JP2013529472A5

JP2013529472A5 -

Info

Publication number: JP2013529472A5
Application number: JP2013516983A
Authority: JP
Filing date: 2011-06-30
Publication date: 2014-08-14
Anticipated expiration: 2031-06-30

Claims

サンプル中の標的核酸のヌクレオチド配列を測定する方法であって、
1）n個のサンプルを提供し、nは1以上の整数であり、前記サンプルは、好ましくは、哺乳類動物に由来し、更に好ましくは、ヒト、特にヒトの血液サンプルに由来する、解析すべきn個のサンプルをm個のグループに分けるのが好ましく、mは整数であり且つn≧m≧1である、
2）増幅：各サンプルに対して、1対又は複数対のタグプライマーを用いて、当該サンプルに由来のテンプレートが存在している場合に、標的核酸を増幅するのに適する条件下でPCR増幅を行い、その内、各1対のタグプライマーは、プライマータグを含む正方向タグプライマーと逆方向タグプライマー（いずれも縮重プライマーであってもよい）から構成され、正方向タグプライマーと逆方向タグプライマーに含まれるプライマータグは同じであってもよいし、異なっていてもよく、異なるサンプルに用いられるタグプライマー対におけるプライマータグは互いに異なる、
3）混合：n>1の場合に、各サンプルのPCR増幅産物を一緒に混合する、
4）断片化：得られた増幅産物を不完全断片化し、精製回収する、
5）シークエンシング：回収されたDNA混合物に対して、シークエンシングを行い、断片化されたDNAの配列を得る、
6）組み立て：サンプルごとの独特なプライマータグを基にして、得られたシークエンシング結果をサンプルと一対一に対応付けさせ、対照プログラムを利用して、各シークエンシング配列をPCR産物の相応するDNAの参考配列に位置決めさせ、配列のオーバラップ及び連鎖関係に基づいて断片化されたDNAの配列から、完全な標的核酸を組み立てる、
ことを含む方法。
各1対のプライマータグとPCRプライマー対は1対のタグプライマーを組み合わせて構成し、正逆方向のPCRプライマーの5’末端に、正方向プライマータグと逆方向プライマータグをそれぞれに有する、又は、任意の接続配列により正方向プライマータグと逆方向プライマータグがそれぞれ接続されていることを特徴とする請求項1記載の方法。
前記PCRプライマーは、HLA遺伝子を増幅するためのPCRプライマー、特にHLA-A/B遺伝子を増幅するためのPCRプライマー、好ましくはHLA-A/Bの第2、3、4エキソン及びHLA-DRB1の第2エキソンを増幅するためのPCRプライマーであり、好ましくは前記HLA-A/Bの第2、3、4エキソンを増幅するためのＰＣＲプライマーは表1または表2に示すものであり、好ましくは前記HLA-DRB1の第2エキソンを増幅するためのＰＣＲプライマーは表7に示すものであることを特徴とする請求項1又は2記載の方法。
前記PCRプライマーは、HLA遺伝子を増幅するためのPCRプライマー、特にHLA-C遺伝子を増幅するためのPCRプライマー、好ましくはHLA-Cの第2、第3及び/又は第4エキソンを増幅するためのＰＣＲプライマーであり、好ましくは前記ＰＣＲプライマーは表3又は4に示すものであることを特徴とする請求項1又は2記載の方法。
前記PCRプライマーはHLA遺伝子を増幅するためのPCRプライマー、特にHLA-DRB1遺伝子を増幅するためのPCRプライマー、好ましくはHLA-DQB1の第2及び/又は第3エキソンを増幅するためのＰＣＲプライマーであり、好ましくは前記ＰＣＲプライマーは表5に示すものであることを特徴とする請求項1又は2記載の方法。
前記プライマータグは、PCRプライマーに対して設計し、好ましくはHLAの特定の遺伝子を増幅するためのPCRプライマーに対して設計し、更に好ましくはHLA-A/Bの第2、3、4エキソン及びHLA-DRB1の第2エキソンを増幅するためのPCRプライマーに対して設計し、特に好ましくは表2又は表3又は表7に示されるようなPCRプライマーに対して設計し、前記プライマータグは、特に、表6に示される95対のプライマータグのうちの少なくとも10対、又は少なくとも20対、又は少なくとも30対、又は少なくとも40対、又は少なくとも50対、又は少なくとも60対、又は少なくとも70対、又は少なくとも80対、又は少なくとも90対、又は95対を含み（或いは、前記1組のプライマータグは表1に示される95対のプライマータグのうちの10〜95対（例えば、10〜95対、20〜95対、30〜95対、40〜95対、50〜95対、60〜95対、70〜95対、80〜95対、90〜95対、又は95対）からなる）、かつ、
前記1組のプライマータグは、少なくとも表6に示される95対のプライマータグのうちのPI-1〜PI-10、又は PI-11〜PI-20、又はPI-21〜PI-30、又はPI-31〜PI-40、又はPI-41〜PI-50、又はPI-51〜PI-60、又はPI-61〜PI-70、又はPI-71〜PI-80、又はPI-81〜PI-90、又はPI-91〜PI-95、或いはこれらのうちのいずれか2個又は複数個の組み合わせを含むことが好ましいことを特徴とする請求項1記載の方法。
請求項1に記載の1）〜4）のことを含み、
5）ライブラリー構築：断片化されたPCR産物のライブラリーでPCR-Freeシークエンシングライブラリーを構築し、異なるPCR-Freeシークエンシングライブラリーと区別するように、ライブラリーに異なるライブラリーアダプターを付け、用いられたシークエンサーの最大読み取り長から、用いられたシークエンサーに適用されるDNAの最大長範囲までのあらゆるDNAバンド、好ましくは450〜750bpの長さ範囲のDNA断片を精製回収する、
6）シークエンシング：回収されたDNA混合物に対してシークエンシングを行い、断片化されたDNAの配列を得る、
7）組み立て：各ライブラリーの異なるライブラリーアダプター配列とサンプルごとの独特なプライマータグを基にして、得られたシークエンシング結果をサンプルと一対一に対応付けさせ、対照プログラムを利用して、各シークエンシング配列をPCR産物の相応するDNAの参考配列に位置決めさせ、配列のオーバラップ及び連鎖関係に基づいて断片化されたDNAの配列から、完全な標的核酸を組み立てる、
ことを更に含む特徴とする請求項1記載の方法。
請求項1〜7のいずれか1項の方法を利用して患者からのサンプル（特に血液サンプル）に対してシークエンシングを行い、シークエンシング結果を、HLAデータベース（例えばIMGT HLA専門的データベース）におけるHLAのエキソン、好ましくはHLA-A/Bの第2、3、4エキソン、HLA-Cの第2、第3及び/又は第4エキソン、HLA-DQB1遺伝子の第2及び/又は第3エキソン遺伝子及び/又はHLA-DRB1の第2エキソンの配列のデータと対照を行い、配列の対照の結果が100％で合致しているものが、対応するサンプルのHLA遺伝子型であることを特徴とする請求項1〜7のいずれか1項に記載のサンプル中の標的核酸のヌクレオチド配列を測定する方法のHLAタイピングにおける用途。
1組のプライマータグであって、表6に示される95対のプライマータグのうちの少なくとも10対、又は少なくとも20対、又は少なくとも30対、又は少なくとも40対、又は少なくとも50対、又は少なくとも60対、又は少なくとも70対、又は少なくとも80対、又は少なくとも90対、又は95対を含み（或いは、前記1組のプライマータグは表1に示される95対のプライマータグのうちの10〜95対（例えば、10〜95対、20〜95対、30〜95対、40〜95対、50〜95対、60〜95対、70〜95対、80〜95対、90〜95対、又は95対）からなる）、かつ、
前記1組のプライマータグは、少なくとも表6に示される95対のプライマータグのうちのPI-1〜PI-10、又は PI-11〜PI-20、又はPI-21〜PI-30、又はPI-31〜PI-40、又はPI-41〜PI-50、又はPI-51〜PI-60、又はPI-61〜PI-70、又はPI-71〜PI-80、又はPI-81〜PI-90、又はPI-91〜PI-95、或いはこれらのうちのいずれか2個又は複数個の組み合わせを含むことが好ましい1組のプライマータグ。
請求項9に記載の1組のプライマータグをPCRシークエンシング法に使用する用途であって、特に、各1対のプライマータグとPCRプライマー対は1対のタグプライマーを組み合わせて構成し、正逆方向のPCRプライマーの5’末端に、正方向プライマータグと逆方向プライマータグをそれぞれに有する、又は、任意の接続配列により方向プライマータグと逆方向プライマータグがそれぞれ接続されている、用途。
PCRプライマーは、HLAの特定の遺伝子を増幅するためのPCRプライマー、好ましくはHLA-A/Bの第2、3、4エキソン及びHLA-DRB1の第2エキソンを増幅するためのＰＣＲプライマーであり、好ましくは前記HLA-A/Bの第2、3、4エキソンを増幅するためのＰＣＲプライマーは表1または表2に示すものであり、好ましくは前記HLA-DRB1の第2エキソンを増幅するためのＰＣＲプライマーは表7に示すものであり、或いは好ましくはHLA-C遺伝子の第2、第3及び/又は第4エキソンを増幅するためのＰＣＲプライマーであり、好ましくは前記ＰＣＲプライマーは表3又は4に示すものであり、或いは好ましくはHLA-DQB1の第2及び/又は第3エキソンを増幅するためのＰＣＲプライマーであり、好ましくは前記ＰＣＲプライマーは表5に示すものであることを特徴とする請求項10に記載の用途。
請求項9に記載の1組のプライマータグと測定すべき標的配列を増幅するPCRプライマー対とから組み合わせてなる1組のタグプライマーであって、各1対のプライマータグとPCRプライマー対は1対のタグプライマーを組み合わせて構成し、正逆方向のPCRプライマーの5’末端に、正方向プライマータグと逆方向プライマータグをそれぞれに有する、又は、任意の接続配列により方向プライマータグと逆方向プライマータグがそれぞれ接続されている、タグプライマー。
前記PCRプライマーは、HLAの特定の遺伝子を増幅するためのPCRプライマー、好ましくはHLA-A/Bの第2、3、4エキソン及びHLA-DRB1の第2エキソンを増幅するためのＰＣＲプライマーであり、好ましくは前記HLA-A/Bの第2、3、4エキソンを増幅するためのＰＣＲプライマーは表1または表2に示すものであり、好ましくは前記HLA-DRB1の第2エキソンを増幅するためのＰＣＲプライマーは表7に示すものであり、或いは好ましくはHLA-C遺伝子の第2、第3及び/又は第4エキソンを増幅するためのＰＣＲプライマーであり、好ましくは前記ＰＣＲプライマーは表3又は4に示すものであり、或いは好ましくはHLA-DQB1の第2及び/又は第3エキソンを増幅するためのＰＣＲプライマーであり、好ましくは前記ＰＣＲプライマーは表5に示すものであることを特徴とする請求項12に記載のタグプライマー。
請求項１〜７のいずれか一項に記載のサンプル中の標的核酸のヌクレオチド配列を測定する方法を含むHLAタイピング方法であって、
前記ライブラリーアダプタータグ技術を結合して、断片化されたPCR産物のライブラリーでPCR-Freeシークエンシングライブラリーを構築することは、m種のライブラリーを用いて、2）で得られたm個のPCR産物のライブラリーにアダプターを付加し、各PCR産物のライブラリーごとに異なるライブラリーアダプターを使用することによって、m個のアダプタータグシークエンシングライブラリーを構築することであり、m個のアダプタータグシークエンシングライブラリーを等モルで混合して混合アダプタータグシークエンシングライブラリーを構築し、その中のライブラリーアダプターの接続方法とは、PCR工程を行うことなくDNA接続酵素で直接的に接続することを指していることを特徴とするHLAタイピング方法。
HLA遺伝子タイピング用のPCRプライマーであって、前記PCRプライマーは、HLA-A/Bの第2、3、4エキソン及びHLA-DRB1の第2エキソンを増幅するためのＰＣＲプライマーであり、好ましくは前記HLA-A/Bの第2、3、4エキソンを増幅するためのＰＣＲプライマーは表1または表2に示す如くであり、好ましくは前記HLA-DRB1の第2エキソンを増幅するためのＰＣＲプライマーは表7に示すものであり、或いは、HLA-C遺伝子の第2、第3及び/又は第4エキソンを増幅するためのＰＣＲプライマーであり、好ましくは前記ＰＣＲプライマーは表3又は4に示すものであり、或いはHLA-DQB1の第2及び/又は第3エキソンを増幅するためのＰＣＲプライマーであり、好ましくは前記ＰＣＲプライマーは表5に示すものであることを特徴とするHLA遺伝子タイピング用のPCRプライマー。
HLA-A、B遺伝子タイピング用の1セットのPCRプライマーであって、前記PCRプライマーは表1又は表2に示すものであり、好ましくは前記タイピングは、第2世代シークエンシング法とサンガー法を含めるシークエンシング法により行われる1セットのPCRプライマー。
請求項16に記載のPCRプライマーがHLA遺伝子タイピングに用いる用途であり、請求項16に記載のPCRプライマーを使用して請求項1に記載の方法により得られた結果に基づいて組立と対照解析を行い、シークエンシング結果をデータベースにおける標準配列と比較し、HLA遺伝子タイピング結果を得ることを特徴する用途。
サンプル中のHLA-C遺伝子の第2、3及び/又は4エキソンにシークエンシングを行う方法であって、
1）サンプルを1つ提供して当該サンプルのDNAを抽出する、
2）SEQ ID NO：25及びSEQ ID NO：26、SEQ ID NO：27及びSEQ ID NO：28、SEQ ID NO：29及びSEQ ID NO：30、若しくはSEQ ID NO：31及びSEQ ID NO：32、SEQ ID NO：33及びSEQ ID NO：34、SEQ ID NO：35及びSEQ ID NO：36からなる群より選ばれるプライマー対を用いて前記DNAを増幅してPCR産物を取得し、好ましくはPCR産物を精製する、
3）前記PCR産物に対してシークエンシングを行う、
ことを含む方法。
HLA-C遺伝子タイピング方法であって、
1）SEQ ID NO：25及びSEQ ID NO：26、SEQ ID NO：27及びSEQ ID NO：28、SEQ ID NO：29及びSEQ ID NO：30、若しくはSEQ ID NO：31及びSEQ ID NO：32、SEQ ID NO：33及びSEQ ID NO：34、SEQ ID NO：35及びSEQ ID NO：36からなる群より選ばれるプライマー対を用いてPCR増幅を行い、決定すべきサンプルのHLA-C遺伝子の第2、3及び/又は4エキソンを増幅する、
2）増幅されたエキソンに対してシークエンシングを行い、シークエンシング結果をデータベースにおける基準サンプルと比較して遺伝子タイピング結果を特定する、
ことを含むHLA-C遺伝子タイピング方法。
サンプル中のHLA-DQB1の第2及び/又は第3エキソンにシークエンシングを行う方法であって、
1）サンプルを1つ提供して当該サンプルのDNAを抽出する、
2）SEQ ID NO：37及びSEQ ID NO：38、及び/又はSEQ ID NO：39及びSEQ ID NO：40のプライマー対を使用して前記DNAを増幅してPCR産物を取得し、好ましくはPCR産物を精製する、
3）前記PCR産物に対してシークエンシングを行う、
ことを含む方法。
HLA-DQB1遺伝子タイピング方法であって、
1）SEQ ID NO：37及びSEQ ID NO：38、及び/又はSEQ ID NO：39及びSEQ ID NO：40のプライマー対を用いてPCR増幅を行い、決定すべきサンプルのHLA-C遺伝子の第2及び/又は第3エキソンを増幅する、
2）増幅されたエキソンに対してシークエンシングを行い、シークエンシング結果をデータベースにおける基準サンプルと比較して遺伝子タイピング結果を特定する、
ことを含むHLA-DQB1遺伝子タイピング方法。