JP2019516378A - 外因性ランディングパッドへの核酸のゲノム組込みのための組成物および方法 - Google Patents

外因性ランディングパッドへの核酸のゲノム組込みのための組成物および方法 Download PDF

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Abstract

【課題】宿主細胞のゲノム中に操作により作製された１つまたは複数の外因性ランディングパッドに１つまたは複数の外因性ドナー核酸を組み込む組成物および方法が本明細書で提供される。【解決手段】ある特定の実施形態において、外因性ランディングパッドおよび外因性ドナー核酸は、外因性ドナー核酸が、ランディングパッド周辺のゲノム配列から独立して、ランディングパッドのいずれかへの組込みを起こすことができるように、標準化された適合性を有する相同性領域を含む。ある特定の実施形態において、本方法は、ランディングパッドを含む宿主細胞を、１つまたは複数の外因性ドナー核酸、およびランディングパッド内の二本鎖破断を引き起こすことが可能なヌクレアーゼと接触させる工程、およびいずれかのランディングパッドに組み込まれた１つまたは複数の外因性ドナー核酸を含む宿主細胞を回収する工程を含む。【選択図】図１３

Description

[0001] 本明細書で提供される組成物および方法は、一般的に、分子生物学および遺伝子工学の分野に関する。
[0002] 遺伝子工学技術は、様々な分野で宿主細胞のゲノムに改変を導入するのに使用されてきた。合成生物学の分野において、微生物を操作して標的分子を生産することはしばしば、宿主細胞のゲノムへの多数の異なる核酸の導入および組込みを伴う。発酵のための工業用微生物は、重度に遺伝子改変されており、新たな標的分子生産に複雑な生合成経路を操作するための標準的な技術を使用することは、膨大な量の時間と資源を消費する可能性がある。さらに、標的分子を生産するように株が一旦操作されたら、追加の性能の獲得はしばしば、単一の標的設計ではなく、複数のパラメーターの同時の改変（例えば、複数の遺伝子の過剰発現を、それ以外の下方制御と組み合わせること）を必要とする。
[0003] 一般的に、複数のパラメーターを改変するためのコンビナトリアル戦略は、株のエンジニア（strain engineer）によって予め決定されることになる。例えば、株のエンジニアは、宿主細胞に導入しようとする核酸コンストラクトのどの組合せがその表現型を改善するのかを手作業で決定することになる。しかしながら、大規模なコンビナトリアルなサーチの余地をカバーするために、何百または何千もの予め決定された核酸コンストラクトの組合せを構築し、宿主細胞に形質転換し、スクリーニングする必要があると予想される。このような大規模な核酸コンストラクトの組合せをスクリーニングして経験的に最適な組合せを決定することは、時間がかかると予想される。例えば、スクリーニングプロセスは、宿主細胞を何百または何千もの核酸コンストラクトの組合せで形質転換すること、各形質転換をＰＣＲで検証すること、および得られた形質転換宿主細胞の表現型を分析することを包含すると予想される。多くの場合において、異なる宿主細胞のバックグラウンドは、組換えのための好適な相同性領域がない可能性があり、または宿主細胞の機能に負の影響を与えることなく核酸コンストラクトを組み込むことができる「オープンな」ニュートラルなゲノム遺伝子座の利用可能性によって制限されると予想されることから、核酸コンストラクトを再使用することは、そのようなバックグラウンドにおいて問題を生じる可能性がある。
[0004] それゆえに、核酸コンストラクトの宿主細胞への導入および組込みのための改善された方法および組成物への必要性がある。さらに、宿主細胞の表現型および／または標的分子の産生をモジュレートするための核酸コンストラクトのコンビナトリアルな組込みのための改善された方法および組成物に対する必要性もある。
[0005] 宿主細胞媒介組換えを介した外因性ドナー核酸のゲノム組込みは、典型的には、各外因性ドナー核酸が、ゲノムの部位特異的な相同配列を有することを必要とする。これらの配列は、外因性ドナー核酸を特異的なゲノム部位で相同組換え(homologously recombine)を可能にする。異なるゲノム部位で、または異なる宿主細胞のバックグラウンドで外因性ドナー核酸を組み込むことが望ましい場合、外因性ドナー核酸は、組込みのための新しいゲノム部位に適合性を有する相同配列が包含されるように改変され再カスタマイズされることを必要とする。このようなカスタマイゼーションは、時間と資源を消費する。
[0006] したがって、一態様において、宿主細胞のゲノムへの組込みのための外因性ドナー核酸の再カスタマイゼーションを最小化する組成物および方法が本明細書で提供される。一実施形態において、宿主細胞のゲノムは、標準化された相同配列を含む外因性ドナー核酸の組込みをさらに容易にするのに使用できるランディングパッドを含むように改変される。宿主細胞のゲノム中に操作により作製されたランディングパッドは、外因性ドナー核酸の標準化された相同配列の相同組換えが可能なランディングパッド相同配列を含む。ある特定の実施形態において、外因性ドナー核酸は、ゲノム組込みのためにゲノムの部位特異的な相同配列を頼らない標準化された相同配列を含むことから、外因性ドナー核酸は、再カスタマイズする必要がなく、適合性を有するランディングパッドが存在する限り、異なる宿主細胞のバックグラウンドで、または異なるゲノム遺伝子座で再使用することができる。
[0007] 特定の実施形態において、宿主細胞のゲノム中の各ランディングパッドは、上流ランディングパッド相同配列（ULP）と下流ランディングパッド相同配列（DLP）との間に位置するヌクレアーゼ標的配列（NTS）をさらに含む。特定の実施形態において、ヌクレアーゼ標的配列（NTS）は、部位特異的ヌクレアーゼによって認識され結合できるヌクレオチド配列を含む。外因性ランディングパッドを有する宿主細胞は、ランディングパッド相同配列に適合性を有する相同配列を含む外因性ドナー核酸（ES）と同時に、部位特異的ヌクレアーゼと接触させることができる。ヌクレアーゼは、ランディングパッドで標的化された二本鎖破断を引き起こすと予想され、これは、ヌクレアーゼと接触していない宿主細胞と比較して（ES）組込み効率の有意な増加をもたらすと予想される。
[0008] 特定の実施形態において、外因性ドナー核酸は、モジュラー式のＤＮＡパーツである（コンポーネントポリヌクレオチドとも称される）。ある特定の実施形態において、単一のコンポーネントポリヌクレオチドそれだけでは、宿主細胞のゲノム中のランディングパッドでの相同組換えのための全ての相同配列を有していない。しかしながら、宿主細胞を複数のコンポーネントポリヌクレオチドと接触させる場合、適合性リンカー配列を有するこれらのコンポーネントポリヌクレオチドの２つ以上が、インビボで相同組換えして、組み立てられたコンポーネントポリヌクレオチドを生成することができる。組み立てられたコンポーネントポリヌクレオチドは、このようにしてランディングパッド相同配列に適合性を有する相同配列を含むこととなり、ランディングパッドでの相同組換えが可能になる。コンポーネントポリヌクレオチドは、コンビナトリアル的に互いに組み換えることができることから、コンポーネントポリヌクレオチドの使用は、特異的なゲノム遺伝子座に標的化される単一型の外因性ドナー核酸と比較して、外因性ドナー核酸のハイスループットな組込みおよびスクリーニングのために多大な分子多様性をもたらすことができる。
[0009] 別の態様において、宿主細胞は、宿主細胞のゲノム中に操作により作製された複数の標準化されたランディングパッドと共に提供される。用語「標準化された」ランディングパッドは、本明細書において、各ランディングパッドが、他のランディングパッド中のものと同一または実質的に同一な一対のランディングパッド相同配列（ULP）および（DLP）を含む複数のランディングパッドを指すものとして使用される。ある特定の実施形態において、外因性ドナー核酸もそれらの５’および３’領域において適合性を有する相同性領域で標準化される場合、それらは、それら各々のランディングパッド相同配列との相同組換えが可能である。外因性ドナー核酸は、標準化されたランディングパッドのいずれかで宿主細胞のゲノム中にランダムに組込みを起こすことができる。標準化されたランディングパッドのいずれかへの外因性ドナー核酸の組込みのランダムさは、大量の外因性ドナー核酸または外因性ドナー核酸のライブラリーを迅速かつコンビナトリアル的に組み込むのに有効な手段を提供することができる。
[0010] 例えば、宿主細胞のゲノム中に組み込まれた３０個の外因性ドナー核酸と３つの標準化されたランディングパッドとを用いれば、３０個の外因性ドナー核酸のいずれかは、３つの標準化されたランディングパッドのいずれかへの組込みを起こすことができ、その結果として、宿主細胞のゲノムに組み込まれた外因性ドナー核酸の２７，０００個の異なる組合せを含む可能性がある宿主細胞の集団が生じる。一方で、３つのゲノムの特異的な組込み部位への組込みを起こすように設計された３０個の外因性ドナー核酸を用いれば、宿主細胞のゲノムに組み込まれた外因性ドナー核酸の１０００個の異なる組合せを含む宿主細胞の集団を生成することができる。
[0011] コンビナトリアルな組込み多様性は、宿主細胞のゲノムに組み込もうとする外因性ドナー核酸としてコンポーネントポリヌクレオチドを利用することによってさらに強化することができる。例えば、上記で例示された例において、各外因性ドナー核酸が２つのコンポーネントポリヌクレオチドとして宿主細胞に導入される場合、それは、遺伝子型の２１６，０００個の異なる組合せを含む可能性がある宿主細胞の集団を生成することができる。標準化されたランディングパッドのいずれかへの（特異的なゲノム部位においてではなく）組み立てられたコンポーネントポリヌクレオチドの組込みのランダムさは、宿主細胞のゲノムに組み込まれたドナー核酸の分子多様性をさらに強化する。それゆえに、このようなランダムさは、改変された宿主細胞によって呈される望ましい特色を包含するより一層大規模な表現型のバリエーションをもたらすことができる。
[0012] したがって、一態様において、宿主細胞のゲノム中に組み込まれた１つまたは複数の（x）外因性ランディングパッドを含む宿主細胞であって、各外因性ランディングパッドは、上流ランディングパッド相同配列（ULP）と下流ランディングパッド相同配列（DLP）との間に位置するヌクレアーゼ標的配列（NTS）を含む、宿主細胞が本明細書で提供される。ある特定の実施形態において、宿主細胞のゲノム中の（x）外因性ランディングパッドの数は、約１〜約１００、約２〜約５０、約３〜約２０などのあらゆる好適な数であり得る。ある特定の実施形態において、適合性を有する相同配列を有する外因性ドナー核酸が、標準化されたランディングパッドのいずれかで宿主細胞媒介相同組換えを介して組込みを起こすことができるように、全てのランディングパッドは、標準化されたランディングパッド相同配列を含む。ある特定の実施形態において、ランディングパッドは、宿主細胞のゲノム中の選択されたニュートラルな遺伝子座において組み込まれている。特定の実施形態において、ランディングパッドは、宿主細胞のゲノム中の遺伝子間領域(intergenic region)において組み込まれている。
[0013] 別の態様において、１つまたは複数の外因性ドナー核酸（ES）であって、各外因性ドナー核酸は、上流ライブラリー配列（UL）と下流ライブラリー配列（DL）との間に位置する目的の核酸（D）を含み、各（UL）は、（x）外因性ランディングパッドのいずれかの（ULP）で相同組換えが可能であり、各（DL）は、（x）外因性ランディングパッドのいずれかの（DLP）で相同組換えが可能である、外因性ドナー核酸（ES）が本明細書で提供される。ある特定の実施形態において、外因性ドナー核酸（ES）は、互いに同一な上流ライブラリー配列（UL）および互いに同一な下流ライブラリー配列（DL）を含む。ある特定の実施形態において、外因性ドナー核酸（ES）は、各ランディングパッド周辺の内因性ゲノム配列から独立して、外因性ランディングパッドのいずれかにおいて組込みを起こすことが可能である。
[0014] 別の態様において、宿主細胞のゲノムに外因性ドナー核酸を組み込むための方法が本明細書で提供される。ある特定の実施形態において、本方法は、
（ａ）宿主細胞のゲノム中に組み込まれた複数の（x）外因性ランディングパッドを含む宿主細胞であって、各外因性ランディングパッドは、上流ランディングパッド相同配列（ULP）と下流ランディングパッド相同配列（DLP）との間に位置するヌクレアーゼ標的配列（NTS）を含む、宿主細胞を、
（ｉ）１つまたは複数の外因性ドナー核酸（ES）であって、各（ES）は、上流ライブラリー配列（UL）と下流ライブラリー配列（DL）との間に位置する目的の核酸（D）を含み、各（UL）は、（x）外因性ランディングパッドのいずれかの任意の（ULP）で相同組換えが可能であり、各（DL）は、（x）外因性ランディングパッドのいずれかの任意の（DLP）で相同組換えが可能である、外因性ドナー核酸（ES）；および
（ｉｉ）（NTS）に結合し、１つまたは複数の（x）外因性ランディングパッド内の部位を切断することが可能な、１つまたは複数のヌクレアーゼ（N）
と接触させる工程；および
（ｂ）接触させた宿主細胞から生成した宿主細胞を回収する工程
を含み、
外因性ドナー核酸（ES）のいずれかは、各ランディングパッド周辺のゲノム配列から独立して、（x）外因性ランディングパッドのいずれかにおいて組み込まれる。一部の実施形態において、ｘは、少なくとも２の整数である。ある特定の実施形態において、少なくとも２つ以上の外因性ドナー核酸は、互いに同一な上流ライブラリー配列（UL）および互いに同一な下流ライブラリー配列（DL）を含む。
[0015] ある特定の実施形態において、上流ランディングパッド相同配列（ULP）および下流ランディングパッド相同配列（DLP）の各々は、各々上流ライブラリー配列（UL）および下流ライブラリー配列（DL）のそれぞれと相同性を有する約１００、約２００、または約５００塩基対を含む。ある特定の実施形態において、外因性ドナー核酸の上流ライブラリー配列（UL）および下流ライブラリー配列（DL）の各々は、約５００塩基対の長さである。
[0016] ある特定の実施形態において、外因性ドナー核酸の２つ以上は、宿主細胞に共に形質転換されるコンポーネントポリヌクレオチドである。一実施形態において、本方法は、
（ａ）宿主細胞のゲノム中に組み込まれた１つまたは複数の（x）外因性ランディングパッドを含む宿主細胞であって、各外因性ランディングパッドは、上流ランディングパッド相同配列（ULP）と下流ランディングパッド相同配列（DLP）との間に位置するヌクレアーゼ標的配列（NTS）を含む、宿主細胞を、
（ｉ）１つまたは複数の第１のコンポーネントポリヌクレオチドであって、各第１のコンポーネントポリヌクレオチドは、５’から３’方向に、
（１）１つまたは複数の（x）外因性ランディングパッドの任意の（ULP）と相同組換えが可能な上流ライブラリー配列（UL）；
（２）第１の目的の核酸、および
（３）第１のリンカー配列
を含む、第１のコンポーネントポリヌクレオチド；
（ｉｉ）１つまたは複数の最後のコンポーネントポリヌクレオチドであって、各最後のコンポーネントポリヌクレオチドは、５’から３’方向に、
（１）最後のリンカー配列、
（２）最後の目的の核酸、および
（３）１つまたは複数の（x）外因性ランディングパッドのいずれかの任意の（DLP）と相同組換えが可能な下流ライブラリー配列（DL）
を含み、
１つまたは複数の第１のコンポーネントポリヌクレオチドの任意の第１のリンカー配列は、１つまたは複数の最後のコンポーネントポリヌクレオチドの任意の最後のリンカー配列と相同組換えが可能である、最後のコンポーネントポリヌクレオチド；および
（ｉｉｉ）（NTS）に結合し、１つまたは複数の（x）外因性ランディングパッド内の部位を切断することが可能な、１つまたは複数のヌクレアーゼ（N）
と接触させる工程；および
（ｂ）接触させた宿主細胞から生成した宿主細胞を回収する工程
を含み、
１つまたは複数の第１のコンポーネントポリヌクレオチドからの第１のコンポーネントポリヌクレオチドと、１つまたは複数の最後のコンポーネントポリヌクレオチドからの最後のコンポーネントポリヌクレオチドとの任意の組合せが、インビボでそれらのリンカー配列を介して相同組換えされ、該組合せが、各ランディングパッド周辺のゲノム配列から独立して、１つまたは複数の（x）外因性ランディングパッドのいずれかにおいて組み込まれる。ある特定の実施形態において、ｘは、少なくとも１の整数である。ある特定の実施形態において、ｘは、少なくとも２の整数である。
[0017] 一部の実施形態において、３つ以上のコンポーネントポリヌクレオチドは、ランディングパッドでの組込みのために宿主細胞に共に形質転換される。一実施形態において、コンポーネントポリヌクレオチドは、（ａ）１つまたは複数の第１のコンポーネントポリヌクレオチドであって、各第１のコンポーネントポリヌクレオチドは、５’から３’方向に、上流ランディングパッド相同配列（ULP）と相同組換えが可能な上流ライブラリー配列、Ｄ０群から選択される任意のＤＮＡセグメント、リンカー配列ＬＢ０を含む、第１のコンポーネントポリヌクレオチド；１つまたは複数の中間(intermediate)コンポーネントポリヌクレオチドであって、各中間コンポーネントポリヌクレオチドは、５’から３’方向に、第１のリンカー配列ＬＡｎ、Ｄｎ群から選択される任意のＤＮＡセグメント、第２のリンカー配列ＬＢｎを含み、ｎは、１から中間コンポーネントポリヌクレオチドの数までの整数を表す、中間コンポーネントポリヌクレオチド；および（ｃ）１つまたは複数の最後のコンポーネントポリヌクレオチドであって、各最後のコンポーネントポリヌクレオチドは、５’から３’方向に、リンカー配列ＬＡｍ、Ｄｍ群から選択される任意のＤＮＡセグメント、および下流ランディングパッド相同配列（DLP）と相同組換えが可能な下流ライブラリー配列を含む、最後のコンポーネントポリヌクレオチドを含む。このような実施形態において、各リンカー配列ＬＢ（ｐ−１）は、リンカー配列ＬＡｐと相同組換えが可能であり、ｎは、１〜（ｍ−１）の様々な整数であり、ｐは、１〜ｍの整数を表し、各Ｄ０群、・・・Ｄｎ群、・・・Ｄｍ群、は、独立して、１つまたは複数のＤＮＡセグメントからなる。この実施形態において、１つまたは複数の第１のコンポーネントポリヌクレオチドからの第１のコンポーネントポリヌクレオチド、１つまたは複数の中間コンポーネントポリヌクレオチドからの中間コンポーネントポリヌクレオチド、および１つまたは複数の最後のコンポーネントポリヌクレオチドからの最後のコンポーネントポリヌクレオチドの任意の組合せが、インビボでそれらのリンカー配列を介して相同組換えされ、該組合せが、各ランディングパッド周辺のゲノム配列から独立して、１つまたは複数の（x）外因性ランディングパッドのいずれかにおいて組み込まれる。一部の実施形態において、ｘは、少なくとも１の整数である。一部の実施形態において、ｘは、少なくとも２の整数である。
[0018] 別の態様において、ゲノム組込みの方法は、本明細書に記載される、（ａ１）１つまたは複数の外因性ドナー核酸（ES）、（ａ２）１つまたは複数の第１のコンポーネントポリヌクレオチドおよび１つまたは複数の最後のコンポーネントポリヌクレオチド、ならびに（ａ３）１つまたは複数の第１のコンポーネントポリヌクレオチド、１つまたは複数の中間コンポーネントポリヌクレオチド、および１つまたは複数の最後のコンポーネントポリヌクレオチドの任意の組合せと、細胞を接触させることを含む。
[0019] 別の態様において、宿主細胞のゲノム中に組み込まれたランディングパッドの一部は、特異的なゲノム遺伝子座を標的化するように設計される。例えば、標的化されたランディングパッドは、そのネイティブの遺伝子座で、内因性遺伝子に隣接して組み込まれていてもよい。このような標的化されたランディングパッドは、プロモーターライブラリーをスクリーニングし、内因性遺伝子の発現の適正量を決定して(titrate)、最適なプロモーターを決定するのに使用することができる。別の例において、標的化されたランディングパッドを、目的の遺伝子のオープンリーディングフレームの３’に組み込んで、ターミネーターライブラリーまたはデグロンライブラリーをスクリーニングすることができる。これらの実施形態において、標的化されたランディングパッドに適合性を有する標準化されたライブラリーまたはリンカー配列を含むコンポーネントポリヌクレオチドを使用することができる。ある特定の実施形態において、標的化されたランディングパッドは、１つまたは複数の標準化された外因性ランディングパッドと組み合わせて使用することができ、これは、標準化された外因性ランディングパッド周辺のゲノム配列から独立して、あらゆる外因性ドナー核酸を組み込むのに使用することができる。
[0020] 別の態様において、外因性ドナー核酸による表現型の寄与を決定する方法が本明細書で提供される。ある特定の実施形態において、本方法は、（ａ）宿主細胞を、複数の外因性核酸（ES）と接触させる工程であって、各（ES）は、バーコード配列でタグ付けされており、宿主細胞のゲノムは、宿主細胞媒介相同組換えを介して、宿主細胞のゲノム中の複数の（ES）の任意の１つまたは組合せを組み込むように設計されている、工程；（ｂ）接触させた宿主細胞から生成した、特異的な表現型を呈する宿主細胞をスクリーニングする工程；および（ｃ）各（ES）に関連付けられたバーコード配列を使用して、宿主細胞のゲノム中に組み込まれた（ES）のアイデンティティ(identity)を決定する工程を含む。ある特定の実施形態において、複数の外因性ドナー核酸（ES）の少なくとも２つは、適合性リンカー配列を有するコンポーネントポリヌクレオチドである。コンポーネントポリヌクレオチドは、インビボで相同組換えして、宿主細胞媒介相同組換えを介してランディングパッドにおいて組み込まれている組み立てられたコンポーネントポリヌクレオチドを生成する。各コンポーネントポリヌクレオチドは、個々にバーコード配列でタグ付けされ、これは、どのコンポーネントポリヌクレオチドの組合せがランディングパッド中に組み込まれているかを決定するのに使用することができる。
[0021] 別の態様において、本明細書に記載される１つまたは複数のランディングパッドを含む改変された宿主細胞が本明細書で提供される。
[0022] 別の態様において、外因性核酸のゲノム組込みを実行するのに有用なキットが本明細書で提供される。一部の実施形態において、キットは、（ａ）本明細書に記載される１種または複数の宿主細胞；（ｂ）本明細書に記載される１つまたは複数の外因性ドナー核酸；および／または（ｃ）本明細書に記載される１つまたは複数のヌクレアーゼを含む。一部の実施形態において、キットは、複数のプライマー対をさらに含み、各プライマー対は、各外因性ドナー核酸に関連付けられたバーコード配列を同定することが可能である。
[0023] これらのおよび他の実施形態を、その利点および特徴の多くと共に、以下の文章および添付された図面と共により詳細に記載する。
[0024]図１Ａは、ＡＬＧ１遺伝子座（「iALG1」）の遺伝子間領域に位置する、「ＵＬ」と表記される上流ランディングパッド配列（ULP）、「ＤＬ」と表記される下流ランディングパッド配列（DLP）、および「Ｘ」と表記されるヌクレアーゼ標的配列（NTS）を有する外因性ランディングパッドの例示的な実施形態を例示する図である。外因性ドナー核酸（ES）との相同組換えに使用される外因性ランディングパッドの（ULP）および（DLP）は、全ての図面にわたり点描を含むボックスとして示される。[0025] 図１Ｂは、「ＵＬ」と表記される上流ライブラリー配列（UL）および「ＤＬ」と表記される下流ライブラリー配列（DL）を有する３つの外因性ドナー核酸のライブラリーを例示する図であり、各外因性ドナー核酸のＵＬおよびＤＬは、それぞれ外因性ランディングパッドの（ULP）および（DLP）と相同組換えが可能である。３つの外因性ドナー核酸の各々は、目的の核酸として、オープンリーディングフレームと、リンカー配列（「A」）を介してプロモーター（矢印として示される）に作動可能に連結したターミネーターとを含む。目的の核酸は、各外因性ドナー核酸中で（UL）と（DL）との間に位置する。[0026]図１Ｃは、外因性ドナー核酸のマーカーレスゲノム組込みの例示的な実施形態を例示する図である。外因性ランディングパッドは、「Ｘ」と表記される（NTS）で、部位特異的ヌクレアーゼ（一丁のはさみとして示される）によって切断される。 [0027]図１Ｄは、外因性ランディングパッドの別の実施形態を例示する図であり、図１Ｄにおいて、外因性ランディングパッドは、「ＵＬ」と表記される（ULP）の５’末端に隣接するインシュレーター配列（例えば、転写ターミネーター）および「ＤＬ」と表記される（DLP）の３’末端に隣接する別のインシュレーター配列をさらに含む。ランディングパッド中に組み込まれたインシュレーター配列は、宿主細胞のゲノム中の外因性ランディングパッドの外側に配置された別のプロモーターからの予期せぬ「リードスルー」転写を防いだりまたは低減させたりすることができる。[0028]図１Ｅは、ランディングパッドに組み込むことができる３つの異なるタイプの外因性ドナー核酸を例示する図である。図１Ｅの一番上は、単一のＤＮＡパーツで作製される外因性ドナー核酸を例示する。図１Ｅの中央は、インビボで組み立てられてランディングパッドに組み込むことができる２つの別個のコンポーネントポリヌクレオチドを例示する。図１Ｅの一番下は、インビボで組み立てられてランディングパッドに組み込むことができる３つの別個のコンポーネントポリヌクレオチドを例示する。[0029]図１Ｆは、第１のコンポーネントポリヌクレオチドとしてのプロモーターのライブラリー、中間コンポーネントポリヌクレオチドとしてのオープンリーディングフレームのライブラリー、および最後のコンポーネントポリヌクレオチドとしてのターミネーター配列のライブラリーを例示する図であり、これらは、コンビナトリアル的に組み合わせて、適合性を有するランディングパッド相同配列と共にランディングパッドに組み込むことができる。 [0030]図２Ａは、宿主細胞のゲノム中に挿入された３つの標準化された外因性ランディングパッドの例示的な実施形態を例示する図である。標準化された外因性ランディングパッドは、宿主細胞のゲノム中のＡＬＧ１遺伝子座、ＭＧＡ１遺伝子座、およびＹＣＴ１遺伝子座の遺伝子間領域において組み込まれた、同じ上流ランディングパッド相同配列（ULP、「UL」として示される）および同じ下流ランディングパッド相同配列（DLP、「DL」として示される）を含む。[0031]図２Ｂ〜２Ｄは、様々なＤＮＡ「ステッチ（stitch）」設計における外因性ドナー核酸の異なるライブラリーを例示する図である。各外因性ドナー核酸は、標準化された外因性ランディングパッドに相同組換えするための少なくとも１つの標準化された相同配列（UL、DLまたはULおよびDLの両方）を含む。[0032]図２Ｂは、外因性ドナー核酸のライブラリーの例示的な実施形態を例示する図であり、このようなライブラリーの各々は、上流ライブラリー配列（UL）と下流ライブラリー配列（DL）との間に位置する、プロモーターに作動可能に連結した（すなわち、「ロックドプロモーター」設計での）単一のオープンリーディングフレーム（ORF）を含む。[0033]図２Ｃは、コンポーネントポリヌクレオチドである外因性ドナー核酸のライブラリーの例示的な実施形態を例示する図である。宿主細胞中で、適合性リンカー配列を有する２つのコンポーネントポリヌクレオチドがインビボで相同組換えを介して組み立てられる場合、それらは、様々なマルチオープンリーディングフレームをロックドプロモーター設計で生成する。図２Ｃにおいて、適合性リンカー配列は、「ＳＮＡＰ」として示される。[0034]図２Ｄは、コンポーネントポリヌクレオチドである外因性ドナー核酸のライブラリーの別の例示的な実施形態を例示する図である。コンポーネントポリヌクレオチドがインビボで相同組換えを介して組み立てられる場合、それらは、プロモーターに作動可能に連結した単一のＯＲＦの異なる組合せを生成する。別個のコンポーネントポリヌクレオチドにおいて、プロモーターはＯＲＦから割裂することから、このＤＮＡステッチ設計は、「スプリットプロモーター」設計と称される。 [0035]図３Ａは、追加の機能的なエレメント、すなわち、外因性ランディングパッド中に存在するヌクレアーゼ標的配列（NTS）と異なるバーコード配列およびヌクレアーゼ標的配列を含む例示的な外因性ドナー核酸（これは、コンポーネントポリヌクレオチドである）を例示する図である。図３Ａに示される第１のコンポーネントポリヌクレオチドは、「Ｙ−カッター」ヌクレアーゼ標的配列を含む。図３Ｂは、追加の機能的なエレメント、すなわち、外因性ランディングパッド中に存在するヌクレアーゼ標的配列（NTS）と異なるバーコード配列およびヌクレアーゼ標的配列を含む例示的な外因性ドナー核酸（これは、コンポーネントポリヌクレオチドである）を例示する図である。図３Ｂに示される最後のコンポーネントポリヌクレオチドは、「Ｚ−カッター」ヌクレアーゼ標的配列を含む。[0036]図３Ｃは、宿主細胞のゲノム中に操作により作製された３つの標準化された外因性ランディングパッドを例示する図である。[0037]図３Ｄは、図３Ｃに示される標準化された外因性ランディングパッドに組み込まれたバーコードが付いたコンポーネントポリヌクレオチドの異なる組合せを例示する図である。図３Ｄはまた、宿主細胞のゲノム中に組み込まれたバーコード配列の周りのプライマー結合セグメントにアニールするように設計された、一対の標準オリゴヌクレオチドプライマーの位置（矢印により示される）も例示する。 [0038]図４は、ヌクレアーゼ、Ｘ−カッター（すなわち、CphI）をコードするプラスミドと共に、第１のコンポーネントポリヌクレオチドおよび最後のコンポーネントポリヌクレオチドのコンビナトリアルライブラリーのゲノム組込みのための例示的なワークフローを例示する図である。例示的なワークフローは、コロニーの選択、ハイスループットスクリーニングアッセイ、および標準化されたランディングパッドに組み込まれた遺伝子およびプロモーターを同定するための標準プライマーを用いた有望な株の遺伝子型の決定をさらに例示する。ハイスループット組込みおよびスクリーニングアッセイから決定された遺伝子型と表現型との関係によれば、ライブラリーの組成を調整して、宿主細胞の表現型をさらに改善することができる。 [0039]図５Ａは、３つの標準化された外因性ランディングパッド（ULおよびDLランディングパッド相同配列を含む）と、下流ライブラリー配列としてＤＬ１を含む最後のコンポーネントポリヌクレオチドの標的化された組込みのために使用することができる遺伝子座１におけるアドレス指定可能なランディングパッド（ULおよびDL1ランディングパッド相同配列を含む）とを含む宿主細胞のゲノムの例示的な実施形態を例示する。[0039]図５Ｂは、３つの標準化された外因性ランディングパッド（ULおよびDLランディングパッド相同配列を含む）と、下流ライブラリー配列としてＤＬ１を含む最後のコンポーネントポリヌクレオチドの標的化された組込みのために使用することができる遺伝子座１におけるアドレス指定可能なランディングパッド（ULおよびDL1ランディングパッド相同配列を含む）とを含む宿主細胞のゲノムの例示的な実施形態を例示する。 [0040]図６Ａは、アドレス指定可能であり任意選択のランディングパッドをさらに取り入れることによって、標準化された外因性ランディングパッドのフレキシビリティー（ALG1遺伝子座、MGA1遺伝子座、およびYCT1遺伝子座の遺伝子間領域における）を増加させることの例示的な実施形態を例示する図である。図６Ａは、宿主細胞に共に形質転換されることにより図６Ｂに示される全ての５つのランディングパッドへのＤＮＡコンストラクトの同時のコンビナトリアルな組込みが可能な、プールされたＤＮＡコンストラクト（すなわち、コンポーネントポリヌクレオチド）およびプールされたヌクレアーゼを例示する図である。図６Ｂは、アドレス指定可能であり任意選択のランディングパッドをさらに取り入れることによって、標準化された外因性ランディングパッドのフレキシビリティー（ALG1遺伝子座、MGA1遺伝子座、およびYCT1遺伝子座の遺伝子間領域における）を増加させることの例示的な実施形態を例示する図である。外因性ランディングパッドは、遺伝子座１であり、遺伝子座２は、標準化された外因性ランディングパッドの下流ランディングパッド相同配列（DL）と比較して、異なる下流ランディングパッド相同配列（それぞれDL1およびDL2）を含む。適合性を有するライブラリー配列（DL1およびDL2）を有する外因性ドナー核酸の特定のサブセットのみを組み込むことができるため、これらの遺伝子座におけるこれらの外因性ランディングパッドは、アドレス指定可能である。これらのアドレス指定可能な外因性ランディングパッドはまた、３つの標準化されたランディングパッドを切断するためにＸ−カッターが提供される場合に切断されないヌクレアーゼ標的配列「Ｇ」および「Ｈ」を含むため、それらは任意選択でもある。それらは、それぞれＧ−カッターおよびＨ−カッターが提供される場合にのみ切断される。 [0041]図７Ａは、宿主細胞のゲノム中のネイティブの遺伝子座でオープンリーディングフレームの５’末端にプロモータースワップランディングパッドを取り込むのに使用することができる例示的なプロモータースワップランディングパッドビルディングコンストラクトを例示する図である。図７Ｂに、宿主細胞のゲノム中に組み込まれたプロモータースワップランディングパッドを示す。図７Ｂにおいて、外因性ドナー核酸の相同組換えに使用されるプロモータースワップランディングパッド中の相同配列（ULおよびA）は、点描を含む領域で示される。図７Ｃは、プロモーターのコンビナトリアルライブラリーおよびヌクレアーゼを用いたプロモータースワップランディングパッドを有する親株での形質転換をさらに例示する図である。図７Ｄは、形質転換後、コロニーをピックアップし、望ましい表現型に関してスクリーニングし、遺伝子型解析して、プロモーターライブラリーからのどのプロモーターが宿主細胞中において望ましい表現型に寄与するのかを決定できることを例示する図である。 [0042]図７Ｅは、宿主細胞のゲノム中のネイティブの遺伝子座でオープンリーディングフレームの３’末端にターミネータースワップランディングパッドを組み込むのに使用できる例示的なターミネータースワップランディングパッドビルディングコンストラクトを例示する図である。図７Ｆに、宿主細胞のゲノム中に組み込まれたターミネータースワップランディングパッドを示す。図７Ｇおよび図７Ｈは、デグロンライブラリーまたはターミネーターライブラリーのいずれかでのターミネータースワップランディングパッドを含む親株の形質転換を例示する図である。 [0043]図８は、プロモータースワップランディングパッド（１）を、外因性の標準化されたランディングパッド（２）と組み合わせて使用して、これらのランディングパッドにコンポーネントポリヌクレオチドを同時に組み込んで、２つの別個の遺伝子発現の適正量を決定する例示的な実施形態を例示する図である。 [0044]図９は、プロモーターライブラリーを使用して２つのオープンリーディングフレーム（ORF1およびORF2）の発現と、標的化された組込みとの釣り合いをとった例示的な実施形態を例示する図である。図９において、ＯＲＦ１を含む最後のコンポーネントポリヌクレオチドは、ＡＬＧ１遺伝子座におけるランディングパッド１でのみ組込みを起こすと予想され、ＯＲＦ２を含む最後のコンポーネントポリヌクレオチドは、ｉＹＣＴ１遺伝子座におけるランディングパッド２でのみ組込みを起こすと予想される。 [0045]図１０Ａは、単一のＯＲＦ形質転換コンポーネントを例示する図である。単一のＯＲＦ形質転換は、ＵＬ／ＤＬ相同性を端に有する等モル濃度の４つのコンストラクト：ｐＧＡＬ１＞ＧＦＰ、ｐＧＡＬ１＞ＲＦＰ、ｐＧＡＬ＞ＲＦＰ、およびプロモーターレスの非蛍光性「スペーサー」コンストラクトからなっていた。[0046]図１０Ｂは、スプリットＯＲＦ形質転換コンポーネントを例示する図である。スプリット形質転換は、各組込み部位での組換えを容易にするために「Ａ」リンカー相同性を含有する等モル濃度の９つのスプリットプロモーターおよび４つのプロモーターレスＯＲＦからなっていた。ｐＧＡＬ１の１％からｐＧＡＬ１の７５％までの予測された発現レベルの範囲にかかるようにプロモーターを選んだ。[0047]図１０Ｃは、単一のＯＲＦ形質転換（A）対スプリット形質転換（B）における特異的なＧＦＰ測定の頻度（ウェルの数）を示すヒストグラムを例示する図である。 [0048]図１１は、異なるランディングパッド相同配列を含む親株の組込み効率を例示する図である。 [0049]図１２は、ライブラリーコンポーネントおよびランディングパッド、ライブラリーのハイスループットスクリーニング、およびランディングパッド中に組み込まれたコンビナトリアルライブラリーコンポーネントの変異誘発と比較した性能を例示する図である。 [0050]図１３は、ピロリン酸イソペンテニル（IPP）産生、ならびにＩＰＰおよびジメチルアリルピロリン酸（DMAPP）のゲラニルピロリン酸（GPP）、ファルネシルピロリン酸（FPP）、およびゲラニルゲラニルピロリン酸（GGPP）への変換、ならびに様々なイソプレノイド合成のためのメバロン酸（MEV）経路の概略図を例示する図である。
５.１ 定義
[0051] 用語「ランディングパッド」は、本明細書で使用される場合、外因性ドナー核酸の挿入をさらに容易にするための、宿主細胞のゲノム中に操作により作製された組換え標的部位を指す。ある特定の実施形態において、ランディングパッドは、外因性ドナー核酸の相同組換えに使用されるランディングパッド相同配列の間に位置するヌクレアーゼ標的配列（NTS）を含む。ヌクレアーゼ標的配列（NTS）は、部位特異的ヌクレアーゼによって認識され、ヌクレアーゼは、（NTS）に結合し、外因性ランディングパッド内の部位を切断する。当業者は、ヌクレアーゼが、ＮＴＳの内側または外側で切断することが可能であることを認識していると予想される。
[0052] 用語「外因性」ランディングパッドは、通常天然に見出されないランディングパッドを指す。ある特定の実施形態において、外因性ランディングパッドは、それらの挿入の前に宿主細胞のゲノム中に存在しないランディングパッド相同配列（例えば、上流ランディングパッド相同配列および下流ランディングパッド相同配列）を含み、および／またはそのランディングパッド相同配列は、宿主細胞のゲノム中のその天然の遺伝子座の外側に（すなわち、非ネイティブの遺伝子座に）位置する。
[0053] 用語「異種」または「外因性」は、通常天然に見出されないものを指す。例えば、用語「異種ヌクレオチド配列」または「外因性核酸」は、自然界で所与の細胞に通常見出されないヌクレオチド配列を指す。したがって、異種ヌクレオチド配列または外因性ヌクレオチド配列は、（ａ）その宿主細胞にとって外来であるもの（すなわち、細胞にとって「外因性」であるもの）；（ｂ）宿主細胞中に天然に見出されるが（すなわち、「内因性」であるが）、細胞中で天然にはない量（すなわち、宿主細胞中に天然に見出される量より多いまたは少ない量）で存在するもの；または（ｃ）宿主細胞中に天然に見出されるが、その天然の遺伝子座の外側に位置するものであり得る。
[0054] 用語「外因性ドナー核酸」は、宿主細胞のゲノムに組み込むために供与される外因性核酸を指す。ある特定の実施形態において、外因性ドナー核酸は、外因性ランディングパッドへの組込みに必要な相同配列を有する単一パーツのＤＮＡ断片であり得る。他の実施形態において、外因性ドナー核酸は、外因性ランディングパッドへの組込みを起こすように他のコンポーネントポリヌクレオチドと一般的に組み合わせられるコンポーネントポリヌクレオチドであり得る。
[0055] 用語「内因性核酸」は、本明細書で使用される場合、自然界で所与の細菌、生物、または細胞に通常見出される、および／またはそれらによって産生される核酸を指す。また「内因性核酸」は、「ネイティブの核酸」、または所与の細菌、生物、または細胞にとって「ネイティブ」であり、宿主細胞のゲノム中のその天然の遺伝子座に位置する核酸とも称される。
[0056] 用語「接触させる」は、本明細書で使用される場合、核酸を取り込んで宿主細胞のゲノムに組み込むことを可能にするために、核酸が、宿主細胞に十分に近接して、内部または外部に置かれることを指す。
[0057] 用語「ライブラリー」は、本明細書で使用される場合、それらの５’および３’末端に公知の共通の配列または実質的に共通の配列を含有する核酸の集合体を指す。ある特定の実施形態において、ライブラリー中の外因性ドナー核酸は、宿主細胞のゲノム中の外因性ランディングパッドへの相同組換えに使用される、その５’領域における上流ライブラリー配列およびその３’領域における下流ライブラリー配列を含む。ある特定の実施形態において、ライブラリー中のコンポーネントポリヌクレオチドは、その５’領域に上流ライブラリー配列、およびその３’領域にリンカーを含んでいてもよい。ある特定の実施形態において、ライブラリー中のコンポーネントポリヌクレオチドは、その５’領域にリンカー、およびその３’領域に下流ライブラリー配列を含んでいてもよい。ある特定の実施形態において、コンポーネントポリヌクレオチドのライブラリーは、５’および３’領域の両方にリンカーを含んでいてもよい。
[0058] 用語「切断する」、「切断」および／または「切断すること」は、本明細書で使用される場合、ヌクレアーゼ、例えばホーミングエンドヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼまたはＴＡＬ−エフェクターヌクレアーゼに関して、特定の核酸において二本鎖破断（DSB）を作り出す作用を指す。ＤＳＢは、当業者によって理解されている通り、平滑末端または付着末端（すなわち、５’または３’オーバーハング）を残すことができる。
[0059] 用語「操作された宿主細胞」は、本明細書で使用される場合、遺伝子工学技術（すなわち、組換えテクノロジー）を使用して親細胞を遺伝学的に改変することによって生成される宿主細胞を指す。操作された宿主細胞は、親細胞のゲノムに対してヌクレオチド配列の付加、欠失、および／または改変を含んでいてもよい。
[0060] 用語「相同性」は、本明細書で使用される場合、２つ以上の核酸配列、または２つ以上のアミノ酸配列間の同一性を指す。配列同一性は、同一性（または類似性もしくは相同性）のパーセンテージに関して測定することができる。パーセンテージが高いほど、配列が互いに同一により近くなる。核酸またはアミノ酸配列の相同体またはオーソログは、標準的方法を使用して並べた場合、比較的高い程度の配列同一性を有する。比較のための配列のアライメント方法は当業界において周知である。様々なプログラムおよびアライメントアルゴリズムが、Smith & Waterman, Adv. Appl. Math. 2:482, 1981；Needleman & Wunsch, J. Mol. Biol. 48:443, 1970; Pearson & Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:2444, 1988; Higgins & Sharp, Gene, 73:237-44, 1988; Higgins & Sharp, CABIOS 5:151-3, 1989; Corpet et al., Nuc. Acids Res. 16:10881-90, 1988; Huang et al. Computer Appls. Biosc. 8, 155-65, 1992; and Pearson et al., Meth. Mol. Bio. 24:307-31, 1994. Altschul et al., J. Mol. Biol. 215:403-10, 1990に記載されており、配列のアライメント方法および相同性の計算の詳細な考察が提示されている。配列分析プログラムｂｌａｓｔｐ、ｂｌａｓｔｎ、ｂｌａｓｔｘ、ｔｂｌａｓｔｎおよびｔｂｌａｓｔｘと関連して使用するための、ＮＣＢＩベーシックローカルアライメントサーチツール(BLAST)（Altschul et al., J. Mol. Biol. 215:403-10, 1990）は、国立バイオテクノロジー情報センター（NCBI、National Library of Medicine、Building 38A、Room 8N805、Bethesda、Md. 20894）などの数々のソースから、さらにインターネットで入手可能である。追加の情報は、ＮＣＢＩのウェブサイトで見出すことができる。
[0061] 用語「配列同一性」または「パーセント同一性」は、本明細書で使用される場合、そのコンテクスト中、または２つ以上の核酸もしくはタンパク質配列において、２つ以上の配列または部分配列が同じであること、または２つ以上の配列または部分配列が、同じであるアミノ酸残基またはヌクレオチドの特定のパーセンテージを有することを指す。例えば、配列は、比較ウィンドウにわたり、または配列比較アルゴリズムを使用して、もしくは手作業でのアライメントと目視検査によって測定した場合に指定された領域にわたり、比較して最大限一致するように並べられた場合、特定の領域にわたり、参照配列に対して、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％のパーセントの同一性、またはそれより高い同一性を有していてもよい。例えば、同一性のパーセントは、配列中の同一なヌクレオチド（またはアミノ酸残基）の数を、全てのギャップの長さを引いた総ヌクレオチド（またはアミノ酸残基）の長さで割った比率を計算することによって決定される。
[0062] 便宜上、２つの配列間の同一性の程度は、当業界において公知のコンピュータープログラムおよび数学的なアルゴリズムを使用して確認することができる。このようなパーセント配列同一性を計算するアルゴリズムは、一般的に、比較領域にわたり配列ギャップおよびミスマッチを考慮に入れる。配列を比較し並べるプログラム、例えば、Ｃｌｕｓｔａｌ Ｗ（Thompson et al., (1994) Nucleic Acids Res., 22: 4673-4680）、ＡＬＩＧＮ（Myers et al., (1988) CABIOS, 4: 11-17）、ＦＡＳＴＡ（Pearson et al., (1988) PNAS, 85:2444-2448; Pearson (1990), Methods Enzymol., 183: 63-98)およびｇａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴ（Altschul et al., (1997) Nucleic Acids Res., 25: 3389-3402）は、この目的のために有用である。配列分析プログラムＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＮ、ＢＬＡＳＴＸ、ＴＢＬＡＳＴＮおよびＴＢＬＡＳＴＸと関連して使用するための、ＢＬＡＳＴまたはＢＬＡＳＴ２．０（Altschul et al., J. Mol. Biol. 215:403-10, 1990）は、国立バイオテクノロジー情報センター（NCBI）などの数々のソースから、さらにインターネットで入手可能である。追加の情報は、ＮＣＢＩのウェブサイトで見出すことができる。
[0063] ある特定の実施形態において、配列アライメントおよびパーセント同一性の計算は、その標準的なデフォルトパラメーターを使用するＢＬＡＳＴプログラムを使用して決定することができる。ヌクレオチド配列のアライメントおよび配列同一性の計算の場合、ＢＬＡＳＴＮプログラムは、そのデフォルトパラメーター（ギャップ開始ペナルティー＝５、ギャップ伸長ペナルティー＝２、核酸マッチ＝１、核酸ミスマッチ＝−３、期待値＝１０．０、文字サイズ＝１１）と共に使用される。ポリペプチド配列のアライメントおよび配列同一性の計算の場合、ＢＬＡＳＴＰプログラムは、そのデフォルトパラメーター（ギャップ開始＝１１、ギャップ伸長ペナルティー＝２；核酸マッチ＝１；核酸ミスマッチ＝−３、期待値＝１０．０；文字サイズ＝１１；行列Blosum 62）と共に使用される。代替として、以下のプログラムおよびパラメーターが使用される:Ｃｌｏｎｅ Ｍａｎａｇｅｒ Ｓｕｉｔｅ、バージョン５のＡｌｉｇｎ Ｐｌｕｓソフトウェア（Sci-Ed Software）；ＤＮＡ比較：グローバル比較、標準的なリニアスコア行列、ミスマッチペナルティー＝２、開始ギャップペナルティー＝４、伸長ギャップペナルティー＝１。アミノ酸比較:グローバル比較、ＢＬＯＳＵＭ ６２スコア行列。
[0064] 用語「マーカーレス」は、本明細書で使用される場合、選択可能マーカーの組込みを伴わない宿主細胞のゲノム内の外因性ランディングパッドへのドナーＤＮＡ（例えば、外因性ドナー核酸）の組込みを指す。一部の実施形態において、この用語はまた、宿主細胞のゲノムへの選択可能マーカーの組込みに頼る選択スキームを利用せずに、このような宿主細胞を回収することも指す。例えば、ある特定の実施形態において、エピソームまたは染色体外の選択マーカーが、ゲノム標的部位を切断することが可能なヌクレアーゼをコードするプラスミドを含む細胞に関して選択するのに利用される場合がある。このような使用は、選択可能マーカーが宿主細胞のゲノムに組み込まれない限り、「マーカーレス」とみなされることになる。
[0065] 用語「ポリヌクレオチド」は、本明細書で使用される場合、当業者によって理解される通り、ヌクレオチド単位で構成されるポリマーを指す。好ましいヌクレオチド単位としては、これらに限定されないが、アデニン（A）、グアニン（G）、シトシン（C）、チミン（T）、およびウラシル（U）を含むものが挙げられる。有用な改変されるヌクレオチド単位としては、これらに限定されないが、４−アセチルシチジン、５−（カルボキシヒドロキシルメチル）ウリジン、２−Ｏ−メチルシチジン、５−カルボキシメチルアミノメチル−２−チオウリジン、５−カルボキシメチルアミノ−メチルウリジン、ジヒドロウリジン、２−Ｏ−メチルプソイドウリジン、２−Ｏ−メチルグアノシン、イノシン、Ｎ６−イソペンチルアデノシン、１−メチルアデノシン、１−メチルプソイドウリジン、１−メチルグアノシン、１−メチルイノシン、２，２−ジメチルグアノシン、２−メチルアデノシン、２−メチルグアノシン、３−メチルシチジン、５−メチルシチジン、Ｎ６−メチルアデノシン、７−メチルグアノシン、５−メチルアミノメチルウリジン、５−メトキシアミノメチル−２−チオウリジン、５−メトキシウリジン、５−メトキシカルボニルメチル−２−チオウリジン、５−メトキシカルボニルメチルウリジン、２−メチルチオ−Ｎ６−イソペンチルアデノシン、ウリジン−５−オキシ酢酸−メチルエステル、ウリジン−５−オキシ酢酸、ワイブトキソシン、ワイブトシン、プソイドウリジン、クエオシン、２−チオシチジン、５−メチル−２−チオウリジン、２−チオウリジン、４−チオウリジン、５−メチルウリジン、２−Ｏ−メチル−５−メチルウリジン、２−Ｏ−メチルウリジンなどを含むものが挙げられる。ポリヌクレオチドとしては、天然に存在する核酸、例えばデオキシリボ核酸（「DNA」）およびリボ核酸（「RNA」）、加えて核酸類似体が挙げられる。核酸類似体としては、天然に存在しない塩基を包含するもの、天然に存在するホスホジエステル結合以外の他のヌクレオチドとの連結で係合するヌクレオチド、またはホスホジエステル結合以外の連結を介して結合する塩基を包含するヌクレオチドが挙げられる。したがって、ヌクレオチド類似体としては、これらに限定されないが、例えば、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホロトリエステル、ホスホロアミデート、ボラノホスフェート、メチルホスホネート、キラル−メチルホスホネート、２−Ｏ−メチルリボヌクレオチド、ペプチド核酸（PNA）などが挙げられる。
[0066] 本明細書において、ポリヌクレオチド配列を記載するのに従来の表記法が使用される。一本鎖ポリヌクレオチド配列の左側の末端は５’末端であり、二本鎖ポリヌクレオチド配列の左側方向は５’方向と称される。
[0067] 用語「ＤＮＡセグメント」は、その代わりに以下の例では「ビット」とも称されるが、本明細書で使用される場合、ＤＮＡのあらゆる単離されたまたは分離可能な分子を指す。有用な例としては、これらに限定されないが、タンパク質コード配列、レポーター遺伝子、蛍光マーカーコード配列、プロモーター、エンハンサー、ターミネーター、イントロン、エクソン、ポリＡテール、多重クローニング部位、核局在化シグナル、ｍＲＮＡ安定化シグナル、選択可能マーカー、組込み遺伝子座、エピトープタグコード配列、分解シグナル、スペーサー配列、もしくはバーコード配列、または他のあらゆる天然に存在するもしくは合成ＤＮＡ分子が挙げられる。一部の実施形態において、ＤＮＡセグメントは、天然起源であってもよい。代替として、ＤＮＡセグメントは、インビトロで生産された、完全に合成起源であってもよい。さらに、ＤＮＡセグメントは、単離された天然に存在するＤＮＡ分子の任意の組合せ、または単離された天然に存在するＤＮＡ分子と合成ＤＮＡ分子との任意の組合せを含んでいてもよい。例えば、ＤＮＡセグメントは、タンパク質コード配列に作動可能に連結した異種プロモーター、ポリＡテールに連結されたタンパク質コード配列、フレーム内でエピトープタグコード配列と連結されたタンパク質コード配列などを含んでいてもよい。
[0068] 「プライマー」は、ポリヌクレオチドテンプレート配列、例えばプライマー結合セグメントに特異的にハイブリダイズすることが可能であり、合成に好適な条件下で、すなわちヌクレオチドおよび合成反応を触媒する物質（例えば、ＤＮＡポリメラーゼ）の存在下で、相補的ポリヌクレオチドを合成するための始点を提供することが可能なポリヌクレオチド配列を指す。プライマーは、ポリヌクレオチドテンプレート配列に相補的であるが、ポリヌクレオチドテンプレート配列の正確な相補物でなくてもよい。例えば、プライマーは、ポリヌクレオチドテンプレート配列の相補物に、少なくとも約８０、８５、９０、９５、９６、９７、９８、または９９％同一であってもよい。プライマーは、可変長を有していてもよいが、一般的には少なくとも１５塩基である。一部の実施形態において、プライマーは、１５塩基〜３５塩基の長さである。一部の実施形態において、プライマーは、３５塩基より長い長さである。他の実施形態において、プライマーは、少なくとも５０℃の融解温度（Tm）、すなわちＤＮＡ二重鎖の半分が解離して一本鎖になると予想される温度を有する。他の実施形態において、プライマーは、約５０℃〜７０℃のＴｍを有する。さらに他の実施形態において、プライマーは、ポリヌクレオチドテンプレート配列へのハイブリダイゼーションの効率に影響を与えないように、明らかなＤＮＡまたはＲＮＡ２次構造を形成しない。
[0069] 用語「プライマー結合セグメント」は、本明細書で使用される場合、合成に好適な条件下で相補的ポリヌクレオチドを合成するための始点が提供されるようにプライマーに結合するポリヌクレオチド配列である。
[0070] 用語「リンカー配列」は、本明細書で使用される場合、インビボでの相同組換えを介して別のコンポーネントポリヌクレオチド中のリンカー配列と相同組換えが可能な、コンポーネントポリヌクレオチド中のポリヌクレオチド配列を指す。ある特定の実施形態において、コンポーネントポリヌクレオチドのリンカー配列は、外因性ランディングパッドのランディングパッドリンカー配列と相同組換えが可能である。
[0071] 用語「同時に」は、本明細書で使用される場合、複数の組込みに関して使用される場合、宿主細胞が、ヌクレアーゼ、例えばヌクレアーゼをコードするプラスミドと、宿主細胞のゲノムに組み込もうとする１つより多くのドナーＤＮＡとで共に形質転換される時点から始まり、形質転換宿主細胞またはそのクローン集団が、ランディングパッドにおけるドナーＤＮＡ組込みの成功に関してスクリーニングされる時点で終わる期間を包含する。一部の実施形態において、「同時に」に包含される期間は、少なくともヌクレアーゼが宿主細胞の染色体内のその標的配列に結合してそれを切断するのに必要な時間である。一部の実施形態において、「同時に」に包含される期間は、宿主細胞が、ヌクレアーゼ、例えばヌクレアーゼをコードするプラスミドと１つより多くのドナーＤＮＡとで共に形質転換される時点から始まる、少なくとも６、１２、２４、３６、４８、６０、７２、９６または９６時間より長い時間である。
[0072] 用語「デグロン配列」は、デグロンタンパク質にフレーム内で融合した別のタンパク質に、融合したタンパク質の分解速度を変化させることによって不安定さを付与するタンパク質をコードする核酸を指す。
[0073] 用語「ターミネーター」は、転写単位（例えば遺伝子）の終わりを規定し、転写機構から新たに合成されたＲＮＡを放出するプロセスを開始させる転写ターミネーター配列を指す。
[0074] 用語「インシュレーター配列」は、外因性ランディングパッド中に挿入されたヌクレオチド配列であって、宿主細胞のゲノム中でランディングパッドの上流に配置された別のプロモーターからの予期せぬ「リードスルー」転写からランディングパッドを隔離する配列を指す。インシュレーター配列の例は、転写ターミネーター、または上流プロモーターからの予期せぬリードスルー転写を空間配置的に妨げる構造を形成する核酸である。
[0075] 用語「ニュートラルな遺伝子座」は、公知の機能または遺伝子転写がない、またはそこへの外因性ランディングパッドの組込みおよび／または外因性ドナー核酸の組込みが、対照細胞と比較して細胞の生存率または機能に有意に影響を与えない宿主細胞のゲノムにおける配置を指す。用語「ニュートラルな遺伝子座」は、複数の外因性ランディングパッドのコンテクストにおいて、タンパク質をコードする同じＤＮＡコンストラクトのそこへの組込みが類似したタンパク質発現レベルをもたらすゲノム遺伝子座を指す可能性がある。
[0076] 用語「遺伝子間領域」は、公知の機能がない遺伝子間に配置されたＤＮＡ配列のストレッチを指し、非コードＤＮＡのサブセットである。
５．２ 宿主細胞のゲノム中に外因性ランディングパッドを含む宿主細胞の生成
[0077] 宿主細胞のゲノム中に組み込まれた１つまたは複数の外因性ランディングパッドを含むように改変された宿主細胞、およびこのような宿主細胞を生成する方法が本明細書で提供される。外因性ランディングパッドは、本明細書で使用される場合、相同組換えを介した目的の外因性ドナー核酸の挿入をさらに容易にするために、安定して宿主細胞のゲノムに組み込まれる組換えによって生成した標的部位を指す。外因性ランディングパッドは、適合性を有する相同配列を含む外因性ドナー核酸の相同組換えを容易にするために、その５’および３’末端にランディングパッド相同性領域を含む。ある特定の実施形態において、その５’および３’末端におけるランディングパッドの相同性領域（ランディングパッド相同配列とも称される）は、宿主細胞のゲノムにとって外因性であり、宿主細胞のゲノムにおいて提示されず、外因性ドナー核酸の組込みは、宿主細胞における相同組換えのためにいかなる内因性ゲノム配列にも頼らない。したがって、ある特定の実施形態において、ランディングパッドにおける外因性ドナー核酸の組込み事象は、外因性ランディングパッドが配置されているところの周辺の内因性ゲノム配列から独立している。
[0078] ある特定の実施形態において、ランディングパッドは、ランディングパッド内でＤＮＡ二本鎖破断（DSB）を生成することが可能な部位特異的ヌクレアーゼによって認識可能であり、それと結合可能なヌクレアーゼ標的配列（NTS）をさらに含む。ランディングパッド内のＤＳＢは、外因性ドナー核酸の組込み効率を増加させ、ＤＳＢを修復できる形質転換宿主細胞が富化される。特定の実施形態において、宿主細胞のゲノム中に組み込まれたランディングパッドは、上流ランディングパッド相同配列（ULP）、下流ランディングパッド相同配列（DLP）、および（ULP）と（DLP）との間に位置するヌクレアーゼ標的配列（NTS）を含む。
[0079] 図１Ａは、宿主細胞中のＡＬＧ１遺伝子座下流の遺伝子間領域において組み込まれた１つのランディングパッドを含む宿主細胞の例示的な実施形態を例示する。この実施形態において、上流ランディングパッド相同配列（ULP）は、「ＵＬ」と表記され、下流ランディングパッド相同配列（DLP）は、「ＤＬ」と表記される。ヌクレアーゼ標的配列（NTS）は、「Ｘ」と表記される。ある特定の実施形態において、ランディングパッドは、予め決定された遺伝子座、すなわち宿主細胞中で下流の遺伝子間領域ＡＬＧ１遺伝子座中に組換え操作により作製される。ある特定の実施形態において、（ULP）および（DLP）の少なくとも１つは、宿主細胞のゲノム中に存在しない、組換えによって生成した合成配列である。ある特定の実施形態において、（ULP）および（DLP）の少なくとも１つは、宿主細胞のゲノム中に内因的に存在するが、それらの天然の遺伝子座の外側に（すなわち、ランディングパッド中の非ネイティブの遺伝子座に）配置されている配列であってもよい。
[0080] 図１Ｂは、外因性ドナー核酸のライブラリーを例示しており、各外因性ドナー核酸（ES）は、上流ライブラリー配列（UL）と下流ライブラリー配列（DL）との間に位置する目的の核酸（すなわち、曲がった矢印として示されるプロモーターに作動可能に連結したターミネーター配列を有するオープンリーディングフレーム）を含む。図１Ｂに示される例示的な実施形態において、各プロモーターは、リンカー配列「Ａ」を介してＯＲＦに作動可能に連結している。しかしながら、リンカー配列Ａは、ある特定の実施形態において省略されてもよく、外因性ドナー核酸は、プロモーターがリンカー配列を介さずオープンリーディングフレーム（ORF）に直接作動可能に連結するように操作されてもよい。
[0081] 図１Ａで例示された実施形態において、ランディングパッドの上流ランディングパッド相同配列（ULP）は、外因性ドナー核酸の（UL）と同じヌクレオチド配列を含み、ランディングパッドの下流ランディングパッド相同配列（DLP）は、外因性ドナー核酸の（DL）と同じヌクレオチド配列を含む。それゆえに、ライブラリー中のいずれの外因性ドナー核酸の（UL）も、ランディングパッドの（UL）と相同組換えが可能であり、ライブラリー中のいずれの外因性ドナー核酸（DL）も、図１Ａに示されるランディングパッドの（DL）と相同組換えが可能である。ランディングパッド中のヌクレアーゼ標的配列は、ヌクレアーゼＸ−カッター（例えば、ＣｐｈＩであり、図１Ａでは一丁のはさみとして示される）によって認識可能であり、それと結合可能である。図１Ｃで示されるように、ランディングパッド中に一旦組み込まれたら、目的の核酸（例えば、プロモーターに作動可能に連結したＯＲＦ１）の端部に、外因性ランディングパッド相同配列（すなわち、ULおよびDL）が配置され、これらは、宿主細胞のゲノム中の内因性ゲノム配列（例えば、ｉＡＬＧ１）に入れ子になっている(nested within)。しかしながら、この実施形態において、内因性ゲノム配列は、相同組換えに使用されない。
[0082] 図１Ｄは、外因性ランディングパッドの別の実施形態を例示する。ｉＡＬＧ１遺伝子座において組み込まれた外因性ランディングパッドは、図１Ａに示されるランディングパッドに実質的に類似しているが、ランディングパッドは、ランディングパッドの５’領域に「ＵＬ」と表記される上流ランディングパッド配列に隣接して、さらにランディングパッドの３’領域に「ＤＬ」と表記される下流ランディングパッド配列に隣接してインシュレーター配列をさらに含む。図１Ｄは、ランディングパッドの５’および３’領域の両方に存在するインシュレーター配列を例示するが、ある特定の実施形態において、ランディングパッドは、ランディングパッドの５’領域にのみ、３’領域にのみインシュレーター配列を有するか、または５’領域にも３’領域にもインシュレーター配列を有さない。ある特定の実施形態において、インシュレーター配列は、転写ターミネーター配列である。
[0083] 図１Ｅは、ランディングパッドに組み込むことができる３つの異なるタイプの外因性ドナー核酸を例示する。図１Ｅの一番上は、単一のＤＮＡパーツで作製される外因性ドナー核酸を例示する。外因性ドナー核酸は、上流ライブラリー配列（UL）と下流ライブラリー配列（DL）との間に位置する目的の核酸を含む。目的の核酸は、プロモーター（曲がった矢印として示される）とターミネーター（「term」）との間に位置するオープンリーディングフレーム（「ORF」）である。プロモーターおよびＯＲＦは、リンカー配列「Ａ」を介して連結される。
[0084] 図１Ｅの中央は、インビボで組み立てられ、ランディングパッドへの組込みを起こすことができる２つの別個のコンポーネントポリヌクレオチドとしての外因性ドナー核酸を例示する。左側に示される第１のコンポーネントポリヌクレオチドは、目的の核酸としてプロモーター配列を有し、右側に示される最後のコンポーネントポリヌクレオチドは、目的の核酸としてＯＲＦを有する。左側のコンポーネントポリヌクレオチドおよび右側のコンポーネントポリヌクレオチドが、インビボで一致するリンカー配列「Ａ」を介して組み立てられる場合、それらは、図１Ｄに示されるランディングパッドへの組込みを起こすことが可能である。
[0085] 図１Ｅの一番下は、インビボで組み立てられ、組み立てられたパーツとしてランディングパッドへの組込みを起こすことができる、３つの別個のコンポーネントポリヌクレオチドの外因性ドナー核酸を例示する。左側に示される第１のコンポーネントポリヌクレオチドは、目的の核酸としてプロモーター配列を有し、中央に示される中間コンポーネントポリヌクレオチドは、目的の核酸としてＯＲＦを有し、右側に示される最後のコンポーネントポリヌクレオチドは、目的の核酸としてターミネーターを有する。第１のコンポーネントポリヌクレオチドおよび中間コンポーネントポリヌクレオチドの各々は、整合リンカー配列「Ａ」を含み、中間コンポーネントポリヌクレオチドおよび最後のコンポーネントポリヌクレオチドの各々は、整合リンカー配列「Ｂ」を含む。コンポーネントポリヌクレオチドが、インビボでそれら各々の整合リンカー配列「Ａ」および「Ｂ」を介して組み立てられる場合、それらは、図１Ｄに示されるランディングパッドへの組込みを起こすことが可能である。
[0086] 図１Ｅは、ランディングパッドに核酸を組み込むための、単一パーツの外因性ドナー核酸、２パーツのコンポーネントポリヌクレオチド、または３パーツのコンポーネントポリヌクレオチドの使用を例示するが、ランディングパッドへの組込みに利用できるコンポーネントポリヌクレオチドの数は、３より多くてもよい。以下のセクション５．３．３で、ゲノム組込みへのコンポーネントポリヌクレオチドの使用をさらに説明する。
[0087] 図１Ｆは、図１Ｄに示されるコンビナトリアル的に組み合わせてランディングパッドに組み込むことができる３パーツのコンポーネントポリヌクレオチドを例示する。図１Ｆにおいて、第１のコンポーネントポリヌクレオチドのプロモーターライブラリーが左側に示され、これらの各々は、上流ライブラリー配列（UL）と第１のリンカー配列（A）との間に位置する異なるプロモーター配列を含む。図１Ｆの中央に、中間コンポーネントポリヌクレオチドのＯＲＦライブラリーが示され、これらの各々は、上流中間リンカー配列「Ａ」と下流中間リンカー配列「Ｂ」との間に位置する異なるＯＲＦを含む。図１Ｆの右側に、最後のコンポーネントポリヌクレオチドのターミネーターライブラリーが示され、これらの各々は、最後のリンカー配列「Ｂ」と下流ライブラリー配列（DL）との間に位置する異なるターミネーターを含む。各ライブラリーからの各コンポーネントポリヌクレオチドは、他のライブラリー中の他のコンポーネントポリヌクレオチドとコンビナトリアル的に組み合わせることができる。それゆえに、図１Ｆに示される９つのコンポーネントポリヌクレオチドをコンビナトリアル的に組み合わせて、単一のランディングパッドにおいて組み込まれたコンポーネントポリヌクレオチドの２７個の異なる組合せを生成することができ、これらは、２７種の異なる表現型を有する宿主細胞の集団を生成する可能性がある。
[0088] 特定の実施形態において、宿主細胞は、宿主細胞のゲノム中に組み込まれた２つ以上の外因性ランディングパッドを含む。ある特定の実施形態において、２つ以上の外因性ランディングパッドは、それらの上流ランディングパッド相同配列（ULP）が互いに同一または実質的に同一であり、それらの下流ランディングパッド相同配列（DLP）が互いに同一または実質的に同一であるという点で標準化される。標準化されたランディングパッド相同配列は、外因性ドナー核酸が、その５’および３’領域に適合性を有する相同性領域を含む限り、あらゆる外因性ドナー核酸のあらゆるランディングパッドへの宿主細胞媒介相同組換えを容易にする。したがって、ある特定の実施形態において、ライブラリー中の全ての外因性ドナー核酸は、その５’末端に、ランディングパッドのいずれかで任意の（ULP）と相同組換えできる標準化された上流ライブラリー配列（UL）、およびその３’末端に、ランディングパッドのいずれかで任意の（DLP）と相同組換えできる標準化された下流ライブラリー配列（DL）を含む。
[0089] ある特定の実施形態において、ランディングパッドは、宿主細胞のゲノムの「ニュートラルな」遺伝子座であることが予め決定されているゲノム遺伝子座に組み込まれている。ある特定の実施形態において、ランディングパッド組込みのためのゲノム遺伝子座は、ＲＮＡシーケンシングによってゲノム遺伝子座の周りの領域に遺伝子転写が見出されない場合、ニュートラルな遺伝子座とみなされる。ある特定の実施形態において、ＲＮＡ配列によってゲノム遺伝子座の周りの領域に遺伝子転写が見出されない場合、さらに、ゲノム遺伝子座が、他の近縁種（例えば、サッカロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）およびサッカロマイセス・パラドクサス（Saccharomyces paradoxus））において、それらのゲノム配列を並べたときに類似の位置を有するゲノム遺伝子座に相同な配列を含まない場合、ランディングパッド組込みのためのゲノム遺伝子座は、ニュートラルな遺伝子座とみなされる。近縁種のゲノム配列は、あらゆる好適な方法を使用して、例えば視覚的に、または例えばＢＬＡＳＴｎ、ｇｅｎｏｍｅ．ｕｃｓｃ．ｅｄｕからのＵＣＳＣゲノムブラウザなどのアルゴリズムを使用して比較することができる。一部の実施形態において、１つまたは複数のランディングパッドは、公知の機能がない宿主細胞のゲノム中の遺伝子間領域において組み込まれている。一部の実施形態において、１つまたは複数のランディングパッドは、宿主細胞のゲノムの非コード領域において組み込まれている。一部の実施形態において、１つまたは複数のランディングパッドは、宿主細胞のゲノムのコード領域において組み込まれるかまたはそれに隣接している。
[0090] 一部の実施形態において、配列分析によってニュートラルであると決定されたこれらのゲノム遺伝子座はさらに、宿主細胞の機能に基づき検証される。例えば、標的分子産生、バイオマス収量、細胞増殖速度などのパラメーターに対するランディングパッド組込みの作用を測定して、ランディングパッドの組込みがない対照宿主細胞と比較することができる。一部の実施形態において、１つのランディングパッド中に組み込まれたレポーター遺伝子の発現を、宿主細胞のゲノム中の他のランディングパッド中に組み込まれた場合の発現と比較して、異なるランディングパッドにおける組込み効率またはレポーター遺伝子の発現のあらゆる変動を決定することができる。
[0091] 用語「ニュートラルな遺伝子座」は、複数の外因性ランディングパッドのコンテクストにおいて、そこにタンパク質をコードする同じＤＮＡコンストラクトが組み込まれると、タンパク質発現のレベルの類似が起こるゲノム遺伝子座を指す場合がある。例えば、複数の外因性ランディングパッドにおいて組み込まれたレポーター遺伝子の発現レベルは、外因性ランディングパッドがニュートラルな遺伝子座において組み込まれる場合、５０％未満、４０％未満、３０％未満、２０％未満、１０％未満、または５％未満変化する可能性がある。それゆえに、ある特定の実施形態において、ニュートラルな遺伝子座での外因性ランディングパッドの組込みは、外因性ランディングパッドにおいて組み込まれた外因性核酸の発現のためのあらゆるゲノム配置のコンテクストを除去する。
[0092] 図２Ａは、宿主細胞のゲノム中に組み込まれた３つの標準化された外因性ランディングパッドを含む宿主細胞の例示的な実施形態を例示する。図２Ａに示される例示的な実施形態において、３つの標準化されたランディングパッドは、酵母細胞ゲノム中の遺伝子座ＡＬＧ１、ＭＧＡ１、およびＹＣＴ１下流（すなわち、それぞれｉＡＬＧ１、ｉＭＧＡ１、およびｉＹＣＴ１）の遺伝子間領域中に組み込まれている。これらの遺伝子間のゲノム遺伝子座は、ニュートラルな遺伝子座として検証されている。図２Ａで例示された実施形態において、各ランディングパッドは、ランディングパッドの上流ランディングパッド相同配列（ULP）と下流ランディングパッド相同配列（DLP）との間に位置する、ヌクレアーゼ「Ｘ−カッター」（例えば、CphI）によって認識可能であり、それと結合可能なヌクレアーゼ標的配列（NTS）を含む。図２Ａにおいて、３つのランディングパッドの（ULP）は、外因性ドナー核酸のライブラリーの上流ライブラリー配列（UL）と同じ配列を含み、３つのランディングパッドの（DLP）は、外因性ドナー核酸のライブラリーの下流ライブラリー配列（DL）と同じ配列を含む。図２Ａ〜２Ｄで例示された実施形態において、３つのランディングパッドの各々が、ヌクレアーゼＸ−カッター（例えば、CphI）によって結合できる同じヌクレアーゼ標的配列を含むことから、これらのランディングパッドは、ヌクレアーゼ標的配列を特異的に認識し、ランディングパッド内の部位を切断する単一のヌクレアーゼだけを使用して、複数の外因性ドナー核酸の同時の組込みを適合させることができる。
[0093] あらゆる好適な数のランディングパッドを、宿主細胞のゲノムに組み込まれていてもよい。ある特定の実施形態において、宿主細胞のゲノムに組み込まれたランディングパッドの数は、１〜５００である。ある特定の実施形態において、宿主細胞のゲノム中に組み込まれたランディングパッドの数は、２〜２５０である。ある特定の実施形態において、宿主細胞のゲノム中に組み込まれたランディングパッドの数は、３〜２００である。ある特定の実施形態において、宿主細胞のゲノム中に組み込まれたランディングパッドの数は、３〜５０である。ある特定の実施形態において、宿主細胞のゲノム中に組み込まれたランディングパッドの数は、３〜２０である。ある特定の実施形態において、宿主細胞のゲノム中に組み込まれたランディングパッドの数は、３〜１０である。ある特定の実施形態において、宿主細胞のゲノム中に組み込まれたランディングパッドの数は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００、４００、５００、またはこれらの数の間のあらゆる数である。
[0094] 図２Ａは、３つの別個のゲノム遺伝子座中の３つのランディングパッドを例示するが、一部の実施形態において、２つ以上のランディングパッドは、単一のゲノム遺伝子座中に組み込まれていてもよい。例えば、タンデム式の２つのランディングパッドは、ＡＬＧ１遺伝子座から下流の遺伝子間領域に組み込まれていてもよい。このような実施形態において、相同組換えを介してランディングパッドをループ化する代わりに、ランディングパッドを保持する宿主細胞の選択圧力を付加するために、必須の遺伝子を２つのランディングパッド間に挿入してもよい。代替として、組換え事象により生存不可能な細胞が生じるように、染色体転移に適合性を有する染色体位置を有する遺伝子座を選択することができる。
[0095] 各ランディングパッド配列は、当業界において公知のあらゆる技術を使用して生成することができる。一部の実施形態において、ランディングパッド配列の全体を、化学合成および／または組換え分子生物学技術を使用して新たに合成することができる。例えば、ＫｏｓｕｒｉおよびＣｈｕｒｃｈ、Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｔｈｏｄｓ １１：４９９〜５０７（２０１４）を参照されたい。ある特定の実施形態において、各ランディングパッドのパーツ（例えば、ULP、DLP、およびNTS）を別個のパーツとして別々に合成して、次いで一緒にライゲートしてもよい。代替として、ランディングパッド配列は、商業的な核酸合成サービスから得ることができる。これらとしては、例えば、Ｔｗｉｓｔ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ（San Francisco、CA）、Ｂｉｏｍａｔｉｋ（Wilmington、DE）、Ｇｅｎｅｓｃｒｉｐｔ（Piscataway、NJ）、およびｗｗｗ．ｉｎｔｒｏｇｅｎ．ｃｏｍ経由で利用可能なＧｅｎｅＡｒｔ遺伝子合成サービスが挙げられる。
[0096] ランディングパッドは、当業界において公知のあらゆる好適な方法を使用して宿主細胞のゲノムに組み込むことができる。例えば、選択可能マーカーを使用する相同組換えによる従来の遺伝子標的化方法を使用して、ランディングパッドを宿主細胞のゲノムに導入し組み込むことができる。一部の実施形態において、それに続き、選択可能マーカー遺伝子を宿主細胞のゲノムから切り出してもよい。例えば米国特許番号第７，９１９，６０５号及び第９，０１８，３６４号を参照。一部の実施形態において、デザイナーヌクレアーゼ、例えばＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系などを使用して、望ましい特異的な標的ゲノム遺伝子座への１つまたは複数のランディングパッドの組込みを容易にすることができる。例えば、米国特許公開公報第２０１５／０１８４１９９号；Horwitz et al., Cell Systems 1, 88-96, Jul 29, 2015; Cong et al., 2013, Science 339: 819-823; Jao et al., 2013, Proc. Natl. Acad. Sci USA 110, 13904-13909; Wang et al. 2013, Cell 153, 910-918; Jacobs et al., 2014, Nat. Commun. 5, 5344を参照されたい。
５．２．１．上流および下流ランディングパッド相同配列
[0097] ある特定の実施形態において、宿主細胞のゲノム中に操作により作製された外因性ランディングパッドの各々は、その５’領域に上流ランディングパッド相同配列（ULP）およびその３’領域に下流ランディングパッド相同配列（DLP）を含む。これらの配列は、宿主細胞媒介組換えおよび外因性ドナー核酸の組込みのための相同性領域を提供する。特定の実施形態において、ランディングパッド相同配列は、それらが組み込まれるゲノム遺伝子座にとって「外因性」である。言い換えると、これらのランディングパッド相同配列は、それらが組み込まれるゲノム遺伝子座の内因性配列の一部ではない。他の実施形態において、ランディングパッド相同配列は、宿主細胞のゲノム中に存在していてもよいが、それらは、ランディングパッド中のそれらの非ネイティブの遺伝子座に配置される。
[0098] ある特定の実施形態において、ランディングパッド相同配列は、いずれのゲノムＤＮＡとも配列相同性を共有しない。ある特定の実施形態において、（ULP）および／または（DLP）のヌクレオチド配列は、合成である。ある特定の実施形態において、（ULP）および／または（DLP）のヌクレオチド配列は、コンピューターアルゴリズムによってランダムに生成する。好適なランディングパッド相同配列は、望ましくない特徴を有するランダムに生成した配列、例えば、宿主細胞のゲノム中の、タンデムおよび／または逆方向反復配列、ＤＮＡの２次構造、ならびに公知の生物学的配列へのあらゆる有意な相同性を有する配列を除去することによって選択される。ある特定の実施形態において、ランダムに生成したヌクレオチドをさらにフィルタリングして、約３０％〜約７０％、典型的には約４０％〜６０％、典型的には約４５％〜約５５％、または約５０％のＧＣ含量（またはグアニン−シトシン含量）を含むものを選択する。
[0099] 一部の実施形態において、（ULP）および（DLP）は、いずれのランディングパッドでの外因性核酸（ES）のゲノム組込みを可能にする十分な長さおよび配列同一性を有するあらゆるヌクレオチド配列を含んでいてもよい。ある特定の実施形態において、（ULP）および（DLP）の各々は、独立して、約２０〜５，０００ヌクレオチドからなる。ある特定の実施形態において、（ULP）および（DLP）の各々は、独立して、約２０〜２，５００ヌクレオチドからなる。ある特定の実施形態において、（ULP）および（DLP）の各々は、独立して、約２５〜１，０００ヌクレオチドからなる。ある特定の実施形態において、（ULP）および（DLP）の各々は、独立して、約５０〜５００ヌクレオチドからなる。ある特定の実施形態において、（ULP）および（DLP）の各々は、独立して、約１００〜約５００ヌクレオチドからなる。ある特定の実施形態において、（ULP）および（DLP）の各々は、独立して、約２０、２５、５０、７５、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、１１００、１２００、１３００、１４００、１５００、１６００、１７００、１８００、１９００、２０００、２１００、２２００、２３００、２４００、２５００、２６００、２７００、２８００、２９００、３０００、３１００、３２００、３３００、３４００、３５００、３６００、３７００、３８００、３９００、４０００、４１００、４２００、４３００、４４００、４５００、４６００、４７００、４８００、４９００、５０００ヌクレオチドからなるか、またはこれらの数の間のあらゆる数である。一部の実施形態において、（ULP）および（DLP）の各々は、独立して、約５００ヌクレオチドからなる。一部の実施形態において、（ULP）および（DLP）の各々は、独立して、約２００ヌクレオチドからなる。一部の実施形態において、（ULP）および（DLP）の各々は、独立して、約１００ヌクレオチドからなる。
[00100] 宿主細胞のゲノム中に組み込まれた２つ以上のランディングパッドが存在するある特定の実施形態において、ランディングパッド中の全ての（ULP）のヌクレオチド配列は、互いに実質的に同一であり、ランディングパッド中の全ての（DLP）中のヌクレオチド配列は、互いに実質的に同一である。例えば、ランディングパッド中の全ての（ULP）は、互いに少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるヌクレオチド配列を含み、ランディングパッド中の全ての（DLP）は、互いに少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態において、ランディングパッド中の全ての（ULP）のヌクレオチド配列は、互いに同一であり、ランディングパッド中の全ての（DLP）中のヌクレオチド配列は、互いに同一である。このような例示的な実施形態は、３つのランディングパッドが「ＵＬ」と表記される３つの同一な（ULP）および「ＤＬ」と表記される３つの同一な（DLP）を含む図２Ａで例示される。宿主細胞のゲノム中に組み込まれた２つ以上のランディングパッドが、実質的に同一な（ULP）および（DLP）を含む場合、これらのランディングパッドは、標準化されたランディングパッドまたは一次ランディングパッドと称される。
[00101] ある特定の実施形態において、宿主細胞のゲノムは、一次ランディングパッドとは異なる１つまたは複数の代替ランディングパッドを含んでいてもよい。これらの代替ランディングパッドの例示的な実施形態は図５Ｂ、６Ｂ、７Ａ〜７Ｃ、および８で例示されており、これらは以下のセクションでさらに詳細に説明される。これらの代替ランディングパッドは、一次ランディングパッドに追加して取り込んでもよいし、またはその代わりに取り込んでもよい。
５．２．２．ヌクレアーゼ標的配列
[00102] 各ランディングパッド中のヌクレアーゼ標的配列（NTS）は、ヌクレアーゼによって認識されるヌクレオチド配列を含む。ヌクレアーゼが各ランディングパッド中のヌクレアーゼ標的配列（NTS）を認識してそれに結合すると、ヌクレアーゼは、ランディングパッド中の（NTS）内またはそのすぐ近くの部位を切断することができる。ある特定の実施形態において、ヌクレアーゼ標的配列は、ランディングパッド配列の少なくとも１つに隣接して配置される。ある特定の実施形態において、ヌクレアーゼ標的配列（NTS）は、上流ランディングパッド相同配列（ULP）と下流ランディングパッド相同配列（DLP）との間に位置する。ヌクレアーゼがヌクレアーゼ標的配列を有するランディングパッドを含む宿主細胞に導入されると、ヌクレアーゼは、ランディングパッド内の部位で二本鎖破断を引き起こすことができ、それにより切断部位で、またはその近くで相同組換えの頻度が大きく増加する。
[00103] 一部の実施形態において、複数のランディングパッドは、同じヌクレアーゼ標的配列を含み、それによってヌクレアーゼ標的配列を特異的に認識する単一のヌクレアーゼのみを使用した同時の複数の組込み事象が容易になる。一部の実施形態において、宿主細胞のゲノム中の複数のランディングパッドの一部は、異なるヌクレアーゼによって認識可能であり、それと結合可能である異なるヌクレアーゼ標的配列を有していてもよい。このような実施形態において、異なるヌクレアーゼを同時にまたは逐次的に使用して、宿主細胞のゲノム中の同時のまたは逐次的な外因性ドナー核酸の組込みのために異なるヌクレアーゼ標的配列を切断することができる。
[00104] 一部の実施形態において、ランディングパッド中のヌクレアーゼ標的配列は、宿主細胞のネイティブのゲノム中に特に提示されないヌクレアーゼ標的配列を含む。一部の実施形態において、ヌクレアーゼによって認識されるヌクレアーゼ標的配列は、ランディングパッド内でのみ宿主細胞のゲノム中に存在し、それによってヌクレアーゼによるあらゆるオフターゲットのゲノム結合および切断が最小化される。ある特定の実施形態において、特異的なヌクレアーゼは、少なくとも１２塩基対の長さの、または一部の場合において１４〜５５塩基対の長さのポリヌクレオチド認識部位を有する希少切断エンドヌクレアーゼであってもよい。このようなエンドヌクレアーゼは、エンドヌクレアーゼ活性を有する天然タンパク質由来のもの、例えばホーミングエンドヌクレアーゼ（ＷＯ２００４／０６７７３６）、または様々な核酸結合ポリペプチドをヌクレアーゼコンポーネント、例えばＦｏｋ−１またはＴｅｖ−１触媒ドメイン（ＷＯ２０１２１３８９２７）に融合するによるもののいずれかであり得る。この点において操作することができる適切な核酸結合ドメインは、例えば、ジンクフィンガードメイン（Kim et al., 1994, Chimeric restriction endonuclease, PNAS, 91:883-887）、キサントモナス属関連の微生物由来のＴＡＬエフェクター（ＷＯ２０１１／０７２２４６）または内共生性のバークホルデリア・リゾキシニカ（Burkholderia rhizoxinica）に由来するＭＢＢＢＤ（モジュラー式の塩基対塩基結合ドメイン）である。加えて、ヌクレアーゼＣａｓ９相同体およびＲＮアーゼＩＩＩを含む系（CRISPR/Cas9）は、細菌性微生物の免疫系から開発されている。この系において、エンドヌクレアーゼタンパク質複合体の特異性は、「ガイドＲＮＡ」（gRNA）と呼ばれる特異的な一本鎖ＲＮＡによってアドレス指定される。このガイドＲＮＡは、ヌクレアーゼコンポーネントＣａｓ９によって切断される核酸標的配列をハイブリダイズする能力を有する（Le Cong et al., 2013, Science, 339 (6121): 819-823）。これらのヌクレアーゼによって認識可能であるか、および／またはそれと結合できるヌクレアーゼ標的配列は周知であり、当業界で説明されている。以下のセクション５．６で、好適なヌクレアーゼおよびヌクレアーゼ標的配列の説明をさらに詳細に説明する。
５．２．３．好適な宿主細胞
[00105] ランディングパッドを有する親株を生成するための好適な宿主細胞としては、目的の核酸または「ドナーＤＮＡ」が染色体のまたはエピソームの遺伝子座に組み込まれることが望ましいあらゆる細胞が挙げられる。一部の実施形態において、細胞は、相同組換えを起こす能力を有する生物の細胞である。例示的な実施形態のいくつかは酵母（S.cerevisiae）で実証されているが、本明細書で提供されるゲノム改変方法は、組換え系が酵母の場合ほどの能力がないとしても、機能的な組換え系を有する全ての生物で実施が可能であると考えられる。機能的な相同組換え系を有する他の細胞または細胞型としては、細菌、例えばバチルス・ズブチリス（Bacillus subtilis）および大腸菌（E.coli）（これは、RecE RecT組換え能を有する；Muyrers et al., EMBO rep. 1: 239-243, 2000）；原生動物（例えば、プラスモジウム属、トキソプラズマ属）；他の酵母（例えば、シゾサッカロマイセス・ポンベ（SchizoSaccharomyces pombe））；糸状菌（例えば、アシュビア・ゴシッピイ（Ashbya gossypii））；植物、例えば蘚類のヒメツリガネゴケ（Physcomitrella patens）（Schaefer and Zryd, Plant J. 11: 1195-1206, 1997；および動物細胞、例えば哺乳類細胞およびニワトリＤＴ４０細胞（Dieken et al., Nat. Genet. 12:174-182, 1996）が挙げられる。
[00106] 一部の実施形態において、宿主細胞は、原核細胞である。一部の実施形態において、宿主細胞は、真核細胞である。一部の実施形態において、細胞は、真菌細胞（例えば、酵母細胞）、細菌細胞、植物細胞、または動物細胞（例えば、ニワトリ細胞）である。一部の実施形態において、宿主細胞は、哺乳類細胞である。一部の実施形態において、宿主細胞は、チャイニーズハムスター卵巣（CHO）細胞、ＣＯＳ−７細胞、マウス線維芽細胞、マウス胚性癌腫細胞、またはマウス胚幹細胞である。一部の実施形態において、宿主細胞は、昆虫細胞である。一部の実施形態において、宿主細胞は、Ｓ２細胞、シュナイダー（Schneider）細胞、Ｓ１２細胞、５Ｂ１−４細胞、Ｔｎ５細胞、またはＳｆ９細胞である。一部の実施形態において、宿主細胞は、単細胞の真核生物細胞である。
[00107] 特定の実施形態において、宿主細胞は、酵母細胞である。有用な酵母宿主細胞としては、微生物受託機関（例えばIFO、ATCCなど）に寄託された酵母細胞が挙げられ、なかでも、アシクロコニディウム属（Aciculoconidium）、アンブロシオザイマ属（Ambrosiozyma）、アルスロアスカス属（Arthroascus）、アルキシオザイマ属（Arxiozyma）、アシュビア属（Ashbya）、バブジェビア属（Babjevia）、ベンシングトニア属（Bensingtonia）、ボトリオアスカス属（Botryoascus）、ボトリオザイマ属（Botryozyma）、ブレッタノマイセス属（Brettanomyces）、ビュレラ属（Bullera）、ビュレロマイセス属（Bulleromyces）、カンジダ属（Candida）、シテロミセス属（Citeromyces）、クラビスポラ属（Clavispora）、クリプトコックス属（Cryptococcus）、シストフィロバシディウム属（Cystofilobasidium）、デバリオマイセス属（Debaryomyces）、デッケラ属（Dekkara）、ディポダスコプシス属（Dipodascopsis）、ディポダスカス属（Dipodascus）、エニエラ属（Eeniella）、エンドマイコプセラ属（Endomycopsella）、エレマスカス属（Eremascus）、エレモテシウム属（Eremothecium）、エリスロバシディウム属（Erythrobasidium）、フェロマイセス属（Fellomyces）、フィロバシディウム属（Filobasidium）、ガラクトマイセス属（Galactomyces）、ゲオトリクム属（Geotrichum）、ガイラーモンデラ属（Guilliermondella）、ハンセニアスポラ属（Hanseniaspora）、ハンセヌラ属（Hansenula）、ハセガワエア属（Hasegawaea）、ホルターマンニア属（Holtermannia）、ホルモアスカス属（Hormoascus）、ハイフォピキア属（Hyphopichia）、イッサチェンキア属（Issatchenkia）、クロエケラ属（Kloeckera）、クロエケラスポラ属（Kloeckeraspora）、クルイベロマイセス属（Kluyveromyces)、コンドア属（Kondoa）、クライシア属（Kuraishia）、クルツマノマイセス属（Kurtzmanomyces）、ロイコスポリジウム属（Leucosporidium）、リポマイセス属（Lipomyces）、ロデロマイセス属（Lodderomyces）、マラセジア属（Malassezia）、メトシュニコウィア属（Metschnikowia）、ムラキア属（Mrakia）、ミクソザイマ属（Myxozyma）、ナドソニア属（Nadsonia）、ナカザワエア属（Nakazawaea）、ネマトスポラ属（Nematospora）、オガタエア属（Ogataea）、オースポリディウム属（Oosporidium）、パチソレン属（Pachysolen）、ファチコスポラ属（Phachytichospora）、ファフィア属（Phaffia）、ピキア属（Pichia）、ロドスポリディウム属（Rhodosporidium）、ロドトルラ属（Rhodotorula）、サッカロマイセス属（Saccharomyces）、サッカロマイコーデス属（Saccharomycodes）、サッカロマイコプシス属（Saccharomycopsis）、サイトエラ属（Saitoella）、サカグチア属（Sakaguchia）、サターノスポラ属（Saturnospora）、シゾブラストスポリオン属（Schizoblastosporion）、シゾサッカロマイセス属（Schizosaccharomyces）、シュワニオミセス属（Schwanniomyces）、スポリディオボラス属（Sporidiobolus）、スポロボロマイセス属（Sporobolomyces）、スポロパキデミア属（Sporopachydermia）、ステファノアスカス属（Stephanoascus）、ステリグマトマイセス属（Sterigmatomyces）、ステリグマトスポリディウム属（Sterigmatosporidium）、シンビオタフリナ属（Symbiotaphrina）、シンポディオマイセス属（Sympodiomyces）、シンポディオマイコプシス属（Sympodiomycopsis）、トルラスポラ属（Torulaspora）、トリコスポリエラ属（Trichosporiella）、トリコスポロン属（Trichosporon）、トリゴノプシス属（Trigonopsis）、ツチヤエア属（Tsuchiyaea）、ウデニオマイセス属（Udeniomyces）、ワルトマイセス属（Waltomyces）、ウィカーハミア属（Wickerhamia）、ウィカーハミエラ属（Wickerhamiella）、ウィカーハミエラ属（Williopsis）、ヤマダザイマ属（Yamadazyma）、ヤロウイア属（Yarrowia）、ザイゴアスカス属（Zygoascus）、チゴサッカロマイセス属（Zygosaccharomyces）、ザイゴウィリオプシス属（Zygowilliopsis）、およびザイゴザイマ属（Zygozyma）に属するものが挙げられる。
[00108] 一部の実施形態において、酵母宿主細胞は、サッカロマイセス・セレビシエ細胞、ピキア・パストリス（Pichia pastoris）細胞、シゾサッカロマイセス・ポンベ細胞、デッケラ・ブルクセレンシス（Dekkera bruxellensis）細胞、クルイベロマイセス・ラクティス（Kluyveromyces lactis）細胞、アークスラ・アデニニボランス（Arxula adeninivorans）細胞、またはハンセヌラ・ポリモルファ（Hansenula polymorpha）（現在、ピキア・アンガスタ（Pichia angusta）として公知）細胞である。特定の実施形態において、酵母宿主細胞は、サッカロマイセス・セレビシエ細胞である。一部の実施形態において、酵母宿主細胞は、サッカロマイセス・フラギリス（Saccharomyces fragilis）細胞またはクルイベロマイセス・ラクティス（以前はサッカロマイセス・ラクティスと呼ばれていた）細胞である。一部の実施形態において、酵母宿主細胞は、カンジダ属に属する細胞であり、例えばカンジダ・リポリチカ（Candida lipolytica）、カンジダ・ギリエルモンジイ（Candida guilliermondii）、カンジダ・クルセイ（Candida krusei）、カンジダ・プソイドトロピカリス（Candida pseudotropicalis）、またはカンジダ・ユチリス（Candida utilis）である。他の特定の実施形態において、酵母宿主細胞は、クリベロマイセス・マルキシアヌス（Kluveromyces marxianus）細胞である。
[00109] 特定の実施形態において、酵母宿主細胞は、パン酵母、ＣＢＳ ７９５９細胞、ＣＢＳ ７９６０ 細胞、ＣＢＳ ７９６１細胞、ＣＢＳ ７９６２細胞、ＣＢＳ ７９６３細胞、ＣＢＳ ７９６４細胞、ＩＺ−１９０４細胞、ＴＡ細胞、ＢＧ−１細胞、ＣＲ−１細胞、ＳＡ−１細胞、Ｍ−２６細胞、Ｙ−９０４細胞、ＰＥ−２細胞、ＰＥ−５細胞、ＶＲ−１細胞、ＢＲ−１細胞、ＢＲ−２細胞、ＭＥ−２細胞、ＶＲ−２細胞、ＭＡ−３細胞、ＭＡ−４細胞、ＣＡＴ−１細胞、ＣＢ−１細胞、ＮＲ−１細胞、ＢＴ−１細胞およびＡＬ−１細胞からなる群から選択されるサッカロマイセス・セレビシエ細胞である。一部の実施形態において、宿主細胞は、ＰＥ−２細胞、ＣＡＴ−１細胞、ＶＲ−１細胞、ＢＧ−１細胞、ＣＲ−１細胞、およびＳＡ−１細胞からなる群から選択されるサッカロマイセス・セレビシエ細胞である。特定の実施形態において、サッカロマイセス・セレビシエ宿主細胞は、ＰＥ−２細胞である。他の特定の実施形態において、サッカロマイセス・セレビシエ宿主細胞は、ＣＡＴ−１細胞である。他の特定の実施形態において、サッカロマイセス・セレビシエ宿主細胞は、ＢＧ−１細胞である。
[00110] 一部の実施形態において、酵母宿主細胞は、工業的な発酵、例えばバイオエタノール発酵に好適な細胞である。特定の実施形態において、細胞は、工業的な発酵環境において認められるストレス条件である、高い溶媒濃度、高温、基質利用の拡張、栄養素の制限、浸透圧ストレス、酸性度、亜硫酸塩および細菌汚染、またはそれらの組合せのもとで存在するように調整される。
５．３ ランディングパッドに組み込まれる外因性ドナー核酸
[0001] 別の態様において、標準化されたランディングパッドがそのゲノム中に操作により作製されたあらゆる宿主細胞での再使用に適した、標準化された相同配列を含む外因性ドナー核酸が本明細書で提供される。ある特定の実施形態において、宿主細胞に導入された外因性ドナー核酸は、それらがランディングパッドにそれ自体で相同組換えできるように、上流および下流ライブラリー配列の両方を含む。ある特定の実施形態において、外因性ドナー核酸は、コンポーネントポリヌクレオチドであり、それらはいずれも、ランディングパッドで相同組換えするための上流および下流ライブラリー配列の両方を有していない。適合性リンカー配列を有するコンポーネントポリヌクレオチドが、インビボで相同組換えを介して組み立てられる場合、上流および下流ライブラリー配列の両方を有する組み立てられたコンポーネントポリヌクレオチドは、宿主細胞のゲノム中のランディングパッドで相同組換えが可能である。一部の実施形態において、各コンポーネントポリヌクレオチドは、上流ライブラリー配列（UL）とリンカー配列との間に位置する目的の核酸を含む。他の実施形態において、各コンポーネントポリヌクレオチドは、リンカー配列と下流ライブラリー配列（DL）との間に位置する目的の核酸を含む。ある特定の実施形態において、コンポーネントポリヌクレオチドは、２つのリンカー配列の間に位置する目的の核酸を含む。コンポーネントポリヌクレオチドのこれらの異なるセットが宿主細胞と接触すると、それら各々のリンカー配列は、インビボで相同組換えして、宿主細胞のゲノム中のランディングパッドのいずれか１つに組み立てられたコンポーネントポリヌクレオチドを組み込むことができる。ある特定の実施形態において、外因性ドナー核酸は、直鎖状ＤＮＡ分子として宿主細胞に導入される。ある特定の実施形態において、外因性ドナー核酸は、環状ＤＮＡ分子として宿主に導入される。
[00111] 外因性ドナー核酸は、当業者にとって明白なあらゆる技術によって生成することができる。ある特定の実施形態において、組込みポリヌクレオチドは、当業界において周知のポリメラーゼ連鎖反応（PCR）および分子クローニング技術を使用して生成される。例えば、PCR Technology: Principles and Applications for DNA Amplification, ed. HA Erlich, Stockton Press, New York, N.Y. (1989); Sambrook et al., 2001, Molecular Cloning - A Laboratory Manual, 3rd edition, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY; PCR Technology: Principles and Applications for DNA Amplification, ed. HA Erlich, Stockton Press, New York, N.Y. (1989); 米国特許番号第８，１１０，３６０号を参照されたい。
５．３．１．外因性ドナー核酸における上流および下流ライブラリー配列
[00112] ある特定の実施形態において、外因性ドナー核酸（ES）は、上流ライブラリー配列（UL）と下流ライブラリー配列（DL）との間に位置する目的の核酸（D）を含み、（UL）および（DL）は、宿主細胞のゲノム中の１つまたは複数のランディングパッドで宿主細胞媒介相同組換えを開始させることが可能である。ある特定の実施形態において、外因性ドナー核酸のライブラリーに関して、それらの上流ライブラリー配列（UL）は、同一または実質的に同一であり、それらの下流ライブラリー配列（DL）は、同一または実質的に同一である。相同組換えによって外因性ドナー核酸をゲノムに組み込むために、外因性ドナーポリヌクレオチドは、一般的に、一方の末端に（UL）および他方の末端に（DL）を含む。一部の実施形態において、（UL）は、宿主細胞のゲノム中に組み込まれた１つまたは複数のランディングパッドの５’領域、例えば、上流ランディングパッド相同配列（ULP）に相同である。ある特定の実施形態において、（DL）は、１つまたは複数のランディングパッドの３’領域、例えば下流ランディングパッド相同配列（DLP）に相同である。一部の実施形態において、（UL）は、１つまたは複数のランディングパッドの５’領域、例えば、（ULP）に約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％相同または同一なヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態において、（DL）は、１つまたは複数のランディングパッドの３’領域、例えば、（DLP）に約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％相同または同一なヌクレオチド配列を含む。
[00113] ある特定の実施形態において、（UL）は、目的の核酸（D）の５’に位置する。一部の実施形態において、（UL）は、（D）の５’末端に直接隣接して位置する。一部の実施形態において、（UL）は、（D）の５’の上流に位置する。ある特定の実施形態において、（DL）は、目的の核酸（D）の３’に位置する。一部の実施形態において、（DL）は、（D）の３’末端に直接隣接して位置する。一部の実施形態において、（DL）は、（D）の３’の下流に位置する。
[00114] 典型的には、ランディングパッドにおける外因性ドナーポリヌクレオチドの組込みに影響を与える可能性がある特性としては、これらに限定されないが、ゲノム組込みに使用される上流および下流ライブラリー配列の長さ、外因性ドナー核酸コンストラクトの全体の長さ、およびランディングパッドのゲノム組込み遺伝子座のヌクレオチド配列または配置が挙げられる。例えば、ライブラリー配列の１つの鎖と、宿主細胞のゲノム中の特定のランディングパッド相同配列の１つの鎖との間での有効なヘテロ二重鎖形成は、ランディングパッド相同配列に関して、外因性ドナー核酸の上流および下流ライブラリー配列の長さに依存する可能性がある。ゲノム組込み配列として使用されるライブラリー配列の長さの有効な範囲は、一般的に２０〜５，０００ヌクレオチド、典型的には２５〜５，０００ヌクレオチド、より典型的には５０〜５，０００ヌクレオチドである。ゲノム組込み配列とゲノム遺伝子座との間の相同性の有効な長さの議論については、Hasty et al., Mol Cell Biol 11:5586-91 (1991)を参照されたい。
[00115] ある特定の実施形態において、（UL）および（DL）は、適合性を有するランディングパッド相同配列と共にいずれのランディングパッドでの外因性核酸（ES）のゲノム組込みを可能にする十分な長さおよび配列同一性を有するあらゆるヌクレオチド配列を含んでいてもよい。ある特定の実施形態において、（UL）および（DL）の各々は、独立して、約２０〜５，０００ヌクレオチドからなる。ある特定の実施形態において、（UL）および（DL）の各々は、独立して、約１００〜２，５００ヌクレオチドからなる。ある特定の実施形態において、（UL）および（DL）の各々は、独立して、約１００〜１，０００ヌクレオチドからなる。ある特定の実施形態において、（UL）および（DL）の各々は、独立して、約２５０〜７５０ヌクレオチドからなる。ある特定の実施形態において、（UL）および（DL）の各々は、独立して、約１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、１１００、１２００、１３００、１４００、１５００、１６００、１７００、１８００、１９００、２０００、２１００、２２００、２３００、２４００、２５００、２６００、２７００、２８００、２９００、３０００、３１００、３２００、３３００、３４００、３５００、３６００、３７００、３８００、３９００、４０００、４１００、４２００、４３００、４４００、４５００、４６００、４７００、４８００、４９００または５，０００ヌクレオチドからなる。一部の実施形態において、（UL）および（DL）の各々は、独立して、約５００ヌクレオチドからなる。
[00116] ある特定の実施形態において、１つまたは複数の外因性ドナー核酸における（UL）のヌクレオチド配列は、互いに実質的に同一である。ある特定の実施形態において、１つまたは複数の外因性ドナー核酸における（DL）のヌクレオチド配列は、互いに実質的に同一である。例えば、１つまたは複数の外因性ドナー核酸における全ての（UL）は、互いに少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるヌクレオチド配列を含み、１つまたは複数の外因性ドナー核酸における全ての（DL）は、互いに少なくとも７０％、７５％，８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態において、１つまたは複数の外因性ドナー核酸における全ての（DL）のヌクレオチド配列は、互いに同一であり、１つまたは複数の外因性ドナー核酸における全ての（DL）のヌクレオチド配列は、互いに同一である。
５．３．２．目的の核酸
[00117] 一部の実施形態において、外因性ドナー核酸は、目的の核酸（D）をさらに含む。目的の核酸は、当業者によって有用とみなされているあらゆるＤＮＡセグメントであり得る。例えば、ＤＮＡセグメントは、宿主ゲノムに「ノックイン」可能な目的の遺伝子を含んでいてもよい。他の実施形態において、ＤＮＡセグメントは、宿主細胞のゲノムの標的部位へのコンストラクトの組込み時に標的遺伝子を特異的に崩壊させることにより、崩壊した遺伝子を機能できなくすることが可能な「ノックアウト」コンストラクトとして機能する。目的の核酸（D）の有用な例としては、これらに限定されないが、タンパク質コード配列、レポーター遺伝子、蛍光マーカーコード配列、プロモーター、エンハンサー、ターミネーター、転写活性化因子、転写リプレッサー、転写活性化因子結合部位、転写リプレッサー結合部位、イントロン、エクソン、ポリＡテール、多重クローニング部位、核局在化シグナル、ｍＲＮＡ安定化シグナル、組込み遺伝子座、エピトープタグコード配列、分解シグナル、スペーサーもしくはスタッファー(stuffer)配列（例えば、公知の機能がないランダムに生成した配列）、リンカー配列、デグロン配列、融合パートナー配列、他のあらゆる天然に存在するもしくは合成ＤＮＡ分子、またはそれらの組合せもしくは部分的組合せが挙げられる。一部の実施形態において、（D）は、天然の起点に由来するものでもよい。代替として、（D）は、完全にインビトロで生産された合成の起点に由来するものでもよい。
[00118] さらに、（D）は、単離された天然に存在するＤＮＡ分子の任意の組合せ、または単離された天然に存在するＤＮＡ分子と合成ＤＮＡ分子との任意の組合せを含んでいてもよい。例えば、（D）は、タンパク質コード配列に作動可能に連結した異種プロモーター、ポリＡテールに連結されたタンパク質コード配列、フレーム内でエピトープタグコード配列と連結されたタンパク質コード配列などを含んでいてもよい。目的の核酸（D）は、クローニングされたＤＮＡ（例えば、ＤＮＡ「ライブラリー」）から当業界において公知の標準的手順により得てもよいし、化学合成により得てもよいし、ｃＤＮＡクローニングにより得てもよいし、または望ましい細胞から精製されたゲノムＤＮＡもしくはその断片のクローニングにより得てもよいし、またはＰＣＲ増幅およびクローニングにより得てもよい。例えば、Sambrook et al.,Molecular Cloning,A Laboratory Manual,3d.ed.,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,New York(2001);Glover,D.M.(ed.),DNA Cloning:A Practical Approach,2d.ed.,MRL Press,Ltd.,Oxford,U.K.(1995)を参照されたい。
[00119] 特定の実施形態において、目的の核酸（D）は、選択可能マーカーをコードする核酸を含まない。これらの実施形態において、本明細書に記載される方法によってもたらされる組込みの高い効率は、選択培地で形質転換した細胞を増殖させる必要なく組込み事象のスクリーニングおよび同定を可能にする。しかしながら、それにもかかわらず選択培地での増殖が望ましい他の実施形態において、目的の核酸（D）は、宿主ゲノムへの外因性核酸の組込みを選択するのに使用できる選択可能マーカーを含んでいてもよい。
[00120] 多種多様の選択可能マーカーが当業界において公知である
（例えば、Kaufinan, Meth. Enzymol. 185:487 (1990); Kaufman, Meth. Enzymol., 185:537 (1990); Srivastava and Schlessinger, Gene, 103:53 (1991); Romanos et al., in DNA Cloning 2: Expression Systems, 2nd Edition, pages 123-167 (IRL Press 1995); Markie, Methods Mol. Biol., 54:359 (1996); Pfeifer et al., Gene, 188:183 (1997); Tucker and Burke, Gene, 199:25 (1997); Hashida-Okado et al., FEBS Letters, 425:117 (1998)を参照）。一部の実施形態において、選択可能マーカーは、薬物耐性マーカーである。薬物耐性マーカーは、そうでなければ細胞を殺していたと予想される外因性薬物を細胞が無毒化することを可能にする。薬物耐性マーカーの説明に役立つ例としては、これらに限定されないが、例えばアンピシリン、テトラサイクリン、カナマイシン、ブレオマイシン、ストレプトマイシン、ハイグロマイシン、ネオマイシン、Ｚｅｏｃｉｎ（商標）などの抗生物質に対する耐性を付与するものが挙げられる。他の実施形態において、選択可能マーカーは、栄養要求性マーカーである。栄養要求性マーカーは、必須成分が欠如した培地中で増殖しながら、細胞が必須成分（通常はアミノ酸）を合成することを可能にする。選択可能な栄養要求性遺伝子配列としては、例えば、ｈｉｓＤが挙げられ、これは、ヒスチジノールの存在下でのヒスチジン非含有培地中における増殖を可能にするものである。他の選択可能マーカーとしては、ブレオマイシン耐性遺伝子、メタロチオネイン遺伝子、ハイグロマイシンＢ−ホスホトランスフェラーゼ遺伝子、ＡＵＲＩ遺伝子、アデノシンデアミナーゼ遺伝子、アミノグリコシドホスホトランスフェラーゼ遺伝子、ジヒドロ葉酸レダクターゼ遺伝子、チミジンキナーゼ遺伝子、キサンチン−グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ遺伝子などが挙げられる。他の実施形態において、選択可能マーカーは、栄養要求性突然変異をレスキューするもの以外のマーカーである。例えば、宿主細胞株は、突然変異を公知の選択方法によって同定できる限りは、栄養要求性突然変異以外の突然変異、例えば、宿主にとって致死性ではない突然変異や、株の意図した使用、例えば工業的発酵に対して有害作用も引き起こさない突然変異を含んでいてもよい。
[00121] 染色体に組み込まれたポリヌクレオチドを含む宿主細胞形質転換株はまた、個々のＤＮＡセグメント（例えば、コンポーネントポリヌクレオチド）またはＤＮＡセグメントの組合せによってコードされた他の特色、例えば発光するペプチドの発現を呈する宿主細胞形質転換株を選択することによって、または個々の宿主細胞コロニーの分子分析によって、例えば、単離された組み立てられたポリヌクレオチドまたは染色体の組込み部位の制限酵素マッピング、ＰＣＲ増幅、または配列分析によって同定することもできる。ある特定の実施形態において、各外因性ドナー核酸に関連付けられたバーコード配列は、個々のＤＮＡセグメントまたは宿主細胞のゲノム中に組み込まれたＤＮＡセグメントの組合せを同定するのに使用することができる。
５．３．３．コンポーネントポリヌクレオチドおよびそのランディングパッドでの組込み
[00122] ほとんどのラージスケールの宿主細胞の操作は、既存のＤＮＡパーツの使用および再使用を伴う。ある特定の実施形態において、外因性ドナー核酸は、組み立てられたポリヌクレオチドの様々な組合せを生成するためのモジュラーパーツとして共に形質転換することができるＤＮＡパーツ（コンポーネントポリヌクレオチドとも称される）である。組み立てられたポリヌクレオチドの様々な組合せが、ランディングパッド中に組み込まれると、それらは、ランディングパッド中の組込みのために５’および３’領域の両方に相同配列を有する単一の断片のポリヌクレオチドと比較して、操作された宿主細胞においてより大きい分子多様性をもたらす。分子多様性が大きければ大きいほど、操作された宿主細胞が呈する表現型をより多様にすることができる。このような結果は、以下のさらなる詳細に記載される図１０で実証される。さらに、コンポーネントポリヌクレオチドは、インビボでコンビナトリアル的に組み立てられ、宿主細胞のゲノムにコンビナトリアル的に組み込まれることから、モジュラーパーツとしてのコンポーネントポリヌクレオチドの使用は、宿主細胞の生成において時間とコストを節約することができる。また、コンポーネントポリヌクレオチドは、宿主細胞が、適合性を有する相同配列を有するランディングパッドを含む場合、異なる宿主細胞のバックグラウンドまたは異なるゲノム遺伝子座での組込みのために再カスタマイズする必要もない。
[00123] したがって、相同組換えを介してインビボで組み立てて、組み立てられたコンポーネントポリヌクレオチドを生成することができるコンポーネントポリヌクレオチドが本明細書で提供される。ある特定の実施形態において、２つのコンポーネントポリヌクレオチド、すなわち第１のコンポーネントポリヌクレオチドおよび最後のコンポーネントポリヌクレオチドは、インビボで宿主細胞において相同組換えされて、宿主細胞のゲノム中のランディングパッドのいずれかに組み込まれる。この実施形態において、１つまたは複数の第１のコンポーネントポリヌクレオチドの各々は、５’から３’方向に、上流ランディングパッド相同配列（ULP）と相同組換えが可能な上流ライブラリー配列（UL）；第１の目的の核酸、および第１のリンカー配列を含む。１つまたは複数の最後のコンポーネントポリヌクレオチドの各々は、５’から３’方向に、最後のリンカー配列、最後の目的の核酸、および下流ランディングパッド相同配列（DLP）と相同組換えが可能な下流ライブラリー配列（DL）を含む。１つまたは複数の第１のコンポーネントポリヌクレオチドの３’末端における各第１のリンカー配列は、１つまたは複数の最後のコンポーネントポリヌクレオチドの５’末端で各最後のリンカー配列と相同組換えが可能であり、コンポーネントポリヌクレオチドの様々な組合せを生成することができる。ランディングパッド内で部位特異的ヌクレアーゼによって二本鎖破断が誘導されると、内因性相同組換え機構は、ランディングパッド中の切断された部位で組み立てられたコンポーネントポリヌクレオチドを高い組込み効率で組み込む。図１Ｅの中央に、２つのコンポーネントポリヌクレオチドの例を例示する。
[00124] ある特定の実施形態において、３つ以上の異なるタイプのコンポーネントポリヌクレオチド（例えば、第１のコンポーネントポリヌクレオチド、中間コンポーネントポリヌクレオチド、および最後のコンポーネントポリヌクレオチド）は、宿主細胞に共に形質転換される。この実施形態において、１つまたは複数の第１のコンポーネントポリヌクレオチドの各々は、５’から３’方向に、上流ランディングパッド相同配列（ULP）と相同組換えが可能な上流ライブラリー配列（UL）、Ｄ０群から選択される任意のＤＮＡセグメント、リンカー配列ＬＢ０を含む。１つまたは複数の中間コンポーネントポリヌクレオチドの各々は、５’から３’方向に、第１のリンカー配列ＬＡｎ、Ｄｎ群から選択される任意のＤＮＡセグメント、第２のリンカー配列ＬＢｎを含む。この実施形態において、ｎは、１から中間コンポーネントポリヌクレオチドの数までの整数を表す。１つまたは複数の最後のコンポーネントポリヌクレオチドの各々は、５’から３’方向に、リンカー配列ＬＡｍ、Ｄｍ群から選択される任意のＤＮＡセグメント、および下流ランディングパッド相同配列（DLP）と相同組換えが可能な下流ライブラリー配列（DL）を含む。この実施形態において、各リンカー配列ＬＢ（ｐ−１）は、リンカー配列ＬＡｐと相同組換えが可能であり、ｎは、１〜（ｍ−１）までの様々な整数であり、ｐは、１〜ｍの整数を表し、各Ｄ０群、・・・Ｄｎ群、・・・Ｄｍ群、は、独立して、１つまたは複数のＤＮＡセグメントからなる。
[00125] ある特定の実施形態において、ＤＮＡセグメント（D0群、Dn群、またはDm群における）は、あらゆる目的の核酸であり得る。例えば、セクション５．２．２に記載されるあらゆる目的の核酸は、コンポーネントポリヌクレオチド中にＤＮＡセグメントとして取り込むことができる。
[00126] ある特定の実施形態において、３つのコンポーネントポリヌクレオチドを組み立てて、ランディングパッドに組み込むことができる。３つのコンポーネントポリヌクレオチド（第１のコンポーネントポリヌクレオチド、中間コンポーネントポリヌクレオチド、および最後のコンポーネントポリヌクレオチド）の例は、図１Ｅの一番下に例示される。
[00127] ある特定の実施形態において、インビボでコンポーネントポリヌクレオチドを互いに相同組換えするリンカー配列は、そのカウンターパートのリンカー配列への相同組換えを可能にする十分な長さおよび配列同一性を有するあらゆるヌクレオチド配列を含んでいてもよい。ある特定の実施形態において、各リンカー配列は、約２０〜５，０００ヌクレオチドからなる。ある特定の実施形態において、各リンカー配列は約２４〜２，５００ヌクレオチドからなる。ある特定の実施形態において、各リンカー配列は、約２４〜１，０００ヌクレオチドからなる。ある特定の実施形態において、各リンカー配列は約２４〜５００ヌクレオチドからなる。ある特定の実施形態において、各リンカー配列は、約２４〜約１００ヌクレオチドからなる。ある特定の実施形態において、短いリンカー配列（例えば、約２４〜約３６ヌクレオチド）は、それらが２つのコンポーネントポリヌクレオチドを近接させる必要があるＤＮＡセグメント（例えば、プロモーターおよびオープンリーディングフレーム）と共に組み立てるのに使用される場合、使用される。例えば、プロモーターをオープンリーディングフレームに接続するのに使用される図１Ｅに示されるリンカー配列「Ａ」は、比較的短い配列（例えば、約２４〜約３６ヌクレオチド）であり得る。一方で、２つのオープンリーディングフレームを組み立てるのに使用される図２Ｃに示されるリンカー配列「ＳＮＡＰ」は、比較的長い配列（例えば、５００〜５０００ヌクレオチド）であり得る。
[00128] ある特定の実施形態において、インビボでコンポーネントポリヌクレオチドを相同組換えする２つのリンカー配列は、互いに約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％相同または同一なヌクレオチド配列を含んでいてもよい。例えば、第１のコンポーネントポリヌクレオチドおよび最後のコンポーネントポリヌクレオチドがインビボで組み立てられ、ランディングパッドへの組込みを起こす場合、第１のコンポーネントポリヌクレオチドの３’末端における第１のリンカー配列および最後のコンポーネントポリヌクレオチドの５’末端における最後のリンカー配列は、互いに約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％相同であるかまたは同一であるヌクレオチド配列を含む。１つまたは複数の中間コンポーネントポリヌクレオチドが、１つまたは複数の第１のコンポーネントポリヌクレオチドおよび１つまたは複数の最後のコンポーネントポリヌクレオチドと共に導入される場合、リンカー配列ＬＢ（ｐ−１）およびリンカーＬＡｐは、互いに約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％相同であるかまたは同一であるヌクレオチド配列を含む。
[00129] 好適なコンポーネントポリヌクレオチドおよびコンポーネントポリヌクレオチドに関する他の特徴は、その全体が参照により本明細書に組み入れられる米国特許第８，１１０，３６０号でさらに詳細に説明されている。
５．３．４．追加の機能的なエレメント：バーコード配列および追加のヌクレアーゼ標的配列
[00130] 本明細書で提供される外因性ドナー核酸は、追加の機能的なエレメントを含んでいてもよい。ある特定の実施形態において、追加の機能的なエレメントは、宿主細胞のゲノム中の外因性ランディングパッド中に存在するものとは異なるヌクレアーゼ標的配列を包含していてもよい。例えば、図３Ａで示されるように、第１のコンポーネントポリヌクレオチドは、上流ライブラリー配列（UL）と第１のリンカー配列（「A」）との間に位置するプロモーター（曲がった矢印として示される）を含む。図３Ａに示される第１のコンポーネントポリヌクレオチドは、宿主細胞のゲノム中のランディングパッド内の標的ヌクレアーゼ配列「Ｘ」（図３Ｃに示される）とは異なる、ヌクレアーゼＹ−カッターによって結合できるヌクレアーゼ標的配列「Ｙ」をさらに含む。図３Ｂに示される最後のコンポーネントポリヌクレオチドは、最後のリンカー配列（「A」）と下流ライブラリー配列（DL）との間に位置するオープンリーディングフレーム（ORF）を含む。最後のコンポーネントポリヌクレオチドは、宿主細胞のゲノム中のランディングパッド内の標的ヌクレアーゼ配列「Ｘ」とは異なる、ヌクレアーゼＺ−カッターによって結合できるヌクレアーゼ標的配列「Ｚ」をさらに含む。コンポーネントポリヌクレオチドがランディングパッドに組換えおよび組込みを起こすと、これらの追加のヌクレアーゼ標的配列（例えば、ＹおよびＺ部位）は、後続の形質転換中に宿主細胞のゲノム中に追加の外因性ドナー核酸をさらに導入するために、後で利用することができる。
[00131] ある特定の実施形態において、公知の配列の固有なバーコードは、各外因性ドナー核酸に関連付けられている。バーコード配列は、宿主細胞のゲノム中のランディングパッド内に組み込まれる外因性ドナー核酸の同定をさらに容易にするために使用することができる。一般的に、バーコード配列は、宿主細胞のゲノム中のランディングパッド中に組み込まれた外因性ドナー核酸またはコンポーネントポリヌクレオチドの同定が可能になるように十分な長さを有し、互いに十分に異なっている。ある特定の実施形態において、各バーコード配列は、少なくとも４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、またはそれより多くのヌクレオチド長を有していてもよい。一実施形態において、バーコード配列は、７ヌクレオチド長を有していてもよい。
[00132] バーコード配列は、各外因性ドナー核酸またはコンポーネントポリヌクレオチド中のあらゆる好適な配置に取り込むことができる。コンポーネントポリヌクレオチド中のバーコード配列の例示的な配置は、図３Ａおよび３Ｂにおいて一連の水平のバーライン（「NNNNNNNの7ntバーコード」とも表記される）として示される。ある特定の実施形態において、第１のコンポーネントポリヌクレオチドは、上流ライブラリー配列（UL）と目的の核酸（例えば、曲がった矢印として示されるプロモーター）との間に位置するバーコード配列を含んでいてもよい。ある特定の実施形態において、最後のコンポーネントポリヌクレオチドは、下流ライブラリー配列（DL）と目的の核酸（例えば、ORF）との間に位置するバーコード配列を含んでいてもよい。特定の実施形態において、バーコード配列は、上流ライブラリー配列（UL）と追加の機能的なエレメント、例えばヌクレアーゼ標的配列（例えば、Ｙ−カッター部位）との間に挿入することができる。ある特定の実施形態において、ヌクレアーゼ標的配列（例えば、Ｙ−カッター部位）は、所与のライブラリーにおいて、全ての第１のコンポーネントポリヌクレオチドに共通である。特定の実施形態において、バーコード配列は、下流ライブラリー配列と追加のエレメント、例えばヌクレアーゼ標的配列（例えば、Ｚ−カッター部位）との間に挿入することができる。ある特定の実施形態において、ヌクレアーゼ標的配列（例えば、Ｚ−カッター部位）は、所与のライブラリーにおいて、全ての最後のコンポーネントポリヌクレオチドに共通である。「Ｙ」および「Ｚ」ヌクレアーゼ標的配列を外因性ドナー核酸に組み込むことによって、それらは、バーコード増幅のための共通のプライマー結合部位として役立たせることができ、さらに追加のラウンドまたは切断およびヌクレオチド組込みを可能にする。図３Ｃに示される実施形態において、ｉＡＬＧ１遺伝子座でランディングパッド中に組み込まれた第１のコンポーネントポリヌクレオチドのアイデンティティは、一対の以下の標準プライマー：ｉＡＬＧ１のゲノム配列に結合する「ＵＬ」と表記される（ULP）の５’の上流に位置するプライマー、および「Ｙ」ヌクレアーゼ標的配列に結合するプライマーＰＹを使用することによって決定することができる。ｉＡＬＧ１遺伝子座におけるランディングパッドにおいて組み込まれた最後のコンポーネントポリヌクレオチドのアイデンティティは、一対の以下の標準プライマー：「Ｚ」ヌクレアーゼ標的配列に結合するプライマーＰＺ、および「ＤＬ」と表記される（DLP）の３’の下流に位置するｉＡＬＧ１のゲノム配列に結合するプライマーを使用することによって決定することができる。
５．４ 外因性ドナー核酸のゲノム組込みの方法
[00133] 宿主細胞のゲノム中において操作により作製された１つまたは複数のランディングパッドに１つまたは複数の外因性ドナー核酸をゲノム組込みのための方法が本明細書で提供される。上述したように、ある特定の実施形態において、宿主細胞のゲノムに組み込まれた各ランディングパッドは、外因性ドナー核酸の宿主細胞媒介相同組換えを容易にするために、標準化された相同配列を含む。このような実施形態において、標準化されたランディングパッド相同配列は、外因性ドナー核酸それ自体が、ランディングパッド相同配列に適合性を有する相同配列を含む限り、あらゆる外因性ドナー核酸の、宿主細胞のゲノム中のあらゆるランディングパッドでの組込みを可能にする。それゆえに、ある特定の実施形態において、外因性ドナー核酸の組込み事象は、ランディングパッド周辺のゲノム遺伝子座から独立しており、組換えのために内因性ゲノム配列との相同性を頼らない。特定の実施形態において、本方法は、宿主細胞を、１つまたは複数の外因性ドナー核酸、およびランディングパッド中に配置されたヌクレアーゼ標的配列を切断することが可能な１つまたは複数のヌクレアーゼと接触させる工程を含む。ランディングパッド内での切断は、切断部位で、またはその近くで相同組換えの頻度を大きく増加させる。
５．４．１．ランディングパッドにおける外因性ドナー核酸の組込み
[00134] 図１Ａ〜１Ｃは、部位特異的ヌクレアーゼを使用した単一のランディングパッドにおける外因性ドナー核酸のライブラリーからの単一の外因性ドナー核酸のマーカーレスゲノム組込み方法の例示的な実施形態を例示する。外因性ドナー核酸は、宿主細胞に導入され、ここで外因性ドナー核酸は、上流ライブラリー配列（UL）と下流ライブラリー配列（DL）と端部に有する目的の核酸を含む（例えば、プロモーターに作動可能に連結したORF）。図１Ａ〜１Ｃに示される実施形態において、外因性ドナー核酸の（UL）および（DL）は、それぞれランディングパッドの上流ランディングパッド相同配列（ULP）および下流ランディングパッド相同配列（DLP）と配列同一性を共有する。図１Ｂに示される実施形態において、図１Ａに示されるランディングパッド中に組込みを起こすことができる４つの異なる外因性ドナー核酸がある。部位特異的ヌクレアーゼ（一丁のはさみとして示される）は、ランディングパッド中のヌクレアーゼ標的配列（NTS、「X」として示される）を認識し切断する。部位特異的ヌクレアーゼによってヌクレアーゼ標的配列内の二本鎖破断が誘導されると、内因性相同組換え機構は、切断された部位で目的の核酸を組み込む。図１Ｃで示されるように、宿主細胞のゲノムに一旦組み込まれたら、目的の核酸は、上流および下流ランディングパッド相同配列（図１Ｃに示されるULおよびDL）の間に配置され、ニュートラルなゲノム遺伝子座（例えば、酵母ゲノム中のＡＬＧ１遺伝子座下流の遺伝子間領域）に入れ子になっている。図１Ａ〜１Ｃで例示されているように、外因性ドナー核酸のゲノム組込み事象は、相同組換えのために内因性ゲノム配列を頼らない。図１Ｄ〜１Ｆは、ランディングパッド中の組込みに好適な、ランディングパッドおよび外因性ドナー核酸およびコンポーネントポリヌクレオチドの代替の実施形態を例示する。
[00135] 図１Ａ〜１Ｆで例示された実施形態において、内因性相同組換え機構は、二本鎖破断を含まないゲノム部位と比較してより高い頻度で、切断された部位に目的の核酸を組み込む。この組込み頻度の増加は、組換え事象を受けた形質転換株を選択するために選択可能マーカーを共に組み込む必要性を取り除く。例えば操作された微生物の構築中の選択可能マーカーへの必要性をなくすことによって、完全で機能的な生合成経路を含む株を構築するのに必要な時間は大幅に少なくなる。加えて、所与の宿主生物にとって利用可能なマーカーの蓄えが限定されているために選択可能マーカーを再利用する必要性があることにより、操作戦略がもはや制限されることはない。
[00136] 一部の実施形態において、うまく組み込まれた外因性核酸を含む形質転換した細胞のマーカーレス回収は、１０００、９００、８００、７００、６００、５００、４００、３００、２００または１００個のスクリーニングされた接触させた宿主細胞またはそれらのクローン集団毎に約１の頻度内で起こる。特定の実施形態において、うまく組み込まれた外因性核酸を含む形質転換した細胞のマーカーレス回収は、９０、８０、７０、６０、５０、４０、３０、２０または１０個のスクリーニングされた接触させた宿主細胞またはそれらのクローン集団毎に約１の頻度内で起こる。より特定の実施形態において、うまく組み込まれた外因性核酸を含む形質転換した細胞のマーカーレス回収は、９、８、７、６、５、４、３または２個のスクリーニングされた接触させた宿主細胞またはそれらのクローン集団毎に約１の頻度内で起こる。ある特定の実施形態において、宿主細胞のゲノム中に操作により作製された全てのランディングパッド（例えば、３つのランディングパッド）への外因性ドナー核酸組込みの成功率は、９０％より大きい。ある特定の実施形態において、宿主細胞のゲノム中に操作により作製された全てのランディングパッド（例えば、３つのランディングパッド）への外因性ドナー核酸組込みの成功率は、９５％より大きい。より特定の実施形態において、宿主細胞は、酵母細胞であり、他の宿主細胞型に比べて酵母の相同組換え能力が増加したことに起因して、組込み頻度が増加している。
[00137] 選択可能マーカーを使用せずに外因性ドナー核酸がランディングパッド中に組み込まれた細胞を同定するための様々な方法が利用可能である。一部の実施形態において、このような方法は、ランディングパッド中のあらゆる変化を検出しようとするものであり、これらに限定されないが、ＰＣＲ方法、シーケンシング方法、ヌクレアーゼ消化、例えば、制限マッピング、サザンブロット、およびそれらの任意の組合せが挙げられる。ある特定の実施形態において、外因性ドナー核酸に関連付けられたバーコード配列は、ランディングパッドにおいて組み込まれた外因性ドナー核酸のアイデンティティを決定するのに使用することができる。ランディングパッド中の外因性ドナー核酸（またはコンポーネントポリヌクレオチド）のゲノム組込みの成功率は高いことから、形質転換宿主細胞の表現型は、宿主細胞遺伝子型解析せずに目的の外因性ドナー核酸を有する細胞を同定するのに使用することができる。
[00138] 特定の実施形態において、宿主細胞のゲノムの複数の外因性ランディングパッド中に外因性核酸を同時にゲノム組込みのための方法が本明細書で提供される。本方法は、
（ａ）宿主細胞のゲノム中に組み込まれた複数の（x）外因性ランディングパッドを含む宿主細胞であって、各外因性ランディングパッドは、上流ランディングパッド相同配列（ULP）と下流ランディングパッド相同配列（DLP）との間に位置するヌクレアーゼ標的配列（NTS）を含む、宿主細胞を、
（ｉ）１つまたは複数の外因性ドナー核酸（ES）であって、各（ES）は、上流ライブラリー配列（UL）と下流ライブラリー配列（DL）との間に位置する目的の核酸（D）を含み、各（UL）は、（x）外因性ランディングパッドのいずれかの任意の（ULP）で相同組換えが可能であり、各（DL）は、（x）外因性ランディングパッドのいずれかの任意の（DLP）で相同組換えが可能である、外因性ドナー核酸（ES）；および
（ｉｉ）複数の（x）外因性ランディングパッドのいずれかの（NTS）に結合し、（x）外因性ランディングパッド内の部位を切断することが可能な、１つまたは複数のヌクレアーゼ（N）
と接触させる工程；および
（ｂ）接触させた宿主細胞から生成した宿主細胞を回収する工程
を含み、
外因性ドナー核酸（ES）のいずれかは、各ランディングパッド周辺のゲノム配列から独立して、複数の（x）外因性ランディングパッドのいずれかにおいて組み込まれる。ある特定の実施形態において、ｘは、少なくとも２の整数である。ある特定の実施形態において、ｘは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９または２０の整数である。
[00139] 図２Ａおよび図２Ｂは、複数のランディングパッドへの複数の外因性ドナー核酸の同時のゲノム組込みの例示的な実施形態を例示する。上述したように、図２Ａは、ゲノム遺伝子座ＡＬＧ１、ＭＧＡ１、およびＹＣＴ１下流の遺伝子間領域に３つのランディングパッドを含む例示的な宿主細胞を例示する。この実施形態において、各ランディングパッドは、上流ランディングパッド相同配列（ULP）と下流ランディングパッド相同配列（DLP）との間に位置する、ヌクレアーゼＸ−カッター（例えば、CphI）によって切断できる「Ｘ」として示されるヌクレアーゼ標的配列（NTS）を含む。図２Ａに示される実施形態において、全ての３つのランディングパッドは、（ULP）に関して同じヌクレオチド配列「ＵＬ」、（DLP）に関して同じヌクレオチド配列「ＤＬ」、および同じヌクレアーゼ標的配列Ｘを有する。それゆえに、図２Ａに示される例示的な実施形態において、全ての３つのランディングパッドは、ランディングパッドのいずれかへの組込みのために適合性を有する相同配列を含むあらゆる外因性ドナー核酸を組み込むように標準化されている。
[00140] 図２Ｂは、ランディングパッド相同配列との宿主細胞媒介相同組換えに適合性を有する相同配列（ライブラリー配列と称される）を含む外因性ドナー核酸のライブラリーを例示する。図２Ｂで例示された実施形態において、各外因性ドナー核酸は、プロモーター（ORF上流の曲がった矢印として示される）に作動可能に連結した遺伝子またはオープンリーディングフレーム（「ORF」）である目的の核酸を含む。図２Ｂにおいて、各目的の核酸（D）は、上流ライブラリー配列（図２Ｂでは「ＵＬ」と表記される）と下流ライブラリー配列（図２Ｂでは「ＤＬ」と表記される）との間に位置する。宿主細胞に導入されると、宿主細胞媒介相同組換えを介して、外因性ドナー核酸の各上流ライブラリー配列（UL）は、あらゆる上流ランディングパッド相同配列（ULP）で相同組換えが可能であり、外因性ドナー核酸の各下流ライブラリー配列（DL）は、あらゆる下流ランディングパッド相同配列（DLP）で相同組換えが可能である。
[00141] 一部の実施形態において、図２Ｂに示される２つ以上の異なるタイプの外因性ドナー核酸は、外因性ドナー核酸の異なる組合せを宿主細胞のゲノム中のランディングパッドに組み込むことができるように、宿主細胞と接触させることができる。一部の実施形態において、異なるタイプの外因性ドナー核酸のモル比は、各タイプの外因性ドナー核酸の組込み率に互いに相対的に影響を与えるように変更することができる。他の実施形態において、同じ外因性ドナー核酸の複数のコピーが宿主細胞のゲノム中の標準化されたランディングパッドにおいて組み込むことができるように、単一タイプの外因性ドナー核酸を宿主細胞に導入することができる。
[00142] 一部の実施形態において、外因性ドナー核酸は、「スタッファー」または「スペーサー」配列（例えば、ランダムに生成した、機能しない配列）を含む別の外因性ドナー核酸と組み合わせて導入されてもよい。例えば、図４を参照されたい。スタッファー配列を含む外因性ドナー核酸を使用することによって、宿主細胞のゲノム中に組み込まれた他の機能的な核酸のコピー数を変更することができる。例えば、これらの２つのＤＮＡコンストラクトで形質転換した宿主細胞の一部は、３つのランディングパッド中に組み込まれた、ＯＲＦ１の単一のコピーおよびスペーサー配列の２つのコピーを包含していてもよいし、ＯＲＦ１の２つのコピーおよびスペーサー配列の１つのコピーを包含していてもよいし、ＯＲＦ１の３つのコピーおよび０個のスペーサー配列などを包含していてもよい。ある特定の実施形態において、ランディングパッド中に組み込まれた異なるコピー数の各タイプの外因性ドナー核酸を有する宿主細胞を生成するために、スタッファー配列を含む外因性ドナー核酸は、２つ以上の異なるタイプの外因性ドナー核酸と組み合わせて共に導入することができる。
[00143] 図２Ａおよび図２Ｂで例示された実施形態において、ヌクレアーゼＸ−カッター（例えば、CphI）も宿主細胞に導入され、ここでヌクレアーゼＸ−カッターは、その対応するヌクレアーゼ標的配列（NTS）内の固有な配列を認識し切断することが可能である。ヌクレアーゼＸ−カッターによってヌクレアーゼ標的配列（NTS）が切断されたら、内因性相同組換え機構は、二本鎖破断を含まないランディングパッドと比較してより高い頻度で、いずれかの３つの標準化されたランディングパッドに、外因性ドナー核酸（例えば、ＯＲＦ１、ＯＲＦ２、ＯＲＦ３、またはＯＲＦ４を含む）のいずれかを同時に組み込むことを容易にする。４つのオープンリーディングフレームのいずれかが３つのランディングパッドのいずれかにおいて組込みを起こすことができるため、本明細書で提供される方法は、ランディングパッド中に組み込まれたオープンリーディングフレームの様々な組合せを有する多様な宿主細胞の集団を生成する。
[00144] ある特定の実施形態において、宿主細胞と接触する異なるタイプの外因性核酸（ES）の数は、宿主細胞のゲノム中に存在するランディングパッド（x）の数によって限定されない。一実施形態において、宿主細胞に導入された異なるタイプの外因性ドナー核酸の数は、宿主細胞のゲノム中に存在するランディングパッド（x）の数を超えていてもよい。他の実施形態において、宿主に導入された異なるタイプの外因性ドナー核酸の数は、宿主細胞のゲノム中に存在するランディングパッド（x）の数未満であってもよい。
[00145] 図１Ａ〜図１Ｃで例示される単一のランディングパッドにおける単一の外因性核酸の組込みと同様に、複数の外因性ドナー核酸の同時の複数の組込みは、ランディングパッドを二本鎖破断を誘導することが可能なヌクレアーゼと接触させない場合と比較してより実質的に高い頻度で起こる。一部の実施形態において、この組込み頻度の増加は、複数の組換え事象を同定するために１つまたは複数の選択可能マーカーを共に組み込む必要性を取り除く。一部の実施形態において、複数のうまく組み込まれた外因性核酸を含む形質転換した細胞のマーカーレス回収は、１０００、９００、８００、７００、６００、５００、４００、３００、２００または１００個のスクリーニングされた接触させた宿主細胞またはそれらのクローン集団毎に約１の頻度内で起こる。特定の実施形態において、マーカーレス回収は、９０、８０、７０、６０、５０、４０、３０、２０または１０個のスクリーニングされた接触させた宿主細胞またはそれらのクローン集団毎に約１の頻度内で起こる。より特定の実施形態において、マーカーレス回収は、９、８、７、６、５、４、３または２個のスクリーニングされた接触させた宿主細胞またはそれらのクローン集団毎に約１の頻度内で起こる。ある特定の実施形態において、宿主細胞のゲノム中に操作により作製された全てのランディングパッド（例えば、３つのランディングパッド）への外因性ドナー核酸組込みの成功率は、９０％より大きい。ある特定の実施形態において、宿主細胞のゲノム中に操作により作製された全てのランディングパッド（例えば、３つのランディングパッド）への外因性ドナー核酸組込みの成功率は、９５％より大きい。より特定の実施形態において、宿主細胞は、酵母細胞であり、他の宿主細胞型に比べて酵母の相同組換え能力が増加したことに起因して、組込み頻度が増加している。
５．４．１．１ ランディングパッドにおけるコンポーネントポリヌクレオチドの組込み
[00146] 別の態様において、コンポーネントポリヌクレオチドである外因性ドナー核酸を組み込むための方法が本明細書で提供される。コンポーネントポリヌクレオチドは、宿主細胞に導入されると、互いに相同組換えして、１つまたは複数の組み立てられたコンポーネントポリヌクレオチドを生成する。これらの組み立てられたコンポーネントポリヌクレオチドは、その５’および３’末端に相同性領域を含み、それにより、宿主細胞のゲノム中のランディングパッドのいずれかでそれらが相同組換えおよび組込みを起こすことを可能にする。ある特定の実施形態において、各コンポーネントポリヌクレオチドは、少なくとも１つのリンカー配列を含み、それにより、インビボでリンカー配列を使用して各コンポーネントポリヌクレオチドを別のコンポーネントポリヌクレオチドと相同組換えすることを可能にする。ある特定の実施形態において、コンポーネントポリヌクレオチドは、単一の形質転換反応で、宿主細胞に共に導入される。
[00147] したがって、一態様において、宿主細胞のゲノム中の１つまたは複数のランディングパッド中にコンポーネントポリヌクレオチドをゲノムで組み込む(genomically integrating)方法が本明細書で提供される。一実施形態において、本方法は、
（ａ）宿主細胞のゲノム中に組み込まれた１つまたは複数の（x）外因性ランディングパッドを含む宿主細胞であって、各外因性ランディングパッドは、上流ランディングパッド相同配列（ULP）と下流ランディングパッド相同配列（DLP）との間に位置するヌクレアーゼ標的配列（NTS）を含む、宿主細胞を、
（ｉ）１つまたは複数の第１のコンポーネントポリヌクレオチドであって、各第１のコンポーネントポリヌクレオチドは、５’から３’方向に、
（１）上流ランディングパッド相同配列（ULP）と相同組換えが可能な上流ライブラリー配列（UL）；
（２）第１の目的の核酸、および
（３）第１のリンカー配列
を含む、第１のコンポーネントポリヌクレオチド；
（ｉｉ）１つまたは複数の最後のコンポーネントポリヌクレオチドであって、各最後のコンポーネントポリヌクレオチドは、５’から３’方向に、
（１）最後のリンカー配列、
（２）最後の目的の核酸、および
（３）下流ランディングパッド相同配列（DLP）と相同組換えが可能な下流ライブラリー配列（DL）
を含み、
１つまたは複数の第１のコンポーネントポリヌクレオチドの任意の第１のリンカー配列は、１つまたは複数の最後のコンポーネントポリヌクレオチドの任意の最後のリンカー配列と相同組換えが可能である、最後のコンポーネントポリヌクレオチド；および
（ｉｉｉ）１つまたは複数の（x）外因性ランディングパッドのいずれかにおいて任意の（NTS）を切断することが可能なヌクレアーゼ（N）
と接触させる工程；および
（ｂ）接触させた宿主細胞から生成した宿主細胞を回収する工程
を含み、
１つまたは複数の第１のコンポーネントポリヌクレオチドからの第１のコンポーネントポリヌクレオチドと、１つまたは複数の最後のコンポーネントポリヌクレオチドからの最後のコンポーネントポリヌクレオチドとの任意の組合せが、インビボでそれらのリンカー配列を介して相同組換えされ、該組合せが、各ランディングパッド周辺のゲノム配列から独立して、１つまたは複数の（x）外因性ランディングパッドのいずれかにおいて組み込まれる。一部の実施形態において、ｘは、少なくとも１の整数である。
[00148] この実施形態において、コンポーネントポリヌクレオチドが、１つまたは複数のランディングパッド中の上流ランディングパッド相同配列（ULP）に相同組換えおよび組込みを起こすように、その５’末端に相同性領域を含む場合、そのコンポーネントポリヌクレオチドは、第１のコンポーネントポリヌクレオチドと称される。同様に、コンポーネントポリヌクレオチドが、１つまたは複数のランディングパッド中の下流ランディングパッド相同配列（DLP）と相同組換えするように、その３’末端に相同性領域を含む場合、そのコンポーネントポリヌクレオチドは、最後のコンポーネントポリヌクレオチドと称される。
[00149] ある特定の実施形態において、宿主細胞のゲノム中に存在するランディングパッド（x）の数は、少なくとも２つであり、第１および最後のコンポーネントポリヌクレオチドの任意の組合せは、その数のランディングパッド（x）のいずれかにおいて組み込まれる。ある特定の実施形態において、宿主細胞のゲノム中に存在するランディングパッド（x）の数は、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９または２０である。ある特定の実施形態において、第１および最後のコンポーネントポリヌクレオチドの任意の組合せは、これらの複数の（x）ランディングパッドのいずれかにおいて組み込まれる。
[00150] 図２Ｃは、コンビナトリアル的に組み合わされて、宿主細胞のゲノム中に存在する３つのランディングパッドのいずれかにコンビナトリアル的に組み込むことができるコンポーネントポリヌクレオチドの例示的な実施形態を例示する。図２Ｃで示されるように、各々それ自体のプロモーターに作動可能に連結した２つのオープンリーディングフレームは、コンビナトリアル的に組み合わされて、図２Ａに示されるランディングパッドのいずれかに組み立てられたコンポーネントポリヌクレオチドを組み込む。図２Ｃにおいて、第１のコンポーネントポリヌクレオチドは、５’から３’方向に、上流ライブラリー配列（UL）、プロモーターに作動可能に連結したオープンリーディングフレームＯＲＦ１、および第１のリンカー配列「ＳＮＡＰ」を含む。第１のコンポーネントポリヌクレオチドの上流ライブラリー配列（UL）は、図２Ａに示される実施形態において上流ライブラリー配列（UL）と同じ配列を有する上流ランディングパッド相同配列（ULP）と相同組換えが可能である。最後のコンポーネントポリヌクレオチドは、５’から３’方向に、最後のリンカー配列ＳＮＡＰ、プロモーターに作動可能に連結したオープンリーディングフレーム、および下流ランディングパッド相同配列（DLP）と相同組換えが可能な下流ライブラリー配列ＤＬを含む。図２Ａに示される例示的な実施形態において、（DLP）は、下流ライブラリー配列（DL）と同じ配列を有する。第１のコンポーネントポリヌクレオチドの第１のリンカー配列（すなわち、図２ＣにおけるSNAP）は、インビボで最後のコンポーネントポリヌクレオチドの最後のリンカー配列（すなわち、図２ＣにおけるSNAP）と相同組換えが可能であり、組み立てられたコンポーネントポリヌクレオチドを生成することができる。相同組換えする場合、組み立てられたコンポーネントポリヌクレオチドは、各オープンリーディングフレームがそれ自体のプロモーター（「ロックドプロモーター」設計と称される）に作動可能に連結した複数のオープンリーディングフレームを生成する。第１のコンポーネントポリヌクレオチドにおける上流ライブラリー配列（UL）および最後のコンポーネントポリヌクレオチドにおける下流ライブラリー配列（DL）は、図２Ａに示される宿主細胞のゲノム中の３つのランディングパッドのいずれかにおける組み立てられたコンポーネントポリヌクレオチドの組込みを可能にする。組み立てられたコンポーネントポリヌクレオチドはいずれも、複数のランディングパッドのいずれかでコンビナトリアル的に組み込むことができる。
[00151] 図２Ｃに示されるコンポーネントポリヌクレオチドは、それ自体のプロモーターに作動可能に連結した各オープンリーディングフレームを例示するが、一部の実施形態において、プロモーターは、オープンリーディングフレームから分離されており、２つの異なるコンポーネントポリヌクレオチドとして宿主細胞に共に導入されてもよい。例えば、図２Ｃにおいて、（UL）およびＯＲＦ１を含むコンポーネントポリヌクレオチドは、２つの別個のコンポーネントポリヌクレオチド（リンカー配列Ａを有するプロモーターコンポーネントポリヌクレオチドおよびリンカー配列Ａを有するプロモーターレスＯＲＦ１）に分離していてもよいし、（DL）およびＯＲＦ２、ＯＲＦ３、またはＯＲＦ４を含むコンポーネントポリヌクレオチドは、同様に２つの別個のコンポーネントポリヌクレオチドに分離していてもよい。宿主細胞のゲノムにコンビナトリアル的に組み込むことができる追加のコンポーネントポリヌクレオチドで宿主細胞を形質転換することによって、株におけるより大きいコンビナトリアルな多様性をもたらすことができる。
[00152] 図２Ｄは、一緒に組み立てられて宿主細胞のゲノム中のランディングパッドに組み込まれるコンポーネントポリヌクレオチドの別の例示的な実施形態を例示する。図２Ｄに示される例示的な実施形態において、「スプリット−プロモーター」設計のコンポーネントポリヌクレオチドが例示され、第１のコンポーネントポリヌクレオチドは、様々なプロモーター強度を有する異なるプロモーターを含み、最後のコンポーネントポリヌクレオチドは、異なるオープンリーディングフレームを含む。より具体的には、第１のコンポーネントポリヌクレオチドは、５’から３’の方向で、宿主細胞のゲノム中のランディングパッド中の上流ランディング配列（ULP）と相同組換えが可能な上流ライブラリー配列（UL）、プロモーター；および「Ａ」で表される第１のリンカー配列を含む。最後のコンポーネントポリヌクレオチドは、５’から３’の方向で、「Ａ」で表される最後のリンカー配列、オープンリーディングフレーム（例えば、ＯＲＦ１、ＯＲＦ２、ＯＲＦ３、およびＯＲＦ４）、および宿主細胞のゲノム中のランディングパッド中の下流ランディング配列（DLP）と相同組換えが可能な下流ライブラリー配列（DL）を含む。１つまたは複数の第１のコンポーネントポリヌクレオチドが、１つまたは複数の最後のコンポーネントポリヌクレオチドと組み合わせて宿主細胞に導入される場合、第１のコンポーネントポリヌクレオチドの第１のリンカー配列Ａは、最後のコンポーネントポリヌクレオチドの最後のリンカー配列Ａと相同組換えして、組み立てられたコンポーネントポリヌクレオチドの異なる組合せを生成する。４つの異なる第１のコンポーネントポリヌクレオチドが、図２Ｄで示されるように４つの異なる最後のコンポーネントポリヌクレオチドと共に宿主細胞に導入される場合、宿主細胞は、１６個の異なる組み立てられたコンポーネントポリヌクレオチドを生成する可能性があり、図２Ａに示される３つのランディングパッドに組み込むことができる。異なるコピー数の組み立てられたコンポーネントポリヌクレオチドは各々、３つのランディングパッド中に組み込まれる可能性があるため、標準化されたランディングパッドへの組込みのランダムさはさらに、宿主細胞中で追加の遺伝学的変異をもたらすことができる。
[00153] 図２Ｃおよび図２Ｄは、組み立てられたコンポーネントポリヌクレオチドの異なる組合せを生成するのに２つのコンポーネントポリヌクレオチドの組合せ（すなわち、第１のコンポーネントポリヌクレオチドおよび最後のコンポーネントポリヌクレオチド）が使用される例示的な実施形態を例示するが、インビボで組み立てられたコンポーネントポリヌクレオチドを生成するために、３つ以上のコンポーネントポリヌクレオチドの組合せを使用することができる。例えば、ある特定の実施形態において、１つまたは複数の中間コンポーネントポリヌクレオチドを、第１のコンポーネントポリヌクレオチドと最後のコンポーネントポリヌクレオチドとの間に組み立てて、コンポーネントポリヌクレオチドのＤＮＡ集合体を生成することができる。さらに、図２Ｄは、（UL）に隣接してプロモーターを含むコンポーネントポリヌクレオチドを例示するが、一部の実施形態において、（DL）とリンカー配列との間にプロモーターを取り込むことができる。
[00154] したがって、一態様において、１種または複数の宿主細胞のゲノム中に操作により作製されたランディングパッドのいずれかに組み込むための、インビボで組み立てられた３つ以上のコンポーネントポリヌクレオチドをゲノムで組み込む方法が本明細書で提供される。一実施形態において、本方法は、
（ａ）宿主細胞のゲノム中に組み込まれた１つまたは複数の（x）外因性ランディングパッドを含む宿主細胞であって、１つまたは複数の外因性ランディングパッドの各々は、上流ランディングパッド相同配列（ULP）と下流ランディングパッド相同配列（DLP）との間に位置するヌクレアーゼ標的配列（NTS）を含む、宿主細胞を、
（ｉ）１つまたは複数の第１のコンポーネントポリヌクレオチドであって、各第１のコンポーネントポリヌクレオチドは、５’から３’方向に、上流ランディングパッド相同配列（ULP）と相同組換えが可能な上流ライブラリー配列（UL）、Ｄ０群から選択される任意のＤＮＡセグメント、リンカー配列ＬＢ０を含む、第１のコンポーネントポリヌクレオチド；
（ｉｉ）１つまたは複数の中間コンポーネントポリヌクレオチドであって、各中間コンポーネントポリヌクレオチドは、５’から３’方向に、第１のリンカー配列ＬＡｎ、Ｄｎ群から選択される任意のＤＮＡセグメント、第２のリンカー配列ＬＢｎを含み、ｎは、１から中間コンポーネントポリヌクレオチドの数までの整数を表す、中間コンポーネントポリヌクレオチド；
（ｉｉｉ）１つまたは複数の最後のコンポーネントポリヌクレオチドであって、各最後のコンポーネントポリヌクレオチドは、５’から３’方向に、リンカー配列ＬＡｍ、Ｄｍ群から選択される任意のＤＮＡセグメント、および下流ランディングパッド相同配列（DLP）と相同組換えが可能な下流ライブラリー配列（DL）を含む、最後のコンポーネントポリヌクレオチド
と接触させる工程であって、
各リンカー配列ＬＢ（ｐ−１）は、リンカー配列ＬＡｐと相同組換えが可能であり、ｎは、１〜（ｍ−１）の様々な整数であり、ｐは、１〜ｍの整数を表し、各Ｄ０群、・・・Ｄｎ群、・・・Ｄｍ群、は、独立して、１つまたは複数のＤＮＡセグメントからなる、工程；および
（ｂ）接触させた宿主細胞から生成した宿主細胞を回収する工程
を含み、
１つまたは複数の第１のコンポーネントポリヌクレオチドからの第１のコンポーネントポリヌクレオチド、１つまたは複数の中間コンポーネントポリヌクレオチドからの中間コンポーネントポリヌクレオチド、および１つまたは複数の最後のコンポーネントポリヌクレオチドからの最後のコンポーネントポリヌクレオチドの任意の組合せが、インビボでそれらのリンカー配列を介して相同組換えされ、該組合せが、各ランディングパッド周辺のゲノム配列から独立して、１つまたは複数の（x）外因性ランディングパッドのいずれかにおいて組み込まれる。一部の実施形態において、ｘは、少なくとも１の整数である。一部の実施形態において、ｘは、２の整数である。一部の実施形態において、ｘは、３の整数である。一部の実施形態において、ｘは、４、５、６、７、８、９または１０の整数である。
[00155] ある特定の実施形態において、宿主細胞のゲノム中に存在するランディングパッド（x）の数は、少なくとも２つであり、第１の、中間、および最後のコンポーネントポリヌクレオチドの任意の組合せは、ランディングパッドのいずれかにおいて組み込まれる。ある特定の実施形態において、宿主細胞のゲノム中に存在するランディングパッド（x）の数は、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９または２０である。ある特定の実施形態において、第１の、中間、および最後のコンポーネントポリヌクレオチドの任意の組合せは、これらの複数のランディングパッドのいずれかにおいて組み込まれる。
[00156] コンポーネントポリヌクレオチドに関する組成物および方法の追加の詳細は、参照によりその全体が本明細書に組み入れられる米国特許第８，１１０，３６０号に見出すことができる。
５．４．２．外因性ドナー核酸の遺伝子型／表現型の関係の追跡
[00157] 本明細書で提供される組成物および方法は、外因性ドナー核酸の何百および何千ものコンビナトリアルな組込みを生成する迅速で効率的な方法を提供する。外因性ドナー核酸の多様なコンビナトリアルな組込みは、ある特定の観察可能な特色または表現型（例えば、細胞機能、標的分子産生など）を有する操作された宿主細胞を生成することができる。このような多様なコンビナトリアルな組込みによって生成した異なる表現型を追跡し、外因性ドナー核酸の様々な組合せによる遺伝子型の寄与と共にマッピングすることができる。
[00158] したがって、外因性ドナー核酸による表現型の寄与をスクリーニングする方法が本明細書で提供される。一実施形態において、本方法は、
（ａ）宿主細胞を、複数の外因性核酸（ES）と接触させる工程であって、各（ES）は、バーコード配列でタグ付けされており、宿主細胞のゲノムは、宿主細胞媒介相同組換えを介して、宿主細胞のゲノム中の複数の（ES）の任意の１つまたは組合せを組み込むように設計されている、工程；
（ｂ）接触させた宿主細胞から生成した、特異的な表現型を呈する宿主細胞をスクリーニングする工程；および
（ｃ）各（ES）に関連付けられたバーコード配列を使用して、宿主細胞のゲノムに組み込まれた（ES）のアイデンティティを決定する工程
を含む。
[00159] ある特定の実施形態において、宿主細胞のゲノム中に組み込まれた複数の（x）外因性ランディングパッドを提供することによって、宿主細胞のゲノム中の複数の（ES）の任意の１つまたは組合せを組み込むように設計されている。ある特定の実施形態において、各外因性ランディングパッドは、各ランディングパッド中に、上流ランディングパッド相同配列（ULP）と下流ランディングパッド相同配列（DLP）との間に位置するヌクレアーゼ標的配列（NTS）を含む。ある特定の実施形態において、宿主細胞は、ヌクレアーゼまたはヌクレアーゼをコードするプラスミドおよび複数の（ES）と同時に接触させる。
[00160] ある特定の実施形態において、複数の外因性ドナー核酸（ES）の少なくとも２つは、インビボで宿主細胞に共に形質転換され、相同組換えを介して組み立てられてランディングパッドにおいて組込みを起こすコンポーネントポリヌクレオチドである。このような実施形態において、各コンポーネントポリヌクレオチドは、各コンポーネントポリヌクレオチドを他のコンポーネントポリヌクレオチドと区別するその固有なバーコード配列と連結されていてもよい。ある特定の実施形態において、１つまたは複数の第１のコンポーネントポリヌクレオチドおよび１つまたは複数の最後のコンポーネントポリヌクレオチドが宿主細胞と接触して、宿主細胞のゲノム中の複数のランディングパッドにおいて組み込まれた組み立てられたコンポーネントポリヌクレオチドが生成される。ある特定の実施形態において、１つまたは複数の第１のコンポーネントポリヌクレオチド、１つまたは複数の中間コンポーネントポリヌクレオチド、および１つまたは複数の最後のコンポーネントポリヌクレオチドが宿主細胞と接触して、宿主細胞のゲノム中の複数のランディングパッドにおいて組み込まれた組み立てられたコンポーネントポリヌクレオチドが生成される。
[00161] 図４は、外因性ドナー核酸によって表現型の寄与をスクリーニングする方法の１つの例示的な実施形態を例示する。図２Ａに関して上述したように、図４に示される宿主細胞は、宿主細胞のゲノム中に３つのランディングパッドを含み、各ランディングパッドは、上流ランディングパッド相同配列（ULP）と下流ランディングパッド相同配列（DLP）との間に位置するヌクレアーゼ標的配列（NTS）を含む。宿主細胞は、コンポーネントポリヌクレオチド（例えば、様々な強度のプロモーターを含む９つの第１のコンポーネントポリヌクレオチド、および図４に示されるオープンリーディングフレームを含む１０個の最後のコンポーネントポリヌクレオチド）と接触し、インビボで相同組換えされると、組み立てられたコンポーネントポリヌクレオチドの様々な組合せが生成する。図４に示される実施形態において、宿主細胞は、ランディングパッド中のヌクレアーゼ標的配列Ｘを切断することが可能なヌクレアーゼＸ（例えば、F-CphI）をコードするプラスミドと同時に形質転換される。
[00162] 形質転換した細胞は、あらゆる好適な培地で増殖させることができる。例えば、図４で示されるように、形質転換宿主細胞を選択培地で平板培養して、コロニーを回収する。コロニーをピックアップし、ハイスループットスクリーニングを使用して、「ヒット」、または表現型について関心のあるコロニーに関してスクリーニングする。例えば、図４で示されるように、形質転換宿主細胞の表現型は、２つの異なるアッセイ、すなわちアッセイ１およびアッセイ２でスクリーニングすることができる。アッセイ１は、例えばある条件下での標的分子の産生であってもよいし、アッセイ２は、別の条件下での標的分子の産生であってもよい。次いで、ある特定の表現型（例えば、両方のアッセイにおける高いレベルの標的分子産生）を呈する形質転換宿主細胞を選択することができる。次いで、宿主細胞のゲノム中のランディングパッドに組み込まれたコンポーネントポリヌクレオチド（例えば、遺伝子およびプロモーター）を同定するために、標準プライマーを用いて選択された宿主細胞を遺伝子型解析する。図４は、標準プライマー結合部位の配置を示す。これらの標準化されたプライマーを使用して、ランディングパッド中に組み込まれたコンポーネントポリヌクレオチドだけでなく、各コロニーにおける（ES）組込みのゲノム配置も決定することができる。外因性ドナー核酸の様々なコンビナトリアルな組込みの遺伝子型−表現型の関係を決定した後、遺伝子改変された宿主細胞に関する望ましい表現型（例えば、標的分子産生）をさらに改善するために、外因性ドナー核酸の組成を調整することができる。
[00163] 図４は、バーコード配列を使用してある特定の表現型を有する個々の株を選択し、遺伝子型解析する例示的な実施形態を例示するが、バルクのコンビナトリアル的に操作された宿主細胞の集団の遺伝子型は、バーコード配列を使用して追跡することができる。言い換えれば、個々の形質転換株中に組み込まれた外因性ドナー核酸のアイデンティティを決定する代わりに、ある特定の表現型（例えば、望ましいまたは望ましくない表現型のいずれか）を有する複数の形質転換株を一緒にプールして、プールされた集団の遺伝子型を全体として決定することができる。例えば、様々な株のプールされた集団において、どの外因性ドナー核酸が集団中で富化されるかを決定することができる。ある特定の実施形態において、集団全体の遺伝子型を、最初にスクリーニングを介してそれらの表現型を決定せずとも経時的に追跡することができる。例えば、発酵容器に株の混合集団を接種することができ、どの遺伝子型が経時的に「継承されるか」を決定することができる。ある特定の実施形態において、ＰＣＲ反応を実行して各ランディングパッド領域を増幅することにより、プールされた集団中の富化された外因性ドナー核酸のアイデンティティを決定することができる。あらゆる好適なシーケンシング方法（例えば、次世代シーケンシング）が、ＰＣＲ反応から生成したアンプリコンに関連付けられたバーコード配列を決定するのに使用することができる。バーコード情報に基づき、プールされた株の集団中のどの外因性ドナー核酸がある特定の表現型に寄与するのかを決定することができる。この情報に基づき、望ましくない表現型に関連する外因性ドナー核酸の優先順位を下げて、コンビナトリアル設計の次のラウンドから除去することができ、望ましい表現型を有するものを優先させて、コンビナトリアル設計の次のラウンドで繰り返すことができる。
５．４．３．アドレス指定可能なまたは任意選択のランディングパッドでのゲノム組込み
[00164] 別の態様において、図２Ａに示される標準化された一次ランディングパッドに加えて、またはその代わりに任意選択のまたはアドレス指定可能なランディングパッドを含む宿主細胞のゲノム中の外因性ドナー核酸をゲノム組込み方法が本明細書で提供される。ある特定の実施形態において、標準化された一次ランディングパッドに加えて、またはその代わりにアドレス指定可能なランディングパッドを作り出して、外因性ドナー核酸のサブセットに標的化された組込みを実行することが望ましい場合がある。これらのランディングパッドは、「アドレス指定可能な」ランディングパッドと称されるが、これはなぜなら、外因性ドナー核酸のサブセットが、標準化された一次ランディングパッドにではなくこれらのランディングパッドへの組込みを起こすようにアドレス指定または指示され得るためである。
[00165] 図５Ｂは、二次ランディングパッドが図２Ａに示される標準化された一次ランディングパッドとは異なる例示的な実施形態を例示する。図２Ａで例示された実施形態において、全ての３つの一次ランディングパッドは、全ての（ULP）につき同じ上流相同性ランディングパッド配列「ＵＬ」および全ての（DLP）につき同じ下流相同性ランディングパッド配列「ＤＬ」を含む。宿主細胞のゲノム中の遺伝子座１において組み込まれた第４のランディングパッドは、上流ランディングパッド相同配列（UL）を含み、これは、標準化された一次ランディングパッドと同じであるが異なる下流ランディングパッド相同配列（DL1）を含む。（UL）および（DL1）を有する二次ランディングパッドを使用して、特異的な外因性ドナー核酸（例えば、図５Ａに示される最後のコンポーネントポリヌクレオチドＡ−ＯＲＦ５−ＤＬ１）を、異なるプロモーターを有する第１のコンポーネントポリヌクレオチドのいずれかと組み合わせて組み込むことができる。これらのコンポーネントポリヌクレオチドは、第１のコンポーネントポリヌクレオチドのいずれかとコンビナトリアル的に組み合わされて、ＡＬＧ１、ｉＭＧＡ１、およびｉＹＣＴ１遺伝子座で標準化された一次ランディングパッドに組み込まれるように設計された他の最後のコンポーネントポリヌクレオチド（Ａ−ＯＲＦ１−ＤＬ、Ａ−ＯＲＦ２−ＤＬ、Ａ−ＯＲＦ３−ＤＬおよびＡ−ＯＲＦ４−ＤＬ）と共に形質転換することができる。
[00166] 図６Ｂは、標準化された一次ランディングパッドとは異なる２つの任意選択のアドレス指定可能なランディングパッドをさらに含む別の例示的な実施形態を例示する。図６Ｂに示される宿主細胞は、宿主細胞のゲノム中の遺伝子間領域ｉＡＬＧ１、ｉＭＧＡ１、およびｉＹＣＴ１において組み込まれている３つの一次ランディングパッドを含む。これらの一次ランディングパッドは、上流ランディングパッド相同配列（UL）の同じセット、下流ランディングパッド相同配列（DL）の同じセット、（UL）と（DL）との間に位置するヌクレアーゼ認識部位Ｘの同じセットを含む。図６Ｂで示されるように、宿主細胞は、遺伝子座１および遺伝子座２における２つのアドレス指定可能なランディングパッドをさらに含む。これらの２つのアドレス指定可能なランディングパッドを使用して、特異的な外因性ドナー核酸（例えば、遺伝子座１における最後のコンポーネントポリヌクレオチドＡ−ＯＲＦ４−ＤＬ１、および遺伝子座２における最後のコンポーネントポリヌクレオチドＡ−ＯＲＦ５−ＤＬ２）を、異なるプロモーターを有する第１のコンポーネントポリヌクレオチドのいずれかと組み合わせて組み込むことができる。これらのコンポーネントポリヌクレオチドは、第１のコンポーネントポリヌクレオチドのいずれかとコンビナトリアル的に組み合わされ、標準化されたランディングパッドへの組込みを起こすように設計された他の最後のコンポーネントポリヌクレオチド（A-ORF1-DL、A-ORF2-DL、A-ORF3-DL）と共に形質転換することができる。
[00167] 遺伝子座１および遺伝子座２におけるアドレス指定可能なランディングパッドはまた、任意選択のランディングパッドでもあり、これはなぜなら、それらが、Ｘ−カッターが導入されて一次ランディングパッドを切断するときに切断されないが、任意選択で別個のヌクレアーゼによって「開裂」または切断される標的ヌクレアーゼ配列を含むためである。遺伝子座１における任意選択のランディングパッドは、Ｇ−カッターによって認識される標的ヌクレアーゼ配列「Ｇ」を含む。遺伝子座２における任意選択のランディングパッドは、Ｈ−カッターによって認識および／または結合できる標的ヌクレアーゼ配列「Ｈ」を含む。これらの任意選択のランディングパッドは、一次ランディングパッドの切断と同時に、またはその後に逐次的に、それ自体のヌクレアーゼ（例えば、Ｇ−カッターおよびＨ−カッター）によって切断することができる。
[00168] 図６Ａは、プールされた「カッター」試薬（例えば、ヌクレアーゼをコードするプラスミド）と組み合わせて使用できるプールされたＤＮＡコンストラクト（すなわち、コンポーネントポリヌクレオチド）を例示する。図６Ｂに示される全てのランディングパッドが上流ランディングパッド相同配列として（UL）を有するため、上流ライブラリー配列として（UL）を含むコンポーネントポリヌクレオチドの第１のセットは、５つのランディングパッドのいずれか１つで（UL）と相同組換えするのに適合性を有する。一方で、ＯＲＦ１、ＯＲＦ２、またはＯＲＦ３を含むコンポーネントポリヌクレオチドの第２のセットは、ｉＡＬＧ１遺伝子座、ｉＭＧＡ１遺伝子座、およびｉＹＣＴ１遺伝子座で一次ランディングパッドのいずれかにコンビナトリアル的への組込みを起こすことができる。しかしながら、ＯＲＦ４を含むコンポーネントポリヌクレオチドのみが、遺伝子座１における（DL1）に対するその（DL1）の相同性のために、遺伝子座１において組込みを起こすことができる。同様に、ＯＲＦ５を含むコンポーネントポリヌクレオチドのみが、遺伝子座２における（DL2）に対するその（DL2）相同性のために、遺伝子座２において組込みを起こすことができる。
[00169] 任意選択のおよび／またはアドレス指定可能なランディングパッドには他の多くのバリエーションがある。例えば、宿主細胞は、上流ランディングパッド相同配列および下流ランディングパッド相同配列の両方に関して、標準化されたランディングパッドの一次セットと比較して異なる相同配列を含むランディングパッドの追加のセットを含んでいてもよい。ある特定の実施形態において、ランディングパッドは、ゲノム配列にとって外因性の上流ランディングパッド相同配列（例えば、ランダムに生成したヌクレオチド配列）、およびゲノム遺伝子座にとって内因性の下流ランディングパッド相同配列（例えば、ゲノム遺伝子座のオープンリーディングフレーム）を含んでいてもよい。ある特定の実施形態において、ランディングパッドは、ゲノム遺伝子座にとって内因性の上流ランディングパッド相同配列（例えば、ゲノム遺伝子座のオープンリーディングフレーム）、およびゲノム遺伝子座にとって外因性の下流ランディングパッド相同配列を含んでいてもよい。
５．４．４．標的化されたランディングパッドへの標的化されたランディングパッドおよび外因性ドナー核酸の組込み
[00170] 本明細書で提供される組成物および方法は、特異的なゲノム部位への外因性ドナー核酸の標的化された組込み、および遺伝子改変された宿主細胞の表現型に対するその作用のスクリーニングにおいて適用される可能性がある。ある特定の実施形態において、特異的なゲノム部位における外因性ドナー核酸の標的化された組込みは、外因性ドナー核酸を宿主細胞に導入する前に、そのようなゲノム部位にランディングパッドを組み込むことによって達成することができる。目的の遺伝学的エレメント（例えば、オープンリーディングフレーム）に隣接する特異的なゲノム部位で一旦組み込まれたら、これらのランディングパッドは、外因性ドナー核酸を特異的なゲノム部位において組み込むことを可能にする。このような特異的なゲノム部位に構築された外因性ランディングパッドは、外因性ドナー核酸を特異的なゲノム部位で標的化してランディングパッドに組み込むことを可能にすることから、「標的化されたランディングパッド」と称される。したがって、ある特定の実施形態において、目的の核酸（例えば、プロモーター、ターミネーター、またはデグロン配列）を含む外因性ドナー核酸を、標的化されたランディングパッドに組み込んで、オープンリーディングフレームの転写および／またはそのタンパク質の発現もしくは安定性に対するそれらの作用をスクリーニングすることができる。
[00171] ある特定の実施形態において、標的化されたランディングパッドは、パーツ（例えば、図１Ｅおよび図２Ｂ〜２Ｄに示される（UL）、（DL）、（A））の既存のライブラリー中の外因性ドナー核酸の相同配列に適合性を有する相同配列を含む。したがって、標準的なライブラリー配列および／または標準化されたリンカー配列を有する外因性ドナー核酸のライブラリーは、再カスタマイゼーション不要の特異的なゲノム部位における標的化されたランディングパッドへの標的化された組込みに利用することができる。
[00172] したがって、一態様において、宿主細胞のゲノムへの核酸の標的化された組込みのための方法であって、
（ａ）オープンリーディングフレームの５’に組み込まれた外因性ランディングパッドを含む宿主細胞であって、外因性ランディングパッドは、上流ランディングパッド相同配列（ULP）と下流ランディングパッドリンカー配列（DLPL）との間に位置するヌクレアーゼ標的配列（NTS）を含む、宿主細胞を、
（ｉ）１つまたは複数の第１のコンポーネントポリヌクレオチドであって、各第１のコンポーネントポリヌクレオチドは、５’から３’方向に、
（１）（ULP）と相同組換えが可能な上流ライブラリー配列（UL）；
（２）第１の目的の核酸；および
（３）第１のリンカー配列
を含む、第１のコンポーネントポリヌクレオチド；
（ｉｉ）（NTS）に結合し、外因性ランディングパッド内の部位を切断することが可能な、ヌクレアーゼ（N）
と接触させる工程
（ｂ）接触させた宿主細胞から生成した宿主細胞を回収する工程
を含み、
（DLPL）は、１つまたは複数の第１のコンポーネントポリヌクレオチドのいずれかの第１のリンカー配列と相同組換えして、外因性ランディングパッドで、１つまたは複数の第１のコンポーネントポリヌクレオチドからの第１のコンポーネントポリヌクレオチドを外因性ランディングパッドに組み込むことが可能である、方法が本明細書で提供される。
[00173] ある特定の実施形態において、オープンリーディングフレームは、そのネイティブの遺伝子座における内因性遺伝子のオープンリーディングフレームである。他の実施形態において、オープンリーディングフレームは、オープンリーディングフレームが配置されている特異的なゲノム部位に標的化されたランディングパッドを導入する前の非ネイティブの遺伝子座に組み込まれた外因性遺伝子のオープンリーディングフレームである。
[00174] ある特定の実施形態において、本方法は、（ａ）回収された宿主細胞の表現型をスクリーニングして、特定の表現型を有する宿主細胞を選択する工程；および（ｂ）宿主細胞中の外因性ランディングパッド中に組み込まれた第１のコンポーネントポリヌクレオチドのアイデンティティを決定する工程をさらに含む。ある特定の実施形態において、各コンポーネントポリヌクレオチドは、固有なバーコード配列を含み、バーコード配列は、標的化されたランディングパッド中に組み込まれた第１のコンポーネントポリヌクレオチドを同定するのに使用することができる。ある特定の実施形態において、標的化されたランディングパッドは、上記のセクション５．２に記載される１つまたは複数の標準化されたランディングパッドと共に、宿主細胞のゲノム中に存在する。
[00175] ある特定の実施形態において、本方法は、調節配列（例えば、プロモーター）を含む第１のコンポーネントポリヌクレオチドのライブラリーを含む目的の内因性遺伝子の適正量を決定すること（例えば、下方制御または上方制御すること）に適用することができる。図７Ａは、オープンリーディングフレームのネイティブの遺伝子座で「プロモータースワップランディングパッド」を組み込むのに使用することができるプロモータースワップランディングパッドビルディングコンストラクトの概略図を例示する。宿主細胞のゲノム中に一旦組み込まれたら、プロモータースワップランディングパッドは、ライブラリー中のあらゆるプロモーターを目的のオープンリーディングフレームの５’に組み込むことができる。
[00176] 図７Ａを参照すると、プロモータースワップランディングパッドビルディングコンストラクトは、第１のコンポーネントポリヌクレオチドの相同組換えのための、上流ランディングパッド相同配列（ULP、「UL」として示される）、および下流ランディングパッドリンカー配列（DLPL、「A」として示される）を含む。プロモータースワップランディングパッドビルディングコンストラクトは、ヌクレアーゼ標的配列（NTS、「X」として示される）、および（ULP）と（DLPL）との間に位置する一時的なプロモーターｐＡＣＴ１をさらに含む。プロモーターランディングパッドビルディングコンストラクトは、ＯＲＦのネイティブの遺伝子座における相同組換えのために、ＯＲＦの上流配列（「US_ORF」）、およびそれぞれ相同的に５’および３’領域のためのＯＲＦの一部をさらに含む。図７Ｂに示したように、プロモータースワップランディングパッドが宿主細胞のゲノム中に一旦組み込まれると、一時的なプロモーターｐＡＣＴ１がオープンリーディングフレームの発現を作動させる。
[00177] プロモータースワップランディングパッドは、あらゆる好適な方法を使用して望ましいゲノム部位において組み込むことができる。例えば、図７Ａで示されるように、部位特異的ヌクレアーゼ（例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９）は、オープンリーディングフレームのためのネイティブのプロモーターｐＯＲＦを切断するのに使用することができる。ネイティブのプロモーターｐＯＲＦが一旦切断されると、プロモータースワップランディングパッドビルディングコンストラクトは、オープンリーディングフレームの上流配列（US_ORF）およびＯＲＦの５’領域と宿主細胞媒介相同組換えを介して相同組換えされる。図７Ｂに、ＯＲＦの５’において組み込まれたプロモータースワップランディングパッドで形質転換したこのような宿主細胞を示す。この宿主細胞を親宿主細胞として使用することにより、ＯＲＦの転写、そのタンパク質発現または安定性を改変できる様々な調節配列を含む第１のコンポーネントポリヌクレオチドをさらに組み込んでスクリーニングすることができる。
[00178] 図７Ｃを参照すると、プロモータースワップランディングパッドを有する親宿主細胞は、プロモーターライブラリーと接触させる。プロモーターライブラリーは、目的の核酸として様々な強度のプロモーターを含む第１のコンポーネントポリヌクレオチドを含む。ライブラリー中の各第１のコンポーネントポリヌクレオチドは、上流ライブラリー配列（UL）と第１のリンカー配列Ａとの間に位置する異なるプロモーター（曲がった矢印として示される）を含む。ある特定の実施形態において、ライブラリー中の各第１のコンポーネントポリヌクレオチドは、図３Ａで示されるように、バーコード配列および／または追加のヌクレアーゼ標的配列をさらに含む。プロモータースワップランディングパッドを有する親宿主細胞は、プロモータースワップランディングパッド中の標的ヌクレアーゼ配列Ｘを切断するために、ヌクレアーゼＸ−カッター（例えば、CphI）をコードするプラスミドと接触させることができ、それにより、第１のコンポーネントポリヌクレオチドがプロモータースワップランディングパッドにおいて組込みを起こすことが可能になる。
[00179] 図７Ｄにおいて、概略図は、プロモーターライブラリーで形質転換した宿主細胞のコロニーのピックアップ、および望ましい表現型を有する宿主細胞のスクリーニングをさらに例示する。コロニーの遺伝子型（すなわち、プロモーター配列）は、あらゆる好適な方法を使用して同定することができる。例えば、第１のコンポーネントポリヌクレオチドの各々がバーコード配列を含む場合、第１のコンポーネントポリヌクレオチドに関連付けられたバーコード配列は、回収された宿主細胞を遺伝子型解析するのに使用することができる。バーコード配列に隣接する領域に結合する標準プライマーは、バーコード配列を含むアンプリコンを生成するのに使用することができる。アンプリコンは、次世代シーケンシングなどのあらゆる好適な技術を使用してシーケンシングすることができる。ある特定の実施形態において、標準プライマーを使用して生成したアンプリコンは、次世代シーケンシング（例えば、IlluminaからのMiSeqシステムを介した）の前に断片化する必要性をなくすある特定の断片サイズ（例えば、約５００〜約７００塩基対）を有する。
[00180] 図７Ａ〜７Ｄに示される内因性遺伝子発現（例えば、そのネイティブの遺伝子座におけるオープンリーディングフレーム）の適正量を決定する方法は、単なる例示であり、他の多くのバリエーションがある。例えば、第１のコンポーネントポリヌクレオチドは、他の機能的なエレメント、例えば、遺伝子改変された宿主細胞の様々な細胞機能または表現型の改変を引き起こすことができる、転写レギュレーター配列、デグロン配列、または融合パートナー配列を含んでいてもよい。
[00181] 別の態様において、標的化されたランディングパッドを、特異的なゲノム部位に操作により作製してオープンリーディングフレームの３’に位置させることができる。したがって、宿主細胞のゲノムに核酸を標的化組込みするための方法であって、
（ａ）オープンリーディングフレームの３’に組み込まれた外因性ランディングパッドを含む宿主細胞であって、外因性ランディングパッドは、上流ランディングパッドリンカー配列（ULPL）と下流ランディングパッド相同配列（DLP）との間に位置するヌクレアーゼ標的配列（NTS）を含む、宿主細胞を、
（ｉ）１つまたは複数の最後のコンポーネントポリヌクレオチドであって、各最後のコンポーネントポリヌクレオチドは、５’から３’方向に、
（１）最後のリンカー配列；
（２）最後の目的の核酸；および
（３）（DLP）と相同組換えが可能な下流ライブラリー配列（DL）
を含む、最後のコンポーネントポリヌクレオチド；
（ｉｉ）（NTS）に結合し、外因性ランディングパッド内の部位を切断することが可能な、ヌクレアーゼ（N）
と接触させる工程、
（ｃ）接触させた宿主細胞から生成した宿主細胞を回収する工程であって、
（ULPL）は、１つまたは複数の最後のコンポーネントポリヌクレオチドのいずれかの最後のリンカー配列と相同組換えして、外因性ランディングパッドで、１つまたは複数の最後のコンポーネントポリヌクレオチドからの最後のコンポーネントポリヌクレオチドを組み込むことが可能である、工程
を含む方法も本明細書で提供される。
[00182] 図７Ｅ〜図７Ｈに、オープンリーディングフレームの３’に位置する標的化されたランディングパッドを利用する例示的な実施形態を例示する。図７Ｅは、上流ランディングパッドリンカー配列（ULPL、「A」として示される）と下流ランディングパッド相同配列（DLP、「DL」として示される）との間に位置するヌクレアーゼ標的配列（NTS、「X」として示される）を含む、ターミネータースワップランディングパッドビルディングコンストラクトを例示する。ターミネータースワップランディングパッドビルディングコンストラクトは、その５’領域におけるオープンリーディングフレーム（「ORF」）の一部およびその３’領域におけるＯＲＦの下流配列（「DS_ORF」）をさらに含む。これらの５’および３’領域における配列は、ＯＲＦのネイティブの遺伝子座へのターミネータースワップランディングパッドの宿主細胞媒介相同組換えに使用することができる。図７Ｅに示される実施形態において、ターミネータースワップランディングパッドビルディングコンストラクトは、（ULPL、「A」として示される）と（NTS、「X」として示される）との間に位置する一時的なターミネーターであるｔＡＣＴ１をさらに含む。宿主細胞は、ターミネータースワップランディングパッドビルディングコンストラクトおよびＯＲＦのネイティブのターミネーター（「tORF」として示される）を標的化しそれを切断することができるヌクレアーゼで形質転換される。図７Ｆに、それにより得られた宿主細胞のゲノム中の組み込まれたターミネータースワップランディングパッドを示す。宿主細胞のゲノム中でＯＲＦの３’に組み込まれたターミネータースワップランディングパッドを有するこの親宿主細胞は、標準ライブラリーリンカー配列および下流ライブラリー配列を有する最後のコンポーネントポリヌクレオチドの様々なライブラリーをスクリーニングするのに使用することができる。
[00183] ある特定の実施形態において、図７Ｇで示されるように、ターミネータースワップランディングパッドは、デグロンライブラリーを組み込むのに使用することができる。このような実施形態において、（ULPL、「A」として示される）に隣接するオープンリーディングフレームの３’末端は、ターミネータースワップランディングパッド中の「＊」と表記される位置に終止コドンを含まない。図７Ｇにおいて、デグロンライブラリーは、４つの最後のコンポーネントポリヌクレオチドを含み、各最後のコンポーネントポリヌクレオチドは、５’から３’方向に、最後のリンカー配列（「A」として示される）、最後の目的の核酸（ターミネーターに融合したデグロン配列）、および下流ライブラリー配列（DL）を含む。４つの最後のコンポーネントポリヌクレオチドの各々は、異なるデグロン配列（デグロン１、デグロン２、デグロン３、およびデグロン４）を含む。組み込まれたターミネータースワップランディングパッドを有する親宿主細胞は、（NTS）に結合してランディングパッド内の部位を切断することが可能なヌクレアーゼで形質転換される場合、デグロンライブラリー中の最後のコンポーネントポリヌクレオチドのいずれかが、ランディングパッドにおいて組込みを起こすことができる。ランディングパッドにおいて組み込まれたデグロン配列は、フレーム内でＯＲＦに融合され、このようなコンストラクトから発現された融合タンパク質は、融合タンパク質の分解をモジュレートすることができる。融合タンパク質の分解速度または安定性をモジュレートすることが望ましい場合、図７Ｇで示されるように、最後のコンポーネントポリヌクレオチドのデグロンライブラリーは、ターミネータースワップランディングパッドを使用してスクリーニングすることができる。
[00184] 他の実施形態において、ターミネータースワップランディングパッドは、オープンリーディングフレームの３’末端に終止コドンを含む。このようなターミネータースワップランディングパッドは、最後のコンポーネントポリヌクレオチドのターミネーターライブラリーを組み込むことにおいて有用である。ターミネーターは、ＲＮＡプロセシングにおいて重要な役割を果たし、ＲＮＡ半減期の変動性、最終的には遺伝子発現に寄与する。図７Ｈにおいて、ターミネーターライブラリーは、４つのコンポーネントポリヌクレオチドを含み、各最後のコンポーネントポリヌクレオチドは、５’から３’方向に、最後のリンカー（「A」として示される）、最後の目的の核酸（ターミネーター）、および下流ライブラリー配列（DL）を含む。４つのコンポーネントポリヌクレオチドの各々は、異なるターミネーター配列（term1、term2、term3、およびterm4）を含む。組み込まれたターミネータースワップランディングパッドを有する親宿主細胞が、（NTS）に結合しランディングパッド内の部位を切断することが可能なヌクレアーゼで形質転換される場合、ターミネーターライブラリー中の最後のコンポーネントポリヌクレオチドのいずれかが、ターミネータースワップランディングパッドにおいて組込みを起こすことができる。ＲＮＡ半減期、したがってオープンリーディングフレームからの遺伝子発現を改変することが望ましい場合、ターミネーターライブラリーのスクリーニングは特に有用である。
[00185] 別の態様において、標的化されたランディングパッドに外因性ドナー核酸の標的化された組込みを組み合わせること、および外因性ドナー核酸のゲノム遺伝子座に頼らない別のランディングパッドへの組込みの方法が本明細書で提供される。例えば、宿主細胞は、図７に関して説明したような標的化されたランディングパッド、および１つまたは複数の二次ランディングパッドを含み、各二次ランディングパッドは、二次上部ランディングパッド相同配列と二次下流ランディングパッド相同配列との間に位置するヌクレアーゼ標的配列を含む。この実施形態において、二次上部ランディングパッド相同配列および二次下流ランディングパッド相同配列の少なくとも１つが、標的化されたランディング相同配列とは異なっている。
[00186] ある特定の実施形態において、標的化されたランディングパッドへの外因性ドナー核酸の標的化された組込みを、標準化されたランディングパッド（例えば、図２Ａに示される）へのランダムな外因性ドナー核酸の組込みと組み合わせて、宿主細胞の表現型に対するそれらのコンビナトリアルな作用を決定することができる。図８は、このような例を例示する。標的化されたランディングパッドとは対照的に、宿主細胞のゲノム中のニュートラルな遺伝子座における標準の外因性ランディングパッドは、ランディングパッドが配置されるゲノム部位のいかなるコンテクストも要せずに、そこに組み込まれた外因性ドナー核酸を発現させることを可能にする。それゆえに、ニュートラルな遺伝子座における外因性ランディングパッドは、ゲノム遺伝子座に頼らない組込みランディングパッドとも称される。
[00187] 図８で例示された実施形態において、親宿主細胞は、２つの異なるランディングパッド、ＥＲＧ９遺伝子座における標的化されたランディングパッド、およびゲノム遺伝子座に頼らない組込みランディングパッドである二次ランディングパッドを含む。ＥＲＧ９遺伝子座における標的化されたランディングパッドは、ネイティブのＥＲＧ９遺伝子の発現の適正量を決定するための様々なプロモーターの組込みを可能にする。ｉＡＬＧ１遺伝子座の遺伝子間領域における二次ランディングパッドは、様々なプロモーターをファルネセンシンターゼ遺伝子（「FS」）とコンビナトリアル的に組み合わせるのに使用される。
[00188] ネイティブのＥＲＧ９は、様々な生物においてステロール生合成の第１の工程を触媒するスクアレンシンターゼをコードする。ステロールの産生は、細胞バイオマス産生などの様々な細胞機能において重要である。しかしながら、細胞バイオマス産生は、発酵中の工業用微生物における標的分子産生に対して釣り合いをとることが必要である。図８に示される例示的な実施形態において、生合成経路（例えば、メバロン酸経路）は、ファルネセンシンターゼを介して望ましい標的分子（例えば、ファルネセン）に、またはＥＲＧ９を介してバイオマスに変換できる中間体（例えば、ＦＰＰまたはファルネシル二リン酸）を生産する。標的分子（例えば、ファルネセン）の産生を増加させるために、ＥＲＧ９の発現を減少させ、ファルネセンシンターゼ遺伝子を過剰発現することが望ましい。
[00189] ＥＲＧ９の発現とファルネセンシンターゼの最適な釣り合いを達成するために、２つの遺伝子の発現は、図８で示されるように、プロモーターライブラリーの異なるセットを使用して宿主細胞で同時に適正量を決定することができる。比較的弱いｐＳＮＬ１プロモーターのライブラリーは、ｐＳＬＮ１ライブラリーの上流ランディングパッド相同配列（ULP、「UL1」として示される）および上流ライブラリー配列（UL1）の相同組換えを介して、ＥＲＧ９遺伝子座で標的化されたプロモータースワップランディングパッドに組み込むことができる。比較的強いｐＧＡＬプロモーターのライブラリーは、ｐＧＡＬライブラリーの上流ランディングパッド相同配列（ULP、「UL」として示される）および上流ライブラリー配列（UL）の相同組換えを介して、二次ランディングパッドに組み込むことができる。プロモーターライブラリーのこれらの２つのセットで同時に形質転換される宿主細胞をスクリーニングして、細胞バイオマス産生への必要性と釣り合いがとられた最適な標的分子の産生を有する株を同定することができる。ある特定の実施形態において、最適な株に組み込まれたプロモーターは、コンポーネントポリヌクレオチド中の各プロモーターに関連付けられたバーコード配列を使用して同定することができる。
[00190] 別の態様において、外因性ドナー核酸の標的化された組込みのために宿主細胞のゲノムにおいて標準化されたランディングパッドを利用する方法が本明細書で提供される。一部の場合において、標的化されたランディングパッドを作り出す代わりに、特異的な遺伝子の標的化された組込みは、ランディングパッド相同配列に隣接する内因性ゲノム配列を使用して達成することができる。したがって、宿主細胞のゲノムへの外因性ドナー核酸の標的化された組込みの方法が本明細書において提供され、本方法は、
（ａ）宿主細胞のゲノム中に組み込まれた１つまたは複数の（x）外因性ランディングパッドを含む宿主細胞であって、各外因性ランディングパッドは、上流ランディングパッド相同配列（ULP）と下流ランディングパッド相同配列（DLP）との間に位置するヌクレアーゼ標的配列（NTS）を含み、各ランディングパッドは、上部の内因性ゲノム配列（UEG）ｘと下流内因性ゲノム配列（DEG）ｘとに入れ子になっている、宿主細胞を、
（ｉ）１つまたは複数の（x）外因性ランディングパッドを切断することが可能なヌクレアーゼ（NTS）；および
（ｉｉ）１つまたは複数の第１のコンポーネントポリヌクレオチドであって、各第１のコンポーネントポリヌクレオチドは、５’から３’方向に、
（１）１つまたは複数の外因性ランディングパッドのいずれかの任意の（ULP）と相同組換えが可能な上流ライブラリー配列（UL）；
（２）第１の目的の核酸；
（３）第１のリンカー配列
を含む、第１のコンポーネントポリヌクレオチド；および
（ｉｉｉ）１つまたは複数の最後のコンポーネントポリヌクレオチドであって、各最後のコンポーネントポリヌクレオチドは、５’から３’方向に、
（１）最後のリンカー配列；
（２）最後の目的の核酸；および
（３）１つまたは複数の（x）外因性ランディングパッドの（DEG）ｘと相同組換えが可能な下流ライブラリー配列（DL）
を含む、最後のコンポーネントポリヌクレオチド
と接触させる工程、
（ｂ）接触させた細胞から生成した宿主細胞を回収する工程
を含み、
１つまたは複数の第１のコンポーネントポリヌクレオチドからの第１のコンポーネントポリヌクレオチドと、１つまたは複数の最後のコンポーネントポリヌクレオチドからの最後のコンポーネントポリヌクレオチドとの任意の組合せが、インビボでそれらのリンカー配列を介して相同組換えされ、該組合せが、（DEG）ｘを有する外因性ランディングパッドにおいて組み込まれ、ｘは、少なくとも１の整数である。
[00191] 図９に、例示的な実施形態を例示する。図９に示される親宿主細胞は、２つのランディングパッドを含む。第１および第２のランディングパッドは両方とも、上流ランディングパッド相同配列（UL）と下流ランディングパッド相同配列（DL）との間に位置するヌクレアーゼ標的配列（X）を含む標準化されたランディングパッドである。２つのランディングパッドは、親宿主細胞において、それぞれＡＬＧ１遺伝子座およびＹＣＴ１遺伝子座下流の遺伝子間領域中に操作により作製される。外因性ドナー核酸の標的化された組込みのために、親株は、以下：１）ヌクレアーゼ標的配列Ｘを切断するヌクレアーゼ；２）様々なプロモーターを含むプロモーターライブラリー（すなわち、様々なプロモーター強度を有するプロモーターを含む９つの第１のコンポーネントポリヌクレオチド）；３）常にランディングパッド１において組込みを起こすように設計されるＯＲＦ１を含む最後のコンポーネントポリヌクレオチド；および２）常にランディングパッド２において組込みを起こすように設計されるＯＲＦ２を含む最後のコンポーネントポリヌクレオチドと接触させる。ＯＲＦ１を含む最後のコンポーネントポリヌクレオチドは、ｉＡＬＧ１遺伝子座の下流内因性ゲノム配列（DEG）に同一な下流ライブラリー配列を含むことから、常にランディングパッド１において組込みを起こす。ＯＲＦ２を含む最後のコンポーネントポリヌクレオチドは、ｉＹＣＴ１遺伝子座の下流内因性ゲノム配列（DEG）に同一な下流ライブラリー配列を含むことから、ランディングパッド２で常に組込みを起こす。これらのＯＲＦを含む外因性ドナー核酸は、コンビナトリアル的に組み合わされ、プロモーターを含む第１のコンポーネントポリヌクレオチドのいずれかと組み込まれる。様々なプロモーターに作動可能に連結したＯＲＦ１およびＯＲＦ２で形質転換した宿主細胞をスクリーニングして、望ましい表現型を有する宿主細胞を選択することによって、これらのＯＲＦの最適に釣り合った共発現を決定することができる。ある特定の実施形態において、望ましい表現型を有する選択された宿主細胞は、各コンポーネントポリヌクレオチドに関連付けられたバーコード配列を使用して遺伝子型解析することができる。
[00192] 別の態様において、宿主細胞のゲノムへの外因性ドナー核酸の標的化された組込みの方法は、相同組換えのための上流ライブラリー配列として（UEG）を含む、第１のコンポーネントポリヌクレオチドのライブラリーを相同組換えするための上流内因性ゲノム配列（UEG）を利用する。本方法は、
（ａ）宿主細胞のゲノム中に組み込まれた１つまたは複数の（x）外因性ランディングパッドを含む宿主細胞であって、各外因性ランディングパッドは、上流ランディングパッド相同配列（ULP）と下流ランディングパッド相同配列（DLP）との間に位置するヌクレアーゼ標的配列（NTS）を含み、各ランディングパッドは、上部の内因性ゲノム配列（UEG）ｘと下流内因性ゲノム配列（DEG）ｘとに入れ子になっている、宿主細胞を、
（ｉ）１つまたは複数の（x）外因性ランディングパッドを切断することが可能なヌクレアーゼ（NTS）；および
（ｉｉ）１つまたは複数の第１のコンポーネントポリヌクレオチドであって、各第１のコンポーネントポリヌクレオチドは、５’から３’方向に、
（１）１つまたは複数の（x）外因性ランディングパッドの（UEG）ｘと相同組換えが可能な上流ライブラリー配列（UL）；
（２）第１の目的の核酸；
（３）第１のリンカー配列
を含む、第１のコンポーネントポリヌクレオチド；および
（ｉｉｉ）１つまたは複数の最後のコンポーネントポリヌクレオチドであって、各最後のコンポーネントポリヌクレオチドは、５’から３’方向に、
（１）最後のリンカー配列；
（２）最後の目的の核酸；および
（３）１つまたは複数の（x）外因性ランディングパッドのいずれかの任意のＤＬＰと相同組換えが可能な下流ライブラリー配列（DL）
を含む、最後のコンポーネントポリヌクレオチド
と接触させる工程
（ｂ）接触させた宿主細胞から生成した宿主細胞を回収する工程
を含み、
１つまたは複数の第１のコンポーネントポリヌクレオチドからの第１のコンポーネントポリヌクレオチドと、１つまたは複数の最後のコンポーネントポリヌクレオチドからの最後のコンポーネントポリヌクレオチドとの任意の組合せが、インビボでそれらのリンカー配列を介して相同組換えされ、該組合せが、（UEG）ｘを有する外因性ランディングパッドにおいて組み込まれ、ｘは、少なくとも１の整数である。
５．５ 代謝経路を操作するための方法
[00193] 本明細書に記載される方法および組成物は、例えば生物燃料、医薬品またはバイオマテリアルへのバイオマス変換に最適化された生合成経路を含む組換え生物を構築するための特定の利点を提供する。機能的な非ネイティブの生物学的経路が、抗マラリア薬であるアルテミシニン（例えば、Martin et al., Nat Biotechnol 21:796-802 (2003)参照） 脂肪酸由来の燃料および化学物質（例えば、脂肪エステル、脂肪族アルコールおよびワックス；例えば、Steen et al., Nature 463:559-562 (2010)参照；ハロゲン化メチル由来の燃料および化学物質（例えば、Bayer et al., J Am Chem Soc 131:6508-6515 (2009)参照）； コレステロール降下薬を生成するポリケチドシンターゼ（例えば、Ma et al., Science 326:589-592 (2009)参照）；およびポリケチド（例えば、Kodumal, Proc Natl Acad Sci USA 101:15573-15578 (2004)参照）の前駆体の産生のために微生物宿主においてうまく構築されてきた。
[00194] 従来、代謝を操作すること、特定には生合成経路の構築、または生合成経路を介した代謝フラックスの最適化は、１つずつの連続的な様式で進められてきたが、それにより経路コンポーネントが導入され、すなわち単一の遺伝子座に同時に、宿主細胞のゲノムに組み込まれてきた。本明細書で提供される組込み方法を利用して、典型的に宿主細胞、例えば微生物細胞を、新しい代謝経路、すなわち宿主細胞によって内因的に生産されない代謝産物を産生する代謝経路の酵素をコードする１つまたは複数の異種ヌクレオチド配列を含むように操作するのに必要とされる時間を低減することができる。他の特定の実施形態において、本明細書で提供される組込み方法は、宿主細胞にとって内因性の代謝経路、すなわち宿主細胞によって内因的に産生される代謝産物を産生する代謝経路の酵素をコードする１つまたは複数の異種ヌクレオチド配列を含むように宿主細胞を効率的に操作するのに使用することができる。他の特定の実施形態において、本明細書で提供される組込み方法は、生成物を産生する代謝経路の酵素をコードする２つ以上の異種ヌクレオチド配列の発現の釣り合いをとることによって、代謝フラックスを最適化し、高い生成物のタイターを達成するのに使用することができる。例えば、図８に関して上述したように、標準化された相同配列を有するプロモーターライブラリーを利用することにより代謝フラックスを最適化して、バイオマスおよび目的の最終生成物の産生の釣り合いをとることができる。さらに、本方法は、１つの宿主細胞シャーシ中の複数のランディングパッドに組み込まれた最適化された経路コンポーネントを含むＤＮＡアセンブリを、第２の宿主細胞シャーシ中の類似のランディングパッドに移すことを可能にする。望ましい遺伝子型を操作するのに必要なラウンド数を低減することによって、代謝経路を最適化する構築のペースが実質的に増加する。
５．５．１．イソプレノイド経路の操作
[00195] 一部の実施形態において、本明細書で提供される方法は、操作された宿主細胞の生成物プロファイルを改変するために、生合成経路の１つまたは複数のコンポーネントを同時に導入する、置き換える、または適正量を決定するのに利用することができる。一部の実施形態において、生合成経路は、イソプレノイド経路である。
[00196] テルペンは、多くの生物で産生される炭化水素の大分類である。テルペンが化学的に改変されると（例えば、炭素骨格の酸化または転位を介して）、得られた化合物は、一般的にテルペノイドと称され、これはまた、イソプレノイドとしても公知である。イソプレノイドは、例えば、電子伝達鎖におけるキノンとして、タンパク質プレニル化を介した細胞内の標的化および制御における膜のコンポーネントとして、カロチノイド、クロロフィルなどの光合成色素として、ホルモンおよび補因子として、ならびに様々なモノテルペン、セスキテルペン、およびジテルペンを含む植物防御化合物として、多くの重要な生物学的な役割を果たす。それらは、抗生物質、ホルモン、抗がん薬、防虫剤、および化学物質として工業的に有用である。
[00197] テルペンは、イソプレン単位（Ｃ５Ｈ８）を連結することによって誘導され、存在するイソプレン単位の数によって分類される。ヘミテルペンは、単一のイソプレン単位からなる。イソプレンそれ自体が、唯一のヘミテルペンと考えられている。モノテルペンは、２つのイソプレン単位で作られており、分子式Ｃ１０Ｈ１６を有する。モノテルペンの例は、ゲラニオール、リモネン、およびテルピネオールである。セスキテルペンは、３つのイソプレン単位で構成され、分子式Ｃ１５Ｈ２４を有する。セスキテルペンの例は、ファルネセンおよびファルネソールである。ジテルペンは、４つのイソプレン単位で作られており、分子式Ｃ２０Ｈ３２を有する。ジテルペンの例は、カフェストール、カーウェオール、センブレン、およびタキサジエンである。セスタテルペンは、５つのイソプレン単位で作られており、分子式Ｃ２５Ｈ４０を有する。セスタテルペンの例は、ゲラニルファルネソールである。トリテルペンは、６つのイソプレン単位からなり、分子式Ｃ３０Ｈ４８を有する。テトラテルペンは、８つのイソプレン単位を含有し、分子式Ｃ４０Ｈ６４を有する。生物学的に重要なテトラテルペンとしては、非環式リコピン、単環式ガンマ−カロテン、および二環式アルファおよびベータ−カロテンが挙げられる。ポリテルペンは、多くのイソプレン単位の長鎖からなる。天然ゴムは、二重結合がｃｉｓであるポリイソプレンからなる。
[00198] テルペンは、ピロリン酸イソペンテニル（イソペンテニル二リン酸またはIPP）およびその異性体であるジメチルアリルピロリン酸（ジメチルアリル二リン酸またはDMAPP）の縮合を介して生合成される。ＩＰＰおよびＤＭＡＰＰを生成する２つの経路、すなわち真核生物のメバロン酸依存性（MEV）経路（図１３）、および原核生物のメバロン酸非依存性またはデオキシキシルロース-５-リン酸（DXP）経路が公知である。植物は、ＭＥＶ経路およびＤＸＰ経路の両方を使用する。順にＩＰＰおよびＤＭＡＰＰが、プレニル二リン酸シンターゼ（例えば、それぞれＧＰＰシンターゼ、ＦＰＰシンターゼ、およびＧＧＰＰシンターゼ）の作用を介して、ポリプレニル二リン酸（例えば、ゲラニル二リン酸またはＧＰＰ、ファルネシル二リン酸またはＦＰＰ、およびゲラニルゲラニル二リン酸またはGGPP）に縮合される。ポリプレニル二リン酸中間体は、テルペンシンターゼによってより複雑なイソプレノイド構造に変換される。
[00199] テルペンシンターゼは、複数の生成物を形成する大きい遺伝子ファミリーに組織化されている。テルペンシンターゼの例としては、ＧＰＰをモノテルペンに変換するモノテルペンシンターゼ；ＧＧＰＰをジテルペンに変換するジテルペンシンターゼ；およびＦＰＰをセスキテルペンに変換するセスキテルペンシンターゼが挙げられる。セスキテルペンシンターゼの例は、ＦＰＰをファルネセンに変換するファルネセンシンターゼである。テルペンシンターゼは、代謝の分岐点で作動し、細胞により産生されるイソプレノイドのタイプを指図するため、イソプレノイドへの経路フラックスの制御において重要である。さらに、テルペンシンターゼは、このようなテルペンの高収量の産生の鍵を握っている。したがって、異種イソプレノイド産生のために操作された宿主における経路フラックスを改善する１つの戦略は、テルペンシンターゼをコードする核酸の複数のコピーを導入することである。例えば、ファルネセンなどのセスキテルペンの産生が望ましいＭＥＶ経路を含む操作された微生物において、セスキテルペンシンターゼ、例えばファルネセンシンターゼが経路の末端酵素として利用され、ファルネセン産生に最適化された株の生成のために、ファルネセンシンターゼ遺伝子の複数のコピーが宿主細胞に導入されてもよい。
[00200] あらゆるイソプレノイドの生合成がプレニル二リン酸シンターゼおよびテルペンシンターゼ上流の同じ経路コンポーネントを頼るため、これらの経路コンポーネントは、宿主「プラットフォーム」株中に一旦操作により作製されたら、あらゆるセスキテルペンの産生に利用することができ、セスキテルペンのアイデンティティは、宿主細胞に導入された特定のセスキテルペンシンターゼによって決定することができる。さらに、異なるイソプレン単位を有するテルペンの産生、例えばセスキテルペンの代わりにモノテルペンの産生が望ましい場合、それでもなお経路の上流コンポーネントを利用しながら、異なるテルペンを産生するようにプレニル二リン酸シンターゼとテルペンシンターゼの両方を置き換えることができる。
[00201] したがって、本明細書で提供される方法および組成物は、望ましいイソプレノイドおよび／またはイソプレノイド産生レベルの強化がもたらされるように、イソプレノイド産生経路、例えばＭＥＶ経路を含む宿主細胞を効率的に改変するのに利用することができる。一部の実施形態において、宿主細胞は、ＭＥＶ経路を含み、本明細書で提供される同時の複数の組込みの方法は、宿主細胞のテルペン生成物プロファイルを定義するためにプレニル二リン酸シンターゼおよび／またはテルペンシンターゼの複数のコピーを同時に導入するのに利用することができる。一部の実施形態において、プレニル二リン酸シンターゼは、ＧＰＰシンターゼであり、テルペンシンターゼは、モノテルペンシンターゼである。一部の実施形態において、プレニル二リン酸シンターゼは、ＦＰＰシンターゼであり、テルペンシンターゼは、セスキテルペンシンターゼである。一部の実施形態において、プレニル二リン酸シンターゼは、ＧＧＰＰシンターゼであり、テルペンシンターゼは、ジテルペンシンターゼである。他の実施形態において、宿主細胞は、ＭＥＶ経路、ならびに第１のタイプのテルペン、例えばファルネセンの産生のためのプレニル二リン酸シンターゼおよび／またはテルペンシンターゼを含み、本明細書で提供される同時の複数の組込みの方法は、第２のタイプのテルペン、例えばアモルファジエンを産生するためにプレニル二リン酸シンターゼおよび／またはテルペンシンターゼの１つまたは複数のコピーを同時に置き換えるのに利用することができる。本明細書で提供される方法は、経路コンポーネントの複数のコピーを利用するあらゆる生合成経路の構築および／または改変のために同様に利用することができ、単一の経路コンポーネントの複数のコピーの付加またはスワップによってその生成物プロファイルを容易に改変できる宿主細胞操作することに特に有用である。
５．５．２．生合成経路のためのコンビナトリアルな組込みライブラリーを生成する方法
[00202] 生合成経路が一旦構築されたら、代謝フラックスが最適化されて高い生成物のタイターが達成されるように、全てのコンポーネントの発現レベルを計画する必要がある。フラックスを最適化するための一般的なアプローチとしては、経路コンポーネント遺伝子のアイデンティティを変更すること、遺伝子のコドン最適化、溶解性タグの使用、短縮化または公知の突然変異の使用、および遺伝子の発現コンテクスト（すなわちプロモーターおよびターミネーターの選択）が挙げられる。従来の方法を使用した株構築の過程におけるこの変動性をサンプリングすることは、非現実的に多くの数の株の生成と保管を必要とする。例えば、株のエンジニアが３つの遺伝子座にコンストラクトを組み込むことを計画し、各遺伝子座につき１０個のバリアントを考案したとすれば、コンビナトリアルな多様性を完全にサンプリングするには１，０００個の株の生成が必要になる。経路の遺伝子が協同して働いており、必ずしも全ての代謝産物の中間体を容易にスクリーニングできるとは限らないため、各組込みサイクル後に経路遺伝子の個々の寄与を評価することは、しばしば不可能である。したがって、株のエンジニアは、新規の代謝経路を構築するときに技術者がサンプリングする設計の余地を著しく制限する選択をすることが慣例になっている。
[00203] 最適な経路設計をよりよく同定するために、本明細書で提供されるゲノム改変方法は、外因性ドナー核酸のコンビナトリアルライブラリーを含む株を生成するのに利用することができる。一部の実施形態において、本方法は、宿主細胞のゲノムを、１つまたは複数のヌクレアーゼおよび１つまたは複数のドナーＤＮＡアセンブリ（例えば、コンポーネントポリヌクレオチド）と接触させて、ゲノム中の標準化されたランディングパッドにおけるドナーＤＮＡの複数の同時組込みを容易にすることに頼る。操作された株の多様性をもたらすために、本方法は、宿主株のコンビナトリアルな組込みライブラリーが生成できるように、ドナーＤＮＡのライブラリー、すなわち、１つまたは複数の標準化されたランディングパッドおよび／または標的化されたランディングパッドのための組込みコンストラクトの混合物を共に形質転換することを含む。高い頻度の複数の組込みの達成は、大規模なゲノムの品質管理を要せずとも直接的に生成物に関して得られた株を合理的にスクリーニングできること、さらに、スクリーニング後に、上位の株のアイデンティティを例えばシーケンシングによって決定できることを意味する。この方法は、個々の株生成、品質管理および保管の負担をなくし、技術者が１つの試験管中で多様な組込み組合せを生成して、例えば経路の最終生成物に関するスクリーニングによって最良の性能を示した株を選別することを可能にする。
[00204] したがって、一部の実施形態において、本明細書で提供される宿主細胞のゲノムに複数の外因性核酸を組み込むための方法は、本明細書に記載される１つまたは複数のランディングパッドを含む宿主細胞を複数のライブラリーと接触させる工程を含み、各ライブラリー（L）は、複数の外因性核酸を含み、選択された外因性核酸は、５’から３’方向に、上流ライブラリー配列（UL）、（D）群から選択されるあらゆる目的の核酸、および下流ライブラリー配列（DL）を含み、ここで（UL）および（DL）は、宿主細胞のゲノム中の１つまたは複数のランディングパッドにおける選択された外因性核酸の宿主細胞媒介相同組換えを開始させることが可能であり；さらに（NTS）で切断することが可能なヌクレアーゼ（N）を含み、その結果、前記切断は、ランディングパッドの相同組換えが起こる。
[00205] 一部の実施形態において、各ライブラリー（L）は、共通の生合成経路の酵素をコードする外因性核酸を含む。一部の実施形態において、（D）群は、少なくとも１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６または１０６より多くの固有な目的の核酸を含む。一部の実施形態において、各ライブラリー（L）は、生合成経路の酵素のバリアントをコードする複数の外因性核酸を含む。用語「バリアント」は、本明細書で使用される場合、選択された酵素と比較して異なるヌクレオチドまたはアミノ酸配列を有する生合成経路の酵素を指す。例えば、一部の実施形態において、ライブラリー（L）は、セスキテルペンシンターゼバリアントを含み、選択されたセスキテルペンシンターゼの野生型バージョンと比較して、セスキテルペンシンターゼバリアントは、ヌクレオチドの付加、欠失、および／または置換を含んでいてもよく、このような付加、欠失、および／または置換は、対応するアミノ酸配列に変化をもたらす場合もあるし、またはもたらさない場合もある。他の実施形態において、酵素バリアントは、参照酵素、例えば野生型バージョンと比べてアミノ酸の付加、欠失および／または置換を含む。
[00206] 一部の実施形態において、宿主細胞は、前記接触の前に、生合成経路の１つまたは複数の酵素をコードする１つまたは複数の異種ヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態において、生合成経路の１つまたは複数の酵素をコードする１つまたは複数の異種ヌクレオチド配列は、ランディングパッドにゲノムで組み込まれる。
５．６ヌクレアーゼ
[00207] 本明細書に記載される方法の一部の実施形態において、宿主細胞のゲノムは、ランディングパッド中のヌクレアーゼ標的配列（NTS）で、またはそのすぐ近くで、二本鎖を切断すること、すなわち二本鎖破断を引き起こすことが可能な１つまたは複数のヌクレアーゼと接触させる。一部の実施形態において、二本鎖破断誘導物質は、特異的なポリヌクレオチド認識配列を認識し、および／またはそれに結合して、認識配列で、またはその近くで破断を引き起こすあらゆる物質である。二本鎖破断誘導物質の例としては、これらに限定されないが、エンドヌクレアーゼ、部位特異的リコンビナーゼ、トランスポザーゼ、トポイソメラーゼ、およびジンクフィンガーヌクレアーゼが挙げられ、さらにそれらの改変された誘導体、バリアント、および断片が挙げられる。
[00208] 本明細書に記載される方法の一部の実施形態において、宿主細胞のゲノムは、ランディングパッド内の指定された領域で切断すること、すなわち破断を引き起こすことが可能な１つまたは複数のヌクレアーゼと接触させる。一部の実施形態において、破断は、ヌクレアーゼ標的配列のＤＮＡ鎖の両方ではなく一方が切断される（すなわち、「ニックが入れられる」）一本鎖破断である。一部の実施形態において、破断は、二本鎖破断である。一部の実施形態において、破断誘導物質は、特異的なポリヌクレオチド認識配列を認識し、および／またはそれに結合して、認識配列で、またはその近くで破断を引き起こすあらゆる物質である。破断誘導物質の例としては、これらに限定されないが、エンドヌクレアーゼ、部位特異的リコンビナーゼ、トランスポザーゼ、トポイソメラーゼ、およびジンクフィンガーヌクレアーゼが挙げられ、さらにそれらの改変された誘導体、バリアント、および断片が挙げられる。
[00209] 一部の実施形態において、１つまたは複数のヌクレアーゼの各々は、選択されたヌクレアーゼ標的配列（NTS）内の指定された領域で破断を引き起こすことが可能である。一部の実施形態において、ヌクレアーゼは、ランディングパッド中の（NTS）の５’領域と３’領域との間に位置する領域で破断を引き起こすことが可能である。他の実施形態において、ヌクレアーゼは、（NTS）の５’および３’領域の上流または下流に位置する領域で破断を引き起こすことが可能である。
[00210] ヌクレアーゼ標的配列（NTS）は、破断誘導物質を特異的に認識し、および／またはそれと結合するあらゆるポリヌクレオチド配列である認識配列を含む。認識部位配列の長さは、様々であってもよく、例えば、少なくとも１０、１２、１４、１６、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０ヌクレオチドまたはそれより長い長さを有する配列が挙げられる。
[00211] 一部の実施形態において、認識配列は、パリンドロームであり、すなわち１つの鎖の配列が相補鎖で逆方向で同じに読める。一部の実施形態において、ニック／切断部位は、認識配列内である。他の実施形態において、ニック／切断部位は、認識配列の外側である。一部の実施形態において、切断は、平滑末端を生じる。他の実施形態において、切断は、一本鎖オーバーハング、すなわち「付着末端」を生じ、これは、５’オーバーハング、または３’オーバーハングのいずれであってもよい。
[00212] 一部の実施形態において、ランディングパッド内の認識配列は、宿主細胞のゲノムにとって内因性であってもよいし、または外因性であってもよい。認識部位が内因性配列である場合、認識部位は、天然に存在する、またはネイティブの破断誘導物質によって認識される認識配列であり得る。代替として、内因性認識部位は、内因性認識配列を特異的に認識して破断をもたらすように設計または選択された、改変または操作された破断誘導物質によって認識され、および／またはそれと結合することができる。一部の実施形態において、改変された破断誘導物質は、ネイティブの天然に存在する破断誘導物質から誘導される。他の実施形態において、改変された破断誘導物質は、人工的に作り出されるかまたは合成される。このような改変または操作された破断誘導物質を選択するための方法は、当業界において公知である。例えば、タンパク質のアミノ酸配列バリアントは、ＤＮＡ中の突然変異によって調製することができる。変異誘発およびヌクレオチド配列の変更のための方法としては、例えば、Kunkel, (1985) Proc Natl Acad Sci USA 82:488-92; Kunkel, et al., (1987) Meth Enzymol 154:367-82; 米国特許第４，８７３，１９２号；Walker and Gaastra,eds.(1983)Techniques in Molecular Biology（MacMillan Publishing Company、New York）およびそこで引用された文献が挙げられる。タンパク質の生物活性に影響を与える可能性が低いアミノ酸置換に関する指針は、例えば、Dayhoff,et al.(1978)Atlas of Protein Sequence and Structure（Natl Biomed Res Found、Washington, D.C.）のモデルで見出される。保存的置換、例えば１つのアミノ酸を類似の特性を有する別のアミノ酸でスワップすることが好ましい場合がある。保存的な欠失、挿入、およびアミノ酸置換は、タンパク質の特徴における大幅な変化を引き起こすことが予期されず、あらゆる置換、欠失、挿入、またはそれらの組合せの作用は、慣例的なスクリーニングアッセイによって評価することができる。二本鎖破断を誘導する活性に関するアッセイが公知であり、一般的には、認識部位を含有するＤＮＡ基質に対するそのような物質の全体的な活性および特異性を測定するものである。
５．６．１．クラスター化された規則的に間隔があいた短いパリンドロームの反復（CRISPR；Clustered Regulatory Interspaced Short Palindromic Repeats）
[00213] 本明細書で提供される方法の一部の実施形態において、ヌクレアーゼは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ由来のＲＮＡガイドエンドヌクレアーゼである。ＣＲＩＳＰＲは、タイプＩＩの原核性ＣＲＩＳＰＲ（クラスター化された規則的に散在した短いパリンドロームの反復）適応免疫系に基づくゲノム編集ツールである。真正細菌および古細菌におけるＣＲＩＳＰＲ系は、外から侵入してきたＤＮＡを標的化し切断するのに小型ＲＮＡおよびＣＲＩＳＰＲ関連（Cas）エンドヌクレアーゼを使用する。Bhaya et al.,Annu Rev Genet 45:273-297(2011);Terns et al.,Curr Opin Microbiol 14(3):321-327(2011);およびWiedenheft et al.,Nature 482(7385):331-338を参照されたい。細菌において、ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座は、スペーサーと呼ばれる外因性ＤＮＡ（長さ約３０ｂｐ）のセグメントによって分離した一連の反復で構成されている。反復−スペーサーアレイは長い前駆体として転写され、反復配列内でプロセシングされて、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼによって切断された標的配列を特定する小型ｃｒＲＮＡ（プロトスペーサーとしても公知）を生成する。次いでＣＲＩＳＰＲスペーサーを使用して、ＲＮＡまたはＤＮＡレベルで外因性遺伝学的エレメントを認識しサイレンシングする。切断には、プロトスペーサー隣接モチーフ（PAM）として公知の標的領域の３’末端のすぐ下流にある配列モチーフが必須である。ＰＡＭは、標的ＤＮＡ中に存在するが、それを標的化するｃｒＲＮＡには存在しない。
[00214] 最も簡単なＣＲＩＳＰＲ系の１つは、化膿性連鎖球菌（Streptococcus pyognes）由来のタイプＩＩ ＣＲＩＳＰＲ系である。ＣＲＩＳＰＲ関連Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼおよび２つの小型ＲＮＡ、標的相補的ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（crRNA）；およびトランス作用性ｃｒＲＮＡ（tracrRNA）が、外来ＤＮＡのＲＮＡガイド切断にとって十分である。Ｃａｓ９タンパク質は、タイプＩＩ ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系の特徴的なタンパク質であり、これは、ＲｕｖＣおよびＨＮＨヌクレアーゼに相同な２つのヌクレアーゼドメインを含有する大きい単量体ＤＮＡヌクレアーゼである。Ｃａｓ９は、ＰＡＭ（プロトスペーサー隣接モチーフ）配列モチーフに隣接するＤＮＡ標的配列にｃｒＲＮＡ：ｔｒａｃｒＲＮＡ複合体によってガイドされる。ｔｒａｃｒＲＮＡへの成熟ｃｒＲＮＡ塩基対は、Ｃａｓ９を標的ＤＮＡに方向付ける２つのＲＮＡ構造を形成する。ｃｒＲＮＡガイド配列に相補的な部位で、Ｃａｓ９ＨＮＨヌクレアーゼドメインは相補鎖を切断し、それに対してＣａｓ９ＲｕｖＣ様ドメインは非相補鎖を切断し、結果として標的ＤＮＡにおいて二本鎖破断が生じる。例えば、Deltcheva et al.,Nature 47(7340):602-607(2011)を参照されたい。
[00215] 近年の研究によれば、Ｃａｓ９をガイドしてインビトロで部位特異的ＤＮＡ二本鎖破断を導入するためのゲノム編集ツールとして、ｃｒＲＮＡ：ｔｒａｃｒＲＮＡ複合体を模擬する単一のガイドＲＮＡ（gRNA）キメラが、Ｃａｓ９と共に利用できることが示されている。標的ゲノム内の切断の特異性は、ネイティブのｃｒＲＮＡ：ｔｒａｃｒＲＮＡ複合体を模擬するキメラガイドＲＮＡ分子（gRNA）のスペーサー様の部分によって決定される。したがって、機能的なＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系における最小限の数のコンポーネントは、２つ、すなわちＣａｓ９およびｓｇＲＮＡである。その５’末端に配置されたｓｇＲＮＡガイド配列は、ＤＮＡ標的特異性を付与する。それゆえに、ガイド配列を改変することによって、異なる標的特異性を有するｓｇＲＮＡを作り出すことが可能になる。ガイド配列の標準的な長さは、２０ｂｐである。結果として、ＤＮＡ標的も、２０ｂｐとそれに続くコンセンサスＮＧＧであり、それに続いてＰＡＭ配列が存在する。この改変されたＣＲＩＳＰＲ系の使用は、インビトロで（例えば、Jinek et al., Science 337(6096):816-821 (2012)参照）、哺乳類細胞株において（例えば、Mali et al., Science 339(6121):823-826 (2013), Jinek et al., Elife 2:e00417 (2013); Cong et al., Science 339(6121):819-823 (2013); and Cho et al., Nat Biotechnol 31(3):230-232 (2013) 参照）、細菌において（例えば、Jiang et al., Nat Biotechnol 31(3):233-239 (2013); and Gasiunas et al., Proc Natl Acad Sci USA 109(39):E2579-E2586. (2012) 参照）、酵母において（例えば、DiCarlo et al., Nucleic Acid Res 41(7):4336-4343 (2013)参照)、ゼブラフィッシュにおいて（例えば、Hwang et al., Nat Biotechnol 31(3):227-229 (2013)；およびChang et al., Cell Res 23(4):465-472 (2013) 参照）、マウスにおいて（例えば、Wang et al., Cell 153(4):910-918 (2013) 参照）および植物において（例えば、Belhaj et al., Plant Methods 9:39 (2013) 参照）実証されている。
[00216] Ｃａｓ９ヌクレアーゼは、（１）異種宿主内での発現を増加させるためのコドン最適化；（２）適した区画化のための核局在化シグナル（NLS）への融合；および（３）ヌクレアーゼを鎖特異的ニッカーゼに変換するためのＨＮＨまたはＲｕｖＣドメインのいずれかの部位特異的変異誘発によって改変することができる。ＲｕｖＣまたはＨＮＨ−モチーフのいずれかにおけるＣａｓ９の部位特異的変異誘発は鎖切断特異性を示したことから、野生型エンドヌクレアーゼに加えて２つの鎖に特異的なニッカーゼが提供され、ＤＮＡの標的化された一本鎖破断を可能にする。例えば、Jinek et al., Science 337(6096):816-821 (2012)および Gasiunas et al., Proc Natl Acad Sci USA 109(39):E2579-E2586. (2012)を参照されたい。ジンクフィンガーヌクレアーゼおよびＴＡＬＥＮに関して報告されているように、１つの鎖のみを破断するニッカーゼとして機能するようにヌクレアーゼを改変することは、オフターゲット切断による毒性を低減し、さらに非ＨＲメカニズム、例えば、ＮＨＥＪを介した破断修復速度も低くすることができる。例えば、Jinek et al., Science 337(6096):816-821 (2012)参照。
[00217] 当業界において公知のあらゆるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系は、本明細書で提供される方法および組成物におけるヌクレアーゼとして用途がある。高度に多様なＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系は、３つの主要なタイプに類別され、これはさらにコアエレメント含量および配列に基づき１０のサブタイプに分割される（例えば、Makarova et al., Nat Rev Microbiol 9:467-77 (2011)参照）。外来核酸のｃｒＲＮＡ媒介サイレンシングに関与する核タンパク質複合体の構造的な構成および機能は、個々のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓタイプ間で異なっている（Wiedenheft et al., Nature 482:331-338 (2012)参照）。タイプｌ−Ｅ系において、大腸菌（Escherichia coli）によって例示されるように、ｃｒＲＮＡは、カスケードと呼ばれるマルチサブユニットエフェクター複合体（抗ウイルス性防御のためのＣＲＩＳＰＲ関連複合体）に取り込まれ（Brouns et al., Science 321: 960-4 (2008)）、これが標的ＤＮＡに結合して、シグネチャーＣａｓ３タンパク質による分解を引き起こす（Sinkunas et al., EMBO J 30:1335^2 (2011); Beloglazova et al., EMBO J 30:616-27 (2011)）。スルフォロブス・ソルファタリカス（Sulfolobus solfataricus）およびパイロコッカス・フリオサス（Pyrococcus furiosus）のタイプＩＩＩのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系において、Ｃａｓ ＲＡＭＰモジュール（Cmr）およびｃｒＲＮＡ複合体は、インビトロで合成ＲＮＡを認識してそれを切断するが（Hale et al., Mol Cell 45:292-302 (2012); Zhang et al., Mol Cell, 45:303-13 (2012)）、スタフィロコッカス・エピデルミディス（Staphylococcus epidermidis）のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系は、インビボでＤＮＡを標的化する（Marraffini & Sontheimer, Science. 322:1843-5 (2008)）。タイプＩＩのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系による、より具体的にはストレプトコッカス・サーモフィラス（Streptococcus thermophilus）ＤＧＣＣ７７１０のＣＲＩＳＰＲ３／Ｃａｓ系におけるＤＮＡサイレンシングに関与するＲＮＰ複合体（Horvath & Barrangou, Science 327:167-70 (2010)）は、１２個の反復−スペーサー単位の上流に配置される４つのｃａｓ遺伝子：ｃａｓ９、ｃａｓｌ、ｃａｓ２、およびｃｓｎ２からなる。Ｃａｓ９（以前の名称はcas5またはcsnl）は、タイプＩＩ系のシグネチャー遺伝子である（Makarova et al., Nat Rev Microbiol 9:467-77 (2011)）。
[00218] 本明細書で提供される方法および組成物において用途があるＣＲＩＳＰＲ系としてはさらに、その内容が本明細書にその全体として取り込まれる国際公報番号ＷＯ２０１３／１４２５７８Ａ１およびＷＯ２０１３／０９８２４４Ａ１に記載されるものも挙げられる。
５．６．２．転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（TALEN）
[00219] 本明細書で提供される方法の一部の実施形態において、ヌクレアーゼの１種または複数は、ＴＡＬ−エフェクターＤＮＡ結合ドメイン−ヌクレアーゼ融合タンパク質（TALEN）である。キサントモナス属における植物病原菌のＴＡＬエフェクターは、宿主ＤＮＡと結合してエフェクター特異的な宿主遺伝子を活性化することによって、疾患において重要な役割を果たすか、または防御を引き起こす。例えば、Gu et al. (2005) Nature 435:1122-5; Yang et al., (2006) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 103:10503-8; Kay et al., (2007) Science 318:648-51; Sugio et al., (2007) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 104:10720-5; Romer et al., (2007) Science 318:645-8; Boch et al., (2009) Science 326(5959):1509-12;およびMoscou and Bogdanove, (2009) 326(5959):1501参照。ＴＡＬエフェクターは、１つまたは複数のタンデムリピートドメインを介して配列特異的な方式でＤＮＡと相互作用するＤＮＡ結合ドメインを含む。繰り返しの配列は、典型的には３４アミノ酸を含み、リピートは、典型的には互いに９１〜１００％相同である。リピートの多型は通常、１２および１３位に配置され、１２および１３位における反復可変二残基（repeat variable-diresidue）のアイデンティティと、ＴＡＬ−エフェクターの標的配列における隣接するヌクレオチドのアイデンティティとが１対１で対応すると考えられる。
[00220] ＴＡＬ−エフェクターＤＮＡ結合ドメインは、望ましい標的配列に結合し、例えばタイプＩＩ制限エンドヌクレアーゼからのヌクレアーゼドメイン、典型的にはＦｏｋＩなどのタイプＩＩ制限エンドヌクレアーゼからの非特異的切断ドメインに融合するように操作することができる（例えば、Kim et al. (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:1156-1160参照）。他の有用なエンドヌクレアーゼとしては、例えば、ＨｈａＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ、Ｎｏｄ、ＢｂｖＣＩ、ＥｃｏＲＩ、ＢｇｌＩおよびＡｌｗＩが挙げられる。したがって、好ましい実施形態において、ＴＡＬＥＮは、組み合わされて、ＴＡＬＥＮが特異的なヌクレオチド配列内またはそれに隣接する標的ＤＮＡを切断するように標的ＤＮＡ配列中の特異的なヌクレオチド配列に結合する複数のＴＡＬエフェクターリピート配列を含むＴＡＬエフェクタードメインを含む。本明細書で提供される方法に有用なＴＡＬＥＮＳとしては、ＷＯ１０／０７９４３０および米国特許公開公報第２０１１／０１４５９４０号に記載されるものが挙げられる。
[00221] 一部の実施形態において、標的ＤＮＡ内の特異的なヌクレオチド配列に結合するＴＡＬエフェクタードメインは、１０個以上のＤＮＡ結合リピート、好ましくは１５個以上のＤＮＡ結合リピートを含んでいてもよい。一部の実施形態において、各ＤＮＡ結合リピートは、標的ＤＮＡ配列中の塩基対の認識を決定する反復可変二残基（RVD）を含み、この場合、各ＤＮＡ結合リピートは、標的ＤＮＡ配列中の１つの塩基対を認識することに関与し、ＲＶＤは、Ｃを認識するためのＨＤ；Ｔを認識するためのＮＧ；Ａを認識するためのＮＩ；ＧまたはＡを認識するためのＮＮ；ＡまたはＣまたはＧまたはＴを認識するためのＮＳ；ＣまたはＴを認識するためのＮ＊、ここで、＊は、ＲＶＤの第２の位置におけるギャップである；Ｔを認識するためのＨＧ；Ｔを認識するためのＨ＊、ここで、＊は、ＲＶＤの第２の位置におけるギャップである；Ｔを認識するためのＩＧ；Ｇを認識するためのＮＫ；Ｃを認識するためのＨＡ；Ｃを認識するためのＮＤ；Ｃを認識するためのＨＩ；Ｇを認識するためのＨＮ；Ｇを認識するためのＮＡ；ＧまたはＡを認識するためのＳＮ；およびＴを認識するためのＹＧの１つまたは複数を含む。本明細書で提供される方法の一部の実施形態において、ヌクレアーゼの１種または複数は、部位特異的リコンビナーゼである。部位特異的リコンビナーゼは、リコンビナーゼとも称され、これは、その適合性を有する組換え部位間の保存的部位特異的組換えを触媒するポリペプチドであり、ネイティブのポリペプチドに加えて、活性を保持する誘導体、バリアントおよび／または断片、ならびにネイティブのポリヌクレオチド、活性を保持するリコンビナーゼをコードする誘導体、バリアントおよび／または断片を包含する。部位特異的リコンビナーゼおよびその認識部位の総論に関しては、Sauer(1994)Curr Op Biotechnol 5:521-7;およびSadowski、(1993) FASEB 7:760-7を参照されたい。一部の実施形態において、リコンビナーゼは、セリンリコンビナーゼまたはチロシンリコンビナーゼである。一部の実施形態において、リコンビナーゼは、インテグラーゼまたはレゾルバーゼファミリー由来である。一部の実施形態において、リコンビナーゼは、ＦＬＰ、Ｃｒｅ、ラムダインテグラーゼ、およびＲからなる群から選択されるインテグラーゼである。インテグラーゼファミリーの他のメンバーに関しては、例えば、Esposito, et al., (1997) Nucleic Acids Res 25:3605-14およびAbremski, et al., (1992) Protein Eng 5:87-91を参照されたい。反応速度、補因子相互作用および必要条件、発現、最適条件、ならびに／または認識部位特異性、ならびにリコンビナーゼおよびバリアントの活性に関するスクリーニングを改変するための方法は公知であり、例えば、Miller,et al.,(1980)Cell 20:721-9;Lange-Gustafson and Nash,(1984)J Biol Chem 259:12724-32;Christ,et al.,(1998)J Mol Biol 288:825-36;Lorbach,et al.,(2000)J Mol Biol 296:1175-81;Vergunst,et al.,(2000)Science 290:979-82;Dorgai,et al.,(1995)J Mol Biol 252:178-88;Dorgai,et al.,(1998)J Mol Biol 277:1059-70;Yagu,et al.,(1995)J Mol Biol 252:163-7;Sclimente,et al.,(2001)Nucleic Acids Res 29:5044-51;Santoro and Schultze,(2002)Proc Natl Acad Sci USA 99:4185-90;Buchholz and Stewart,(2001)Nat Biotechnol 19:1047-52;Voziyanov,et al.,(2002)Nucleic Acids Res 30:1656-63;Voziyanov,et al.,(2003)J Mol Biol 326:65-76;Klippel,et al.,(1988)EMBO J 7:3983-9;Arnold,et al.,(1999)EMBO J 18:1407-14;ＷＯ０３／０８０４５；ＷＯ９９／２５８４０；およびＷＯ９９／２５８４１を参照されたい。認識部位は、約３０ヌクレオチドの最小の部位から数百ヌクレオチドまでの範囲である。天然に存在する部位、およびバリアントなどのリコンビナーゼのためのあらゆる認識部位を使用することができる。バリアント認識部位は公知であり、例えば、Hoess, et al., (1986) Nucleic Acids Res 14:2287-300; Albert, et al., (1995) Plant J 7:649-59; Thomson, et al., (2003) Genesis 36:162-7; Huang, et al., (1991) Nucleic Acids Res 19:443-8; Siebler and Bode, (1997) Biochemistry 36:1740-7; Schlake and Bode, (1994) Biochemistry 33:12746-51; Thygarajan, et al., (2001) Mol Cell Biol 21:3926-34; Umlauf and Cox, (1988) EMBO J 7:1845-52; Lee and Saito, (1998) Gene 216:55-65; ＷＯ０１／２３５４５；ＷＯ９９／２５８２１；ＷＯ９９／２５８５１；ＷＯ０１／１１０５８；ＷＯ０１／０７５７２および米国特許第５，８８８，７３２号を参照されたい。
[00222] 本明細書で提供される方法の一部の実施形態において、ヌクレアーゼの１種または複数は、トランスポザーゼである。トランスポザーゼは、ゲノム中の１つの配置から別の配置へのトランスポゾンの転移を媒介するポリペプチドである。トランスポザーゼは、典型的には、二本鎖破断を誘導して、トランスポゾンを切り出し、末端近くのリピートを認識し、切り出されトランスポゾンの末端を一緒にするが、一部の系では、転移中に末端を一緒にするのに他のタンパク質も必要である。トランスポゾンおよびトランスポザーゼの例としては、これらに限定されないが、トウモロコシ由来のＡｃ／Ｄｓ、Ｄｔ／ｒｄｔ、Ｍｕ−Ｍ１／ＭｎおよびＳｐｍ（Ｅｎ）／ｄＳｐｍエレメント、キンギョソウ由来のＴａｍエレメント、バクテリオファージ由来のＭｕトランスポゾン、細菌トランスポゾン（Tn）および挿入配列（IS）、酵母のＴｙエレメント（レトロトランスポゾン）、シロイヌナズナ由来のＴａ１エレメント（レトロトランスポゾン）、ショウジョウバエ由来のＰエレメントトランスポゾン（Gloor, et al., (1991) Science 253:1110-1117）、ショウジョウバエ由来のＣｏｐｉａ、ＭａｒｉｎｅｒおよびＭｉｎｏｓエレメント、イエバエ由来のＨｅｒｍｅｓエレメント、イラクサギンウワバ（Trichplusia ni）由来のＰｉｇｇｙＢａｃｋエレメント、Ｃ．エレガンス（C. elegans）由来のＴｃ１エレメント、およびマウス由来のＩＡＰエレメント（レトロトランスポゾン）が挙げられる。
５．６．３．ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ZFN）
[00223] 本明細書で提供される方法の一部の実施形態において、ヌクレアーゼの１つまたは複数は、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ZFN）である。ＺＦＮは、ジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメインおよび破断誘導物質ドメインで構成される操作された破断誘導物質である。操作されたＺＦＮは、２つのジンクフィンガーアレイ（ZFA）からなり、それらの各々は、二量体化されると活性になるＦｏｋＩ酵素由来のヌクレアーゼドメインなどの非特異的なエンドヌクレアーゼの単一のサブユニットに融合している。典型的には、単一のＺＦＡは、３または４つのジンクフィンガードメインからなり、それらの各々は、特異的なヌクレオチドの三つ組み（GGC、GATなど）を認識するように設計されている。したがって、２つの「３フィンガー」ＺＦＡで構成されるＺＦＮは、１８塩基対の標的部位を認識することが可能である。１８塩基対の認識配列は、一般的に、ヒトや植物のゲノムなどの大きいゲノム内であっても固有である。２つのＦｏｋＩヌクレアーゼ単量体の共局在化および二量体化を方向付けることによって、ＺＦＮは、標的化された遺伝子座におけるＤＮＡで破断を作り出す機能的な部位特異的エンドヌクレアーゼを生成する。
[00224] 有用なジンクフィンガーヌクレアーゼとしては、公知のもの、および本明細書に記載される１種または複数のヌクレアーゼ標的配列（NTS）に特異性を有するように操作されたものが挙げられる。ジンクフィンガードメインは、例えば宿主細胞のゲノムの標的部位内の選択されたポリヌクレオチド認識配列に特異的に結合するポリペプチドを設計するのに適している。ＺＦＮは、非特異的なエンドヌクレアーゼドメイン、例えばＨＯまたはＦｏｋＩなどのタイプＩＩエンドヌクレアーゼ由来のヌクレアーゼドメインに連結された、操作されたＤＮＡ結合ジンクフィンガードメインからなる。代替として、操作されたジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメインは、ＤＮＡニック導入／切断活性を保持する他の破断誘導物質またはその誘導体に融合していてもよい。例えば、このタイプの融合は、破断誘導物質を異なる標的部位に方向付ける、ニックまたは切断部位の配置を変更する、誘導物質をより短い標的部位に方向付ける、または誘導物質をより長い標的部位に方向付けるのに使用することができる。一部の例において、ジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメインは、部位特異的リコンビナーゼ、トランスポザーゼ、またはＤＮＡニック導入および／または切断活性を保持するその誘導体に融合していてもよい。追加の官能基が、ジンクフィンガー結合ドメイン、例えば転写活性化因子ドメイン、転写リプレッサードメイン、およびメチラーゼなどに融合していてもよい。一部の実施形態において、ヌクレアーゼドメインの二量体化が、切断活性に必要である。
[00225] 各ジンクフィンガーは、標的ＤＮＡ中の３つの連続した塩基対を認識する。例えば、３フィンガードメインは、ヌクレアーゼの二量体化の要件を満たした場合に９つの隣接したヌクレオチドの配列を認識したが、１８ヌクレオチドの認識配列と結合するには、２セットのジンクフィンガー三つ組みが使用される。有用なデザイナージンクフィンガーモジュールとしては、様々なＧＮＮおよびＡＮＮ三つ組みを認識するもの（Dreier, et al., (2001) J Biol Chem 276:29466-78; Dreier, et al., (2000) J Mol Biol 303:489-502; Liu, et al., (2002) J Biol Chem 277:3850-6), as well as those that recognize various CNN or TNN triplets (Dreier, et al., (2005) J Biol Chem 280:35588-97; Jamieson, et al., (2003) Nature Rev Drug Discov 2:361-8). See also, Durai, et al., (2005) Nucleic Acids Res 33:5978-90; Segal, (2002) Methods 26:76-83; Porteus and Carroll, (2005) Nat Biotechnol 23:967-73; Pabo, et al., (2001) Ann Rev Biochem 70:313-40; Wolfe, et al., (2000) Ann Rev Biophys Biomol Struct 29:183-212; Segal and Barbas, (2001) Curr Opin Biotechnol 12:632-7; Segal, et al., (2003) Biochemistry 42:2137-48; Beerli and Barbas, (2002) Nat Biotechnol 20:135-41; Carroll, et al., (2006) Nature Protocols 1:1329; Ordiz, et al., (2002) Proc Natl Acad Sci USA 99:13290-5; Guan, et al., (2002) Proc Natl Acad Sci USA 99:13296-301;ＷＯ２００２０９９０８４；ＷＯ００／４２２１９；ＷＯ０２／４２４５９；ＷＯ２００３０６２４５５；ＵＳ２００３００５９７６７；米国特許出願公開番号２００３／０１０８８８０；米国特許第６，１４０，４６６号、第６，５１１，８０８号および第６，４５３，２４２号が挙げられる。有用なジンクフィンガーヌクレアーゼとしてはまた、ＷＯ０３／０８０８０９；ＷＯ０５／０１４７９１；ＷＯ０５／０８４１９０；ＷＯ０８／０２１２０７；ＷＯ０９／０４２１８６；ＷＯ０９／０５４９８５；およびＷＯ１０／０６５１２３に記載されるものも挙げられる。
５．６．４．エンドヌクレアーゼ
[00226] 本明細書で提供される方法の一部の実施形態において、ヌクレアーゼの１つまたは複数は、エンドヌクレアーゼである。エンドヌクレアーゼは、ポリヌクレオチド鎖内のホスホジエステル結合を切断する酵素であり、塩基を損傷することなく特異的な部位としてＤＮＡを切断する制限エンドヌクレアーゼが挙げられる。制限エンドヌクレアーゼは、タイプＩ、タイプＩＩ、タイプＩＩＩ、およびタイプＩＶエンドヌクレアーゼを包含し、これらはさらに、サブタイプを包含する。制限エンドヌクレアーゼは、例えばＲＥＢＡＳＥデータベース（rebase.neb.comのウェブページ；Roberts, et al., (2003) Nucleic Acids Res 31:418-20), Roberts, et al., (2003) Nucleic Acids Res 31:1805-12, and Belfort, et al., (2002) in Mobile DNA II, pp. 761-783, Eds. Craigie, et al., ASM Press, Washington, D.C.でさらに説明され分類されている。
[00227] 本明細書で使用される場合、エンドヌクレアーゼはまた、制限エンドヌクレアーゼと同様に、特異的な認識配列と結合し切断するホーミングエンドヌクレアーゼも包含する。しかしながら、ホーミングエンドヌクレアーゼの認識部位は、典型的にはより長く、例えば約１８ｂｐまたはそれより長い。ホーミングエンドヌクレアーゼは、メガヌクレアーゼとしても公知であり、保存された配列モチーフに基づき以下のファミリー：ＬＡＧＬＩＤＡＤＧ（配列番号：１）ホーミングエンドヌクレアーゼ、ＨＮＨホーミングエンドヌクレアーゼ、Ｈｉｓ−Ｃｙｓボックスホーミングエンドヌクレアーゼ、ＧＩＹ−ＹＩＧ（配列番号２）ホーミングエンドヌクレアーゼ、およびシアノバクテリアのホーミングエンドヌクレアーゼに分類されている。例えば、Stoddard,Quarterly Review of Biophysics 38(1):49-95(2006)を参照されたい。これらのファミリーは、それらの保存されたヌクレアーゼ活性部位のコアモチーフおよび触媒メカニズム、生物学的およびゲノム分布、ならびに非ホーミングヌクレアーゼ系とのより広い関係において大きく異なっている。例えば、Guhan and Muniyappa (2003) Crit Rev Biochem Mol Biol 38:199-248; Lucas, et al., (2001) Nucleic Acids Res 29:960-9; Jurica and Stoddard, (1999) Cell Mol Life Sci 55:1304-26; Stoddard, (2006) Q Rev Biophys 38:49-95;およびMoure, et al., (2002) Nat Struct Biol 9:764を参照されたい。これらのファミリー由来の有用な特異的ホーミングエンドヌクレアーゼの例としては、これらに限定されないが、Ｉ−ＣｒｅＩ（Rochaix et al., Nucleic Acids Res. 13: 975-984 (1985)参照）、Ｉ−ＭｓｏＩ（Lucas et al., Nucleic Acids Res. 29: 960-969 (2001)参照）、Ｉ−ＳｃｅＩ（Foury et al., FEBS Lett. 440: 325-331 (1998)参照）、Ｉ−ＳｃｅＩＶ（Moran et al., Nucleic Acids Res. 20: 4069-4076 (1992)参照）、Ｈ−ＤｒｅＩ（Chevalier et al., Mol. Cell 10: 895-905 (2002)参照）、Ｉ−ＨｍｕＩ（Goodrich-Blair et al., Cell 63: 417-424 (1990); Goodrich-Blair et al., Cell 84: 211-221 (1996)参照）、Ｉ−ＰｐｏＩ（Muscarella et al., Mol. Cell. Biol. 10: 3386-3396 (1990)参照）、Ｉ−ＤｉｒＩ（Johansen et al., Cell 76: 725-734 (1994); Johansen, Nucleic Acids Res. 21: 4405 (1993)参照）、Ｉ−ＮｊａＩ（Elde et al., Eur. J. Biochem. 259: 281-288 (1999); De Jonckheere et al., J. Eukaryot. Microbiol. 41: 457-463 (1994)参照）、Ｉ−ＮａｎＩ（Elde et al., S. Eur. J. Biochem. 259: 281-288 (1999); De Jonckheere et al., J. Eukaryot. Microbiol. 41: 457-463 (1994)参照）、Ｉ−ＮｉｔＩ（De Jonckheere et al., J. Eukaryot. Microbiol. 41: 457-463 (1994); Elde et al., Eur. J. Biochem. 259: 281-288 (1999)参照）、Ｉ−ＴｅｖＩ（Chu et al., Cell 45: 157-166 (1986)参照）、Ｉ−ＴｅｖＩＩ（Tomaschewski et al., Nucleic Acids Res. 15: 3632-3633 (1987)参照）、Ｉ−ＴｅｖＩＩＩ（Eddy et al., Genes Dev. 5: 1032-1041 (1991)参照）、Ｆ−ＴｅｖＩ（Fujisawa et al., Nucleic Acids Res. 13: 7473-7481 (1985)参照）、Ｆ−ＴｅｖＩＩ（Kadyrov et al., Dokl. Biochem. 339: 145-147 (1994); Kaliman, Nucleic Acids Res. 18: 4277 (1990)参照）、Ｆ−ＣｐｈＩ（Zeng et al., Curr. Biol. 19: 218-222 (2009)参照）、ＰＩ−ＭｇａＩ（Saves et al., Nucleic Acids Res. 29:4310-4318 (2001)参照）、Ｉ−ＣｓｍＩ（Colleaux et al., Mol. Gen. Genet. 223:288-296 (1990)参照）、Ｉ−ＣｅｕＩ（Turmel et al., J .Mol. Biol. 218: 293-311 (1991)参照）およびＰＩ−ＳｃｅＩ（Hirata et al., J. Biol. Chem. 265: 6726-6733 (1990)参照）が挙げられる。
[00228] 本明細書に記載される方法の一部の実施形態において、ホーミングエンドヌクレアーゼの天然に存在するバリアントおよび／または操作された誘導体が使用される。反応速度、補因子相互作用、発現、最適条件、および／または認識部位特異性、ならびに活性にするスクリーニングを改変するための方法は公知であり、例えば、Epinat, et al., (2003) Nucleic Acids Res 31:2952-62; Chevalier, et al., (2002) Mol Cell 10:895-905; Gimble, et al., (2003) Mol Biol 334:993-1008; Seligman, et al., (2002) Nucleic Acids Res 30:3870-9; Sussman, et al., (2004) J Mol Biol 342:31-41; Rosen, et al., (2006) Nucleic Acids Res 34:4791-800; Chames, et al., (2005) Nucleic Acids Res 33:e178; Smith, et al., (2006) Nucleic Acids Res 34:e149; Gruen, et al., (2002) Nucleic Acids Res 30:e29; Chen and Zhao, (2005) Nucleic Acids Res 33:e154; ＷＯ２００５１０５９８９；ＷＯ２００３０７８６１９；ＷＯ２００６０９７８５４；ＷＯ２００６０９７８５３；ＷＯ２００６０９７７８４；およびＷＯ２００４０３１３４６参照。有用なホーミングエンドヌクレアーゼは、ＷＯ０４／０６７７３６；ＷＯ０４／０６７７５３；ＷＯ０６／０９７７８４；ＷＯ０６／０９７８５３；ＷＯ０６／０９７８５４；ＷＯ０７／０３４２６２；ＷＯ０７／０４９０９５；ＷＯ０７／０４９１５６；ＷＯ０７／０５７７８１；ＷＯ０７／０６０４９５；ＷＯ０８／１５２５２４；ＷＯ０９／００１１５９；ＷＯ０９／０９５７４２；ＷＯ０９／０９５７９３；ＷＯ１０／００１１８９；ＷＯ１０／０１５８９９；およびＷＯ１０／０４６７８６に記載のものも含む。
[00229] 二本鎖破断誘導物質としてあらゆるホーミングエンドヌクレアーゼを使用することができ、これらに限定されないが、Ｈ−ＤｒｅＩ、Ｉ−ＳｃｅＩ、Ｉ−ＳｃｅＩＩ、Ｉ−ＳｃｅＩＩＩ、Ｉ−ＳｃｅＩＶ、Ｉ−ＳｃｅＶ、Ｉ−ＳｃｅＶＩ、Ｉ−ＳｃｅＶＩＩ、Ｉ−ＣｅｕＩ、Ｉ−ＣｅｕＡＩＩＰ、Ｉ−ＣｒｅＩ、Ｉ−ＣｒｅｐｓｂＩＰ、Ｉ−ＣｒｅｐｓｂＩＩＰ、Ｉ−ＣｒｅｐｓｂＩＩＩＰ、Ｉ−ＣｒｅｐｓｂＩＶＰ、Ｉ−ＴｌｉＩ、Ｉ−ＰｐｏＩ、Ｐｉ−ＰｓｐＩ、Ｆ−ＳｃｅＩ、Ｆ−ＳｃｅＩＩ、Ｆ−ＳｕｖＩ、Ｆ−ＣｐｈＩ、Ｆ−ＴｅｖＩ、Ｆ−ＴｅｖＩＩ、Ｉ−ＡｍａＩ、Ｉ−ＡｎｉＩ、Ｉ−ＣｈｕＩ、Ｉ−ＣｍｏｅＩ、Ｉ−ＣｐａＩ、Ｉ−ＣｐａＩＩ、Ｉ−ＣｓｍＩ、Ｉ−ＣｖｕＩ、Ｉ−ＣｖｕＡＩＰ、Ｉ−ＤｄｉＩ、Ｉ−ＤｄｉＩＩ、Ｉ−ＤｉｒＩ、Ｉ−ＤｍｏＩ、Ｉ−ＨｍｕＩ、Ｉ−ＨｍｕＩＩ、Ｉ−ＨｓＮＩＰ、Ｉ−ＬｌａＩ、Ｉ−ＭｓｏＩ、Ｉ−ＮａａＩ、Ｉ−ＮａｎＩ、Ｉ−ＮｃｌＩＰ、Ｉ−ＮｇｒＩＰ、Ｉ−ＮｉｔＩ、Ｉ−ＮｊａＩ、Ｉ−Ｎｓｐ２３６ＩＰ、Ｉ−ＰａｋＩ、Ｉ−ＰｂｏＩＰ、Ｉ−ＰｃｕＩＰ、Ｉ−ＰｃｕＡＩ、Ｉ−ＰｃｕＶＩ、Ｉ−ＰｇｒＩＰ、Ｉ−ＰｏｂＩＰ、Ｉ−ＰｏｒＩ、Ｉ−ＰｏｒＩＩＰ、Ｉ−ＰｂｐＩＰ、Ｉ−ＳｐＢｅｔａＩＰ、Ｉ−ＳｃａＩ、Ｉ−ＳｅｘＩＰ、Ｉ−ＳｎｅＩＰ、Ｉ−ＳｐｏｍＩ、Ｉ−ＳｐｏｍＣＰ、Ｉ−ＳｐｏｍＩＰ、Ｉ−ＳｐｏｍＩＩＰ、Ｉ−ＳｑｕＩＰ、Ｉ−Ｓｓｐ６８０３１、Ｉ−ＳｔｈＰｈｉＪＰ、Ｉ−ＳｔｈＰｈｉＳＴ３Ｐ、Ｉ−ＳｔｈＰｈｉＳＴｅ３ｂＰ、Ｉ−ＴｄｅＩＰ、Ｉ−ＴｅｖＩ、Ｉ−ＴｅｖＩＩ、Ｉ−ＴｅｖＩＩＩ、Ｉ−ＵａｒＡＰ、Ｉ−ＵａｒＨＧＰＡＩＰ、Ｉ−ＵａｒＨＧＰＡ１３Ｐ、Ｉ−ＶｉｎＩＰ、Ｉ−ＺｂｉＩＰ、ＰＩ−ＭｇａＩ、ＰＩ−ＭｔｕＩ、ＰＩ−ＭｔｕＨＩＰ、ＰＩ−ＭｔｕＨＩＩＰ、ＰＩ−ＰｆｕＩ、ＰＩ−ＰｆｕＩＩ、ＰＩ−ＰｋｏＩ、ＰＩ−ＰｋｏＩＩ、ＰＩ−Ｒｍａ４３８１２ＩＰ、ＰＩ−ＳｐＢｅｔａＩＰ、ＰＩ−ＳｃｅＩ、ＰＩ−ＴｆｕＩ、ＰＩ−ＴｆｕＩＩ、ＰＩ−ＴｈｙＩ、ＰＩ−ＴｌｉＩまたはＰＩ−ＴｌｉＩＩまたはそれらのあらゆるバリアントもしくは誘導体などが挙げられる。
[00230] 一部の実施形態において、エンドヌクレアーゼは、ネイティブのまたは内因性の認識配列と結合する。他の実施形態において、エンドヌクレアーゼは、非ネイティブのまたは外因性の認識配列と結合し、ネイティブのまたは内因性の認識配列と結合しない改変されたエンドヌクレアーゼである。
５．６．５．ランディングパッド中のヌクレアーゼ標的配列
[00231] 本明細書で提供される方法において、ランディングパッド中のヌクレアーゼ標的配列の近くまたはその内で二本鎖破断を引き起こすことが可能なヌクレアーゼが、宿主細胞に導入されると、それにより切断部位で、またはその近くで相同組換えの頻度が大きく増加する。好ましい実施形態において、ヌクレアーゼの認識配列を含むヌクレアーゼ標的配列（NTS）は、ランディングパッドでのみ宿主細胞のゲノム中に存在し、それによってヌクレアーゼによるあらゆるオフターゲットのゲノム結合および切断が最小化される。
[00232] 利用しようとするヌクレアーゼがＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ由来のＲＮＡガイドエンドヌクレアーゼである場合、最適なヌクレアーゼ標的配列は、使用される特定のＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓエンドヌクレアーゼの標的認識の必要条件に従って選択してもよい。例えばＣａｓ９標的認識は、標的ＤＮＡ中の「プロトスペーサー」配列とｃｒＲＮＡ中の残りのスペーサー配列との間で相補性が検出されたときに起こる。Ｃａｓ９は、３’末端に正しいプロトスペーサー隣接モチーフ（PAM）も存在する場合だけＤＮＡを切断する。異なるタイプＩＩ系は、異なるＰＡＭ必要条件を有する。Ｓ．ピオゲネス（S. pyogenes）系は、ＮＧＧ配列を必要とし、式中Ｎはあらゆるヌクレオチドであり得る。Ｓ．サーモフィラスタイプＩＩ系は、ＮＧＧＮＧおよびＮＮＡＧＡＡＷをそれぞれ必要とするが、異なるＳ．ミュータンス系はＮＧＧまたはＮＡＡＲを許容する。遺伝子情報科学分析により、新しいＰＡＭを同定し、ＣＲＩＳＰＲ標的可能な配列のセットを拡張するのに役立つ可能性がある、様々な細菌におけるＣＲＩＳＰＲ遺伝子座の大規模データベースが生成した。例えば、Rho et al., PLoS Genet. 8, e1002441 (2012); and D. T. Pride et al., Genome Res. 21, 126 (2011)参照。Ｓ．サーモフィラスにおいて、Ｃａｓ９は、プロトスペーサーの３ｂｐ上流に平滑末端化された二本鎖破断を生成するが、これは、Ｃａｓ９タンパク質中の２つの触媒ドメイン：ＤＮＡの相補鎖を切断するＨＮＨドメインおよび非相補鎖を切断するＲｕｖＣ様ドメインにより媒介されるプロセスである。
[00233] 利用しようとするヌクレアーゼがジンクフィンガーヌクレアーゼである場合、最適なヌクレアーゼ標的配列は、多数の公共的に利用可能なオンラインリソースを使用して選択してもよい。例えば、その全体が参照により組み入れられるReyon et al.,BMC Genomics 12:83(2011)を参照されたい。例えば、オリゴマー化プール工学（Oligomerized Pool Engineering；OPEN）は、高い特異性およびインビボにおける官能性を有するジンクフィンガーアレイを操作するための高度にロバストな公共的に利用可能なプロトコールであり、植物、ゼブラフィッシュ、およびヒトの体細胞および多能性幹細胞において効率的に機能するＺＦＮを生成するのにうまく使用されてきた。ＯＰＥＮは、事前に構築された候補ＺＦＡのランダム化されたプールをスクリーニングして、望ましい標的配列に高い親和性および特異性を有するものを同定する選択ベースの方法である。ＺＦＮＧｅｎｏｍｅは、ＯＰＥＮによって生成したＺＦＮの可能性がある標的部位を同定し可視化するためのＧＢｒｏｗｓｅベースのツールである。ＺＦＮＧｅｎｏｍｅは、モデル生物のシーケンシングされ注釈が付けられたゲノムにおける可能性があるＺＦＮ標的部位の要約を提供する。現在のところＺＦＮＧｅｎｏｍｅは、７つのモデル生物；Ｓ．セレビシエ、コナミドリムシ（C. reinhardtii）、シロイスナズナ（A. thaliana）、キイロショウジョウバエ（D. melanogaster）、ゼブラフィッシュ（D. rerio）、Ｃ．エレガンス、およびホモサピエンス（H. sapiens）の完全にシーケンシングされたゲノム内にマッピングされた合計で１１.６０万種を超える可能性があるＺＦＮ標的部位を包含する。近い将来、追加のモデル生物、３つの植物種、Ｇｌｙｃｉｎｅ ｍａｘ（ダイズ）、Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ（イネ）、Ｚｅａ ｍａｙｓ（トウモロコシ）、および３つの動物種、Ｔｒｉｂｏｌｉｕｍ ｃａｓｔａｎｅｕｍ（コクヌストモドキ）、Ｍｕｓ ｍｕｓｃｕｌｕｓ（マウス）、Ｒａｔｔｕｓ ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ（ドブネズミ）などが追加されると予想される。ＺＦＮＧｅｎｏｍｅは、転写開始部位に対するその染色体の配置および位置などの各々の可能性があるＺＦＮ標的部位に関する情報を提供する。使用者は、数々の異なる基準（例えば、遺伝子番号、転写番号、標的部位の配列）を使用してＺＦＮＧｅｎｏｍｅに問い合わせることができる。
[00234] 利用しようとするヌクレアーゼがＴＡＬ−エフェクターヌクレアーゼである場合、一部の実施形態において、最適なヌクレアーゼ標的配列は、その全体が参照により組み入れられるSanjana et al.,Nature Protocols,7:171-192(2012)によって記載された方法に従って選択してもよい。簡単に言えば、ＴＡＬＥＮは、二量体として機能し、左および右ＴＡＬＥＮと称される一対のＴＡＬＥＮはＤＮＡの逆の鎖における配列を標的化する。ＴＡＬＥＮは、ＴＡＬＥＮ ＤＮＡ−結合ドメインおよび単量体のＦｏｋＩ触媒ドメインの融合体として操作により作製される。ＦｏｋＩの二量体化を容易にするために、左および右ＴＡＬＥＮ標的部位が、およそ１４〜２０塩基の間隔をあけて選ばれる。それゆえに、一対のＴＡＬＥＮの場合、各々の標的化される２０ｂｐの配列、すなわち最適な標的部位は、５’−ＴＮ１９Ｎ１４−２０Ｎ１９Ａ−３’の形態を有することになり、ここで左ＴＡＬＥＮは５’−ＴＮ１９−３’を標的化し、右ＴＡＬＥＮは５’−Ｎ１９Ａ−３’のアンチセンス鎖（N=A、G、TまたはC）を標的化する。
[00235] 本明細書で提供される方法の他の実施形態において、ヌクレアーゼ標的配列は、宿主細胞にとって外因性である。一部の実施形態において、同じヌクレアーゼ標的配列の複数のコピーが、ランディングパッド中に操作により作製され、それによってヌクレアーゼ標的配列を特異的に認識する単一のヌクレアーゼのみを使用した同時の複数の組込み事象が容易になる。他の実施形態において、複数の異なるヌクレアーゼ標的配列は、異なるランディングパッドで、宿主細胞のゲノム中に操作により作製される。一部の実施形態において、操作により作製されたランディングパッドは、他の状況では宿主細胞のネイティブのゲノム中に提示されない標的ヌクレアーゼ配列を含む。例えば、ホーミングエンドヌクレアーゼは、通常イントロンまたはインテイン中に埋め込まれている大きい認識部位（１２〜４０ｂｐ）を標的化し、したがって、それらの認識部位は、極めてまれであり、これらの部位は哺乳類サイズのゲノム中に全く存在しないかまたはわずかしか存在しない。したがって、一部の実施形態において、外因性ヌクレアーゼ標的配列は、ホーミングエンドヌクレアーゼの認識配列である。一部の実施形態において、ホーミングヌクレアーゼは、Ｈ−ＤｒｅＩ、Ｉ−ＳｃｅＩ、Ｉ−ＳｃｅＩＩ、Ｉ−ＳｃｅＩＩＩ、Ｉ−ＳｃｅＩＶ、Ｉ−ＳｃｅＶ、Ｉ−ＳｃｅＶＩ、Ｉ−ＳｃｅＶＩＩ、Ｉ−ＣｅｕＩ、Ｉ−ＣｅｕＡＩＩＰ、Ｉ−ＣｒｅＩ、Ｉ−ＣｒｅｐｓｂＩＰ、Ｉ−ＣｒｅｐｓｂＩＩＰ、Ｉ−ＣｒｅｐｓｂＩＩＩＰ、Ｉ−ＣｒｅｐｓｂＩＶＰ、Ｉ−ＴｌｉＩ、Ｉ−ＰｐｏＩ、Ｐｉ−ＰｓｐＩ、Ｆ−ＳｃｅＩ、Ｆ−ＳｃｅＩＩ、Ｆ−ＳｕｖＩ、Ｆ−ＣｐｈＩ、Ｆ−ＴｅｖＩ、Ｆ−ＴｅｖＩＩ、Ｉ−ＡｍａＩ、Ｉ−ＡｎｉＩ、Ｉ−ＣｈｕＩ、Ｉ−ＣｍｏｅＩ、Ｉ−ＣｐａＩ、Ｉ−ＣｐａＩＩ、Ｉ−ＣｓｍＩ、Ｉ−ＣｖｕＩ、Ｉ−ＣｖｕＡＩＰ、Ｉ−ＤｄｉＩ、Ｉ−ＤｄｉＩＩ、Ｉ−ＤｉｒＩ、Ｉ−ＤｍｏＩ、Ｉ−ＨｍｕＩ、Ｉ−ＨｍｕＩＩ、Ｉ−ＨｓＮＩＰ、Ｉ−ＬｌａＩ、Ｉ−ＭｓｏＩ、Ｉ−ＮａａＩ、Ｉ−ＮａｎＩ、Ｉ−ＮｃｌＩＰ、Ｉ−ＮｇｒＩＰ、Ｉ−ＮｉｔＩ、Ｉ−ＮｊａＩ、Ｉ−Ｎｓｐ２３６ＩＰ、Ｉ−ＰａｋＩ、Ｉ−ＰｂｏＩＰ、Ｉ−ＰｃｕＩＰ、Ｉ−ＰｃｕＡＩ、Ｉ−ＰｃｕＶＩ、Ｉ−ＰｇｒＩＰ、Ｉ−ＰｏｂＩＰ、Ｉ−ＰｏｒＩ、Ｉ−ＰｏｒＩＩＰ、Ｉ−ＰｂｐＩＰ、Ｉ−ＳｐＢｅｔａＩＰ、Ｉ−ＳｃａＩ、Ｉ−ＳｅｘＩＰ、Ｉ−ＳｎｅＩＰ、Ｉ−ＳｐｏｍＩ、Ｉ−ＳｐｏｍＣＰ、Ｉ−ＳｐｏｍＩＰ、Ｉ−ＳｐｏｍＩＩＰ、Ｉ−ＳｑｕＩＰ、Ｉ−Ｓｓｐ６８０３１、Ｉ−ＳｔｈＰｈｉＪＰ、Ｉ−ＳｔｈＰｈｉＳＴ３Ｐ、Ｉ−ＳｔｈＰｈｉＳＴｅ３ｂＰ、Ｉ−ＴｄｅＩＰ、Ｉ−ＴｅｖＩ、Ｉ−ＴｅｖＩＩ、Ｉ−ＴｅｖＩＩＩ、Ｉ−ＵａｒＡＰ、Ｉ−ＵａｒＨＧＰＡＩＰ、Ｉ−ＵａｒＨＧＰＡ１３Ｐ、Ｉ−ＶｉｎＩＰ、Ｉ−ＺｂｉＩＰ、ＰＩ−ＭｇａＩ、ＰＩ−ＭｔｕＩ、ＰＩ−ＭｔｕＨＩＰ、ＰＩ−ＭｔｕＨＩＩＰ、ＰＩ−ＰｆｕＩ、ＰＩ−ＰｆｕＩＩ、ＰＩ−ＰｋｏＩ、ＰＩ−ＰｋｏＩＩ、ＰＩ−Ｒｍａ４３８１２ＩＰ、ＰＩ−ＳｐＢｅｔａＩＰ、ＰＩ−ＳｃｅＩ、ＰＩ−ＴｆｕＩ、ＰＩ−ＴｆｕＩＩ、ＰＩ−ＴｈｙＩ、ＰＩ−ＴｌｉＩもしくはＰＩ−ＴｌｉＩＩ、またはそれらのあらゆるバリアントもしくは誘導体からなる群から選択される。特定の実施形態において、外因性ゲノムヌクレアーゼ標的配列は、Ｉ−ＳｃｅＩ、ＶＤＥ（ＰＩ−ＳｃｅＩ）、Ｆ−ＣｐｈＩ、ＰＩ−ＭｇａＩまたはＰＩ−ＭｔｕＩＩの認識配列であり、これらの各々を以下に提供する。
Figure 2019516378
５．６．６．送達
[00236] 一部の実施形態において、本明細書に記載される方法に有用な１つまたは複数のヌクレアーゼは、精製されたタンパク質として宿主細胞に提供される、例えば送達される。他の実施形態において、１つまたは複数のヌクレアーゼは、ヌクレアーゼをコードする核酸を含むポリヌクレオチドを介して提供される。他の実施形態において、１つまたは複数のヌクレアーゼは、宿主の細胞核中で直接翻訳することができる精製されたＲＮＡとして宿主細胞に導入される。
[00237] ある特定の実施形態において、組込みポリヌクレオチド、上述したようにヌクレアーゼもしくは精製されたヌクレアーゼタンパク質をコードするポリヌクレオチド、またはそれらの任意の組合せが、当業界において公知の細胞に外因性タンパク質および／または核酸を導入するためのあらゆる従来の技術を使用して宿主細胞に導入することができる。このような方法としては、これらに限定されないが、溶液からの細胞による分子の直接的な取り込み、または例えば、リポソームまたはイムノリポソームを使用したリポフェクションを介して促進された取り込み；粒子媒介トランスフェクションなどが挙げられる。例えば、米国特許第５，２７２，０６５号；Goeddel et al.,eds,1990,Methods in Enzymology,vol.185,Academic Press,Inc.,CA; Krieger,1990,Gene Transfer and Expression--A Laboratory Manual,Stockton Press,NY;Sambrook et al.,1989,Molecular Cloning--A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory,NY;およびAusubel et al.,eds.,Current Edition,Current Protocols in Molecular Biology,Greene Publishing Associates and Wiley Interscience,NYを参照されたい。細胞を形質転換するための特定の方法は当業界において周知である。Hinnen et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 75:1292-3(1978);Cregg et al.,Mol.Cell.Biol.5:3376-3385(1985)を参照されたい。例示的な技術としては、これらに限定されないが、スフェロプラスト化、エレクトロポレーション、ＰＥＧ１０００媒介形質転換、および酢酸リチウムまたは塩化リチウム媒介形質転換が挙げられる。
[00238] 一部の実施形態において、宿主細胞、特定には、それ以外の状況で従来の技術を使用して形質転換／トランスフェクトすることが難しい宿主細胞、例えば植物に、組込みポリヌクレオチド、ヌクレアーゼ、精製されたヌクレアーゼタンパク質をコードするポリヌクレオチド、またはそれらの任意の組合せを導入するのに、遺伝子銃が利用される。遺伝子銃は、形質転換反応物を顕微鏡レベルの金粒子に結合させ、次いで圧縮ガスを使用して標的細胞に粒子を押し出すことによって作用する。
[00239] 一部の実施形態において、ヌクレアーゼをコードする核酸を含むポリヌクレオチドは、宿主細胞内でヌクレアーゼの発現を可能にする発現ベクターである。好適な発現ベクターとしては、これらに限定されないが、大腸菌、酵母、または哺乳類細胞における遺伝子発現での使用に関して公知のものが挙げられる。大腸菌発現ベクターの例としては、これらに限定されないが、ｐＳＣＭ５２５、ｐＤＩＣ７３、ｐＳＣＭ３５１およｐＳＣＭ３５３が挙げられる。酵母発現ベクターの例としては、これらに限定されないが、ｐＰＥＸ７およびｐＰＥＸ４０８が挙げられる。好適な発現ベクターの他の例としては、ＣＥＮ．ＡＲＳ配列および酵母選択可能マーカーを含むシャトルベクターの酵母−大腸菌のｐＲＳシリーズ；および２μプラスミドが挙げられる。一部の実施形態において、ヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチドは、天然に存在するポリヌクレオチド配列と比較して宿主細胞中でより高い使用頻度を有するコドンで置換されるように改変されていてもよい。例えばヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチドは、天然に存在するポリヌクレオチド配列と比較してＳ．セレビシエ中でより高い使用頻度を有するコドンで置換されるように改変されていてもよい。
[00240] ヌクレアーゼが各単量体の別々の発現を必要とするヘテロ二量体として機能する一部の実施形態において、ジンクフィンガーヌクレアーゼおよびＴＡＬ−エフェクターヌクレアーゼの場合と同様に、ヘテロ二量体の各単量体は、同じ発現プラスミドから発現されてもよいし、または異なるプラスミドから発現されてもよい。異なる標的部位で二本鎖破断を行うために複数のヌクレアーゼが細胞に導入される実施形態において、ヌクレアーゼは、単一のプラスミドにコードされてもよいし、または別個のプラスミドにコードされてもよい。
[00241] ある特定の実施形態において、ヌクレアーゼ発現ベクターは、発現ベクターを含む宿主細胞の選択を可能にする選択可能マーカーをさらに含む。このような選択は、十分な量のヌクレアーゼの発現が、例えば、１２、２４、３６、４８、６０、７２、８４、９６時間、または９６時間より長い期間にわたり起こるのに必要な期間、宿主細胞中にベクターを保持するために有用である場合があり、その後、宿主細胞を、発現ベクターが保持されなくなる条件下で増殖させてもよい。ある特定の実施形態において、選択可能マーカーは、ＵＲＡ３、ハイグロマイシンＢホスホトランスフェラーゼ、アミノグリコシドホスホトランスフェラーゼ、ゼオシン耐性、およびホスフィノトリシンＮ−アセチルトランスフェラーゼからなる群から選択される。一部の実施形態において、ヌクレアーゼ発現ベクターは、１つまたは複数のドナー核酸分子の組込み後に発現ベクターを含有しない宿主細胞の選択を可能にする対抗選択可能なマーカー（counter-selectable marker）を含んでいてもよい。使用されるヌクレアーゼ発現ベクターはまた、選択マーカーを有さない一過性のベクターであってもよいし、または選択されないベクターである。特定の実施形態において、一過性のヌクレアーゼ発現ベクターを含む宿主細胞の後代は、時間経過に伴いベクターを失う。
[00242] ある特定の実施形態において、発現ベクターは、ヌクレアーゼをコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結した転写終結配列およびプロモーターをさらに含む。一部の実施形態において、プロモーターは、構成的プロモーターである。一部の実施形態において、プロモーターは、誘導性プロモーターである。酵母細胞で使用するのに好適なプロモーターの説明に役立つ例としては、これらに限定されないが、Ｋ．ラクティス（K. lactis）のＴＥＦ１遺伝子のプロモーター、サッカロマイセス・セレビシエのＰＧＫ１遺伝子のプロモーター、サッカロマイセス・セレビシエのＴＤＨ３遺伝子のプロモーター、抑制性プロモーター、例えば、サッカロマイセス・セレビシエのＣＴＲ３遺伝子のプロモーター、および誘導性プロモーター、例えば、サッカロマイセス・セレビシエのガラクトース誘導性プロモーター（例えば、ＧＡＬ１、ＧＡＬ７およびＧＡＬ１０遺伝子のプロモーター）が挙げられる。
[00243] 一部の実施形態において、核局在化配列（NLS）を含む追加のヌクレオチド配列が、ヌクレアーゼをコードするヌクレオチド配列の５’に連結される。ＮＬＳは、より大きいヌクレアーゼ（＞２５ｋＤ）の核局在化を容易にすることができる。一部の実施形態において、核局在化配列は、ＳＶ４０核局在化配列である。一部の実施形態において、核局在化配列は、酵母核局在化配列である。
[00244] ヌクレアーゼ発現ベクターは、当業者にとって明白なあらゆる技術によって作製することができる。ある特定の実施形態において、ベクターは、当業界において周知のポリメラーゼ連鎖反応（PCR）および分子クローニング技術を使用して作製される。例えば、PCR Technology: Principles and Applications for DNA Amplification, ed. HA Erlich, Stockton Press, New York, N.Y. (1989); Sambrook et al., 2001, Molecular Cloning - A Laboratory Manual, 3rd edition, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY参照。
５.７ キット
[00245] 別の態様において、本明細書に記載される１つまたは複数の外因性核酸をゲノムで組み込むための方法を実行するのに有用なキットが本明細書で提供される。一部の実施形態において、キットは、
（ａ）宿主細胞のゲノム中に組み込まれた複数の外因性ランディングパッドを含む宿主細胞であって、各外因性ランディングパッドは、上流ランディングパッド相同配列（ULP）と下流ランディングパッド相同配列（DLP）との間に位置するヌクレアーゼ標的配列（NTS）を含む、宿主細胞；
（ｂ）複数の外因性ドナー核酸であって、各外因性ドナー核酸（ES）は、上流ライブラリー配列（UL）と下流ライブラリー配列（DL）との間に位置する目的の核酸（D）を含み、各（UL）は、宿主細胞のゲノム中のランディングパッドの任意の上流ランディングパッド相同配列（ULP）で相同組換えが可能であり、各（DL）は、任意の下流ランディングパッド相同配列（DLP）で相同組換えが可能である、外因性ドナー核酸；および
（ｃ）ランディングパッド中の任意の（NTS）を切断することが可能な、１つまたは複数のヌクレアーゼ（N）
を含む。
[00246] 一部の実施形態において、（D）は、選択可能マーカー、プロモーター、エピトープタグをコードする核酸配列、目的の遺伝子、レポーター遺伝子、終止コドンをコードする核酸配列からなる群から選択される。一部の実施形態において、キットは、複数のプライマー対をさらに含み、各プライマー対は、ＰＣＲによって外因性ドナー核酸の組込みを同定することが可能である。
[00247] 一部の実施形態において、キットは、宿主細胞のいずれかのランディングパッドに１つまたは複数の外因性ドナー核酸を組み込む方法を説明する使用説明書をさらに含む。
６．１ 実施例１：ＣＬｉＸ親株の構築および形質転換
[00248] ＣＬｉＸ（Ｘ−カッターを使用したコンビナトリアルライブラリー組込み）親株を生成するために、エンドヌクレアーゼ認識部位（F-CphI）の端にある「上流ライブラリー」（UL）および「下流ライブラリー」（DL）配列からなるＤＮＡ「ランディングパッド」を、サッカロマイセス・セレビシエＣＥＮ．ＰＫ２の３つの別個のゲノム遺伝子座に組み込んだ。具体的には、ランディングパッドを、ＡＬＧ１（ｉＡＬＧ１）、ＭＧＡ１（ｉＭＧＡ１）およびＹＣＴ１（ｉＹＣＴ１）の下流の遺伝子間領域に標的化した。これらの遺伝子座の各々におけるＤＮＡ組込みが、株表現型に測定可能な影響がないことを事前に確認された。ＵＬおよびＤＬ配列を、５００ｂｐの長さおよび５０％のＧＣ含量の制約でランダムな配列ジェネレーターから誘導した。これらの配列を手作業で選定して、ヌクレオチドおよび翻訳されたＢＬＡＳＴサーチ（それぞれBLASTnおよびBLASTx）に基づき、タンデムおよび逆方向反復配列、ＤＮＡ２次構造、および公知の生物学的な配列に対するあらゆる有意な相同性を除去した。遺伝子座の標的配列を包含する各ランディングパッドのヌクレオチド配列は、配列番号８〜１０として提供される。
[00249] 各ランディングパッドを、最適化した酢酸リチウム（LiAc）形質転換体で、標準的な分子生物学技術を用いてＣＥＮ．ＰＫ２に組み込んだ。簡単に言えば、３０℃で振盪しながら（２００ｒｐｍ）酵母抽出物ペプトンデキストロース（YPD）培地中で細胞を一晩増殖し、ＹＰＤ１００ｍＬ中０．１のＯＤ６００に希釈し、０．６〜０．８のＯＤ６００に増殖させた。各形質転換体につき、培養物５ｍＬを遠心分離によって回収し、滅菌水５ｍＬ中で洗浄し、再度遠沈させ、１００ｍＭのＬｉＡｃ １ｍＬに再懸濁し、マイクロ遠沈管に移した。細胞を３０秒間遠沈させ（１３，０００×ｇ）上清を除去し、細胞を、５０％ＰＥＧ ２４０μＬ、１ＭのＬｉＡｃ ３６μＬ、加熱処理済みサケ精子ＤＮＡ １０μＬ、およびドナーＤＮＡ ７４μＬからなる形質転換ミックス中に再懸濁した。４２℃で４０分間のヒートショック後、細胞をＹＰＤ培地中で一晩回復させ、その後、選択培地上で平板培養した。ランディングパッド組込みを、５’および３’組込み端部を標的化するプライマーを用いたコロニーＰＣＲによって確認した。
６．２ 実施例２：「ロックドプロモーター」および「スプリットプロモーター」設計のゲノム組込みの比較
[00250] 多数の設計バリアントが、ＣＬｉＸ組込みに適合性を有する。「ロックドプロモーター」設計は、ＵＬおよびＤＬ相同性を端部に有する個々のオープンリーディングフレーム（ORF）を駆動する固定されたプロモーターを含有する。「スプリット」設計は、小さい相同な「リンカー」配列において組換えを介して組み合わされた複数のパーツからなる。最も一般的には、１つのパーツは、ＵＬ相同配列、それに続くプロモーターおよびＤＮＡリンカーからなる「スプリットプロモーター」であり、第２のパーツは、ＤＮＡリンカー、オープンリーディングフレーム、およびＤＬ相同配列からなるプロモーターレスＯＲＦである。この設計バリアントを使用して、複数の「スプリットプロモーター」のプールされた形質転換体は、コンビナトリアル的に各ＯＲＦの発現の適正量を決定するのに使用することができる。本発明者らは、スペーサー配列を含有する「スペーサー」コンストラクトと共に蛍光タンパク質（GFP、RFP、およびBFP）をコードするＤＮＡコンストラクトを使用して、ロックドおよびスリットプロモーター設計の両方を試験した。
[00251] ロックドプロモーター設計のために、各蛍光性遺伝子をｐＧＡＬ１プロモーターによって転写し、ＵＬおよびＤＬ相同配列を端部に付して、各ランディングパッドでの組込みを可能にした。「スペーサー」コンストラクトは、ＵＬおよびＤＬ相同性を端部に有する１ｋｂの「スペーサー」配列からなっていた。本発明者らは、等モル量のこれらの４種のコンストラクトを一緒にプールして（ロックドプロモーターＧＦＰ、ＲＦＰ、ＢＦＰ、および「スペーサー」、図１０Ａを参照）、１μｇの総ＤＮＡ濃度にし、ＣＬｉＸ親株を形質転換した。１μｇのＧ４１８耐性Ｆ−ＣｐｈＩエンドヌクレアーゼをコードするプラスミドも形質転換に提供して、各ＣＬｉＸ組込み部位を切断した。形質転換体をＧ４１８を含有する寒天プレート上で平板培養して、ＣｐｈＩを発現し、提供されたドナーＤＮＡで各二本鎖破断を修復した細胞を選択した。Ｇ４１８プレート上でドナーＤＮＡおよびＣｐｈＩを含有するプールされた形質転換体から１００個のコロニーを回収したが、ＣｐｈＩのみを含有する対照形質転換体ではコロニーは存在しなかった。この結果から、ＣｐｈＩは、高い効率で切断し、非相同末端結合（NHEJ）などの修復メカニズムは偽陽性を生じる可能性が低いことが示される。１７６個のコロニーをＢＳＭ培地＋２％スクロースを含有する９６ウェルプレートにピックアップし、３０℃で一晩インキュベートした。翌朝、ＢＳＭ培地＋４％ガラクトースを含有する９６ウェルプレートに継代接種を実行して、ｐＧＡＬ１から発現を誘導した。２４時間のインキュベーション後、各ウェルにつきＧＦＰ、ＲＦＰ、およびＢＦＰ蛍光を測定した。
[00252] スプリット設計のために、本発明者らは、ＧＦＰ、ＲＦＰ、ＢＦＰ、および「スペーサー」配列のためのプロモーターレスＯＲＦと対を形成するための異なる発現強度を有する９種のスプリットプロモーターを構築した（図１０Ｂ）。ｐＧＡＬ１は、試験された最も強いプロモーターであり、これを、単一のＯＲＦ設計との比較を可能にするために提供した。他の８種の試験されたスプリットプロモーターは、ＧＦＰ蛍光で定量化したところ、ｐＧＡＬ１の発現レベルが１％（pSLN1）〜７５％（pGAL1_v20）の範囲であった。全ての１３種のコンストラクトを等モル量で一緒にプールして１μｇの最終濃度にし、Ｆ−ＣｐｈＩと共にＣＬｉＸ親株に形質転換した。上述したようなＢＳＭ培地＋４％ガラクトース中での２４時間のインキュベーション後、５２８個のコロニーをＧＦＰ、ＲＦＰ、およびＢＦＰの蛍光に関して査定した。
[00253] ロックドプロモーター設計のために、各固定プロモーター蛍光性コンストラクトは、コピー数（すなわち、どれだけ多くの回数コンストラクトが３つの利用可能なランディングパッドに組み込まれたか）のみによって変更が可能である。したがって、本発明者らは、各測定ウェルからの蛍光値が０回、１回、２回、および３回組込みに対応する４つの別個の「ビン」に分類されることを観察した。ｐＧＡＬ１＞ＧＦＰ組込みの回数に対応するＧＦＰ蛍光に関する１回、２回、および３回の「ビン」は、図１０Ｃにおいて平行斜線で示されたカラムとしてはっきりと確認できる（より見やすくするために、＜３００ＲＦＵである０回のビンはこのプロットから除去される）。ここで、各蛍光タンパク質でこのパターンが観察されたことに留意されたい。
[00254] スプリット設計のために、各蛍光性コンストラクトは、プロモーター強度（すなわち、スプリットプロモーターがプロモーターレスＯＲＦと組換えされた）およびコピー数において変更が可能である。追加のプロモーターはｐＧＡＬ１より弱いため、本発明者らの懸念は、スプリット設計からの蛍光測定が、各ロックドプロモーター蛍光性コンストラクトの１回、２回、および３回コピー間の間隔に「埋もれる」と予想されることであった。図１０Ｃで観察されたように、スプリットプロモーターのＲＦＵ値（灰色のバー）が実際に拡張された範囲をカバーした。２００ＲＦＵによるビニングによって、ｐＧＡＬ１＞ＧＦＰの０回から３回コピーまでのほぼ全ての発現レベルを単一の形質転換でカバーした。
６．３ 実施例３：ＣＬｉＸ親株を使用したゲノム組込みの効率
[00255] この実施例は、宿主細胞のゲノムにおける標的化された二本鎖破断の誘導後の、Ｓ．セレビシエ宿主の３つの異なるランディングパッドにおける同時組込みを実証する結果を提供する。株Ａ、Ｂ、およびＣは同じＳ．セレビシエ株由来であり、それら全ては、ＡＬＧ１、ＭＧＡ１およびＹＣＴ１の下流の遺伝子間領域に配置された３つのＣＬｉＸランディングパッドを含む。これらの株間の差は、上流および下流ランディングパッド相同配列（UL/DL）の長さである。株ＡにおけるランディングパッドのＵＬおよびＤＬの各々の長さは、５００塩基対であり、株ＢにおけるランディングパッドのＵＬおよびＤＬの各々の長さは、２００塩基対であり、株ＣにおけるランディングパッドのＵＬおよびＤＬの各々の長さは、１００塩基対である。株Ａを「ロックド」ステッチ設計（すなわち、プロモーターに作動可能に連結したGFP）で形質転換し、別の実験で、株Ａを「スプリット」プロモーター設計でも形質転換し、ここで２つの別々のＤＮＡコンストラクトを使用して、実施例２に記載したものと類似したＧＦＰおよび様々な強度の異なるプロモーターを導入した。株Ｂを「スプリット」プロモーター設計のＤＮＡコンストラクトで形質転換した。株Ｃを「スプリット」プロモーター設計のＤＮＡコンストラクトで形質転換した。「ロックド」ステッチ設計または「スプリット」プロモーター設計いずれかの全てのＤＮＡコンストラクトにおいて、相同組換えに使用した上流ライブラリー配列および下流ライブラリー配列の各々は、５００塩基対である。ｃＰＣＲ、蛍光測定、およびサンガーシーケンシングによって組込みを検証した。
[00256] 図１１で示されるように、全ての３つのランディングパッドへの組込みの成功率は９５％より大きかった。
６．４ 実施例４：イソプレノイド産生におけるライブラリーコンポーネントおよびランディングパッドのコンビナトリアルな組込みの性能
[00257] 図１２で例示されているように、３つのコンビナトリアルな「ＣＬｉＸ」ランディングパッドを、イソプレノイド化合物を高いタイターで産生するように操作されたサッカロマイセス・セレビシエＣＥＮ．ＰＫ２株に組み込んだ。形質転換およびランディングパッド組込みのための方法は、実施例１および２に記載されている。ライブラリー組込みのために、ＵＬ相同配列、バーコード配列、「Ｙ」ヌクレアーゼ認識、プロモーター配列、およびリンカー配列からなる６種のコンストラクトを、リンカー配列、オープンリーディングフレーム、「Ｚ」ヌクレアーゼ認識部位、バーコード配列、およびＤＬ相同配列からなる８種のプロモーターレスＯＲＦと対にした。イソプレノイドのタイターを改善すると仮定されたＯＲＦを選んだ。リンカー、ランダムなＤＮＡヌクレオチドからなる「スタッファー」配列、「Ｚ」ヌクレアーゼ認識部位、バーコード配列、およびＤＬ相同配列からなる類似の構造を有する第９のＤＮＡコンストラクトを加えた。このコンストラクトの意図は、このランダムな配列の組込みは株の性能に影響を与えないと予想されるため、１または２つのＯＲＦの組込みを可能にすることであった。
[00258] この１５種のコンストラクトのライブラリーを等モル量で一緒にプールして１μｇの最終濃度にし、Ｆ−ＣｐｈＩをコードするＧ４１８耐性プラスミド１μｇと共に親株に形質転換した。これまでに１．１で説明したようなＬＢ＋Ｇ４１８からなる固体培地上でコロニーを回収した。５７６０個のコロニーを、２％糖と共に最小培地（BSM）を含有する９６ウェルプレートにピックアップした。一晩増殖させた後、４％糖１または６％糖２のいずれかを含有する液状培地に培養物を継代接種した。増殖の３日後、培養物を、ＵＶベースのアッセイを使用してイソプレノイドのタイターに関してアッセイした。比較のために、「親」対照株（３つのランディングパッドを有するが組込みがないイソプレノイド産生株）を提供した。
[00259] 糖１、糖２、または両方の糖（「ヒット」として公知）において改善された性能を有していたライブラリーから４２個の株を選択した。これらの株を、イソプレノイドのタイターに関して複製を増加させて（株１つ当たり１２個の複製）再度アッセイし、親株をＵＶによって変異誘発した別個のライブラリーからの４２個の「ヒット」と比較した。コンビナトリアルライブラリーからの４２個の株のうち３７個は再度、イソプレノイドのタイターに関して親より有意に改善されていた。親からの改善の平均有効サイズまたは規模は変異誘発ライブラリーよりも劇的に増加した。
[00260] 複製を増加させてアッセイした４２個の株を、標準化されたバーコードを使用して遺伝子型解析して、各遺伝子座において組み込まれたプロモーターおよびＯＲＦのアイデンティティを決定した。ＯＲＦ１の場合、転写活性化因子がライブラリーの残りに比べて富化された。Ｐ３は、ライブラリー中の最も弱いプロモーターであるが、これは、組込みの７５％超においてＯＲＦ１と対を形成した。これらの結果から、ＯＲＦ１の過剰発現は、イソプレノイドのタイターを増加させるのに有効な方法であったが、低いレベルで発現された場合のみであったことが示唆された。
[00261] 図１２に示されるこれらの結果は、ライブラリーコンポーネント（例えば、様々な発現強度のプロモーターおよびORF）のコンビナトリアルな組込みが、遺伝子の共発現の最適な釣り合いを決定して標的分子産生を最大にするために、同時に様々な遺伝子の発現の適正量を決定することにおいて有効な手段であることを実証する。ランディングパッドへのライブラリーコンポーネントのコンビナトリアルな組込みはさらに、遺伝子型のより一層多くのバリエーションを生成する、および株につき得られた表現型をさらに改善する利点を提供することができる。
[00262] 本明細書または図面に記載されるあらゆる実施形態からの１つまたは複数の特徴は、本明細書や図面に記載されるあらゆる他の実施形態の１つまたは複数の特徴と、本発明の範囲から逸脱することなく組み合わせることができる。
[00263] 「１つの（ａ）」、「１つの（an）」、または「その（the）」の記載は、具体的にそうではないことが示されない限り、「１つまたは複数」を意味することが意図される。
[00264] 本明細書に引用された全ての公報および特許、出願は、各々個々の公報または特許出願が具体的かつ個々に参照により組み入れられることが示されたのと同様に、参照により本明細書に組み入れられる。特許請求された主題を様々な実施形態に関して説明してきたが、当業者は、様々な改変、置換、省略、および変更がそれらの本質から逸脱することなくなし得ることを理解しているものと予想される。したがって、主題の範囲は、それらの均等物を含め以下の特許請求の範囲によってのみ限定されることが意図される。

Claims (85)

  1. 宿主細胞のゲノムに１つまたは複数の外因性ドナー核酸を組み込むための方法であって、
    （ａ１）または（ａ２）または（ａ３）のいずれか：
    （ａ１）宿主細胞のゲノム中に組み込まれた複数の（x）外因性ランディングパッドを含む宿主細胞であって、各外因性ランディングパッドは、上流ランディングパッド相同配列（ULP）と下流ランディングパッド相同配列（DLP）との間に位置するヌクレアーゼ標的配列（NTS）を含む、宿主細胞を、
    （ｉ）１つまたは複数の外因性ドナー核酸（ES）であって、各（ES）は、上流ライブラリー配列（UL）と下流ライブラリー配列（DL）との間に位置する目的の核酸（D）を含み、各（UL）は、（x）外因性ランディングパッドのいずれかの任意の（ULP）で相同組換えが可能であり、各（DL）は、（x）外因性ランディングパッドのいずれかの任意の（DLP）で相同組換えが可能である、外因性ドナー核酸（ES）
    と接触させる工程；または
    （ａ２）宿主細胞のゲノム中に組み込まれた１つまたは複数の（x）外因性ランディングパッドを含む宿主細胞であって、各外因性ランディングパッドは、上流ランディングパッド相同配列（ULP）と下流ランディングパッド相同配列（DLP）との間に位置するヌクレアーゼ標的配列（NTS）を含む、宿主細胞を、
    （ｉ）１つまたは複数の第１のコンポーネントポリヌクレオチドであって、各第１のコンポーネントポリヌクレオチドは、５’から３’方向に、
    （１）１つまたは複数の（x）外因性ランディングパッドのいずれかの任意の（ULP）と相同組換えが可能な上流ライブラリー配列（UL）；
    （２）第１の目的の核酸、および
    （３）第１のリンカー配列
    を含む、第１のコンポーネントポリヌクレオチド；
    （ｉｉ）１つまたは複数の最後のコンポーネントポリヌクレオチドであって、各最後のコンポーネントポリヌクレオチドは、５’から３’方向に、
    （１）最後のリンカー配列；
    （２）最後の目的の核酸；および
    （３）１つまたは複数の（x）外因性ランディングパッドのいずれかの任意の（DLP）で、相同組換えが可能な下流ライブラリー配列（DL）、
    を含む、最後のコンポーネントポリヌクレオチド
    と接触させる工程であって、
    １つまたは複数の第１のコンポーネントポリヌクレオチドの任意の第１のリンカー配列は、１つまたは複数の最後のコンポーネントポリヌクレオチドの任意の最後のリンカー配列と相同組換えが可能である、工程；または
    （ａ３）宿主細胞のゲノム中に組み込まれた１つまたは複数の（x）外因性ランディングパッドを含む宿主細胞であって、各外因性ランディングパッドは、上流ランディングパッド相同配列（ULP）と下流ランディングパッド相同配列（DLP）との間に位置するヌクレアーゼ標的配列（NTS）を含む、宿主細胞を、
    （ｉ）１つまたは複数の第１のコンポーネントポリヌクレオチドであって、各第１のコンポーネントポリヌクレオチドは、５’から３’方向に、１つまたは複数の（x）外因性ランディングパッドの任意の（ULP）と相同組換えが可能な上流ライブラリー配列（UL）、Ｄ０群から選択される任意のＤＮＡセグメント、リンカー配列ＬＢ０を含む、第１のコンポーネントポリヌクレオチド；
    （ｉｉ）１つまたは複数の中間コンポーネントポリヌクレオチドであって、各中間コンポーネントポリヌクレオチドは、５’から３’方向に、第１のリンカー配列ＬＡｎ、Ｄｎ群から選択される任意のＤＮＡセグメント、第２のリンカー配列ＬＢｎを含み、ｎは、１から中間コンポーネントポリヌクレオチドの数までの整数を表す、中間コンポーネントポリヌクレオチド；および
    （ｉｉｉ）１つまたは複数の最後のコンポーネントポリヌクレオチドであって、各最後のコンポーネントポリヌクレオチドは、５’から３’方向に、リンカー配列ＬＡｍ、Ｄｍ群から選択される任意のＤＮＡセグメント、および１つまたは複数の（x）外因性ランディングパッドの任意の（DLP）と相同組換えが可能な下流ライブラリー配列（DL）を含む、最後のコンポーネントポリヌクレオチド
    と接触させる工程であって、
    各リンカー配列ＬＢ（ｐ−１）は、リンカー配列ＬＡｐと相同組換えが可能であり、ｎは、１〜（ｍ−１）の様々な整数であり、ｐは、１〜ｍの整数を表し、各Ｄ０群、・・・Ｄｎ群、・・・Ｄｍ群、は、独立して、１つまたは複数のＤＮＡセグメントからなる、工程；および
    （ｂ）（NTS）に結合し、１つまたは複数の（x）外因性ランディングパッド内の部位を切断することが可能な、１つまたは複数のヌクレアーゼ（N）；および
    （ｃ）接触させた宿主細胞から生成した宿主細胞を回収する工程；
    を含み、
    （ａ１）について、外因性ドナー核酸（ES）のいずれかは、各ランディングパッド周辺のゲノム配列から独立して、（x）外因性ランディングパッドのいずれかにおいて組み込まれ、ｘは、少なくとも２の整数であり；
    （ａ２）について、１つまたは複数の第１のコンポーネントポリヌクレオチドからの第１のコンポーネントポリヌクレオチドと、１つまたは複数の最後のコンポーネントポリヌクレオチドからの最後のコンポーネントポリヌクレオチドとの任意の組合せが、インビボでそれらのリンカー配列を介して相同組換えされ、該組合せが、各ランディングパッド周辺のゲノム配列から独立して、１つまたは複数の（x）外因性ランディングパッドのいずれかにおいて組み込まれ、ｘは、少なくとも１の整数であり；
    （ａ３）について、１つまたは複数の第１のコンポーネントポリヌクレオチドからの第１のコンポーネントポリヌクレオチド、１つまたは複数の中間コンポーネントポリヌクレオチドからの中間コンポーネントポリヌクレオチド、および１つまたは複数の最後のコンポーネントポリヌクレオチドからの最後のコンポーネントポリヌクレオチドの任意の組合せが、インビボでそれらのリンカー配列を介して相同組換えされ、該組合せが、各ランディングパッド周辺のゲノム配列から独立して、１つまたは複数の（x）外因性ランディングパッドのいずれかにおいて組み込まれ、ｘは、少なくとも１の整数である、方法。
  2. （ａ２）について、１つまたは複数の第１のコンポーネントポリヌクレオチドの各々が、プロモーターを含み、１つまたは複数の最後のコンポーネントポリヌクレオチドの各々が、目的の遺伝子を含む、請求項１に記載の方法。
  3. （ａ１）について、２つ以上の外因性ドナー核酸（ES）が、互いに同一な上流ライブラリー配列（UL）および互いに同一な下流ライブラリー配列（DL）を含み；
    （ａ２）について、２つ以上の第１のコンポーネントポリヌクレオチドが、互いに同一な上流ライブラリー配列（UL）、および互いに同一な第１のリンカー配列を含み；１つまたは複数の最後のコンポーネントポリヌクレオチドが、互いに同一な最後のリンカー配列、および互いに同一な下流ライブラリー配列（DL）を含み；
    （ａ３）について、２つ以上の（two more）第１のコンポーネントポリヌクレオチドが、互いに同一な上流ライブラリー配列（UL）、および互いに同一なリンカー配列ＬＢ０を含み；２つ以上の中間コンポーネントポリヌクレオチドが、互いに同一な第１のリンカー配列ＬＡｎ、および互いに同一な第２のリンカー配列ＬＢｎを含み；２つ以上の最後のコンポーネントポリヌクレオチドが、互いに同一なリンカー配列ＬＡｍ、および互いに同一な下流ライブラリー配列（DL）を含む、請求項１または２に記載の方法。
  4. （ULP）および（DLP）の各々が、約２０ヌクレオチド〜約５，０００ヌクレオチド長、約２５ヌクレオチド〜約１０００ヌクレオチド長、約２５ヌクレオチド〜約５００ヌクレオチド長、または約１００ヌクレオチド〜約５００ヌクレオチド長を含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
  5. （ULP）および（DLP）の各々が、それぞれ（UL）および（DL）の各々と相同性を有する約１００塩基対を含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
  6. （ULP）および（DLP）の各々が、それぞれ（UL）および（DL）の各々と相同性を有する約２００塩基対を含む、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
  7. 各（ULP）および（DLP）が、各々（UL）および（DL）のそれぞれと相同性を有する約５００塩基対を含む、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
  8. （UL）および（DL）の各々が、約５００塩基対を含み、（UL）および（DL）の各々の少なくとも一部が、宿主細胞媒介相同組換えのためにそれぞれ（ULP）および（DLP）に実質的に相同である、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
  9. （ａ１）および（ａ２）を含む、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
  10. （ａ１）および（ａ３）を含む、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
  11. （ａ２）および（ａ３）を含む、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
  12. （ａ１）、（ａ２）および（ａ３）を含む、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
  13. 宿主細胞が、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９または２０個の外因性ランディングパッドを含む、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
  14. １つまたは複数の外因性ランディングパッドが、宿主細胞のゲノム中の選択されたニュートラルな遺伝子座において組み込まれている、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の方法。
  15. １つまたは複数の外因性ランディングパッドが、宿主細胞のゲノム中の遺伝子間領域において組み込まれている、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の方法。
  16. 宿主細胞が、２つ以上の外因性ランディングパッドを含み、各（UL）が、外因性ランディングパッドのいずれかの任意の（ULP）で相同組換えが可能であり、各（DL）が、外因性ランディングパッドのいずれかの任意の（DLP）で相同組換えが可能である、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の方法。
  17. （ES）、コンポーネントポリヌクレオチドの群、または両方が、各外因性ランディングパッド周辺のゲノム配列から独立して、２つ以上のランディングパッドのいずれかにおいて組込みを起こすことが可能である、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の方法。
  18. 宿主細胞が、宿主細胞のゲノム中に組み込まれた少なくとも１つの二次ランディングパッド、二次上流ランディングパッド相同配列と二次下流ランディング相同性パッド配列との間に位置する二次ヌクレアーゼ標的配列を含む二次ランディングパッドをさらに含み、
    （ａ）二次上流ランディングパッド配列は、１つまたは複数の外因性ランディングパッドの（ULP）とは異なっているか；
    （ｂ）二次下流ランディングパッド配列は、１つまたは複数の外因性ランディングパッドの（DLP）とは異なっているか；
    （ｃ）二次ヌクレアーゼ標的配列は、１つまたは複数の外因性ランディングパッドの（NTS）とは異なっているか；または
    （ｄ）それらの任意の組合せである、請求項１〜１７のいずれか一項に記載の方法。
  19. 宿主細胞のゲノムへの外因性ドナー核酸の標的化された組込みのための方法であって、
    （ａ）オープンリーディングフレームの５’に組み込まれた外因性ランディングパッドを含む宿主細胞であって、外因性ランディングパッドは、上流ランディングパッド相同配列（ULP）と下流ランディングパッドリンカー配列（DLPL）との間に位置するヌクレアーゼ標的配列（NTS）を含む、宿主細胞を、
    （ｉ）１つまたは複数の第１のコンポーネントポリヌクレオチドであって、各第１のコンポーネントポリヌクレオチドは、５’から３’方向に、
    （１）（ULP）と相同組換えが可能な上流ライブラリー配列（UL）；
    （２）第１の目的の核酸；および
    （３）第１のリンカー配列
    を含む、第１のコンポーネントポリヌクレオチド；
    （ｉｉ）（NTS）に結合し、外因性ランディングパッド内の部位を切断することが可能な、ヌクレアーゼ（N）
    と接触させる工程、
    （ｂ）接触させた宿主細胞から生成した宿主細胞を回収する工程
    を含み、
    （DLPL）は、１つまたは複数の第１のコンポーネントポリヌクレオチドのいずれかの第１のリンカー配列と相同組換えして、外因性ランディングパッドで、１つまたは複数の第１のコンポーネントポリヌクレオチドからの第１のコンポーネントポリヌクレオチドを組み込むことが可能である、方法。
  20. 第１の目的の核酸が、プロモーターであり、プロモーターは、第１のリンカー配列および（DLPL）の宿主細胞媒介相同組換えを介してオープンリーディングフレームに作動可能に連結される、請求項１９に記載の方法。
  21. 第１のリンカー配列が、約２４〜約３６ヌクレオチド長である、請求項２０に記載の方法。
  22. 宿主細胞のゲノムへの核酸の標的化された組込みのための方法であって、
    （ａ）オープンリーディングフレームの３’に組み込まれた外因性ランディングパッドを含む宿主細胞であって、外因性ランディングパッドは、上流ランディングパッドリンカー配列（ULPL）と下流ランディングパッド相同配列（DLP）との間に位置するヌクレアーゼ標的配列（NTS）を含む、宿主細胞を、
    （ｉ）１つまたは複数の最後のコンポーネントポリヌクレオチドであって、各最後のコンポーネントポリヌクレオチドは、５’から３’方向に、
    （１）最後のリンカー配列；
    （２）最後の目的の核酸；および
    （３）（DLP）と相同組換えが可能な下流ライブラリー配列（DL）
    を含む、最後のコンポーネントポリヌクレオチド；
    （ｉｉ）（NTS）に結合し、外因性ランディングパッド内の部位を切断することが可能な、ヌクレアーゼ（N）
    と接触させる工程、
    （ｂ）接触させた宿主細胞から生成した宿主細胞を回収する工程
    を含み、
    （ULPL）は、１つまたは複数の最後のコンポーネントポリヌクレオチドのいずれかの最後のリンカー配列と相同組換えして、外因性ランディングパッドで、１つまたは複数の最後のコンポーネントポリヌクレオチドからの最後のコンポーネントポリヌクレオチドを組み込むことが可能である、方法。
  23. 最後の目的の核酸が、ターミネーターを含む、請求項２２に記載の方法。
  24. 最後の目的の核酸が、デグロン配列およびデグロン配列から下流に位置するターミネーターを含む、請求項２２に記載の方法。
  25. オープンリーディングフレームが、その宿主細胞のゲノム中のネイティブの遺伝子座における内因性遺伝子のオープンリーディングフレームである、請求項１９〜２４のいずれか一項に記載の方法。
  26. オープンリーディングフレームが、宿主細胞のゲノム中の非ネイティブの遺伝子座において組み込まれた外因性遺伝子のオープンリーディングフレームである、請求項１９または２４に記載の方法。
  27. 各第１のコンポーネントポリヌクレオチドまたは各最後のコンポーネントポリヌクレオチドが、バーコード配列を含む、請求項１９〜２６のいずれか一項に記載の方法。
  28. 宿主細胞が、二次上部ランディングパッド相同配列と二次下流ランディングパッド相同配列との間に位置する二次ヌクレアーゼ標的配列（NTS）を含む二次ランディングパッドをさらに含み、
    （ａ）二次上流ランディングパッド相同配列は、外因性ランディングパッドの（ULP）とは異なっているか；
    （ｂ）二次下流ランディングパッド相同配列は、外因性ランディングパッドの（DLP）とは異なっているか；
    （ｃ）二次（NTS）は、外因性ランディングパッドの（NTS）とは異なっているか；または
    （ｄ）それらの任意の組合せである、請求項１９〜２７のいずれか一項に記載の方法。
  29. 宿主細胞のゲノムへの外因性ドナー核酸の標的化された組込みのための方法であって、
    （ａ）宿主細胞のゲノム中に組み込まれた１つまたは複数の（x）外因性ランディングパッドを含む宿主細胞であって、各外因性ランディングパッドは、上流ランディングパッド相同配列（ULP）と下流ランディングパッド相同配列（DLP）との間に位置するヌクレアーゼ標的配列（NTS）を含み、各ランディングパッドは、上部の内因性ゲノム配列（UEG）ｘと下流内因性ゲノム配列（DEG）ｘとに入れ子になっている、宿主細胞を、
    （ｉ）１つまたは複数の（x）外因性ランディングパッドを切断することが可能なヌクレアーゼ（NTS）；および
    （ｉｉ）１つまたは複数の第１のコンポーネントポリヌクレオチドであって、各第１のコンポーネントポリヌクレオチドは、５’から３’方向に、
    （１）１つまたは複数の外因性ランディングパッドのいずれかの任意の（ULP）と相同組換えが可能な上流ライブラリー配列（UL）；
    （２）第１の目的の核酸；
    （３）第１のリンカー配列
    を含む、第１のコンポーネントポリヌクレオチド；および
    （ｉｉｉ）１つまたは複数の最後のコンポーネントポリヌクレオチドであって、各最後のコンポーネントポリヌクレオチドは、５’から３’方向に、
    （１）最後のリンカー配列；
    （２）最後の目的の核酸；および
    （３）１つまたは複数の（x）外因性ランディングパッドの（DEG）ｘと相同組換えが可能な下流ライブラリー配列（DL）
    を含む、最後のコンポーネントポリヌクレオチド
    と接触させる工程、
    （ｂ）接触させた宿主細胞から生成した宿主細胞を回収する工程
    を含み、
    １つまたは複数の第１のコンポーネントポリヌクレオチドからの第１のコンポーネントポリヌクレオチドと、１つまたは複数の最後のコンポーネントポリヌクレオチドからの最後のコンポーネントポリヌクレオチドとの任意の組合せが、インビボでそれらのリンカー配列を介して相同組換えされ、該組合せが、（DEG）ｘを有する外因性ランディングパッドにおいて組み込まれ、ｘは、少なくとも１の整数である、方法。
  30. １つまたは複数の第１のコンポーネントポリヌクレオチドが、第１の目的の核酸としてプロモーターを含み、１つまたは複数の最後のコンポーネントポリヌクレオチドが、最後の目的の核酸としてオープンリーディングフレームを含む、請求項２９に記載の方法。
  31. 宿主細胞のゲノムへの外因性ドナー核酸の標的化された組込みのための方法であって、
    （ａ）宿主細胞のゲノム中に組み込まれた１つまたは複数の（x）外因性ランディングパッドを含む宿主細胞であって、各外因性ランディングパッドは、上流ランディングパッド相同配列（ULP）と下流ランディングパッド相同配列（DLP）との間に位置するヌクレアーゼ標的配列（NTS）を含み、各ランディングパッドは、上部の内因性ゲノム配列（UEG）ｘと下流内因性ゲノム配列（DEG）ｘとに入れ子になっている、宿主細胞を、
    （ｉ）１つまたは複数の（x）外因性ランディングパッドを切断することが可能なヌクレアーゼ（NTS）；および
    （ｉｉ）１つまたは複数の第１のコンポーネントポリヌクレオチドであって、各第１のコンポーネントポリヌクレオチドは、５’から３’方向に、
    （１）１つまたは複数の（x）外因性ランディングパッドの（UEG）ｘと相同組換えが可能な上流ライブラリー配列（UL）；
    （２）第１の目的の核酸；
    （３）第１のリンカー配列
    を含む、第１のコンポーネントポリヌクレオチド；および
    （ｉｉｉ）１つまたは複数の最後のコンポーネントポリヌクレオチドであって、各最後のコンポーネントポリヌクレオチドは、５’から３’方向に、
    （１）最後のリンカー配列；
    （２）最後の目的の核酸；および
    （３）１つまたは複数の（x）外因性ランディングパッドのいずれかの任意のＤＬＰと相同組換えが可能な下流ライブラリー配列（DL）
    を含む、最後のコンポーネントポリヌクレオチド
    と接触させる工程、
    （ｂ）接触させた宿主細胞から生成した宿主細胞を回収する工程
    を含み、
    １つまたは複数の第１のコンポーネントポリヌクレオチドからの第１のコンポーネントポリヌクレオチドと、１つまたは複数の最後のコンポーネントポリヌクレオチドからの最後のコンポーネントポリヌクレオチドとの任意の組合せが、インビボでそれらのリンカー配列を介して相同組換えされ、該組合せが、（UEG）ｘを有する外因性ランディングパッドにおいて組み込まれ、ｘは、少なくとも１の整数である、方法。
  32. １つまたは複数の第１のコンポーネントポリヌクレオチドが、第１の目的の核酸としてオープンリーディングフレームを含み、１つまたは複数の最後のコンポーネントポリヌクレオチドが、最後の目的の核酸として、ターミネーターまたはターミネーターに融合したデグロン配列を含む、請求項３１に記載の方法。
  33. ｘが、少なくとも２の整数である、請求項２９〜３２のいずれか一項に記載の方法。
  34. １つまたは複数の外因性ランディングパッドが、宿主細胞のゲノム中の選択されたニュートラルな遺伝子座において組み込まれている、請求項２９〜３３のいずれか一項に記載の方法。
  35. １つまたは複数の外因性ランディングパッドが、宿主細胞のゲノム中の遺伝子間領域において組み込まれている、請求項２９〜３４のいずれか一項に記載の方法。
  36. （ULP）または（DLP）のいずれかまたは両方のヌクレオチド配列が、宿主細胞のゲノムの内因性ゲノム配列に実質的な相同性を有さないランダムに生成したヌクレオチド配列から得られる、請求項１〜３５のいずれか一項に記載の方法。
  37. （ULP）または（DLP）のいずれかまたは両方のヌクレオチド配列が、宿主細胞のゲノム中に存在しない、請求項１〜３６のいずれか一項に記載の方法。
  38. 宿主細胞を、２つ以上の異なるタイプの（ES）と接触させる、請求項１〜３７のいずれか一項に記載の方法。
  39. 外因性ランディングパッドの各々が、上流内因性ゲノム配列と（ULP）の５’領域との間に位置するインシュレーター配列、（DLP）の３’領域と下流内因性ゲノム配列との間に位置するインシュレーター配列、または両方の配置に位置するインシュレーター配列を含む、請求項１〜３８のいずれか一項に記載の方法。
  40. 第１のコンポーネントポリヌクレオチド、中間コンポーネントポリヌクレオチド、および最後のコンポーネントポリヌクレオチドの各リンカー配列が、約２０ヌクレオチド〜約５，０００ヌクレオチド長、約２５ヌクレオチド〜約１０００ヌクレオチド長、約２５ヌクレオチド〜約５００ヌクレオチド長、または約１００ヌクレオチド〜約５００ヌクレオチド長である、請求項１〜３９のいずれか一項に記載の方法。
  41. 第１のコンポーネントポリヌクレオチド、中間コンポーネントポリヌクレオチド、および最後のコンポーネントポリヌクレオチドの各リンカー配列が、約２４ヌクレオチド〜約３６ヌクレオチド長である、請求項１〜４０のいずれか一項に記載の方法。
  42. （ａ１）についての各（ES）の目的の核酸（D）、（ａ２）についての第１の目的の核酸および最後の目的の核酸、ならびに（ａ３）についてのＤＮＡセグメントが、目的の遺伝子、レポーター遺伝子、選択可能マーカー、プロモーター、終止コドン、エピトープタグをコードする核酸配列、リンカー、（NTS）と異なる二次ヌクレアーゼ標的配列、バーコード配列、スタッファー配列、デグロン配列、ターミネーター、融合パートナー配列、シス作用性転写レギュレーター配列、それらの組合せまたは部分的組合せからなる群から選択される、請求項１〜４１のいずれか一項に記載の方法。
  43. 各（ES）が、直鎖状である、請求項１〜４２のいずれか一項に記載の方法。
  44. 各（ES）、第１のコンポーネントポリヌクレオチド、中間コンポーネントポリヌクレオチド、および最後のコンポーネントポリヌクレオチドが、追加の機能的なエレメントを含む、請求項１〜４３のいずれか一項に記載の方法。
  45. 追加の機能的なエレメントが、バーコード、（NTS）と異なる二次ヌクレアーゼ標的部位、シス調節エレメントのためのＤＮＡ結合部位、またはそれらの任意の組合せからなる群から選択される、請求項４４に記載の方法。
  46. 宿主細胞が、生合成経路の１つまたは複数の酵素をコードする１つまたは複数の異種ヌクレオチド配列を含む、請求項１〜４５のいずれか一項に記載の方法。
  47. 生合成経路の１つまたは複数の酵素をコードする１つまたは複数の異種ヌクレオチド配列が、１つまたは複数の外因性ランディングパッド中にゲノムで組み込まれる、請求項４６に記載の方法。
  48. 回収する工程が、選択可能マーカーの組込みを必要としない、請求項１〜４７のいずれか一項に記載の方法。
  49. 回収する工程が、ＰＣＲ、サザンブロット、制限マッピング、およびＤＮＡシーケンシングからなる群から選択される少なくとも１つの方法によって組込みを同定することを含む、請求項１〜４８のいずれか一項に記載の方法。
  50. （ａ）回収された宿主細胞の表現型をスクリーニングする工程；および
    （ｂ）外因性ランディングパッド中に組み込まれたコンポーネントポリヌクレオチドのアイデンティティを決定する工程
    をさらに含む、請求項１〜４９のいずれか一項に記載の方法。
  51. 表現型をスクリーニングする工程が、標的分子または細胞バイオマスの産生レベルを決定する工程を含む、請求項５０に記載の方法。
  52. ヌクレアーゼ標的配列が、ホーミングエンドヌクレアーゼのための認識配列である、請求項１〜５１のいずれか一項に記載の方法。
  53. ヌクレアーゼ標的配列が、ガイドＲＮＡのための認識配列である、請求項１〜５２のいずれか一項に記載の方法。
  54. ヌクレアーゼ（N）が、エンドヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、ＴＡＬ−エフェクターＤＮＡ結合ドメイン−ヌクレアーゼ融合タンパク質（TALEN）、トランスポザーゼ、部位特異的リコンビナーゼ、およびＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ由来のＲＮＡガイドエンドヌクレアーゼからなる群から選択される、請求項１〜５３のいずれか一項に記載の方法。
  55. ジンクフィンガーヌクレアーゼが、操作されたジンクフィンガー結合ドメインに融合したタイプＩＩＳ制限エンドヌクレアーゼの切断ドメインを含む融合タンパク質である、請求項５４に記載の方法。
  56. タイプＩＩＳ制限エンドヌクレアーゼが、ＨＯエンドヌクレアーゼおよびＦｏｋＩエンドヌクレアーゼからなる群から選択される、請求項５５に記載の方法。
  57. ジンクフィンガー結合ドメインが、３、５または６つのジンクフィンガーを含む、請求項５４に記載の方法。
  58. エンドヌクレアーゼが、ＬＡＧＬＩＤＡＤＧホーミングエンドヌクレアーゼ、ＨＮＨホーミングエンドヌクレアーゼ、Ｈｉｓ−Ｃｙｓボックスホーミングエンドヌクレアーゼ、ＧＩＹ−ＹＩＧホーミングエンドヌクレアーゼ、およびシアノバクテリアのホーミングエンドヌクレアーゼからなる群から選択されるホーミングエンドヌクレアーゼである、請求項５４に記載の方法。
  59. エンドヌクレアーゼが、Ｈ−ＤｒｅＩ、Ｉ−ＳｃｅＩ、Ｉ−ＳｃｅＩＩ、Ｉ−ＳｃｅＩＩＩ、Ｉ−ＳｃｅＩＶ、Ｉ−ＳｃｅＶ、Ｉ−ＳｃｅＶＩ、Ｉ−ＳｃｅＶＩＩ、Ｉ−ＣｅｕＩ、Ｉ−ＣｅｕＡＩＩＰ、Ｉ−ＣｒｅＩ、Ｉ−ＣｒｅｐｓｂＩＰ、Ｉ−ＣｒｅｐｓｂＩＩＰ、Ｉ−ＣｒｅｐｓｂＩＩＩＰ、Ｉ−ＣｒｅｐｓｂＩＶＰ、Ｉ−ＴｌｉＩ、Ｉ−ＰｐｏＩ、Ｐｉ−ＰｓｐＩ、Ｆ−ＳｃｅＩ、Ｆ−ＳｃｅＩＩ、Ｆ−ＳｕｖＩ、Ｆ−ＣｐｈＩ、Ｆ−ＴｅｖＩ、Ｆ−ＴｅｖＩＩ、Ｉ−ＡｍａＩ、Ｉ−ＡｎｉＩ、Ｉ−ＣｈｕＩ、Ｉ−ＣｍｏｅＩ、Ｉ−ＣｐａＩ、Ｉ−ＣｐａＩＩ、Ｉ−ＣｓｍＩ、Ｉ−ＣｖｕＩ、Ｉ−ＣｖｕＡＩＰ、Ｉ−ＤｄｉＩ、Ｉ−ＤｄｉＩＩ、Ｉ−ＤｉｒＩ、Ｉ−ＤｍｏＩ、Ｉ−ＨｍｕＩ、Ｉ−ＨｍｕＩＩ、Ｉ−ＨｓＮＩＰ、Ｉ−ＬｌａＩ、Ｉ−ＭｓｏＩ、Ｉ−ＮａａＩ、Ｉ−ＮａｎＩ、Ｉ−ＮｃｌＩＰ、Ｉ−ＮｇｒＩＰ、Ｉ−ＮｉｔＩ、Ｉ−ＮｊａＩ、Ｉ−Ｎｓｐ２３６ＩＰ、Ｉ−ＰａｋＩ、Ｉ−ＰｂｏＩＰ、Ｉ−ＰｃｕＩＰ、Ｉ−ＰｃｕＡＩ、Ｉ−ＰｃｕＶＩ、Ｉ−ＰｇｒＩＰ、Ｉ−ＰｏｂＩＰ、Ｉ−ＰｏｒＩ、Ｉ−ＰｏｒＩＩＰ、Ｉ−ＰｂｐＩＰ、Ｉ−ＳｐＢｅｔａＩＰ、Ｉ−ＳｃａＩ、Ｉ−ＳｅｘＩＰ、Ｉ−ＳｎｅＩＰ、Ｉ−ＳｐｏｍＩ、Ｉ−ＳｐｏｍＣＰ、Ｉ−ＳｐｏｍＩＰ、Ｉ−ＳｐｏｍＩＩＰ、Ｉ−ＳｑｕＩＰ、Ｉ−Ｓｓｐ６８０３１、Ｉ−ＳｔｈＰｈｉＪＰ、Ｉ−ＳｔｈＰｈｉＳＴ３Ｐ、Ｉ−ＳｔｈＰｈｉＳＴｅ３ｂＰ、Ｉ−ＴｄｅＩＰ、Ｉ−ＴｅｖＩ、Ｉ−ＴｅｖＩＩ、Ｉ−ＴｅｖＩＩＩ、ｉ−ＵａｒＡＰ、ｉ−ＵａｒＨＧＰＡＩＰ、Ｉ−ＵａｒＨＧＰＡ１３Ｐ、Ｉ−ＶｉｎＩＰ、Ｉ−ＺｂｉＩＰ、ＰＩ−ＭｇａＩ、ＰＩ−ＭｔｕＩ、ＰＩ−ＭｔｕＨＩＰ ＰＩ−ＭｔｕＨＩＩＰ、ＰＩ−ＰｆｕＩ、ＰＩ−ＰｆｕＩＩ、ＰＩ−ＰｋｏＩ、ＰＩ−ＰｋｏＩＩ、ＰＩ−Ｒｍａ４３８１２ＩＰ、ＰＩ−ＳｐＢｅｔａＩＰ、ＰＩ−ＳｃｅＩ、ＰＩ−ＴｆｕＩ、ＰＩ−ＴｆｕＩＩ、ＰＩ−ＴｈｙＩ、ＰＩ−ＴｌｉＩまたはＰＩ−ＴｌｉＩＩからなる群から選択される、請求項５４に記載の方法。
  60. エンドヌクレアーゼが、非ネイティブのまたは外因性の認識配列に特異的に結合し、ネイティブのまたは内因性の認識配列と結合しないように改変されている、請求項５９に記載の方法。
  61. 改変されたエンドヌクレアーゼが、ＬＡＧＬＩＤＡＤＧホーミングエンドヌクレアーゼ、ＨＮＨホーミングエンドヌクレアーゼ、Ｈｉｓ−Ｃｙｓボックスホーミングエンドヌクレアーゼ、ＧＩＹ−ＹＩＧホーミングエンドヌクレアーゼ、およびシアノバクテリアのホーミングエンドヌクレアーゼからなる群から選択されるホーミングエンドヌクレアーゼ由来である、請求項６０に記載の方法。
  62. 改変されたエンドヌクレアーゼが、Ｈ−ＤｒｅＩ、Ｉ−ＳｃｅＩ、Ｉ−ＳｃｅＩＩ、Ｉ−ＳｃｅＩＩＩ、Ｉ−ＳｃｅＩＶ、Ｉ−ＳｃｅＶ、Ｉ−ＳｃｅＶＩ、Ｉ−ＳｃｅＶＩＩ、Ｉ−ＣｅｕＩ、Ｉ−ＣｅｕＡＩＩＰ、Ｉ−ＣｒｅＩ、Ｉ−ＣｒｅｐｓｂＩＰ、Ｉ−ＣｒｅｐｓｂＩＩＰ、Ｉ−ＣｒｅｐｓｂＩＩＩＰ、Ｉ−ＣｒｅｐｓｂＩＶＰ、Ｉ−ＴｌｉＩ、Ｉ−ＰｐｏＩ、Ｐｉ−ＰｓｐＩ、Ｆ−ＳｃｅＩ、Ｆ−ＳｃｅＩＩ、Ｆ−ＳｕｖＩ、Ｆ−ＣｐｈＩ、Ｆ−ＴｅｖＩ、Ｆ−ＴｅｖＩＩ、Ｉ−ＡｍａＩ、Ｉ−ＡｎｉＩ、Ｉ−ＣｈｕＩ、Ｉ−ＣｍｏｅＩ、Ｉ−ＣｐａＩ、Ｉ−ＣｐａＩＩ、Ｉ−ＣｓｍＩ、Ｉ−ＣｖｕＩ、Ｉ−ＣｖｕＡＩＰ、Ｉ−ＤｄｉＩ、Ｉ−ＤｄｉＩＩ、Ｉ−ＤｉｒＩ、Ｉ−ＤｍｏＩ、Ｉ−ＨｍｕＩ、Ｉ−ＨｍｕＩＩ、Ｉ−ＨｓＮＩＰ、Ｉ−ＬｌａＩ、Ｉ−ＭｓｏＩ、Ｉ−ＮａａＩ、Ｉ−ＮａｎＩ、Ｉ−ＮｃｌＩＰ、Ｉ−ＮｇｒＩＰ、Ｉ−ＮｉｔＩ、Ｉ−ＮｊａＩ、Ｉ−Ｎｓｐ２３６ＩＰ、Ｉ−ＰａｋＩ、Ｉ−ＰｂｏＩＰ、Ｉ−ＰｃｕＩＰ、Ｉ−ＰｃｕＡＩ、Ｉ−ＰｃｕＶＩ、Ｉ−ＰｇｒＩＰ、Ｉ−ＰｏｂＩＰ、Ｉ−ＰｏｒＩ、Ｉ−ＰｏｒＩＩＰ、Ｉ−ＰｂｐＩＰ、Ｉ−ＳｐＢｅｔａＩＰ、Ｉ−ＳｃａＩ、Ｉ−ＳｅｘＩＰ、Ｉ−ＳｎｅＩＰ、Ｉ−ＳｐｏｍＩ、Ｉ−ＳｐｏｍＣＰ、Ｉ−ＳｐｏｍＩＰ、Ｉ−ＳｐｏｍＩＩＰ、Ｉ−ＳｑｕＩＰ、Ｉ−Ｓｓｐ６８０３１、Ｉ−ＳｔｈＰｈｉＪＰ、Ｉ−ＳｔｈＰｈｉＳＴ３Ｐ、Ｉ−ＳｔｈＰｈｉＳＴｅ３ｂＰ、Ｉ−ＴｄｅＩＰ、Ｉ−ＴｅｖＩ、Ｉ−ＴｅｖＩＩ、Ｉ−ＴｅｖＩＩＩ、ｉ−ＵａｒＡＰ、ｉ−ＵａｒＨＧＰＡＩＰ、Ｉ−ＵａｒＨＧＰＡ１３Ｐ、Ｉ−ＶｉｎＩＰ、Ｉ−ＺｂｉＩＰ、ＰＩ−ＭｇａＩ、ＰＩ−ＭｔｕＩ、ＰＩ−ＭｔｕＨＩＰ ＰＩ−ＭｔｕＨＩＩＰ、ＰＩ−ＰｆｕＩ、ＰＩ−ＰｆｕＩＩ、ＰＩ−ＰｋｏＩ、ＰＩ−ＰｋｏＩＩ、ＰＩ−Ｒｍａ４３８１２ＩＰ、ＰＩ−ＳｐＢｅｔａＩＰ、ＰＩ−ＳｃｅＩ、ＰＩ−ＴｆｕＩ、ＰＩ−ＴｆｕＩＩ、ＰＩ−ＴｈｙＩ、ＰＩ−ＴｌｉＩまたはＰＩ−ＴｌｉＩＩからなる群から選択されるエンドヌクレアーゼ由来である、請求項６０に記載の方法。
  63. 宿主細胞が、真菌細胞、細菌細胞、植物細胞、および動物細胞からなる群から選択される、請求項１〜６２のいずれか一項に記載の方法。
  64. 宿主細胞が、酵母細胞である、請求項１〜６３のいずれか一項に記載の方法。
  65. 酵母細胞が、サッカロマイセス・セレビシエ細胞である、請求項６４に記載の方法。
  66. サッカロマイセス・セレビシエ細胞が、パン酵母、Ｍａｕｒｉ、Ｓａｎｔａ Ｆｅ、ＩＺ−１９０４、ＴＡ、ＢＧ−１、ＣＲ−１、ＳＡ−１、Ｍ−２６、Ｙ−９０４、ＰＥ−２、ＰＥ−５、ＶＲ−１、ＢＲ−１、ＢＲ−２、ＭＥ−２、ＶＲ−２、ＭＡ−３、ＭＡ−４、ＣＡＴ−１、ＣＢ−１、ＮＲ−１、ＢＴ−１またはＡＬ−１株のサッカロマイセス・セレビシエ細胞である、請求項６５に記載の方法。
  67. 外因性ドナー核酸によって表現型の寄与を決定する方法であって、
    （ａ）宿主細胞を、複数の外因性核酸（ES）と接触させる工程であって、各（ES）は、バーコード配列でタグ付けされており、宿主細胞のゲノムは、宿主細胞媒介相同組換えを介して、宿主細胞のゲノム中の複数の（ES）の任意の１つまたは組合せを組み込むように設計されている、工程；
    （ｂ）接触させた宿主細胞から生成した、特異的な表現型を呈する宿主細胞をスクリーニングする工程；および
    （ｃ）各（ES）に関連付けられたバーコード配列を使用して、宿主細胞のゲノムに組み込まれた（ES）のアイデンティティを決定する工程
    を含む方法。
  68. 宿主細胞のゲノム中に組み込まれた複数の（x）外因性ランディングパッドを提供することによって、宿主細胞のゲノムが、宿主細胞のゲノム中の複数の（ES）の任意の１つまたは組合せを組み込むように設計されており、各外因性ランディングパッドは、各ランディングパッド中に、上流ランディングパッド相同配列（ULP）と下流ランディングパッド相同配列（DLP）との間に位置するヌクレアーゼ標的配列（NTS）を含む、請求項６７に記載の方法。
  69. バーコード配列でタグ付けされた各（ES）が、
    （ａ）上流ライブラリー配列（UL）と下流ライブラリー配列（DL）との間に位置する目的の核酸であって、ＵＬは、（x）外因性ランディングパッドの任意の（ULP）と相同組換えが可能であり、ＤＬは、（x）外因性ランディングパッドの任意のＤＬＰと相同組換えが可能である、目的の核酸；
    （ｂ）上流ライブラリー配列（UL）とリンカー配列との間に位置する目的の核酸であって、（UL）は、（x）外因性ランディングパッドの任意の（ULP）と相同組換えが可能であり、リンカー配列は、別の（ES）のリンカー配列と相同組換えが可能である、目的の核酸；
    （ｃ）リンカー配列と下流ライブラリー配列（DL）との間に位置する目的の核酸であって、（DL）は、（x）外因性ランディングパッドの任意の（DLP）と相同組換えが可能であり、リンカー配列は、別の（ES）のリンカー配列と相同組換えが可能である、目的の核酸；または
    （ｄ）２つの異なるリンカー配列間に位置する目的の核酸であって、
    ２つの異なるリンカー配列の各々は、別の（ES）のリンカー配列と相同組換えが可能である、核酸
    を含む、請求項６７または６８に記載の方法。
  70. 請求項１〜６９のいずれか一項に記載の方法によって生成された宿主細胞。
  71. 宿主細胞のゲノム中に組み込まれた複数の外因性ランディングパッドを含む宿主細胞であって、各外因性ランディングパッドは、上流ランディングパッド相同配列（ULP）と下流ランディングパッド相同配列（DLP）との間に位置するヌクレアーゼ標的配列（NTS）を含み、複数の外因性ランディングパッドは、（ULP）と同一または実質的に同一な配列および（DLP）と同一または実質的に同一な配列を含む、宿主細胞。
  72. 宿主細胞が、約３〜約２０個の外因性ランディングパッドを含む、請求項７１に記載の宿主細胞。
  73. （ULP）および（DLP）のヌクレオチド配列が、宿主細胞のゲノムの内因性ゲノム配列に実質的な相同性を有さないランダムに生成したヌクレオチド配列から得られる、請求項７１または７２に記載の宿主細胞。
  74. （ULP）および（DLP）のヌクレオチド配列が、宿主細胞のゲノム中に存在しない、請求項７１〜７３のいずれか一項に記載の宿主細胞。
  75. （ULP）および（DLP）の各々が、約２０ヌクレオチド長から約５，０００ヌクレオチド長、約２５ヌクレオチドから約１０００ヌクレオチド長、約２５ヌクレオチドから約５００ヌクレオチド長または約１００ヌクレオチドから約５００ヌクレオチド長を含む、請求項７１〜７４のいずれか一項に記載の宿主細胞。
  76. １つまたは複数の外因性ランディングパッドが、宿主細胞のゲノム中の選択されたニュートラルな遺伝子座において組み込まれている、請求項７１〜７５のいずれか一項に記載の宿主細胞。
  77. １つまたは複数の外因性ランディングパッドが、宿主細胞のゲノム中の遺伝子間領域において組み込まれている、請求項７１〜７６のいずれか一項に記載の宿主細胞。
  78. （ａ）宿主細胞のゲノム中に組み込まれた複数の外因性ランディングパッドを含む宿主細胞であって、各外因性ランディングパッドは、上流ランディングパッド相同配列（ULP）と下流ランディングパッド相同配列（DLP）との間に位置するヌクレアーゼ標的配列（NTS）を含む、宿主細胞；
    （ｂ）複数の外因性ドナー核酸であって、各外因性ドナー核酸（ES）は、上流ライブラリー配列（UL）と下流ライブラリー配列（DL）との間に位置する目的の核酸（D）を含み、各（UL）は、任意の上流ランディングパッド相同配列（ULP）で相同組換えが可能であり、各（DL）は、宿主細胞のゲノム中のランディングパッドの任意の下流ランディングパッド相同配列（DLP）で相同組換えが可能である、外因性ドナー核酸；および
    （ｃ）複数の外因性ランディングパッドを切断することが可能な、１つまたは複数のヌクレアーゼ（N）
    を含むキット。
  79. １つまたは複数の外因性ランディングパッドが、宿主細胞のゲノム中の選択されたニュートラルな遺伝子座において組み込まれている、請求項７８に記載のキット。
  80. １つまたは複数の外因性ランディングパッドが、宿主細胞のゲノム中の遺伝子間領域において組み込まれている、請求項７８または７９に記載のキット。
  81. （ULP）および（DLP）のヌクレオチド配列が、宿主細胞のゲノムの内因性ゲノム配列に実質的な相同性を有さないランダムに生成したヌクレオチド配列から得られる、請求項７８〜８０のいずれか一項に記載のキット。
  82. （ULP）および（DLP）のヌクレオチド配列が、宿主細胞のゲノム中に存在しない、請求項７８〜８１のいずれか一項に記載のキット。
  83. （ULP）および（DLP）の各々が、約２０ヌクレオチドから約５，０００ヌクレオチド長、約２５ヌクレオチドから約１０００ヌクレオチド長、約２５ヌクレオチドから約５００ヌクレオチド長または約１００ヌクレオチドから約５００ヌクレオチド長を含む、請求項７８〜８２のいずれか一項に記載のキット。
  84. 複数の外因性ドナー核酸の各々が、バーコード配列を含む、請求項７８〜８３のいずれか一項に記載のキット。
  85. 複数のプライマー対をさらに含み、各プライマー対は、外因性ドナー核酸の各々に関連付けられたバーコード配列を同定することが可能である、請求項８４に記載のキット。
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