JP2019512261A - アデノウイルスコートタンパク質由来送達賦形剤 - Google Patents
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Abstract
Description
従って、最初の様態において、本発明は、アデノウイルスペントンベースプロトマーを含む改変ポリペプチドに関する。ここにおいて、該ペントンベースプロトマーは、第一RGDループ、第2RGDループ、可変ループ(Vループ)、アデノウイルスファイバータンパク質結合クレフト、及び/又は、N項ドメインを包含し、以下の一つ以上を含む。
(i) 第1、第2、第1と第2の両方のRGDループ、及び/又はVループにおいて少なくとも1つの標的特異的結合ドメイン;及び/又は
(ii) 第1、第2、第1と第2の両方のRGDループ、及び/又はVループにおいて1以上の非アデノウイルスペプチド;及び/又は
(iii) ペントンベースプロトマーのN及び/又はCの末端において非アデノウイルスポリペプチド;及び/又は
(iv) 第1、第2、第1と第2の両方のRGDループ、Vループにおいて、及び/又はペントンベースプロトマーのN末端ドメインにおいて少なくとも1つの異種カプリングの残留。ここで、ペントンベースプロトマーt内のN末端ドメインのN末端は以下のように定義される。
X1-G-R-N-S-I-R (配列番号: 44)
そして、ペントンベースプロトマー内のN末端ドメインのC末端は以下のように定義される。
D-X2-R-S-R-G (配列番号: 45),
ここに、
X1はGとEを構成する群から選択され、そして、
X2はDとEを構成する群から選択され、及び/又は
(v) 第1、第2又は第1と第2の両方RGDループの1以上のアミノ酸、及び/又はペントンベースプロトマーのVループの1以上のアミノ酸と共有結合的に、又は非共有結合的に結合した薬剤又はポリペプチド、及び/又は
(vi) ペントンベースプロトマーのアデノウイルスファイバータンパク質結合クレフトにおける少なくとも1つの異種カプリング残留
ここにおいて、第1様態の改変ポリペプチドは好ましくはVLPにアセンブルすることができる。
(i) 非アデノウイルスポリペプチド、及び/又は
(ii) 薬剤又はラベルに共有結合的又は非共有結合的に結合する。
第3の様態において、本発明は、該発明のアデノウイルスペントンベースプロトマーを有する改変ポリペプチドをコードする核酸、及び/又は、ファイバータンパク質フラグメントを結合するアデノウイルスペントンベースプロトマーを有する該発明の改変ポリペプチドに関する。
(i) アデノウイルスペントンベースプロトマーを有するポリペプチドであり、該ペントンベースプロトマーは、第1RGDループ、第2RGDループ及び/又は可変ループをコードする核酸に、核酸エンコード非アデノウイルスポリペプチドを導入するのに適合したアデノウイルスファイバータンパク質に対する第1RGDループ、第2RGDループ、可変ループ、及び/又は結合部位を含有している。又は、
(ii) C末端及び/又はN末端における非アデノウイルスペプチドをコードする核酸を導入するために適合したファイバータンパク質フラグメントを結合するアデノウイルスペントンベースプロトマーを有するポリペプチド。
(a) 該発明の組み換え宿主細胞を提供する。
(b) 改変ポリペプチドを発現する。
(c) 改変ポリペプチドを精製する。
(a) 該発明のクローニングベクターを提供する。
(b) 病気又は患者に特有な非アデノウイルスポリペプチドのアミノ酸配列を確定する。
(c) 少なくとも1個の該非アデノウイルスポリペプチドを、第1RGDループ、第2RGDループ、及び/又はアデノウイルスペントンベースプロトマーの可変ループをコードする核酸に、及び/又はファイバータンパク質フラグメントを結合するアデノウイルスペントンベースプロトマーを含有する改変ペプチドのN末端又はC末端をコードする核酸の直前又は直後の核酸の位置に挿入する。
(d) ファイバータンパク質を結合するアデノウイルスペントンベースプロトマーを含有する改変ポリペプチドと選択的に一緒に宿主細胞において改変アデノウイルスペントンベースプロトマーを発現する。
(e) 選択的にファイバータンパク質を結合するアデノウイルスペントンベースプロトマーを含有するVLP、又は、ファイバータンパク質フラグメントを結合するアデノウイルスペントンベースプロトマーを含有する該改変ポリペプチドを精製する。
(a) 該発明のクローニングベクターを提供する。
(b) 病気又は患者に特有な非アデノウイルスポリペプチドの核酸配列を確定する。
(c) 少なくとも1個の非アデノウイルスポリペプチドを、ファイバータンパク質フラグメントを結合するアデノウイルスペントンベースプロトマーを含有するETGポリペプチドのN末端又はC末端をコードする核酸の直前又は直後の核酸の位置に挿入する。
(d) ファイバータンパク質を結合するアデノウイルスペントンベースプロトマーを含有する改変ポリペプチドをアデノウイルスペントンベースロトマーと選択的に一緒に宿主細胞において発現する。
(e1) ファイバータンパク質フラグメントを結合するアデノウイルスペントンベースプロトマーを含有する該改変ポリペプチドを精製し、アデノウイルスペントンベースプロトマー又は該発明のアデノウイルスペントンベースプロトマーと混合する。
(e2) アデノウイルスペントンベースプロトマーが共発現した場合、該VLPを精製する。
(a) 病気又は患者に特有な非アデノウイルスポリペプチドのアミノ酸配列を確定する。
(b) ファイバータンパク質フラグメントを結合するアデノウイルスペントンベースプロトマーを含有する該発明の改変ポリペプチドと該非アデノウイルスポリペプチドの少なくとも1個とを合成する。
(c) 該改変ポリペプチドをアデノウイルスペントンベースプロトマーと混合するか、該発明の改変アデノウイルスペントンベースプロトマーを該発明の五量体又は該発明のVLPとを混合する。
本発明を実施するために、他に指示がなければ、当該分野の文献で説明されている化学、生化学及び組換えDNA技術の従来の方法が用いられる(参考例:Molecular Cloning:A Laboratory Manual(第2版)、 Sambrook他、Cold Spring Harbor Laboratory Press、Cold Spring Harbor 1989)。
本発明の文脈において使用される「アデノウイルスファイバータンパク質結合クレフト」という用語は、アデノウイルスファイバータンパク質との相互作用表面を形成するペントンベースプロトマーの折り畳み構造(fold)を指す。図6に示すように、結合クレフトは、異なるアデノウイルス間で保存されているポリペプチド配列のいくつかの非連続ストレッチによって形成される。
本発明の文脈において使用される「抗原決定基」としても知られる「エピトープ」という用語は、免疫系、特に抗体、B細胞又はT細胞によって認識される巨大分子の部分である。本明細書中で使用される場合、「エピトープ」は、本明細書に記載の抗体(例えば、抗体又はその抗原結合フラグメント)に結合することができる巨大分子の一部である。エピトープは、通常、アミノ酸又は糖側鎖などの化学的に活性な表面の分子群からなり、通常、特異的な三次元構造特性ならびに特異的な電荷特性を有する。立体配座及び非立体配座エピトープは、変性溶媒の存在下で、前者への結合ではなく後者への結合が失われるという点で区別することができる。
BLASTタンパク質プログラム(スコア= 50、ワード長= 3)を用いて、BLASTタンパク質検索を行う。比較目的のためのギャップ付きアラインメントを得るために、Altschul et al,(1997)Nucleic Acids Res. 25:3389-3402で説明しているGapped BLASTを利用する。BLAST及びGapped BLASTプログラムを利用する場合、それぞれのプログラムのデフォルトパラメータを使用する。配列一致分析は、Shuffle-LAGAN(Brudno M.、Bioinformatics 2003b、19 Suppl 1:I54-162)又はマルコフランダムフィールドのような確立された相同性マッピング技術によって補完してもよい。本出願において配列同一性率が参照される場合、特に示さない限り、これらの比率は、より長い配列の全長を基準として計算される。 「ハイブリダイゼーション」は、2つの核酸配列間の配列同一性又は相同性の尺度として使用することもできる。 F、N、又はM2-1、又はこれらのいずれかの一部をコードする核酸配列は、標準ハイブリダイゼーション技術に従ってハイブリダイゼーションプローブとして使用することができる。ハイブリダイゼーション条件は、当業者に公知であり、例えばCurrent Protocols in Molecular Biology、John Wiley&Sons、NY、6.3.1-6.3.6,1991に見出すことができる。「中程度のハイブリダイゼーション条件」は、 30℃で2×塩化ナトリウム/クエン酸ナトリウム(SSC)中でハイブリダイゼーションした後、50℃で1×SSC、0.1%SDSで洗浄することと同等である。 「高度に厳しい条件」は、45℃での6X塩化ナトリウム/クエン酸ナトリウム(SSC)中でのハイブリダイゼーションとそれに続く65℃で0.2×SSC、0.1%SDS中での洗浄と等価であると定義される。
本発明の文脈で使用することがある「生理学的緩衝溶液」には、限定されないが、塩化ナトリウム溶液、脱塩水、ならびにリン酸緩衝液、クエン酸緩衝液、トリス緩衝液(トリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン)、HEPES緩衝液([4(2ヒドロキシエチル)ピペラジノ]エタンスルホン酸)又はMOPS緩衝液(3モルホリノ-1プロパンスルホン酸)などを含むが、これらに限定しない。それぞれの緩衝液の選択は、一般に、所定の緩衝液モル濃度に依存する。リン酸緩衝液は、例えば注射溶液及び注入溶液に適している。
(i) 第1、第2又は第1及び第2の両方のRGDループ及び/又はVループ中の少なくとも1つの標的特異的結合ドメイン;及び/又は
(ii) 第1、第2又は第1及び第2の両方のRGDループ及び/又はVループの1つ又は複数の非アデノウイルスポリペプチド;及び/又は
(iii) ペントンベースプロトマーのN末端及び/又はC末端の非アデノウイルスポリペプチド;及び/又は
(iv) 第1、第2又は第1及び第2の両方のRGDループ、Vループ及び/又はペントンベースプロトマーのN末端ドメインにおける少なくとも1つの異種結合残基であって、ペントンベースプロトマー内のN末端ドメインの末端は、以下のように定義される:
X1-G-R-N-S-I-R(配列番号44)
又、ペントンベースプロトマー内のN末端ドメインのC末端は以下のように定義される:
D-X2-R-S-R-G(配列番号45)、
ここで
X1はG及びE、好ましくはEからなる群から選択され、又
X2は、D及びE、好ましくはEからなる群から選択され、及び/又は
(v) 第1、第2又は第1及び第2の両方のRGDループの2つ以上のアミノ酸と及び/又はペントンベースプロトマーのVループの2つ以上のアミノ酸と共有結合又は非共有結合した薬物、標識及び/又はポリペプチ;及び/又は
(vi) ペントンベースプロトマーのアデノウイルスファイバータンパク質結合クレフトの少なくとも1つの異種カップリング残基であって、改変されたポリペプチドは、好ましくは、VLPに組み立てることができる。
(i) 第1、第2又は第1及び第2の両方のRGDループ及び/又はVループに少なくとも1つの標的特異的結合ドメインを含む;及び/又は
(ii) ペントンベースプロトマーのN末端及び/又はC末端の非アデノウイルスポリペプチド;及び/又は
(iii) 第1、第2又は第1及び第2の両方のRGDループ、Vループ及び/又はペントンベースプロトマーのN末端ドメインにおける少なくとも1つの異種結合残基であって、ペントンベースプロトマー内のN末端ドメインの末端は、以下のように定義される:
X1-G-R-N-S-I-R(配列番号44)
又、ペントンベースプロトマー内のN末端ドメインのC末端は以下のように定義される:
D-X2-R-S-R-G(配列番号45)、
ここで
X1は、G及びE、好ましくはEからなる群から選択され、又
X2は、D及びE、好ましくはEからなる群から選択され;及び/又は
(iv) 第1、第2又は第1及び第2の両方のRGDループの2つ以上のアミノ酸と及び/又はペントンベースプロトマーのVループの2つ以上のアミノ酸と共有結合又は非共有結合した薬物、標識及び/又はポリペプチ;及び/又は
(v) ペントンベースプロトマーのアデノウイルスファイバータンパク質結合クレフトの少なくとも1つの異種カップリング残基であって、改変されたポリペプチドは、好ましくは、VLPに組み立てることができる。
本発明者らは、ペントン基質プロトマーのN末端及び/又はC末端のいずれかに位置するポリペプチドがペントン及びそれに続くVLPアセンブリと干渉せずまたアセンブルされたVLP中で表面露出されることを観察した。したがって、さらなる代替の実施形態(iii)において、非アデノウイルスポリペプチドは、介在ペプチドリンカーの有無に関係なく、ペントンベースプロトマーのN末端及び/又はC末端に連結され得る。したがって、第1及び/又は第2の実施形態と組み合わせると、ペントンベースのプロトマーは、1つ又は複数のループ、好ましくは3つのループすべてにおいて、ならびにN末端、C末端又はN及びC末端に非アデノウイルスポリペプチドを含み得る。この代替実施形態は、他の代替実施形態(i)、(iii)、(iv)、(v)及び/又は(vi)の少なくとも1つと組み合わせられることが好ましい。
X1-G-R-N-S-I-R(配列番号44)
ペントンベースプロトマー内のN末端ドメインのC末端は、以下のように定義されることが好ましい:
D-X2-R-S-R-G(配列番号45)、
ここで
X1はG及びE、好ましくはEからなる群から選択され、及び
X2は、D及びEからなる群から選択される。
P-T-X1-Xc-R-N-Xc-I-R(配列番号: 50)。
P-T-X1-G-R-Xc-S-I-R(配列番号: 51)及びT-Q-T-I-N-X60-Xc-X61(配列番号: 52)
又は
P-T-X1-G-R-N-Xc-I-R(配列番号: 53)及び
T-C-P-Xc-V-X62-K-A-L-G(配列番号: 54)
ここで
X1はG及びE、好ましくはEからなる群から選択される
Xcは各場合のは結合残基、好ましくはCであり; D、E及びK、最も好ましくはC;
X60は、F、I及びL、好ましくはF及びL、最も好ましくはFからなる群から選択され、
X61は、D及びE、好ましくはEからなる群から選択され;また
X62は、H及びY、好ましくはYからなる群から選択される。
実施形態(i)による少なくとも1つの標的特異的結合ドメインの挿入、及び/又は実施形態(ii)による1つ以上の非アデノウイルスペプチドの挿入、及び/又は実施形態(iv)による少なくとも1つの異種結合残基の挿入、及び/又は第1、第2及び第1及び第2の両方のRGDループの1つ又は複数のアミノ酸並びに実施形態(v)によるVループの1つ以上のアミノ酸への薬物又はポリペプチドの共有結合又は非共有結合が配列番号:65〜67のアミノ酸312〜339の間で発生すること及び/又は第2 RGDループへの挿入が配列番号:65~67のアミノ酸150~178の間で発生すること及び/又はVループへの挿入が配列番号:65〜67のアミノ酸65〜67の間で発生することが好ましい。このような挿入は、第1及び第2のTGDループ及びVループに属するそれぞれ示されたアミノ酸のうちの全部又は一部を削除することがある。
本発明の改変タンパク質によって形成されたペントン及びVLPの熱安定化は、本発明の改変タンパク質の他の代替実施形態のいずれかとの関連においても望ましい。従って、N末端ドメインに関連して上記(iv)で言及された代替実施形態は、この代替形態(v)、(vi)がN末端ドメインに関連しない限りは、代替実施形態(i)、(ii)、(iii)、(v)又は(vi)の一つ又は複数と組み合わせることが好ましい。(iv)及び(vi)で言及された代替実施形態が、改変されたペントンベースプロトマー中に存在し、又この代替の実施形態、すなわち、(v)がN末端ドメインに関連しない限り、(i)、(ii)、(iii)、(iv)の1つ以上と組み合わされることが好ましい、
好ましい実施形態では、アデノウイルスファイバーのフラグメントを使用して、部分、例えば、ポリペプチド、薬物、又は標識などを、ペントンベースプロトマー、アセンブルされたペントン及び/又はアセンブルされたVLPに非共有結合的に結合する。この相互作用は、本発明の第1態様の改変ポリペプチド中に存在するペントンベースプロトマーのアデノウイルスファイバータンパク質結合クレフトを介して媒介される。以下に記載される好ましい実施形態では、ファイバーフラグメントは、ファイバーフラグメントのペントンベースプロトマーへの共有結合のための異種結合残基を含む。結合残基は、カウンターパート、すなわち共有結合を形成し得る残基を必要とするので、ペントンベースプロトマーのアデノウイルスファイバータンパク質結合クレフトに含まれる少なくとも1つの異種結合残基は、本発明の第1態様の改変タンパク質のさらに好ましい代替実施形態(vi)である。結合クレフト及びファイバータンパク質フラグメントの結合残基は、ファイバータンパク質フラグメントがペントンベースプロトマーのクレフトに結合すると共有結合の形成を可能にするように配置される。
(i)非アデノウイルスペプチドと関連し、及び/又は
(ii)薬物又は標識に共有結合又は非共有結合している。
本発明の第2態様の改変ポリペプチドに含まれるペントンベースプロトマーのアデノウイルスファイバータンパク質結合クレフトに特異的に結合する少なくとも1つのアデノウイルスファイバータンパク質N末端フラグメントは、本明細書を通して、「粘着剤」(STICKER) とも呼ばれる。
X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-X10-X11(配列番号15)
ここで
X3は、D、E及びNからなる群から選択され、好ましくはDであり;
X4は、V、L及びIからなる群から選択され、好ましくはVであり;
X5は任意のアミノ酸であり、好ましくはA、D、E、K、S及びTからなる群から選択され、より好ましくはTであり;
X6は任意のアミノ酸であり、好ましくはA、D、E及びKからなる群から選択され、より好ましくはAであり;
X7は、F、Y及びWからなる群から選択され、好ましくはYであり;
X8は、A、D、E、N及びQからなる群から選択され、好ましくはE又はQであり、より好ましくはEであり;
X9は、好ましくはA、D、E、N及びKからなる群から選択される任意のアミノ酸であり、より好ましくはEであり;
X10は、S又はTからなる群から選択され、好ましくはSであり;そして
X11は任意のアミノ酸であり、第1のRGDループのN末端アミノ酸を構成する。
及び/又は
以下の配列は、第1のRGDループのC末端を規定し、同時に、ペントンベースプロトマー内の第2のRGDループのN末端を規定する:
X12-X13-X14-X15-X16(配列番号16)
ここで
X12は任意のアミノ酸であり、第1のRGDループのC末端アミノ酸を構成する。
X13はRであり;
X14はGであり;
X15はDであり;そして
X16は第2のRGDループの任意のアミノ酸及びN末端アミノ酸であり;
及び/又は
以下の配列は、ペントンベースプロトマー内の第2のRGDループのC末端を構成する。
X17-X18-X19-X20-X21-X22-X23-X24(配列番号17)。
ここで
X17は任意のアミノ酸であり、第2のRGDループのC末端アミノ酸を構成する。
X18は、I、L及びVからなる群から選択され、好ましくはIであり;
X19は、D、E、K、N、Q及びVからなる群から選択され、好ましくはQ又はKであり、より好ましくはQであり;
X20は、C、G及びPからなる群から選択され、好ましくはPであり;
X21は、I、L及びVからなる群から選択され、好ましくはL又はVであり、より好ましくはLであり;
X22は、D、E、S及びTからなる群から選択され、好ましくはE又はTであり、より好ましくはEであり;
X23は、D、E、K、S及びTからなる群から選択され、好ましくはE、K又はTであり、より好ましくはKであり;そして
X24は、D及びEからなる群から選択され、好ましくはDである。
同様に、以下の配列は、ペントンベースプロトマーのVループのN末端を規定する:
X25-X26-X27-X28-X29-X30-X31-X32(配列番号18)。
ここで
X25は、F、Y及びWからなる群から選択され、好ましくはFであり;
X26は、H、K及びRからなる群から選択され、好ましくはKであり;
X27は、A、V、I及びLからなる群から選択され、好ましくはAであり;
X28は、H、K及びRからなる群から選択され、好ましくはRであり;
X29は、A、V、I及びLからなる群から選択され、好ましくはVであり;
X30は、A、V、I、L及びMからなる群から選択され、好ましくはMであり;
X31は、A、V、I及びLからなる群から選択され、好ましくはVであり;そして
X32は任意のアミノ酸であり、VループのN末端アミノ酸を構成する。
及び/又は
以下の配列は、VループのC末端を規定する
X33-X34-X35-X36-X37-X38-X39(配列番号19)
ここで
X33は任意のアミノ酸であり、VループのC末端アミノ酸を構成する。
X34は、F、Y及びWからなる群から選択され、好ましくはYであり;
X35は、D、E、S及びTからなる群から選択され、好ましくはE又はTであり、より好ましくはEであり;
X36は、F、Y及びWからなる群から選択され、好ましくはWであり;
X37は、A、F、V、Y及びWからなる群から選択され、好ましくはF又はVであり、より好ましくはFであり;
X38は、D、E、S及びTからなる群から選択され、好ましくはD又はEであり、より好ましくはEであり;そして
X39は、F、Y及びWからなる群から選択され、好ましくはFであり;
及び/又は、ペントンベースプロトマー内の以下の非連続ペプチドの1つ以上がアデノウイルスファイバータンパク質結合クレフトを形成する(太字のアミノ酸はファイバーと直接相互作用する)
X32はN末端アミノ酸であり、X33はVループのC末端アミノ酸である。 Vループの1つ以上の又は全てのアミノ酸は、挿入された標的特異的結合ドメイン及び/又は非アデノウイルスポリペプチドによって置換されてもよい。
M-T-I-D-L-M-N-N-A-I-X40-X41-X42-Y-L-X43-X44-G-R-Q-X45-G-V-L-E-S (配列番号20)。
W-D-P-X46-T-X47-X48-P-G (配列番号46);
X49-V-X50-X51-Y-X52-X53 (配列番号);
X54-X55-R-S-Y (配列番号48);及び/又は
L-T-X56-V-F-N-R-F-P-X57 (配列番号49)
ここで
X40は、V、I及びLからなる群から選択され;
X41は、E及びDからなる群から選択され;
X42は、H、N及びQ、好ましくはH及びNからなる群から選択され;
X43は、K、E、R、Q及びAからなる群から選択され;
X44は、V、L及びI、好ましくはV及びIからなる群から選択され;
X45は、H、N及びQ、好ましくはH及びNからなる群から選択され;
X46は、V、I、L、E又はD、好ましくはV及びEからなる群から選択され;
X47は、V、L及びI、好ましくはV及びIからなる群から選択され;
X48は、M、T及びS、好ましくはM及びTからなる群から選択され;
X49は、D、E、N及びQ、好ましくはD及びNからなる群から選択され;
X50は、好ましくはA、D、P、K及びTからなる群から選択される任意のアミノ酸であり;
X51は、A、D、E、K及びRからなる群から選択され、好ましくはA、E及びKであり;
X52は、D、E、L、I、Q及びNからなる群から選択され、好ましくはE、L及びQであり;
X53は、A、D、E、K、N、Q及びRからなる群から選択され、好ましくはA、E、N及びKであり;
X54は、K、R、S及びT、好ましくはK、S及びTからなる群から選択され;
X55は、A、D、E、G、K、N、Q、R、S及びT、好ましくはD、G、K、N及びSからなる群から選択される。
X56は、H、K及びRからなる群から選択され、好ましくはH及びRであり;そして
X57は、D及びEからなる群から選択される。
驚くべきことに、大きな非相同ポリペプチドを、本発明のペントン及びその後のVLPのアセンブリを乱すことなく、第1及び/又は第2のRGDループに挿入され及び/又はこれを置換することができることが見出された。
本発明の第1又は第2態様の改変ポリペプチドの好ましい実施形態では、非アデノウイルスポリペプチド又は挿入又は結合されたポリペプチドは、免疫原性ペプチド、病原体中和ペプチド、ウイルスペプチド、細菌ペプチド、免疫調節ペプチド、及び癌ペプチドから構成される群から選ばれる。デング熱HAKKQDVVVLGSQEGAM(配列番号: 55)、Cチクングニア熱STKDNFNVYKATRPYLAH(配列番号: 56)及びZジカウイルスSTKDNFNVYKATRPLAH(配列番号: 57)のウイルスペプチドが特に好ましい。STICKER及びチクングニア熱ペプチドを含む本発明の第2態様の改変ポリペプチドの例は、AKRARLSTSFNPVPYEDESSTKDNFNVYKATRPYLAH(配列番号: 58)、AKRARLSTSFNPVPYEDECSSTKDNFNVYKATRPYLAH(配列番号: 59)及びAKRARLSTCFNPVPYEDESSTKDNFNVYKATRPYLAH(配列番号: 60)である。後者の2つの例は、結合残基、すなわち、ペントンベースプロトマーのファイバーの結合クレフト中の対応する結合残基と共有結合を形成するためのCysを含む。
X58-F-N-P-V-Y-P-Y-X59(配列番号: 43)
ここで
X58は、S、D及びT、好ましくはS又はDからなる群から選択され、より好ましくはSであり;又
X59は、E、D及びG、好ましくはE又はDからなる群から選択され、より好ましくはEである。
好ましくは、ファイバータンパク質フラグメントは、ファイバーの9〜20連続アミノ酸の長さを有する。
KSFX64NXc1Xc2AVY(配列番号: 68)
ここで
X64は、Y及びFからなる群から選択され、好ましくはYであり;
Xc1は、D、E及び結合残基からなる群から選択され、好ましくはCysであり;
Xc2は、L、Q及び結合残基からなる群から選択され、好ましくはCysであり;
又、ここでXc1及びXc2の少なくとも1つ、好ましくはこれら両方が結合残基、好ましくはCysである。
ペントンベースプロトマー中の結合残基がアミノ酸位置476及び/又は477又は別のアデノウイルスのペントンベースプロトマーの類似のアミノ酸位置に位置する場合には、本発明の第2態様の改変ポリペプチドの対応する結合残基がポリペプチドのSTICKER部分のC末端に結合残基を含むことが望ましい。結合残基は、以下の配列に示すように、STICKER内に位置することが好ましい。
X58-F-N-P-V-Y-P-Y-X59-(X63)n-Xc (配列番号: 69)
ここで
X58は、S、D及びT、好ましくはS又はD、より好ましくはSからなる群から選択され; 又
X59は、E、D及びG、好ましくはE又はD、より好ましくはEからなる群から選択され;
X63はいずれの場合も独立して任意のアミノ酸、好ましくはこの又はこれらの位置でファイバータンパク質に天然に存在するアミノ酸であり;
Xcは結合残基、好ましくはC、D、E、及びKであり、最も好ましくはCであり; 又
nは0〜10の整数、すなわち0,1,2,3,4,5,6,7,8,9又は10、好ましくは1〜5、より好ましくは2である。
このように、本発明の第2態様の改変タンパク質は、好ましい形態において、配列番号: 69のSTICKERポリペプチドを含む。本発明の第2態様の改変タンパク質に含まれ得る特に好ましいSTICKERポリペプチドは、次の通りである
A-K-R-A-R-L-S-T-X58-F-N-P-V-Y-P-Y-X59-D-E-Xc(配列番号: 76)
ここで
X58は、S、D及びT、好ましくはS又はDからなる群から選択され、より好ましくはSであり;
X59は、E、D及びG、好ましくはE又はDからなる群から選択され、より好ましくはEであり; 又
Xcは結合残基、好ましくはC、D、E及びKであり、最も好ましくはCである。
A-K-R-A-R-L-S-T-S-F-N-P-V-Y-P-Y-E-D-E-C(配列番号: 77)
Xc-X65-R-S-Y-N(配列番号: 73)
ここで
Xcは結合残基、好ましくはC、D、E、及びKであり、最も好ましくはCであり; 又
X65は任意のアミノ酸であり、好ましくはD、E、G、K、N又はS、より好ましくはS又はNからなる群から選択される。
結合残基がこの位置に含まれる場合、本発明の第2態様の改変ポリペプチドは、以下のアミノ酸配列に示される対応する結合残基を含むことが好ましい:
Xc-F-N-P-V-Y-P-Y-X59(配列番号: 70)
ここで
X59は、E、D及びG、好ましくはE又はD、より好ましくはEからなる群から選択され;及び/又は
Xcは結合残基、好ましくはC、D、E、及びKであり、最も好ましくはCである。
A-K-R-A-R-L-S-T-XC-F-N-P-V-Y-P-Y-X59-D-E-S(配列番号: 74)
ここで
Xcは結合残基、好ましくはC、D、E、及びKであり、最も好ましくはCであり; 又
X59は、E、D及びG、好ましくはE又はD、より好ましくはEからなる群から選択される。
特に好ましい実施形態では、STICKERポリペプチドは、位置9に結合残基Cysを含み、以下のアミノ酸配列からなる:
A-K-R-A-R-L-S-T-C-F-N-P-V-Y-P-Y-E-D-E-S(配列番号: 75)
第4態様において、本発明は、本発明の核酸を含む発現ベクターに関する。発現ベクターは、プラスミド及びウイルスベクターを含み又本発明の第1及び/又は第2態様の改変タンパク質をコードするコード配列及び特定の宿主生物(例えば、細菌、酵母、植物、昆虫、又は哺乳動物)又はインビトロ発現系における作動可能に連結されたコード配列の発現に必要な適切なDNA配列を含む。)又はインビトロ発現系で発現させることができる。クローニングベクターは、一般に、一部の希望されたDNAフラグメントを改変して増幅するために使用され、希望されたDNAフラグメントの発現に必要な機能的配列を欠いている可能性がある。
当分野では、抗原性エピトープを急速に変化させる疾患、例えば、インフルエンザ、又は患者特異的エピトープ混合物により特徴付けられる疾患に対する免疫付与がクチンの迅速な適応又は個体化を必要とすることが認識されている。本発明のVLPは、それぞれ希望する抗原を表示するように迅速に適合させることができる。したがって、本発明は、第5態様において、第1及び/又は第2のRGDループ又はVループへの核酸セグメントの迅速挿入に適したクローニングベクターに関するもので、一つ又は複数の希望する抗原をコードする。本発明のこの形態のクローニングベクターは、次のものを含む。
(i)アデノウイルスペントンベースプロトマーを含むポリペプチドで、前記ペントンベースプロトマーは、第1のRGDループ、第2のRGDループ、可変ループ及び/又は非アデノウイルスペプチドをコードする核酸を第1のRGDループ、第2のRGDループ、可変ループをコードする核酸に挿入するのに適したアデノウイルスファイバータンパク質の結合部位を含む;又は、
(ii)非アデノウイルスペプチドをコードする核酸をC及び/又はN末端に導入するのに適したアデノウイルスペントンベースプロトマー結合ファイバータンパク質フラグメントを含むポリペプチド。
野生型ペントンベースプロトマーから構成又は含有するVLPは、賦形剤を提供するために利用され、これらのVLPは本発明の第2態様の改変ポリペプチドを利用することにより異なる非アデノウイルスポリペプチドで修飾されることも想定されている。本発明の第2態様の改変ポリペプチドが好ましい実施形態では短くなることから、例えば、固体化学によって1日以内に合成することができる。達成される。したがって、第9態様では、本発明は、5つのアデノウイルスペントンベースプロトマー及び本発明の第2の態様の少なくとも1つの改変ポリペプチドをそれぞれ含む12量体を含むVLPに関する。ペントンベースプロトマーの全てのファイバータンパク質結合クレフトが占有され、したがってこれらのVLPが本発明の第2態様の60個の改変ポリペプチドを含むことが好ましい。
(a)本発明の組換え宿主細胞を提供する;
(b)改変されたポリペプチドを発現させる;及び
(c)改変されたポリペプチドを精製する。
(a)本発明のクローニングベクターを提供する;
(b)疾患又は患者に特異的な非アデノウイルスペプチドのアミノ酸配列を確定する;
(c)該非アデノウイルスペプチドの少なくとも1つをコードする核酸を、アデノウイルスペントンベースの第1のRGDループ、第2のRGDループ、及び/又はアデノウイルスペントンベースプロトマーの可変ループコードする核酸に、及び/又は、ファイバータンパク質フラグメントを結合するアデノウイルスペントンベースプロトマーを含む改変ポリペプチドのN又はC末端をコードする核酸の前又は後の核酸位置で挿入する。
(d)宿主細胞の改変アデノウイルスペントンベースプロトマーを、望ましくは、ファイバータンパク質フラグメントを結合するアデノウイルスペントンベースプロトマーを含む改変ポリペプチドと一緒に発現させる;及び
(e)ファイバータンパク質フラグメントを結合するアデノウイルスペントンベースプロトマーを含むVLP、又はファイバータンパク質フラグメントを結合するアデノウイルスペントンベースプロトマーを含む該改変ポリペプチドを精製する。
(a)本発明のクローニングベクターを提供する;
(b)疾患又は患者に特異的な非アデノウイルスペプチドのアミノ酸配列を確定する;
(c)該非アデノウイルスポリペプチドの少なくとも1つをコードする核酸を、ファイバータンパク質フラグメントを含む改変ポリペプチドのN末端又はC末端をコードする核酸の前又は後の核酸位置において挿入する。
(d)選択的に、アデノウイルスペントンベースプロトマーと一緒に宿主細胞中でファイバータンパク質フラグメントを結合するアデノウイルスペントンベースプロトマーを含む改変されたポリペプチドを発現させる。
(e1)ファイバータンパク質フラグメント結合アデノウイルスペントンベースプロトマーを含む前記改変されたポリペプチドを精製し、本発明のアデノウイルスペントンベースプロトマー又は改変されたアデノウイルスペントンベースプロトマーと混合するか、又は
(e2)アデノウイルスペントンベースプロトマーが共発現されている場合に該VLPを精製する。
(a)疾患又は患者に特異的な非アデノウイルスペプチドのアミノ酸配列を確定する。
(b)ファイバータンパク質フラグメントを結合するアデノウイルスペントンベースプロトマー及び該非アデノウイルスペプチドの少なくとも1つを含む、本発明の改変ポリペプチドを合成する工程、又は、
(c)該改変ポリペプチドをアデノウイルスペントンベースプロトマーと又は該発明の改変アデノウイルスペントンベースプロトマーを本発明の五量体又は本発明のVLPと混合する工程。
さらに、そのような医薬組成物は、アジュバント及び/又は追加の活性成分などの他の薬理学的に活性な物質を含むことができるが、これに限定されない。本発明の文脈におけるアジュバントとしては、無機アジュバント、有機アジュバント、油性アジュバント、サイトカイン、微粒子アジュバント、ビロソーム、細菌アジュバント、合成アジュバント、又は合成ポリヌクレオチドアジュバントが挙げられるが、これらに限定されない。
第17態様において、本発明は、本発明のアデノウイルスペントンベースプロトマーを含む改変ポリペプチド及び/又は、ファイバータンパク質フラグメント結合アデノウイルスペントンベースプロトマー、本発明の1以上の改変タンパク質をコードする核酸、本発明の発現ベクター又は感染性疾患、免疫疾患又は癌を治療及び/又は予防するための本発明のVLP含む本発明の改変ポリペプチドに関する。
ADDomerは、非常に高収率(1リットルの発現培養物につき数10グラム)で設計され製造された。 ADDomerを精製して均質的にするための一般的な3工程プロトコルが確定された(下記参照)。概念実証プロジェクトでは、高度に免疫原性を有するエピトープを、ADDomerの機能化ループに挿入することが実験的に確定された。この際、粒子形成を混乱させることなく、又は、収率を顕著に低下させることはなかった。 チクングニア熱エピトープを含むADDomersを均質的に精製し、細胞ベースで動物試験を開始して、ワクチン候補としての効力を確定した。 ADDomerは、電子顕微鏡法、均質に構造化された離散多量体(十二面体)を含む様々な技術で確認された。システイン - ジスルフィド化学は、ADDomerの既に顕著な熱安定性(冷鎖要求の排除)をさらに高めるために実施された。さらに、ペプチドエピトープのみならず、タンパク質ドメイン及び高親和性結合剤(ナノボディDARPins、抗体フラグメント)を含むタンパク質全体を含むADDomersーを調製し、これらを大規模に製造するための効率的なプロトルを確立しつつある。 ジカ熱ウイルスの最近の出現により引き起こされたADDomerベースのZジカ熱ワクチン候補も設計され、ADDomersも同時に複数の病気と闘うように設計された(コンボワクチン)。これらを検証する細胞ベース及び動物実験が行われる。
以下においては、ADDomer VLP及びADDomer VLPワクチンを生成及び検証するための実験及びプロトコルが記載されている
天然に発生する12量体の種(例えば、アデノウイルスAd3血清型に由来)の原子構造は、X線結晶構造解析によって確定さた(Szolajska Eら、PLoS One。2012; 7(9):e46075及びZubieta C et al、Mol Cell 2005:17(1):121-35)。原子構造の注意深い検査により、拡張ループ構造の存在が解明された。より正確にいえば、野生型12量体のいわゆるRGDループにおける1つの可変ループ(Vループと呼ぶ)及び2つの領域が、機能化の潜在的部位として同定された。多数の12量体プロトマーの比較により、長さ及び配列組成の両方において、種全体のV-ループ及び2つのRGD-ループ領域の幅広い変動性が明らかになり、それらの可能性が明らかとなった。この情報を使用して、我々は合成デザイナー12量体プロモーターをコード化するDNA配列を新規に設計した。エンドヌクレアーゼ切断部位を表すDNA配列を導入することにより、V-ループ及び2つのRGDを表すアミノ酸の設計された変異(ランダム化を含めて)を促進することによって、BioBrick設計(Shetty et al. J。Biol。End。2008) (RGDloop2、RGDloop2)が適用された。野生型ヒトAd3血清型12量体の高い溶解性及び構造完全性を維持しながら、上記ループ領域の完全なBioBrick設計を特徴とする組換え12量体(ADDomer)を生じるプロトマーが同定されるまで、プロトマー設計の最適化を繰り返した。
ADDomerは、すでに非常に熱安定性があり、37℃で長時間保管することができ、インフラが不十分な遠隔地でのコールドチェーンを必要としないことを示している。 天然のAd3粒子の結晶座標を調べると、いわゆる「ストランドスワッピング」領域が明らかになり、プロトマーのセグメントが隣接するプロトマーの近傍まで伸びて、その結果として、共有結合の形成を可能にする距離内にあるアミノ酸が並置された 。我々は、ADDomer中にある、これらのアミノ酸をシステインで遺伝的に置換し、それぞれ異なるプロトマー由来の2つのシステインがジスルフィド結合形成に必要な距離内にあった。
次に、MultiBacシステムを用いてADDomerを発現された。ADDomerをコードする遺伝子は、最初から合成され(S配列番号63:63及びコードされたADDomerは配列番号64で提供)、古典的クローニング法(制限/ライゲーション)によってMultiBacシステムの伝達プラスミドであるpACEBacに挿入された。ADDomer遺伝子を含む合成 MultiBacは、ADDomerのような複雑な生物製剤の製造のために発明者の1人(Berger)によって特別に開発された。ADDomer遺伝子を含む合成MultiBacウイルスが調整され(図7及び8参照)、既述のプロトコル(Berger Iet al.、J Vis Exp.(2013)77):e50159及びFitzgerald DJ et al. Nat Methods(2006)3(12):1021)を用いて感染させた昆虫細胞培養物を調製した。 ADDomerタンパク質含有細胞ペレットを、記載のように遠心分離によって調製した。細胞ペレットを-80℃で保存した。ペプチド又はタンパク質エピトープが挿入されたADDomerの発現、ならびに超安定性ADDomerの発現が、比較可能で、非常に高い収率及び均質に構造化された12面体粒子をすべて生じさせた。
例として、主要な中和チクングニア熱免疫エピトープHAKKQDVVVLGSQEGAM(配列番号55)の複数のコピーを表示するADDomer-CHIKADDomerベースのVLPワクチン候補が構築された。主要中和免疫エピトープはチクングニア熱エンベロープタンパク質の一部であり、極端にあるN末端に位置する直鎖ペプチドエピトープである(Kam YWet al.、EMBO Mol Med。(2012); 4(4):330-4)。圧倒的多数の患者血清において、この線状ペプチドエピトープと反応する抗体が見出される。 ADDomerは、制限された様式(ADDomerスキャホールドに共有結合したN及びC末端)、又は非制限的な様式(特定のプロテアーゼによる切断によって遊離されたN末端)、又は制限と非制限が組み合わさった様式のいずれかで、ADDomerスキャホールドの構造的完全性を維持しつつ線状エピトープを表示する手段を提供する。使用される好ましい構成は以下の通りである。AKRARLSTSFNPVPYEDESSTKDNFNVYKATRPYLAH(配列番号:58)、AKRARLSTSFNPVPYEDECSSTKDNFNVYKATRPYLAH(配列番号:59)及びAKRARLSTCFNPVPYEDESSTKDNFNVYKATRPYLAH(配列番号:60)。 チクングニア熱の主要な中和エピトープの自然様の表示は、それぞれが中和エピトープ配列に先行した特異的TEV切断部位を含み、自然のN末端を保持し、エピトープの複数コピーを表示するADDomerのTEVプロテアーゼ媒介切断によって達成された。同様のアプローチは、 ADDomerによって表示される任意のエピトープ又はペプチド又はタンパク質ドメインに対して利用することができる。
Spodoptera frugiperda Sf21昆虫細胞ペレットは凍結融解により溶解された。溶解物を、昆虫細胞の標準的なプロトコルに従って遠心分離により清浄化した(Berger I 他、J Vis Exp。(2013)(77):e50159及びFitzgerald DJ et al.、Nat Methods、2006 3(12):1021)。 清浄化した上清を15〜40%スクロース勾配でロードし、Beckman SW41ローターを用いて一晩遠心分離した。1.1mLの画分が勾配の頂部から回収され、タンパク質の内容を分析し、サイズ排除クロマトグラフィー(SEC)をプールするために変性SDSポリアクリルアミド電気泳動(SDS-PAGE)にロードされ、 及び/又はイオン交換(IEX)がスクロース透析の後に行われた。
精製されたADDomer及びADDomer変異体を、ネガティブステイン電子顕微鏡(EM)によって可視化して、それらのアセンブリ状態及びそれらの構造的完全性を評価した。担体物質上に沈着させる前に、約0.1mg / mlの濃度のADDomerと共に標準的なマイカ - 炭素調製物を利用した。試料を1%(wt / vol)のケイ素タングステン酸ナトリウム(pH7.0)を用いて染色し、JEOL電子顕微鏡により100kVで可視化した。画像の記録及び分析は、Gatanが提供するソフトウェアを用いて行った。 熱安定性実験のために、ADDモノマーを凍結、4℃、室温(室温)又は37℃で1週間保存した。電子顕微鏡法では、室温又は37℃での保存により、正確に自己集合した粒子が熱安定性を示すことが示された。 45℃での2時間のADDomer(配列番号64)のインキュベーションは、可逆的な粒子の分解をもたらし、室温で戻したときに再集合した。この可逆的解離は、熱移動アッセイ(図10、矢印参照)によっても観察されたが、50℃超の温度でのみ不可逆的な解離が見られた。
ADDomer-CHIK チクングニア熱 ADDomer VLPワクチン候補のネズミ免疫分析のために、6週齢のBALB / c雌マウスを使用した。8匹のマウスからなる4群(例えば、チクングニア熱 VLPワクチン候補の場合、i)ADDomer、ii)ADDomer CHIK無制約エピトープ、iii)ADDomer CHIK制限エピトープ、iv)単離されたCHIK主要中和ペプチドエピトープ交差体 - 陽性対照としてKLHに連結した)。各動物に10μgのADDomer及びADDomer変異体を2週間間隔で注射した。 IgA、IgM、全IgG、IgG1 IgG2a及び抗CHIK抗体をELISAによりマウス血清から力価測定した。他のADDomer VLPワクチン候補の免疫分析も同様の方法で設計した。 ADDomer表面における2種類のエピトープディスプレイを試験した(制限付き及び緩和、以下の第7項目参照)。時間依存性応答が観察された(第0〜第6週)。抗Chikエピトープ応答を引き起こす拘束形態に対するエピトープの緩和された形態の優れた能力が示された(図12)。
目的のエピトープの上流にTEV切断部位を付加することにより、拘束された又は緩和された2つの異なる形態でのそのディスプレイが可能になる。 精製すると、エピトープは、ADDomerループに自然に拘束される。 室温で2時間、TEV(タバコエッチウイルス)プロテアーゼ(1/100 w:w)を添加することにより、エピトープを緩和し、スカフォールド表面で直線状に表示することができる。 切断効率は、SDS-PAGEによって容易に監視することができる。 注目すべきは、全体のADDomer足場はこの切断によって影響を受けないことである(図11)。
大きなエピトープ配列を運ぶADDomerの能力を評価した。 この目的のために、200アミノ酸長の人工エピトープをADDomer(拡張ADDomerと命名)に挿入した。 これにより、正しく自動アセンブルされたADDomerが得られた。 挿入は、図13に示すように、SDS-PAGE分析及び質量分析の両方によって確認した。
ADDomerの能力を広げるために、ADDomerで追加のエピトープの付加でが可能なシステムを開発した。単一のシステインを、ADDomer配列の特定の位置(K363C又はQ476C又はA477Cのいずれか)に挿入した。 K363Cは、20アミノ酸長のファイバータンパク質断片(配列番号59に由来するペプチドC20(配列番号77))との共有ジスルフィド架橋を形成するように設計され、Q476C又はA477Cは、別のファイバータンパク質フラグメント(配列番号60に由来するペプチドC9(配列番号75))と同様の作用を行うよに設計された。ペプチドを対応するCys修飾ADDomerとの共有結合的相互作用は、酸化状態(すなわち、β-メルカプトエタノールの不在)又は還元条件(β-メルカプトエタノールの添加)下で、対応するペプチドと粒子をインキュベートすることによって確認された。複合体をSDS-PAGE上で泳動し、ADDomerは特異的抗体及びCy3で標識した二次抗体によって検出され、ビオチン化したペプチドをAlexa488標識アビジンで検出された。右のCys-ADDomer /ペプチドを使用した場合、ペプチドの存在はADDomerバンドサイズで検出された(図14の円)。この相互作用は、還元条件下で妨げられたので、Cys-ADDomerとペプチドとの間に形成されたジスルフィド架橋に特異的であった。
1.第1のRGDループ、第2のRGDループ、可変ループ(Vループ)、アデノウイルスファイバータンパク質結合クレフト及び/又はN末端ドメインを含むアデノウイルスペントンベースのプロトマーを含む改変ポリペプチドで、以下の1以上のを含む:
(i)第1及び第2のRGDループの第1、第2又は両方、及び/又はVループ中の少なくとも1つの標的特異的結合ドメイン;及び/又は
(ii)第1及び第2のRGDループの第1、第2又はその両方及び/又はVループの1つ以上の非アデノウイルスペプチド;及び/又は
(iii)ペントンベースプロトマーのN末端及び/又はC末端の非アデノウイルスペプチド;及び/又は
(iv)ペントロンベースプロトマーのVループ及び/又はN末端ドメインにおける第1及び第2のRGDループにおける第1、第2又は両方の少なくとも1つの異種カップリング残基であって、ペントンベースプロトマー内のN末端ドメインの末端は、以下のように定義される:
X1-G-R-N-S-I-R(配列番号44)
ペントンベースプロトマー内のN末端ドメインのC末端は以下のように定義される:
D-X2-R-S-R-G(配列番号45)
ここで 、
X1は、G及びEからなる群から選択され、
X2は、D及びEからなる群から選択され;及び/又は
(v)第1及び第2のRGDループ及び/又はVループの1つ以上のアミノ酸の1以上ののアミノ酸の1以上ののアミノ酸に共有結合又は非共有結合した薬物、標識又はポリペプチドペントンベースプロトマー;及び/又は
(vi)ペントンベースプロトマーのアデノウイルスファイバータンパク質結合クレフトの少なくとも1つの異種カップリング残基で、 改変されたポリペプチドは、好ましくは、VLPに組み込むことができる。
2.少なくとも1つのアデノウイルスファイバータンパク質N末端フラグメントを含み、ペントンベースプロトマーのアデノウイルスファイバータンパク質結合クレフトに特異的に結合する改変ポリペプチドであって、
(i)非アデノウイルスペプチド及び/又は
(ii)は、薬物又は標識に共有結合又は非共有結合している。
3.項目1又は項目2による改変ポリペプがヒト又は非ヒトの類人猿のアデノウイルス、好ましくは、チンパンジー(Pan)、ゴリラ(Gorilla)及びオランウータン(Pongo)、より好ましくはBonobo(Pan paniscus)及びコモンチンパンジーおものである。
4.アデノウイルスが、以下のものから構成される群から選ばれた、項3による改変ポリペプチド。
hAd3、hAd4、hAd5、hAd7、hAd11、hAd26、hAd35、及びhAd49、ChAd3、ChAd4、ChAd5、ChAd6、ChAd7、ChAd8、ChAd9、及びChAd5 PanAd1、PanAd2、PanAd3、ChAd55、ChAd73、ChAd83、ChAd146、及びChAd147
5.野生型ペントンベースプロトマーの配列が、配列番号1から14からなる群から選択される、項目1又は項目3又は項目4による改変ポリペプチド。
6.第1項又は第3項から第5項に記載の改変ポリペプチドであって、以下の配列が、ペントンベースプロトマー内の第1RGDループのN末端を定義する
X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-X10-X11(配列番号15)
ここで
X3は、D、E及びNからなる群から選択され、好ましくはDであり;
X4は、V、L及びIからなる群から選択され、好ましくはVであり;
X5は任意のアミノ酸であり、好ましくはA、D、E、K、S及びTからなる群から選択され、より好ましくはTであり;
X6は任意のアミノ酸であり、好ましくはA、D、E及びKからなる群から選択され、より好ましくはAであり;
X7は、F、Y及びWからなる群から選択され、好ましくはYであり;
X8は、A、D、E、N及びQからなる群から選択され、好ましくはE又はQであり、より好ましくはEであり;
X9は、好ましくはA、D、E、N及びKからなる群から選択される任意のアミノ酸であり、より好ましくはEであり;
X10は、S又はTからなる群から選択され、好ましくはSであり;そして
X11は任意のアミノ酸であり、第1のRGDループのN末端アミノ酸を構成する。
次の配列は、第1のRGDループのC末端及び第2のRGDループのN末端をペントンベースプロトマー内に定義する:
X12-X13-X14-X15-X16(配列番号16)
ここに、
X12は任意のアミノ酸であり、第1のRGDループのC末端アミノ酸を構成する;
X13はRであり;
X14はGであり;
X15はDであり; そして
X16は任意のアミノ酸であり、第2のRGDループのN末端アミノ酸を構成する;
及び/又は
以下の配列は、ペントンベースプロトマー内の第2のRGDループのC末端を定義する:
X17-X18-X19-X20-X21-X22-X23-X24(配列番号17)
ここで
X17は、任意のアミノ酸であり、第2のRGDループのC末端アミノ酸を構成する;
X18は、I、L及びVからなる群から選択され、好ましくはIであり;
X19は、D、E、K、N、Q及びVからなる群から選択され、好ましくはQ又はKであり、より好ましくはQであり;
X20は、C、G及びPからなる群から選択され、好ましくはPであり;
X21は、I、L及びVからなる群から選択され、好ましくはL又はVであり、より好ましくはLであり;
X22は、D、E、S及びTからなる群から選択され、好ましくはE又はTであり、より好ましくはEであり;
X23は、D、E、K、S及びTからなる群から選択され、好ましくはE、K又はTであり、より好ましくはKであり;そして
X24は、D及びEからなる群から選択され、好ましくはDであり;
及び/又は
次のシーケンスは、VループのN末端を定義する:
X25-X26-X27-X28-X29-X30-X31-X32(配列番号18)。
ここで
X25は、F、Y及びWからなる群から選択され、好ましくはFであり;
X26は、H、K及びRからなる群から選択され、好ましくはKであり;
X27は、A、V、I及びLからなる群から選択され、好ましくはAであり;
X28は、H、K及びRからなる群から選択され、好ましくはRであり;
X29は、A、V、I及びLからなる群から選択され、好ましくはVであり;
X30は、A、V、I、L及びMからなる群から選択され、好ましくはMであり;
X31は、A、V、I及びLからなる群から選択され、好ましくはVであり;そして
X32は任意のアミノ酸であり、VループのN末端アミノ酸を構成する。
及び/又は
以下の配列は、VループのC末端を規定する:
X33-X34-X35-X36-X37-X38-X39(配列番号19)
ここで
X33は任意のアミノ酸であり、VループのC末端アミノ酸を構成する;
X 34は、F、Y及びWからなる群から選択され、好ましくはYであり;
X 35は、D、E、S及びTからなる群から選択され、好ましくはE又はTであり、より好ましくはEであり;
X 36は、F、Y及びWからなる群から選択され、好ましくはWであり;
X 37は、A、F、V、Y及びWからなる群から選択され、好ましくはF又はVであり、より好ましくはFであり;
X38は、D、E、S及びTからなる群から選択され、好ましくはD又はEであり、より好ましくはEであり;そして
X 39は、F、Y及びWからなる群から選択され、好ましくはFであり;
及び/又は、ペントンベースプロトマー内の以下の非連続ペプチドの1つ以上がアデノウイルスファイバータンパク質結合クレフトを形成する(太字のアミノ酸はファイバーと直接相互作用する)
M-T-I-D-L-M-N-N-A-I-X40-X41-X42-Y-L-X43-X44-G-R-Q-X45-G-V-L-E-S (配列番号20)。
W-D-P-X46-T-X47-X48-P-G (配列番号46);
X49-V-X50-X51-Y-X52-X53 (配列番号);
X54-X55-R-S-Y (配列番号48);及び/又は
L-T-X56-V-F-N-R-F-P-X57 (配列番号49)
ここで
X40は、V、I及びLからなる群から選択され;
X41は、E及びDからなる群から選択され;
X42は、H、N及びQ、好ましくはH及びNからなる群から選択され;
X43は、K、E、R、Q及びAからなる群から選択され;
X44は、V、L及びI、好ましくはV及びIからなる群から選択され;
X45は、H、N及びQ、好ましくはH及びNからなる群から選択され;
X46は、V、I、L、E又はD、好ましくはV及びEからなる群から選択され;
X47は、V、L及びI、好ましくはV及びIからなる群から選択され;
X48は、M、T及びS、好ましくはM及びTからなる群から選択され;
X49は、D、E、N及びQ、好ましくはD及びNからなる群から選択され;
X50は、好ましくはA、D、P、K及びTからなる群から選択される任意のアミノ酸であり;
X51は、A、D、E、K及びRからなる群から選択され、好ましくはA、E及びKであり;
X52は、D、E、L、I、Q及びNからなる群から選択され、好ましくはE、L及びQであり;
X53は、A、D、E、K、N、Q及びRからなる群から選択され、好ましくはA、E、N及びKであり;
X54は、K、R、S及びT、好ましくはK、S及びTからなる群から選択され;
X55は、A、D、E、G、K、N、Q、R、S及びT、好ましくはD、G、K、N及びSからなる群から選択される。
X56は、H、K及びRからなる群から選択され、好ましくはH及びRであり;そして
X57は、D及びEからなる群から選択される。
7.互いに独立して、X3〜X10のアミノ酸配列が、DVTAYEES(配列番号21)、DVDAYENS(配列番号22)、DVAEYEKS(配列番号22) 配列番号23)、DVEAYEKS(配列番号24)、DVDAYEKS(配列番号25)、DVSKYEAS(配列番号26)、NVKAYEDS(配列番号27)、DVKKYENS(配列番号28)、DVDAYQAS(配列番号29)及びDVDAYQAS(配列番号30)からなる群から選択され、X18〜X24のアミノ酸配列は、IQPLEKD(配列番号31)、IQPVEKD :32)、IKPLEKD(配列番号33)、IVPLTKD(配列番号34)、IEPVETD(配列番号35)及びIKPLTED(配列番号36)のアミノ酸配列において、X25〜 X33〜X39のアミノ酸配列は、FKARVMV(配列番号37)、FRAKLMV(配列番号38)及びFRAKVMV(配列番号39)からなる群から選択され、YEWFEF 配列番号40)、YEWVEF(配列番号41)及びYEWAEF(配列番号42)を含む。
8.第1のRGDループの標的特異的結合ドメインは、互いに独立して、5〜300アミノ酸、好ましくは6〜200アミノ酸の長さを有する、項目1又は3〜7のいずれかに記載の改変ポリペプチド。第2のRGDループの標的特異的結合ドメインは、5〜300アミノ酸、好ましくは10〜200アミノ酸の長さを有する。及び/又はVループ中の標的特異的結合ドメインは、5〜300アミノ酸、好ましくは10〜200アミノ酸の長さを有する。
9.標的特異的結合ドメインの少なくとも1つが、免疫原性ペプチド、病原体中和ペプチド、ウイルスペプチド、細菌ペプチド、免疫調節ペプチドに特異的に結合することができる、項目1又は3〜8のいずれかに記載の改変ポリペプチド。好ましくは細胞レセプター、低分子量タグ、好ましくはビオチン又はキチンの表面に結合することができる。
10.非アデノウイルスポリペプチド又はポリペプチドが、免疫原性ペプチド、病原体中和ペプチド、ウイルス性ペプチド、細菌性ペプチド、免疫調節性ペプチド及び癌ペプチドからなる群より選択される、項目1〜9のいずれかに記載の改変ポリペプチド。ペプチド。
11.非アデノウイルスペプチド又はペプチドがプロテアーゼ切断部位、好ましくは配列特異的エンドペプチダーゼ切断部位、より好ましくはタバコエッチウイルスNIaプロテアーゼ(TEV)を含む、項目10のいずれかに記載の改変ポリペプチド。
12.カップリング残基が、Lys、Cys、Asp、及びGlu、好ましくはCysを含む群から選択される、項目1〜11のいずれかに記載の改変ポリペプチド。
13.薬物が、化学療法薬、抗病原薬、免疫調節薬、及び抗炎症薬の群から選択される、項目1から項目12のいずれかに記載の改変ポリペプチド。
14.ァイバータンパク質断片が、以下を含む、項目2に記載の改変ポリペプチド。
X58-F-N-P-V-Y-P-Y-X59(配列番号43)
ここで
X58は、S、D及びTからなる群から選択され、好ましくはS又はDであり、より好ましくはSであり;そして
X59は、E、D及びGからなる群から選択され、好ましくはE又はDであり、より好ましくはEである。
15.前記ファイバータンパク質断片が9〜20アミノ酸の長さを有する、項目14に記載の改変ポリペプチド。
16.前記ファイバータンパク質断片のN末端及び/又はC末端に挿入された、及び/又は前記末端に位置する少なくとも1つのカップリング残基が、好ましくは挿入され、及び/又は配置されている、項目2及び14又は15に記載の改変ポリペプチド。配列番号43のN末端及び/又はC末端に存在するか、又はファイバータンパク質断片のアミノ酸に結合している。
17.項目1から16のいずれかに記載のポリペプチドをコードする核酸。
18.項目17の核酸を含む発現ベクター。
19.以下をコードするクローニングベクターであり、
(i)アデノウイルスペントンベースプロトマーを含むポリペプチドで、該ペントンベースプロトマーが、第1RGDループ、第2ループ、可変ルール、及び/又は第1のRGDループ、第2のRGDループ、可変ループをコードするアミノ酸に非アデノウイルスペプチドをコードする核酸を導入するためにに適合したアデノウイルスファイバータンパク質の結合部位を有する。又は、
(ii)非アデノウイルスペプチドをコードする核酸をC及び/又はN末端に導入するために適合したペントンベースプロトマーのアデノウイルスファイバータンパク質結合クレフト(cleft)に特異的に結合するアデノウイルスファイバータンパク質N末端フラグメントを含むポリペプチド。
20.項目19のクローニングベクターで、適合化に1以上の酵素部位で、好ましくは、BamHI、KpnI、KasI、NarI、SfdI、EcoRI及びRsrII、PfoI、BssHII、SalI、SacI、XbaI、BstEII及びHindIIIを含む。
21.項目18の発現ベクター、又は、項目19又は20のクローニングベクターを含む組み換え宿主細胞。
22.項目1、項目3から13に記載のアデノウイルスペントンベースプロトマーを含む5つの改変ポリペプチドを含む五量体。
23.項目22に記載の12の五量体を含むウイルス様粒子(VLP)。
24.請求項2〜4及び10〜16に記載のペントンベースプロトマーのアデノウイルスファイバータンパク質結合裂け目(cleft)に特異的に結合するアデノウイルスファイバータンパク質N末端フラグメントを含む少なくとも1つの改変ポリペプチドを含む、項目23に記載のVLP。
25.G51C、S555C、G53C、Y64C、S54C、D114Cなどのアミノ酸残基のCysに少なくとも1つの突然変異をさらに含む、項目24に記載のVLP。
26.請求項2から4のいずれか1項目に記載のアデノウイルスファイバータンパク質結合裂け目に特異的に結合するアデノウイルスファイバータンパク質N末端フラグメントを含む少なくとも1つの改変ポリペプチド及び5つのアデノウイルスペントンベースプロトマーを含む12の五量体10〜16。
27.請求項1〜16のいずれかに記載の改変ポリペプチドの製造方法であって、
(a)項目21の組換え宿主細胞を提供する;
(b)改変ポリペプチドを発現させる工程;そして
(c)改変ポリペプチドを精製する工程。
28.項目27に記載の方法、及び前記改変ポリペプチドをVLPにアセンブルする工程をさらに含む、項目23〜26のいずれか1項目に記載のVLPの製造方法。
29.VLPをプロテアーゼ、好ましくは配列特異的エンドペプチダーゼ切断部位、より好ましくはTEVと共にインキュベートする工程をさらに含む、項目28に記載の方法。
30.疾患及び/又は患者特異的非アデノウイルスペプチドを含む、項目23から26のいずれかに記載のVLPの製造方法であって、
(a)項目19及び/又は20のクローニングベクターを提供する;
(b)疾患又は患者特異的非アデノウイルスペプチドのアミノ酸配列を確定する;
(c)前記非アデノウイルスペプチドの少なくとも1つをコードする核酸を、第1のRGDループ、第2のRGDループ、及び/又はアデノウイルスペントンベースプロトマーの可変ループをコードする核酸に挿入すること、及び/又は核酸ペントンベースプロトマーのアデノウイルスファイバータンパク質結合クレフトに特異的に結合するアデノウイルスファイバータンパク質N末端フラグメントを含む改変ポリペプチドのN末端又はC末端をコードする核酸の前又は後の位置;
(d)必要に応じて、ペントンベースプロトマーのアデノウイルスファイバータンパク質結合クレフトに特異的に結合するアデノウイルスファイバータンパク質N末端フラグメントを含む改変ポリペプチドと一緒に、宿主細胞中で操作されたアデノウイルスペントンベースプロトマーを発現させる工程;そして
(e)場合によりアデノウイルスペントンベースプロトマー結合ファイバータンパク質断片を含むVLP、又はアデノウイルスペントンベースプロトマー結合ファイバータンパク質断片を含む前記改変ポリペプチドを精製する段階。
31. 疾患及び/又は患者特異的非アデノウイルスペプチドを含む、項目23〜26のいずれかに記載のVLPの製造方法であって、
(a)項目20のクローニングベクターを提供する工程;
(b)疾患又は患者特異的非アデノウイルスペプチドのアミノ酸配列を確定する;
(c)前記非アデノウイルスペプチドの少なくとも1つをコードする核酸を、前記改変ポリペプチドのN末端又はC末端をコードする核酸の前又は後の核酸位置に挿入すること;ペントンベースプロトマーのアデノウイルスファイバータンパク質結合クレフト;
(d)場合によりアデノウイルスペントンベースプロトマーと共に、宿主細胞中のペントンベースプロトマーのアデノウイルスファイバータンパク質結合クレフトに特異的に結合するアデノウイルスファイバータンパク質N末端フラグメントを含む改変ポリペプチドを発現させる工程;そして
(e1)アデノウイルスファイバータンパク質のN末端フラグメントを含む前記改変ポリペプチドを精製する工程と、アデノウイルスファイバータンパク質の結合部位にペントンベースのプロトマーのアデノウイルスペントンベースのプロトマー又はエンジニアリングアデノウイルスペントンベースのプロトマーと混合する工程と、 〜13;又は
(e2)前記アデノウイルスペントンベースプロトマーが共発現されている場合に前記VLPを精製する工程。
32.疾患及び/又は患者特異的非アデノウイルスペプチドを含む、項目23から26のいずれかに記載のVLPの製造方法であって、
(a)疾患又は患者特異的非アデノウイルスペプチドのアミノ酸配列を確定すること;
(b)ペントンベースプロトマーのアデノウイルスファイバータンパク質結合クレフトに特異的に結合するアデノウイルスファイバータンパク質N末端フラグメントと、前記非天然アミノ酸配列の少なくとも1つとを含む、項目2〜4及び10〜16のいずれかに記載の改変ポリペプチドを合成すること、アデノウイルスペプチド;そして
(c)前記改変ポリペプチドを、項目1又は3〜10のいずれかに記載のアデノウイルスペントンベースプロトマー又はアデノウイルスペントンベースプロトマーと、項目19に記載のVLPの項目18に記載の五量体とを混合する工程。
33. 項目28〜32のいずれかに記載の方法によって製造可能なVLP。
34. 項目1〜16のいずれかに記載の改変ポリペプチド、項目17の核酸、項目18の発現ベクター又は項目23〜26又は33のいずれかのVLP、及び薬学的に許容される担体を含む医薬組成物、及び/又は適切な賦形剤を含む。
35. 請求項1〜16のいずれかに記載の改変ポリペプチド、項目17の核酸、項目18の発現ベクター又は項目23〜26又は33のいずれかのVLP、感染症の治療及び/又は予防用のポリペプチド、免疫疾患又は癌である。
Claims (18)
- アデノウイルスペントンベースプロトマーを含む改変ポリペプチドであって、該ペントンベースプロトマーが、第1のRGDループ、第2のRGDループ、可変ループ(Vループ)、アデノウイルスファイバータンパク質結合クレフト及び/又はN末端ドメインを含み、更に、第1のRGDループ又は第2のRGDループ又は第1と第2の両方のRGDループ及び/又はVループ中に1つ以上の非アデノウイルスペプチドを含み、選択的に以下の1つ以上を含む改変ポリペプチド。
(i)第1のRGDループ又は第2のRGDループ又は第1と第2の両方のRGDループ及び/又はVループ中に少なくとも1つの標的特異的結合ドメイン;及び/又は
(ii)ペントンベースプロトマーのN末端及び/又はC末端の非アデノウイルスペプチド;及び/又は
(iii)第1のRGDループ又は第2のRGDループ又は第1と第2の両方のRGDループ、Vループ及び/又ペントンベースプロトマーのN末端中に、少なくとも1つの異種カップリング残基であって、ペントンベースプロトマー内のN末端ドメインの末端は、以下のように定義される。
X1-G-R-N-S-I-R(配列番号44)、
ペントンベースプロトマー内のN末端ドメインのC末端は以下のように定義される。
D-X2-R-S-R-G(配列番号45)
ここで
X1は、G及びEからなる群から選択され、
X2は、D及びEからなる群から選択され;及び/又は。
(iv)第1及び第2のRGDループ及び/又はVループの1以上ののアミノ酸の1以上ののアミノ酸の1つ以上のアミノ酸に共有結合又は非共有結合した薬物、標識又はポリペプチドペントンベースプロトマー;及び/又は
(v)ペントンベースプロトマーのアデノウイルスファイバータンパク質結合クレフトの少なくとも1つの異種カップリング残基で、改変されたポリペプチドはVLPsにアセンブルすることができる。 - ペントンベースプロトマーのアデノウイルスファイバータンパク質結合クレフトに特異的に結合する、少なくとも1つのアデノウイルスファイバータンパク質N末端フラグメントを含む改変ポリペプチドであって、
前記アデノウイルスファイバータンパク質N末端フラグメントが、
(i) 非アデノウイルスペプチドにも特異結合し、及び/又は
(ii) 薬物又は標識に共有結合又は非共有結合している
改変ペプチド。 - 下記の配列が、ペントンベースプロトマーの中の第1のRGDループのN末端を規定する、請求項1に記載の改変ポリペプチド。
X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-X10-X11(配列番号15)
ここで
X3は、D、E及びNからなる群から選択され、好ましくはDであり;
X4は、V、L及びIからなる群から選択され、好ましくはVであり;
X5は任意のアミノ酸であり、好ましくはA、D、E、K、S及びTからなる群から選択され、より好ましくはTであり;
X6は任意のアミノ酸であり、好ましくはA、D、E及びKからなる群から選択され、より好ましくはAであり;
X7は、F、Y及びWからなる群から選択され、好ましくはYであり;
X8は、A、D、E、N及びQからなる群から選択され、好ましくはE又はQであり、より好ましくはEであり;
X9は、好ましくはA、D、E、N及びKからなる群から選択される任意のアミノ酸であり、より好ましくはEであり;
X10は、S又はTからなる群から選択され、好ましくはSであり;そして
X11は任意のアミノ酸であり、第1のRGDループのN末端アミノ酸を構成する。
及び/又は
次の配列は、ペントンベースプロトマーにおいて、第1のRGDループのC末端及び第2のRGDループのN末端を定義する。
X12-X13-X14-X15-X16(配列番号16)
ここで
X12は任意のアミノ酸であり、第1のRGDループのC末端アミノ酸を構成する。
X13はRであり;
X14はGであり;
X15はDであり;そして
X16は任意のアミノ酸であり、第2のRGDループのN末端アミノ酸を構成する。
及び/又は
下記の配列は、ペントンベースプロトマーの第2のRGDループのC末端を規定する。
X17-X18-X19-X20-X21-X22-X23-X24(配列番号17)。
ここで
X17は任意のアミノ酸であり、第2のRGDループのC末端アミノ酸を構成する。
X18は、I、L及びVからなる群から選択され、好ましくはIであり;
X19は、D、E、K、N、Q及びVからなる群から選択され、好ましくはQ又はKであり、より好ましくはQであり;
X20は、C、G及びPからなる群から選択され、好ましくはPであり;
X21は、I、L及びVからなる群から選択され、好ましくはL又はVであり、より好ましくはLであり;
X22は、D、E、S及びTからなる群から選択され、好ましくはE又はTであり、より好ましくはEであり;
X 23は、D、E、K、S及びTからなる群から選択され、好ましくはE、K又はTであり、より好ましくはKであり;そして
X24は、D及びEからなる群から選択され、好ましくはDであり;
及び/又は
次のシーケンスは、VループのN末端を定義する。
X25-X26-X27-X28-X29-X30-X31-X32(配列番号18)。
ここで
X25は、F、Y及びWからなる群から選択され、好ましくはFであり;
X26は、H、K及びRからなる群から選択され、好ましくはKであり;
X27は、A、V、I及びLからなる群から選択され、好ましくはAであり;
X28は、H、K及びRからなる群から選択され、好ましくはRであり;
X29は、A、V、I及びLからなる群から選択され、好ましくはVであり;
X30は、A、V、I、L及びMからなる群から選択され、好ましくはMであり;
X31は、A、V、I及びLからなる群から選択され、好ましくはVであり;そして
X32は任意のアミノ酸であり、VループのN末端アミノ酸を構成する。
及び/又は
下記の配列は、VループのC末端を規定する
X33-X34-X35-X36-X37-X38-X39(配列番号19)
ここで
X33は任意のアミノ酸であり、VループのC末端アミノ酸を構成する。
X34は、F、Y及びWからなる群から選択され、好ましくはYであり;
X35は、D、E、S及びTからなる群から選択され、好ましくはE又はTであり、より好ましくはEであり;
X36は、F、Y及びWからなる群から選択され、好ましくはWであり;
X37は、A、F、V、Y及びWからなる群から選択され、好ましくはF又はVであり、より好ましくはFであり;
X38は、D、E、S及びTからなる群から選択され、好ましくはD又はEであり、より好ましくはEであり;そして
X39は、F、Y及びWからなる群から選択され、好ましくはFであり;
及び/又は、ペントンベースプロトマー内の以下の非連続ペプチドの1つ以上がアデノウイルスファイバータンパク質結合クレフトを形成する(太字のアミノ酸はファイバーと直接相互作用する)
M-T-I-D-L-M-N-N-A-I-X40-X41-X42-Y-L-X43-X44-G-R-Q-X45-G-V-L-E-S(配列番号20);
W-D-P-X46-T-X47-X48-P-G (配列番号46);
X49-V-X50-X51-Y-X52-X53 (配列番号47);
X54-X55-R-S-Y (配列番号48);及び/又は
L-T-X56-V-F-N-R-F-P-X57 (配列番号49)
ここで
X40は、V、I及びLからなる群から選択され;
X41は、E及びDからなる群から選択され;
X42は、H、N及びQ、好ましくはH及びNからなる群から選択され;
X43は、K、E、R、Q及びAからなる群から選択され;
X44は、V、L及びI、好ましくはV及びIからなる群から選択され;
X45は、H、N及びQ、好ましくはH及びNからなる群から選択され;
X46は、V、I、L、E又はD、好ましくはV及びEからなる群から選択され;
X47は、V、L及びI、好ましくはV及びIからなる群から選択され;
X48は、M、T及びS、好ましくはM及びTからなる群から選択され;
X49は、D、E、N及びQ、好ましくはD及びNからなる群から選択され;
X50は、好ましくはA、D、P、K及びTからなる群から選択される任意のアミノ酸であり;
X51は、A、D、E、K及びRからなる群から選択され、好ましくはA、E及びKであり;
X52は、D、E、L、I、Q及びNからなる群から選択され、好ましくはE、L及びQであり;
X53は、A、D、E、K、N、Q及びRからなる群から選択され、好ましくはA、E、N及びKであり;
X54は、K、R、S及びT、好ましくはK、S及びTからなる群から選択され;
X55は、A、D、E、G、K、N、Q、R、S及びT、好ましくはD、G、K、N及びSからなる群から選択される。
X56は、H、K及びRからなる群から選択され、好ましくはH及びRであり;そして
X57は、D及びEからなる群から選択される。 - 請求項2に記載の改変ポリペプチドであって、ファイバータンパク質フラグメントが下記配列を含む改変ポリペプチド。
X58-F-N-P-V-Y-P-Y-X59(配列番号43)
ここで
X58は、S、D及びTからなる群から選択され、好ましくはS又はDであり、より好ましくはSであり;そして
X59は、E、D及びGからなる群から選択され、好ましくはE又はDであり、より好ましくはEである。 - 請求項1から4のいずれかに記載のポリペプチドをコード化する核酸。
- 請求項5に記載の核酸又はクローニングベクターを含む発現ベクターであって、
(i)第1のRGDループ、第2のRGDループ、可変ループ及び/又は、非アデノウイルスペプチドをコード化する核酸を、第1のRGDループ、第2のRGDループ、及び/又は可変ループをコード化する核酸に導入するために適合されたアデノウイルスファイバータンパク質のための結合部位を含む、アデノウイルスペントンベースプロトマーを含むポリペプチド、又は
(ii)非アデノウイルスペプチドをコードする核酸を、C及び/又はN末端に導入するために適合されたペントンベースプロトマーのアデノウイルスファイバータンパク質結合クレフトに特異的に結合するアデノウイルスファイバータンパク質N末端フラグメントを含むポリペプチド
をコード化する発現ベクター。 - 請求項1に記載の発現ベクター又は請求項6に記載のクローニングベクターを含む組換え宿主細胞。
- 請求項1又は3に記載のアデノウイルスペントンベースプロトマーを含む5つの改変ポリペプチドを含む五量体。
- 請求項6に記載の12の五量体を含むウイルス様粒子(VLP)。
- それぞれが5つのアデノウイルスペントンベースプロトマーを含む12の五量体及び、請求項2又は4に記載のペントンベースプロトマーのアデノウイルスファイバータンパク質結合クレフトに特異的に結合するアデノウイルスファイバータンパク質N末端フラグメントを含む少なくとも1つの改変ポリペプチドを含むVLP。
- 請求項1から4のいずれかに記載する改変ポリペプチドの製造方法であって、以下の工程を有する製造方法。
(a)請求項7の組換え宿主細胞を提供する工程。
(b)改変ポリペプチドを発現させる工程、および
(c)改変ポリペプチドを精製する工程。 - 請求項11に記載の工程及び、改変ポリペプチドをVLPにアセンブルさせる追加の工程を含む、請求項9又は10によるVLPを製造する方法。
- 疾患及び/又は患者に特異的な非アデノウイルスペプチドを含む、請求項9又は10によるVLPを製造する方法で、以下の工程を有するVLPを製造する方法。
(a)請求項6に記載のクローニングベクターを提供する工程、
(b)疾患又は患者に特異的な非アデノウイルスペプチドのアミノ酸配列を確定する工程。
(c)該非アデノウイルスペプチドの少なくとも1つを、アデノウイルスペントンベースプロトマーの第1のRGDループ、第2のRGDループ、及び/又は可変ループをコードする核酸、及び/又は、ペントンベースプロトマーのアデノウイルスファイバータンパク質結合クレフトに特異的に結合するアデノウイルスファイバータンパク質N末端フラグメントを含む改変ポリペプチドのN末端又はC末端をコードする核酸の前又は後の核酸の位置に挿入する工程。
(d)ペントンベースプロトマーのアデノウイルスファイバータンパク質結合クレフトに特異的に結合するアデノウイルスファイバータンパク質N末端フラグメントを含む改変ポリペプチドと選択的に同時に、宿主細胞中で操作されたアデノウイルスペントンベースプロトマーを発現させる工程、及び
(e)選択的に、アデノウイルスペントンベースプロトマー結合ファイバータンパク質フラグメントか、又はアデノウイルスペントンベースプロトマー結合ファイバータンパク質フラグメントを含む該改変ポリペプチドを含むVLPを精製する工程。 - 疾患及び/又は患者に特異的な非アデノウイルスペプチドを含む、請求項9又は10によるVLPを製造する方法で、以下の工程を有する方法。
(a)請求項6によるクローニングベクターを提供する工程。
(b)疾患又は患者に特異的な非アデノウイルスペプチドのアミノ酸配列を確定する工程、
(c)該非アデノウイルスペプチドの少なくとも1つを、アデノウイルスペントンベースプロトマーの第1のRGDループ、第2のRGDループ、及び/又は可変ループをコードする核酸に、及び/又は、ペントンベースプロトマーのアデノウイルスファイバータンパク質結合クレフトに特異的に結合するアデノウイルスファイバータンパク質N末端フラグメントを含む改変ポリペプチドのN末端又はC末端をコードする核酸の前又は後の核酸の位置に挿入する工程、
(d)選択的に、アデノウイルスペントンベースプロトマーと共に、宿主細胞中のペントンベースプロトマーのアデノウイルスファイバータンパク質結合クレフトに特異的に結合するアデノウイルスファイバータンパク質N末端フラグメントを含む改変ポリペプチドを発現させる工程、および
(e1)ペントンベースプロトマーのアデノウイルスファイバータンパク質結合クレフトを含む該改変ポリペプチドを精製し、アデノウイルスベントンベースプロトマー又は請求項1又は3の改変アデノウイルスペントンベースプロトマーと混合する工程、又は
(e2)アデノウイルスペントンベースプロトマーが共発現されている場合、該VLPを精製する工程。 - 疾患及び/又は患者に特異的な非アデノウイルスペプチドを含む、請求項項9又は10によよるVLPを製造する方法で、以下の工程を有するVLPを製造する方法。
(a)疾患又は患者に特異的な非アデノウイルスペプチドのアミノ酸配列を確定する工程、
(b)ペントンベースプロトマーのアデノウイルスファイバータンパク質結合クレフトに特異的に結合するアデノウイルスファイバータンパク質N末端フラグメント、及び該非アデノウイルスペプチドの少なくとも1つを含む、請求項2又は4による改変ポリペプチドを合成する工程、及び
(c)該改変ポリペプチドを、アデノウイルスペントンベースプロトマー又は請求項1又は3による改変アデノウイルスペントンベースプロトマー、請求項8による五量体、又は請求項9又は10によるVLPと混合する工程。 - 請求項28から32のいずれかによるの方法によって製造可能なVLP。
- 請求項1から4のいずれかによる改変ポリペプチド、請求項5の核酸、請求項6記載の発現ベクター又は請求項7、8又は14のいずれかのVLP、及び薬学的に許容される担体及び/又は適切な賦形剤を含む医薬組成物。
- 請求項1から4のいずれかによる改変ポリペプチド、請求項5の核酸、請求項6の発現ベクター又は免疫疾患又はがんを治療及び/又は予防するための請求項7、8か14のいずれかによるVLP。
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