に相補的な配列を含む。第１の２セットの開始－終了位置はプローブ位置を示し、第２の２セットの開始－終了位置は関連する４ｋｂ領域を示す。以下の情報がプローブデータの表に提供されている：
－ ＨｙｐｅｒＧ＿Ｓｔａｔｓ：超幾何学的エンリッチメントのパラメータに基づいて遺伝子座内でその数の有意なＥｐｉＳｗｉｔｃｈ（商標）マーカーを見つける確率に対するｐ値
－ 総プローブ数：遺伝子座で試験されたＥｐｉＳｗｉｔｃｈ（商標）コンフォメーションの総数
－ 有意なプローブ数：遺伝子座で統計的に有意であることがわかったＥｐｉＳｗｉｔｃｈ（商標）コンフォメーションの数
－ ＦＤＲ ＨｙｐｅｒＧ：マルチ試験（Ｆｉｍｍｕｎｏｒｅｓｐｏｓｉｖｅｎｅｓｓｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ Ｒａｔｅ）で修正された超幾何学的ｐ値
－ パーセント有意性：遺伝子座で試験されたマーカーの数に対する有意なＥｐｉＳｗｉｔｃｈ（商標）マーカーのパーセンテージ
－ ｌｏｇＦＣ：エピジェネティック比（ＦＣ）の２を底とする対数
－ ＡｖｅＥｘｐｒ：すべてのアレイおよびチャネルにわたるプローブに対する平均ｌｏｇ２式
－ Ｔ：モデレートされたｔ統計
－ ｐ値：生のｐ値
－ ａｄｊ．ｐ値：調整されたｐ値またはｑ値
－ Ｂ－Ｂ統計（ロッドまたはＢ）は、その遺伝子が差次的に発現される対数オッズである。
－ ＦＣ－非ログ倍率変化
－ ＦＣ＿１－ゼロを中心とした非ログ倍率変化
－ ＬＳ－バイナリ値、これはＦＣ＿１値に関連する。－１．１未満のＦＣ＿１値、これは－１に設定され、ＦＣ＿１値が１．１を超える場合は、これは１に設定される。これらの値の間の値は０である。
表５および６は、関連する染色体相互作用が発生することがわかっている遺伝子を示している。遺伝子座の表におけるｐ値はＨｙｐｅｒＧ Ｓｔａｔｓと同じである（超幾何学的エンリッチメントのパラメータに基づいて遺伝子座内でその数の有意なＥｐｉＳｗｉｔｃｈ（商標）を見つける確率に対するｐ値）。ＬＳ列は、その特定のサブグループとの関連する相互作用の有無（予後状態）を示している。
表５に関して、ＤＬＢＣＬは１で示される予後マーカーを指し、健常（ｈｅａｌｔｈｙ）は－１で示される健常対照を指す。
プローブは、Ｔａｑ１部位から３０ｂｐ離れるように設計されている。ＰＣＲの場合、ＰＣＲプライマーは典型的に、ライゲートされた産物を検出するように設計されているが、Ｔａｑ１部位からの位置は様々である。
プローブ位置：
Ｓｔａｒｔ１－フラグメント１上のＴａｑｌ部位の上流の３０の塩基
Ｅｎｄ１－フラグメント１上のＴａｑｌ制限部位
Ｓｔａｒｔ２－フラグメント２上のＴａｑｌ制限部位
Ｅｎｄ２－フラグメント２上のＴａｑｌ部位の下流の３０塩基
Ｓｔａｒｔ１－フラグメント１上のＴａｑｌ部位の上流の３０の塩基
Ｅｎｄ１－フラグメント１上のＴａｑｌ制限部位
Ｓｔａｒｔ２－フラグメント２上のＴａｑｌ制限部位
Ｅｎｄ２－フラグメント２上のＴａｑｌ部位の下流の３０塩基
４ｋｂ配列位置：
Ｓｔａｒｔ１－フラグメント１上のＴａｑｌ部位の上流の４０００塩基
Ｅｎｄ１－フラグメント１上のＴａｑｌ制限部位
Ｓｔａｒｔ２－フラグメント２上のＴａｑｌ制限部位
Ｅｎｄ２－フラグメント２上のＴａｑｌ部位の下流の４０００塩基
Ｓｔａｒｔ１－フラグメント１上のＴａｑｌ部位の上流の４０００塩基
Ｅｎｄ１－フラグメント１上のＴａｑｌ制限部位
Ｓｔａｒｔ２－フラグメント２上のＴａｑｌ制限部位
Ｅｎｄ２－フラグメント２上のＴａｑｌ部位の下流の４０００塩基
ラッソまたは弾性ネット正則化全体を適合させる手順に関連するＧＬＭＮＥＴ値（ラムダを０．５（弾性ネット）に設定）。
本明細書の表では、前立腺がんの侵攻性のサブグループは、以下の説明を伴うクラス３の患者を指す：
－ ＰＳＡレベルが２０ｎｇ／ｍｌを超える、
－ グリーソンスコアが８から１０の間である、および
－ ＴステージがＴ２ｃ、Ｔ３またはＴ４である。
－ ＰＳＡレベルが２０ｎｇ／ｍｌを超える、
－ グリーソンスコアが８から１０の間である、および
－ ＴステージがＴ２ｃ、Ｔ３またはＴ４である。
本明細書の表では、前立腺がんの緩慢性のサブグループは、以下の説明を伴うクラス１の患者を指す：
－ ＰＳＡレベルが１ｍｌあたり１０ｎｇ未満である、
－ グリーソンスコアが６以下である、および
－ ＴステージがＴ１からＴ２ａの間である。
－ ＰＳＡレベルが１ｍｌあたり１０ｎｇ未満である、
－ グリーソンスコアが６以下である、および
－ ＴステージがＴ１からＴ２ａの間である。
表７は、ＤＬＢＣＬに対する好ましいマーカーを示している。表８および９は、リンパ腫に対する好ましいマーカーを示している。
表５～７は、ヒトの分類に好ましい。表８および９は、イヌ、例えば犬の分類に好ましい。
マーカーおよびマーカーのパネルを同定するために採用されるアプローチ
本明細書に記載される本発明は、表現型に密接にリンクした、染色体コンフォメーションプロファイルおよびそれ自体の調節モダリティとしての３Ｄアーキテクチャに関する。バイオマーカーの発見は、表現型の違いを表す臨床サンプルの代表的なコホートでのパターン認識とスクリーニングによるアノテーションに基づいていた。コード部分および非コード部分にわたって、および、例えば、オープンリーディングフレーム内（イントロン）またはオープンリーディングフレーム外の非コード部位に係留する、統計的に播種する一貫した条件付きの播種する染色体コンフォメーションの同定のための既知の遺伝子の非コード５’’および３’’の大きな揺れにわたって、ゲノムの有意な部分をアノテートし、スクリーニングした。
本明細書に記載される本発明は、表現型に密接にリンクした、染色体コンフォメーションプロファイルおよびそれ自体の調節モダリティとしての３Ｄアーキテクチャに関する。バイオマーカーの発見は、表現型の違いを表す臨床サンプルの代表的なコホートでのパターン認識とスクリーニングによるアノテーションに基づいていた。コード部分および非コード部分にわたって、および、例えば、オープンリーディングフレーム内（イントロン）またはオープンリーディングフレーム外の非コード部位に係留する、統計的に播種する一貫した条件付きの播種する染色体コンフォメーションの同定のための既知の遺伝子の非コード５’’および３’’の大きな揺れにわたって、ゲノムの有意な部分をアノテートし、スクリーニングした。
最良のマーカーの選択の際には、マーカーリードに対する統計データおよびｐ値に主導される。特定の遺伝子への参照は、位置参照を容易にするために使用され、最も近い遺伝子は通常、参照に使用される。遺伝子からのシス位置および関連する近傍の染色体コンフォメーションが、その特定の遺伝子の発現への調節の特異的な要素に寄与し得る可能性を排除することは不可能である。マーカーの選択または検証の時点で、染色体コンフォメーションの名称で位置座標として参照される遺伝子に発現パラメータは必要とされない。シグネチャ内の、選択され、検証された染色体コンフォメーションは、参照で使用される遺伝子の発現プロファイルに関係なく、それ自体で層別化エンティティを播種している。アンカー部位でのＳＮＰ、遺伝子転写プロファイルの変化、Ｈ３Ｋ２７ａｃのレベルでの変化など、関連する規制モダリティについてさらなる研究が行われてもよい。
臨床表現型の違いとその層別化の問題を、表現型に対する基本的な生物学とエピジェネティクスの制御に基づいて、例えば規制のネットワークのフレームワークから取り上げる。したがって、層別化を支援するために、ネットワークの変化をキャプチャすることができ、これは、例えば、最小限のノイズで試験コホートを層別化するための最適数のマーカーの評価を含むマーカー減少のための機械学習アルゴリズムに従うことによって、いくつかのバイオマーカーのシグネチャを介して行われることが好ましい。これは通常、ケースバイケースで３～１７のマーカーで終了する。パネルに対するマーカーの選択は、交差検証の統計的パフォーマンスによって行われ得る（例えば、参照名に使用される隣接遺伝子の機能的関連性によってではない）。
マーカーのパネル（隣接遺伝子の名称付き）は、ゲノムの有意な部分にわたる１４，０００～６０，０００のアノテートされたＥｐｉＳｗｉｔｃｈ部位にわたって統計的播種力を分析する偏りのない方法で、ゲノムの有意な部分にわたるスクリーニングからのクラスタ化された選択の産物である。これは、層別化の問題に対する既知の機能的価値のある遺伝子上の染色体コンフォメーションの調整されたキャプチャとして認識されるべきではない。染色体相互作用の部位の総数は１２０万であるため、組み合わせの潜在的な数は１２０万の１２０万乗になる。それにもかかわらず、追従したアプローチは、関連する染色体相互作用の同定を可能にする。
この用途によって提供される特異的なマーカーは、疾病に統計的に（有意に）関連付けられて、選択されている。これは、関連する表のｐ値が実証するものである。各マーカーは、関連する疾病で現れるネットワークの調節解除の一部としての生物学的エピジェネティックな事象を表すものと見られ得る。実際には、これらのマーカーが、対照と比較して、患者の群に普及していることを意味している。例として、平均で、個々のマーカーは典型的に、試験される患者の８０％および試験される対照の１０％に存在し得る。
すべてのマーカーの単純な追加が、調節解除のいくつかの間のネットワークの相互関係を表すわけではない。ここでは、標準の多変量バイオマーカー分析ＧＬＭＮＥＴ（Ｒパッケージ）が導入される。ＧＬＭＮＥＴパッケージは、マーカーのいくつかの間の相互依存性を同定する助けとなり、これは、疾患の表現型につながる調節解除を達成する上での共同の役割を反映している。ＧＬＭＮＥＴスコアが最も高いマーカーをモデル化して、その後、試験することで、患者コホートを正確に同定するマーカーの最小数だけでなく、対照群での低い有病率のバックグラウンドの統計学的ノイズが要因で、患者の対照群での最も少ない偽陽性をもたらす最小数の同定ももたらされる。典型的に、選択されたマーカーの群（組み合わせ）（３～１０など）は、検出の感度および特異度の両方の間で最適なバランスを提供し、これは、疾病に対して選択されたすべての統計的に有意なマーカーの個々の特性からの多変量解析に関連して生じる。
本明細書の表は、長距離相互作用部位間の接合部をオーバーラップするアレイ分析用のアレイプローブ（６０ｍｅｒ）の参照名、染色体番号、および並置される２つの染色体フラグメントの開始と終了を示している。表はまた、マーカーの各々に関する（２つの異なる蛍光色で標識された）対照サンプルに対する疾患の競合ハイブリダイゼーションにおける標準アレイの読み出し値を示している。標準の読み出し値として、各マーカープローブに示されている：
－ 平均発現シグナル
－ 対照と疾患サンプルに対する蛍光色検出の有意差に関するｔ検定
－ マーカー読み出しの有意性のｐ値
－ 調整ｐ値（大きなデータセット用のボンフェローニ補正を使用）、Ｂ－バックグラウンドシグナル、ＦＣ－対照サンプルにおける色検出のための倍率変化
－ＦＣ＿１－症例（疾患または疾患タイプ）サンプルにおける第２の色検出のための倍率変化、ＬＳ（ループステータス）－競合ハイブリダイゼーションにおける２色の閾値間の一般的な蛍光シグナル、－１は、シグナルが、ＣＧＨアレイのプローブに対して試験されたときに、対応する蛍光色の患者サンプルに一般的であることを意味している。
－ 当座の遺伝子座
－ 総プローブ数－アレイ上の異なる位置プローブがその遺伝子座にわたって試験された数
－ 有意なプローブ数－症例サンプルと対照サンプルを区別する上で有意であることが判明したものの数
－ 超幾何学的統計（Hypergeometric Stat）は、疾患検出のための有意なプローブによる遺伝子座のエンリッチメントの統計である
－ ＦＤＲ ＨｙｐｅｒＧは、ＦＤＲによって大規模なデータセットに対して調整されたものと同じ統計である（標準手順）
－ その遺伝子座で有意であることが判明したプローブのパーセンテージ
－ ｌｏｇＦＣは、そのプローブに対するアレイ読み出し値の倍率変化の対数である。有意なプローブの高度なエンリッチメントを有する遺伝子座に着目することで、例えばネットワークの調節解除の最良なカバレッジをマーカーに提供する疾患に関連付けられた複数の入力を有する規制ハブを表す上位のプローブの選択の助けとなる。
－ 平均発現シグナル
－ 対照と疾患サンプルに対する蛍光色検出の有意差に関するｔ検定
－ マーカー読み出しの有意性のｐ値
－ 調整ｐ値（大きなデータセット用のボンフェローニ補正を使用）、Ｂ－バックグラウンドシグナル、ＦＣ－対照サンプルにおける色検出のための倍率変化
－ＦＣ＿１－症例（疾患または疾患タイプ）サンプルにおける第２の色検出のための倍率変化、ＬＳ（ループステータス）－競合ハイブリダイゼーションにおける２色の閾値間の一般的な蛍光シグナル、－１は、シグナルが、ＣＧＨアレイのプローブに対して試験されたときに、対応する蛍光色の患者サンプルに一般的であることを意味している。
－ 当座の遺伝子座
－ 総プローブ数－アレイ上の異なる位置プローブがその遺伝子座にわたって試験された数
－ 有意なプローブ数－症例サンプルと対照サンプルを区別する上で有意であることが判明したものの数
－ 超幾何学的統計（Hypergeometric Stat）は、疾患検出のための有意なプローブによる遺伝子座のエンリッチメントの統計である
－ ＦＤＲ ＨｙｐｅｒＧは、ＦＤＲによって大規模なデータセットに対して調整されたものと同じ統計である（標準手順）
－ その遺伝子座で有意であることが判明したプローブのパーセンテージ
－ ｌｏｇＦＣは、そのプローブに対するアレイ読み出し値の倍率変化の対数である。有意なプローブの高度なエンリッチメントを有する遺伝子座に着目することで、例えばネットワークの調節解除の最良なカバレッジをマーカーに提供する疾患に関連付けられた複数の入力を有する規制ハブを表す上位のプローブの選択の助けとなる。
サンプル調製および染色体相互作用の検出のための好ましい態様
サンプルを調製する方法および染色体コンフォメーションを検出する方法が、本明細書に記載されている。これらの方法の最適化された（従来とは異なる）バージョンは、例えばこのセクションで説明されているように使用することができる。
サンプルを調製する方法および染色体コンフォメーションを検出する方法が、本明細書に記載されている。これらの方法の最適化された（従来とは異なる）バージョンは、例えばこのセクションで説明されているように使用することができる。
典型的に、サンプルは少なくとも２×１０５の細胞を含む。サンプルは最大５×１０５の細胞を含んでよい。一態様では、サンプルは２×１０５から５．５×１０５の細胞を含む。
染色体遺伝子座に存在するエピジェネティックな染色体相互作用の架橋が、本明細書に記載されている。これは細胞溶解が起こる前に実施され得る。細胞溶解は、４～６分間または約５分間など、３～７分間実施され得る。いくつかの態様では、細胞溶解は、少なくとも５分間および１０分間未満実施される。
制限酵素によるＤＮＡの消化が本明細書に記載されている。典型的に、ＤＮＡ制限は、約２０分など、約１０～３０分の期間、約６５℃など、約５５℃から約７０℃で実施される。
好ましくは、頻繁にカッター制限酵素が使用され、結果として４０００塩基対までの平均フラグメントサイズを有するライゲートされたＤＮＡのフラグメントがもたらされる。随意に、制限酵素により、結果として、ライゲートされたＤＮＡのフラグメントは、約２５６塩基対などの約２００～３００塩基対の平均フラグメントサイズを有する。一態様では、典型的なフラグメントサイズは、４００～２，０００または５００～１，０００塩基対など、２００塩基対～４，０００塩基対である。
ＥｐｉＳｗｉｔｃｈ法の一態様では、ＤＮＡ制限消化工程とＤＮＡライゲート工程との間でＤＮＡ沈殿工程は実施されない。
ＤＮＡライゲートは本明細書に記載されている。典型的に、ＤＮＡライゲートは、約１０分間など、５～３０分間実施される。
サンプル中のタンパク質は、例えばプロテイナーゼ、随意にプロテイナーゼＫを使用して、酵素的に消化され得る。タンパク質は、約３０分～１時間、例えば約４５分間酵素的に消化され得る。タンパク質の消化、例えばプロテイナーゼＫ消化後の一態様では、架橋反転またはフェノールＤＮＡ抽出工程はない。
一態様では、ＰＣＲ検出は、好ましくは、ライゲートされた核酸の存在／不在に対するバイナリ読み出し値を用いて、ライゲートされた核酸の単一のコピーを検出することができる。
図５は、染色体相互作用を検出する好ましい方法を示している。
本発明のプロセスおよび使用
本発明のプロセスは、様々な方法で説明することができる。これは、ライゲートされた核酸を作製する方法として説明することができ、当該方法は、（ｉ）染色体相互作用で一緒になった染色体領域をインビトロで架橋する工程、（ii）上記架橋されたＤＮＡを切断または制限消化切断にさらす工程、および（iii）上記架橋された切断したＤＮＡ末端をライゲートして、ライゲートされた核酸を形成する工程を含み、ライゲートされた核酸の検出は、遺伝子座での染色体状態を判定するために使用され得、好ましくは、
－ 遺伝子座は、表５に言及される遺伝子座、領域、または遺伝子のいずれかであり得る、および／または
－ 染色体相互作用は、本明細書に言及されるまたは表５に開示されるプローブのいずれかに対応する染色体相互作用のいずれかであり得る、および／または
－ ライゲートされた産物は、（ｉ）表５に開示されるプローブ配列のいずれかと同一または相同である配列または（ii）（ii）に相補的な配列を有するかまたは含み得る。
本発明のプロセスは、様々な方法で説明することができる。これは、ライゲートされた核酸を作製する方法として説明することができ、当該方法は、（ｉ）染色体相互作用で一緒になった染色体領域をインビトロで架橋する工程、（ii）上記架橋されたＤＮＡを切断または制限消化切断にさらす工程、および（iii）上記架橋された切断したＤＮＡ末端をライゲートして、ライゲートされた核酸を形成する工程を含み、ライゲートされた核酸の検出は、遺伝子座での染色体状態を判定するために使用され得、好ましくは、
－ 遺伝子座は、表５に言及される遺伝子座、領域、または遺伝子のいずれかであり得る、および／または
－ 染色体相互作用は、本明細書に言及されるまたは表５に開示されるプローブのいずれかに対応する染色体相互作用のいずれかであり得る、および／または
－ ライゲートされた産物は、（ｉ）表５に開示されるプローブ配列のいずれかと同一または相同である配列または（ii）（ii）に相補的な配列を有するかまたは含み得る。
本発明のプロセスは、集団内の異なるサブグループを表す染色体状態を検出するためのプロセスとして説明することができ、当該プロセスは、染色体相互作用がゲノムの定義されたエピジェネティックに活性な領域内に存在するか存在しないかを判定することを含み、好ましくは、
－ サブグループは予後の有無によって定義される、および／または
－ 染色体状態は、表５に言及される任意の遺伝子座、領域、または遺伝子であり得る、および／または
－ 染色体相互作用は、表５に言及されるものまたは表５に開示されるプローブのいずれかに対応するもののいずれかであり得る。
－ サブグループは予後の有無によって定義される、および／または
－ 染色体状態は、表５に言及される任意の遺伝子座、領域、または遺伝子であり得る、および／または
－ 染色体相互作用は、表５に言及されるものまたは表５に開示されるプローブのいずれかに対応するもののいずれかであり得る。
本発明のプロセスは、ライゲートされた核酸を作製する方法として説明することができ、当該方法は、（ｉ）染色体相互作用で一緒になった染色体領域をインビトロで架橋する工程、（ii）上記架橋されたＤＮＡを切断または制限消化切断にさらす工程、および（iii）上記架橋された切断したＤＮＡ末端をライゲートして、ライゲートされた核酸を形成する工程を含み、ライゲートされた核酸の検出は、遺伝子座での染色体状態を判定するために使用され得、好ましくは、
－ 遺伝子座は、表６に言及される遺伝子座、領域、または遺伝子のいずれかであり得る、および／または
－ 染色体相互作用は、本明細書に言及されるまたは表６に開示されるプローブのいずれかに対応する染色体相互作用のいずれかであり得る、および／または
－ ライゲートされた産物は、（ｉ）表６に開示されるプローブ配列のいずれかと同一または相同である配列または（ii）（ii）に相補的な配列を有するかまたは含み得る。
－ 遺伝子座は、表６に言及される遺伝子座、領域、または遺伝子のいずれかであり得る、および／または
－ 染色体相互作用は、本明細書に言及されるまたは表６に開示されるプローブのいずれかに対応する染色体相互作用のいずれかであり得る、および／または
－ ライゲートされた産物は、（ｉ）表６に開示されるプローブ配列のいずれかと同一または相同である配列または（ii）（ii）に相補的な配列を有するかまたは含み得る。
本発明のプロセスは、集団内の異なるサブグループを表す染色体状態を検出するためのプロセスとして説明することができ、当該プロセスは、染色体相互作用がゲノムの定義されたエピジェネティックに活性な領域内に存在するか存在しないかを判定することを含み、好ましくは、
－ サブグループは予後の有無によって定義される、および／または
－ 染色体状態は、表６に言及される任意の遺伝子座、領域、または遺伝子であり得る、および／または
－ 染色体相互作用は、表６に言及されるものまたは表６に開示されるプローブのいずれかに対応するもののいずれかであり得る。
－ サブグループは予後の有無によって定義される、および／または
－ 染色体状態は、表６に言及される任意の遺伝子座、領域、または遺伝子であり得る、および／または
－ 染色体相互作用は、表６に言及されるものまたは表６に開示されるプローブのいずれかに対応するもののいずれかであり得る。
本発明は、表５に言及される任意の遺伝子座、遺伝子または領域での染色体相互作用の検出を含む。本発明は、染色体相互作用を検出するための本明細書に言及される核酸およびプローブの使用、例えば、染色体相互作用を検出するための少なくとも１、５、１０、２０または５０のそのような核酸またはプローブの使用を含む。核酸またはプローブは、好ましくは、少なくとも１、５、１０、２０または５０の異なる遺伝子座または遺伝子における染色体相互作用を検出する。本発明は、表５にリストされたプライマーまたはプライマー対のいずれかを使用する、または本明細書に記載されるこれらのプライマーの変異体（プライマー配列を含むか、またはプライマー配列のフラグメントおよび／または相同体を含む配列）を使用する染色体相互作用の検出を含む。
本発明は、表６に言及される任意の遺伝子座、遺伝子または領域での染色体相互作用の検出を含む。本発明は、染色体相互作用を検出するための本明細書に言及される核酸およびプローブの使用を含む。本発明は、表６にリストされたプライマーまたはプライマー対のいずれかを使用する、または本明細書に記載されるこれらのプライマーの変異体（プライマー配列を含むか、またはプライマー配列のフラグメントおよび／または相同体を含む配列）を使用する染色体相互作用の検出を含む。
染色体相互作用が、定義された遺伝子、領域、または位置内で生じるかどうかを分析する場合、相互作用で一緒になった染色体の両方の部分が、定義された遺伝子、領域、または位置内にあるか、またはいくつかの態様では、染色体の１つの部分のみが、定義された遺伝子、領域、または位置内にある。
同様に、表８および９の染色体相互作用は、本発明のプロセスおよび方法において使用され得る。
新しい処置を特定するための本発明の方法の使用
染色体相互作用の知識は、疾病に対する新しい処置を特定するために使用することができる。本発明は、例えば、前立腺がんまたはＤＬＢＣＬの治療に関連する、新しい治療薬を特定または設計するために本明細書で定義された染色体相互作用の方法および使用を提供する。
染色体相互作用の知識は、疾病に対する新しい処置を特定するために使用することができる。本発明は、例えば、前立腺がんまたはＤＬＢＣＬの治療に関連する、新しい治療薬を特定または設計するために本明細書で定義された染色体相互作用の方法および使用を提供する。
相同体
ポリヌクレオチド／核酸（例えばＤＮＡ）配列の相同体は、本明細書で参照される。そのような相同体は、典型的に、例えば、少なくとも１０、１５、２０、３０、１００またはそれ以上の連続したヌクレオチドの領域、または染色体相互作用に関与する染色体の領域に由来する核酸の部分にわたって、少なくとも７０％の相同性、好ましくは少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の相同性を有する。相同性は、ヌクレオチド同一性（「ハード相同性」と呼ばれることもある）に基づいて計算され得る。
ポリヌクレオチド／核酸（例えばＤＮＡ）配列の相同体は、本明細書で参照される。そのような相同体は、典型的に、例えば、少なくとも１０、１５、２０、３０、１００またはそれ以上の連続したヌクレオチドの領域、または染色体相互作用に関与する染色体の領域に由来する核酸の部分にわたって、少なくとも７０％の相同性、好ましくは少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の相同性を有する。相同性は、ヌクレオチド同一性（「ハード相同性」と呼ばれることもある）に基づいて計算され得る。
したがって、特定の態様では、ポリヌクレオチド／核酸（例えばＤＮＡ）配列の相同体は、パーセンテージ配列同一性を参照することによって本明細書で言及される。典型的に、そのような相同体は、例えば、少なくとも１０、１５、２０、３０、１００またはそれ以上の連続したヌクレオチドの領域、または染色体相互作用に関与する染色体の領域に由来する核酸の部分にわたって、少なくとも７０％の配列同一性、好ましくは少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を有する。
例えば、ＵＷＧＣＧパッケージは、相同性および／または％配列同一性（例えば、そのデフォルト設定で使用される）を計算するために使用することができるＢＥＳＴＦＩＴプログラムを提供する（Devereux et al(1984)Nucleic Acids Research 12,p387-395）。ＰＩＬＥＵＰおよびＢＬＡＳＴアルゴリズムは、例えば、Altschul S. F. (1993) J Mol Evol 36: 290-300；Altschul, S, F et al (1990) J Mol Biol 215: 403-10に記載されるように、相同性および／または％配列同一性を計算する、および／または配列を整列させる（（典型的にそれらのデフォルト設定で）同等または対応する配列を同定するなど）ために使用することができる。
ＢＬＡＳＴ解析を実行するためのソフトウェアは、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎを通じて公開されている。このアルゴリズムは、最初に、データベース配列内の同じ長さの単語と整列したときに一部の正の値の閾値スコアＴに一致するかまたはそれを満たす照合配列内の長さＷの短い単語を同定することによって高スコアの配列ペア（ＨＳＰ）を同定することを含む。Ｔは近隣単語スコア閾値と呼ばれる（上記のAltschul et al）。これらの初期の近隣単語ヒットは、それらを含むＨＳＰを見つけるために検索を開始するためのシードとして機能する。単語ヒットは、累積アラインメントスコアを増やすことができる限り、各配列に沿って両方向に拡張される。各方向の単語ヒットの拡張は、次の場合に停止される：累積アラインメントスコアがその最大達成値から数量Ｘだけ低下する；１つまたは複数の負のスコアの残基アラインメントの累積により、累積アラインメントスコアがゼロ以下になる；またはいずれかの配列の終わりに到達する。ＢＬＡＳＴアルゴリズムパラメータＷ５ ＴおよびＸは、アラインメントの感度および速度を判定する。ＢＬＡＳＴプログラムは、デフォルトとして、１１の語長（Ｗ）、５０のＢＬＯＳＵＭ６２スコアリングマトリックス（Henikoff and Henikoff (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 10915-10919を参照）アラインメント（Ｂ）、１０の期待値（Ｅ）、Ｍ＝５、Ｎ＝４、および両方のストランドの比較を使用する。
ＢＬＡＳＴアルゴリズムは、２つの配列間の類似性の統計分析を実施する（例えば、Karlin and Altschul (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 5873-5787を参照）。BＬＡＳＴアルゴリズムによって提供される類似性の１つの尺度は、最小合計確率（Ｐ（Ｎ））であり、これは、２つのポリヌクレオチド配列間の一致が偶然に生じる確率の指標を提供する。例えば、第１の配列と第２の配列との比較における最小合計確率が約１未満、好ましくは約０．１未満、より好ましくは約０．０１未満、最も好ましくは約０．００１未満である場合、配列は別の配列と類似していると見なされる。
相同配列は、典型的に、（ヌクレオチドの置換、欠失、または挿入であり得る）１０、１５、または２０塩基未満など、１、２、３、４またはそれ以上の塩基だけ異なる。これらの変化は、相同性および／または％配列同一性の計算に関連して、上述の領域のいずれかにわたって測定され得る。
「プライマー対」の相同性は、例えば、後に別のプライマー対と比較する（これも単一の配列として見なされる）目的で、（２つの配列が一緒に結合されているかのように）２つの配列を単一の配列と見なすことによって計算することができる。
アレイ
核酸の第２のセットはアレイに結合され得、一態様では、アレイに結合される少なくとも１５，０００、４５，０００、１００，０００または２５０，０００の異なる第２の核酸があり、これらは好ましくは、少なくとも３００、９００、２０００または５０００の遺伝子座を表している。一態様では、第２の核酸の１つ、または複数、またはすべての異なる集団は、アレイの１つを超える別個の領域に結合され、事実上、アレイ上で繰り返され、エラー検出を可能にする。アレイは、Ａｇｉｌｅｎｔ ＳｕｒｅＰｒｉｎｔ Ｇ３ Ｃｕｓｔｏｍ ＣＧＨマイクロアレイプラットフォームに基づき得る。アレイへの第１の核酸の結合の検出は、デュアルカラーシステムによって実施され得る。
核酸の第２のセットはアレイに結合され得、一態様では、アレイに結合される少なくとも１５，０００、４５，０００、１００，０００または２５０，０００の異なる第２の核酸があり、これらは好ましくは、少なくとも３００、９００、２０００または５０００の遺伝子座を表している。一態様では、第２の核酸の１つ、または複数、またはすべての異なる集団は、アレイの１つを超える別個の領域に結合され、事実上、アレイ上で繰り返され、エラー検出を可能にする。アレイは、Ａｇｉｌｅｎｔ ＳｕｒｅＰｒｉｎｔ Ｇ３ Ｃｕｓｔｏｍ ＣＧＨマイクロアレイプラットフォームに基づき得る。アレイへの第１の核酸の結合の検出は、デュアルカラーシステムによって実施され得る。
治療薬（例えば、個体の分類に基づいて選択されるか、または本発明による試験に基づいて選択される）
治療薬は本明細書に言及されている。本発明は、特定の個体、例えば本発明のプロセスによって同定された個体の病状を予防または処置する際に使用するためのそのような薬剤を提供する。これは、治療上有効な量の薬剤を必要としている個体に投与することを含み得る。本発明は、特定の個体の疾病を予防または処置するための医薬品の製造における薬剤の使用を提供する。
治療薬は本明細書に言及されている。本発明は、特定の個体、例えば本発明のプロセスによって同定された個体の病状を予防または処置する際に使用するためのそのような薬剤を提供する。これは、治療上有効な量の薬剤を必要としている個体に投与することを含み得る。本発明は、特定の個体の疾病を予防または処置するための医薬品の製造における薬剤の使用を提供する。
薬剤の配合は薬剤の性質に依存する。薬剤は、薬剤および薬学的に許容可能な担体または希釈剤を含む医薬組成物の形態で提供される。適切な担体および希釈剤には、等張食塩水、例えばリン酸緩衝生理食塩水が含まれる。典型的な経口剤形には、錠剤、カプセル、液体溶液および液体懸濁液が含まれる。薬剤は、非経口、静脈内、筋肉内、皮下、経皮、または経口投与用に製剤され得る。
薬剤の用量は、以下の様々なパラメータに従って、特に使用される物質に従って判定され得る；治療を受ける個体の年齢、体重、疾病；投与経路；および必要なレジメン。医師は、任意の特定の薬剤に必要な投与経路および投与量を判定することができる。しかし、適切な用量は、例えば、１日１回から３回摂取される、１～４０ｍｇ／ｋｇの体重など、０．１～１００ｍｇ／ｋｇの体重であり得る。
治療薬は、本明細書に開示される任意のそのような薬剤であり得るか、または本明細書の任意の表（表５または６を含む）において開示される任意のタンパク質または遺伝子を含む、本明細書に開示される任意の「標的」を標的とし得る。組み合わせて開示される任意の薬剤が、個別に投与するためにも開示されると見なされるべきであることが理解される。
前立腺がん治療
疾患進行の段階に応じて前立腺がん治療が推奨される。放射線療法、ホルモン療法および化学療法は、前立腺がん治療でしばしば使用される３つのオプションである。単一の治療または治療の組み合わせが使用され得る。
疾患進行の段階に応じて前立腺がん治療が推奨される。放射線療法、ホルモン療法および化学療法は、前立腺がん治療でしばしば使用される３つのオプションである。単一の治療または治療の組み合わせが使用され得る。
化学療法
化学療法は、身体の他の臓器に浸潤した前立腺がん（転移性前立腺がん）の治療にしばしば使用される。化学療法は、癌細胞の増殖の過程を妨げることによって癌細胞を破壊する。化学療法は、前立腺がんを治癒するものではないが、前立腺がんを抑制下で維持し、症状を軽減し、それゆえ日常生活への影響を少なくする。
化学療法は、身体の他の臓器に浸潤した前立腺がん（転移性前立腺がん）の治療にしばしば使用される。化学療法は、癌細胞の増殖の過程を妨げることによって癌細胞を破壊する。化学療法は、前立腺がんを治癒するものではないが、前立腺がんを抑制下で維持し、症状を軽減し、それゆえ日常生活への影響を少なくする。
放射線療法
この治療法は、限局性および局所進行性の前立腺がんを治癒するために使用され得る。放射線療法は、転移性前立腺がんの進行を遅らせ、症状を緩和するためにも使用することができる。患者は、化学療法を受ける前にホルモン療法を受けて、治療が成功する可能性を高め得る。再発の可能性を減らすために、放射線療法の後にホルモン療法も推奨され得る。
この治療法は、限局性および局所進行性の前立腺がんを治癒するために使用され得る。放射線療法は、転移性前立腺がんの進行を遅らせ、症状を緩和するためにも使用することができる。患者は、化学療法を受ける前にホルモン療法を受けて、治療が成功する可能性を高め得る。再発の可能性を減らすために、放射線療法の後にホルモン療法も推奨され得る。
ホルモン療法
ホルモン療法は、しばしば、放射線療法と組み合わせて使用される。通常、手術または放射線療法を受けることに適合し、その意思のある男性の限局性前立腺がんの治療には、ホルモン療法は単独で使用されるべきではない。ホルモン療法は、進行性前立腺がんの進行を遅らせ、症状を緩和するために使用することができる。ホルモンは前立腺における細胞の増殖を制御する。特に、前立腺がんは増殖するためにホルモンテストステロンを必要とする。ホルモン療法の目的は、テストステロンの産生を停止するか、または患者の身体のテストステロンの使用を停止させることによって、テストステロンの効果をブロックすることである。
ホルモン療法は、しばしば、放射線療法と組み合わせて使用される。通常、手術または放射線療法を受けることに適合し、その意思のある男性の限局性前立腺がんの治療には、ホルモン療法は単独で使用されるべきではない。ホルモン療法は、進行性前立腺がんの進行を遅らせ、症状を緩和するために使用することができる。ホルモンは前立腺における細胞の増殖を制御する。特に、前立腺がんは増殖するためにホルモンテストステロンを必要とする。ホルモン療法の目的は、テストステロンの産生を停止するか、または患者の身体のテストステロンの使用を停止させることによって、テストステロンの効果をブロックすることである。
前立腺がん治療に使用され得る他の治療法
・前立腺全摘除術
・高密度焦点式超音波療法
・寒冷療法
・密封小線源治療
・待機療法
・経尿道的前立腺切除術
・進行性前立腺がんの治療
・ステロイド
・前立腺全摘除術
・高密度焦点式超音波療法
・寒冷療法
・密封小線源治療
・待機療法
・経尿道的前立腺切除術
・進行性前立腺がんの治療
・ステロイド
ＤＬＢＣＬ療法
ＤＬＢＣＬの治療には以下の４つの治療法が使用され得る：
－ 化学療法
－ 放射線療法
－ モノクローナル抗体療法
－ ステロイド療法
ＤＬＢＣＬの治療には以下の４つの治療法が使用され得る：
－ 化学療法
－ 放射線療法
－ モノクローナル抗体療法
－ ステロイド療法
上記治療法はいずれもリンパ腫の治療にも使用され得る。
本明細書に言及される物質の形態
本明細書に言及される、核酸または治療薬などの物質はいずれも、精製または単離された形態であり得る。それらは自然界に見られるものとは異なる形態であり得、例えば、それらは自然界に生じない他の物質と組み合わせて存在し得る。核酸（本明細書で定義される配列の部分を含む）は、自然界に見られるものとは異なる配列を有し得、例えば、相同性に関するセクションに記載されるように配列において少なくとも１、２、３、４またはそれ以上のヌクレオチド変化を有する。核酸は５’または３’末端に異種配列を有し得る。核酸は自然界に見られるものと化学的に異なり得、例えば、それらは何らかの方法で修飾され得るが、それでもワトソン・クリック塩基対が可能であることが好ましい。適切な場合に、核酸は二本鎖または一本鎖の形態で提供される。本発明は、本明細書に言及される特異的な核酸配列のすべてを一本鎖または二本鎖の形態で提供し、したがって、開示される任意の配列に対する相補鎖を含む。
本明細書に言及される、核酸または治療薬などの物質はいずれも、精製または単離された形態であり得る。それらは自然界に見られるものとは異なる形態であり得、例えば、それらは自然界に生じない他の物質と組み合わせて存在し得る。核酸（本明細書で定義される配列の部分を含む）は、自然界に見られるものとは異なる配列を有し得、例えば、相同性に関するセクションに記載されるように配列において少なくとも１、２、３、４またはそれ以上のヌクレオチド変化を有する。核酸は５’または３’末端に異種配列を有し得る。核酸は自然界に見られるものと化学的に異なり得、例えば、それらは何らかの方法で修飾され得るが、それでもワトソン・クリック塩基対が可能であることが好ましい。適切な場合に、核酸は二本鎖または一本鎖の形態で提供される。本発明は、本明細書に言及される特異的な核酸配列のすべてを一本鎖または二本鎖の形態で提供し、したがって、開示される任意の配列に対する相補鎖を含む。
本発明は、予後に関連する染色体相互作用の検出を含む、本発明の任意のプロセスを実行するためのキットを提供する。そのようなキットは、本発明のプロセスによって産生されたライゲートされた核酸を検出することができる薬剤などの、関連する染色体相互作用を検出することができる特異的結合剤を含むことができる。キットに存在する好ましい薬剤には、例えば本明細書に記載されるように、ＰＣＲ反応においてライゲートされた核酸を増幅することができる、ライゲートされた核酸またはプライマー対にハイブリダイズすることができるプローブが含まれる。
本発明は、関連する染色体相互作用を検出することができるデバイスを提供する。デバイスは、好ましくは、本明細書に記載される任意のそのような薬剤、プローブまたはプライマー対などの、染色体相互作用を検出することができる任意の特異的結合剤、プローブまたはプライマー対を含む。
検出方法
一態様では、染色体相互作用に関連するライゲートされた配列の定量的検出が、ＰＣＲ反応中の活性化で検出可能であるプローブを使用して実行され、上記ライゲートされた配列は、エピジェネティックな染色体相互作用で一緒になる２つの染色体領域からの配列を含み、上記方法は、ＰＣＲ反応中にライゲートされた配列をプローブと接触させる工程、およびプローブの活性化の程度を検出する工程を含み、上記プローブはライゲートされた部位に結合する。当該方法では、典型的に、二重標識蛍光加水分解プローブを使用してＭＩＱＥに準拠した方法で特定の相互作用を検出することができる。
一態様では、染色体相互作用に関連するライゲートされた配列の定量的検出が、ＰＣＲ反応中の活性化で検出可能であるプローブを使用して実行され、上記ライゲートされた配列は、エピジェネティックな染色体相互作用で一緒になる２つの染色体領域からの配列を含み、上記方法は、ＰＣＲ反応中にライゲートされた配列をプローブと接触させる工程、およびプローブの活性化の程度を検出する工程を含み、上記プローブはライゲートされた部位に結合する。当該方法では、典型的に、二重標識蛍光加水分解プローブを使用してＭＩＱＥに準拠した方法で特定の相互作用を検出することができる。
プローブは概して、非アクティブおよびアクティブ状態の検出可能なラベルで標識されているため、活性化された場合にのみ検出される。活性化の程度は、ＰＣＲ反応に存在するテンプレート（ライゲートされた産物）の程度に関連する。検出は、ＰＣＲのすべてまたは一部の間、例えば、ＰＣＲのサイクルの少なくとも５０％または８０％の間に実行され得る。
プローブは、オリゴヌクレオチドの一端に共有結合したフルオロフォア、およびヌクレオチドの他端に結合した消光剤を含むことができ、その結果、フルオロフォアの蛍光は消光剤によってクエンチされる。一態様では、フルオロフォアはオリゴヌクレオチドの５’末端に結合され、消光剤はオリゴヌクレオチドの３’末端に共有結合される。本発明の方法で使用することができるフルオロフォアには、ＦＡＭ、ＴＥＴ、ＪＯＥ、Ｙａｋｉｍａ Ｙｅｌｌｏｗ、ＨＥＸ、Ｃｙａｎｉｎｅ ３、ＡＴＴＯ ５５０、ＴＡＭＲＡ、ＲＯＸ、Ｔｅｘａｓ Ｒｅｄ、Ｃｙａｎｉｎｅ ３．５、ＬＣ ６１０、ＬＣ ６４０、ＡＴＴＯ ６４７Ｎ、Ｃｙａｎｉｎｅ ５、Ｃｙａｎｉｎｅ ５．５、およびＡＴＴＯ ６８０が含まれる。適切なフルオロフォアと共に使用することができる消光剤には、ＴＡＭ、ＢＨＱ１、ＤＡＢ、Ｅｃｌｉｐ、ＢＨＱ２、およびＢＢＱ６５０が含まれ、随意に、上記フルオロフォアは、ＨＥＸ、Ｔｅｘａｓ ＲｅｄおよびＦＡＭから選択される。フルオロフォアと消光剤の好ましい組み合わせには、ＦＡＭとＢＨＱ１、およびＴｅｘａｓ ＲｅｄとＢＨＱ２が含まれる。
ｑＰＣＲアッセイでのプローブの使用
本発明の加水分解プローブは、典型的に、濃度が一致したネガティブコントロールで温度勾配が最適化されている。好ましくは、一段階のＰＣＲ反応が最適化される。より好ましくは、標準曲線が計算される。ライゲートされた配列の接合部にわたって結合する特異的なプローブを使用することの利点は、ネステッドＰＣＲアプローチを使用せずにライゲートされた配列に対する特異度を達成することができることである。本明細書に記載される方法は、低コピー数の標的の正確かつ精密な定量化を可能にする。温度勾配の最適化の前に、標的のライゲートされた配列は精製することができ、例えば、ゲル精製することができる。標的のライゲートされた配列は配列決定することができる。好ましくは、ＰＣＲ反応は、約１０ｎｇ、または５～１５ｎｇ、または１０～２０ｎｇ、または１０～５０ｎｇ、または１０～２００ｎｇのテンプレートＤＮＡを使用して実施される。フォワードおよびリバースプライマーは、一方のプライマーが、ライゲートされたＤＮＡ配列で表される染色体領域のうちの１つの配列に結合し、もう一方のプライマーが、例えば、配列に相補的であることによって、ライゲートされたＤＮＡ配列で表される他の染色体領域に結合するように設計されている。
本発明の加水分解プローブは、典型的に、濃度が一致したネガティブコントロールで温度勾配が最適化されている。好ましくは、一段階のＰＣＲ反応が最適化される。より好ましくは、標準曲線が計算される。ライゲートされた配列の接合部にわたって結合する特異的なプローブを使用することの利点は、ネステッドＰＣＲアプローチを使用せずにライゲートされた配列に対する特異度を達成することができることである。本明細書に記載される方法は、低コピー数の標的の正確かつ精密な定量化を可能にする。温度勾配の最適化の前に、標的のライゲートされた配列は精製することができ、例えば、ゲル精製することができる。標的のライゲートされた配列は配列決定することができる。好ましくは、ＰＣＲ反応は、約１０ｎｇ、または５～１５ｎｇ、または１０～２０ｎｇ、または１０～５０ｎｇ、または１０～２００ｎｇのテンプレートＤＮＡを使用して実施される。フォワードおよびリバースプライマーは、一方のプライマーが、ライゲートされたＤＮＡ配列で表される染色体領域のうちの１つの配列に結合し、もう一方のプライマーが、例えば、配列に相補的であることによって、ライゲートされたＤＮＡ配列で表される他の染色体領域に結合するように設計されている。
ライゲートされたＤＮＡ標的の選択
本発明は、プライマーを、ライゲートされた配列に結合および増幅するそれらの能力に基づいて選択すること、およびそれが結合する標的配列のプローブ配列に基づく特性、特に標的配列の曲率を選択することを含む、本明細書で定義されるＰＣＲ法で使用するためのプライマーおよびプローブを選択する工程を含む。
本発明は、プライマーを、ライゲートされた配列に結合および増幅するそれらの能力に基づいて選択すること、およびそれが結合する標的配列のプローブ配列に基づく特性、特に標的配列の曲率を選択することを含む、本明細書で定義されるＰＣＲ法で使用するためのプライマーおよびプローブを選択する工程を含む。
プローブは典型的に、制限部位にまたがる並置された制限フラグメントであるライゲートされた配列に結合するように設計／選択される。本発明の一態様では、特定の染色体相互作用に関連するライゲートされる可能性のある配列の予測される曲率が、例えば、本明細書で参照される特定のアルゴリズムを使用して計算される。曲率は、例えば、らせん回転あたり１０．５°など、らせん回転あたりの度数として表すことができる。ライゲートされた配列は、ライゲートされた配列が、らせん回転あたり少なくとも５°、典型的に、らせん回転あたり少なくとも１０°、１５°または２０°、例えばらせん回転あたり５°～２０°の曲率傾向ピークスコアを有する場合に標的化のために選択される。好ましくは、らせん回転あたりの曲率傾向ピークスコアは、ライゲートされた部位の上流および／または下流の２０～４００の塩基など、少なくとも２０、５０、１００、２００または４００の塩基に対して計算される。したがって、一態様では、ライゲートされた産物における標的配列は、これらのレベルの曲率のいずれかを有する。標的配列は、最低の熱力学的構造の自由エネルギーに基づいて選択することもできる。
特定の態様
一態様では、染色体内相互作用のみが分類／検出され、（異なる染色体間の）染色体外相互作用は分類／検出されない。
一態様では、染色体内相互作用のみが分類／検出され、（異なる染色体間の）染色体外相互作用は分類／検出されない。
特定の態様では、特定の染色体相互作用、例えば、（例えば、本明細書で言及される任意のプローブまたはプライマー対によって定義されるような）本明細書で言及される任意の特異的な相互作用は分類されない。いくつかの態様では、染色体相互作用は、本明細書に言及される遺伝子のいずれにおいても分類されない。
本明細書で提供されたデータは、マーカーが、関連する疾患状況の症例と非症例を区別することができる「普及（disseminating）」しているものであることを示している。したがって、本発明を実施するときに、当業者は、個体が存在するのがどのサブグループなのかを相互作用の検出によって判定することができるであろう。一実施形態では、（不在または存在のいずれかによって）関連する疾患状況に関連付けられている形態での試験されたマーカーの少なくとも７０％の検出の閾値が、個体が関連するサブグループに存在するかどうかを判定するために使用され得る。
スクリーニング方法
本発明は、どの染色体相互作用が集団の予後のサブグループに対応する染色体状態に関連するかを判定する方法を提供し、当該方法は、染色体の異なる状態を有するサブグループからの核酸の第１のセットをインデックス核酸の第２のセットと接触させる工程、および相補的配列がハイブリダイズすることを可能にする工程を含み、第１および核酸の第２のセットにおける核酸は、染色体相互作用で一緒になった両方の染色体領域からの配列を含むライゲートされた産物を表し、核酸の第１のセットと核酸の第２のセットとの間のハイブリダイゼーションのパターンによって、どの染色体相互作用が予後のサブグループに特異的であるかを判定することが可能になる。サブグループは、例えば、特定の疾病または治療を参照した、本明細書で定義される特異的なサブグループのいずれかであり得る。
本発明は、どの染色体相互作用が集団の予後のサブグループに対応する染色体状態に関連するかを判定する方法を提供し、当該方法は、染色体の異なる状態を有するサブグループからの核酸の第１のセットをインデックス核酸の第２のセットと接触させる工程、および相補的配列がハイブリダイズすることを可能にする工程を含み、第１および核酸の第２のセットにおける核酸は、染色体相互作用で一緒になった両方の染色体領域からの配列を含むライゲートされた産物を表し、核酸の第１のセットと核酸の第２のセットとの間のハイブリダイゼーションのパターンによって、どの染色体相互作用が予後のサブグループに特異的であるかを判定することが可能になる。サブグループは、例えば、特定の疾病または治療を参照した、本明細書で定義される特異的なサブグループのいずれかであり得る。
公報
本明細書で言及されるすべての公報の内容は、引用により本明細書に組み込まれ、本発明に関連する特徴をさらに定義するために使用され得る。
本明細書で言及されるすべての公報の内容は、引用により本明細書に組み込まれ、本発明に関連する特徴をさらに定義するために使用され得る。
具体的な態様
ＥｐｉＳｗｉｔｃｈ（商標）プラットフォーム技術により、遺伝子座での正常な状態と異常な状態との間の規制変化のエピジェネティックな規制シグネチャを検出する。ＥｐｉＳｗｉｔｃｈ（商標）プラットフォームは、染色体コンフォメーションシグネチャとしても知られるヒト染色体の高次構造の制御に関連付けられた遺伝子制御の基本的なエピジェネティックレベルを同定およびモニターする。染色体シグネチャは、遺伝子調節解除のカスケードにおける別個の主要な工程である。これらは、ＤＮＡメチル化やＲＮＡプロファイリングなどの、後期エピジェネティックおよび遺伝子発現バイオマーカーを利用するバイオマーカープラットフォームに対する固有の一連の利点を備えた高次バイオマーカーである。
ＥｐｉＳｗｉｔｃｈ（商標）プラットフォーム技術により、遺伝子座での正常な状態と異常な状態との間の規制変化のエピジェネティックな規制シグネチャを検出する。ＥｐｉＳｗｉｔｃｈ（商標）プラットフォームは、染色体コンフォメーションシグネチャとしても知られるヒト染色体の高次構造の制御に関連付けられた遺伝子制御の基本的なエピジェネティックレベルを同定およびモニターする。染色体シグネチャは、遺伝子調節解除のカスケードにおける別個の主要な工程である。これらは、ＤＮＡメチル化やＲＮＡプロファイリングなどの、後期エピジェネティックおよび遺伝子発現バイオマーカーを利用するバイオマーカープラットフォームに対する固有の一連の利点を備えた高次バイオマーカーである。
ＥｐｉＳｗｉｔｃｈ（商標）アレイアッセイ
カスタムＥｐｉＳｗｉｔｃｈ（商標）アレイスクリーニングプラットフォームには、１５Ｋ、４５Ｋ、１００Ｋ、および２５０Ｋの固有の染色体コンフォメーションの４つの密度があり、各キメラフラグメントはアレイ上で４回繰り返され、有効密度を、それぞれ６０Ｋ、１８０Ｋ、４００Ｋ、および１００万にする。
カスタムＥｐｉＳｗｉｔｃｈ（商標）アレイスクリーニングプラットフォームには、１５Ｋ、４５Ｋ、１００Ｋ、および２５０Ｋの固有の染色体コンフォメーションの４つの密度があり、各キメラフラグメントはアレイ上で４回繰り返され、有効密度を、それぞれ６０Ｋ、１８０Ｋ、４００Ｋ、および１００万にする。
カスタム設計されたＥｐｉＳｗｉｔｃｈ（商標）アレイ
１５ＫのＥｐｉＳｗｉｔｃｈ（商標）アレイは、ＥｐｉＳｗｉｔｃｈ（商標）Ｂｉｏｍａｒｋｅｒ発見技術で照合された約３００の遺伝子座を含むゲノム全体をスクリーニングすることができる。ＥｐｉＳｗｉｔｃｈ（商標）アレイは、Ａｇｉｌｅｎｔ ＳｕｒｅＰｒｉｎｔ Ｇ３ Ｃｕｓｔｏｍ ＣＧＨマイクロアレイプラットフォーム上に構築され、この技術は、４つの密度、６０Ｋ、１８０Ｋ、４００Ｋ、および１００万のプローブを提供する。各ＥｐｉＳｗｉｔｃｈ（商標）プローブが４つ組として表示されるため、アレイあたりの密度は１５Ｋ、４５Ｋ、１００Ｋ、および２５０Ｋまで減少し、それゆえ、再現性の統計的評価が可能になる。遺伝子座ごとに照合される潜在的なＥｐｉＳｗｉｔｃｈ（商標）マーカーの平均数は５０であり、調査することができる遺伝子座の数は３００、９００、２０００、および５０００である。
１５ＫのＥｐｉＳｗｉｔｃｈ（商標）アレイは、ＥｐｉＳｗｉｔｃｈ（商標）Ｂｉｏｍａｒｋｅｒ発見技術で照合された約３００の遺伝子座を含むゲノム全体をスクリーニングすることができる。ＥｐｉＳｗｉｔｃｈ（商標）アレイは、Ａｇｉｌｅｎｔ ＳｕｒｅＰｒｉｎｔ Ｇ３ Ｃｕｓｔｏｍ ＣＧＨマイクロアレイプラットフォーム上に構築され、この技術は、４つの密度、６０Ｋ、１８０Ｋ、４００Ｋ、および１００万のプローブを提供する。各ＥｐｉＳｗｉｔｃｈ（商標）プローブが４つ組として表示されるため、アレイあたりの密度は１５Ｋ、４５Ｋ、１００Ｋ、および２５０Ｋまで減少し、それゆえ、再現性の統計的評価が可能になる。遺伝子座ごとに照合される潜在的なＥｐｉＳｗｉｔｃｈ（商標）マーカーの平均数は５０であり、調査することができる遺伝子座の数は３００、９００、２０００、および５０００である。
ＥｐｉＳｗｉｔｃｈ（商標）カスタムアレイパイプライン
ＥｐｉＳｗｉｔｃｈ（商標）アレイは、ＥｐｉＳｗｉｔｃｈ（商標）ライブラリの生成後、Ｃｙ５において標識されたサンプルの１つのセット、およびＣｙ３において標識された比較／分析されるべきサンプル（対照）のもう１つのセットを備えたデュアルカラーシステムである。アレイはＡｇｉｌｅｎｔ ＳｕｒｅＳｃａｎ Ｓｃａｎｎｅｒを使用してスキャンされ、結果として生じる特徴がＡｇｉｌｅｎｔ Ｆｅａｔｕｒｅ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎソフトウェアを使用して抽出される。その後、データはＲでのＥｐｉＳｗｉｔｃｈ（商標）アレイ処理スクリプトを使用して処理される。アレイは、Ｒ：Ｌｉｍｍａ＊でのＢｉｏｃｏｎｄｕｃｔｏｒにおける標準デュアルカラーパッケージを使用して処理される。アレイの正規化は、Ｌｉｍｍａ＊でのｎｏｒｍａｌｉｚｅｄＷｉｔｈｉｎＡｒｒａｙｓ機能を使用して実行われ、これは、オンチップのＡｇｉｌｅｎｔ陽性対照およびＥｐｉＳｗｉｔｃｈ（商標）陽性対照に対して行われる。Ｌｉｍｍａ＊を使用して分析するために、データはＡｇｉｌｅｎｔ Ｆｌａｇ呼び出しに基づいてフィルタリングされ、Ａｇｉｌｅｎｔ対照プローブは取り外され、テクニカルレプリケートプローブは平均化される。プローブは、比較されている２つのシナリオ間の違いに基づいてモデル化され、偽発見率を使用して修正される。＜＝－１．１または＝＞１．１であり、ｐ＜＝０．１ＦＤＲのｐ値をパスする変動係数（ＣＶ）＜＝３０％のプローブが、さらなるスクリーニングに使用される。プローブセットを減らすために、ＲでのＦａｃｔｏｒＭｉｎｅＲパッケージを使用してさらなる複数因子分析が実施される。
ＥｐｉＳｗｉｔｃｈ（商標）アレイは、ＥｐｉＳｗｉｔｃｈ（商標）ライブラリの生成後、Ｃｙ５において標識されたサンプルの１つのセット、およびＣｙ３において標識された比較／分析されるべきサンプル（対照）のもう１つのセットを備えたデュアルカラーシステムである。アレイはＡｇｉｌｅｎｔ ＳｕｒｅＳｃａｎ Ｓｃａｎｎｅｒを使用してスキャンされ、結果として生じる特徴がＡｇｉｌｅｎｔ Ｆｅａｔｕｒｅ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎソフトウェアを使用して抽出される。その後、データはＲでのＥｐｉＳｗｉｔｃｈ（商標）アレイ処理スクリプトを使用して処理される。アレイは、Ｒ：Ｌｉｍｍａ＊でのＢｉｏｃｏｎｄｕｃｔｏｒにおける標準デュアルカラーパッケージを使用して処理される。アレイの正規化は、Ｌｉｍｍａ＊でのｎｏｒｍａｌｉｚｅｄＷｉｔｈｉｎＡｒｒａｙｓ機能を使用して実行われ、これは、オンチップのＡｇｉｌｅｎｔ陽性対照およびＥｐｉＳｗｉｔｃｈ（商標）陽性対照に対して行われる。Ｌｉｍｍａ＊を使用して分析するために、データはＡｇｉｌｅｎｔ Ｆｌａｇ呼び出しに基づいてフィルタリングされ、Ａｇｉｌｅｎｔ対照プローブは取り外され、テクニカルレプリケートプローブは平均化される。プローブは、比較されている２つのシナリオ間の違いに基づいてモデル化され、偽発見率を使用して修正される。＜＝－１．１または＝＞１．１であり、ｐ＜＝０．１ＦＤＲのｐ値をパスする変動係数（ＣＶ）＜＝３０％のプローブが、さらなるスクリーニングに使用される。プローブセットを減らすために、ＲでのＦａｃｔｏｒＭｉｎｅＲパッケージを使用してさらなる複数因子分析が実施される。
＊注：ＬＩＭＭＡは、マイクロアレイ実験で差次的発現を評価するための線形モデルおよび経験ベイズプロセスである。Ｌｉｍｍａは、マイクロアレイまたはＲＮＡ－Ｓｅｑから生じる遺伝子発現データを分析するためのＲパッケージである。
プローブのプールは、最初に、調整されたｐ値、ＦＣおよびＣＶ＜３０％（任意のカットオフポイント）パラメータに基づいて選択され、最終的にピッキングが行われる。さらなる分析および最終的なリストは、最初の２つのパラメータ（調整されたｐ値；ＦＣ）のみに基づいて作成される。
統計パイプライン
ＥｐｉＳｗｉｔｃｈ（商標）スクリーニングアレイは、ＥｐｉＳｗｉｔｃｈ（商標）ＰＣＲプラットフォームに変換するための高価値のＥｐｉＳｗｉｔｃｈ（商標）マーカーを選択するために、ＲでのＥｐｉＳｗｉｔｃｈ（商標）分析パッケージを使用して処理される。
ＥｐｉＳｗｉｔｃｈ（商標）スクリーニングアレイは、ＥｐｉＳｗｉｔｃｈ（商標）ＰＣＲプラットフォームに変換するための高価値のＥｐｉＳｗｉｔｃｈ（商標）マーカーを選択するために、ＲでのＥｐｉＳｗｉｔｃｈ（商標）分析パッケージを使用して処理される。
工程１
プローブを、修正された線形回帰モデルの積である、それらの修正されたｐ値（偽発見率、ＦＤＲ）に基づいて選択する。ｐ値＜＝０．１未満のプローブを選択し、その後、エピジェネティック比（ＥＲ）によってさらに減少させ、さらなる分析に選択するためにプローブＥＲは＜＝－１．１または＝＞１．１でなければならない。最終的なフィルタは変動係数（ＣＶ）であり、プローブは＜＝０．３未満でなければならない。
プローブを、修正された線形回帰モデルの積である、それらの修正されたｐ値（偽発見率、ＦＤＲ）に基づいて選択する。ｐ値＜＝０．１未満のプローブを選択し、その後、エピジェネティック比（ＥＲ）によってさらに減少させ、さらなる分析に選択するためにプローブＥＲは＜＝－１．１または＝＞１．１でなければならない。最終的なフィルタは変動係数（ＣＶ）であり、プローブは＜＝０．３未満でなければならない。
工程２
統計リストからの上位４０のマーカーを、ＰＣＲ変換に対するマーカーとして選択するためのそれらのＥＲに基づいて選択する。負のＥＲ負荷が最も高い上位２０のマーカーおよび正のＥＲ負荷が最も高い上位２０のマーカーがリストを形成する。
統計リストからの上位４０のマーカーを、ＰＣＲ変換に対するマーカーとして選択するためのそれらのＥＲに基づいて選択する。負のＥＲ負荷が最も高い上位２０のマーカーおよび正のＥＲ負荷が最も高い上位２０のマーカーがリストを形成する。
工程３
工程１から結果として得たマーカー、統計的に有意なプローブは、超幾何学的エンリッチメント（ＨＥ）を使用したエンリッチメント分析の基礎を形成する。この分析によって、有意なプローブリストからのマーカー減少が可能になり、工程２からのマーカーとともに、ＥｐｉＳｗｉｔｃｈ（商標）ＰＣＲプラットフォームに変換されたプローブのリストが形成される。
工程１から結果として得たマーカー、統計的に有意なプローブは、超幾何学的エンリッチメント（ＨＥ）を使用したエンリッチメント分析の基礎を形成する。この分析によって、有意なプローブリストからのマーカー減少が可能になり、工程２からのマーカーとともに、ＥｐｉＳｗｉｔｃｈ（商標）ＰＣＲプラットフォームに変換されたプローブのリストが形成される。
統計プローブは、どの遺伝的位置が統計的に有意なプローブのエンリッチメントを有しているかを判断するためにＨＥによって処理され、これは、どの遺伝的位置がエピジェネティックな違いのハブであるかを示している。
補正されたｐ値に基づく最も有意なエンリッチメント遺伝子座がプローブリストの作成のために選択される。０．３または０．２のｐ値未満の遺伝的位置が選択される。工程２からのマーカーを用いる、これらの遺伝子位置にマッピングされる統計プローブは、ＥｐｉＳｗｉｔｃｈ（商標）ＰＣＲ変換に対する高価値マーカーを形成する。
アレイの設計および処理
アレイ設計
１．遺伝子座を、ＳＩＩソフトウェア（現在はｖ３．２）を使用して次のように処理する。
ａ．これらの特異的な遺伝子座でゲノムの配列を引き出す（５０ｋｂ上流および２０ｋｂ下流の遺伝子配列）。
ｂ．この領域内の配列がＣＣに関与する確率を定義する。
ｃ．特異的なＲＥを使用して配列をカットする。
ｄ．どの制限フラグメントが特定の配向で相互作用する傾向にあるかを判定する。
ｅ．異なるＣＣが一緒に相互作用する可能性をランク付けする。
２．アレイサイズを判定し、したがって利用可能なプローブ位置の数（ｘ）を判定する。
３．ｘ／４の相互作用を引き出す。
４．各相互作用に対して、パート１から制限部位までの３０ｂｐおよびパート２の制限部位までの３０ｂｐの配列を定義する。それらの領域が反復ではないことを確認し、反復である場合は、除外して次の相互作用をリスト上に書き取る。両方の３０ｂｐを結合してプローブを定義する。
５．ｘ／４プローブ＋定義された対照プローブのリストを作成し、４回複製して、アレイ上に作成されるべきリストを作成する。
６．カスタムＣＧＨアレイ用のＡｇｉｌｅｎｔ Ｓｕｒｅ設計のウェブサイトにプローブのリストをアップロードする。
７．プローブ群を使用して、ＡｇｉｌｅｎｔカスタムＣＧＨアレイを設計する。
アレイ設計
１．遺伝子座を、ＳＩＩソフトウェア（現在はｖ３．２）を使用して次のように処理する。
ａ．これらの特異的な遺伝子座でゲノムの配列を引き出す（５０ｋｂ上流および２０ｋｂ下流の遺伝子配列）。
ｂ．この領域内の配列がＣＣに関与する確率を定義する。
ｃ．特異的なＲＥを使用して配列をカットする。
ｄ．どの制限フラグメントが特定の配向で相互作用する傾向にあるかを判定する。
ｅ．異なるＣＣが一緒に相互作用する可能性をランク付けする。
２．アレイサイズを判定し、したがって利用可能なプローブ位置の数（ｘ）を判定する。
３．ｘ／４の相互作用を引き出す。
４．各相互作用に対して、パート１から制限部位までの３０ｂｐおよびパート２の制限部位までの３０ｂｐの配列を定義する。それらの領域が反復ではないことを確認し、反復である場合は、除外して次の相互作用をリスト上に書き取る。両方の３０ｂｐを結合してプローブを定義する。
５．ｘ／４プローブ＋定義された対照プローブのリストを作成し、４回複製して、アレイ上に作成されるべきリストを作成する。
６．カスタムＣＧＨアレイ用のＡｇｉｌｅｎｔ Ｓｕｒｅ設計のウェブサイトにプローブのリストをアップロードする。
７．プローブ群を使用して、ＡｇｉｌｅｎｔカスタムＣＧＨアレイを設計する。
アレイ処理
１．テンプレート作成にＥｐｉＳｗｉｔｃｈ（商標）標準操作手順（ＳＯＰ）を使用してサンプルを処理する。
２．アレイ処理ラボによってエタノール沈殿でクリーンアップする。
３．Ａｇｉｌｅｎｔ ＳｕｒｅＴａｇ完全ＤＮＡラベリングキット－Ａｇｉｌｅｎｔ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ａｒｒａｙ－ｂａｓｅｄ ＣＧＨ ｆｏｒ Ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｅｎｚｙｍａｔｉｃ ｌａｂｅｌｌｉｎｇ ｆｏｒ Ｂｌｏｏｄ， Ｃｅｌｌｓ ｏｒ Ｔｉｓｓｕｅｓに従ってサンプルを処理する。
４．Ａｇｉｌｅｎｔ特徴抽出ソフトウェアを用いるＡｇｉｌｅｎｔ Ｃスキャナーを使用してスキャンする。
１．テンプレート作成にＥｐｉＳｗｉｔｃｈ（商標）標準操作手順（ＳＯＰ）を使用してサンプルを処理する。
２．アレイ処理ラボによってエタノール沈殿でクリーンアップする。
３．Ａｇｉｌｅｎｔ ＳｕｒｅＴａｇ完全ＤＮＡラベリングキット－Ａｇｉｌｅｎｔ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ａｒｒａｙ－ｂａｓｅｄ ＣＧＨ ｆｏｒ Ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｅｎｚｙｍａｔｉｃ ｌａｂｅｌｌｉｎｇ ｆｏｒ Ｂｌｏｏｄ， Ｃｅｌｌｓ ｏｒ Ｔｉｓｓｕｅｓに従ってサンプルを処理する。
４．Ａｇｉｌｅｎｔ特徴抽出ソフトウェアを用いるＡｇｉｌｅｎｔ Ｃスキャナーを使用してスキャンする。
ＥｐｉＳｗｉｔｃｈ（商標）バイオマーカーのシグネチャは、複雑な疾患表現型の層別化において高いロバスト性、感度、および特異度を実証する。この技術は、エピジェネティクスの科学における最新のブレークスルー、非常に有益なクラスのエピジェネティックバイオマーカーとしての染色体コンフォメーションシグネチャのモニタリングおよび評価を利用する。学術環境で展開されている現在の研究方法論では、ＣＣＳを検出するために、細胞材料の生化学的処理に３～７日を要する。これらの手順は、感度および再現性が制限されており、さらに、設計段階でＥｐｉＳｗｉｔｃｈ（商標）分析パッケージによって提供される標的化された洞察の恩恵を有していない。
ＥｐｉＳｗｉｔｃｈ（商標）アレイのインシリコのマーカー同定
ゲノム全体のＣＣＳ部位は、関連するすべての層別リードバイオマーカーの同定のために試験コホートからの臨床サンプル上のＥｐｉＳｗｉｔｃｈ（商標）アレイによって直接評価される。ＥｐｉＳｗｉｔｃｈ（商標）アレイプラットフォームは、その高いスループット能力、および多数の遺伝子座を迅速にスクリーニングするその能力が要因で、マーカーの同定に使用される。使用したアレイはＡｇｉｌｅｎｔカスタムＣＧＨアレイであったが、これにより、インシリコのソフトウェアで同定されたマーカーを照合することが可能になる。
ゲノム全体のＣＣＳ部位は、関連するすべての層別リードバイオマーカーの同定のために試験コホートからの臨床サンプル上のＥｐｉＳｗｉｔｃｈ（商標）アレイによって直接評価される。ＥｐｉＳｗｉｔｃｈ（商標）アレイプラットフォームは、その高いスループット能力、および多数の遺伝子座を迅速にスクリーニングするその能力が要因で、マーカーの同定に使用される。使用したアレイはＡｇｉｌｅｎｔカスタムＣＧＨアレイであったが、これにより、インシリコのソフトウェアで同定されたマーカーを照合することが可能になる。
ＥｐｉＳｗｉｔｃｈ（商標）ＰＣＲ
その後、ＥｐｉＳｗｉｔｃｈ（商標）アレイによって同定された潜在的なマーカーが、ＥｐｉＳｗｉｔｃｈ（商標）ＰＣＲまたはＤＮＡシーケンサー（すなわち、Ｒｏｃｈｅ ４５４、Ｎａｎｏｐｏｒｅ ＭｉｎＩＯＮなど）のいずれかによって検証される。統計的に有意で、最良の再現性を示す上位のＰＣＲマーカーが、最終的なＥｐｉＳｗｉｔｃｈ（商標）シグネチャセットへのさらなる減少のために選択され、独立したサンプルのコホートで検証される。ＥｐｉＳｗｉｔｃｈ（商標）ＰＣＲは、確立された標準化された操作手順プロトコルに従って、訓練を受けた技術者が実施することができる。すべてのプロトコルおよび試薬の製造は、研究の質およびプロトコルを転送する機能を確かなものとするために、ＩＳＯ １３４８５および９００１認定の下で実施される。ＥｐｉＳｗｉｔｃｈ（商標）ＰＣＲおよびＥｐｉＳｗｉｔｃｈ（商標）アレイバイオマーカープラットフォームは、全血および細胞株の両方の分析と互換性がある。試験は、少量の血液を使用して非常に少ないコピー数で異常を検出するのに十分な感度がある。
その後、ＥｐｉＳｗｉｔｃｈ（商標）アレイによって同定された潜在的なマーカーが、ＥｐｉＳｗｉｔｃｈ（商標）ＰＣＲまたはＤＮＡシーケンサー（すなわち、Ｒｏｃｈｅ ４５４、Ｎａｎｏｐｏｒｅ ＭｉｎＩＯＮなど）のいずれかによって検証される。統計的に有意で、最良の再現性を示す上位のＰＣＲマーカーが、最終的なＥｐｉＳｗｉｔｃｈ（商標）シグネチャセットへのさらなる減少のために選択され、独立したサンプルのコホートで検証される。ＥｐｉＳｗｉｔｃｈ（商標）ＰＣＲは、確立された標準化された操作手順プロトコルに従って、訓練を受けた技術者が実施することができる。すべてのプロトコルおよび試薬の製造は、研究の質およびプロトコルを転送する機能を確かなものとするために、ＩＳＯ １３４８５および９００１認定の下で実施される。ＥｐｉＳｗｉｔｃｈ（商標）ＰＣＲおよびＥｐｉＳｗｉｔｃｈ（商標）アレイバイオマーカープラットフォームは、全血および細胞株の両方の分析と互換性がある。試験は、少量の血液を使用して非常に少ないコピー数で異常を検出するのに十分な感度がある。
本発明の実施形態を示すパラグラフ
１．集団内のサブグループを表す染色体状態を検出するためのプロセスであって、当該プロセスが、その染色体状態に関連する染色体相互作用がゲノムの定義された領域内に存在するか否かを判定する工程を含み；かつ
－ 上記染色体相互作用は、随意に、どの染色体相互作用が集団のサブグループに対応する染色体状態に関連するかを判定する方法によって特定されており、当該方法は、染色体の異なる状態を有するサブグループからの核酸の第１のセットをインデックス核酸の第２のセットと接触させる工程、および相補的配列のハイブリダイズを可能にする工程を含み、第１および核酸の第２のセットにおける核酸は、染色体相互作用で一緒になった両方の染色体領域からの配列を含むライゲートされた産物を表し、核酸の第１のセットと核酸の第２のセットとの間のハイブリダイゼーションのパターンにより、どの染色体相互作用がサブグループに特異的であるかの判定が可能になり、および
－ サブグループは前立腺がんの予後に関連し、染色体相互作用は、
（ｉ）表６にリストされた領域または遺伝子のいずれかに存在する、および／または
（ii）表６に示された任意のプローブによって表された染色体相互作用のいずれかに対応する、および／または
（iii）（ｉ）または（ii）を含むまたはそれに隣接する４，０００塩基領域に存在するか、
または、
－ サブグループはＤＬＢＣＬの予後に関連し、染色体相互作用は、
ａ）表５にリストされた領域または遺伝子のいずれかに存在する、および／または
ｂ）表５に示された任意のプローブによって表された染色体相互作用のいずれかに対応する、および／または
ｃ）（ａ）または（ｂ）を含むまたはそれに隣接する４，０００塩基領域に存在する、プロセス。
１．集団内のサブグループを表す染色体状態を検出するためのプロセスであって、当該プロセスが、その染色体状態に関連する染色体相互作用がゲノムの定義された領域内に存在するか否かを判定する工程を含み；かつ
－ 上記染色体相互作用は、随意に、どの染色体相互作用が集団のサブグループに対応する染色体状態に関連するかを判定する方法によって特定されており、当該方法は、染色体の異なる状態を有するサブグループからの核酸の第１のセットをインデックス核酸の第２のセットと接触させる工程、および相補的配列のハイブリダイズを可能にする工程を含み、第１および核酸の第２のセットにおける核酸は、染色体相互作用で一緒になった両方の染色体領域からの配列を含むライゲートされた産物を表し、核酸の第１のセットと核酸の第２のセットとの間のハイブリダイゼーションのパターンにより、どの染色体相互作用がサブグループに特異的であるかの判定が可能になり、および
－ サブグループは前立腺がんの予後に関連し、染色体相互作用は、
（ｉ）表６にリストされた領域または遺伝子のいずれかに存在する、および／または
（ii）表６に示された任意のプローブによって表された染色体相互作用のいずれかに対応する、および／または
（iii）（ｉ）または（ii）を含むまたはそれに隣接する４，０００塩基領域に存在するか、
または、
－ サブグループはＤＬＢＣＬの予後に関連し、染色体相互作用は、
ａ）表５にリストされた領域または遺伝子のいずれかに存在する、および／または
ｂ）表５に示された任意のプローブによって表された染色体相互作用のいずれかに対応する、および／または
ｃ）（ａ）または（ｂ）を含むまたはそれに隣接する４，０００塩基領域に存在する、プロセス。
２．－ 上記前立腺がんの予後が、癌が侵攻性であるかまたは緩慢性であるかに関連する、および／または
－ 上記ＤＬＢＣＬの予後が生存に関連する
パラグラフ１に記載のプロセス。
－ 上記ＤＬＢＣＬの予後が生存に関連する
パラグラフ１に記載のプロセス。
３．サブグループが前立腺がんに関連し、染色体相互作用の具体的な組み合わせが、
（ｉ）表６のプローブによって表される染色体相互作用のすべてを含むこと、および／または
（ii）表６のプローブによって表される染色体相互作用の少なくとも１、２、３、または４を含むこと、および／または
（iii）表６にリストされる領域または遺伝子の少なくとも１、２、３、または４に一緒に存在するもの、および／または
（iv）分類される染色体相互作用の少なくとも１、２、３、または４が、表６のプローブによって表される染色体相互作用を含むまたはそれに隣接する４，０００塩基領域に存在するもの
に分類される、パラグラフ１または２に記載のプロセス。
（ｉ）表６のプローブによって表される染色体相互作用のすべてを含むこと、および／または
（ii）表６のプローブによって表される染色体相互作用の少なくとも１、２、３、または４を含むこと、および／または
（iii）表６にリストされる領域または遺伝子の少なくとも１、２、３、または４に一緒に存在するもの、および／または
（iv）分類される染色体相互作用の少なくとも１、２、３、または４が、表６のプローブによって表される染色体相互作用を含むまたはそれに隣接する４，０００塩基領域に存在するもの
に分類される、パラグラフ１または２に記載のプロセス。
４．サブグループがＤＬＢＣＬに関連し、染色体相互作用の特異的な組み合わせが、
（ｉ）表５のプローブによって表される染色体相互作用のすべてを含むこと、および／または
（ii）表５のプローブによって表される染色体相互作用の少なくとも１０、２０、３０、５０、または８０を含むこと、および／または
（iii）表５にリストされる領域または遺伝子の少なくとも１０、２０、３０、または５０に一緒に存在するもの、および／または
（iv）分類される染色体相互作用の少なくとも１０、２０、３０、５０、または８０が、表５のプローブによって表される染色体相互作用を含むまたはそれに隣接する４，０００塩基領域に存在するもの
に分類される、パラグラフ１または２に記載のプロセス。
（ｉ）表５のプローブによって表される染色体相互作用のすべてを含むこと、および／または
（ii）表５のプローブによって表される染色体相互作用の少なくとも１０、２０、３０、５０、または８０を含むこと、および／または
（iii）表５にリストされる領域または遺伝子の少なくとも１０、２０、３０、または５０に一緒に存在するもの、および／または
（iv）分類される染色体相互作用の少なくとも１０、２０、３０、５０、または８０が、表５のプローブによって表される染色体相互作用を含むまたはそれに隣接する４，０００塩基領域に存在するもの
に分類される、パラグラフ１または２に記載のプロセス。
５．サブグループがＤＬＢＣＬに関連し、染色体相互作用の特異的な組み合わせが、
（ｉ）表７に示される染色体相互作用のすべてを含むこと、および／または
（ii）表７に示される染色体相互作用の少なくとも１、２、５または８を含むこと
に分類される、パラグラフ１または２に記載のプロセス。
（ｉ）表７に示される染色体相互作用のすべてを含むこと、および／または
（ii）表７に示される染色体相互作用の少なくとも１、２、５または８を含むこと
に分類される、パラグラフ１または２に記載のプロセス。
６．少なくとも１０、２０、３０、４０または５０の染色体相互作用が分類され、好ましくは少なくとも１０の染色体相互作用が分類される
パラグラフ１～５のいずれか１つに記載のプロセス。
パラグラフ１～５のいずれか１つに記載のプロセス。
７．染色体相互作用が、
－ 個体からのサンプルにおいて、および／または
－ 染色体相互作用の部位でのＤＮＡループの有無を検出することによって、および／または
－ 染色体コンフォメーションと一緒になっている染色体の遠位領域の有無を検出することによって、および／または
－ ライゲートされた核酸の存在を検出することによって分類され、ライゲートされた核酸は、上記分類中に生成され、その配列が染色体相互作用において一緒になる染色体の領域に各々対応する２つの領域を含み、ライゲートされた核酸の検出は、好ましくは、
（ｉ）表６に言及される特異的なプローブ配列のいずれかと少なくとも７０％の同一性を有するプローブによる、および／または（ii）表６の任意のプライマー対と少なくとも７０％の同一性を有するプライマー対による、前立腺がんの予後の場合に、または
（ii）表５に言及される特異的なプローブ配列のいずれかと少なくとも７０％の同一性を有するプローブによる、および／または（ｂ）表５の任意のプライマー対と少なくとも７０％の同一性を有するプライマー対による、ＤＬＢＣＬの予後の場合に行われる
パラグラフ１～６のいずれか１つに記載のプロセス。
－ 個体からのサンプルにおいて、および／または
－ 染色体相互作用の部位でのＤＮＡループの有無を検出することによって、および／または
－ 染色体コンフォメーションと一緒になっている染色体の遠位領域の有無を検出することによって、および／または
－ ライゲートされた核酸の存在を検出することによって分類され、ライゲートされた核酸は、上記分類中に生成され、その配列が染色体相互作用において一緒になる染色体の領域に各々対応する２つの領域を含み、ライゲートされた核酸の検出は、好ましくは、
（ｉ）表６に言及される特異的なプローブ配列のいずれかと少なくとも７０％の同一性を有するプローブによる、および／または（ii）表６の任意のプライマー対と少なくとも７０％の同一性を有するプライマー対による、前立腺がんの予後の場合に、または
（ii）表５に言及される特異的なプローブ配列のいずれかと少なくとも７０％の同一性を有するプローブによる、および／または（ｂ）表５の任意のプライマー対と少なくとも７０％の同一性を有するプライマー対による、ＤＬＢＣＬの予後の場合に行われる
パラグラフ１～６のいずれか１つに記載のプロセス。
８．－ 核酸の第２のセットが、核酸の第１のセットよりも大きな個体の群からのものである、および／または
－ 核酸の第１のセットが、少なくとも８の個体からのものである、および／または
－ 核酸の第１のセットが、第１のサブグループからの少なくとも４の個体、および好ましくは第１のサブグループと重複しない第２のサブグループからの少なくとも４の個体からのものである、および／または
－ プロセスが、医療処置のために個体を選択するために実行される
パラグラフ１～７のいずれか１つに記載のプロセス。
－ 核酸の第１のセットが、少なくとも８の個体からのものである、および／または
－ 核酸の第１のセットが、第１のサブグループからの少なくとも４の個体、および好ましくは第１のサブグループと重複しない第２のサブグループからの少なくとも４の個体からのものである、および／または
－ プロセスが、医療処置のために個体を選択するために実行される
パラグラフ１～７のいずれか１つに記載のプロセス。
９．－ 核酸の第２のセットが、選択されていない群を表す、および／または
－ 核酸の第２のセットが、定義された位置でアレイに結合される、および／または
－ 核酸の第２のセットが、少なくとも１００の異なる遺伝子における染色体相互作用を表す、および／または
－ 核酸の第２のセットが、少なくとも１，０００の異なる染色体相互作用を表す少なくとも１，０００の異なる核酸を含む、および／または
－ 核酸の第１のセットおよび核酸の第２のセットが、長さが１０から１００のヌクレオチド塩基を有する少なくとも１００の核酸を含む
パラグラフ１～８のいずれか１つに記載のプロセス。
－ 核酸の第２のセットが、定義された位置でアレイに結合される、および／または
－ 核酸の第２のセットが、少なくとも１００の異なる遺伝子における染色体相互作用を表す、および／または
－ 核酸の第２のセットが、少なくとも１，０００の異なる染色体相互作用を表す少なくとも１，０００の異なる核酸を含む、および／または
－ 核酸の第１のセットおよび核酸の第２のセットが、長さが１０から１００のヌクレオチド塩基を有する少なくとも１００の核酸を含む
パラグラフ１～８のいずれか１つに記載のプロセス。
１０．核酸の第１のセットが、
（ｉ）染色体相互作用で一緒になった染色体領域を架橋する工程と、
（ii）随意に酵素を用いる制限消化切断によって、上記架橋領域を切断にさらす工程と、
（iii）上記架橋された切断されたＤＮＡ末端をライゲートして、（特に、ライゲートされたＤＮＡを含む）核酸の第１のセットを形成する工程と、を含むプロセスで得られる
パラグラフ１～９のいずれか１つに記載のプロセス。
（ｉ）染色体相互作用で一緒になった染色体領域を架橋する工程と、
（ii）随意に酵素を用いる制限消化切断によって、上記架橋領域を切断にさらす工程と、
（iii）上記架橋された切断されたＤＮＡ末端をライゲートして、（特に、ライゲートされたＤＮＡを含む）核酸の第１のセットを形成する工程と、を含むプロセスで得られる
パラグラフ１～９のいずれか１つに記載のプロセス。
１１．ゲノムの上記定義された領域が、
（ｉ）一塩基多型（ＳＮＰ）を含む、および／または
（ii）マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）を発現する、および／または
（iii）非コードＲＮＡ（ｎｃＲＮＡ）を発現する、および／または
（iv）少なくとも１０の連続するアミノ酸残基をコードする核酸配列を発現する、および／または
（ｖ）制御要素を表す、および／または
（vii）ＣＴＣＦ結合部位を含む
パラグラフ１～１０のいずれか１つに記載のプロセス。
（ｉ）一塩基多型（ＳＮＰ）を含む、および／または
（ii）マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）を発現する、および／または
（iii）非コードＲＮＡ（ｎｃＲＮＡ）を発現する、および／または
（iv）少なくとも１０の連続するアミノ酸残基をコードする核酸配列を発現する、および／または
（ｖ）制御要素を表す、および／または
（vii）ＣＴＣＦ結合部位を含む
パラグラフ１～１０のいずれか１つに記載のプロセス。
１２．表６に定義されるような少なくとも５つの染色体相互作用を分類する工程を含む、前立腺がんが侵攻性であるか緩慢性であるかを判定するために実行される、パラグラフ１～１１のいずれか１つに記載のプロセス。
１３．表５に定義されるような少なくとも５つの染色体相互作用を分類する工程を含む、ＤＬＢＬＣの予後を判定するために実行される、パラグラフ１～１２のいずれか１つに記載のプロセス。
１４．－ 好ましくは、上記プロセスは、候補薬剤が、異なるレベルの予後に関連付けられている染色体状態への変化を引き起こすことができるかどうかを検出するために使用され、
－ 染色体相互作用が表６の任意のプローブによって表される、および／または
－ 染色体相互作用が表６にリストされる任意の領域または遺伝子に存在する、
および随意に、
－ 染色体相互作用が、染色体相互作用がパラグラフ１で定義されるような染色体状態に関連していることを判定する方法によって同定される、および／または
－ 染色体相互作用の変化が、（ｉ）表６に言及されるプローブ配列のいずれかと少なくとも７０％の同一性を有するプローブ、および／または（ii）表６の任意のプライマー対と少なくとも７０％の同一性を有するプライマー対によってモニターされる、前立腺がんに対する治療薬を特定または設計するために実行される
パラグラフ１～１３のいずれか１つに記載のプロセス。
－ 染色体相互作用が表６の任意のプローブによって表される、および／または
－ 染色体相互作用が表６にリストされる任意の領域または遺伝子に存在する、
および随意に、
－ 染色体相互作用が、染色体相互作用がパラグラフ１で定義されるような染色体状態に関連していることを判定する方法によって同定される、および／または
－ 染色体相互作用の変化が、（ｉ）表６に言及されるプローブ配列のいずれかと少なくとも７０％の同一性を有するプローブ、および／または（ii）表６の任意のプライマー対と少なくとも７０％の同一性を有するプライマー対によってモニターされる、前立腺がんに対する治療薬を特定または設計するために実行される
パラグラフ１～１３のいずれか１つに記載のプロセス。
１５．－ 好ましくは、上記プロセスは、候補薬剤が、異なるレベルの予後に関連付けられている染色体状態への変化を引き起こすことができるかどうかを検出するために使用され、
－ 染色体相互作用が表５の任意のプローブによって表される、および／または
－ 染色体相互作用が表５にリストされる任意の領域または遺伝子に存在する、
および随意に、
－ 染色体相互作用が、染色体相互作用がパラグラフ１で定義されるような染色体状態に関連していることを判定する方法によって同定される、および／または
－ 染色体相互作用の変化が、（ｉ）表５に言及されるプローブ配列のいずれかと少なくとも７０％の同一性を有するプローブ、および／または（ii）表５の任意のプライマー対と少なくとも７０％の同一性を有するプライマー対によってモニターされる、ＤＬＢＣＬに対する治療薬を特定または設計するために実行される
パラグラフ１～１３のいずれか１つに記載のプロセス。
－ 染色体相互作用が表５の任意のプローブによって表される、および／または
－ 染色体相互作用が表５にリストされる任意の領域または遺伝子に存在する、
および随意に、
－ 染色体相互作用が、染色体相互作用がパラグラフ１で定義されるような染色体状態に関連していることを判定する方法によって同定される、および／または
－ 染色体相互作用の変化が、（ｉ）表５に言及されるプローブ配列のいずれかと少なくとも７０％の同一性を有するプローブ、および／または（ii）表５の任意のプライマー対と少なくとも７０％の同一性を有するプライマー対によってモニターされる、ＤＬＢＣＬに対する治療薬を特定または設計するために実行される
パラグラフ１～１３のいずれか１つに記載のプロセス。
１６．染色体相互作用の検出に基づいて標的を選択する工程、および好ましくは標的のモジュレータをスクリーニングして免疫療法のための治療薬を特定する工程を含み、上記標的が随意にタンパク質である、パラグラフ１４または１５に記載のプロセス。
１７．分類または検出が、ライゲートされた産物を増幅することができるプライマーおよびＰＣＲ反応中にライゲートされた部位に結合するプローブを使用する定量ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）によるライゲートされた産物の特異的検出を含み、上記プローブが、染色体相互作用で一緒になった染色体領域の各々からの配列に相補的な配列を含み、好ましくは、上記プローブが、
上記ライゲートされた産物に特異的に結合するオリゴヌクレオチド、および／または
オリゴヌクレオチドの５’末端に共有結合したフルオロフォア、および／または
オリゴヌクレオチドの３’末端に共有結合した消光剤を含み、および
随意に、上記フルオロフォアが、ＨＥＸ、Ｔｅｘａｓ ＲｅｄおよびＦＡＭから選択される、および／または
上記プローブが、１０から４０のヌクレオチド塩基の長さ、好ましくは２０から３０のヌクレオチド塩基の長さの核酸配列を含む、パラグラフ１～１６のいずれか１つに記載のプロセス。
上記ライゲートされた産物に特異的に結合するオリゴヌクレオチド、および／または
オリゴヌクレオチドの５’末端に共有結合したフルオロフォア、および／または
オリゴヌクレオチドの３’末端に共有結合した消光剤を含み、および
随意に、上記フルオロフォアが、ＨＥＸ、Ｔｅｘａｓ ＲｅｄおよびＦＡＭから選択される、および／または
上記プローブが、１０から４０のヌクレオチド塩基の長さ、好ましくは２０から３０のヌクレオチド塩基の長さの核酸配列を含む、パラグラフ１～１６のいずれか１つに記載のプロセス。
１８．－ プロセスの結果がレポートで提供される、および／または
－ プロセスの結果が、患者の治療スケジュールを選択するために使用される、および好ましくは個体のための特定の治療法を選択するために使用される
パラグラフ１～１７のいずれか１つに記載のプロセス。
－ プロセスの結果が、患者の治療スケジュールを選択するために使用される、および好ましくは個体のための特定の治療法を選択するために使用される
パラグラフ１～１７のいずれか１つに記載のプロセス。
１９．パラグラフ１～１３および１７のいずれか１つに記載のプロセスによって個体の前立腺がんまたはＤＬＢＣＬを処置する方法で使用するための治療薬であって、個体が治療薬を必要としていると特定されている、治療薬。
本発明は、以下の実施例によって例示される。
実施例１
ＥｐｉＳｗｉｔｃｈ（商標）（染色体コンフォメーションシグネチャ）マーカーの使用
一次的および二次的な患部組織との高い一致および強力な検証結果を有する、非常に普及しているＥｐｉＳｗｉｔｃｈ（商標）マーカーを一貫して観察してきた。ＥｐｉＳｗｉｔｃｈ（商標）バイオマーカーシグネチャは、複雑な疾患表現型の層別化において高いロバスト性、感度、および特異度を実証している。
実施例１
ＥｐｉＳｗｉｔｃｈ（商標）（染色体コンフォメーションシグネチャ）マーカーの使用
一次的および二次的な患部組織との高い一致および強力な検証結果を有する、非常に普及しているＥｐｉＳｗｉｔｃｈ（商標）マーカーを一貫して観察してきた。ＥｐｉＳｗｉｔｃｈ（商標）バイオマーカーシグネチャは、複雑な疾患表現型の層別化において高いロバスト性、感度、および特異度を実証している。
ＥｐｉＳｗｉｔｃｈ（商標）技術は、非常に効果的なスクリーニング手段、早期検出、コンパニオン診断、異常で応答性の高い遺伝子発現に関連付けられた主要な疾患のモニターおよび予後分析をもたらす。ＯＢＤアプローチの主な利点は、非侵襲的で、迅速であり、不安定なタンパク質／ＲＮＡ分子よりもむしろ、染色体シグネチャの一部としての高度に安定したＤＮＡベースの標的に依存していることである。
ＣＣＳは、エピジェネティックな制御および細胞の全ゲノムにわたる遺伝情報へのアクセスの安定した制御フレームワークを形成する。ＣＣＳの変化は、その結果が明らかな異常として自ずと現れるよりかなり前の制御のモードおよび遺伝子発現の初期の変化を反映している。ＣＣＳの簡単な考え方は、ＤＮＡの異なる離れた制御部分が互いに近接して相互の機能に影響を与えるトポロジカルな配置であるということである。これらの接続は、ランダムに行われるわけではなく、高度に制御され、有意なバイオマーカーの層別化力を有する高レベルの制御メカニズムとして十分に認識されている。
前立腺がんの予後の層別化
マーカーは、クラスＩ（低リスク、緩慢性）、クラスＩＩ（中程度）、およびクラスＩＩＩ（侵攻性の高リスク）の遡及的アノテーションに基づいて開発された。マーカーは、健常対照に対する患者のロバストな分類を示し、クラスを区別する。サンプルは英国からのものであった。
マーカーは、クラスＩ（低リスク、緩慢性）、クラスＩＩ（中程度）、およびクラスＩＩＩ（侵攻性の高リスク）の遡及的アノテーションに基づいて開発された。マーカーは、健常対照に対する患者のロバストな分類を示し、クラスを区別する。サンプルは英国からのものであった。
前立腺がん患者の血液と健常対照者の血液とを区別することができるＥｐｉＳｗｉｔｃｈ（商標）バイオマーカーの同定
最初に、カスタムＥｐｉＳｗｉｔｃｈ（商標）マイクロアレイの研究を用い、８人の前立腺がん（ＰＣａ）および８人の対照の個体を区別するために、４２５の遺伝子座にわたって～１５，０００の潜在的なＣＣＳを同定およびスクリーニングした。統計的に有意な上位のマーカーを、ネステッドＰＣＲアッセイに転移し、２４個のＰＣａおよび２５個の健常対照のサンプルのより大きなサンプルコホートでスクリーニングした。それぞれ、１００％（９５％ＣＩ－８６．２％～１００％）および１００％（９５％ＣＩ－８６．７％～１００％）の感度および特異度を有するＰＣａおよび対照サンプルを分類したマイクロアレイから転移された上位５のＣＣＳを使用して、分類子を開発した。
最初に、カスタムＥｐｉＳｗｉｔｃｈ（商標）マイクロアレイの研究を用い、８人の前立腺がん（ＰＣａ）および８人の対照の個体を区別するために、４２５の遺伝子座にわたって～１５，０００の潜在的なＣＣＳを同定およびスクリーニングした。統計的に有意な上位のマーカーを、ネステッドＰＣＲアッセイに転移し、２４個のＰＣａおよび２５個の健常対照のサンプルのより大きなサンプルコホートでスクリーニングした。それぞれ、１００％（９５％ＣＩ－８６．２％～１００％）および１００％（９５％ＣＩ－８６．７％～１００％）の感度および特異度を有するＰＣａおよび対照サンプルを分類したマイクロアレイから転移された上位５のＣＣＳを使用して、分類子を開発した。
図１は、開発サンプルコホートの４９個のサンプルに対する上位５のマーカーの主成分分析を示している。
診断分類子を使用して、８３％の精度で２４個のＰＣａおよび５個の健常対照のサンプルからなる追加の盲検化された独立したコホート（ｎ＝２９）を分類した。ＥｐｉＳｗｉｔｃｈ（商標）前立腺がんアッセイのさらなる開発を、９５個のＰＣａおよび９７個の対照の追加のサンプルコホート（ｎ＝１９２）を用いて実施した。これは、２０個のサンプル（１０個のＰＣａ、１０個の対照）の盲検サンプルコホートで検証された。この検証の結果は表１に示される。
ＰＣＡプログラムの最新のプロジェクトでは、加水分解プローブベースのリアルタイム定量ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）を利用したＰＣａ診断用の代替ＰＣＲフォーマットを開発した。６－マーカーモデルの性能は表２に示される。
概要
さまざまな病期の米国および英国のサンプルを使用する、ＰＣａ診断プログラム中に開発されたＥｐｉＳｗｉｔｃｈ（商標）ＰＣａ診断シグネチャの３つの独立した盲検化された検証により、前立腺がんの診断に関して＞８０％の感度および特異度が達成される。ＰＣａを検出するためのゴールドスタンダードの臨床アッセイである前立腺特異抗原（ＰＳＡ）血液検査は、それ自体が他のさまざまな変数に依存しており、典型的に、３２～６８％の感度および特異度の範囲を有する。さらに、並行研究トラックにより、結果として、ＰＣＡと診断された個々の患者に対する臨床管理および治療選択を支援するために前立腺がんの予後を評価するＥｐｉＳｗｉｔｃｈ（商標）アッセイが開発された。
さまざまな病期の米国および英国のサンプルを使用する、ＰＣａ診断プログラム中に開発されたＥｐｉＳｗｉｔｃｈ（商標）ＰＣａ診断シグネチャの３つの独立した盲検化された検証により、前立腺がんの診断に関して＞８０％の感度および特異度が達成される。ＰＣａを検出するためのゴールドスタンダードの臨床アッセイである前立腺特異抗原（ＰＳＡ）血液検査は、それ自体が他のさまざまな変数に依存しており、典型的に、３２～６８％の感度および特異度の範囲を有する。さらに、並行研究トラックにより、結果として、ＰＣＡと診断された個々の患者に対する臨床管理および治療選択を支援するために前立腺がんの予後を評価するＥｐｉＳｗｉｔｃｈ（商標）アッセイが開発された。
追加のカスタムＥｐｉＳｗｉｔｃｈマイクロアレイの研究を、８人の侵攻性の前立腺がん患者（クラス３）と８人の緩慢性ＰＣａ患者（クラス１）とを区別するために、４２６の遺伝子座にわたって～１５，０００の潜在的なＣＣＳを同定およびスクリーニングするために実施した。ＰＣａクラスの説明は添付で見ることができる。統計的に有意な上位のマーカーを、ネステッドＰＣＲアッセイに転移し、４２個のクラス１、２５個のクラス２および１９個のクラス３のＰＣａのサンプルのより大きなサンプルコホートでスクリーニングした。
統計的に有意な上位６個のマーカーを使用して、クラス１（低リスク）およびクラス３（高リスク）のＰＣａを分類するための予後分類子を開発した。４２個のクラス１および２５個のクラス３のサンプルの独立したサンプルコホート（ｎ＝２７）での分類子の性能は表３に示される。
代替の分析では、クラス２とクラス３のＰＣａ間で層別化されたさらなる６個のマーカーが見つかった。２つの分類子は２つのマーカーを共有し、各分類子も４つの固有のマーカーを有している。
図２は、２つのＰＣＡ予後分類子のＶＥＮＮ比較を示す。
クラス２ ｖｓ クラス３のＰＣａ分類子の性能は表４に示される。
結論
診断および予後のバイオマーカーの開発は、複数の臨床サンプルコホートで達成した。実施したすべてのマーカーのスクリーニングおよび選択は、健常対照に対する前立腺がんのさまざまな病期（病期１～３）の患者（診断的用途）の他に、緩慢性の、低リスクのカテゴリ１の前立腺がんに対する、侵攻性の、高リスクのカテゴリ３の患者（予後的用途）、または中リスクのカテゴリ２の患者において染色体コンフォメーションシグネチャを介してモニターされた全身性の、血液ベースのエピジェネティックな変化に基づいていた。
診断および予後のバイオマーカーの開発は、複数の臨床サンプルコホートで達成した。実施したすべてのマーカーのスクリーニングおよび選択は、健常対照に対する前立腺がんのさまざまな病期（病期１～３）の患者（診断的用途）の他に、緩慢性の、低リスクのカテゴリ１の前立腺がんに対する、侵攻性の、高リスクのカテゴリ３の患者（予後的用途）、または中リスクのカテゴリ２の患者において染色体コンフォメーションシグネチャを介してモニターされた全身性の、血液ベースのエピジェネティックな変化に基づいていた。
ＰＣａ対健常対照に関する層別化開発の結果は、試験コホートおよび一連の盲検化検証で最大＞８０％の感度および特異度を示した。高リスクのカテゴリ３対低リスクのカテゴリ１のＰＣａの層別化が、最大６７個のサンプルのコホートで最大８０％の感度および最大９２％の特異度を示した一方で、高リスクのカテゴリ３対中リスクのカテゴリ２の層別化は、最大４４個のサンプルのコホートで最大８４％の感度および最大８８％の特異度を示した。
添付
低リスク－カテゴリ１
限局性前立腺がんは、以下の場合に低リスクとして分類される：
ＰＳＡレベルが１ｍｌあたり１０ｎｇ未満である、および
グリーソンスコアが６以下である、および
ＴステージがＴ１とＴ２ａとの間である。
低リスク－カテゴリ１
限局性前立腺がんは、以下の場合に低リスクとして分類される：
ＰＳＡレベルが１ｍｌあたり１０ｎｇ未満である、および
グリーソンスコアが６以下である、および
ＴステージがＴ１とＴ２ａとの間である。
中リスク－カテゴリ２
限局性前立腺がんは、以下の少なくとも１つである場合に中リスクとして分類される：
ＰＳＡレベルが１０～２０ｎｇ／ｍｌである、
グリーソンスコアが７である、
ＴステージがＴ２ｂである。
限局性前立腺がんは、以下の少なくとも１つである場合に中リスクとして分類される：
ＰＳＡレベルが１０～２０ｎｇ／ｍｌである、
グリーソンスコアが７である、
ＴステージがＴ２ｂである。
高リスク－カテゴリ３
限局性前立腺がんは、以下の少なくとも１つである場合に高リスクとして分類される：
ＰＳＡレベルが２０ｎｇ／ｍｌ以上である、
グリーソンスコアが８から１０の間である、
ＴステージがＴ２ｃ、Ｔ３またはＴ４である。
限局性前立腺がんは、以下の少なくとも１つである場合に高リスクとして分類される：
ＰＳＡレベルが２０ｎｇ／ｍｌ以上である、
グリーソンスコアが８から１０の間である、
ＴステージがＴ２ｃ、Ｔ３またはＴ４である。
癌がＴ３またはＴ４ステージである場合、これは、前立腺の外側の線維性被覆（カプセル）を突き破ったことを意味するため、局所進行性前立腺がんとして分類される。
実施例２．ＤＬＢＣＬに対するマーカーの同定
概要
これは、続く治療（すなわち、Ｒ－ＣＨＯＰ）の選択のための予後不良および予後良好の患者の主要な群の同定に関連している。バイオマーカーは、遡及的全生存期間に基づいて開発されてきた。通常、患者は、ＡＢＣ（予後不良）またはＧＣＢ（予後良）などの疾患サブタイプに従って、ＮａｎｏｓｔｒｉｎｇやＦｌｕｉｄｉｇｍのような生検ベースの遺伝子発現基準によって分類される。しかし、すべての患者をＡＢＣまたはＧＣＢ（いわゆる、タイプＩＩＩ、または未分類の患者）として分類することができたわけではない。ＡＢＣまたはＧＣＢの標準分類に関係なく、治療前のベースラインでの生存の予後に対する分類を提供するバイオマーカーを同定した。
概要
これは、続く治療（すなわち、Ｒ－ＣＨＯＰ）の選択のための予後不良および予後良好の患者の主要な群の同定に関連している。バイオマーカーは、遡及的全生存期間に基づいて開発されてきた。通常、患者は、ＡＢＣ（予後不良）またはＧＣＢ（予後良）などの疾患サブタイプに従って、ＮａｎｏｓｔｒｉｎｇやＦｌｕｉｄｉｇｍのような生検ベースの遺伝子発現基準によって分類される。しかし、すべての患者をＡＢＣまたはＧＣＢ（いわゆる、タイプＩＩＩ、または未分類の患者）として分類することができたわけではない。ＡＢＣまたはＧＣＢの標準分類に関係なく、治療前のベースラインでの生存の予後に対する分類を提供するバイオマーカーを同定した。
マーカーの同定
ＤＬＢＣＬは、患者の生存率に明確な違いを示し（予後不良 ｖｓ 予後良好）、サブタイプへの多数の分子の読み出しを特徴とする。さまざまなサブタイプも現在の臨床診療で異なって扱われている。これには、例えば、化学療法に対するリツキシマブおよびＣＨＯＰの併用が含まれる。さまざまなアプローチが存在する。
ＤＬＢＣＬは、患者の生存率に明確な違いを示し（予後不良 ｖｓ 予後良好）、サブタイプへの多数の分子の読み出しを特徴とする。さまざまなサブタイプも現在の臨床診療で異なって扱われている。これには、例えば、化学療法に対するリツキシマブおよびＣＨＯＰの併用が含まれる。さまざまなアプローチが存在する。
現在実施されている分子の読み出しは、直接生検によって得られた生物学的材料に対して実施される、アレイによる遺伝子発現プロファイリングに基づいている。それらには、極端なタイプのＡＢＣおよびＧＣＢに対するＮａｎｏｓｔｒｉｎｇおよびＦｌｕｉｄｉｇｍのアレイベースの試験が含まれる。ＡＮＣサブタイプは通常、予後不良と関連している。すべての患者がＡＢＣまたはＧＣＢとして分類することができたわけではなく、確立された遺伝子発現プロファイルおよび生存不良の予後との任意の関連性に関して、多数の患者が未分類（またはタイプＩＩＩ）のままである。他のモダリティによる転写遺伝子発現プロファイリングに関係なく、予後不良対予後良好の患者を直接分類する全身バイオマーカーを構築した。
工程１：Ｅｐｉｓｗｉｔｃｈスクリーニングアレイを使用して、ＤＬＢＣＬに対する生存の予後不良および予後良好を表す細胞株の群のエピジェネティックプロファイルを比較した。これにより、アレイベースのマーカーの同定、およびＰＣＲフォーマットでの同じ標的に対して使用するネステッドＰＣＲプライマーの設計が可能になる。
工程２：既知の遡及的生存アノテーションを有する５７～５８人の未分類のＤＬＢＣＬ患者からのベースライン血液サンプルで読み取られた上位１０のネステッドＰＣＲベースのマーカーを使用した。表６は、マーカー、最終的なシグネチャ、および分類子モデルによるパフォーマンスに対する詳細を提供している。
研究では、どのようにベースラインが、臨床生存データと比較して予後不良／良好のこれらの患者に対して呼び出しするかを示している。これはハザード比のＣｏｘ推定値であり、すなわち、予後不良へのベースライン分類は、特定の値＞１を有して、臨床事後アノテーションによる予後良好グループよりもむしろ、予後不良生存グループに属する確率が高いことを示している。後者は、試設計の臨床チームにとって特に価値があり、関心がある。
詳細な論評
びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）は、成人で最も一般的なタイプの非ホジキンリンパ腫である。これは、青年期から老年期の間でいつでも発生しかねず、米国では毎年１０万人あたり７～８人が罹患しているが、発症率は年齢とともに増加する。遺伝子発現プロファイリングにより、胚中心Ｂ細胞様（ＧＣＢ）および活性化Ｂ細胞様（ＡＢＣ）というＤＬＢＣＬの２つの主要なタイプが明らかになった。ＧＣＢ ＤＬＢＣＬは、二次リンパ器官、例えばリンパ節から発生し、ここで、ナイーブＢ細胞は感染が解消された後に分裂を停止しない。ＡＢＣ ＤＬＢＣＬは、胚中心を離れて形質細胞、すなわち形質芽細胞Ｂ細胞になる準備ができているＢ細胞のサブセットで始まると考えられているが、現実は、Ｂ細胞のライフサイクル全体を通じてさまざまな形態のＤＬＢＣＬが発生するため、より複雑である。
びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）は、成人で最も一般的なタイプの非ホジキンリンパ腫である。これは、青年期から老年期の間でいつでも発生しかねず、米国では毎年１０万人あたり７～８人が罹患しているが、発症率は年齢とともに増加する。遺伝子発現プロファイリングにより、胚中心Ｂ細胞様（ＧＣＢ）および活性化Ｂ細胞様（ＡＢＣ）というＤＬＢＣＬの２つの主要なタイプが明らかになった。ＧＣＢ ＤＬＢＣＬは、二次リンパ器官、例えばリンパ節から発生し、ここで、ナイーブＢ細胞は感染が解消された後に分裂を停止しない。ＡＢＣ ＤＬＢＣＬは、胚中心を離れて形質細胞、すなわち形質芽細胞Ｂ細胞になる準備ができているＢ細胞のサブセットで始まると考えられているが、現実は、Ｂ細胞のライフサイクル全体を通じてさまざまな形態のＤＬＢＣＬが発生するため、より複雑である。
異なるサブタイプはさまざまな予後を有し、ＧＣＢ ＤＬＢＣＬに関しては５年生存率は６０％であるが、ＡＢＣ ＤＬＢＣＬに関しては５年生存率はわずか３５％である。サブタイプの各々は遺伝子発現の違いを特徴としている。ＧＣＢ ＤＬＢＣＬでは、転写抑制因子ＢＣＬ６はしばしば過剰発現されるが、ＡＢＣ ＤＬＢＣＬでは、ＮＦ－κＢ経路はしばしば構成的に活性化されることがわかる。現在あまりよく理解されていないタイプＩＩＩと呼び出しされるＤＬＢＣＬの第３のタイプもあるが、これは２つの主要なタイプ間に位置する遺伝子発現プロファイルを有していると考えられている。
現在の診断方法には、罹患したリンパ節の切除生検とそれに続く免疫組織化学的検査（ＩＨＣ）が含まれる。現在、ＤＬＢＣＬの治療手順はサブタイプに関係なく同じである。さまざまなサブタイプの病因、治療反応、および結果は大きく異なるため、差別化された治療戦略の開発を支援するために、サブタイプを区別するためのロバストで非侵襲的なアッセイを開発する必要性がまだある。ＤＬＢＣＬに対する予測および予後バイオマーカーを見つけるために多くの研究が行われてきたが、サブタイプを区別するために使用することができる単一の試験に対するコンセンサスはない。
ＤＬＢＣＬ患者の血液中のＤＬＢＣＬの異なるサブタイプを区別することができるＥｐｉＳｗｉｔｃｈ（商標）バイオマーカーを同定する
ＥｐｉＳｗｉｔｃｈ（商標）アレイプラットフォームを使用して、ＤＬＢＣＬ細胞株および血液サンプルを調べ、健常対照患者に存在しなかったバイオマーカーを同定してから、３０のＡＢＣ、３０のＧＣＢ、および１０の健常対照サンプルからなる７０の患者コホートでこれらのバイオマーカーを確認した。
ＥｐｉＳｗｉｔｃｈ（商標）アレイプラットフォームを使用して、ＤＬＢＣＬ細胞株および血液サンプルを調べ、健常対照患者に存在しなかったバイオマーカーを同定してから、３０のＡＢＣ、３０のＧＣＢ、および１０の健常対照サンプルからなる７０の患者コホートでこれらのバイオマーカーを確認した。
ＥｐｉＳｗｉｔｃｈ（商標）アレイ
ＥｐｉＳｗｉｔｃｈ（商標）カスタムアレイは、パターン認識ソフトウェアを使用して設計されたプローブを用いて、数千の考えられ得るＣＣＳのスクリーニングを可能にする。ＥｐｉＳｗｉｔｃｈ（商標）技術によってキャプチャされたさまざまな長距離の染色体相互作用は、対象の遺伝子座に課せられたエピジェネティックな制御フレームワークを反映し、これらの遺伝子座の同時制御に寄与するシグナル伝達経路からの個々の異なる入力に対応する。全体として、異なる入力の組み合わせは遺伝子発現を調節する。具体的な生理学的条件下での異常なまたは別個の染色体コンフォメーションシグネチャの同定は、すべての入力シグナルが遺伝子発現プロファイルに統合される前に、調節解除への特異的な寄与のための重要な証拠を提供する。
ＥｐｉＳｗｉｔｃｈ（商標）カスタムアレイは、パターン認識ソフトウェアを使用して設計されたプローブを用いて、数千の考えられ得るＣＣＳのスクリーニングを可能にする。ＥｐｉＳｗｉｔｃｈ（商標）技術によってキャプチャされたさまざまな長距離の染色体相互作用は、対象の遺伝子座に課せられたエピジェネティックな制御フレームワークを反映し、これらの遺伝子座の同時制御に寄与するシグナル伝達経路からの個々の異なる入力に対応する。全体として、異なる入力の組み合わせは遺伝子発現を調節する。具体的な生理学的条件下での異常なまたは別個の染色体コンフォメーションシグネチャの同定は、すべての入力シグナルが遺伝子発現プロファイルに統合される前に、調節解除への特異的な寄与のための重要な証拠を提供する。
いくつかのソースからのデータを使用して、独自のソフトウェアでの分析のために９８の遺伝子座を選択し、１３，３３２の潜在的な染色体コンフォメーションのプローブを試験した。特異的な遺伝子座に１つまたは複数の高次のエピジェネティック染色体コンフォメーションマーカーが存在する、または高次のエピジェネティック染色体コンフォメーションマーカーが存在しない可能性があるため、１つの遺伝子座を見ることは１つのマーカーを見ることと等しいわけではない。製造後、ＤＬＢＣＬ患者および健常対照からの細胞株および血液サンプルを、ＥｐｉＳｗｉｔｃｈプロトコルを使用して処理し、標識化し、アレイにハイブリダイズした。
診断開発用のサンプル
異なるサブタイプに対応し、サブ分類の信頼性のレベルが異なる１６の細胞株を使用した。最も明確なＡＢＣおよびＧＣＢのサブタイプの細胞株を分析に使用した。さらに、４人のＤＬＢＣＬ患者および１１人の健常対照からの血液サンプルを使用した。パート１でのバイオマーカーの同定後、３０のＡＢＣおよび３０のＧＣＢの血液サンプルからなる６０個のサンプルを、ＯＢＤに提供し、Ｆｌｕｉｄｉｇｍ試験によって十分に特徴付け、ＯＢＤによって提供された１０個の健常対照サンプルを補足した。
異なるサブタイプに対応し、サブ分類の信頼性のレベルが異なる１６の細胞株を使用した。最も明確なＡＢＣおよびＧＣＢのサブタイプの細胞株を分析に使用した。さらに、４人のＤＬＢＣＬ患者および１１人の健常対照からの血液サンプルを使用した。パート１でのバイオマーカーの同定後、３０のＡＢＣおよび３０のＧＣＢの血液サンプルからなる６０個のサンプルを、ＯＢＤに提供し、Ｆｌｕｉｄｉｇｍ試験によって十分に特徴付け、ＯＢＤによって提供された１０個の健常対照サンプルを補足した。
結果
アレイ分析
マイクロアレイからの７２の染色体シグネチャ部位を、以下の２つの基準に基づいてスクリーニングするように選択した。
・ＡＢＣ細胞とＧＣＢ細胞との間で層別化するそれらの能力（ｈｉｇｈＡＢＣ＿ｈｉｇｈＧＣＢ）、および／または
・低いＣＶ値（５つのアレイの中央値が分析された、高いＡＢＣ対高いＧＣＢ、ＤＬＢＣＬ１対健常対照、ＤＬＢＣＬ２対健常対照、ＤＬＢＣＬ３対健常対照およびＤＬＢＣＬ４対健常対照）
アレイ分析
マイクロアレイからの７２の染色体シグネチャ部位を、以下の２つの基準に基づいてスクリーニングするように選択した。
・ＡＢＣ細胞とＧＣＢ細胞との間で層別化するそれらの能力（ｈｉｇｈＡＢＣ＿ｈｉｇｈＧＣＢ）、および／または
・低いＣＶ値（５つのアレイの中央値が分析された、高いＡＢＣ対高いＧＣＢ、ＤＬＢＣＬ１対健常対照、ＤＬＢＣＬ２対健常対照、ＤＬＢＣＬ３対健常対照およびＤＬＢＣＬ４対健常対照）
アレイのＥｐｉＳｗｉｔｃｈ（商標）ＰＣＲプラットフォームへの変換
アレイからの対象のプローブを囲む配列の分析後、染色体シグネチャ部位を照合するために６９セットのプライマーを設計した。これらを、その後、プールされたＤＬＢＣＬ血液サンプル上で試験し、これらのうち４９がアッセイで使用するためのＰＣＲ産物に対するＯＢＤ基準を満たしていた。
アレイからの対象のプローブを囲む配列の分析後、染色体シグネチャ部位を照合するために６９セットのプライマーを設計した。これらを、その後、プールされたＤＬＢＣＬ血液サンプル上で試験し、これらのうち４９がアッセイで使用するためのＰＣＲ産物に対するＯＢＤ基準を満たしていた。
これらの４９の潜在的なマーカーの各々を、その後、６つのＤＬＢＣＬ細胞株上で試験し、そのうちの３つはＡＢＣであり、３つはＧＣＢであった。使用した細胞株は、複数の異なる同定方法を使用して同じ分類が見つけられたため、最も信頼のあったもの、ＡＢＣまたはＧＣＢであった。これにより、ＡＢＣおよびＧＣＢの細胞のサブタイプを区別するのに最も有用なマーカーを選択することが可能になった。ＰＣＲプラットフォームで使用するために２８のＥｐｉＳｗｉｔｃｈ（商標）マーカーを同定し、これらはＥｐｉＳｗｉｔｃｈ（商標）マイクロアレイの結果と一致していた。さらに、潜在的なマーカーを、４人のＤＬＢＣＬ患者に対しても試験し、健常対照をプールして、ＤＬＢＣＬ患者には存在するが、健常対照には存在しないものを同定した。２８のＥｐｉＳｗｉｔｃｈ（商標）マーカーのうち２１は、健常対照サンプルには存在しなかったが、ＤＬＢＣＬのマーカーとして、またサブ分類に使用することができるように、ＤＬＢＣＬサンプルには存在していた。
サンプル試験
ＥｐｉＳｗｉｔｃｈ（商標）ＰＣＲプラットフォームにうまく変換された２１のマーカーを、その後、７０の患者の血液サンプルコホート間で試験した。最初に、各マーカーを、６つの新しいＡＢＣサンプル、および６つの新しいＧＣＢサンプルで試験し、２１のマーカーセットは１０のマーカーに絞り込まれ、これは最大の違いを示した。これらの１０のマーカーを、その後、残りの２４のＡＢＣ、２４のＧＣＢ、および１０の健常対照サンプルで試験した。
ＥｐｉＳｗｉｔｃｈ（商標）ＰＣＲプラットフォームにうまく変換された２１のマーカーを、その後、７０の患者の血液サンプルコホート間で試験した。最初に、各マーカーを、６つの新しいＡＢＣサンプル、および６つの新しいＧＣＢサンプルで試験し、２１のマーカーセットは１０のマーカーに絞り込まれ、これは最大の違いを示した。これらの１０のマーカーを、その後、残りの２４のＡＢＣ、２４のＧＣＢ、および１０の健常対照サンプルで試験した。
マーカーの各々を、その後、サブグループを区別するその能力、他のマーカーとのその共線性、およびまた健常をＤＬＢＣＬと区別するその能力の分析にさらした。可能な限り最大の情報を提供したマーカーの６つのサブセットを同定し、これらは、ＡＮＸＡ１１ ＩＦＮＡＲ、ＭＡＰ３Ｋ７、ＭＥＦ２Ｂ、ＮＦＡＴｃ１、およびＴＮＦＲＳ１３Ｃの遺伝子座におけるマーカーである。図３は、ＰＣＡプロット上のサンプルの異なる群を区別するこれらのマーカーの能力を示している。この６マーカーパネルは、健常対照患者をＤＬＢＣＬ患者と明確に区別することができ、これはＤＬＢＣＬに対する血液ベースのアッセイの重要な特徴である。
図３は、６つのＥｐｉＳｗｉｔｃｈ（商標）マーカーバイナリデータに基づく６０人のＤＬＢＣＬおよび１０人の健常な患者のＰＣＡプロットを示している。サンプルは、ＦｌｕｉｄｉｇｍデータによってＡＢＣサブタイプまたはＧＣＢサブタイプとして特徴付けられ、健常対照も示されている。
分類：ＤＬＢＣＬ患者コホート（６０のサンプル）内のＡＢＣおよびＧＣＢのサブタイプの同定
分類を、５倍の交差検証を用いるロジスティック回帰分類子を使用して実施し、次の結果が達成された。交差検証では次の結果が達成された：
ＡＢＣサブタイプ ８３．３％（９５％ＣＩ－６５．３％～９４．３％）
ＧＣＢサブタイプ ８３．３％（９５％ＣＩ－６５．３％～９４．３％）
分類を、５倍の交差検証を用いるロジスティック回帰分類子を使用して実施し、次の結果が達成された。交差検証では次の結果が達成された：
ＡＢＣサブタイプ ８３．３％（９５％ＣＩ－６５．３％～９４．３％）
ＧＣＢサブタイプ ８３．３％（９５％ＣＩ－６５．３％～９４．３％）
さらに、結果として得た６マーカーのロジスティック分類子モデルを、６０人の患者のデータセットの５０の順列で試験した。データを毎回ランダム化し、精度統計をＲＯＣ曲線を使用して計算した。０．８０２の曲線下面積（ＡＵＣ）およびｐ値０．０００００３７（Ｈ０＝「ＡＵＣは０．５に等しい」）は、モデルが正確であり効率的に実施されていることを示している。
結論
この研究では、困難な臨床的質問、特にＤＬＢＣＬのＡＢＣサブタイプとＧＣＢサブタイプの区別に対する返答を提供するＥｐｉＳｗｉｔｃｈ（商標）技術の力を実証した。ハイスループットアレイ法、およびシンプルで費用効果の高いＰＣＲプラットフォームへの変換を使用して、１３，０００を超える潜在的なＣＣＳを試験し、ＤＬＢＣＬサブタイプを区別するための６マーカーパネルに改良した。このパネルは、ＤＬＢＣＬ患者を健常対照と区別することができ、８３．３％の確率でサブタイプを正確に予測することができた。この試験では、ＥｐｉＳｗｉｔｃｈ（商標）（全血ベース）、ＬＰＳ（起源の細胞、組織）、およびＦｌｕｉｄｉｇｍ（起源の細胞、組織）の間のクラス割り当てについても８０％を超える一致があった。
この研究では、困難な臨床的質問、特にＤＬＢＣＬのＡＢＣサブタイプとＧＣＢサブタイプの区別に対する返答を提供するＥｐｉＳｗｉｔｃｈ（商標）技術の力を実証した。ハイスループットアレイ法、およびシンプルで費用効果の高いＰＣＲプラットフォームへの変換を使用して、１３，０００を超える潜在的なＣＣＳを試験し、ＤＬＢＣＬサブタイプを区別するための６マーカーパネルに改良した。このパネルは、ＤＬＢＣＬ患者を健常対照と区別することができ、８３．３％の確率でサブタイプを正確に予測することができた。この試験では、ＥｐｉＳｗｉｔｃｈ（商標）（全血ベース）、ＬＰＳ（起源の細胞、組織）、およびＦｌｕｉｄｉｇｍ（起源の細胞、組織）の間のクラス割り当てについても８０％を超える一致があった。
ＥｐｉＳｗｉｔｃｈ（商標）技術は、長距離の遺伝子間相互作用の変化、つまり染色体コンフォメーションシグネチャを検出し、これは結果として、疾患の病因に関与する重要な遺伝子のエピジェネティックな状態および発現モードの調節の変化につながる。ＥｐｉＳｗｉｔｃｈ（商標）技術に基づく診断手順は、他のラボに移すことができるシンプルで迅速な手法である。この試験は、いくつかの分子生物学反応と、それに続くネステッドＰＣＲによる検出で構成されている。この試験は、複雑な手順を必要とせず、ＰＣＲベースのアッセイを実行する任意のラボで実施することができる。
実施例３
イヌに関してさらなる研究を実施した。１つの目的は、リンパ腫の疑いのある初期診断を支援するためのマーカーを調査して、フォローアップ生検を実施するための要件について獣医に通知することであった。この研究では、上位７５のＥｐｉＳｗｉｔｃｈマイクロアレイのＤＬＢＣＬマーカー（前に同定した）を、ヒトゲノムビルド（Ｇｒｃｈ３７）から現在のイヌのゲノムに変換する。合計３８のイヌのサンプル（リンパ腫の可能性のある１９人の患者と１９の一致した対照サンプルからなる）を、すべての７５のＤＬＢＣＬマーカーを使用してスクリーニングした。この研究を実行するために、以下を実施した：
－ （特異的な遺伝子に関連付けられた）７５のヒトＤＬＢＣＬマーカーに基づいて、犬ゲノム（ＣａｎＦａｍ３．１）におけるオルソログを同定し、Ｂｉｏｍａｒｔから遺伝子座を抽出した。
－ ＥｐｉＳｗｉｔｃｈ（商標）ソフトウェアを実行して、これらの遺伝子座における潜在的な相互作用を同定した。
－ プライマー設計ソフトウェアおよびその他のフィルタを追加して、リストを調査用に７５のマーカーに減らした。
研究および結果は、図６～１６および表８および９に示される。
イヌに関してさらなる研究を実施した。１つの目的は、リンパ腫の疑いのある初期診断を支援するためのマーカーを調査して、フォローアップ生検を実施するための要件について獣医に通知することであった。この研究では、上位７５のＥｐｉＳｗｉｔｃｈマイクロアレイのＤＬＢＣＬマーカー（前に同定した）を、ヒトゲノムビルド（Ｇｒｃｈ３７）から現在のイヌのゲノムに変換する。合計３８のイヌのサンプル（リンパ腫の可能性のある１９人の患者と１９の一致した対照サンプルからなる）を、すべての７５のＤＬＢＣＬマーカーを使用してスクリーニングした。この研究を実行するために、以下を実施した：
－ （特異的な遺伝子に関連付けられた）７５のヒトＤＬＢＣＬマーカーに基づいて、犬ゲノム（ＣａｎＦａｍ３．１）におけるオルソログを同定し、Ｂｉｏｍａｒｔから遺伝子座を抽出した。
－ ＥｐｉＳｗｉｔｃｈ（商標）ソフトウェアを実行して、これらの遺伝子座における潜在的な相互作用を同定した。
－ プライマー設計ソフトウェアおよびその他のフィルタを追加して、リストを調査用に７５のマーカーに減らした。
研究および結果は、図６～１６および表８および９に示される。
実施例４．前立腺がんに関するさらなる研究
前立腺がん（ＰＣａ）に対する現在の診断用血液検査は、初期段階の疾患に対しては信頼性が低く、結果として、良性疾患の男性において不必要な前立腺生検が多数発生し、ＰＣａの男性においては陰性生検の誤った安堵が生まれる。低リスク群の５年生存率は９５％超であり、ほとんどの男性が低侵襲治療の恩恵を受けるため、ＰＣａのリスクを予測することは、治療オプションについて十分な情報に基づいた判定を下すために極めて重要である。三次元ゲノムアーキテクチャおよび染色体構造は、腫瘍と循環細胞の両方で腫瘍形成中に初期の変化を受け、疾患用バイオマーカーとして機能することができる。
前立腺がん（ＰＣａ）に対する現在の診断用血液検査は、初期段階の疾患に対しては信頼性が低く、結果として、良性疾患の男性において不必要な前立腺生検が多数発生し、ＰＣａの男性においては陰性生検の誤った安堵が生まれる。低リスク群の５年生存率は９５％超であり、ほとんどの男性が低侵襲治療の恩恵を受けるため、ＰＣａのリスクを予測することは、治療オプションについて十分な情報に基づいた判定を下すために極めて重要である。三次元ゲノムアーキテクチャおよび染色体構造は、腫瘍と循環細胞の両方で腫瘍形成中に初期の変化を受け、疾患用バイオマーカーとして機能することができる。
この前向き研究では、新たに診断された治療歴のないＰＣａ患者（ｎ＝１４０）および非癌対照（ｎ＝９６）の全血中の４２５の癌関連遺伝子の遺伝子座における１４，２４１の染色体ループに対して染色体コンフォメーションスクリーニングを実施した。
データは、ＰＣａ患者からの末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）が、ＥＴＳ１、ＭＡＰ３Ｋ１４、ＳＬＣ２２Ａ３、およびＣＡＳＰ２の遺伝子の遺伝子座で特異的な染色体コンフォメーション変化を獲得したことを示している。独立した検証コホートでの盲検化試験により、８０％の感度および８０％の特異度でＰＣａ検出を得た。ＰＣａリスク群間のさらなる分析により、高リスクカテゴリ３対低リスクカテゴリ１に対するＢＭＰ６、ＥＲＧ、ＭＳＲ１、ＭＵＣ１、ＡＣＡＴ１、およびＤＡＰＫ１の遺伝子と、高リスクカテゴリ３対中リスクカテゴリ２に対するＨＳＤ３Ｂ２、ＶＥＧＦＣ、ＡＰＡＦ１、ＭＵＣ１、ＡＣＡＴ１、およびＤＡＰＫ１の遺伝子とからなる予後検証セットが得られ、これらは原発性前立腺腫瘍におけるコンフォメーションと高い類似性を有していた。これらのセットは、高リスクカテゴリ３対低リスクカテゴリ１を層別化する８０％の感度および９２％の特異度、および高リスクカテゴリ３対中リスクカテゴリ２の疾患を層別化する８４％の感度および８８％の特異度を達成した。
結果は、ＰＣａ患者の血液中の特異的な染色体コンフォメーションを実証しており、これは高い感度および特異度でのＰＣａの診断および予後を可能にする。これらのコンフォメーションはＰＢＭＣと原発腫瘍との間で共有される。これらのエピジェネティックシグネチャは、血液ベースのＰＣａの診断および予後検査の開発につながる可能性がある。
導入
西欧諸国では、前立腺がん（ＰＣａ）は現在、男性で最も一般的に診断されている非皮膚癌であり、癌関連死の２番目に多い原因である。３０歳の男性の多くは組織学的ＰＣａの証拠を示しており、そのほとんどは微視的なものであり、おそらく臨床症状を示すことはない。診断および予後には、前立腺特異抗原（ＰＳＡ）、侵襲性針生検、グリーソンスコア、および病期が使用される。２，２９９人の患者の大規模な多施設治験では、１２部位の生検スキームが他のすべてのスキームより優れ、全体的なＰＣａ検出率はわずか４４．４％であった。
西欧諸国では、前立腺がん（ＰＣａ）は現在、男性で最も一般的に診断されている非皮膚癌であり、癌関連死の２番目に多い原因である。３０歳の男性の多くは組織学的ＰＣａの証拠を示しており、そのほとんどは微視的なものであり、おそらく臨床症状を示すことはない。診断および予後には、前立腺特異抗原（ＰＳＡ）、侵襲性針生検、グリーソンスコア、および病期が使用される。２，２９９人の患者の大規模な多施設治験では、１２部位の生検スキームが他のすべてのスキームより優れ、全体的なＰＣａ検出率はわずか４４．４％であった。
広く臨床で使用されているＰＣａに対する唯一の利用可能な血液検査は、ＰＳＡの循環レベル（２１％の感度および９１％の特異度）の測定を含むが、前立腺のサイズ、良性前立腺肥大症、および前立腺炎によってもＰＳＡレベルは増加し得る。現在の４．０ｎｇ／ｍｌのカットオフ限界では、すべてのＰＣａ患者の２０％のみが検出されている。初期のＰＣａでは、ＰＳＡ検査は、初期の浸潤癌と潜在性の非致死性腫瘍とを区別するのに十分特異的ではなく、男性の一生にわたって無症候性のままであり得る。進行性のＰＣａでは、結果に対する臨床的代替エンドポイントとしてＰＳＡ動態が使用される。しかし、それらは一般的な予後を示す一方で、個体に対する特異性を欠いている。４Ｋ血液検査（ＡＵＣ ０．８）およびＰＨＩ血液検査（９０％の感度、１７％の特異度）を含む多数のより特異的な血液検査が、ＰＣａ検出のために行われている。ＰＣａの重症度を確立し、患者をリスク群に層別化するために、ＰＳＡレベル、病期、およびグリーソンスコアが使用される。現在まで、低リスクＰＣａと高リスクＰＣａを区別することを可能にする予後血液検査はない。
ｐ５３（腫瘍の最大６４％）、ｐ２１（最大５５％）、ｐ７３およびＭＭＡＣ１／ＰＴＥＮの腫瘍抑制遺伝子の変異を含む、ＰＣａに関連付けられた複数の遺伝的変化が存在するが、これらの変異は遺伝子制御に対するすべての観察された効果の説明にはならない。動的かつ多層の染色体ループ相互作用を含むエピジェネティックなメカニズムは、遺伝子発現の強力な制御因子である。染色体コンフォメーションキャプチャ（３Ｃ）技術により、これらのシグネチャを記録することが可能になる。この研究では、ＥｐｉＳｗｉｔｃｈ（商標）アッセイを使用して、ＰＣａ患者の血液中の特異的な染色体コンフォメーションをスクリーニング、定義、および評価し、診断および予後のマーカーとして機能する可能性のある遺伝子座を同定した。
方法
２つのコホートで、合計１４０人のＰＣａ患者と９６人の対照をリクルートした。コホート１：泌尿器科クリニックに通うＰＣａ診断のある男性（ｎ＝１０５）またはない男性（ｎ＝７７）を、２０１０年１０月から２０１３年９月まで前向きにリクルートした。コホート２：米国から患者のサンプル（１９の対照および３５のＰＣａ）を入手した。リクルート時に、針および採血方法の現在の慣行を使用して、ＰＣａ患者から単一の血液サンプル（５ｍｌ）をＢＤ Ｖａｃｕｔａｉｎｅｒ（登録商標）プラスチックＥＤＴＡチューブに収集した。血液サンプルを受動的に凍結し、処理されるまで－８０°Ｃで保存した。前立腺腫瘍サンプルを、前立腺全摘除術を続けて受けた、前にリクルートした患者（ｎ＝５）から得た。患者の臨床的特徴が表１７に示される。
２つのコホートで、合計１４０人のＰＣａ患者と９６人の対照をリクルートした。コホート１：泌尿器科クリニックに通うＰＣａ診断のある男性（ｎ＝１０５）またはない男性（ｎ＝７７）を、２０１０年１０月から２０１３年９月まで前向きにリクルートした。コホート２：米国から患者のサンプル（１９の対照および３５のＰＣａ）を入手した。リクルート時に、針および採血方法の現在の慣行を使用して、ＰＣａ患者から単一の血液サンプル（５ｍｌ）をＢＤ Ｖａｃｕｔａｉｎｅｒ（登録商標）プラスチックＥＤＴＡチューブに収集した。血液サンプルを受動的に凍結し、処理されるまで－８０°Ｃで保存した。前立腺腫瘍サンプルを、前立腺全摘除術を続けて受けた、前にリクルートした患者（ｎ＝５）から得た。患者の臨床的特徴が表１７に示される。
この研究の主要エンドポイントは、対照と比較した、ＰＣａ患者からのＰＢＭＣにおける染色体コンフォメーションの変化を検出することであった。したがって、すべての治療歴のないＰＣａ患者は、グレード、ステージ、およびＰＳＡレベルに関係なく、この研究に適格であった。前に化学療法を受けた患者または他の癌の患者は、この研究から除外された。ＰＣａ診断を臨床ルーチンに従って確立し、患者を適切な治療に割り当てた。予後研究（副次的エンドポイント）では、患者を関連するＮＣＣＮリスク群に従って層別化した（表１０）。フォローアップ研究は実施しなかった。
黒色腫の暫定的調査結果に基づいて、事前の検出力分析を、Ｒパッケージｐｗｄでｐｗｒ．ｔ．ｔｅｓｔ関数を使用して実施した。試験では、変数間の相関を検出するには群あたり１５人の患者で十分であることが示唆された（β＝５％の確率タイプＩＩエラー、有意水準；９５％の検出力；５０％の信頼区間および４０％の標準偏差）。
ＥｐｉＳｗｉｔｃｈ（商標）技術プラットフォームは、高解像度の３Ｃ結果を回帰分析および機械学習アルゴリズムと組み合わせて、疾患分類を発展させる。癌を診断することができるエピジェネティックなバイオマーカーを選択するために、健常（対照）サンプルと比較した、癌を患う患者からのサンプルを、ゲノムアーキテクチャの条件付きかつ安定したプロファイルの統計的に有意な差についてスクリーニングした。アッセイは、最初にクロマチンをホルムアルデヒドで固定してクロマチン内の会合を捕捉することにより、全血サンプルに対して実施される。その後、固定されたクロマチンをＴａｑＩ制限酵素でフラグメントに消化し、ＤＮＡ鎖を結合して架橋フラグメントを優先する。架橋を逆転させ、ＥｐｉＳｗｉｔｃｈ（商標）ソフトウェアによって前に確立されたプライマーを使用してポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を実施する。ＥｐｉＳｗｉｔｃｈ（商標）を３段階のプロセスで血液サンプルに使用して、ＰＣａ患者と健常対照者との間の染色体コンフォメーションの統計的に有意な差を特定、評価、および検証した（図１７）。第１の工程では、４２５個の手動で精選されたＰＣａ関連遺伝子（公開データベース（ｗｗｗ．ｅｎｓｅｍｂｌ．ｏｒｇ）から取得）からの配列を、クロマチン相互作用に関与する制御シグナルのこの計算による確率的同定のテンプレートとして使用した（表１８）。カスタマイズされたＣＧＨ Ａｇｉｌｅｎｔマイクロアレイ（８×６０ｋ）プラットフォームを、４２５の遺伝子座にわたる１４，２４１の潜在的な染色体コンフォメーションに対して技術的および生物学的反復を試験するように設計した。８のＰＣａおよび８の対照サンプルをアレイに競合的にハイブリダイズし、各遺伝子座の有無の違いを、ＬＩＭＭＡ線形モデリング、その後のバイナリフィルタリングおよびクラスタ分析によって定義した。これにより、最初に、ＰＣａ患者と対照とを最適に区別する能力を有する５３の染色体相互作用が明らかになった（図１７）。
第２の評価段階では、アレイ分析から選択された５３のバイオマーカーがＥｐｉＳｗｉｔｃｈ（商標）ＰＣＲベースの検出プローブに変換され、複数ラウンドのバイオマーカー評価に使用した。ＰＣＲプライマーを、ＰＣａと健常対照とを区別するそれらの能力に従って選択した（各群においてｎ＝６）。ネステッドプライマーを使用して生成されたＰＣＲ産物の同一性を、直接的な配列決定によって確認した。したがって、選択された５３のバイオマーカーを、最初の統計分析後に１５のマーカーに減少し、最終的に５マーカーシグネチャにした（表１１）。この選択された染色体コンフォメーションシグネチャバイオマーカーのセットを、その後、既知のコホート（ｎ＝４９）で試験した。さらに、アレイマーカーリードのＥｐｉＳｗｉｔｃｈ（商標）ＰＣＲ評価から発展された５マーカーシグネチャを、２９のサンプルを初期に試験した既知の４９のサンプルと組み合わせた（合計７８のサンプル）独立した盲検化検証コホートで試験した。存在量レベルを判定し、潜在的な異常値を特定するために、主成分分析も使用した（図１８）。
最後の工程では、ＰＣａ診断を通知するために使用される染色体コンフォメーションシグネチャをさらに検証するために、５マーカーのセットを、盲検化された、血液サンプルの独立した（ｎ＝２０）コホートで試験した。結果を、ベイズロジスティックモデリング、ｐ値帰無仮説（Ｐｒ（Ｎ｜ｚ｜）分析、フィッシャーの直接確率Ｐ検定、およびＧｌｍｎｅｔを使用して分析した（表１２）。５マーカーシグネチャ研究におけるサンプルコホートサイズを、ＰＣａサンプルと健常対照とを区別するための最適なマーカーの選択を可能にするために徐々に増大させた。コホートサイズを、９５のＰＣａおよび９６の健常対照サンプルに拡大した。データの分析および提示を、ＣＯＮＳＯＲＴの推奨事項に従って実施した。すべての測定を盲検化方式で実施した。分析手順を検証するためにＳＴＡＲＤ基準を使用した。予後マーカーの同定についても同様の３段階のアプローチに従った（表１３）。
配列特異的オリゴヌクレオチドを、Ｐｒｉｍｅｒ３を使用したネステッドＰＣＲによって潜在的なマーカーをスクリーニングするために選択した部位の周囲に設計した。すべてのＰＣＲ増幅サンプルを、ＬａｂＣｈｉｐ ＤＮＡ １Ｋ Ｖｅｒｓｉｏｎ２キット（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ、Ｂｅａｃｏｎｓｆｉｅｌｄ、英国）を使用して、ＬａｂＣｈｉｐ ＧＸでの電気泳動によって視覚化し、内部ＤＮＡマーカーを、蛍光色素を使用して製造元のプロトコルに従いＤＮＡチップ上に積載した。蛍光を、機器ソフトウェアを使用してゲル画像上のシミュレートされたバンドに変換されたレーザおよびエレクトロフェログラムの読み取りによって検出した。バンドが陽性と見なされると設定した閾値は、３０蛍光単位以上であった。
選択された患者（ｎ＝５）の生検から原発腫瘍サンプルを得た。粉砕した組織サンプルを、３０分間穏やかに撹拌しながら３７°Ｃで０．１２５％のコラゲナーゼにおいてインキュベートした。再懸濁した細胞（２５０ｕｌ）を、その後、固定アーム遠心分離機において室温で５分間８００ｇで遠心分離し、上清を除去し、ペレットをリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）に再懸濁した。原発腫瘍および一致する血液サンプルを、一定範囲のアッセイ感度（希釈係数１：２）でカテゴリ３対１および３対２に対する６マーカーのセットの存在について分析した。正しいサイズの一致するＰＣＲバンドが検出された場合、１のスコアを割り当て、バンドが検出されなかった場合は０のスコアを割り当てた（表１４）。
方法で記載されているように、ＥｐｉＳｗｉｔｃｈ（商標）技術を使用した段階的な診断バイオマーカー発見プロセスを適用した。カスタマイズされたＣＧＨ Ａｇｉｌｅｎｔマイクロアレイ（８×６０ｋ）プラットフォームを、８のＰＣａおよび８の対照サンプルにおいて（図１７）４２５の遺伝子座にわたる１４，２４１の潜在的な染色体コンフォメーションに対して技術的および生物学的反復を試験するように設計した（図１８）。各遺伝子座の有無を、ＬＩＭＭＡ線形モデリング、その後のバイナリフィルタリングおよびクラスタ分析によって定義した。第２の評価段階では、ネステッドＰＣＲを５３の選択されたバイオマーカーに使用し、それらをさらに１５のマーカーに減少し、最終的に５マーカーシグネチャにした（図１７）。ＰＣａに対するこの明確な染色体コンフォメーション疾患分類シグネチャは、以下の５つのゲノム遺伝子座における染色体相互作用で構成された：ＥＴＳプロトオンコジーン１、転写因子（ＥＴＳ１）、マイトジェン活性化プロテインキナーゼキナーゼキナーゼ１４（ＭＡＰ３Ｋ１４）、溶質キャリアファミリー２２メンバー３（ＳＬＣ２２Ａ３）およびカスパーゼ２（ＣＡＳＰ２）（表１１）。染色体コンフォメーションシグネチャにおけるＥＴＳ１、ＭＡＰ３Ｋ１４、ＳＬＣ２２Ａ３、およびＣＡＳＰ２の遺伝子における特異的な染色体ループのゲノム位置（表１１）を、それらの相対的な染色体にマッピングした。ＥＴＳ１、ＭＡＰ３Ｋ１４、ＳＬＣ２２Ａ３、およびＣＡＳＰ２の遺伝子に対する各染色体コンフォメーションシグネチャ遺伝子座の接合部に対応する２つのゲノム部位を、１２８，２６０，６８２から１２８，５３７，９２６までの１１番染色体、４３，３０３，６０３から４３，４３２，２８２までの１７番染色体、１６０，７４４，２３３から１６０，９４４，７５７までの６番染色体、および１４２，９３５，２３３から１４３，００８，１６３までの７番染色体にマッピングした。染色体ループを示すＥＴＳ１、ＭＡＰ３Ｋ１４、ＳＬＣ２２Ａ３およびＣＡＳＰ２の染色体コンフォメーションシグネチャマーカーのＣｉｒｃｏｓプロットを作成した。５マーカーに対する主成分分析を使用して、存在量レベルを判定し、潜在的な異常値を同定した。この分析を２つの群を含む７８個のサンプルに適用した。第１の群である、４９個の既知のサンプル（２４のＰＣａおよび２５の健常対照）を、２４個のＰＣａサンプルおよび５個の健常対照サンプルを含む２９個のサンプルの第２の群と組み合わせた（図１８）。最終的なトレーニングセットを、９５のＰＣａおよび９６の対照サンプルを使用して構築し、その後、２０個のサンプル（１０の対照および１０のＰＣａ）の独立した盲検化検証コホートで試験した。５つのゲノム遺伝子座における染色体相互作用を使用したＰＣａ検出に対する感度および特異度は、それぞれ、８０％（ＣＩ ４４．３９％～９７．４８％）および８０％（ＣＩ ４４．３９％～９７．４８％）であった（表１２）。
ＰＣａを層別化することができるエピジェネティックなバイオマーカーを選択するために、リスク群カテゴリ１～３（それぞれ、低、中、高、表１０）に分類されたＰＣａ患者からのサンプルを、ゲノムアーキテクチャの条件付きかつ安定したプロファイルの統計的に有意な差に対してスクリーニングした。ＥｐｉＳｗｉｔｃｈ（商標）を３段階のプロセスで血液サンプルに使用して、疾患のさまざまなステージにおけるＰＣａ患者間の染色体コンフォメーションの統計的に有意な差を同定、評価、および検証した（図１７）。第１の工程では、使用したアレイは４２５の遺伝子座をカバーし、試験プローブは合計１４，２４１の潜在的な染色体コンフォメーションに対するものであった。高リスクＰＣａカテゴリ３の患者を、低リスクカテゴリ１または中リスクカテゴリ２と比較した。合計で、ＰＣＲ評価のための１８１の潜在的な層別化マーカーリードをエンリッチメント統計を使用して同定した（表１９）。その後、上位７０のマーカーを、ＰＣＲ検出の次の段階に持ち込み、高リスクカテゴリ３対低リスクカテゴリ１の患者サンプルの層別化をさらに評価し、最終的に高カテゴリ３対低カテゴリ１に対する６マーカーセットを確立した（表１３）。最良のマーカーを、カイ二乗を使用して同定し、その後、カテゴリ１（ｎ＝２１）およびカテゴリ３（ｎ＝１９）の試験セットに対する分類子に組み込んだ。その後、マーカー減少に使用されなかったカテゴリ１（ｎ＝２１）およびカテゴリ３（ｎ＝６）の独立したコホートを、第１のラウンドの盲検化検証に使用した。同様に、６マーカーセットを、２５個のサンプルおよび１９個のサンプルを含む、それぞ、カテゴリ３およびカテゴリ２の試験セットに関して高リスクカテゴリ３対中リスクカテゴリ２について評価した。その後、マーカー減少に使用されなかったカテゴリ２およびカテゴリ３（各群においてｎ＝６）の独立したコホートを、第１のラウンドの盲検化検証に使用した。
最後の工程では、ＰＣａ予後を通知するために使用される染色体コンフォメーションシグネチャをさらに検証するために、高リスクカテゴリ３対低リスクカテゴリ１の６マーカーセットを、より大規模で、より代表的なコホートで試験した。元の盲検化コホートを、マーカー減少に使用された４０個のサンプルを含む６７個のサンプルに拡張した（表１５）。同様に、高リスクカテゴリ３対中リスクカテゴリ２に対する６マーカーセットを、より大規模で、より代表的なコホートで試験した。元の盲検化コホートを４３個のサンプルに拡張した（表１６）。
カテゴリ３対カテゴリ１の６マーカーセットを確立した。このセットには、骨形態形成タンパク質６（ＢＭＰ６）、ＥＴＳ転写因子ＥＲＧ（ＥＲＧ）、マクロファージスカベンジャー受容体１（ＭＳＲ１）、ムチン１（ＭＵＣ１）、アセチルＣｏＡアセチルトランスフェラーゼ１（ＡＣＡＴ１）、および細胞死関連プロテインキナーゼ１（ＤＡＰＫ１）遺伝子が含まれた（表１３）。ヒドロキシ－デルタ－５－ステロイドデヒドロゲナーゼ、３ベータ－およびステロイドデルタ－イソメラーゼ２（ＨＳＤ３Ｂ２）、血管内皮増殖因子Ｃ（ＶＥＧＦＣ）、アポトーシスペプチダーゼ活性化因子１（ＡＰＡＦ１）、ＭＵＣ１、ＡＣＡＴ１およびＤＡＰＫ１を含む、高リスクカテゴリ３対中リスクカテゴリ２に対する６つのバイオマーカーを同定した。顕著なことに、最後の３つのバイオマーカー（ＭＵＣ１、ＡＣＡＴ１およびＤＡＰＫ１）を、カテゴリ１対３および３対２の間で共通していた（表１３）。６つのゲノム遺伝子座における染色体相互作用を使用した高リスクカテゴリ３対低リスクカテゴリ１のＰＣａの層別化は、６７個のサンプルの盲検化コホートにおいて８０％（ＣＩ ５９．３０％～９３．１７％）の感度および９２％（ＣＩ ８０．５２％～９８．５０％）の特異度を示した（表１５）。同様に、高リスクカテゴリ３対中リスクカテゴリ２に対する６マーカーセットを、８４％（ＣＩ ６３．９２％～９５．４６％）の感度および８８％（ＣＩ ６５．２９％～９８．６２％）の特異度を実証する４３個のサンプルのより大規模で、より代表的なコホートで試験した（表１６）。
５つの一致する末梢血および原発腫瘍のサンプルを使用して、末梢循環で同定されたエピジェネティックマーカー（表１３）を腫瘍組織と比較した。結果は、カテゴリ１対３およびカテゴリ２対３の層別化シグネチャの一部として血液中で検出された多数の調節解除マーカーが腫瘍組織で検出され得ることを示した（表１４）。これは、全身的に検出することができる染色体相互作用が、腫瘍形成の原発部位において同じ条件下で検出することができたことを実証している。
前立腺がんのタイムリーな診断は死亡率を低下させるために重要である。ＰＣａに対するスクリーニングの欧州のランダム化研究では、定期的なＰＳＡスクリーニングを受けた男性のＰＣａ死亡率が大幅に低下することが示されている。しかし、総合的なスクリーニングは臨床的に有意でない疾患の過剰診断につながり、低リスク疾患と高リスク疾患とを区別することができる新しい低侵襲検査が緊急に必要とされている。
エピジェネティック分析アプローチは、このニーズに対処するための潜在的に強力な手段を提供する。検査のバイナリの性質（染色体ループが存在するか否か）および巨大な組み合わせ力（＞１０１０の組み合わせが、スクリーニングされた～５０，０００のループで可能である）により、臨床的に十分に定義された基準に正確に適合するシグネチャを作成することが可能になり得る。ＰＣａにおいて、低リスク対高リスクの疾患を識別したり、小さいが侵攻性の腫瘍を同定したり、最も適切な治療オプションを判定したりする。さらに、エピジェネティックな変化は腫瘍形成の初期に現れることが知られており、診断および予後の両方に有用である。
この研究では、ＰＣａに対する非侵襲的血液ベースのエピジェネティックシグネチャの特有のバイオマーカーとして染色体コンフォメーションを同定し、検証した。データは、ＰＣａ患者にのみ存在するＥＴＳ１、ＭＡＰ３Ｋ１４、ＳＬＣ２２Ａ３、およびＣＡＳＰ２の遺伝子の遺伝子座に安定したクロマチンループが存在することを実証している（表１１）。２０の盲検化サンプルの独立したセットにおけるこれらのマーカーの検証は、８０％の感度および８０％の特異度を示し（表１２）、これはＰＣａ血液検査で注目に値する。興味深いことに、これらの遺伝子のいくつかの発現は、すでに癌の病態生理に関連している。ＥＴＳ１はＥＴＳ転写因子ファミリーのメンバーである。ＥＴＳ１を過剰発現する前立腺腫瘍は、上皮間葉転換の細胞の遊走、侵入、および誘導の増加に関連している。ＭＡＰ３Ｋ１４（核因子カッパベータ（ＮＦ－ｋβ）誘導キナーゼ（ＮＩＫ）としても知られている）は、ＭＡＰ３Ｋ群（またはＭＥＫＫ）のメンバーである。生理学的に、ＭＡＰ３Ｋ１４／ＮＩＫは、特にＭＡＰ３Ｋ１４／ＮＩＫが過剰発現されているときに、非標準のＮＦ－ｋβシグナル伝達を活性化し、標準のＮＦ－ｋβシグナル伝達を誘導することができる。腫瘍細胞の侵入を促進するようにミトコンドリアのダイナミクスを制御するためのＭＡＰ３Ｋ１４／ＮＩＫの新しい役割が説明されてきた。ＳＬＣ２２Ａ３（有機カチオントランスポーター３（ＯＣＴ３）としても知られている）は、膜輸送タンパク質のＳＬＣ群のメンバーである。ＳＬＣ２２Ａ３発現はＰＣａ進行に関連している。ＣＡＳＰ２は、カスパーゼ活性化および動員ドメインの群のメンバーである。生理学的に、ＣＡＳＰ２はオートファジーの内因性リプレッサーとして機能することができる。同定された遺伝子のうちの２つ（ＳＬＣ２２Ａ３およびＣＡＳＰ２）は、癌の進行と逆相関することが以前に示された。重要なことに、クロマチンループの存在は遺伝子発現に不確定な影響を与えかねない。
ＰＣａ予後マーカーをスクリーニングするために、ＥｐｉＳｗｉｔｃｈ（商標）カスタムアレイを実施して、低リスクＰＣａ（分類１）および高リスクＰＣａ（分類３）の患者の末梢血からのＤＮＡの競合的ハイブリダイゼーションを分析した。ＢＭＰ６、ＥＲＧ、ＭＳＲ１、ＭＵＣ１、ＡＣＡＴ１、およびＤＡＰＫ１を含む、高リスクカテゴリ３対低リスクカテゴリ１に対する６マーカーセットを同定した。ＨＳＤ３Ｂ２、ＶＥＧＦＣ、ＡＰＡＦ１、ＭＵＣ１、ＡＣＡＴ１、およびＤＡＰＫ１を含む、高リスクカテゴリ３対中リスクカテゴリ２に対する６つのバイオマーカーを同定した。これらのバイオマーカーのうち３つ（ＭＵＣ１、ＡＣＡＴ１、およびＤＡＰＫ１）を、これらのセット間で共有した。データは、ステージ１および３での一致したＰＣａ患者の原発腫瘍および血液における染色体コンフォメーション間の高い一致を示している（表１４）。これらの遺伝子のいくつかの予後的有意性および診断的価値は以前に示唆されている。ＢＭＰ６はＰＣａ骨転移において重要な役割を果たしている。ＥＴＳ１に加えて、ＥＲＧは転写因子のＥＴＳファミリーのもう１つのメンバーである。圧倒的な証拠は、ＥＲＧが、転移、上皮間葉転換、エピジェネティックな再プログラミング、および炎症を含む、ＰＣａの進行に関連するいくつかのプロセスに関与していることを示唆している。ＭＳＲ１はＰＣａに中程度のリスクを与え得る。ＭＵＣ１は、ムチンファミリーに属する膜結合型糖タンパク質である。進行性ＰＣａにおけるＭＵＣ１の高発現は、有害な臨床病理学的腫瘍の特徴および結果不良に関連している。ＡＣＡＴ１の発現は、高グレードおよび進行性のＰＣａで上昇し、生化学的無再発生存率の低下の指標として機能する。ＤＡＰＫ１は、腫瘍抑制因子として、または異なる細胞に関する発癌性分子として機能し得る。ＨＳＤ３Ｂ２は、ステロイドホルモン生合成において重要な役割を果たしており、有害な腫瘍表現型、アンドロゲン受容体シグナル伝達の増加、および早期の生化学的再発を特徴とするＰＣａの関連する画分でアップレギュレーションされる。ＶＥＧＦＣはＶＥＧＦファミリーのメンバーであり、その発現の増加はＰＣａ標本におけるリンパ節転移に関連している。包括的な生化学的アプローチでは、ＡＰＡＦ１はアポトソームのコアとして説明されてきた。
これらの遺伝子座の同定にもかかわらず、ＰＢＭＣにおける癌関連のエピジェネティック変化のメカニズムは未同定のままである。しかし、相互作用は全身的に検出することができ、腫瘍形成の原発部位において同じ条件下で検出され得る（表１４）。したがって、変化を測定することができるようにするには、ＰＢＭＣにおけるクロマチンコンフォメーションを外部要因、おそらく、ＰＣａ腫瘍の細胞によって生成されたものによって指示しなければならない。染色体コンフォメーションのかなりの割合が、腫瘍特異的コンフォメーションを制御する非コードＲＮＡによって制御されることが知られている。腫瘍細胞は、隣接細胞または循環細胞によって形質膜陥入され、それらの染色体コンフォメーションを変化させ得る非コードＲＮＡを分泌することが示されており、この場合では制御因子の可能性がある。バイオマーカーとしてのＲＮＡ検出は依然として非常に困難であるが（低い安定性、バックグラウンドドリフト、統計的層別化分析に対する継続的な基盤）、染色体コンフォメーションシグネチャは、特に核内で試験したときに、バイオマーカー標的の使用に対する十分に認識された安定したバイナリの利点を提供するが、これは、血漿中に存在する循環ＤＮＡが、無傷の細胞核に存在する３Ｄコンフォメーションのトポロジー構造を保持しないためである。対象の遺伝子座にわたるエピジェネティックな制御の並行経路を表す、複数の染色体コンフォメーションが存在する可能性があるため、１つの遺伝子座を見ることが１つのマーカーを見ることと等しくないことに言及することが重要である。ＰＣａ診断の現在の臨床診療における重要な課題の１つは、確定診断を行うのにかかる時間である。これまでのところ、ＰＣａに対する単一の確定的な検査はない。高レベルのＰＳＡは、患者を不確実性の長い旅に導き、そこで、必要に応じて、磁気共鳴画像スキャンとそれに続く生検を受ける。生検は、ＰＳＡ検査よりも信頼性があるが、癌病変の欠落が依然として問題となりかねない主な手順である。ここで説明される５セットのバイオマーカーパネルは、比較的安価で十分に確立された分子生物学技術（ＰＣＲ）に基づいている。サンプルは、収集が簡単で、臨床医に数時間以内に迅速に利用可能な臨床読み出しを提供する生体液に基づいている。これにより順に、時間およびコストが大幅に節約され、ＰＣａの断定的な診断のための現在のプロトコルにおけるギャップを埋める有益な診断判定が支援される。
ＰＣａのリスクを予測することは、治療オプションに関する十分な情報に基づいた判定を下すために極めて重要である。低リスク群の５年生存率は９５％超であり、ほとんどの男性は低侵襲治療の恩恵を受ける。現在、ＰＣａリスクの層別化は、循環ＰＳＡ、腫瘍グレード（生検から）、および腫瘍ステージ（画像所見から）の組み合わせ評価に基づいている。簡単な血液検査を使用して同様の情報を導き出す能力によって、コストの大幅な削減を可能にし、診断プロセスをスピードアップする。ＰＣａ治療で特に重要なのは、最初は低リスクとして現れるが、その後、高リスクに進行する少数の腫瘍を同定することである。したがって、このサブセットは、より迅速でより根本的な介入の恩恵を受ける。
結論として、ここでは、ＰＣａの存在および予後を強く示唆している患者のＰＢＭＣの染色体コンフォメーションのサブセットを同定した。これらのシグネチャによって、ＰＣａに対する迅速な診断および予後の血液検査が開発される大きな可能性があり、これらは現在使用されているＰＳＡ検査の特異性を大幅に上回っている。好ましいマーカーおよび組み合わせは以下を含む：
－ ＥＴＳ１、ＭＡＰ３Ｋ１４、ＳＬＣ２２Ａ３、およびＣＡＳＰ２。これは、以下のネステッドＰＣＲマーカーによる診断である：
－ ＢＭＰ６、ＥＲＧ、ＭＳＲ１、ＭＵＣ１、ＡＣＡＴ１、およびＤＡＰＫ１。これは予後シグネチャである（ネステッドＰＣＲマーカーによる高リスクカテゴリ３対低リスクカテゴリ１）：
－ ＨＳＤ３Ｂ２、ＶＥＧＦＣ、ＡＰＡＦ１、ＭＵＣ１、ＡＣＡＴ１、およびＤＡＰＫ１。これは予後である（高リスクカテゴリ３対中リスクカテゴリ２）
－ ＥＴＳ１、ＭＡＰ３Ｋ１４、ＳＬＣ２２Ａ３、およびＣＡＳＰ２。これは、以下のネステッドＰＣＲマーカーによる診断である：
－ ＢＭＰ６、ＥＲＧ、ＭＳＲ１、ＭＵＣ１、ＡＣＡＴ１、およびＤＡＰＫ１。これは予後シグネチャである（ネステッドＰＣＲマーカーによる高リスクカテゴリ３対低リスクカテゴリ１）：
－ ＨＳＤ３Ｂ２、ＶＥＧＦＣ、ＡＰＡＦ１、ＭＵＣ１、ＡＣＡＴ１、およびＤＡＰＫ１。これは予後である（高リスクカテゴリ３対中リスクカテゴリ２）
実施例５．ＤＬＢＬＣに関するさらなる研究
びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）は、不均質な血液癌であるが、胚中心Ｂ細胞様（ＧＣＢ）および活性化Ｂ細胞様（ＡＢＣ）の２つの主要なサブタイプに広く分類することができる。ＧＣＢおよびＡＢＣのサブタイプは臨床経過が大きく異なり、ＡＢＣの生存予後ははるかに悪い。異なるサブタイプの患者も治療的介入に対して異なる反応を示すことが観察されており、実際、ＡＢＣおよびＧＣＢが完全に別個の疾患と見なすことができると主張する人もいる。治療への反応のこの変動性のために、ＤＬＢＣＬサブタイプを判定するためのアッセイを有することは、既存の治療法の使用への臨床的アプローチを導く上で、また新薬の開発において重要な意味がある。ＤＬＢＣＬをサブタイプ化するための現在のゴールドスタンダードアッセイでは、ホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）組織に関する遺伝子発現プロファイリングを使用して、「起源の細胞」、したがって疾患のサブタイプを判定する。しかし、このアプローチには、１）生検を必要とする、２）複雑で費用と時間のかかる分析アプローチを必要とする、および３）すべてのＤＬＢＣＬ患者を分類しないという点で、いくつかの重大な臨床的制限がある。
びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）は、不均質な血液癌であるが、胚中心Ｂ細胞様（ＧＣＢ）および活性化Ｂ細胞様（ＡＢＣ）の２つの主要なサブタイプに広く分類することができる。ＧＣＢおよびＡＢＣのサブタイプは臨床経過が大きく異なり、ＡＢＣの生存予後ははるかに悪い。異なるサブタイプの患者も治療的介入に対して異なる反応を示すことが観察されており、実際、ＡＢＣおよびＧＣＢが完全に別個の疾患と見なすことができると主張する人もいる。治療への反応のこの変動性のために、ＤＬＢＣＬサブタイプを判定するためのアッセイを有することは、既存の治療法の使用への臨床的アプローチを導く上で、また新薬の開発において重要な意味がある。ＤＬＢＣＬをサブタイプ化するための現在のゴールドスタンダードアッセイでは、ホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）組織に関する遺伝子発現プロファイリングを使用して、「起源の細胞」、したがって疾患のサブタイプを判定する。しかし、このアプローチには、１）生検を必要とする、２）複雑で費用と時間のかかる分析アプローチを必要とする、および３）すべてのＤＬＢＣＬ患者を分類しないという点で、いくつかの重大な臨床的制限がある。
ここでは、エピゲノムアプローチを採用し、ＤＬＢＣＬサブタイプを同定するための血液ベースの染色体コンフォメーションシグネチャ（ＣＣＳ）を開発した。１１８人のＤＬＢＣＬ患者からの臨床サンプルを使用した反復アプローチを採用して、疾患をサブタイプ化するための６つのマーカー（ＤＬＢＣＬ－ＣＣＳ）のパネルを定義した。その後、ＤＬＢＣＬ－ＣＣＳの性能を、ＦＦＰＥ組織からの従来の遺伝子発現プロファイリング（ＧＥＸ）と比較した。
ＤＬＢＣＬ－ＣＣＳは、既知のステータスのサンプルでのＡＢＣおよびＧＣＢの分類において正確であり、分類子の開発に使用される発見コホートでの１００％（６０／６０）サンプルで同一の呼び出しを提供した。また、評価コホートでは、ＤＬＢＣＬ－ＣＣＳは、ＧＥＸ分析で定義された中間サブタイプ（タイプＩＩＩ）を有するサンプルの１００％（５８／５８）でＤＬＢＣＬサブタイプの呼び出しを行うことができた。最も重要なことに、これらの患者が疾患の経過全体を通して長期的に追跡された場合、ＥｐｉＳｗｉｔｃｈ（商標）関連の呼び出しは、ＡＢＣおよびＧＣＢのサブタイプに対する生存率の既知のパターンでより良好に追跡した。
この研究は、ＤＬＢＣＬサブタイプを同定するための、単純で、正確で、費用効果が高く、臨床的に採用可能な血液ベースの診断が可能であるという初期の兆候を提供する。
背景
びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）は最も一般的なタイプの血液癌であり、さまざまな方法論を使用した多くの研究により、遺伝的および生物学的に不均質であることが実証されている。２つの主要なＤＬＢＣＬ分子サブタイプは、胚中心Ｂ細胞様（ＧＣＢ）および活性化Ｂ細胞様（ＡＢＣ）であるが、分子サブタイプのより詳細な定義も提案されている。これらの２つの主要なサブタイプは、劇的に異なる疾患経過を有し、ＡＢＣサブタイプの生存予後がはるかに悪いことが観察されているため、高度な臨床的関連性がある。おそらくより重要なことに、ＧＣＢおよびＡＢＣ（または非ＧＣＢ）のサブタイプを治療するための新規の治験薬が臨床現場で評価されるため、および選択されていない患者の全体的な奏効率が低いという歴史的観察により、治療の開始前に患者サブタイプを同定する差し迫った必要性がある。歴史的に、ＤＬＢＣＬサブタイプは「起源の細胞」（ＣＯＯ）を同定することによって判定される。元のＣＯＯ分類は、階層的クラスタリング分析によって、活性化された末梢血Ｂ細胞または正常な胚中心Ｂ細胞とのＤＬＢＣＬ遺伝子発現の観察された類似性に基づいていた（３）。全ゲノム発現プロファイリング（ＧＥＰ）によるこのＣＯＯ分類によって、ＤＬＢＣＬを活性化Ｂ細胞様（ＡＢＣ）、胚中心Ｂ細胞様（ＧＣＢ）、およびタイプＩＩＩ（未分類）サブタイプに分類し、ＡＢＣ－ＤＬＢＣＬは予後不良および構成的ＮＦ－ｋＢ活性化を特徴とする。それらの将来性のある研究において、ＷｒｉｇｈｔらはＡＢＣとＧＣＢ－ＤＬＢＣＬとの間でそれらの発現が最も判別可能である２７の遺伝子を同定し、ＣＯＯ分類のための線形予測スコア（ＬＰＳ）アルゴリズムを開発した。これらの独自の研究は、全体的に新鮮凍結（ＦＦ）リンパ腫組織の遡及的調査に基づいている。臨床診療におけるこのＣＯＯ分類の適用に関する主な課題は、定期的なホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）診断生検に適したロバストな臨床アッセイの確立であった。いくつかの研究では、定量的ヌクレアーゼプロテクションアッセイ、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ ＨＧ Ｕ１３３ Ｐｌｕｓ ２．０プラットフォームまたはＩｌｌｕｍｉｎａ全ゲノムＤＡＳＬａｓｓａｙを用いるＧＥＰ、およびＮａｎｏＳｔｒｉｎｇリンパ腫サブタイプ化試験（ＬＳＴ）技術を含む、ｍＲＮＡ発現の定量的測定によるＦＦＰＥ組織を使用したＤＬＢＣＬのＣＯＯ分類の可能性も調査した。ＧＥＰによるＣＯＯ分類を要約するために、いくつかの免疫組織化学的検査（ＩＨＣ）ベースのアルゴリズムも調査されてきた。概して、これらの研究は、ＦＦＰＥ組織を使用したＤＬＢＣＬのＣＯＯ分類の高い信頼性およびＡＢＣサブタイプとＧＣＢサブタイプとの間の全生存期間のロバストな分離を実証したたが、再現性の問題、特にアッセイ間の一致の欠如に悩まされている。さらに、任意のＩＨＣベースの測定はベースライン組織を必要とするが、これは常に利用可能ではなく、サンプル収集からアッセイの読み出しまでの現在のターンアラウンドタイムは長く、臨床現場での実施が困難である。
びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）は最も一般的なタイプの血液癌であり、さまざまな方法論を使用した多くの研究により、遺伝的および生物学的に不均質であることが実証されている。２つの主要なＤＬＢＣＬ分子サブタイプは、胚中心Ｂ細胞様（ＧＣＢ）および活性化Ｂ細胞様（ＡＢＣ）であるが、分子サブタイプのより詳細な定義も提案されている。これらの２つの主要なサブタイプは、劇的に異なる疾患経過を有し、ＡＢＣサブタイプの生存予後がはるかに悪いことが観察されているため、高度な臨床的関連性がある。おそらくより重要なことに、ＧＣＢおよびＡＢＣ（または非ＧＣＢ）のサブタイプを治療するための新規の治験薬が臨床現場で評価されるため、および選択されていない患者の全体的な奏効率が低いという歴史的観察により、治療の開始前に患者サブタイプを同定する差し迫った必要性がある。歴史的に、ＤＬＢＣＬサブタイプは「起源の細胞」（ＣＯＯ）を同定することによって判定される。元のＣＯＯ分類は、階層的クラスタリング分析によって、活性化された末梢血Ｂ細胞または正常な胚中心Ｂ細胞とのＤＬＢＣＬ遺伝子発現の観察された類似性に基づいていた（３）。全ゲノム発現プロファイリング（ＧＥＰ）によるこのＣＯＯ分類によって、ＤＬＢＣＬを活性化Ｂ細胞様（ＡＢＣ）、胚中心Ｂ細胞様（ＧＣＢ）、およびタイプＩＩＩ（未分類）サブタイプに分類し、ＡＢＣ－ＤＬＢＣＬは予後不良および構成的ＮＦ－ｋＢ活性化を特徴とする。それらの将来性のある研究において、ＷｒｉｇｈｔらはＡＢＣとＧＣＢ－ＤＬＢＣＬとの間でそれらの発現が最も判別可能である２７の遺伝子を同定し、ＣＯＯ分類のための線形予測スコア（ＬＰＳ）アルゴリズムを開発した。これらの独自の研究は、全体的に新鮮凍結（ＦＦ）リンパ腫組織の遡及的調査に基づいている。臨床診療におけるこのＣＯＯ分類の適用に関する主な課題は、定期的なホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）診断生検に適したロバストな臨床アッセイの確立であった。いくつかの研究では、定量的ヌクレアーゼプロテクションアッセイ、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ ＨＧ Ｕ１３３ Ｐｌｕｓ ２．０プラットフォームまたはＩｌｌｕｍｉｎａ全ゲノムＤＡＳＬａｓｓａｙを用いるＧＥＰ、およびＮａｎｏＳｔｒｉｎｇリンパ腫サブタイプ化試験（ＬＳＴ）技術を含む、ｍＲＮＡ発現の定量的測定によるＦＦＰＥ組織を使用したＤＬＢＣＬのＣＯＯ分類の可能性も調査した。ＧＥＰによるＣＯＯ分類を要約するために、いくつかの免疫組織化学的検査（ＩＨＣ）ベースのアルゴリズムも調査されてきた。概して、これらの研究は、ＦＦＰＥ組織を使用したＤＬＢＣＬのＣＯＯ分類の高い信頼性およびＡＢＣサブタイプとＧＣＢサブタイプとの間の全生存期間のロバストな分離を実証したたが、再現性の問題、特にアッセイ間の一致の欠如に悩まされている。さらに、任意のＩＨＣベースの測定はベースライン組織を必要とするが、これは常に利用可能ではなく、サンプル収集からアッセイの読み出しまでの現在のターンアラウンドタイムは長く、臨床現場での実施が困難である。
ＤＬＢＣＬをサブタイプ化するために歴史的に使用されてきたアプローチの中で、ＣＯＯ評価のための１つの方法は、Ｆｌｕｉｄｉｇｍ ＢｉｏＭａｒｋ ＨＤシステムを使用して定量的逆転写ＰＣＲ（ｑＲＴ－ＰＣＲ）によるＦＦＰＥ組織からの２７の遺伝子の発現を測定するアッセイを使用する。この方法論には既存の手法に比べていくつかの利点があるが、そのアプローチはそれでも、１）組織生検を必要とする、２）高価で、非標準かつ時間のかかる検査手順に依存するという点で、その臨床応用を制限するいくつかの大きな障害に直面している。このように、血液ベースのアッセイがあることで、臨床的適用性がエンリッチメントされたＤＣＢＣＬサブタイプ化のための簡単で、信頼性が高く、費用効果の高い方法を提供することにより当該分野は前進される。
この研究では、ゲノムアーキテクチャの変化の検出に焦点を当てることによって、ＤＬＢＣＬ患者においてＣＯＯ分類を判定するために新しい血液ベースのアッセイを使用した。エピジェネティックな制御フレームワークの一部として、ゲノム領域は、遺伝子発現を機能的に制御する方法として、それらの三次元構造を変更することができる。この制御メカニズムの結果は、異なるゲノム遺伝子座でのクロマチンループの形成である。これらのループの有無は、染色体コンフォメーションキャプチャ（３Ｃ）を使用して経験的に測定することができる。複数のゲノム領域は、安定した条件付きの長距離の染色体相互作用の形成を通じてエピスタシスの調節に貢献する。複数のゲノム遺伝子座での染色体コンフォメーションの集合的な測定は、結果として、染色体コンフォメーションシグネチャ（ＣＣＳ）、またはその外部環境へのゲノム応答を反映する分子バーコードをもたらす。ＣＣＳの検出、スクリーニング、およびモニターには、ＣＣＳを検出するための確立された、高解像度および高スループットの方法論であるＥｐｉＳｗｉｔｃｈプラットフォームを利用した。３Ｃに基づいて、ＥｐｉＳｗｉｔｃｈプラットフォームは、定義された遺伝子座でのクロマチン構造の変化、および長距離の非コードのシスおよびトランス制御相互作用を評価するために発展されてきた。患者の層別化にＥｐｉＳｗｉｔｃｈを使用する利点の中には、そのバイナリの性質、再現性、比較的低いコスト、迅速なターンアラウンドタイム（サンプルは２４時間以内に処理可能）、たった少量の血液（～５０ｍＬ）の要件、およびＰＣＲベースの検出方法のＦＤＡ標準でのコンプライアンスがある。したがって、染色体コンフォメーションは、細胞状態の安定したバイナリの読み出しを提供し、バイオマーカーの出現するクラスを表す。
ここでは、染色体アーキテクチャの変化の評価に基づくアプローチを使用して、ＤＬＢＣＬＣＯＯサブタイプ化に対する血液ベースの診断試験を開発した。ＤＬＢＣＬ患者からの血液サンプルにおけるゲノムアーキテクチャの変化の調査が、組織ベースのＣＯＯ分類アプローチに代わる方法を提案し、臨床的意思判定および試験デザインを導くための新規で、非侵襲的で、より臨床的に適用可能な方法論を提供することができると仮定した。
この研究では、合計で既知のＣＯＯサブタイプを有する１１８人のＤＬＢＣＬ患者および１０人の健常対照（ＨＣ）を使用した。サンプルは、進行性非ホジキンリンパ腫におけるリツキシマブとベバシズマブの第ＩＩＩ相の、ランダム化した、プラセボ対照試験で収集されたサンプルのサブセットであった。簡潔には、新たにＣＤ２０陽性ＤＬＢＣＬと診断された１８歳以上の成人患者を、Ｒ－ＣＨＯＰまたはＲ－ＣＨＯＰとベバシズマブ（ＲＡ－ＣＨＯＰ）にランダム化した。６０人のＤＬＢＣＬ患者から収集された血液サンプルを、ＣＣＳバイオマーカーリードを同定、評価、および改良するための開発コホートとして使用した。このコホートからの患者をすべて、高いサブタイプ固有のＬＰＳ（線形予測スコア）を有する高い／強いＧＣＢ（３０）またはＡＢＣ（３０）として分類した。残りの５８個のＤＬＢＣＬサンプルには中間ＬＰＳがあり、Ｆｌｕｉｄｉｇｍ検査によってＡＢＣ、ＧＣＢ、または未分類と判定された（図２５）。これらの患者サンプルを、ＣＣＳバイオマーカーの発見および開発には使用しなかったが、結果の分類子を評価するために後の段階で使用した。Ｆｌｕｉｄｉｇｍ検査を、リンパ節から得られた組織を使用して行い（パンチ生検として、または手術中に除去した）、ＥｐｉＳｗｉｔｃｈ分析を、治療を受ける前に患者から収集された一致した末梢全血を使用して行った。
患者サンプルに加えて、１２個の細胞株（６個のＡＢＣおよび６個のＧＣＢ）もバイオマーカースクリーニングの初期段階で使用し、ＡＢＣおよびＧＣＢの疾患サブタイプを最適に区別することができる染色体コンフォメーションのセットを同定した（表２０）。細胞株を、アメリカ合衆国培養細胞系統保存機関（ＡＴＣＣ）、ドイツ微生物細胞培養コレクション（ＤＳＭＺ）、および公益財団法人ヒューマンサイエンス振興財団（ＪＨＳＦ）から得た。
ＲＮＡを、治療前のＦＦＰＥ生検から単離し、精製した。ＤＬＢＣＬサブタイプを、ＷｒｉｇｈｔらのアルゴリズムをＤＬＢＣＬサブタイプ予測子の２７個の遺伝子を含むカスタムＦｌｕｉｄｉｇｍ遺伝子発現パネルからの発現データに適応することによって判定した。１５人の非試験被験体のコホートでＦｌｕｄｉｇｍ ｑＲＴ－ＰＣＲをＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘデータと比較することによるＣＯＯアッセイの検証によって、使用した１９の分類遺伝子にわたる一致した新鮮凍結（ＦＦ）サンプルおよびＦＦＰＥサンプルからのｑＲＴ－ＰＣＲ測定値間の高い相関性が明らかになった。同じＦＦサンプルからのＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘマイクロアレイとＦｌｕｉｄｉｇｍ ｑＲＴ－ＰＣＲ測定値間の高い相関性も発見した。Ｆｌｕｉｄｉｇｍ ＣＯＯアッセイからのｑＲＴ－ＰＣＲデータから計算された分類遺伝子の重みは、独立した患者コホートにおける以前のマイクロアレイデータから得られた重みと非常に一致していた。Ｆｌｕｉｄｉｇｍアッセイに由来するＬＰＳ、ＦＦＰＥ腫瘍におけるデータ、およびテクニカルレジストリコホートでの一致したＦＦ組織におけるＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘマイクロアレイデータに由来するＬＰＳの間の高い相関性（７６％の一致）を観察した。
パターン認識アルゴリズムを使用して、長距離の染色体コンフォメーションを形成する可能性のある部位に対するヒトゲノムをアノテートした。パターン認識ソフトウェアは、ベイジアンモデリングに基づいて動作し、領域が長距離のクロマチン相互作用に関与しているという確率的スコアを提供する。９７個の遺伝子座からの配列（表２１）をパターン認識ソフトウェアを介して処理して、ＤＬＢＣＬサブタイプを区別することができる可能性が最も高い１３，３２２の染色体相互作用のリストを生成した。最初のスクリーニングでは、アレイベースの比較を行った。６０ｍｅｒのオリゴヌクレオチドプローブを、これらの潜在的な相互作用を照合するように設計し、カスタムアレイとしてＡｇｉｌｅｎｔ ＳｕｒｅＤｅｓｉｇｎのウェブサイトにアップロードした。各プローブは、ＥｐｉＳｗｉｔｃｈマイクロアレイ上に四つ組で存在した。潜在的なＣＣＳを続いて評価するために、Ｐｒｉｍｅｒ３を使用して設計された配列特異的オリゴヌクレオチドを使用してネステッドＰＣＲ（ＥｐｉＳｗｉｔｃｈ ＰＣＲ）を実施した。オリゴヌクレオチドを、オリゴヌクレオチド特異的ＢＬＡＳＴを使用して特異度に関して試験した。
ＤＬＢＣＬにおいて調節不全であると特定された上位１０のゲノム遺伝子座を、タンパク質リストとしてＣｙｔｏｓｃａｐｅにおけるＲｅａｃｔｏｍｅ Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ Ｎｅｔｗｏｒｋのプラグインにアップロードして、ＤＬＢＣＬにおけるエピジェネティックな調節不全のネットワークを生成した。１０個の遺伝子座をまた、９００万を超える既知の予測されたタンパク質間相互作用を含むデータベースである、ＳＴＲＩＮＧ（相互作用する遺伝子／タンパク質ＤＢの取得のための検索ツール）（https://string-db.org/）にアップロードした。ヒトの相互作用のみに制限して、メインネットワーク（つまり、接続されていないノードを除外した）を生成した。上位の偽発見率（ＦＤＲ）を修正した機能的エンリッチメントを、遺伝子オントロジー（ＧＯ）および京都遺伝子ゲノム百科事典（ＫＥＧＧ）データベースによって同定した。上位１０のゲノム遺伝子座も、ＫＥＧＧ Ｐａｔｈｗａｙ Ｄａｔａｂａｓｅ（https://www.genome.jp/kegg/pathway.html）にアップロードして、ＤＬＢＣＬにおける調節不全を示す特異的な生物学的経路を同定した。
直接検定およびフィッシャー直接検定（カテゴリ変数に関する）を使用して、判別力のあるマーカーを同定した。統計学的有意性のレベルをｐ≦０．０５に設定し、すべての試験を両側で行った。ランダムフォレスト分類子を使用して、ＤＬＢＣＬサブタイプを同定するＥｐｉＳｗｉｔｃｈマーカーの能力を評価した。長期生存分析を、Ｒ（３８）でのｓｕｒｖｉｖａｌ およびｓｕｒｖｍｉｎｅｒのパッケージを使用してカプラン・マイヤー分析によって行った。平均生存時間を両側ｔ検定を使用して計算した。
ＤＬＢＣＬサブタイプを区別することができるＣＣＳバイオマーカーパネルを発見して検証するための段階的なアプローチを採用した（図１９）。ＥｐｉＳｗｉｔｃｈ分類子の発見の第１の工程として、９７の遺伝子座（表２１）を、染色体コンフォメーション相互作用部位の予測される存在のために選択して、アノテートし、ＥｐｉＳｗｉｔｃｈ ＣＧＨ Ａｇｉｌｅｎｔアレイを使用してそれらの経験的存在のためにスクリーニングした。アノテートしたアレイの設計は、１３，３２２の染色体相互作用候補を表し、平均で９９の別個のシス相互作用を各遺伝子座で試験した（９９±６４；平均±ＳＤ）。この発見アレイを使用して、２つの主要なＤＬＢＣＬサブタイプを区別することができる染色体コンフォメーションのより小さなプールをスクリーニングおよび同定した。この工程で使用したサンプルは、ＧＣＢおよびＡＢＣの細胞株（表２０）、および４人の分類されたＤＬＢＣＬ患者（２のＧＣＢおよび２のＡＢＣ）および４人のＨＣからの全血からのものであった。細胞株を、遺伝子発現分析に基づいて高ＡＢＣおよびＧＣＢと低ＡＢＣおよびＧＣＢにグループ分けした。アレイで使用した比較は次の通りであった：１）ＤＬＢＣＬ患者とプールされたＨＣの比較、２）プールされたＤＬＢＣＬサンプルとプールされたＨＣサンプルの比較、３）プールされた高ＧＣＢ細胞株とプールされた高ＡＢＣの比較、および４）プールされた低ＡＢＣとプールされた低ＧＣＢ細胞株の比較。
アレイ分析から、高ＡＢＣ細胞株とＧＣＢ細胞株とを区別し、ＤＬＢＣＬ患者からの血液サンプルには存在するが、ＨＣには存在しない、１，０９５の統計学的に有意な染色体相互作用を同定した。これらを、統計フィルタのセットを使用して上位２９３の相互作用にさらに減らし、そのうち１５１をＡＢＣサブタイプに関連付け、１４３をＧＣＢサブタイプに関連付けた。６０個の分類されたＤＬＢＣＬ患者サンプルに対するＥｐｉＳｗｉｔｃｈＰＣＲプラットフォームを使用したさらなる改良のために、いずれかのサブタイプからの上位７２の相互作用（ＡＢＣに関しては３６の相互作用、ＧＣＢに関しては３６の相互作用）を選択した。１１８個のＤＬＢＣＬサンプルすべてに関して、初期のサブタイプ分類を、２７個の遺伝子のパネルの発現から線形予測スコア（ＬＰＳ）を計算するＷｒｉｇｈｔアルゴリズムに基づいて割り当てた。６０個のサンプルを、ＡＢＣまたはＧＢＣのいずれかに分類し、ＥｐｉＳｗｉｔｃｈ分類子の開発に使用し（「発見コホート」）、５８個のサンプルは中間ＬＰＳスコアであり、これらをＥｐｉＳｗｉｔｃｈ分類子のパフォーマンスの評価に使用した（「評価コホート」）（図１９）。
最初のスクリーニングで同定された７２の相互作用を、発見工程中のＤＬＢＣＬ患者サンプルと１２のＨＣとともに６０のＤＬＢＣＬ分類された（３０のＡＢＣおよび３０のＧＣＢ）患者サンプルの第２のコホートの両方を使用してより小さなプールに絞り込んだ（図１９）。ＥｐｉＳｗｉｔｃｈアッセイによって行われたＤＬＢＣＬサブタイプの呼び出しを、Ｆｌｕｉｄｉｇｍプラットフォームを使用して確認した。Ｆｌｕｉｄｉｇｍ遺伝子発現分析を組織生検サンプルで実行した一方で、同じ患者からの全血をＥｐｉＳｗｉｔｃｈ ＰＣＲアッセイに使用した。精製の最初の工程では、最初のスクリーニングで同定された７２の染色体相互作用が、ＤＬＢＣＬに特異的であり、ＨＣサンプルには存在しないことをＰＣＲによって確認した。これを、最初に６つの分類されていないＤＬＢＣＬサンプルと２つのＨＣで試験し、結果としてＤＬＢＣＬに特異的な２１の相互作用を同定した。次に、ＥｐｉＳｗｉｔｃｈ ＰＣＲを使用して、分類されたＤＬＢＣＬ患者サンプル（１２のＡＢＣおよび１２のＧＣＢ）からの２４の血液サンプルを試験し、フィッシャー直接検定を使用してＤＬＢＣＬに特異的な染色体相互作用を同定した。これによって、結果として、ＡＢＣサブタイプとＧＣＢサブタイプとを正確に区別することができる１０の判別力のある染色体コンフォメーション相互作用のセットが得られ、これらを３６個のＤＬＢＣＬサンプル（１８のＡＢＣおよび１８のＧＣＢ）の追加のセットからの血液サンプルに関してさらに評価した（図１９）。
１０マーカーパネルの精度、パフォーマンス、およびロバスト性を試験するために、完全なサンプルコホートの８０％（合計４８個のサンプル：２４のＡＢＣおよび２４のＧＣＢ）に関する特徴選択のための直接検定を使用し、残りの２０％（１２のサンプル、６のＡＢＣおよび６のＧＣＢ）を最終的に選択されたＣＣＳマーカーの後の試験に使用した。データを１０回分割し、各分割の８０％のトレーニングセットを使用して分割の各々に対して直接検定を実行した。その後、１０分割にわたる１０マーカーに対する複合ｐ値を使用して、マーカーをランク付けした。この分析により、ＩＦＮＡＲ１、ＭＡＰ３Ｋ７、ＳＴＡＴ３、ＴＮＦＲＳＦ１３Ｂ、ＭＥＦ２Ｂ、およびＡＮＸＡ１１の遺伝子座における６つの染色体コンフォメーションを同定した。まとめると、これらの６つの相互作用により、ＤＬＢＣＬ染色体コンフォメーションシグネチャ（ＤＬＢＣＬ－ＣＣＳ）が形成された（図２０）。
ＤＬＢＣＬ－ＣＣＳにおける６つのマーカーを、ランダムフォレスト分類子モデルを作成するために使用し、既知の疾患サブタイプの発見コホートにおけるデータ分割の各々に対する試験セット（１２のサンプル、６のＡＢＣおよび６のＧＣＢ）を分類するように適用した。主成分分析（ＰＣＡ）により、ＤＬＢＣＬ－ＣＣＳ分類子はＡＢＣおよびＧＣＢの患者を健常対照から分離することができた（図２６）。ＤＬＢＣＬ－ＣＣＳに対する複合予測確率は、ロジスティック回帰を使用して生成された各マーカーに対するオッズ比およびモデルに対するオッズ比とともに表２２に示される。モデルは、０．１８６から０．８１の範囲のＡＢＣおよびＧＣＢに対する予測確率スコアを提供した（０＝ＡＢＣ、１＝ＧＣＢ）。正しい分類に対する確率カットオフ値を、ＡＢＣに対して０．３０以下、ＧＣＢに対して０．７０以上に設定した。０．３０以下のスコアは１００％の真の陽性率（感度）（９５％の信頼区間［９５％のＣＩ］８８．４～１００％）であり、一方で０．７０以上のスコアは９６．７％の真の陰性奏効率（特異度）（９５％のＣＩ ８２．８～９９．９％）であった。ＤＬＢＣＬ－ＣＣＳ分類子を用いると、サブタイプ化に対するＦｌｕｉｄｉｇｍ呼び出しと比較して、６０人の患者のうち６０人（１００％）がＡＢＣまたはＧＣＢとして正しく分類された（図２１Ａ、表２２）。このサンプルコホートでのＤＬＢＣＬ－ＣＣＳ分類子に対する受信者動作特性（ＲＯＣ）曲線下のＡＵＣは１であった（図２１Ｂ）。最後に、ＤＬＢＣＬ－ＣＣＳによって行われたＤＬＢＣＬサブタイプの呼び出しを、既知の疾患サブタイプの患者の長期生存曲線と比較した。ＡＢＣとして呼び出しされた患者は、ＧＢＣとして呼び出しされた患者よりも著しく悪い生存率を示した（図２１Ｃ）。
次に、より中間のＬＰＳ値を有する５８人のＤＬＢＣＬ患者のＤＬＢＣＬ－ＣＣＳ評価コホートのパフォーマンスを評価した。ＤＬＢＣＬ－ＣＣＳを適用して、これらの患者をＤＬＢＣＬサブタイプに割り当て、読み出し値をＦｌｕｉｄｉｇｍによって作成された読み出し値と比較した。ＤＬＢＣＬ－ＣＣＳが５８個のサンプルすべてに対してサブタイプ化の呼び出しを行い、一方でＦｌｕｉｄｉｇｍアッセイは３７個のサンプルに対してサブタイプ化の呼び出しを行い、２１個を「未分類」として残した（図２２）。両方のアッセイに対するサブタイプの呼び出しが利用可能である３７のサンプルのうち、１５のサンプル（４０％）を両方のアッセイによって同様に呼び出した（８のＡＢＣおよび７のＧＣＢ）（図２２）。次に、診断時に行われたサブタイプの呼び出しをタイプＩＩＩ患者の長期生存曲線と比較することによって、ＤＬＢＣＬ－ＣＣＳおよびＦｌｕｉｄｉｇｍによって行われたＤＬＢＣＬサブタイプ呼び出しのパフォーマンスを評価した。図２３のカプラン・マイヤー生存曲線に示されているように、ＤＬＢＣＬ－ＣＣＳによって行われたＡＢＣ／ＧＢＣ呼び出しは、ＤＬＢＣＬにおける既知の生存傾向に基づいて２つの集団を分離することができ、ＡＢＣサブタイプは予後不良であった。対照的に、Ｆｌｕｉｄｉｇｍによって定義されたＡＢＣおよびＧＣＢの集団は、臨床的に観察されてきたものとは反対のものであり、ＡＢＣとして分類されたサンプルはＧＣＢとして分類されたサンプルよりも生存期間が長かった。統計学的に有意ではないが、ＤＬＢＣＬ－ＣＣＳによって行われたサブタイプの呼び出しは、ハザード比分析によるサブタイプ間の生存率の違いの過去の臨床観察と一致した。２つの方法間で平均生存時間の有意差が見つかった。ＦｌｕｉｄｉｇｍによってＡＢＣおよびＧＣＢとして分類された患者の平均生存期間は、それぞれ、６５１日および６２６日であり（ｐ＝０．８５４）、一方でＤＬＢＣＬ－ＣＣＳアッセイによってＡＢＣおよびＧＣＢとして分類された患者の平均生存期間は、５５０日および８０１日であった（ｐ＝０．０１７）（図２４）。
この研究でエピジェネティックに調節不全であることが観察された遺伝子座と、ＤＬＢＣＬに関連すると以前に報告された生物学的メカニズムとの間の関連性を調査するために、上位１０の調節不全の遺伝子座を入力として使用して一連のネットワークおよび経路分析を実施した。まず、ＣｙｔｏｓｃａｐｅにおいてＲｅａｃｔｏｍｅ Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ Ｎｅｔｗｏｒｋを構築することによって、これらの遺伝子座が生物学的にどのように関連しているかを調査し、これによって、ＮＦＫＢ１、ＳＴＡＴ３、およびＮＦＡＴＣ１を中心とするネットワークを明らかにした。ＳＴＲＩＮＧ ＤＢを使用してネットワークを構築するために１０個の遺伝子座が使用された場合にも同様の状況が浮かび上がり、最も接続されたハブはＮＦＫＢ１、ＳＴＡＴ３、ＭＡＰ３Ｋ７、およびＣＤ４０を中心としていた。生物学的プロセスに関する上位のエンリッチメントされたＧＯ用語は「転写の正の制御、ＤＮＡテンプレート」であり、分子機能に関する上位のエンリッチメントされたＧＯ用語は「転写活性化因子の活性、ＲＮＡポリメラーゼＩＩ転写制御領域配列特異的な結合」であり、および「トール様受容体シグナル伝達経路」は最もエンリッチメントされたＫＥＧＧ経路であった（表２２）。上位１０の遺伝子座をＫＥＧＧトール様受容体シグナル伝達経路にマッピングすると、ＮＦ－ｋＢおよびインターフェロン媒介性のＪＡＫ－ＳＴＡＴシグナル伝達カスケードを介した炎症性サイトカインおよび共刺激分子の産生に関連する特異的なカスケードを発見した。
異なるＤＬＢＣＬサブタイプに関する疾患の進行に違いが観察されるため、ＡＢＣとＧＢＣの疾患サブタイプを区別することができる簡単で信頼性の高い検査が臨床的に急務となっている。疾患の侵攻性を考慮すると、ＤＬＢＣＬは即時の治療を必要とする。２つの主要なサブタイプは異なる臨床管理パラダイムを有し、特異的なサブタイプを標的とする開発中のいくつかの治療法を用いて、迅速かつ正確な疾患診断を行うことが、臨床管理が疾患サブタイプの知識に依存する場合に重要である。ＤＬＢＣＬにおけるＣＯＯ分類の分野は、ＩＨＣベースの方法論からＤＮＡマイクロアレイ、並列定量的逆転写ＰＣＲ（ｑＲＴ－ＰＣＲ）、およびデジタル遺伝子発現にまで拡大している。現在好まれている方法は、ＦＦＰＥ組織に対するＧＥＰによるＣＯＯの同定に基づいており、臨床現場でのその幅広い採用を制限するいくつかの技術的なおよびロジスティック上の制限に悩まされている。さらに、ＦＦＰＥ組織に対するＧＥＰによるＣＯＯ分類のパフォーマンスおよび信頼性に影響を与える多くの要因が存在し、これらは、リンパ腫標本の性質／品質、データ収集のための実験方法、データの正規化および変換、使用される分類子のタイプ、およびサブタイプの割り当てに使用される確率カットオフを含む。最後に、Ｆｌｕｉｄｉｇｍアプローチを使用してサンプル収集から最終読み出しに移行することは、パフォーマンスの変動をもたらす可能性がある多くの工程間の複雑で時間のかかるプロセスである。これらの要因はすべて、アッセイの全体的なターンアラウンドタイムに影響を与え、既存の薬剤を使用した疾患の診断およびその治療の通知に加えて、新規のＤＬＢＣＬ治療法の後期試験に対する患者の選択に臨床的にも使用することができる方法を制限する。したがって、ＤＬＢＣＬサブタイプを区別するための単純で、低侵襲性であり信頼性の高いアッセイが必要とされている。
段階的な発見アプローチを使用して、ＤＬＢＣＬサブタイプを正確に区別することができる６マーカーのエピジェネティックバイオマーカーパネル、ＤＬＢＣＬ－ＣＣＳを同定した。遺伝子発現シグネチャに由来するサブタイプの結果と比較すると、完全な一致があり、分類子の開発に使用されたサンプルであったため、これは予想されていた。中間ＬＰＳを有するサンプルに適用したときの２つのアッセイ間の一致は低かった（たった４０％超）。これはおそらく、分類方法が異なるＤＬＢＣＬサブタイプの呼び出しに全体的な一致を欠いていることが言及されているため予測されるものであり、タイプＩＩＩのサンプルは、おそらく、そもそもより中間的な生物学を反映している不均質な集団である。しかし、疾患が進行するにつれて長期的に追跡されたタイプＩＩＩのＤＬＢＣＬ患者におけるＥｐｉＳｗｉｔｃｈアッセイの予測分類能力を評価したとき、ＥｐｉＳｗｉｔｃｈアッセイを使用した疾患サブタイプのベースライン予測は、未分類の疾患を有する患者で観察された生存曲線に基づいて実際の疾患サブタイプを予測するのに良好であった。ここで使用される制御３Ｄゲノミクスに基づくエピジェネティックな読み出しが、転写ベースのゴールドスタンダード分子アプローチよりも実際の臨床転帰と一致しているという観察結果は、ＤＬＢＣＬの管理における作用し得る進歩を表している。これはまた、腫瘍学的状態の表現型の違いに密接に関連する分子モダリティとして制御３Ｄゲノミクスのシステム生物学的評価とも一致している。ＤＬＢＣＬが生物学的連続体上で動作し、サブタイプ間の疾患生物学に有意な異質性があることに留意する。設計上、ＤＬＢＣＬ－ＣＣＳを、タイプＩＩＩのサンプルをＡＢＣまたはＧＣＢいずれかのサブタイプに分類するように設定した。ＧＥＸ分析により、タイプＩＩＩのサンプルを、中間のサブタイプの生物学を有していると同定され、そのため、患者のより不均質な集団を表し得る。しかし、ＤＬＢＣＬ－ＣＣＳが、ＧＥＸベースのアプローチを使用するよりも臨床進行によって測定される疾患サブタイプのより良好な予測因子であること、およびＥｐｉＳｗｉｔｃｈアッセイがすべてのサンプルでサブタイプの呼び出しを行うことができたという事実の全体的な観察結果は、このアプローチが、予後の見通しについて通知する、治療の判定を誘導し得る、および現在開発中の新規の治療薬への反応に対する予測を提供するように臨床現場で適用することができることの最初の兆候を提供している。
ネットワーク分析では、ＮＦ－ｋＢおよびＳＴＡＴ３シグナル伝達カスケードが、ＤＬＢＣＬサブタイプを区別する推定メディエータとして出現した。ＤＬＢＣＬにおけるＮＦ－ｋＢシグナル伝達の役割は以前に研究されており、実際、ＡＢＣサブタイプの判別機能の１つは、ＮＦ－ｋＢ標的遺伝子の構成的発現であり、これは、これらの患者の予後不良に対して仮説が立てられているメカニズムである。さらに、構成的シグナル伝達活性化を引き起こす変異は、ＴＮＦＡＩＰ３およびＭＹＤ８８を含むいくつかのＮＦ－ｋＢ経路遺伝子のＡＢＣサブタイプで主に観察されている。
ＤＬＢＣＬの既知のメカニズムを検証することに加えて、ここでのネットワーク分析は、ＤＬＢＣＬにおける治療的介入に対する新規の潜在的なターゲットを同定した。例えば、カルシウムによって制御されたリン脂質結合タンパク質であるＡＮＸＡ１１は、結腸直腸癌、胃癌、および卵巣癌などの他の腫瘍学的疾病に関与しており、ＤＬＢＣＬにおける新規の治療的介入ポイントとなり得る。
ここで説明するＤＬＢＣＬサブタイプ化へのアプローチの主な臨床的利点の１つは、簡素化された検査方法およびワークフローにある。ＧＥＰによる従来のゴールドスタンダードのサブタイプ化は、さまざまな商用プラットフォームを使用して行うことができるが、すべては概して以下の４段階のアプローチに従う（およびこれらを必要とする）：１）組織生検の取得、２）ＦＦＰＥ組織切片の調製、３）遺伝子発現分析、および４）サブタイプのアルゴリズムによる分類。拡大した末梢リンパ節の細針組織生検を得るには、入院患者が臨床現場を訪れ、麻酔を必要とする侵襲的な医療処置を受ける必要とする。それを得ると、パラフィン包埋のために新鮮な生検を準備する必要がある。これは多段階のプロセスであるが、概して、液体固定剤（ホルマリンなど）を検体全体に浸透させるのに十分な時間の浸漬、エタノール勾配を介する連続的な脱水、およびその後の有毒化学物質であるキシレンでの透明化を伴う。最後に、生体試料は、パラフィンワックスで浸潤され、放冷して固化させる必要があり、ミクロトームを使用してマイクロメートルの切片に切断され、実験用スライド上に取り付けられ得る。新鮮な組織からスライド上のＦＦＰＥセクションに移動させるプロセス全体には、数日かかり得る。次に、遺伝子発現分析を行うために、本質的に不安定なＲＮＡを、スライドに取り付けられた組織切片から抽出し、アレイの製造元の仕様に従ってマイクロアレイへのハイブリダイゼーションのために調整し、このプロセスは１日を超え得る。マイクロアレイハイブリダイゼーションに続いて、相対的な遺伝子発現レベルのデジタル読み出し値が得られ、分類アルゴリズムに供給され、ＤＬＢＣＬサブタイプを判定する。総じて、ＤＬＢＣＬが疑われる患者からサブタイプの読み出しに移行するプロセスには、最大１週間以上かかる場合があり、高価なテクノロジーを使用した多くのさまざまな実験工程が含まれ、その各々が途中で実験の可変性をもたらす可能性がある。ここで説明するアプローチでは、生体液の収集からサブタイプの読み出しまでの時間と工程数が劇的に減少する。ＤＬＢＣＬが疑われる患者は、定期的な少量（～１ｍＬ）の採血のために外来診療所に来院することができる。その後、新鮮な凍結血液を、この研究で同定された染色体コンフォメーションの有無の分析のために中央の認定された参考検査室に送ることができ、これは、サンプルを受け取ってから２４時間以内に簡潔で定期的なＰＣＲ計測を使用して染色体コンフォメーションを検出するために、特異的なＰＣＲプライマーセットおよび反応条件とともに入力としてさらに少量（～５０ｍＬ）の全血を使用するプロセスである。ここで説明するＤＬＢＣＬサブタイプ化へのアプローチは、提案された方法論を使用したさらなる改良の可能性が存在するという追加の利点を提供する。この研究では、分類子を構成する染色体コンフォメーションを検出するために、ネステッドＰＣＲ反応のセットを使用してＤＬＢＣＬ－ＣＣＳの最終的な読み出しが行われた。このＰＣＲベースの出力は、定量ＰＣＲを読み出しとして利用し、参考検査室および検査場所にわたる実験の再現性および信頼性を高めるように設計された、定量リアルタイムＰＣＲ実験（ＭＩＱＥ）ガイドラインの公開のための最小限の情報の下で動作するようにさらに改良することができる。最後に、ここで説明するアプローチは、さまざまな生理学的に不均質な形態など、疾患自体の発展する理解に適応可能である。
結論として、ここでは、ＥｐｉＳｗｉｔｃｈ ＣＣＳ読み出しを使用して全血サンプルからの非侵襲的ＣＯＯ割り当てのためのロバストな補完的方法を開発した。ＤＬＢＣＬ患者の大規模コホートでのこの分類アプローチの臨床的妥当性を実証した。ＥｐｉＳｗｉｔｃｈプラットフォームには、臨床的有用性を有するバイオマーカーモダリティとしていくつかの魅力的な特徴がある。ＣＣＳは、非常に高い生化学的安定性を有し、非常に少量の血液（典型的に約５０μｌ）を使用して検出することができ、検出には確立された実験方法および標準的なＰＣＲ読み出し（ＭＩＱＥ準拠のｑＰＣＲを含む）を利用する。最終的に、ＥｐｉＳｗｉｔｃｈアッセイの迅速なターンアラウンドタイム（～８－１６時間）は、Ｆｌｕｉｄｉｇｍプラットフォームに対する４８時間以上と比べて遜色ない。
実施例６イヌのＤＬＢＣＬに関するさらなる研究
ここでは、ＥｐｉＳｗｉｔｃｈ（商標）プラットフォーム技術を使用して、イヌのびまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）を検出するためのバイオマーカーとして染色体コンフォメーションシグネチャ（ＣＣＳ）を評価した。ＥｐｉＳｗｉｔｃｈ（商標）によってヒトＤＬＢＣＬ患者において以前に特徴付けられた確立された全身性の液体細胞診バイオマーカーが、相同免疫病を有する犬に変換されるかどうかを調査した。ヒトから犬へのＣＣＳのオルソロガスな配列変換を、対照およびリンパ腫のイヌのコホートで最初に検証し、妥当性を確認した。
ここでは、ＥｐｉＳｗｉｔｃｈ（商標）プラットフォーム技術を使用して、イヌのびまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）を検出するためのバイオマーカーとして染色体コンフォメーションシグネチャ（ＣＣＳ）を評価した。ＥｐｉＳｗｉｔｃｈ（商標）によってヒトＤＬＢＣＬ患者において以前に特徴付けられた確立された全身性の液体細胞診バイオマーカーが、相同免疫病を有する犬に変換されるかどうかを調査した。ヒトから犬へのＣＣＳのオルソロガスな配列変換を、対照およびリンパ腫のイヌのコホートで最初に検証し、妥当性を確認した。
ＤＬＢＣＬの犬および明らかに健康な犬から血液サンプルを得た。ＤＬＢＣＬと診断された犬はすべて、ＬＩＣＫｉｎｇリンパ腫治験の一部であった。血液サンプルを、治療を開始する前、および実験的介入の＋５日後、しかしドキソルビシン化学療法を開始する前に、各犬から得た。ＥｐｉＳｗｉｔｃｈ技術を使用して、ＣＣＳに対する全身的なエピジェネティックバイオマーカーをモニターした。
１１マーカー分類子を、ヒトＤＬＢＣＬで同定された７５のＥｐｉＳｗｉｔｃｈ ＣＣＳのプールから、２８匹の犬、すなわちＤＬＢＣＬと診断された１４匹および明らかな疾患のない１４匹の対照からの全血で生成した。開発された診断マーカーの検証を、１０匹の犬、すなわちＤＬＢＣＬを有する５匹および５匹の対照の第２のコホートで実施した。 分類子は、第２のコホートでの８０％の精度、８０％の感度、８０％の特異度、８０％の正の予測値（ＰＰＶ）および８０％の負の予測値（ＮＰＶ）でＤＬＢＣＬ対非ＤＬＢＣＬに対する層別化をもたらした。
確立されたＥｐｉＳｗｉｔｃｈ分類子は、通常は遺伝子マーカーに起因する特徴を備えたエピジェネティックな調節解除の強力な全身性のバイナリマーカーを含み、これらの分類マーカーのバイナリステータスは診断にとって統計学的に有意である。
Claims (15)
- 前立腺がんの予後に関連するサブグループを表す染色体状態を検出するためのプロセスであって、前記染色体状態に関連する染色体相互作用がゲノムの定義された領域内に存在するか否かを決定することを含み、前記染色体相互作用が、次の表に示される任意のプローブによって表される染色体相互作用のいずれかに対応する、プロセス。
- 前記前立腺がんの予後は、がんが侵攻性であるかまたは緩慢性であるかに関連する、請求項１記載のプロセス。
- （ｉ）請求項１に記載の表に示されるプローブによって表される染色体相互作用のすべてを含む、および／または
（ii）請求項１に記載の表に示されるプローブによって表される染色体相互作用の少なくとも１、２、３、または４個を含む、
染色体相互作用の組み合わせ、が分類される、請求項１または２に記載のプロセス。 - 染色体相互作用が、
－ 個体からのサンプルにおいて、および／または
－ 染色体相互作用の部位でのＤＮＡループの有無を検出することによって、および／または
－ 染色体コンフォメーションにおいて一緒になっている染色体の遠位領域の有無を検出することによって、および／または
－ 染色体相互作用において一緒になる染色体の領域に各々対応する２つの領域を含む配列を有するライゲートされた核酸の存在を検出することによって
分類され、
前記ライゲートされた核酸の検出が、
（ｉ）次の表：
に記載のプローブ配列のいずれかと少なくとも７０％の同一性を有するプローブにより、および／または（ii）次の表：
に記載の任意のプライマー対と少なくとも７０％の同一性を有するプライマー対により行われる、請求項１～３のいずれか１項に記載のプロセス。
- 前記染色体相互作用が、
（ｉ）染色体相互作用で一緒になった染色体領域を架橋する工程と、
（ii）随意に酵素を用いる制限消化切断によって、前記架橋領域を切断にさらす工程と、
（iii）前記架橋された切断されたＤＮＡ末端をライゲートして、ライゲートされた核酸を形成する工程と、
（iv）前記染色体相互作用に対応するライゲートされた核酸が存在するか否かを検出する工程
を含む方法により検出される、請求項１～４のいずれか１項に記載のプロセス。 - 請求項１に記載の表に示される任意のプローブによって表される染色体相互作用の少なくとも５つの染色体相互作用を分類する工程を含む、前立腺がんが侵攻性であるか緩慢性であるかを判定するために実行される、請求項１～５のいずれか１項に記載のプロセス。
- 好ましくは、前記プロセスは、候補薬剤が、異なるレベルの予後に関連付けられている染色体状態への変化を引き起こすことができるかどうかを検出するために使用され、
前記染色体相互作用の変化が、（ｉ）請求項５に記載のプローブ配列のいずれかと少なくとも７０％の同一性を有するプローブ、および／または（ii）請求項５に記載の任意のプライマー対と少なくとも７０％の同一性を有するプライマー対によってモニターされる、
前立腺がんに対する治療薬を特定または設計するために実行される、請求項１～６のいずれか１項に記載のプロセス。 - 染色体相互作用の検出に基づいて標的を選択する工程、および好ましくは前記標的のモジュレータをスクリーニングして免疫療法のための治療薬を特定する工程を含み、前記標的が随意にタンパク質である、請求項７に記載のプロセス。
- 前記予後がヒトまたはイヌにおけるものである、請求項１～８のいずれか１項に記載のプロセス。
- 前記分類または検出が、前記ライゲートされた産物を増幅することができるプライマーおよびＰＣＲ反応中にライゲートされた部位に結合するプローブを使用する定量ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）による前記ライゲートされた産物の特異的検出を含み、前記プローブが、染色体相互作用で一緒になった染色体領域の各々からの配列に相補的な配列を含み、好ましくは、前記プローブが、
前記ライゲートされた産物に特異的に結合するオリゴヌクレオチド、および／または
前記オリゴヌクレオチドの５’末端に共有結合したフルオロフォア、および／または
前記オリゴヌクレオチドの３’末端に共有結合した消光剤を含み、
および随意に、
前記フルオロフォアが、ＨＥＸ、Ｔｅｘａｓ ＲｅｄおよびＦＡＭから選択される、および／または
前記プローブが、１０から４０のヌクレオチド塩基の長さ、好ましくは２０から３０のヌクレオチド塩基の長さの核酸配列を含む、請求項１～９のいずれか１項に記載のプロセス。 - － 前記プロセスの結果がレポートで提供される、および／または
－ 前記プロセスの結果が、患者の治療スケジュールを選択するために使用される、および好ましくは個体のための特定の治療法を選択するために使用される、請求項１～１０のいずれか１項に記載のプロセス。 - 次の表に示されるいずれかのプローブによって表される少なくとも１つの染色体相互作用が存在するか否かがさらに決定される、請求項１または２に記載のプロセス。
- 次の表に示されるいずれかのプローブによって表される少なくとも１つの染色体相互作用が存在するか否かがさらに決定される、請求項１または２に記載のプロセス。
- 次の表に示されるプローブのいずれかによって表される少なくとも１つの染色体相互作用が存在するか否かがさらに決定される、請求項１または２に記載のプロセス。
- 次の表に示されるプローブのいずれかによって表される少なくとも１つの染色体相互作用が存在するか否かがさらに決定される、請求項１または２に記載のプロセス。
Applications Claiming Priority (7)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| GB1906487.2 | 2019-05-08 | ||
| GBGB1906487.2A GB201906487D0 (en) | 2019-05-08 | 2019-05-08 | DNA Marker |
| GB1914729.7 | 2019-10-11 | ||
| GB201914729A GB201914729D0 (en) | 2019-10-11 | 2019-10-11 | DNA marker |
| GB2006286.5 | 2020-04-29 | ||
| GBGB2006286.5A GB202006286D0 (en) | 2020-04-29 | 2020-04-29 | DNA marker |
| PCT/GB2020/051105 WO2020225551A1 (en) | 2019-05-08 | 2020-05-06 | Chromosome conformation markers of prostate cancer and lymphoma |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2022532108A JP2022532108A (ja) | 2022-07-13 |
| JPWO2020225551A5 true JPWO2020225551A5 (ja) | 2023-05-16 |
Family
ID=70775424
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2021566070A Pending JP2022532108A (ja) | 2019-05-08 | 2020-05-06 | 前立腺がんおよびリンパ腫の染色体コンフォメーションマーカー |
Country Status (13)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US20230049379A1 (ja) |
| EP (1) | EP3966350A1 (ja) |
| JP (1) | JP2022532108A (ja) |
| KR (1) | KR20220007132A (ja) |
| CN (1) | CN114008218A (ja) |
| AU (3) | AU2020268861B2 (ja) |
| CA (1) | CA3138719A1 (ja) |
| GB (3) | GB202117415D0 (ja) |
| IL (1) | IL287597A (ja) |
| SG (1) | SG11202112221TA (ja) |
| TW (1) | TW202108773A (ja) |
| WO (1) | WO2020225551A1 (ja) |
| ZA (1) | ZA202109658B (ja) |
Family Cites Families (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN112322735A (zh) * | 2014-01-16 | 2021-02-05 | 启迪公司 | 用于前列腺癌复发的预后的基因表达面板 |
| CN108738329A (zh) * | 2015-05-29 | 2018-11-02 | 皇家飞利浦有限公司 | 前列腺癌预后方法 |
| WO2016207647A1 (en) * | 2015-06-24 | 2016-12-29 | Oxford Biodynamics Limited | Epigenetic chromosome interactions |
| WO2018100381A1 (en) * | 2016-12-01 | 2018-06-07 | Oxford Biodynamics Limited | Application of epigenetic chromsomal interactions in cancer diagnostics |
-
2020
- 2020-05-06 AU AU2020268861A patent/AU2020268861B2/en active Active
- 2020-05-06 GB GBGB2117415.6D patent/GB202117415D0/en active Pending
- 2020-05-06 US US17/609,273 patent/US20230049379A1/en active Pending
- 2020-05-06 SG SG11202112221TA patent/SG11202112221TA/en unknown
- 2020-05-06 GB GB2406403.2A patent/GB2626699A/en active Pending
- 2020-05-06 GB GB2117415.6A patent/GB2597895B/en active Active
- 2020-05-06 WO PCT/GB2020/051105 patent/WO2020225551A1/en unknown
- 2020-05-06 JP JP2021566070A patent/JP2022532108A/ja active Pending
- 2020-05-06 CN CN202080044081.9A patent/CN114008218A/zh active Pending
- 2020-05-06 CA CA3138719A patent/CA3138719A1/en active Pending
- 2020-05-06 EP EP20726912.7A patent/EP3966350A1/en active Pending
- 2020-05-06 KR KR1020217040317A patent/KR20220007132A/ko unknown
- 2020-05-07 TW TW109115266A patent/TW202108773A/zh unknown
-
2021
- 2021-10-26 IL IL287597A patent/IL287597A/en unknown
- 2021-11-26 ZA ZA2021/09658A patent/ZA202109658B/en unknown
- 2021-12-14 AU AU2021286282A patent/AU2021286282B2/en active Active
- 2021-12-14 AU AU2021286283A patent/AU2021286283B2/en active Active
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| AU2022228167A1 (en) | Methods and materials for assessing loss of heterozygosity | |
| WO2017077499A1 (en) | Biomarkers of squamous cell carcinoma of head and neck, prognostic markers of recurrence in squamous cell carcinoma of head and neck, and methods thereof | |
| EP2121988B1 (en) | Prostate cancer survival and recurrence | |
| US20230377686A1 (en) | Immune gene expression signature in treg enriched tumor samples | |
| JP2023082157A (ja) | 遺伝子調節 | |
| JP2021526375A (ja) | 検出方法 | |
| US20180051342A1 (en) | Prostate cancer survival and recurrence | |
| CN101457254B (zh) | 用于肝癌预后的基因芯片和试剂盒 | |
| AU2022255198A1 (en) | Cell-free dna sequence data analysis method to examine nucleosome protection and chromatin accessibility | |
| JP2024504062A (ja) | 染色体相互作用 | |
| AU2020268861B2 (en) | Chromosome conformation markers of prostate cancer and lymphoma | |
| JP2022548249A (ja) | 診断用染色体マーカー | |
| JPWO2020225551A5 (ja) | ||
| AU2022230780B2 (en) | Chromosome interaction markers | |
| CN111919257B (zh) | 降低测序数据中的噪声的方法和系统及其实施和应用 | |
| CN117795098A (zh) | 染色体相互作用标志物 | |
| EA043425B1 (ru) | Уровни экспрессии иммуноглобулинов в качестве биологического маркера для реакции на ингибитор протеасом |