JP2019516378A5

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Publication number: JP2019516378A5
Application number: JP2018560571A
Authority: JP
Filing date: 2017-05-18
Publication date: 2020-06-18
Anticipated expiration: 2037-05-18

Claims

宿主細胞のゲノムに１つまたは複数の外因性ドナー核酸を組み込むための方法であって、
（ａ１）または（ａ２）のいずれか：
（ａ１）宿主細胞のゲノム中に組み込まれた１つまたは複数の（x）外因性ランディングパッドを含む宿主細胞であって、各外因性ランディングパッドは、上流ランディングパッド相同配列（ULP）と下流ランディングパッド相同配列（DLP）との間に位置するヌクレアーゼ標的配列（NTS）を含む、宿主細胞を、
（ｉ）１つまたは複数の第１のコンポーネントポリヌクレオチドであって、各第１のコンポーネントポリヌクレオチドは、５’から３’方向に、
（１）１つまたは複数の（x）外因性ランディングパッドのいずれかの任意の（ULP）と相同組換えが可能な上流ライブラリー配列（UL）；
（２）第１の目的の核酸、および
（３）第１のリンカー配列
を含む、第１のコンポーネントポリヌクレオチド；
（ｉｉ）１つまたは複数の最後のコンポーネントポリヌクレオチドであって、各最後のコンポーネントポリヌクレオチドは、５’から３’方向に、
（１）最後のリンカー配列；
（２）最後の目的の核酸；および
（３）１つまたは複数の（x）外因性ランディングパッドのいずれかの任意の（DLP）で、相同組換えが可能な下流ライブラリー配列（DL）、
を含む、最後のコンポーネントポリヌクレオチド
と接触させる工程であって、
１つまたは複数の第１のコンポーネントポリヌクレオチドの任意の第１のリンカー配列は、１つまたは複数の最後のコンポーネントポリヌクレオチドの任意の最後のリンカー配列と相同組換えが可能である、工程；または
（ａ２）宿主細胞のゲノム中に組み込まれた１つまたは複数の（x）外因性ランディングパッドを含む宿主細胞であって、各外因性ランディングパッドは、上流ランディングパッド相同配列（ULP）と下流ランディングパッド相同配列（DLP）との間に位置するヌクレアーゼ標的配列（NTS）を含む、宿主細胞を、
（ｉ）１つまたは複数の第１のコンポーネントポリヌクレオチドであって、各第１のコンポーネントポリヌクレオチドは、５’から３’方向に、１つまたは複数の（x）外因性ランディングパッドの任意の（ULP）と相同組換えが可能な上流ライブラリー配列（UL）、Ｄ_０群から選択される任意のＤＮＡセグメント、リンカー配列ＬＢ_０を含む、第１のコンポーネントポリヌクレオチド；
（ｉｉ）１つまたは複数の中間コンポーネントポリヌクレオチドであって、各中間コンポーネントポリヌクレオチドは、５’から３’方向に、第１のリンカー配列ＬＡ_ｎ、Ｄ_ｎ群から選択される任意のＤＮＡセグメント、第２のリンカー配列ＬＢ_ｎを含み、ｎは、１から中間コンポーネントポリヌクレオチドの数までの整数を表す、中間コンポーネントポリヌクレオチド；および
（ｉｉｉ）１つまたは複数の最後のコンポーネントポリヌクレオチドであって、各最後のコンポーネントポリヌクレオチドは、５’から３’方向に、リンカー配列ＬＡ_ｍ、Ｄ_ｍ群から選択される任意のＤＮＡセグメント、および１つまたは複数の（x）外因性ランディングパッドの任意の（DLP）と相同組換えが可能な下流ライブラリー配列（DL）を含む、最後のコンポーネントポリヌクレオチド
と接触させる工程であって、
各リンカー配列ＬＢ_{（ｐ−１）}は、リンカー配列ＬＡ_ｐと相同組換えが可能であり、ｎは、１〜（ｍ−１）の様々な整数であり、ｐは、１〜ｍの整数を表し、各Ｄ_０群、・・・Ｄ_ｎ群、・・・Ｄ_ｍ群、は、独立して、１つまたは複数のＤＮＡセグメントからなる、工程；および
（ｂ）（NTS）に結合し、１つまたは複数の（x）外因性ランディングパッド内の部位を切断することが可能な、１つまたは複数のヌクレアーゼ（N）；および
（ｃ）接触させた宿主細胞から生成した宿主細胞を回収する工程；
を含み、
（ａ１）について、１つまたは複数の第１のコンポーネントポリヌクレオチドからの第１のコンポーネントポリヌクレオチドと、１つまたは複数の最後のコンポーネントポリヌクレオチドからの最後のコンポーネントポリヌクレオチドとの任意の組合せが、インビボでそれらのリンカー配列を介して相同組換えされ、該組合せが、各ランディングパッド周辺のゲノム配列から独立して、１つまたは複数の（x）外因性ランディングパッドのいずれかにおいて組み込まれ、ｘは、少なくとも１の整数であり；
（ａ２）について、１つまたは複数の第１のコンポーネントポリヌクレオチドからの第１のコンポーネントポリヌクレオチド、１つまたは複数の中間コンポーネントポリヌクレオチドからの中間コンポーネントポリヌクレオチド、および１つまたは複数の最後のコンポーネントポリヌクレオチドからの最後のコンポーネントポリヌクレオチドの任意の組合せが、インビボでそれらのリンカー配列を介して相同組換えされ、該組合せが、各ランディングパッド周辺のゲノム配列から独立して、１つまたは複数の（x）外因性ランディングパッドのいずれかにおいて組み込まれ、ｘは、少なくとも１の整数である、方法。
（ａ１）について、２つ以上の第１のコンポーネントポリヌクレオチドが、互いに同一な上流ライブラリー配列（UL）、および互いに同一な第１のリンカー配列を含み；１つまたは複数の最後のコンポーネントポリヌクレオチドが、互いに同一な最後のリンカー配列、および互いに同一な下流ライブラリー配列（DL）を含み；
（ａ２）について、２つ以上の第１のコンポーネントポリヌクレオチドが、互いに同一な上流ライブラリー配列（UL）、および互いに同一なリンカー配列ＬＢ_０を含み；２つ以上の中間コンポーネントポリヌクレオチドが、互いに同一な第１のリンカー配列ＬＡ_ｎ、および互いに同一な第２のリンカー配列ＬＢ_ｎを含み；２つ以上の最後のコンポーネントポリヌクレオチドが、互いに同一なリンカー配列ＬＡ_ｍ、および互いに同一な下流ライブラリー配列（DL）を含む、請求項１に記載の方法。
（ULP）および（DLP）の各々が、約２０ヌクレオチド〜約５，０００ヌクレオチド長、約２５ヌクレオチド〜約１０００ヌクレオチド長、約２５ヌクレオチド〜約５００ヌクレオチド長、または約１００ヌクレオチド〜約５００ヌクレオチド長を含む、請求項１または２に記載の方法。
宿主細胞が、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９または２０個の外因性ランディングパッドを含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
１つまたは複数の外因性ランディングパッドが、宿主細胞のゲノム中の選択されたニュートラルな遺伝子座において組み込まれている、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
１つまたは複数の外因性ランディングパッドが、宿主細胞のゲノム中の遺伝子間領域において組み込まれている、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
宿主細胞が、宿主細胞のゲノム中に組み込まれた少なくとも１つの二次ランディングパッド、二次上流ランディングパッド相同配列と二次下流ランディング相同性パッド配列との間に位置する二次ヌクレアーゼ標的配列を含む二次ランディングパッドをさらに含み、
（ａ）二次上流ランディングパッド配列は、１つまたは複数の外因性ランディングパッドの（ULP）とは異なっているか；
（ｂ）二次下流ランディングパッド配列は、１つまたは複数の外因性ランディングパッドの（DLP）とは異なっているか；
（ｃ）二次ヌクレアーゼ標的配列は、１つまたは複数の外因性ランディングパッドの（NTS）とは異なっているか；または
（ｄ）それらの任意の組合せである、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
（ULP）または（DLP）のいずれかまたは両方のヌクレオチド配列が、宿主細胞のゲノムの内因性ゲノム配列に実質的な相同性を有さないランダムに生成したヌクレオチド配列から得られる、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
（ULP）または（DLP）のいずれかまたは両方のヌクレオチド配列が、宿主細胞のゲノム中に存在しない、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
外因性ランディングパッドの各々が、上流内因性ゲノム配列と（ULP）の５’領域との間に位置するインシュレーター配列、（DLP）の３’領域と下流内因性ゲノム配列との間に位置するインシュレーター配列、または両方の配置に位置するインシュレーター配列を含む、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
各第１のコンポーネントポリヌクレオチド、中間コンポーネントポリヌクレオチド、および最後のコンポーネントポリヌクレオチドが、追加の機能的なエレメントを含む、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
追加の機能的なエレメントが、バーコード、（NTS）と異なる二次ヌクレアーゼ標的部位、シス調節エレメントのためのＤＮＡ結合部位、またはそれらの任意の組合せからなる群から選択される、請求項１１に記載の方法。
宿主細胞が、真菌細胞、細菌細胞、植物細胞、および動物細胞からなる群から選択される、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
真菌細胞が、サッカロマイセス・セレビシエ細胞である、請求項１３に記載の方法。