CN117561070A - 腺病毒载体及其疫苗 - Google Patents

Abstract

本公开内容涉及包含编码具有T细胞表位的抗原的转基因的腺病毒载体。载体衣壳包含具有第一肽伴侣的修饰的衣壳蛋白。第二肽伴侣附接到第一肽伴侣以提供共价连接的肽结合对。第二肽伴侣还附接到抗原，该抗原具有B细胞表位。在优选的实施方案中，编码一种抗原的转基因位于病毒衣壳的腔中，并且附接到第二抗原的第二肽展示在病毒衣壳的表面上。本发明的其他方面涉及包含所述载体的疫苗、其在治疗中的用途以及其制备和治疗方法。

Description

腺病毒载体及其疫苗

发明领域

本发明涉及表达转基因并具有修饰的衣壳蛋白(用抗原修饰)的腺病毒载体疫苗，其中由转基因表达的抗原编码至少一个T细胞表位，并且修饰衣壳的抗原编码至少一个B细胞表位，涉及包含这样的载体的疫苗，以及使用和制备这样的载体和疫苗的方法。

发明背景

腺病毒(Ad)具有包围线性双链基因组的二十面体蛋白衣壳。无脂质包膜。衣壳包含结构蛋白六邻体、纤维、五邻体、IIIa、VIII和IX。认为纤维衣壳蛋白通过knob结构域帮助附接至宿主细胞。Ad依赖于感染宿主，以便能够利用宿主细胞的复制机制进行复制。人类腺病毒有可分为A-G七个“种类(species)”的至少57种血清型，Ad1-57。类似地，存在动物Ad，诸如犬Ad和马Ad，也可分为各种血清型和“种类”。血清型通常由抗血清在体外中和细胞感染的能力来定义。这些病毒已经被很好地研究和理解，它们可以以高滴度生长，并且它们可以感染分裂细胞和非分裂细胞两者，并可以作为附加体在宿主细胞中维持。这些特点使得它们成为良好的治疗选择，因为几乎所有的试验都表明它们是安全和良好耐受的。

二十面体衣壳由几种蛋白组成。六邻体是形成病毒衣壳的20个三角形面的主要蛋白。六邻体蛋白形成三聚体，并且每个三聚体与其他六个三聚体相互作用。12个顶点由五邻体衣壳粒形成，五邻体衣壳粒是3个纤维蛋白和5个五邻体蛋白的复合物。长纤维从每个顶点延伸，由三个相同的链组成，在末端形成knob。衣壳还包含次要蛋白，尤其是其中的pIIIa、pVI、pVIII和pIX。这些次要衣壳蛋白可以位于衣壳的内表面或外表面，并可以具有结构功能之外的另外的功能。例如，pVI可以促进六邻体蛋白进入细胞核，并且pIX可以参与DNA包装到衣壳中和转录活化。

Ad通常用于基因治疗，特别是作为基因递送载体，因为它们具有包含另外的基因序列的能力。已经使用Ad进行了超过2,000项基因治疗试验。腺病毒载体允许将其携带的转基因传递到宿主细胞核中，但不将病毒DNA整合到宿主染色体中。当用作基因治疗载体时，Ad的插入序列很大，具有8-36kb的可用容量。

此外，由于Ad诱导先天免疫应答和适应性免疫应答两者的能力；具有诱导强烈的抗原特异性B细胞和T细胞免疫应答的能力，Ad已经成为一种有前景的疫苗递送媒介物。腺病毒载体具有高度的免疫原性并在抗原递送方面有效。

几种基于腺病毒载体的疫苗候选物被开发并在临床试验中进一步研究，然而，这些中的许多都不成功。Merck公司针对HIV-1开发的基于人类腺病毒血清型5(Ad5)的疫苗诱导了CD8+T细胞应答，但未能预防HIV感染。最近，SARS-CoV-2大流行和来自Johnson&Johnson和Astra Zeneca的腺病毒疫苗(两者都在腺病毒载体中表达来自SARS-CoV-2的“S”蛋白)的使用已经显示了腺病毒载体疫苗的效用。

然而，基于腺病毒的载体在人类和动物治疗中持续成功的主要障碍是腺病毒特异性抗体对载体的中和。腺病毒的自然感染在人类和动物群体中很高，并且因此适应性免疫系统可以通过分泌中和抗体(NAB)来识别和响应腺病毒载体的存在。类似地，先天免疫系统也可以负责协助对腺病毒载体的应答。例如，估计50％至90％的成年群体对Ad5有预先存在的免疫力。

这样的应答可以在观察到所需效果之前清除治疗性腺病毒载体。解决这一问题将使腺病毒治疗载体能够更常规的使用。

在我们的公布为WO2021/084282的早期申请PCT/GB2020/052774(通过引用并入本文)中，我们已经显示了用感兴趣的抗原修饰腺病毒的表面是可行的，该抗原允许通过使用特异性结合肽对来屏蔽载体以免受抗载体抗体影响。

基于来自细菌的附接蛋白的肽结合对(诸如SpyCatcher和SpyTag(WO2011/098772))的使用已被确立为一种不可逆地缀合重组蛋白等的技术。通过蛋白之间的基因融合不可能实现的实体之间的生物缀合可以使用肽结合对来实现。现在有各种Catcher和Tag对可用，一些基于对SpyCatcher和SpyTag的修饰，而另一些基于来自替代细菌蛋白的类似化学。

发明概述

本发明提供了对这样的载体的进一步改进。

有利的是，本发明人首次显示病毒表面可以用较大的抗原性蛋白修饰，该抗原性蛋白具有阻断有效中和单克隆抗体对病毒的中和的有利作用，同时保持病毒感染性，并允许转基因的表达以产生针对转基因编码的抗原和修饰载体的抗原两者的稳健的B细胞免疫和T细胞免疫。如果修饰载体的抗原足够大，则展示的抗原也可能保护病毒疫苗载体免受宿主抗体中和。这确保了病毒疫苗载体可用于多次免疫而不会降低效力。

根据第一方面，本发明提供了一种腺病毒载体，该腺病毒载体编码异源转基因，该异源转基因编码抗原，并且其中载体具有至少一种修饰的衣壳蛋白，所述修饰包括包含共价键合到第二肽伴侣的第一肽伴侣，其中第二伴侣附接到抗原，其特征在于由转基因编码的抗原具有至少一个T细胞表位，并且附接到第二伴侣的抗原具有至少一个B细胞表位。

在第二方面，本发明提供了一种腺病毒载体，该腺病毒载体编码异源转基因，该异源转基因编码抗原，并且其中载体具有至少一种修饰的衣壳蛋白，所述修饰包括包含共价键合到第二肽伴侣的第一肽伴侣，其中第二伴侣附接到抗原，其特征在于由转基因编码的抗原和附接到第二伴侣的抗原共有至少一个表位。

在本发明的第三方面，提供了一种腺病毒载体，该腺病毒载体编码异源转基因，该异源转基因编码抗原，并且其中载体具有至少一种修饰的衣壳蛋白，所述修饰包括包含共价键合到第二肽伴侣的第一肽伴侣，其中第二伴侣附接到抗原，其特征在于由转基因编码的抗原和附接到第二伴侣的抗原来源于同一病原体。

在实施方案中，由转基因编码的抗原的氨基酸序列与附接到第二伴侣的抗原的氨基酸序列是40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、97％、99％、100％相同的。在可选实施方案中，由转基因编码的抗原和附接到第二伴侣的抗原是不同的抗原。

当给予人类或其它哺乳动物时，本发明的载体优化了针对病原体或靶的体液和细胞免疫原性两者的产生。

修饰的衣壳蛋白可以是任何衣壳蛋白，但优选为六邻体蛋白或pIX蛋白。

此外，在实施方案中，修饰的衣壳蛋白是六邻体蛋白，并在HVR环中修饰。

如本文用于本发明的任何方面，第一和第二肽伴侣是能够在适当条件下形成共价键诸如异肽键或酯键的肽对的一部分。这些也被称为蛋白标签和捕手对或蛋白标签和结合伴侣对。第一肽伴侣可以是第一肽标签或可以是第一肽捕手。每个伴侣对可以包含标签和捕手。形成的共价键可以自发反应，或者需要第三个实体诸如连接酶的辅助。关于合适的肽对的其他信息包含于下文。

第一肽伴侣和第二肽伴侣形成肽伴侣对，肽伴侣对可通过异肽键或酯键(优选为异肽键)共价连接。

伴侣对可以描述为包含能够自发形成异肽键的第一伴侣和第二伴侣的两部分接头。特别地，两部分接头可以被视为肽标签和多肽结合伴侣同源对(或“捕手(catcher)”)，当在允许肽标签和其多肽结合伴侣之间自发形成异肽键的条件下接触时，可以通过共价键缀合。这是本领域技术人员已知的。

第一肽伴侣和第二肽伴侣可以来源于纤连蛋白结合蛋白。SpyTag及其伴侣SpyCatcher来源于酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes)纤连蛋白结合蛋白FbaB。SdyTag和SdyCatcher是基于来自停乳链球菌(Streptococcus dysgalactiae)中相关纤连蛋白结合蛋白的天然Cna蛋白B型(CnaB)结构域构建的。这样的肽伴侣的其他衍生物现在也是可得的，诸如作为修饰的捕手的QueenCatcher、Mooncake和KatI以及作为标签的RumTag、RumTrunkTag、BacTag和PhoTag。Isopeptag/Pilin-C对是从酿脓链球菌的蛋白Spy0128创建的。SnoopTag/SnoopCatcher是从肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)的RrgA蛋白开发的，该蛋白与SpyTag/SpyCatcher没有交叉反应。

在一方面，第一肽伴侣是“标签(tag)”伴侣，其可以通过异肽键或酯键与第二肽伴侣共价连接，第二肽伴侣是“捕手”。在这方面，衣壳蛋白优选为六邻体蛋白。因此，修饰六邻体的第一肽伴侣或“标签”优选为DogTag、Isopeptag、Isopeptag-N、SdyTag、PsCsTag或Jo。优选第一肽伴侣或标签不是SpyTag。在该实施方案中，SpyTag在插入到六邻体蛋白期间未被修饰。

在替代方面，第一肽伴侣是“捕手”伴侣，其可以通过异肽键或酯键与第二肽伴侣共价连接，第二肽伴侣是“标签”。在这方面，衣壳蛋白优选为六邻体蛋白。因此，修饰六邻体的第一肽伴侣或“捕手”可以是DogCatcher、SpyCatcher、SnoopCatcher、Pilin-C、Pilin-N、SdyCatcher、PsCsCatcher或In。

在一方面，第一肽伴侣是“捕手”伴侣，其可以通过异肽键或酯键与第二肽伴侣共价连接，第二肽伴侣是“标签”。在这方面，衣壳蛋白优选为pIX蛋白。因此，修饰pIX的第一肽伴侣或“捕手”优选为SpyCatcher、DogCatcher、SnoopCatcher、Pilin-C、Pilin-N、SdyCatcher、PsCsCatcher或In。

在替代方面，第一肽伴侣是“标签”伴侣，其可以通过异肽键或酯键与第二肽伴侣共价连接，第二肽伴侣是“捕手”。在这方面，衣壳蛋白优选为pIX蛋白。因此，修饰pIX蛋白的第一肽伴侣或“标签”优选为SpyTag、Snooptag、SnoopTagJr、DogTag、Isopeptag、Isopeptag-N、SdyTag、PsCsTag或Jo。

在一方面，第一肽伴侣可以插入到六邻体蛋白中，并且任选地向六邻体蛋白中的插入的长度可以长达200个氨基酸、长达150个氨基酸或长达100个氨基酸。向六邻体蛋白中的插入可以位于任何适当的位点，任选地位于任何一个或更多个高变HVR环中。插入到六邻体蛋白中的第一肽伴侣可以是DogTag。DogTag能够与DogCatcher形成自发的共价键，或者在需要催化剂(SnoopLigase)的反应中与SnoopTagJr或SnoopTag形成共价键。因此，DogCatcher或SnoopTagJr或SnoopTag可以是第二肽伴侣。因此，DogTag或SnoopTagJr可以是第二肽伴侣。第二肽伴侣连接或附接到抗原。令本发明人惊讶的是，在如上所述的SpyTag插入失败后，DogTag能够插入到六邻体衣壳蛋白中以形成功能性腺病毒载体，用于蛋白伴侣的衣壳展示。

根据本发明的一方面，提供了一种载体，其中第一肽伴侣和第二肽伴侣选自第一和第二的对的组(group of first and second pairs)：

SpyCatcher和SpyTag；

SnoopCatcher和SnoopTagJr

DogCatcher和DogTag

SnoopTagJr和SnoopCatcher

SpyTag和SpyCatcher

前提是当修饰的衣壳蛋白是六邻体蛋白时，第一伴侣不是SpyCatcher。

其他可以包含在六邻体蛋白中的长度小于100个氨基酸的第一肽伴侣包括：

与Pilin-C配对的Isopeptag

与Pilin-N配对的Isopeptag-N

与SdyCatcher配对的SdyTag

与PsCsCatcher配对的PsCsTag

与In配对的Jo，

使用SnoopLigase与SnoopTag/SnoopTagJr配对的DogTag或

与RrgACatcher(以及从其衍生的DogCatcher：“DogCatcher”)配对的RrgATag/RrgATag2/DogTag。

优选的是，在包含在六邻体蛋白中的可能的肽伴侣中，包含不是SpyTag的插入。

来自酿脓链球菌的纤连蛋白结合蛋白FbaB包含CnaB2黏附蛋白结构域。CnaB2通过Lys和Asp侧链的自发反应形成异肽键而稳定。CnaB2已经被分为13个残基的SpyTag肽和116个残基的SpyCatcher蛋白。

在另一方面，第一肽伴侣可以与pIX衣壳蛋白融合，任选地在N-末端或C-末端，优选地在C-末端。与pIX衣壳蛋白融合的第一肽伴侣可以是SpyCatcher、SnoopCatcher或DogCatcher。SpyCatcher能够与SpyTag形成共价键，SpyTag在此形成第二肽伴侣，并且因此可以附接到抗原。SnoopCatcher能够与SnoopTag或SnoopTagJr形成共价键，并且DogCatcher能够与DogTag形成共价键，并且可以作为第一肽伴侣或第二肽伴侣以任一方向用作结合对。第一肽伴侣也可以是DogTag、SpyTag、SnoopTagJr或SnoopTag，其中匹配的第二肽伴侣是DogCatcher、SnoopTagJr、SnoopTag、SpyCatcher、DogTag、或SnoopCatcher。其他可以适于以任一方向与pIX融合的肽伴侣对为：RrgATag/RrgATag2/DogTag和RrgACatcher、Isopeptag/Pilin-C、Isopeptag-N/Pilin-N、SdyTag/SdyCatcher、PsCsTag/PsCsCatcher和Jo/In。

特别优选的可以是将SnoopCatcher或DogCatcher插入到pIX中，因为它们在本文中都展示了具有良好的腺病毒存活力。此外，这些插入在遗传上稳定超过3代。

所述腺病毒载体可以用于疫苗的制备。疫苗可以是预防性或治疗性的。因此，本发明延伸到本文描述的制备疫苗的方法以及腺病毒载体的疫苗制剂。

因此，在本发明的方面，提供了一种用于制备疫苗制剂的方法，该方法包括将本发明的载体与药学上可接受的赋形剂混合。

本发明还提供了一种用于产生本发明的载体的方法。该方法包括：

i.将编码第一肽伴侣的核酸引入到编码腺病毒衣壳蛋白的核酸中

ii.将编码抗原的转基因引入到腺病毒基因组中

iii.用腺病毒感染细胞并收集子代

iv.将与抗原附接的第二肽伴侣附接到第一肽伴侣，其中通过本发明方法产生的载体的特征在于由转基因编码的抗原具有至少一个T细胞表位，并且附接到第二肽伴侣的抗原具有至少一个B细胞表位。

第二肽伴侣附接到抗原，优选地融合到所述抗原，并且能够与存在于免疫原性腺病毒载体上的第一肽伴侣形成共价键。共价键以及由此产生的附接可以自发发生，或者可以需要使用第三实体诸如连接酶来促进结合。因此，抗原通过肽伴侣对的方式附接到腺病毒，肽伴侣对的第一伴侣包含在修饰的衣壳蛋白中。

在本发明的另一方面，提供了一种疫苗组合物，其包含与药学上可接受的赋形剂混合的本文描述的腺病毒载体。

在本发明的另一方面，提供了编码具有T细胞表位的转基因的免疫原性腺病毒载体，所述载体包含六邻体衣壳蛋白中的至少一个修饰，其中所述修饰包括：第一肽伴侣；和附接到具有至少一个B细胞表位的抗原的第二肽伴侣，其中第一肽伴侣和第二肽伴侣通过共价键偶联。

在实施方案中，由转基因编码的抗原或附接到第二伴侣的抗原是选自以下组的抗原：病毒、细菌、寄生虫或真菌抗原。在实施方案中，抗原包含来自病原体的受体结合结构域。

在实施方案中，附接到第二肽伴侣的抗原选自以下的组：包含至少一个B细胞表位的来自疟原虫属物种(Plasmodium spp)特别是恶性疟原虫(Plasmodium falciparum)或间日疟原虫(Plasmodium Vivax)的CSP蛋白、人巨细胞病毒(HCMV)gB、SARS CoV-2 S蛋白、流感血凝素(HA)或其片段。优选的片段包括来自疟疾CSP蛋白的NANP 18；来自SARS-CoV-2 S蛋白的受体结合结构域(RBD)结构域和来自流感HA的RBD结合结构域。

一般来说，任何抗原的受体结合结构域都是表面修饰载体的优选片段。也就是说，RBD作为一类优选抗原附接到第二肽伴侣。

在实施方案中，转基因编码选自以下组的抗原：编码至少一个T细胞表位的HCMV五聚体、SARS-CoV-2 S蛋白、流感核蛋白或其片段。

附图

通过参考附图将更清楚地理解本公开内容，在附图中：

图1：示出了根据本发明的腺病毒的示意性图示。通过将DogTag插入到六邻体HVR环中对腺病毒衣壳进行模块化共价修饰。通过与插入到六邻体HVR表面环中的DogTag共价偶联，在腺病毒衣壳表面上模块化展示DogCatcher融合的配体。

图2(A-B)：示出了根据图1在腺病毒衣壳表面上展示的构建体设计的示意性图示。

图2A示出了标签蛋白(例如DogTag)被插入到衣壳蛋白(例如六邻体蛋白)的HVR5环中。这里，标签蛋白的上游和下游两个侧翼有两个甘氨酸丝氨酸接头，优选地GSGGSG接头。接头(特别是柔性接头，诸如甘氨酸丝氨酸接头)促进并可以提高标签蛋白向衣壳蛋白的插入，因为这样的接头增加了标签蛋白插入区域的柔性。由此，增加的灵活性可以提高偶联效率。图2A示出了本发明的一种实施方案，其中将接头插入到标签蛋白的两侧，以使柔性最大化，并且从而使偶联效率最大化。然而，应当理解，接头的存在是任选的。插入到六邻体HVR环，特别是HVR5环中的一个优点是这些区域已经是柔性的。因此，将DogTag插入到六邻体HVR环中(即，没有任何接头)将适当地反应以有效地偶联。另外，在不脱离本发明的情况下，设想将接头插入标签蛋白序列上游和/或下游的本发明的其他变化形式也是合适的。

所得的融合蛋白包含在HVR5环中具有标签蛋白(例如DogTag)的衣壳蛋白。因此，融合蛋白的衣壳蛋白(例如六邻体蛋白)组分将第一肽伴侣(例如标签蛋白，优选地DogTag)锚定在病毒衣壳中(如图1所示)，使得第一肽伴侣(例如标签蛋白，优选地DogTag)修饰病毒衣壳的表面。这使得已被修饰(例如通过融合)以包含所选抗原的对应第二肽伴侣(例如Catcher蛋白，优选地DogCatcher)的模块化附接成为可能。由于抗原不直接融合到病毒衣壳，因此使得更大范围的抗原(例如尺寸)和模块化附接到病毒衣壳上的不同抗原组合的选集成为可能。

图2B示出了根据图1展示在腺病毒衣壳表面的DogCatcher-SARS CoV-2-RBD蛋白的任选设计。SARS CoV-2-RBD蛋白(例如抗原)位于C-末端结构域。柔性接头被示出在捕手(DogCatcher)和抗原(例如，SARS CoV-2 S-RBD蛋白)之间。还示出了在N-末端结构域包含IgK前导。

图3.针对通过腺病毒衣壳表面展示产生的Catcher-NANP的抗体应答。图3A：小鼠免疫原性实验的设计和免疫接种方案，以评估对衣壳展示的抗原(Catcher-NANP18)的抗体滴度，以及对含有和不含衣壳配体的载体编码的抗原(GFP)的T细胞和抗体应答。Balb/c小鼠(5只/组)用单剂量的含有在HVR5插入的DogTag的编码GFP的Ad5(Ad(GFP)-T，第1组)、相同但还含有与衣壳表面偶联的DogCatcher-NANP18的载体(Ad(GFP)-T:C-NANP18，第2组)、编码DogCatcher-NANP18构建体的Ad5(Ad(C-NANP18)，第3组)、或剂量为0.01μg蛋白(第4组)或0.1μg蛋白(第5组)的在alhydrogel佐剂中的DogCatcher-NANP18(C-NANP18)重组蛋白进行肌肉内免疫。在第1组-第3组中以通过单细胞感染性测定计算的10^8感染单位的剂量施用腺病毒载体。在Ad(GFP)-T:C-NANP18疫苗批次的制备期间，缀合后通过透析去除过量的C-NANP18蛋白。计算出第2组中的C-NANP18蛋白剂量为每只小鼠小于0.05μg。

图3B-图3D：免疫接种后14天后，处死小鼠，并测量对疫苗抗原的体液和细胞应答。图1B：通过终点ELISA测量第2组-第5组中对C-NANP18的血清IgG抗体应答。图1C：在第1组和第2组中，通过过夜离体IFNγ-ELISPOT测量脾脏中CD8+T细胞对编码的GFP表位HYLSTQSAL(EGFP_200-208)的应答。图1D：通过终点ELISA测量第1组和第2组中对编码的GFP抗原的血清IgG抗体应答。在图3B-图3D中，条形图示出了中位数应答。

图4.Catcher-SARS CoV-2 S-RBD在腺病毒衣壳上的展示提供了免受抗载体中和抗体影响的屏蔽。图4A-图4B：DogCatcher-SARS CoV-2刺突受体结合结构域(S-RBD)与插入到Ad5衣壳上六邻体HVR5环中的DogTag的反应性。在HVR5展示DogTag的Ad5(GFP)载体(1E+10个病毒颗粒)与浓度为3.5μM的CHO细胞表达的DogCatcher-S-RBD融合蛋白孵育。反应在4℃过夜(16h)进行。

图4A：样品在SDS-PAGE凝胶上运行，并且蛋白通过考马斯染色可视化。通过使用Image J比较配体修饰的样品和未修饰(对照)样品中未缀合的六邻体-Tag的条带强度来评估计算偶联效率；计算出64％的六邻体偶联效率。

图4B：对图A中所示的相同样品进行载体感染性测定(通过GFP焦点计数)。条形图示出重复样品的平均值和范围。

图4C：DogCatcher-S-RBD(C-RBD)与Ad5衣壳的偶联降低了有效的载体中和单克隆抗体的效力。在存在不同浓度的靶向腺病毒(Ad5)六邻体的单克隆抗体(mAb 9C12)的情况下，将编码GFP且具有C-RBD屏蔽(Ad-T:C-RBD)或没有衣壳屏蔽(Ad-T)的Ad5载体添加到293A细胞。根据细胞中表达的腺病毒编码的GFP的荧光检测生产性腺病毒感染。示出了单独的Ad5-T或Ad-T:C-RBD的荧光强度随着mAb浓度的增加的变化。

图4D：DogCatcher-S-RBD(C-RBD)与Ad5衣壳的偶联降低了多克隆Ad5免疫血清的载体中和效力。在存在不同稀释度的Ad5中和小鼠血清的情况下，将编码GFP且具有C-RBD屏蔽(Ad-T:C-RBD)或没有衣壳屏蔽(Ad-T)的Ad5载体添加到293A细胞。根据细胞中表达的腺病毒编码的GFP的荧光检测生产性腺病毒感染。示出了单独的Ad5-T或Ad-T:C-RBD的荧光强度随着中和血清浓度的降低的变化。

图4E：用DogCatcherS-RBD修饰的衣壳削弱了人类因子X(FX)介导的Ad对SKOV3细胞的转导。在存在(+FX)或不存在重组人类因子X的情况下，在SKOV3细胞上孵育具有或没有DogCatcher-S-RBD(C-RBD)衣壳屏蔽的编码GFP的Ad5载体(Ad-T)。感染性数据(GFP焦点测定)示出一式三份的孔的平均值+SD。

图5.针对当展示在腺病毒衣壳表面时的SARS CoV-2 S-RBD产生的高滴度抗体应答

图5A：使用腺病毒衣壳展示技术评估针对SARS CoV-2 S-RBD的抗体滴度和针对SARS CoV-2 S/S-RBD的T细胞应答的小鼠免疫原性实验的设计和免疫接种方案。Balb/c小鼠(6只/组)用两次剂量(在第0天和第21天)的含有在HVR5插入的DogTag的编码SARS CoV-2刺突的Ad5(Ad(刺突)-T，第1组)、相同但还含有与衣壳表面偶联的DogCatcher-SARS CoV-2S-RBD的刺突编码载体(Ad(刺突)-T:C-RBD，第2组)、含有在HVR5插入的DogTag且DogCatcher-SARS CoV-2 S-RBD偶联到衣壳表面的编码GFP的Ad5(Ad(GFP)-T:C-RBD，第3组)、或Alhydrogel(第4组)或Addavax(第5组)佐剂中的0.2μg DogCatcher-SARS CoV-2 S-RBD(C-RBD)重组蛋白进行肌肉内免疫。在第1组-第3组中以通过单细胞感染性测定计算的10^8感染单位的剂量施用腺病毒载体。在Ad(刺突)-T:C-RBD和Ad(GFP)-T:C-RBD疫苗批次的制备期间，缀合后通过透析去除过量的C-RBD蛋白。计算出第2组和第3组中的C-RBD蛋白剂量为每只小鼠小于0.2μg。

图5B：终点ELISA示出在第20天(加强前)进行的尾静脉采血血清中针对SARS CoV-2 S-RBD的IgG滴度。

图5C：终点ELISA示出在加强后两周(第35天)进行的心脏采血血清中针对SARSCoV-2 S-RBD的IgG滴度。

图5D：加强前和加强后样品之间SARS CoV-2 S-RBD IgG ELISA滴度的变化倍数。

图5E：在第35天脾脏中针对SARS CoV-2 S-RBD肽库的IFNγT细胞ELISPOT应答。

图5F：在第35天脾脏中针对SARS CoV-2刺突肽库的IFNγT细胞ELISPOT应答。应答是跨越刺突蛋白全长的两个肽库的总和。

在图5A-图5F中，条形图示出了中位数应答。

图6：在腺病毒载体初免-加强方案中，在加强时应用DogCatcher SARS CoV-2刺突-RBD衣壳修饰显著增加SARS CoV-2特异性抗体和T细胞应答

图6A：BALB/c小鼠(n＝12)在D0用Ad(刺突)-Tag肌肉内免疫，并且然后在D21给予Ad(刺突)-Tag(第1组，n＝6)或Ad(刺突)-Tag:Catcher-RBD(第2组，n＝6)的第二次肌肉内免疫。所有疫苗均以10^8感染单位的剂量施用。图6B：通过终点ELISA测量的对RBD的血清IgG抗体应答。将(Ad(刺突))初免后在D20测量的应答与同源(Ad(刺突)-Ad(刺突))或异源(Ad(刺突)-Ad(刺突):C-RBD)初免加强后在D35的应答进行比较。展示了加强后中位数滴度的变化倍数。虚线代表检测限。图6C：D35时脾脏中针对跨越全长(1-1273)SARS CoV-2 S的肽库的IFNγ-ELISPOT应答。图6D：D35时脾脏中针对仅跨越SARS CoV-2 S的C-末端残基633-1273(即不包括RBD结构域)的肽库的IFNγ-ELISPOT应答。在图B-图D中，数据示出中位数应答。

图7：对展示DogCatcher-SARS CoV-2刺突-RBD的腺病毒颗粒的Cryo-TEM分析

图7A：Ad-DogTag(Ad-Tag，对照样品，未修饰)和Ad-DogTag:DogCatcher-RBD(Ad-Tag:Catcher-RBD)颗粒的3D密度图(在)。指示径向着色方案(以灰度)。图7B：示例性2D类平均值。指示从顶点到顶点计算的直径。图7C：I型配体偶联；在相同的轮廓水平示出的不含配体(Ad-Tag)或每个三聚体含有一个偶联的配体(Ad-Tag:Catcher-RBD)的代表性六邻体三聚体的3D结构。图7D：II型配体偶联；在相同的轮廓水平示出的不含配体(Ad-Tag)或每个三聚体含有两个偶联的配体(Ad-Tag:Catcher-RBD)的与五邻体基底相邻的代表性六邻体三聚体的3D结构。以正面和侧面角度两者示出的Ad-DogTag:DogCatcher-RBD的图，以及指示额外电子密度的位置和范围的高阈值和低阈值。在图7C和图7D两者中，拟合了六邻体三聚体结构(PDB 6B1T)，示出了HVR5环的位置(残基270-280，DogTag插入的位点)。图7ECryoEM；将S-RBD结构拟合到Ad-Tag:Catcher-RBD的密度图中。将SARS CoV-2刺突受体结合结构域(S-RBD)的结构(PDB ID J7VB)拟合到偶联到来自图6C和图6D的Ad-Tag:Catcher-RBD表面上的六邻体三聚体的I型和II型配体的3D密度图中。示出了六邻体三聚体结构(PDBID 6B1T)(如前-1)，示出了HVR5环的位置(残基270-280，DogTag插入的位点)。

图8.Catcher-血凝素-RBD在腺病毒衣壳上的展示提供了免受抗衣壳中和抗体影响的屏蔽。

图8A-图8B：与甲型流感血凝素受体结合结构域融合的DogCatcher(DogCatcher-HA-RBD)与插入到Ad5衣壳上六邻体HVR5环中的DogTag的反应性。在HVR5展示DogTag的Ad5(GFP)载体(5E+9个病毒颗粒)与浓度为1.75μM的CHO细胞表达的DogCatcher-HA-RBD融合蛋白孵育。反应在4℃过夜(16h)进行。

图8A：样品在SDS-PAGE凝胶上运行，并且蛋白通过考马斯染色可视化。通过使用Image J比较配体修饰的样品和未修饰(对照)样品中未缀合的六邻体-Tag的条带强度来计算偶联效率；计算出44％的六邻体偶联效率。

图8B：对A中所示的相同样品进行载体感染性测定(通过GFP焦点计数)。条形图展示一式三份的样品的平均值和标准偏差。

图8C：DogCatcher-HA-RBD(C-HA_RBD)与Ad5衣壳的偶联降低了有效载体中和单克隆抗体的效力。在存在不同浓度的靶向腺病毒(Ad5)六邻体的单克隆抗体(mAb 9C12)的情况下，将编码GFP且具有DogCatcher-HA-RBD屏蔽(Ad-T:C-HA_RBD)或没有衣壳屏蔽(Ad-T)的Ad5载体添加到293A细胞。根据细胞中表达的腺病毒编码的GFP的荧光检测生产性腺病毒感染。示出了单独的Ad5-T或Ad-T:C-HA_RBD的荧光强度随着mAb浓度的增加的变化。

详述

本公开内容涉及包含编码具有T细胞表位的抗原的转基因的腺病毒载体。载体衣壳包含具有第一肽伴侣的修饰的衣壳蛋白。第二肽伴侣附接到第一肽伴侣以提供共价连接的肽结合对。第二肽伴侣还附接到抗原，该抗原具有B细胞表位。在优选的实施方案中，编码一种抗原的转基因位于病毒衣壳的腔中，并且附接到第二抗原的第二肽展示在病毒衣壳的表面上。这种展示可以通过由衣壳蛋白和第一肽伴侣形成的融合蛋白来实现，所述第一肽伴侣被修饰在病毒衣壳的表面上。本发明另外的方面涉及包含所述载体的疫苗、其在治疗中的用途以及其制备和治疗方法。

通过仅以实例的方式给出的本发明的一些实施方案的以下描述，并在适当的情况下参考附图和表格，将更清楚地理解本发明。

提及的所有出版物、专利申请、专利和其他参考文献均通过引用以其整体并入。

本公开内容不限于所描述的任何特定实施方案，因此本文使用的术语仅用于描述特定实施方案的目的，而不意图以任何方式进行限制。

定义

为了更容易理解本公开内容，下面收集并首先定义本文采用的某些术语。后续术语的另外定义在整个说明书中阐述。除非另有定义，否则本文使用的所有其他技术和科学术语具有与本公开内容相关领域普通技术人员通常理解的含义。

除非上下文另外清楚地规定，否则如说明书和权利要求中使用的单数形式“一(a)”、“一(an)”和“所述(the)”包含复数指示物。例如，术语“细胞”包括多于一个细胞，包括其混合物。

所有的数值指示，例如，pH、温度、时间、浓度和分子量，包括范围，都是以0.1增量变化(+)或(-)的近似值。应理解的是，尽管并非总是明确地陈述，但所有数字指示之前都有术语“约”。还将理解的是，尽管非总是明确地陈述，但本文描述的试剂仅是示例，并且这样的试剂的等同物是本领域已知的。

在本文中使用的术语“和/或”应被认为是两个指定的特征或组分中的每一个与或不与另一个一起的具体公开内容。因此，如在措辞诸如“A和/或B”中使用的术语“和/或”在本文中意图包括A和B、A或B、A(单独的)和B(单独的)。类似地，如在措辞诸如“A、B和/或C”中使用的术语“和/或”意图涵盖以下方面中的每个方面：A、B和C；A、B或C；A或C；A或B；B或C；A和C；A和B；B和C；A(单独的)；B(单独的)和C(单独的)。

如本文所用的术语“例如”和“即”仅通过实例的方式使用，而不意图限制，并且不应被解释为仅指说明书中明确列举的那些项目。

术语“或更多”、“至少”、“多于”等，例如“至少一个”应被理解为包括但不限于至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149或150、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、2000、3000、4000、5000或多于所陈述的值。还包括在两者之间的任何更大的数字或分数。

相反，术语“不超过”包括小于所陈述的值的每个值。例如，“不超过100个核苷酸”包括100、99、98、97、96、95、94、93、92、91、90、89、88、87、86、85、84、83、82、81、80、79、78、77、76、75、74、73、72、71、70、69、68、67、66、65、64、63、62、61、60、59、58、57、56、55、54、53、52、51、50、49、48、47、46、45、44、43、42、41、40、39、38、37、36、35、34、33、32、31、30、29、28、27、26、25、24、23、22、21、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2、1和0个核苷酸。还包括在两者之间的任何较小的数字或分数。

术语“多于一个”、“至少两个”、“两个或更多个”、“至少第二个”等应被理解为包括但不限于至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19 20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149或150、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、2000、3000、4000、5000或更多。还包括在两者之间的任何更大的数字或分数。

在整个说明书中，词语“包含(comprise)”或变化形式诸如“包含(comprises)”或“包含(comprising)”应被理解为意指包括所陈述的要素、整数或步骤，或者要素、整数或步骤的组，但不排除任何其他要素、整数或步骤，或者要素、整数或步骤的组。应当理解，在本文中任何位置用语言“包括”对方面进行描述，也提供了以术语“由...组成”和/或“基本上由...组成”描述的另外的类似方面。术语“由...组成”不包括权利要求中未指明的任何要素、步骤或成分。In re Gray,53F.2d 520,11USPQ 255(CCPA1931)；Ex parte Davis,80USPQ 448,450(Bd.App.1948)(“由...组成”定义为“将权利要求限制为不包含除所列举的材料之外的材料，但通常与所列举的材料相关的杂质除外”)。术语“基本上由...组成”将权利要求的范围限于所指定的材料或步骤“以及所要求保护的发明的不实质上影响基本特征和新颖特征的那些材料或步骤”。

除非具体陈述或从上下文中明显看出，否则如本文所用，术语“约”是指在由本领域普通技术人员确定的特定值或组成的可接受误差范围内的值或组成，这将部分取决于如何测量或确定该值或组成，即测量系统的限制。例如，根据本领域的实践，“约”或“大约”可以意指在一个或多于一个标准偏差内。“约”或“大约”可以意指高达10％(即±10％)的范围。因此，“约”可以理解为大于或小于陈述的值的10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％、0.5％、0.1％、0.05％、0.01％或0.001％内。例如，约5mg可以包括4.5mg和5.5mg之间的任何量。此外，特别是关于生物系统或过程，这些术语可以意指高达一个数量级或高达一个值的5倍。除非另外说明，否则当在本公开内容中提供特定值或组成时，应假定“约”或“大约”的含义是在该特定值或组成的可接受的误差范围内。

除非另外指出，否则如本文描述的任何浓度范围、百分比范围、比率范围或整数范围应当理解为包括所叙述的范围内的任何整数的值，以及在合适时其分数(诸如整数的十分之一和百分之一)。

本文使用的单位、前缀和符号使用其国际单位制(SI)的公认形式提供。数值范围包括限定该范围的数字。

腺病毒

腺病毒(Ad)是无包膜的双链DNA病毒，具有约36千碱基(kb)的基因组。有超过60种人类腺病毒血清型，分组为种类A-G。每组包括许多腺病毒血清型，例如，亚组种类C包括Ad5和Ad2。Ad5是研究最广泛的血清型，并且也是溶瘤病毒开发中应用最广泛的平台。在溶瘤病毒的开发中，期望能够靶向特定的组织，并因此可以改变趋向性。在临床环境中使用一些腺病毒血清型(包括Ad5)的主要问题是人类预先存在的免疫力。一些科学家试图通过使用首先从类人猿(great ape，诸如大猩猩和黑猩猩)中分离的腺病毒来克服预先存在的免疫力。已经在临床研究中使用的这样的载体的实例包括ChAd3、ChAd155和ChAdOx1。这样的腺病毒有望在人类中具有较低的血清流行率。尽管如此，人类常常已经预先存在这样的病毒，并且当然，如果期望多于一次施用该载体，则会有预先存在的免疫力问题。

腺病毒的尺寸通常为70-90nm，具有二十面体衣壳形状。外衣壳结构(也称为‘衣壳蛋白’)包括三种主要蛋白类型(六邻体、纤维和五邻体基底(penton base))。外衣壳中有另外的次要蛋白，包括VI、VIII、IX、IIIa和IVa2。六邻体是腺病毒衣壳的主要组分，占衣壳蛋白的83％以上https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC187380/。六邻体修饰已显示允许在一些情况下规避预先存在的中和抗体，包括交换来自不同血清型的高变区(HVR)https://www.nature.com/articles/nature04721？proof＝t。

用于修饰的腺病毒

腺病毒可以是复制缺陷的：某些基因从基因组中缺失，以确保当腺病毒用作治疗剂时，它不再能够复制。出于疫苗接种的目的，这些载体通常在E1中具有缺失(使载体复制有缺陷)和/或在E3基因中具有缺失(增加插入片段尺寸的容量)。其他载体可以是由一组基因从基因组中缺失而产生，并且在从事腺病毒工作的人员的技术范围内。这是用于疫苗的优势，其中腺病毒载体的目的是以使抗原具有高免疫原性的形式将抗原呈递给免疫系统，同时限制细胞毒性。

腺病毒可以来自腺病毒的任何血清型或毒株。因此，适合用于修饰的腺病毒可以来自那些感染除人类之外的哺乳动物的腺病毒，以便使先前的暴露影响最小化。衣壳结构高度保守，因此腺病毒血清型和种类可以互换。

腺病毒可以是任何修饰的腺病毒。由此，修饰的腺病毒编码抗原。这些编码的抗原在转导后表达。这提供了多方面预防或治疗的可能性，使得包含至少一个B细胞表位的抗原可以展示在病毒表面上，并且另一抗原在载体转导后使用宿主细胞机器表达。因此，腺病毒是遗传修饰的，使得它包含转基因。这种转基因被设计成用于递送到宿主细胞，并编码包含至少一个T细胞表位的抗原。

腺病毒介导的感染性

腺病毒在表达柯萨奇病毒及腺病毒受体(CAR)的细胞中的感染性是通过纤维蛋白介导的。表达CAR受体的细胞系的实例是HEK293细胞。纤维与细胞表面的CAR受体结合，并且这介导了病毒的最初附接。然而，最近表明，替代纤维介导的腺病毒进入，存在于人血清中的凝血因子因子X(FX)可以与一些腺病毒血清型的六邻体蛋白结合，以促进病毒进入一些细胞类型。通过六邻体蛋白介导感染的细胞系的实例是SKOV3。认为FX通过腺病毒六邻体介导的感染可以增强腺病毒载体在体内的肝趋向性。对六邻体蛋白的修饰诸如DogTag的插入和与抗原的偶联降低了六邻体介导的对细胞的感染性。这是一种理想的效果，因为当以非常高的剂量静脉内注射时，腺病毒的天然趋向性会在患者中引起肝毒性。减少六邻体介导的感染性以减少肝毒性将有利于本发明。

六邻体衣壳蛋白

六邻体衣壳蛋白的尺寸为约100kDa，每个病毒粒子720个单体。六邻体单体组织成三聚体，从而在20个面中的每个面上有12个三聚体，导致每个病毒粒子240个三聚体。六邻体序列包含对应于病毒外表面上的环的高变区(HVR)，并因此几乎覆盖了病毒的整个表面。每个单体具有7个HVR，被鉴定为HVR1-HVR7，它们是血清型特异性的。由于环位于病毒的外表面，因此六邻体环是主要的抗原识别位点，即宿主免疫应答的靶。六邻体蛋白的长度各不相同，例如，Ad2是已知最长的六邻体，具有968个氨基酸的长度(UniProt ID：P03277)。最常用的基因治疗腺病毒Ad5具有952个氨基酸的长度(UniProt ID：P04133)。修饰含有血清型特异性表位的六邻体HVR看起来是克服宿主中和反应的有前景的方法。任何一种HVR都可以被修饰。本文举例说明，令人惊讶地使用DogTag成功地对HVR5进行了修饰。当根据本发明修饰六邻体蛋白并通过肽伴侣对附接抗原时，抗腺病毒中和抗体的中和降低。

pIX衣壳蛋白

pIX蛋白是一种次要衣壳蛋白，其尺寸为约14.3kDa。每个病毒粒子有约240个pIX单体。pIX蛋白的功能是稳定病毒表面的六邻体。pIX蛋白的C-末端暴露在病毒表面，并因此是用于小肽和大肽融合的理想位点。Ad5 pIX具有通过柔性接头连接的两个结构域。Ad5pIX蛋白具有196个氨基酸的长度(UniProt ID：Q2KS03)。

对衣壳蛋白的修饰

衣壳蛋白的修饰可以是遗传的或非遗传的，包括化学和/或遗传/蛋白工程化。化学修饰通常将在病毒衣壳已经形成后进行。工程化方法通常涉及氨基酸序列和/或对应核酸序列的预先计划的改变(即遗传修饰)，以影响蛋白的性质(例如，效率、结合能力、立体选择性、屏蔽等)。因此，蛋白可以被工程化以在氨基酸残基中包含插入、缺失、突变和/或取代。可以通过将抗原掺入到衣壳中对衣壳蛋白进行遗传修饰。可选地，病毒颗粒表面可以被直接修饰。先前已展示了对所有三种主要衣壳蛋白的修饰。然而，这些修饰的结果好坏参半，并且最有前景的方法提供的插入尺寸存在重大障碍，特别是在六邻体修饰方面。例如，HVR环只能接受小的插入(约<100个氨基酸残基)，否则六邻体的结构将变得扭曲并且不再产生病毒，例如在抗原/配体(例如RBD)直接附接(例如融合)到六邻体蛋白的情况。因此，诸如RBD的配体不能直接插入到六邻体蛋白中，因为它们太大。另一方面，化学修饰不如基因修饰精确，进行起来更复杂，并且可能降低修饰的病毒的感染性。

如本文所用的“至少一种修饰”是指使用任何适当的手段将第一肽伴侣插入到病毒衣壳蛋白中。例如，将第一肽伴侣插入到腺病毒的六邻体环中或将第一肽伴侣融合到腺病毒pIX次要衣壳蛋白。这种修饰可以例如通过基因融合在遗传上进行，或在化学上进行。

术语“融合蛋白”或“嵌合蛋白”或“杂合蛋白”可以指由两个单独的蛋白或结构域融合形成的单个多肽，具有或不具有另外的接头序列，并且由两个单独的基因和/或核酸序列编码(例如基因融合)。融合蛋白有三种主要类型，端到端融合、插入融合和分支融合(参见‘Methods in Enzymology’-引言(2021))。“端到端融合蛋白”由下游结构域的N-末端与上游结构域的C-末端连接形成。当‘客体结构域’插入到‘宿主结构域’的中间时，形成“插入融合蛋白”。这样的融合蛋白对形成融合蛋白一部分的其他结构域中的变化更敏感，并且需要更多的工程化努力。“分支融合蛋白”提供了一种非线性的融合方法，并且多于两个结构域围绕一个中心点连接在一起。这样的融合蛋白不能在DNA水平上进行遗传编码，并且因此在蛋白水平上形成。端到端融合是最广泛使用的融合蛋白构建。

通常，融合蛋白的形成可以包括将至少两个不同的核酸序列或基因接合在一起(通常称为“基因融合”)，使得当它们被转录(或表达)和翻译为单个单元时，产生包含所述单独的蛋白或结构域的单个多肽。通常，在单个多肽中的所述单独的蛋白之间的融合位点(参见下文定义)的上游和/或下游可以添加、缺失或取代1-3个氨基酸。但应当理解，可以添加、缺失或取代的氨基酸的数量可以取决于构成单个多肽的蛋白的类型和/或所涉及的表达和/或翻译过程。基因融合通常还可以包括从编码第一种蛋白的cDNA序列去除终止密码子，然后同框附加第二种蛋白的cDNA序列。然后，所述基因融合构建体(即缺少一个终止密码子)将被表达为单个蛋白。这种蛋白可以被工程化为包含两种组分的全部序列，或者只包含每种组分的一部分。

在本发明的范围内，融合蛋白的一个实例是六邻体蛋白:DogTag。

术语“融合位点”是指两个蛋白(或结构域)之间的连接处(interface)，在这里两个蛋白连接在一起形成单个多肽(结构域1—融合位点—结构域2)。

本发明的修饰的衣壳蛋白可以包含接头、间隔物和/或支架序列，其存在使得标签蛋白(例如，DogTag)在衣壳蛋白中/上的柔性、稳定性和最佳构象展示成为可能。

术语“接头”或“接头序列”是用于融合、连接(link)或接合(join)两个蛋白的序列，通常是氨基酸序列(参见‘Methods in Enzymology’，2021)，通过引用并入本文。接头的特征及其对特定目的的适用性在本领域是已知的。参见，例如，Chen等人Adv Drug DelivRev.October15；65(10):1357-1369(2013)(公开了各种类型的接头、它们的性质以及相关的接头设计工具和数据库)，其通过引用并入本文。在一些实施方案中，接头是柔性的、刚性的或体内可裂解的。在一些实施方案中，接头是柔性的。柔性接头通常包含小的非极性氨基酸(例如Gly)或极性氨基酸(例如Ser或Thr)。可以在本公开内容中使用的柔性接头的实例包括主要由以下组成的序列：甘氨酸(G)n的链段，其中例如n＝1-6；丝氨酸(S)n的链段，其中例如n＝1-6，或甘氨酸和丝氨酸残基的链段(“GxS接头”)接头，其中例如x＝1-4。在本公开内容中，柔性接头可以包含4个Gly和Ser残基的重复序列。柔性接头可以包含5个Gly和Ser残基的1-5个重复序列。柔性接头的非限制性实例包括(Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)n(SEQID NO:39)、(Ser-Ser-Ser-Ser-Gly)n、(Gly-Ser-Ser-Gly-Gly)n和(Gly-Gly-Ser-Gly-Gly)n，其中n可以是1和5之间的任何整数。在一些实施方案中，接头长度在5个和25个氨基酸残基之间。在一些实施方案中，柔性接头包含5、10、15、20或25个残基。特别地，接头可以包括GGGGS(G4S)。其他接头可以包括刚性接头，诸如(EAAAK)n，其中例如n＝1-4(参见Arai等人)，A(EAAAK)4ALEA(EAAAK)4A，杂合接头诸如(GSG)6A(EAAAK)6A(GSG)6A(EAAAK)6A(GSG)6，弯曲接头和富含pro的序列(XP)n，其中例如X表示氨基酸(例如Ala、Lys、Glu...)，或可裂解接头，诸如二硫化物和/或蛋白酶敏感序列。包含接头可以通过在结构域之间提供距离来帮助控制两个或更多个结构域之间的空间和功能关系，同时保持它们的连接(参见‘Methods in Enzymology’-引言，2021)，通过引用并入本文。其它合适的接头可以选自由以下组成的组：AS、AST、TVAAPS、TVA、ASTSGPS、KESGSVSSEQLAQFRSLD、EGKSSGSGSESKST、(Gly)6、(Gly)8和GSAGSAAGSGEF。通常，柔性接头提供良好的柔性和溶解性，并且可以作为被动接头来保持功能结构域之间的距离。柔性接头的长度可以调节，以允许融合蛋白的正确折叠或实现最佳生物活性。在一些实施方案中，接头包括序列(Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)。在本公开内容中，融合蛋白可以包含多于一个接头。融合蛋白可以具有第一和第二接头，其中第一和第二接头可以包含相同的序列，或可选地可以包含不同的序列。

肽伴侣对

能够自发形成异肽键的蛋白(所谓的“异肽蛋白”)已被有利地用于开发彼此共价结合并提供不可逆相互作用的肽伴侣对(即两部分接头)(参见例如WO2011/098772和WO2016/193746，两者通过引用并入本文，以及WO2018/189517和WO2018/197854，两者通过引用并入本文)。在这方面，能够自发形成异肽键的蛋白可以表达为单独的片段，以提供第一肽伴侣和作为第一肽伴侣的肽结合伴侣的第二肽伴侣，其中这两种片段能够通过异肽键形成而共价重构。这种共价重构将融合到第二肽伴侣和必需的第一肽伴侣的分子或组分连接起来。由肽伴侣对形成的异肽键在非共价相互作用将快速解离的条件(例如长时间段(例如数周)、高温(到至少95℃)、高作用力或苛刻的化学处理(例如pH 2-11、有机溶剂、去污剂或变性剂))下是稳定的。

异肽键是在羧基基团/羧酰胺基团和氨基基团之间形成的酰胺键，其中羧基基团或氨基基团中的至少一个在蛋白主链(蛋白的骨架)之外。这样的键在典型的生物条件下是化学上不可逆的，并且它们对大多数蛋白酶有抗性。由于异肽键本质上是共价键，因此它们导致了一些最强的测量到的蛋白-蛋白相互作用。

简而言之，两部分接头，即肽伴侣对(所谓的肽标签/结合伴侣或捕手对)可以衍生自能够自发形成异肽键的蛋白(异肽蛋白)，其中该蛋白的结构域被单独表达以产生包含参与异肽键的残基之一(例如天门冬氨酸或天冬酰胺、或赖氨酸)的肽“标签”，以及包含参与异肽键的其他残基(例如赖氨酸、或天冬氨酸或天冬酰胺)和形成异肽键所需的至少一个其他残基(例如谷氨酸)的肽伴侣或肽结合伴侣(或“捕手”)。将肽标签和结合/捕手伴侣混合导致标签和结合伴侣之间自发形成异肽键。因此，通过将肽标签和结合伴侣分别掺入到不同的分子或组分例如蛋白中，可以通过在肽标签和结合伴侣之间形成的异肽键将所述分子或组分共价连接，即，在掺入肽标签和结合伴侣的分子或组分之间形成接头。

异肽键的自发形成可以是孤立的，并不需要添加任何其他实体。对于一些肽标签和结合/捕手伴侣对，可能需要第三实体或辅助实体(诸如连接酶)的存在以便生成异肽键。

肽标签/结合伴侣对(两部分接头)，称为SpyTag/SpyCatcher，衍生自化脓性链球菌FbaB蛋白的CnaB2结构域(Zakeri等人，2012，Proc Natl Acad Sci U S A 109，E690-697)并用于包括疫苗开发在内的各种应用(Brune等人，2016，Scientific reports 6，19234；Thrane等人，2016，Journal of Nanobiotechnology 14,30)。

结合对的变体、衍生物和修饰可以通过任何合适的方法进行。变体、衍生物和功能上可操作的修饰可以包括在与相关结合伴侣形成异肽键的能力方面保持相同功能的氨基酸添加、取代、改变或缺失。

对于一些结合对，需要第三实体诸如酶的介导。例如，SnoopLigase可用于介导SnoopTagJr/SnoopTag和DogTag之间的键形成(Buldun等人，Journal of the AmericanChemical Society 2018 140(8),3008-3018 https://pubs.acs.org/doi/10.1021/ jacs.7b13237，通过引用并入)。因此，配对可能需要酶诸如连接酶的辅助。

应理解，如本文所用，第一肽伴侣或第二肽伴侣中的任一种可以是肽“标签”，而另一种是“结合伴侣/捕手”。

适当地，第一肽伴侣和第二肽伴侣形成称为SpyTag/SpyCatcher的肽伴侣对。适当地，SpyCatcher组分是DeltaN1(ΔN1)SpyCatcher(如在Li,L.,Fierer,J.O.,Rapoport,T.A.&Howarth,M.Structural analysis and optimization of the covalentassociation between SpyCatcher and a peptide Tag.J.Mol.Biol.426，309-317(2014)中所述)，与“SpyCatcher”相比，DeltaN1(ΔN1)SpyCatcher在N-末端具有23个氨基酸的截短。

在其他实施方案中，第一肽伴侣和第二肽伴侣形成肽伴侣对，该肽伴侣对是SpyTag/SpyCatcher的突变形式，显示出增加的异肽键形成的反应速率，诸如，例如在共同未决申请WO2018/197854和Keeble等人，PNAS December 26,2019 116(52)26523-26533https://www.pnas.org/content/116/52/26523.long中描述的那些。在一些实施方案中，这些突变形式可以用于大蛋白(例如>50kDa或>100kDa，诸如本文举例说明的>160kDa的HCMV五聚体蛋白)的附接，和/或其中反应缓慢或空间位阻可能是一个问题的附接。

在实施方案中，第一肽伴侣和第二肽伴侣形成肽伴侣对，该肽伴侣对是RrgACatcher/RrgATag的修饰形式，称为DogCatcher/DogTag。后面这些实体在Keeble等人，Cell Chemical Biology,July 2021(https://doi.org/10.1016/ j.chembiol.2021.07.005)中描述。该论文通过引用并入。

在其他实施方案中，形成肽伴侣对的异肽蛋白可以包括SnoopTag/SnoopCatcher，例如在WO 2016/193746中描述的。

在一些实施方案中，形成肽伴侣对的一种或两种异肽蛋白可以具有N-末端或C-末端截短，同时仍然保持异肽键的反应性。

SdyTag和SdyCatcher是基于来自停乳链球菌中相关纤连蛋白结合蛋白的天然Cna蛋白B型(CnaB)结构域构建的。在一些实施方案中，形成肽伴侣对的异肽蛋白是SdyTag和SdyCatcher，或者基于对这些肽伴侣对的修饰。已知的对SdyCatcher的修饰包括形成QueenCatcher、Mooncake和KatI的修饰。SdyCatcher的这样的修饰形式可以与预先存在的或修饰的标签配对，包括但不限于SdyTag、SnoopTag、SpyTag、RumTag、RumTrunkTag、Clib9、PhoTag、EntTag或BacTag。这样的修饰在WO2021/224451中描述，通过引用并入本文。

在下表中描述了示例性第一和第二肽伴侣对(肽标签/结合伴侣对；反应对)，该列表不是详尽的，并且另外的肽伴侣对可以适用于在本发明中使用：

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这些实体被描述在例如，WO2011/098772、WO2016/193746、WO2018/197854、WO2018/189517或Li L.等人,J.Mol.Biol.426,309–317(2014)中。所有都通过引用并入。

下面列出了各种肽伴侣的示例性序列：

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符号*可以指序列末端的终止密码子。优选地，所述序列应以DSATHI结束，在这种情况下*什么都不是。

结合对的变体、衍生物和修饰可以通过任何合适的方法进行。变体、衍生物和功能上可操作的修饰可以包括在与相关结合伴侣形成异肽键的能力方面保持相同功能的氨基酸添加、取代、改变或缺失。

肽对可以通过参考序列来定义。序列可以与针对肽伴侣列出的序列相同。肽伴侣可以具有与所列序列具有至少60％、70％、80％、85％、90％、95％或99％序列同一性的序列。肽伴侣的变体和衍生物可以包含与所列序列至少90％或95％相似的氨基酸序列。因此，这些实体的同源物可以与其具有至少60％的同源性，与其具有诸如至少65％、诸如至少70％、诸如至少75％、诸如至少80％、诸如至少85％、诸如至少90％、诸如至少91％、诸如至少92％、诸如至少93％、诸如至少94％、诸如至少95％、诸如至少96％、诸如至少97％、诸如至少98％、诸如至少99％的同源性。

对于一些结合对，需要第三实体诸如酶的介导。例如，SnoopLigase可用于介导SnoopTagJr和DogTag之间的键形成。因此，配对可能需要酶诸如连接酶的辅助。

抗原

如本文所用的抗原是指能够诱导免疫应答的任何分子。抗原可以是过敏原抗原、病毒抗原、细菌抗原、寄生虫抗原或真菌抗原。如本文所用的“抗原”包括肽和表位、其变体和衍生物。肿瘤抗原包括肿瘤特异性抗原、肿瘤相关抗原和新抗原(由癌细胞新形成的抗原)。“肿瘤特异性抗原”是指只存在于肿瘤细胞上的抗原。“肿瘤相关抗原”是指由肿瘤细胞和正常细胞两者呈现的抗原。“新抗原”是指由肿瘤细胞新形成的抗原。如本文所用的“抗原”包括肽和表位、其变体和衍生物。

B细胞表位

如本文所用，B细胞表位是被免疫系统的抗体和B细胞特异性地识别的抗原的一部分。

T细胞表位

如本文所用，T细胞表位是被T细胞识别的抗原部分。

可以用作抗原来修饰载体或作为转基因而包含的肿瘤相关抗原包括但不限于，脂肪分化相关蛋白(adipophilin)、AIM-2、ALDH1A1、α-肌动蛋白-4、甲胎蛋白(“AFP”)、ARTC1、B-RAF、BAGE-1、BCLX(L)、BCR-ABL融合蛋白b3a2、β-连环蛋白、BING-4、CA-125、CALCA、癌胚抗原(CEA)、CAGE 1至8、CASP-5、CASP-8、CD274、CD45、Cdc27、CDK12、CDK4、CDKN2A、CEA、CLPP、COA-1、CPSF、CSNK1A1、CTAG1、CTAG2、周期蛋白Dl、周期蛋白-Al、dek-can融合蛋白、DKK1、EFTUD2、延伸因子2、ENAH(hMena)、Ep-CAM、EpCAM、EphA3、上皮肿瘤抗原(ETA)、ETV6-AML1融合蛋白、EZH2、ErbB受体、E6、E7、FGF5、FLT3-ITD、FN1、G250/MN/CAIX、GAGE-1、GAGE-2、GAGE-8、GAGE-3、GAGE-4、GAGE-5、GAGE-6、GAGE-7、GAS7、磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3、GnTV、gp100/Pmel 17、GPNMB、HAUS3、Hepsin、HER-2/neu、HERV-K-MEL、HLA-A11、HLA-A2、HLA-DOB、hsp70-2、HPV E2、HPV E6、HPV E7抗原、IDO1、IGF2B3、IL13Rα2、肠羧基酯酶、K-ras、激肽释放酶4、KIF20A、KK-LC-1、KKLC1、KM-HN-1、KMHN1也称为CCDC110、LAGE-1、LDLR-岩藻糖基转移酶融合蛋白、Lengsin、M-CSF、MAGE-A1、MAGE-A 10、MAGE-A12、MAGE-A2、MAGE-A3、MAGE-A4、MAGE-A6、MAGE-A9、MAGE-C1、MAGE-C2、苹果酸酶、乳腺球蛋白-A、MART2、MATN、MC1R、MCSP、mdm-2、ME1、Melan-A/MART-1、Meloe、中期因子、MMP-2、MMP-7、MUC1、MUC5AC、粘蛋白、MUM-1、MUM-2、MUM-3、肌球蛋白、肌球蛋白I类、N-raw、NA88-A、neo-PAP、NFYC、NY-BR-1、NY-ESO-l/LAGE-2、OA1、OGT、OS-9、P多肽、p53、PAP、PAX5、PBF、pml-RARα融合蛋白、多态性上皮粘蛋白(PEM)、PPP1R3B、PRAME、PRDX5、PSA、PSMA、PTPRK、RAB 38/NY-MEL-1、RAGE-1、RBAF600、RGS5、RhoC、R F43、RU2AS、SAGE、secernin 1、SIRT2、SNRPD1、SOX10、Spl7、SPA17、SSX-2、SSX-4、STEAP1、存活蛋白、SYT-SSX1或SYT-SSX2融合蛋白、TAG-1、TAG-2、端粒酶、TGF-βRII、TPBG、TRAG-3、磷酸丙糖异构酶、TRP-1/gp75、TRP-2、TRP2-INT2、酪氨酸酶(TYR)、VEGF、WT1、XAGE-lb/GAGED2a。

鉴定肿瘤相关抗原领域的技术人员将认识到，新的抗原，包括新抗原，不断被鉴定出来，并且因此该列表并不是穷尽的。

可以用于修饰载体或用作转基因的病毒抗原包括但不限于下列病毒或病毒类别的抗原：人类乳头瘤病毒(HPV)例如L1或L2衣壳蛋白、人类免疫缺陷病毒(HIV)例如gp120/gp160、单纯疱疹病毒(HSV2/HSV1)例如gD和gI、流感病毒(A型、B型和C型)、脊髓灰质炎病毒、呼吸道合胞病毒(RSV)例如F抗原(包括以融合前形式稳定的那些)、鼻病毒、轮状病毒、甲型肝炎病毒、诺沃克病毒群、肠道病毒、星状病毒、麻疹病毒、副流感病毒、腮腺炎病毒、水痘-带状疱疹病毒例如gE、人类巨细胞病毒(HCMV)例如gB、EB病毒、腺病毒、风疹病毒、人类T细胞淋巴瘤I型病毒(HTLV-I)、乙型肝炎病毒(HBV)例如乙型肝炎表面抗原、丙型肝炎病毒(HCV)、丁型肝炎病毒、痘病毒、马尔堡病毒和埃博拉病毒、SARS-Cov-2例如刺突或S蛋白。

类似地，细菌抗原包括但不限于以下细菌的抗原：结核分枝杆菌(Mycobacteriumtuberculosis)、衣原体属(Chlamydia)、淋病奈瑟菌(Neisseria gonorrhoeae)、志贺氏菌属(Shigella)、沙门氏菌属(Salmonella)、霍乱弧菌(Vibrio cholerae)、梅毒螺旋体(Treponema pallidum)、假单胞菌属(Pseudomonas)、百日咳博德特氏菌(Bordetellapertussis)、布鲁氏菌属(Brucella)、土拉弗朗西斯菌(Francisella tularensis)、幽门螺杆菌(Helicobacter pylori)、问号钩端螺旋体(Leptospira interrogans)、嗜肺军团菌(Legionella pneumophila)、鼠疫耶尔森菌(Yersinia pestis)、链球菌属(Streptococcus)(A型和B型)、肺炎球菌属(Pneumococcus)、脑膜炎球菌属(Meningococcus)、流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae)(B型)、弓形虫(Toxoplasmagondii)、弯曲菌属(Campylobacter)、卡他莫拉菌(Moraxella catarrhalis)、肉芽肿克雷伯菌(Klebsiella granulomatis)和放线菌属(Actinomyces)。

同样，真菌抗原包括但不限于以下真菌病原体的抗原：假丝酵母属(Candida)和曲霉属(Aspergillus)、隐球菌属(Cryptococcus)、组织胞浆菌属(Histoplasma)和肺孢子菌属(Pneumocystis)。

寄生虫抗原包括但不限于以下寄生虫病原体的抗原：带绦虫属(Taenia)、吸虫(Fluke)、圆虫(Roundworm)、疟原虫属(Plasmodium)、变形虫属(Amoeba)、贾第虫属(Giardia)、隐孢子虫属(Cryptosporidium)、血吸虫属(Schistosoma)、滴虫属(Trichomonas)、锥虫属(Trypanosoma)和旋毛虫属(Trichinella)。

药物组合物和用途

本发明的组合物可以掺入疫苗或治疗性组合物中。适当地，疫苗或免疫原性组合物将包含免疫原性剂量的本发明的颗粒。

药物组合物可以包含根据本发明的颗粒或组合物，其提供有药学上可接受的载体。合适的载体是本领域技术人员所熟知的。在一种实施方案中，药物组合物包含缓冲剂、赋形剂或载体(carrier)。适当地，药物组合物可以包含合适的赋形剂和配制剂(formulations)以保持组合物的稳定性。适当地，所述配制剂可以包含佐剂。在一种实施方案中，配制剂可以包含AddaVaxTM或具有类似于的配方的类似的基于角鲨烯的水包油纳米乳液。其他合适的佐剂包括基于脂质体的佐剂，诸如Matrix M和AS01。其他合适的佐剂包括基于铝的配制剂，诸如/>在一种实施方案中，配制剂可以包含EDTA，例如浓度为5mM。合适的赋形剂或配制剂可取决于颗粒或免疫原性组合物的性质；例如，表达系统的选择可能影响组合物的蛋白的稳定性、糖基化或折叠，这继而可能影响组合物的最佳配方。确定合适的赋形剂、配制剂或佐剂的方法将是本领域技术人员已知的。/>

疫苗

疫苗是包含针对其可以引起免疫应答的片段或整个实体的制剂。它是能够诱导免疫应答的实体，诸如蛋白、肽、脂蛋白、糖蛋白、多糖或其片段。例如，疫苗可以包含微生物或其能够诱导针对所述微生物的免疫应答的部分。包含根据本发明的免疫原性腺病毒载体的疫苗可用于对抗任何病原体，对于所述病原体，所展示的或由转基因编码的抗原用于诱导针对该抗原的免疫应答。

这样的疫苗组合物(或其他免疫原性组合物)配制在合适的递送媒介物中。通常，免疫原性组合物的剂量在为治疗性组合物定义的范围内。任选地，本发明的疫苗组合物可以配制成含有其他组分，包括例如佐剂、稳定剂、pH调节剂、防腐剂等。这样的组分是疫苗领域的技术人员熟知的。合适的佐剂的实例包括但不限于脂质体、明矾、单磷酰基脂质A、皂苷诸如Qs21和任何生物活性因子，诸如细胞因子、白细胞介素、趋化因子及其最佳组合。应当理解，尽管可以使用佐剂，但通常，本发明的腺病毒疫苗不含佐剂。

本发明可以静脉内、皮内、动脉内、腹膜内、病灶内、颅内、关节内、前列腺内、胸膜内、气管内、鼻内、玻璃体内、阴道内、直肠、表面(topically)、肿瘤内、肌肉内、腹膜内、皮下、囊内、粘膜、心包内、口服、局部和/或使用气雾剂、注射、输注、连续输注、直接或通过导管和/或灌洗对靶细胞进行局部灌注浴施用。通常，本发明的疫苗被肌肉内施用。

该疫苗可用于治疗或预防任何一种上文描述的致病病原体的感染或用于治疗肿瘤。

Ad-DogTag

“Ad-DogTag病毒载体包含DogTag向六邻体衣壳蛋白的表面环中的插入，从而能够展示多达～720个配体/病毒粒子。本发明人使用加SnoopTagJr标签的抗原(使用SnoopLigase作为催化剂)或直接通过DogCatcher连接的抗原实现了抗原与六邻体-DogTag的偶联。先前的技术仅能够将长度为<100个氨基酸的小的免疫原性T细胞或B细胞表位插入到腺病毒六邻体环中。本发明展示了10-60kDa的肽与六邻体的偶联，这在先前是不可能实现的。这代表着在开发特别是基于腺病毒的疫苗方面前进了一大步。

Ad-SpyCatcher

“Ad-SpyCatcher”病毒载体包含SpyCatcher向腺病毒次要衣壳蛋白pIX的C-末端上的融合。本发明在不损失病毒感染性的情况下成功地修饰了pIX次要衣壳蛋白。

Ad-SnoopCatcher

“Ad-SnoopCatcher”病毒载体包含SnoopCatcher向腺病毒次要衣壳蛋白pIX的C-末端上的融合。本发明人已经在不损失病毒感染性的情况下成功地修饰了pIX次要衣壳蛋白。

Ad-DogCatcher

“Ad-DogCatcher”病毒载体包含DogCatcher向腺病毒次要衣壳蛋白pIX的C-末端上的融合。本发明人已经在不损失病毒感染性的情况下成功地修饰了pIX次要衣壳蛋白。

Ad-SnoopTagJr

“Ad-SnoopTagJr”病毒载体包含SnoopTagJr向腺病毒次要衣壳蛋白pIX的C-末端上的融合。本发明人已经在不损失病毒感染性的情况下成功地修饰了pIX次要衣壳蛋白。

疫苗接种

在下面详述的实施例中，我们描述了在温和条件下用多种配体对重组腺病毒颗粒进行自发共价修饰的灵活、快速且靶向的系统。特别地，使用DogTag/DogCatcher反应对，我们靶向六邻体蛋白进行衣壳展示，以使配体密度最大化，因为六邻体是腺病毒衣壳中最丰富的组分。几项先前的研究已经通过将序列直接遗传插入到六邻体HVR环中实现了短免疫原性表位的展示，但是这些通常被限制在<50个残基，因为更大的插入破坏了蛋白的稳定性并阻止了重组载体的成功拯救。其他研究已经对病毒衣壳进行了化学修饰以附接更大的配体，包括在半胱氨酸残基上靶向插入反应性二硫化物基团，但是这些方法可能需要具有挑战性的反应和储存条件来实现缀合和保持修饰的载体的感染性。

使用我们的方法，我们通过与DogCatcher的基因融合和重组融合蛋白与Ad-DogTag的共孵育，将大到SARS CoV-2刺突的RBD(～26kDa)的配体共价偶联到六邻体，在每种情况下实现了对病毒衣壳的广泛覆盖。重要地并且尽管有高比例的六邻体单体与配体缀合，但修饰的载体在体外保持了感染性。Ad5载体对293A细胞的转导已被显示是由腺病毒纤维蛋白与柯萨奇和腺病毒受体(CAR)之间的相互作用介导的，由于测试的配体的尺寸，这些相互作用不太可能被六邻体缀合掩盖，如由cryoEM数据所反映的(图7)。

用DogCatcher-SARS CoV-2刺突-RBD和流感HA-RBD两者修饰Ad衣壳表面降低了体外抗Ad中和抗体的效力。针对mAb9C12的衣壳屏蔽是有效的，可能是由于衣壳表面被RBD配体覆盖。事实上，cryoEM数据指示，所有六邻体三聚体都具有至少一个附接的SARS CoV-2刺突-RBD拷贝，配体密度覆盖了六邻体三聚体表面的大部分(图6)。还实现了对多克隆抗Ad血清中和的屏蔽。研究显示，用Ad载体疫苗接种后的血清通常包含针对除六邻体(包括纤维)之外的其他病毒蛋白(其不太可能被六邻体连接掩盖)的抗体。我们的平台具有屏蔽Ad病毒粒子免受其他潜在的不期望衣壳相互作用物影响的潜力。例如，DogCatcher-SARS CoV-2刺突-RBD的展示在体外阻断了hFX介导的SKOV-3细胞的转导，推测是通过抑制hFX和六邻体之间的相互作用。在体内屏蔽这种相互作用将是有利的，因为hFX已被显示增强Ad5对肝细胞的转导，导致全身施用后的肝隔离和肝毒性。迄今为止，Ad衣壳屏蔽解决方案主要包括用聚合物诸如聚乙二醇(PEG)或N-(2-羟丙基)甲基丙烯酰胺(HPMA)包被病毒粒子。虽然是有效的衣壳屏蔽，但这些聚合物包衣往往会损害载体转导。

用DogCatcher-SARS CoV-2刺突-RBD修饰衣壳显著增强了使用Ad疫苗载体的针对SARS CoV-2的体液免疫的加强。在同源初免-加强方案中，与未修饰的Ad相比，用DogCatcher-SARS CoV-2刺突-RBD修饰编码刺突的Ad载体将抗RBD抗体应答的中位数增加了>10倍。引人注目的是，与未修饰的编码刺突的Ad相比，编码不相关抗原(GFP)但在Ad衣壳上展示SARS CoV-2刺突-RBD的载体也引发了显著更高的抗RBD抗体应答。用我们的平台实现的增强体液免疫的关键是增加了针对衣壳展示的SARS CoV-2刺突-RBD的抗体应答的可加强性(boostability)。与未修饰的Ad相比，用RBD衣壳展示的初免和加强之间抗RBD抗体滴度的倍数增加高～10倍。在用编码刺突的传统未修饰Ad免疫接种后，使用SARS CoV-2刺突-RBD修饰的Ad的异源方案以加强免疫后，得到了类似的观察结果(图6)。在两个实验中，使用编码刺突的未修饰的Ad的同源初免-加强对体液免疫的加强是中度的(在抗RBD ELISA中增加了～2-5倍，图3D和图4B)，并且这些数据与先前在小鼠中使用编码SARS CoV-2刺突的其他Ad载体的报告相当。在人类的COVID-19疫苗试验中，使用同源Ad初免-加强方案对细胞和体液免疫的加强也是中度的，特别是当与用mRNA疫苗的异源方案或同源mRNA方案相比时。初免免疫接种后产生的抗载体免疫可能抑制了使用相同载体加强对编码的抗原的免疫应答的能力；抗Ad中和抗体阻止了抗原特异性免疫所需的载体转导和随后的转基因抗原表达。相比之下，以颗粒形式展示在纳米颗粒或VLP(在佐剂制剂中)上的重组蛋白抗原显示产生了稳健的体液免疫，在同源初免-加强方案中具有高效的加强。先前的研究表明，颗粒抗原通过多种机制(包括B细胞受体交联和在引流淋巴结中的延长滞留)产生有效的抗体应答。针对衣壳修饰的SARS CoV-2刺突-RBD的应答似乎可能是由类似的机制诱导的，特别是因为Ad颗粒具有淋巴结进入和滞留的最佳尺寸，尽管需要未来的研究来进一步阐明这些机制。

本文使用的术语“可加强性”是指在重复施用疫苗时加强适应性免疫应答(抗体或T细胞)的能力。由于第一剂后产生的抗载体免疫，传统腺病毒疫苗在重复施用时通常表现出针对转基因编码的抗原的免疫应答的中度可加强性。另一方面，颗粒蛋白疫苗(诸如本发明中的VLP或修饰的Ad)在重复施用时显示出抗体应答的有效加强。

虽然衣壳抗原修饰诱导了有效的体液免疫，但需要在载体基因组中编码抗原序列才能产生有效的细胞免疫。重要的是，衣壳修饰没有损害T细胞对编码的抗原的应答，并且事实上，与同源方案相比，在加强时使用衣壳修饰的载体的异源初免-加强方案提高了细胞免疫(图6C和图6D)。后一种观察结果表明，我们在加强时应用的衣壳屏蔽技术可能规避了初免免疫接种后产生的抗载体免疫。支持这一假设的是，在两个实验中，使用修饰和未修饰的编码刺突的载体的同源初免-加强方案之间的SARS CoV-2刺突特异性IFNγELISPOT应答中位数是相当的，但在异源方案中为～2倍高(图6C)。

我们的衣壳展示平台对于诱导细胞和体液免疫两者比传统Ad疫苗技术提供了显著的改进。总之，这里呈现的数据支持优化相伴的体液和细胞免疫原性的概念，其中用于抗体诱导的抗原靶展示在衣壳表面，并且有效的T细胞表位编码在载体基因组中。这样的概念将使诱导有效T细胞应答的靶病原体的保守组分(诸如SARS CoV-2的核衣壳或ORF1ab)能够在载体基因组中编码，而中和体液免疫的靶诸如刺突-RBD(其通常在序列同一性上更加异质性)可以展示在衣壳表面，并且甚至在必要时变换为不同的形式以响应新变体的出现。最后，该平台诱导稳健的细胞和体液免疫两者以及增强多次注射方案效力的能力对于预防性疫苗之外的应用可能是有利的，包括针对慢性病毒病原体和癌症的治疗性疫苗。Ad衣壳的快速和可定制共价修饰方法也可用于开发个性化疗法。

实施例

现在将通过实例的方式并参考本文描述的附图来说明本发明的某些方面和实施方案。

本文描述的所有材料、方法和实例详述了落入本发明范围内的具体实例，并支持对本发明的理解。另外，本公开内容仅是说明性的，因此不限于所描述的任何特定方法和实验条件。因此，方法和条件可以变化，并且不意图以任何方式进行限制。尽管与本文描述的可选方法和材料相似或等同的方法和材料可以用于实践或测试本公开内容，但下文描述了合适的方法和材料。

实施例1：-材料和方法

产生表达GFP的细菌人工染色体(BAC)衍生的复制缺陷性Ad5分子克隆

从Invitrogen获得质粒pAd-PL-DEST，一种E1/E3缺失(并因此复制缺陷)的Ad5分子克隆。将由驱动增强型绿色荧光蛋白(EGFP)表达的包含四环素操纵子序列的即刻早期巨细胞病毒启动子(CMVp)组成的表达构建体克隆到穿梭载体pENTR4(Invitrogen)中。然后使用Invitrogen Gateway位点特异性重组(LR克隆酶)技术将CMVp EGFP表达构建体插入到Ad5 E1基因座中。使用正向引物(5’-TTAATTAAcgtcgaccaattctcatg)和反向引物(5’-TTAATTAAgtcgacagcgacacacttg)扩增来自pBELOBAC11(NEB)的BAC序列，以在BAC盒的任一端引入PacI位点。随后用PacI将整个Ad5(GFP)基因组序列克隆到BAC中，以产生pBAC-Ad5(GFP)。

使用BAC GalK重组工程化对pBAC-Ad5(GFP)进行遗传修饰以将DogTag蛋白强力胶 技术(protein superglue technology)插入到病毒衣壳蛋白中

GalK重组工程化所需的大肠杆菌(E.coli)菌株SW102从美国国立卫生研究院国家癌症研究所(National Cancer Institute,National Institutes of Health,USA)获得。由DH10B修饰而来的SW102细胞含有处于温度敏感型阻遏子控制下的λ-Red编码的重组基因(exo、bet、gam)并且半乳糖激酶(GalK)基因(该基因是使用半乳糖作为唯一碳源时细菌生长所必需的)缺失。GalK重组工程化系统使得GalK基因能够用于正选择和负选择两者，并且GalK重组工程化完全按照Warming等人，2005[Warming S,Costantino N,Court DL,Jenkins NA,Copeland Ng.Simple and highly efficient BAC recombineering usinggalK selection.Nucleic Acids Res.2005；33(4):e36]中的描述进行。通过重组工程化将GalK基因插入到六邻体HVR5环特定基因座处，在六邻体HVR5环中创建了一个插入位点(如图2A所述)，然后对GalK的存在进行正选择。通过重组工程化替换GalK来进行DogTag序列的插入，并且随后使用2-脱氧半乳糖针对GalK基因的存在进行负选择(selection against)。所得载体称为Ad5-HVR5-DogTag。

表达SARS CoV-2刺突(1-1208)的pBAC-Ad5 HVR5 DogTag的产生

通过BP克隆酶介导的先前描述的pBAC-Ad5(GFP)-HVR5-DogTag与pDONR221之间的位点特异性重组(pDONR221中的氯霉素抗性基因被氨苄青霉素抗性基因替换)产生Ad5-HVR5-DogTag的pAd-DEST(Invitrogen Gateway)形式。BP克隆酶介导的pBAC-Ad5(GFP)-HVR5-DogTag上的attB位点与pDONR上的attP位点之间的重组用ccdB替换了GFP基因，并在E1基因座侧翼产生attR位点，从而产生pBAC Ad5-HVR5-DogTag DEST。将SARS CoV-2刺突蛋白残基1-1208(Wuhan毒株，包含稳定化突变K986P和V987P以及弗林蛋白酶裂解位点682-GSAS-685的突变，密码子优化用于哺乳动物表达)克隆到穿梭载体pENTR4(Invitrogen)中的CMVp下游，并且然后使用LR克隆酶(Invitrogen)插入到pBAC Ad5-HVR5-DogTag DEST的E1基因座中。

掺入了蛋白强力胶技术的重组腺病毒的转染、生长和拯救

用PacI将来自重组腺病毒分子克隆的BAC DNA线性化，以释放左侧和右侧的病毒末端反向重复序列(ITR)。使用Lipofectamine 2000试剂(Invitrogen)将线性化的DNA转染到25cm²瓶(T25)中的E1补充性人胚胎肾(HEK)293细胞系(对于表达GFP的Ad5载体为293A细胞(Invitrogen)，或者对于表达SARS CoV-2刺突的Ad5载体为293TREX细胞(Invitrogen))中。在观察到细胞病变效应(CPE)后，收获细胞，进行三个冻融循环，并将病毒在HEK293A细胞中进一步扩增。根据标准方案，感染10×150cm²瓶(T150)后，48小时后从感染细胞中收获病毒，并通过CsCl梯度超速离心纯化。纯化的病毒在蔗糖储存缓冲液(10mM Tris-HCl、7.5％w/v蔗糖、pH7.8)中透析，并储存于-80℃。

纯化病毒载体制剂的病毒颗粒计数的估计

纯化制剂中腺病毒颗粒的数量可以通过260nm处的分光光度吸收测量病毒DNA含量来估计，如Maizel等人1968.[J.Maizel,D.White,M.Scharff,The polypeptides ofadenovirus:I.Evidence for multiple protein components in the virion and acomparison of types 2,7A,and 12.Virology,第36卷,第1期,1968年9月,第115-125页]所描述的。简而言之，将样品在含有1％w/v的十二烷基硫酸钠(SDS)的病毒储存缓冲液中按1:10稀释，以从衣壳中释放病毒DNA，并使用分光光度计测量260nm处的吸光度。在260nm处1.00的吸光度(AU，1cm路径长度)对应于1.1×10¹²个病毒颗粒/mL。

重组腺病毒在HEK293A细胞中的感染性滴定

通过单细胞感染性测定评估载体制剂对HEK293A细胞或293TREX细胞的感染滴度。对于表达EGFP的载体，受感染的HEK293A细胞通过荧光显微术直接进行可视化和计数。通过对293A或293TREX细胞中的六邻体衣壳蛋白表达进行免疫染色，对不含荧光标志物的载体使用了另一种测定。在无菌96孔深孔板中，在完全培养基(Dulbecco改良的Eagles培养基，加1×GlutaMAX和10％v/v胎牛血清)中对病毒进行10倍系列稀释。对每种病毒进行两次或三次系列稀释，并且含有80％-90％汇合的贴壁HEK293细胞的96孔板的每个孔中添加50μL的每种稀释液(10³至10¹⁰稀释度)。对于六邻体免疫染色，使用预涂覆聚-L-赖氨酸的96孔板来提高细胞与板表面的粘附性。将板在37℃、5％ CO₂孵育48小时。对于表达EGFP的载体的滴定，感染后48小时，通过荧光显微术对单个GFP阳性细胞进行计数，并以每毫升感染单位(ifu)计算感染滴度。对于六邻体免疫染色，从细胞单层吸出培养基，并用冰冷的甲醇固定细胞。然后将板以Dulbecco磷酸盐缓冲盐水(PBS1X，Gibco)洗涤3次，然后用3％w/v低脂牛奶(Marvel)封闭1小时。将检测性小鼠单克隆抗六邻体抗体(B025/AD51，Thermo-Fisher)以1:1000稀释添加到PBS中的1％w/v牛奶中，并在25℃孵育1小时。一抗孵育后，用PBS中的1％w/v牛奶再洗涤细胞3次，然后添加在PBS中的1％w/v牛奶中以1:1000稀释的碱性磷酸酶(ALP)缀合的山羊抗小鼠二抗(STAR117A,BioRad)。再孵育一小时后，将板以PBS洗涤五次，然后显影。为了显影，将100μL新鲜制备的SIGMAfast BCIP/NBT溶液(Sigma)添加到每个孔中，并将板在25℃孵育，直到出现代表单个感染细胞的深染色的焦点(dark stainedfoci)。CsCl纯化的载体制剂的P:I比率通过将每毫升病毒颗粒的估计数量除以每毫升感染单位(ifu)数来计算。

蛋白和肽配体的产生

将用于表达加多组氨酸标签的重组DogCatcher(具有融合到C-末端的18个拷贝的来自恶性疟原虫环子孢子蛋白的NANP重复序列的(DogCatcher-NANP18))的DNA序列克隆到表达质粒pET45(+)(EMD Millipore)中，用于在BL21(DE3)大肠杆菌(NEB)中的蛋白产生。根据先前公布的方案[SnoopLigase Catalyzes Peptide-Peptide Locking and EnablesSolid-Phase Conjugate Isolation.Buldun CM,Jean JX,Bedford MR,Howarth M.J AmChem Soc.2018 Feb 28；140(8):3008-3018.doi:10.1021/jacs.7b13237]，使用亲和Ni-NTA树脂(Qiagen)纯化重组蛋白，透析到PBS中，并储存于-80℃。

将用于表达与SARS CoV-2刺突受体结合结构域(Wuhan毒株，残基319-532)融合的DogCatcher(DogCatcher-S-RBD)、与刺突受体结合结构域融合的SnoopTagJr(S-RBD-SnJr)和与来自甲型流感的血凝素(HA)的受体结合结构域(H1 A/California/04/2009，残基55-266，基于H3编号)融合的DogCatcher(DogCatcher-HA-RBD)的DNA序列克隆到哺乳动物蛋白表达质粒pcDNA3.4中。DogCatcher在S-RBD和HA-RBD的N-末端融合，并且SnoopTagJr在S-RBD的C-末端融合。为了促进分泌，将IgK前导序列METDTLLLWVLLLWVPGSTGD(SEQ ID NO.46)引入到这些融合蛋白中的每一个的N-末端处。将C-末端C-tag(EPEA)融合到每个构建体上，以实现亲和纯化。RBD-SnoopTagJr在悬浮Expi293F细胞中表达，并且DogCatcher-S-RBD和DogCatcher-HA-RBD在悬浮ExpiCHO-S细胞中表达。从培养上清液中收获蛋白，使用AKTA色谱系统(GE)使用C-tag亲和树脂(Thermo Fisher)进行亲和纯化，并透析到tris缓冲盐水(TBS)pH 7.4中。

偶联反应

对于体外测定，DogCatcher融合的蛋白配体与插入到Ad5衣壳(在六邻体HVR5)中的DogTag之间的偶联反应通过共孵育总体积为20μL的自发反应组分进行，单个组分的浓度如附图图例所述。反应在4℃孵育16h。

用于NANP疫苗研究的配体修饰的载体批次通过将Ad5(GFP)-HVR5-DogTag的1.9E+12个病毒颗粒与35μM DogCatcher-NANP18在4℃共孵育16小时来制备。为了去除过量的配体，使用SpectraPor透析盒(300kDa MWCO)将偶联的载体透析到蔗糖储存缓冲液中。如在考马斯染色的SDS-PAGE凝胶上测量的，透析将过量配体减少了10倍以上。通过SDS-PAGE测量配体覆盖率>90％六邻体。

用于SARS CoV-2疫苗研究和电子显微术的配体修饰的载体批次通过将编码GFP或SARS CoV2刺突的9E+11个病毒颗粒Ad5-HVR5-DogTag与6μM DogCatcher-S-RBD在4℃共孵育16小时来制备。为了去除过量的配体，使用SpectraPor透析盒(300kDa MWCO)将偶联的载体透析到蔗糖储存缓冲液中。如在考马斯染色的SDS-PAGE凝胶上测量的，透析将过量配体减少了至少20倍。

对于所有修饰的疫苗载体，透析后残留的过量配体被计入有效抗原剂量计算中。将配体修饰的载体储存于-80℃，内毒素测试，并在免疫前对储存批次重新进行感染性滴定。

通过SDS-PAGE评估偶联效率

如上所述进行偶联反应，并通过添加SDS上样缓冲液(BioRad，31.5mM Tris-HCl，pH 6.8，10％甘油，1％ SDS，0.005％溴酚蓝，300mM DTT)停止偶联反应。将样品在95℃煮沸5min，并加载到SDS-PAGE(NuPAGE 4％-12％ Bis-Tris,Invitrogen)凝胶上。配体(例如DogCatcher融合的配体)偶联到腺病毒衣壳(例如Ad5-HVR-DogTag)的偶联效率(表示为偶联的总六邻体蛋白％)通过直接凝胶迁移测定进行评估。通过SDS-PAGE(200V，55min)分离蛋白，并通过考马斯染色可视化[用快速考马斯(Generon)染色16h，用水脱色]。通过使用Image J比较配体修饰的样品与未修饰(对照)样品中未缀合的六邻体-Tag的条带强度来计算偶联效率：

抗载体抗体中和测定

为了评估有效的中和性小鼠单克隆抗体(mAb)9C12(Developmental StudiesHybridoma Bank,University of Iowa)对载体的中和，在完全培养基中将表达GFP的Ad5载体与系列稀释的mAb 9C12抗体以1:1的比在37℃一起孵育1小时。然后将载体-抗体混合物添加到96孔板形式中的80％汇合的HEK293A细胞单层(以200ifu/细胞的感染复数感染细胞)。将细胞与载体-抗体混合物一起在37℃5％ CO₂孵育2小时，然后用新鲜培养基替换混合物，并将板返回到37℃5％ CO₂再孵育24h。24h后，HEK293A细胞内的GFP表达用作载体感染性的读数；在荧光计(Tecan)上使用395nm的激发波长和509nm的发射波长测量批量荧光(bulk fluorescence)。

为了评估Ad5阳性血清对载体的中和，通过用1E+8ifu的表达卵白蛋白的Ad5载体(载体具有未修饰的六邻体)免疫小鼠获得血清样品。免疫后两周收获血清，储存于-80℃，并且然后系列稀释用于中和测定(在完全培养基中制备从1:4至1:512的两倍稀释液，以在细胞单层上提供1:8至1:1024的最终范围)。将稀释的血清与Ad5(GFP)载体一起孵育，将混合物在HEK293细胞上孵育，并且24h后读取批量GFP荧光，完全如上文所述。

凝血因子X介导的载体对SKOV3细胞的转导的评估

SKOV3细胞(人卵巢腺癌)在含有2mM谷氨酰胺和15％v/v胎牛血清的McCoy 5a培养基(完全McCoy培养基)中培养。对于该测定，将表达GFP的Ad载体在无血清培养基中系列稀释(1:10至1:10⁷)。将人凝血因子X(FX)(Haematologic Technologies)以8μg/mL的终浓度添加到稀释的载体中。将Ad/FX混合物添加到96孔板中的SKOV3细胞单层中，并在37℃和5％CO₂与细胞一起孵育2.5h。2h后，用完全McCoy培养基替换载体-FX混合物，并将板在37℃、5％CO₂再孵育48h。48h后通过如上所述的GFP阳性焦点计数来评估感染性。

小鼠免疫

所有小鼠程序均按照英国动物(科学程序)法案项目许可证(UK Animals(Scientific Procedures)Act Project Licence，PA7D20B85)的条款进行，并由牛津大学伦理审查机构(Oxford University Ethical Review Body)批准。饲养在无特定病原体环境中的雌性Balb/c小鼠(6周龄，Charles River)通过向每只动物的两条后肢中注射50μL配制在无内毒素PBS(Gibco)中的疫苗进行肌肉内免疫(总共100μL)。施用的腺病毒载体和重组蛋白的剂量如附图图例所述。如所述，蛋白疫苗与佐剂组合施用。Alhydrogel(Invivogen)以佐剂与抗原的1:9v/v比施用。AddaVax(Invivogen)以佐剂与抗原的1:1v/v比施用。在所有研究中，每只小鼠的内毒素剂量<3EU。实验在Biomedical Services,University of Oxford进行。

离体IFN-γELISPOT

过夜脾脏离体干扰素γ(IFN-γ)ELISpot按照先前描述的标准方案进行[LarsenKC,Spencer AJ,Goodman AL,Gilchrist A,Furze J,Rollier CS,Kiss-Toth E,GilbertSC,Bregu M,Soilleux EJ,Hill AV,Wyllie DH,Expression of tak1 and traminducessynergistic pro-inflammatory signalling and adjuvants DNAvaccines.Vaccine.2009Sep 18；27(41):5589-98]。为了测量抗原特异性应答，用肽再次刺激细胞18-20小时。为了测量T细胞对GFP的应答，以5μg/mL的终浓度添加肽CD8+T细胞表位EGFP_200-208。为了测量T细胞对SARS CoV-2刺突受体结合结构域(S-RBD)的应答，用跨越S-RBD区域长度具有11个氨基酸重叠的15-mer肽的肽库(P0DTC2 319-541，PepMix^TM SARSCoV-2 S-RBD，JPT Peptide Technologies)刺激细胞。以0.5μg/mL/肽的终浓度添加汇集的肽。为了测量T细胞对SARS CoV-2刺突蛋白的应答，用跨越刺突蛋白整个长度具有11个氨基酸重叠的15-mer肽的两个肽库(PepMix^TM SARS CoV-2刺突糖蛋白，JPT PeptideTechnologies)刺激细胞。以0.5μg/mL/肽的终浓度添加汇集的肽。用自动化ELISpot读取器系统(AID)测量斑点形成细胞(spot forming cell，SFC)。

IgG ELISA

如先前所述进行IgG终点ELISA[S.Biswas,M.D.Dicks,C.A.Long,E.J.Remarque,L.Siani,S.Colloca等人Transgene optimization,immunogenicity and in vitroefficacy of viral vectored vaccines expressing two alleles of Plasmodiumfalciparum AMA1 PLoS ONE,6(2011),p.e20977]。将平板用1μg/mL的重组GFP蛋白(Millipore)包被以测量GFP特异性应答，用2μg/mL浓度的重组DogCatcher-NANP18蛋白包被以测量DogCatcher-NANP18特异性应答，或用2μg/mL浓度的与SnoopTagJr和C-Tag融合的CHO-S细胞中表达的重组SARS CoV-2 S-RBD蛋白(Wuhan毒株，刺突残基319-532)包被以测量SARS CoV-2 S-RBD特异性应答。为了产生终点滴度，来自用表达不相关抗原(GFP用于DogCatcher-NANP18和SARS CoV-2特异性测定，DogCatcher-NANP18用于GFP特异性测定)的Ad5载体免疫的小鼠的血清用作阴性对照。

CryoEM数据收集与图像处理

CryoEM分析由NanoImaging Services,San Diego,USA进行。将3μl样品Ad5-Tag(对照)和样品Ad5-Tag:Catcher-RBD液滴施加到已在Solarus 950等离子体清洁器(Gatan)中使用25％O₂/75％ Ar混合物进行了10s的等离子体清洁的1/2Cu网C-平载网上。将载网手动浸入液态乙烷中冷冻。使用Thermo Fisher Scientific Glacios Cryo透射电子显微镜进行数据收集，该显微镜在200kV运行，并配备有Falcon 3直接电子探测器。用Leginon软件(57)在28,000x的标称放大倍数进行自动数据收集，对应于的像素尺寸。对于样品Ad5-Tag和Ad5-Tag:Catcher-RBD，使用-2.4至-5.6μm的标称离焦范围，分别记录了总共845个和617个影片。曝光分为19帧，曝光率为2.6e-/像素/s，并且总曝光为/>

对于两个样品，使用cryoSPARC3.1进行运动校正和CTF估计。使用cryoSPARC3.1中的高斯斑点选取器(Gaussian blob picker)，为样品Ad5-Tag:Catcher-RBD选取了总共28,371个颗粒，并为样品Ad5-Tag选取了91,920个颗粒。这些颗粒是从cryoTEM图像中提取的，并在cryoSPARC3.1中进行无参考2D分类。样品Ad5-Tag:Catcher-RBD的最佳的28,307个颗粒和为样品Ad5-Tag选取的所有颗粒用于随后的3D重建。初始模型是从样品Ad5-Tag:Catcher-RBD的所有选择的颗粒中从头产生的，并在cryoSPARC3.1中施加的二十面体对称性的一轮均质细化期间使用。Ad5-Tag:Catcher-RBD的最终3D重建被低通滤波至并在cryoSPARC3.1中施加的二十面体对称性的一轮均质细化期间用作样品Ad5-Tag 3D重建的起始体积。最终3D重建的分辨率由两个独立半图之间的傅里叶壳层相关(Fourier shellcorrelation，FSC)确定，两个样品的FSC＝0.143时为/>使用Chimera将图可视化。

实施例2：腺病毒模块化衣壳修饰的概念

六邻体蛋白是腺病毒衣壳的主要组分(每个病毒粒子包含720个拷贝，组装成240个三聚体)，并且因此是模块化衣壳展示的理想靶。本发明人利用DogTag/DogCatcher反应对实现DogCatcher融合的配体向腺病毒病毒粒子表面上的自发共价偶联。

参考图1，示出了由六邻体蛋白(六边形)形成的病毒衣壳，DogTag示出为附接到六邻体蛋白并展示在病毒衣壳的外部。

为了实现共价衣壳修饰，将DogTag(23个氨基酸)遗传插入到六邻体高变表面环中。这里，示出DogTag的侧翼是柔性甘氨酸-丝氨酸接头序列。如本文描述，设想了具有和不具有接头和/或插入在标签蛋白上游和/或下游的接头的其他构建体设计。

参考图2，示出了DogCatcher-SARS CoV-2 S-RBD(C-RBD)配体的设计，来自SARSCoV-2刺突的残基319-532(受体结合结构域)融合到DogCatcher的C-末端。N-末端Igκ前导序列促进该蛋白在CHO细胞中表达时的分泌。DogCatcher-SARS CoV-2-RBD蛋白被设计为展示在腺病毒衣壳的表面上。DogCatcher与修饰病毒衣壳表面的DogTag反应，从而实现DogCatcher配体向腺病毒病毒粒子表面上的自发共价偶联。柔性接头被示出在捕手(DogCatcher)和抗原(例如，SARS CoV-2 S-RBD蛋白)之间。

实施例3-针对通过腺病毒衣壳表面展示产生的Catcher-NANP的抗体应答

恶性疟原虫(Pf)的环子孢子蛋白(CSP)作为疟疾疫苗候选抗原已被广泛研究。该蛋白含有高度免疫原性的重复区域，主要由序列NANP的重复组成；针对该NANP重复区域的疫苗诱导抗体已被显示保护免于疟疾感染。先前，(WO2021/084282)通过在大肠杆菌中表达产生了重组融合蛋白，该重组融合蛋白由在蛋白序列(由18个连续NANP重复序列组成)的N-末端融合的DogCatcher(DogCatcher-NANP18)组成。先前的数据显示，这种融合蛋白可以偶联到具有插入到HVR5六邻体环中的DogTag的Ad5(Ad-DogTag)。随后在腺病毒衣壳表面展示DogCatcher-NANP18能够在体外屏蔽病毒衣壳免受载体中和抗体影响。

在小鼠中进行免疫原性研究，以评估针对当展示在腺病毒衣壳表面时的DogCatcher-NANP18蛋白的抗体滴度，并与用编码DogCatcher-NANP18构建体的腺病毒载体或佐剂制剂中的DogCatcher-NANP18重组蛋白进行免疫接种进行比较(图3A)。单次疫苗剂量后两周，针对DogCatcher-NANP18的IgG终点滴度，在施用衣壳序列上展示DogCatcher-NANP18的腺病毒载体(Ad(GFP)-T:C-NANP18)后，显著高于施用可比剂量的编码DogCatcher-NANP18的载体(Ad(C-NANP18))或佐剂中的重组蛋白后(图3B)。重要的是，在衣壳表面展示DogCatcher-NANP18配体不会损害针对编码的GFP转基因的免疫应答；GFP CD8+T细胞应答(图3C)和GFP IgG抗体应答(图3D)在具有衣壳配体的载体(Ad(GFP)-T:C-NANP18)和不具有衣壳配体的载体(Ad(GFP)-T)之间相当。

实施例4-腺病毒衣壳上Catcher-SARS CoV-2 S-RBD的展示提供了免受抗载体中和抗体影响的屏蔽

产生了由与SARS CoV-2刺突蛋白受体结合结构域(S-RBD)的N-末端融合的DogCatcher组成的融合蛋白，并在哺乳动物中国仓鼠卵巢(CHO)细胞中表达。将编码GFP转基因的Ad-DogTag(1E+10个病毒颗粒)与DogCatcher-S-RBD(3.5μM)在4℃孵育过夜(16h)。将样品在SDS-PAGE上运行，并通过考马斯染色将蛋白可视化，如图4A所示。偶联效率(表示为总计偶联的六邻体蛋白％)计算为64％。

偶联后，立即对图4A所述的样品进行载体感染性测定。将样品系列稀释，施加至96孔板中的HEK293A细胞单层，并在37℃和5％ CO₂孵育48h。通过荧光显微术对GFP荧光焦点计数来计算感染滴度。感染滴度计算为每毫升的感染单位(ifu)数。数据指示，配体偶联后载体感染性被保留(图4B)。

将偶联载体与系列稀释的病毒中和性小鼠单克隆抗六邻体抗体mAb 9C12(Developmental Studies Hybridoma Bank,University of Iowa)在37℃一起孵育1h，然后将载体-抗体混合物添加到96孔板形式中的80％汇合的HEK293A细胞单层(以200ifu/细胞的感染复数被感染细胞)。将细胞与载体-抗体混合物在37℃和5％ CO₂孵育2h，然后用新鲜培养基替换混合物，并将板返回到37℃5％ CO₂再孵育24h。24h后，HEK293A细胞内的GFP表达用作感染性的读数——在荧光计上使用395nm的激发和509nm的发射测量批量荧光。图4C所示的数据显示，在存在mAb 9C12的浓度增加到50ng/ml的情况下，展示DogCatcher-S-RBD的Ad-DogTag(Ad-T:C-RBD)显示感染性几乎没有降低，而没有衣壳屏蔽的Ad-DogTag(Ad-T)被mAb 9C12有效中和。

在图4D中，用Ad5阳性小鼠血清(而不是mAb 9C12)对偶联的Ad-T:C-RBD进行了中和测定。为了产生Ad5阳性小鼠血清，用1E+8ifu的Ad5(卵白蛋白)(WT六邻体)载体(在E1基因座处编码的组成型CMV启动子的控制下表达卵白蛋白而不是GFP的具有未修饰的六邻体的Ad5 E1和E3缺失载体)对小鼠进行肌肉内免疫，并在免疫后两周收获血清。数据显示，中和抗血清对Ad-T:C-RBD表现出比对Ad-T降低的效力。

在图4E中，进行了一项测定来测试人类因子X介导的SKOV-3细胞的转导。人类凝血因子X(hFX)先前已被显示直接结合Ad5六邻体蛋白，并在体内经由硫酸乙酰肝素蛋白聚糖(HSPG)介导Ad5载体对肝细胞的转导，特别是在血管内递送后。在这种相互作用的体外模型中，用DogCatcher-S-RBD修饰的衣壳完全消除了hFX介导的Ad5对SKOV-3细胞的转导，而没有衣壳屏蔽的Ad5在与hFX共孵育后表现出SKOV-3感染性增加6.6倍(图4E)。

实施例5-针对当展示在腺病毒衣壳表面时的SARS CoV-2 S-RBD产生的高滴度抗体应答

在小鼠中进行免疫原性研究，以评估与在载体基因组中编码有SARS CoV-2刺突蛋白(残基1-1208)的腺病毒载体相比，针对当展示在腺病毒衣壳表面时的SARS CoV-2 S-RBD蛋白的抗体滴度。

在同源初免-加强方案(在第0天和第21天)中，用编码刺突1-1208的Ad-DogTag(Ad(刺突)-T，第1组)、与第1组相同但含有偶联到病毒衣壳的DogCatcher-S-RBD的载体(Ad(刺突)-T:C-RBD，第2组)、含有偶联到病毒衣壳的DogCatcher-S-RBD的编码GFP转基因的Ad-DogTag(Ad(GFP)-T:C-RBD，第3组)或用在alhydrogel(第4组)或Addavax(第5组)佐剂中的重组DogCatcher-S-RBD蛋白(C-RBD)对小鼠免疫接种(图5A)。

示出了加强前(第20天，图5B)和加强后两周(第35天，图5C)针对SARS CoV-2 S-RBD的血清抗体滴度(IgG终点ELISA)。与仅编码刺突蛋白的载体(第1组)相比，用在衣壳表面上展示SARS CoV-2 S-RBD的载体(第2组和第3组)免疫接种后的加强后抗体滴度更高(图3C)。事实上，用Ad(GFP)-T:C-RBD(第3组)免疫接种后的抗体滴度与Ad(刺突)-T:C-RBD(第2组)相当，尽管前一种载体缺乏编码的刺突抗原。图3D示出了第20天和第35天之间ELISA滴度的变化倍数，并指示与没有衣壳展示的刺突编码载体(第1组)相比，衣壳表面上SARSCoV-2 RBD的展示(第2组和第3组)增加了抗体应答的可加强性。

重要的是，在衣壳表面上展示DogCatcher-S-RBD配体不会损害T细胞针对编码的SARS CoV-2刺突抗原的应答。针对SARS CoV-2 S-RBD肽库(图5E)和SARS CoV-2 S(全长)肽库(图5F)的脾脏IFNγT细胞ELISPOT应答示出，Ad(刺突)-T和Ad(刺突)-T:C-RBD的T细胞免疫原性相当。与第3组相比，第1组和第2组中针对SARS CoV-2 S-RBD的T细胞应答程度显著更高，指示编码抗原比衣壳展示更有利于诱导T细胞免疫原性。

总之，这些数据支持使用腺病毒载体优化相伴的体液和细胞免疫原性的概念，其中用于抗体诱导的抗原靶展示在衣壳表面，并且有效的T细胞表位编码在载体基因组中。

实施例6：应用衣壳屏蔽来加强腺病毒疫苗提高了体液和细胞免疫原性两者

鉴于衣壳展示技术引发针对SARS CoV-2的有效体液免疫的能力，我们试图确定RBD衣壳修饰是否可以有效地加强已经接受第一剂编码刺突的传统Ad载体的动物的免疫力。将同源Ad(刺突)-T初免-加强与异源方案进行比较，在异源方案中RBD衣壳屏蔽(Ad(刺突)-T:C-RBD)应用于第二疫苗剂量(图6A)。在同源方案中，在初免免疫接种和加强免疫接种之间观察到抗RBD IgG滴度中位数增加了5.3倍，但在异源方案后观察到滴度增加了>10倍高(63.1倍)(图6B)。另外，与同源方案相比，异源方案中针对全长SARS CoV-2刺突的脾脏IFNγELISPOT应答也更高(图6C)。在使用仅跨越刺突残基633-1273(因此不包含RBD区域)的肽库的IFNγELISPOT测定中观察到类似的观察结果，指示异源初免-加强后增加的对编码的刺突转基因的细胞免疫独立于RBD衣壳配体的贡献而发生(图6D)。

实施例7：展示SARS CoV-2刺突RBD的腺病毒颗粒的CryoEM分析

为了进一步研究用SARS CoV-2刺突-RBD对Ad颗粒的衣壳修饰的性质，对修饰的(Ad-Tag:Catcher-RBD)和未修饰的(Ad-Tag)颗粒进行了cryoEM分析(图7)。与未修饰的颗粒相比，修饰颗粒的3D密度图清楚地指示了从六邻体三聚体向外扩展的额外密度(图7A)。与Ad-Tag颗粒相比，从Ad-Tag:Catcher-RBD颗粒的2D类平均值中也可以观察到从六邻体三聚体突出的额外密度，将颗粒直径从93nm扩展到98nm(图7B)。Ad-Tag上的表面突起(代表六邻体三聚体)具有均匀的密度，而Ad-Tag:Catcher-RBD显示出两个不同的区域，代表偶联的RBD的最外层区域的密度低于六邻体三聚体，这可能是由于附接的配体的柔性引起的。3D密度图分析揭示了每个六邻体三聚体附接了一个(I型，图7C)或两个(II型，图7D)RBD配体。II型修饰在位于衣壳顶点与五邻体亚基相邻的六邻体三聚体上特别丰富。这些三聚体相对于病毒粒子表面的其余部分升高(参见图7A，Ad-Tag图的较暗区域；注意，纤维蛋白未示出)，并且因此空间位阻可能较低，使得多配体占据成为可能。与未修饰的Ad-Tag相比，代表附接的RBD的额外密度对于I型和II型排列都是清楚的；图7E示出了将RBD结构拟合到这些图中(RBD N-末端接近六邻体HVR5，DogCatcher未示出)。该cryoEM数据指示，所有六邻体三聚体都具有至少一个附接的RBD拷贝，配体密度覆盖了六邻体三聚体表面的大部分。

实施例8-腺病毒衣壳上Catcher-HA-RBD的展示提供了免受有效抗衣壳中和抗体影响的屏蔽

产生了由与甲型流感血凝素受体结合结构域(H1 A/California/04/2009株，HA-RBD)的受体结合结构域的N-末端融合的DogCatcher组成的融合蛋白，并在哺乳动物中国仓鼠卵巢(CHO)细胞中表达。将编码GFP转基因的Ad-DogTag(5E+9个病毒颗粒)与DogCatcher-HA-RBD(1.75μM)在4℃孵育过夜(16h)。将样品在SDS-PAGE上运行，并通过考马斯染色将蛋白可视化，如图8A所示。偶联效率计算为44％。

偶联后，立即对图4A所述的样品进行载体感染性测定。将样品系列稀释，施加至96孔板中的HEK293A细胞单层，并在37℃和5％ CO2孵育48h。通过荧光显微术对GFP荧光焦点计数来计算感染滴度。感染滴度计算为每毫升的感染单位(ifu)数。数据指示，配体偶联后载体感染性被保留(图8B)。

将偶联载体与系列稀释的病毒中和性小鼠单克隆抗六邻体抗体mAb 9C12在37℃一起孵育1h，然后将载体-抗体混合物添加到96孔板形式中的80％汇合的HEK293A细胞单层(以200ifu/细胞的感染复数被感染细胞)。将细胞与载体-抗体混合物在37℃和5％ CO2孵育2h，然后用新鲜培养基替换混合物，并将板返回到37℃5％ CO2再孵育24h。24h后，HEK293A细胞内的GFP表达用作感染性的读数——在荧光计上使用395nm的激发和509nm的发射测量批量荧光。图7C所示的数据显示，在存在mAb 9C12的浓度增加到100ng/ml的情况下，展示DogCatcher-HA-RBD(Ad-T:C-RBD)的Ad-DogTag仅显示出中度降低的感染性，而没有衣壳屏蔽的Ad-DogTag(Ad-T)被浓度>10ng/ml的mAb 9C12有效中和。

总之，图4和图8中呈现的数据显示，来自不同致病病毒的受体结合结构域可以展示在腺病毒载体的衣壳表面。用这些RBD结构域修饰腺病毒衣壳作为捕手融合蛋白也可以屏蔽衣壳以有效阻断载体中和抗体的结合和/或其他不期望的衣壳相互作用是可推广的概念。

序列表

<110> 斯拜生物技术有限公司

<120> 疫苗

<130> P34936

<160> 46

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 113

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> SpyCatcher

<400> 1

Val Asp Thr Leu Ser Gly Leu Ser Ser Glu Gln Gly Gln Ser Gly Asp

1 5 10 15

Met Thr Ile Glu Glu Asp Ser Ala Thr His Ile Lys Phe Ser Lys Arg

20 25 30

Asp Glu Asp Gly Lys Glu Leu Ala Gly Ala Thr Met Glu Leu Arg Asp

35 40 45

Ser Ser Gly Lys Thr Ile Ser Thr Trp Ile Ser Asp Gly Gln Val Lys

50 55 60

Asp Phe Tyr Leu Tyr Pro Gly Lys Tyr Thr Phe Val Glu Thr Ala Ala

65 70 75 80

Pro Asp Gly Tyr Glu Val Ala Thr Ala Ile Thr Phe Thr Val Asn Glu

85 90 95

Gln Gly Gln Val Thr Val Asn Gly Lys Ala Thr Lys Gly Asp Ala His

100 105 110

Ile

<210> 2

<211> 92

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> SpyCatcher N1

<400> 2

Asp Ser Ala Thr His Ile Lys Phe Ser Lys Arg Asp Glu Asp Gly Lys

1 5 10 15

Glu Leu Ala Gly Ala Thr Met Glu Leu Arg Asp Ser Ser Gly Lys Thr

20 25 30

Ile Ser Thr Trp Ile Ser Asp Gly Gln Val Lys Asp Phe Tyr Leu Tyr

35 40 45

Pro Gly Lys Tyr Thr Phe Val Glu Thr Ala Ala Pro Asp Gly Tyr Glu

50 55 60

Val Ala Thr Ala Ile Thr Phe Thr Val Asn Glu Gln Gly Gln Val Thr

65 70 75 80

Val Asn Gly Lys Ala Thr Lys Gly Asp Ala His Ile

85 90

<210> 3

<211> 113

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> SpyCatcher002

<400> 3

Val Thr Thr Leu Ser Gly Leu Ser Gly Glu Gln Gly Pro Ser Gly Asp

1 5 10 15

Met Thr Thr Glu Glu Asp Ser Ala Thr His Ile Lys Phe Ser Lys Arg

20 25 30

Asp Glu Asp Gly Arg Glu Leu Ala Gly Ala Thr Met Glu Leu Arg Asp

35 40 45

Ser Ser Gly Lys Thr Ile Ser Thr Trp Ile Ser Asp Gly His Val Lys

50 55 60

Asp Phe Tyr Leu Tyr Pro Gly Lys Tyr Thr Phe Val Glu Thr Ala Ala

65 70 75 80

Pro Asp Gly Tyr Glu Val Ala Thr Ala Ile Thr Phe Thr Val Asn Glu

85 90 95

Gln Gly Gln Val Thr Val Asn Gly Glu Ala Thr Lys Gly Asp Ala His

100 105 110

Thr

<210> 4

<211> 113

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> Spycatcher003

<400> 4

Val Thr Thr Leu Ser Gly Leu Ser Gly Glu Gln Gly Pro Ser Gly Asp

1 5 10 15

Met Thr Thr Glu Glu Asp Ser Ala Thr His Ile Lys Phe Ser Lys Arg

20 25 30

Asp Glu Asp Gly Arg Glu Leu Ala Gly Ala Thr Met Glu Leu Arg Asp

35 40 45

Ser Ser Gly Lys Thr Ile Ser Thr Trp Ile Ser Asp Gly His Val Lys

50 55 60

Asp Phe Tyr Leu Tyr Pro Gly Lys Tyr Thr Phe Val Glu Thr Ala Ala

65 70 75 80

Pro Asp Gly Tyr Glu Val Ala Thr Pro Ile Glu Phe Thr Val Asn Glu

85 90 95

Asp Gly Gln Val Thr Val Asp Gly Glu Ala Thr Glu Gly Asp Ala His

100 105 110

Thr

<210> 5

<211> 83

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> SpyCatcher N1 C2

<400> 5

Asp Ser Ala Thr His Ile Lys Phe Ser Lys Arg Asp Glu Asp Gly Lys

1 5 10 15

Glu Leu Ala Gly Ala Thr Met Glu Leu Arg Asp Ser Ser Gly Lys Thr

20 25 30

Ile Ser Thr Trp Ile Ser Asp Gly Gln Val Lys Asp Phe Tyr Leu Tyr

35 40 45

Pro Gly Lys Tyr Thr Phe Val Glu Thr Ala Ala Pro Asp Gly Tyr Glu

50 55 60

Val Ala Thr Ala Ile Thr Phe Thr Val Asn Glu Gln Gly Gln Val Thr

65 70 75 80

Val Asn Gly

<210> 6

<211> 112

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> SnoopCatcher

<400> 6

Lys Pro Leu Arg Gly Ala Val Phe Ser Leu Gln Lys Gln His Pro Asp

1 5 10 15

Tyr Pro Asp Ile Tyr Gly Ala Ile Asp Gln Asn Gly Thr Tyr Gln Asn

20 25 30

Val Arg Thr Gly Glu Asp Gly Lys Leu Thr Phe Lys Asn Leu Ser Asp

35 40 45

Gly Lys Tyr Arg Leu Phe Glu Asn Ser Glu Pro Ala Gly Tyr Lys Pro

50 55 60

Val Gln Asn Lys Pro Ile Val Ala Phe Gln Ile Val Asn Gly Glu Val

65 70 75 80

Arg Asp Val Thr Ser Ile Val Pro Gln Asp Ile Pro Ala Thr Tyr Glu

85 90 95

Phe Thr Asn Gly Lys His Tyr Ile Thr Asn Glu Pro Ile Pro Pro Lys

100 105 110

<210> 7

<211> 98

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> Spyligase

<400> 7

Asp Tyr Asp Gly Gln Ser Gly Asp Gly Lys Glu Leu Ala Gly Ala Thr

1 5 10 15

Met Glu Leu Arg Asp Ser Ser Gly Lys Thr Ile Ser Thr Trp Ile Ser

20 25 30

Asp Gly Gln Val Lys Asp Phe Tyr Leu Tyr Pro Gly Lys Tyr Thr Phe

35 40 45

Val Glu Thr Ala Ala Pro Asp Gly Tyr Glu Val Ala Thr Ala Ile Thr

50 55 60

Phe Thr Val Asn Glu Gln Gly Gln Val Thr Val Asn Gly Lys Ala Thr

65 70 75 80

Lys Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Glu Asp Ser Ala Thr

85 90 95

His Ile

<210> 8

<211> 98

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> SdyCatcher

<400> 8

Leu Ser Gly Glu Thr Gly Gln Ser Gly Asn Thr Thr Ile Glu Glu Asp

1 5 10 15

Ser Thr Thr His Val Lys Phe Ser Lys Arg Asp Ala Asn Gly Lys Glu

20 25 30

Leu Ala Gly Ala Met Ile Glu Leu Arg Asn Leu Ser Gly Gln Thr Ile

35 40 45

Gln Ser Trp Ile Ser Asp Gly Thr Val Lys Val Phe Tyr Leu Met Pro

50 55 60

Gly Thr Tyr Gln Phe Val Glu Thr Ala Ala Pro Glu Gly Tyr Glu Leu

65 70 75 80

Ala Ala Pro Ile Thr Phe Thr Ile Asp Glu Lys Gly Gln Ile Trp Val

85 90 95

Asp Ser

<210> 9

<211> 104

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> RrgACatcher

<400> 9

Lys Leu Gly Asp Ile Glu Phe Ile Lys Val Asn Lys Asn Asp Lys Lys

1 5 10 15

Pro Leu Arg Gly Ala Val Phe Ser Leu Gln Lys Gln His Pro Asp Tyr

20 25 30

Pro Asp Ile Tyr Gly Ala Ile Asp Gln Asn Gly Thr Tyr Gln Asn Val

35 40 45

Arg Thr Gly Glu Asp Gly Lys Leu Thr Phe Lys Asn Leu Ser Asp Gly

50 55 60

Lys Tyr Arg Leu Phe Glu Asn Ser Glu Pro Ala Gly Tyr Lys Pro Val

65 70 75 80

Gln Asn Lys Pro Ile Val Ala Phe Gln Ile Val Asn Gly Glu Val Arg

85 90 95

Asp Val Thr Ser Ile Val Pro Gln

100

<210> 10

<211> 104

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> DogCatcher V1

<400> 10

Lys Leu Gly Glu Ile Glu Phe Ile Lys Val Asp Lys Thr Asp Lys Lys

1 5 10 15

Pro Leu Arg Gly Ala Val Phe Ser Leu Gln Lys Gln His Pro Asp Tyr

20 25 30

Pro Asp Ile Tyr Gly Ala Ile Asp Gln Asn Gly Thr Tyr Gln Asp Val

35 40 45

Arg Thr Gly Glu Asp Gly Lys Leu Thr Phe Thr Asn Leu Ser Asp Gly

50 55 60

Lys Tyr Arg Leu Ile Glu Asn Ser Glu Pro Pro Gly Tyr Lys Pro Val

65 70 75 80

Gln Asn Lys Pro Ile Val Ser Phe Arg Ile Val Asp Gly Glu Val Arg

85 90 95

Asp Val Thr Ser Ile Val Pro Gln

100

<210> 11

<211> 104

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> DogCatcher V2

<400> 11

Lys Leu Gly Glu Ile Glu Phe Ile Lys Val Asp Lys Thr Asp Lys Lys

1 5 10 15

Pro Leu Arg Gly Ala Val Phe Ser Leu Gln Lys Gln His Pro Asp Tyr

20 25 30

Pro Asp Ile Tyr Gly Ala Ile Asp Gln Asn Gly Thr Tyr Gln Asp Val

35 40 45

Arg Thr Gly Glu Asp Gly Lys Leu Thr Phe Thr Asn Leu Ser Asp Gly

50 55 60

Lys Tyr Arg Leu Phe Glu Asn Ser Glu Pro Pro Gly Tyr Lys Pro Val

65 70 75 80

Gln Asn Lys Pro Ile Val Ala Phe Gln Ile Val Asp Gly Glu Val Arg

85 90 95

Asp Val Thr Ser Ile Val Pro Gln

100

<210> 12

<211> 91

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> PsCsCatcher

<400> 12

Glu Gln Asp Val Val Phe Ser Lys Val Asn Val Ala Gly Glu Glu Ile

1 5 10 15

Ala Gly Ala Lys Ile Gln Leu Lys Asp Ala Gln Gly Gln Val Val His

20 25 30

Ser Trp Thr Ser Lys Ala Gly Gln Ser Glu Thr Val Lys Leu Lys Ala

35 40 45

Gly Thr Tyr Thr Phe His Glu Ala Ser Ala Pro Thr Gly Tyr Leu Ala

50 55 60

Val Thr Asp Ile Thr Phe Glu Val Asp Val Gln Gly Lys Val Thr Val

65 70 75 80

Lys Asp Ala Asn Gly Asn Gly Val Lys Ala Asp

85 90

<210> 13

<211> 282

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> PilinC

<400> 13

Ala Thr Thr Val His Gly Glu Thr Val Val Asn Gly Ala Lys Leu Thr

1 5 10 15

Val Thr Lys Asn Leu Asp Leu Val Asn Ser Asn Ala Leu Ile Pro Asn

20 25 30

Thr Asp Phe Thr Phe Lys Ile Glu Pro Asp Thr Thr Val Asn Glu Asp

35 40 45

Gly Asn Lys Phe Lys Gly Val Ala Leu Asn Thr Pro Met Thr Lys Val

50 55 60

Thr Tyr Thr Asn Ser Asp Lys Gly Gly Ser Asn Thr Lys Thr Ala Glu

65 70 75 80

Phe Asp Phe Ser Glu Val Thr Phe Glu Lys Pro Gly Val Tyr Tyr Tyr

85 90 95

Lys Val Thr Glu Glu Lys Ile Asp Lys Val Pro Gly Val Ser Tyr Asp

100 105 110

Thr Thr Ser Tyr Thr Val Gln Val His Val Leu Trp Asn Glu Glu Gln

115 120 125

Gln Lys Pro Val Ala Thr Tyr Ile Val Gly Tyr Lys Glu Gly Ser Lys

130 135 140

Val Pro Ile Gln Phe Lys Asn Ser Leu Asp Ser Thr Thr Leu Thr Val

145 150 155 160

Lys Lys Lys Val Ser Gly Thr Gly Gly Asp Arg Ser Lys Asp Phe Asn

165 170 175

Phe Gly Leu Thr Leu Lys Ala Asn Gln Tyr Tyr Lys Ala Ser Glu Lys

180 185 190

Val Met Ile Glu Lys Thr Thr Lys Gly Gly Gln Ala Pro Val Gln Thr

195 200 205

Glu Ala Ser Ile Asp Gln Leu Tyr His Phe Thr Leu Lys Asp Gly Glu

210 215 220

Ser Ile Lys Val Thr Asn Leu Pro Val Gly Val Asp Tyr Val Val Thr

225 230 235 240

Glu Asp Asp Tyr Lys Ser Glu Lys Tyr Thr Thr Asn Val Glu Val Ser

245 250 255

Pro Gln Asp Gly Ala Val Lys Asn Ile Ala Gly Asn Ser Thr Glu Gln

260 265 270

Glu Thr Ser Thr Asp Lys Asp Met Thr Ile

275 280

<210> 14

<211> 113

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> QueenCatcher

<400> 14

Ile Asp Thr Met Ser Gly Leu Ser Gly Glu Thr Gly Gln Ser Gly Asn

1 5 10 15

Thr Thr Ile Glu Glu Asp Ser Thr Thr His Val Lys Phe Ser Lys Arg

20 25 30

Asp Ser Asn Gly Lys Glu Leu Ala Gly Ala Met Ile Glu Leu Arg Asn

35 40 45

Leu Ser Gly Gln Thr Ile Gln Ser Trp Val Ser Asp Gly Thr Val Lys

50 55 60

Asp Phe Tyr Leu Met Pro Gly Thr Tyr Gln Phe Val Glu Thr Ala Ala

65 70 75 80

Pro Glu Gly Tyr Glu Leu Ala Ala Pro Ile Thr Phe Thr Val Asn Glu

85 90 95

Gln Gly Gln Val Thr Val Asn Gly Lys Ala Thr Lys Gly Asp Ala His

100 105 110

Ile

<210> 15

<211> 112

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> Kat I

<400> 15

Asp Thr Met Ser Gly Leu Ser Gly Glu Thr Gly Gln Ser Gly Asn Thr

1 5 10 15

Thr Ile Glu Glu Asp Ser Thr Thr His Val Lys Phe Ser Lys Arg Asp

20 25 30

Ser Asn Gly Lys Glu Leu Ala Gly Ala Met Ile Glu Leu Arg Asn Leu

35 40 45

Ser Gly Gln Thr Ile Gln Ser Trp Val Ser Asp Gly Thr Val Lys Asp

50 55 60

Phe Tyr Leu Met Pro Gly Thr Tyr Gln Phe Val Glu Thr Ala Ala Pro

65 70 75 80

Glu Gly Tyr Glu Leu Ala Ala Pro Ile Thr Phe Thr Val Gln Asp Asn

85 90 95

Gly Glu Val Gln Ile Gln Gly Lys Ala Thr Arg Gly Asp Val Pro Ile

100 105 110

<210> 16

<211> 113

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> Mooncake

<400> 16

Ile Asp Thr Met Ser Gly Leu Ser Gly Glu Thr Gly Gln Ser Gly Asn

1 5 10 15

Thr Thr Ile Glu Glu Asp Ser Thr Thr His Val Lys Phe Ser Lys Arg

20 25 30

Asp Ser Asn Gly Lys Glu Leu Ala Gly Ala Met Ile Glu Leu Arg Asn

35 40 45

Leu Ser Gly Gln Thr Ile Gln Ser Trp Val Ser Asp Gly Thr Val Lys

50 55 60

Asp Phe Tyr Leu Met Pro Gly Thr Tyr Gln Phe Val Glu Thr Ala Ala

65 70 75 80

Pro Glu Gly Tyr Glu Leu Ala Ala Pro Ile Thr Phe Thr Val Gln Asp

85 90 95

Asn Gly Glu Val Ile Ile Gln Gly Arg Leu Thr Arg Gly Asp Val His

100 105 110

Ile

<210> 17

<211> 13

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> SpyTag

<400> 17

Ala His Ile Val Met Val Asp Ala Tyr Lys Pro Thr Lys

1 5 10

<210> 18

<211> 14

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> SpyTag002

<400> 18

Val Pro Thr Ile Val Met Val Asp Ala Tyr Lys Arg Tyr Lys

1 5 10

<210> 19

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> SpyTag003

<400> 19

Arg Gly Val Pro His Ile Val Met Val Asp Ala Tyr Lys Arg Tyr Lys

1 5 10 15

<210> 20

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> SnoopTag

<400> 20

Lys Leu Gly Asp Ile Glu Phe Ile Lys Val Asn Lys

1 5 10

<210> 21

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> SnoopTag Jr

<400> 21

Lys Leu Gly Ser Ile Glu Phe Ile Lys Val Asn Lys

1 5 10

<210> 22

<211> 23

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> DogTag

<400> 22

Asp Ile Pro Ala Thr Tyr Glu Phe Thr Asp Gly Lys His Tyr Ile Thr

1 5 10 15

Asn Glu Pro Ile Pro Pro Lys

20

<210> 23

<211> 13

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> SdyTag

<400> 23

Asp Pro Ile Val Met Ile Asp Asn Asp Lys Pro Ile Thr

1 5 10

<210> 24

<211> 13

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> PsCsTag

<400> 24

Gly Asn Lys Leu Thr Val Thr Asp Gln Ala Ala Pro Ser

1 5 10

<210> 25

<211> 19

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> RrgATag

<400> 25

Asp Ile Pro Ala Thr Tyr Glu Phe Thr Asn Asp Lys His Tyr Ile Thr

1 5 10 15

Asn Glu Pro

<210> 26

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> IsopepTag

<400> 26

Thr Asp Lys Asp Met Thr Ile Thr Phe Thr Asn Lys Lys Asp Ala Glu

1 5 10 15

<210> 27

<211> 60

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> RumTag

<400> 27

Ala Gly Cys Gly Ala Ala Ala Ala Cys Gly Gly Cys Ala Ala Cys Cys

1 5 10 15

Cys Gly Cys Thr Gly Ala Thr Thr Gly Thr Gly Ala Thr Gly Gly Thr

20 25 30

Gly Gly Ala Thr Gly Ala Thr Ala Cys Cys Ala Cys Cys Ala Ala Ala

35 40 45

Gly Thr Gly Ala Ala Ala Ala Thr Thr Ala Gly Cys

50 55 60

<210> 28

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> Clib9

<400> 28

Arg Gly Val Pro Thr Ile Val Met Val Asp Cys Tyr Lys Arg Tyr Lys

1 5 10 15

<210> 29

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> RumTrunkTag

<400> 29

Gly Asn Pro Leu Ile Val Met Val Asp Asp Thr Thr Lys Val Lys

1 5 10 15

<210> 30

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> RumTrunk D9N Tag

<400> 30

Gly Asn Pro Leu Ile Val Met Val Asn Asp Thr Thr Lys Val Lys

1 5 10 15

<210> 31

<211> 22

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> PhoTag

<400> 31

Leu Val Thr Gly Thr Ala His Ile Val Met Val Asp Asn Tyr Lys Pro

1 5 10 15

Ile Val Glu Thr Gly Asp

20

<210> 32

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> EntTag

<400> 32

Asn Thr Ile Val Met Val Asp Lys Leu Lys Glu Val Pro Pro Thr

1 5 10 15

<210> 33

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> Rum2Tag

<400> 33

Gly Thr Pro Ile Val Ile Met Val Asp Glu Ala Lys Pro Ser Leu Pro

1 5 10 15

<210> 34

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> Rum3Tag

<400> 34

Gly Asn Pro Leu Ile Val Met Ile Asp Glu Ala Glu Gln Lys Glu Ile

1 5 10 15

<210> 35

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> Rum4Tag

<400> 35

Ala Gly Gly Ile Ile Val Met Lys Asp Asn Thr Thr Lys Val Ser Ile

1 5 10 15

<210> 36

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> Rum5Tag

<400> 36

Gly Asn Pro Ile Val Thr Met Ile Asp Asp Ala Thr Leu Val Lys Ile

1 5 10 15

<210> 37

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> Rum6Tag

<400> 37

Gly Asn Ser Thr Ile Thr Met Val Asp Asp Thr Thr Lys Val His Ile

1 5 10 15

<210> 38

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> Rum7Tag

<400> 38

Gly Thr Pro Leu Ile Val Met Val Asp Asp Thr Thr Lys Val Glu Ile

1 5 10 15

<210> 39

<211> 20

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> BacTag

<400> 39

Asn Glu Lys Val Thr Gly Gln Phe Glu Ile Val Lys Val Asp Ala Asn

1 5 10 15

Asp Lys Thr Lys

20

<210> 40

<211> 19

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> Bac2Tag

<400> 40

Ser Lys Ser Leu Gly Gln Phe Glu Ile Val Lys Val Asp Ala Gln Asp

1 5 10 15

Lys Thr Lys

<210> 41

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> Bac3Tag

<400> 41

Leu Gly Gln Phe Glu Ile Val Lys Val Asp Ser Gln Asp Lys Thr Lys

1 5 10 15

<210> 42

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> Bac4Tag

<400> 42

Val Thr Gly Gln Phe Glu Ile Val Lys Val Asp Ala Glu Asp Lys Thr

1 5 10 15

Arg

<210> 43

<211> 19

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> Bac5Tag

<400> 43

Glu Lys Val Met Gly Gln Phe Glu Ile Met Lys Val Asp Ala Asn Asp

1 5 10 15

Lys Thr Lys

<210> 44

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> BAC序列 pBELOBAC11正向引物

<400> 44

ttaattaacg tcgaccaatt ctcatg 26

<210> 45

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> BAC序列 pBELOBAC11反向引物

<400> 45

ttaattaagt cgacagcgac acacttg 27

<210> 46

<211> 21

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> IgK前导序列

<400> 46

Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro

1 5 10 15

Gly Ser Thr Gly Asp

20

Claims (24)

1.一种腺病毒载体，所述腺病毒载体编码异源转基因，所述异源转基因编码抗原，并且其中所述载体具有至少一种修饰的衣壳蛋白，所述修饰包括包含共价键合到第二肽伴侣的第一肽伴侣，其中所述第二伴侣附接到抗原，其特征在于由所述转基因编码的抗原具有至少一个T细胞表位，并且附接到所述第二伴侣的抗原具有至少一个B细胞表位。

2.根据权利要求1所述的腺病毒载体，所述腺病毒载体编码异源转基因，所述异源转基因编码抗原，并且其中所述载体具有至少一种修饰的衣壳蛋白，所述修饰包括包含共价键合到第二肽伴侣的第一肽伴侣，其中所述第二伴侣附接到抗原，其特征在于由所述转基因编码的抗原和附接到所述第二伴侣的抗原共有至少一个表位。

3.根据权利要求1或2所述的腺病毒载体，其中由所述转基因编码的抗原和附接到所述第二伴侣的抗原来源于同一病原体。

4.根据权利要求1至3所述的载体，其中由所述转基因编码的抗原的氨基酸序列与附接到所述第二伴侣的抗原的氨基酸序列是40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、97％、99％、100％相同的。

5.根据任一前述权利要求所述的载体，其中由所述转基因编码的抗原或附接到所述第二伴侣的抗原是选自以下组的抗原：病毒、细菌、寄生虫或真菌抗原。

6.根据任一前述权利要求所述的载体，其中附接到所述第二伴侣的抗原是抗原的受体结合结构域。

7.根据权利要求1至3或权利要求5或6中任一项所述的腺病毒载体，其中所述转基因编码HCMV五聚体，并且附接到所述第二伴侣的抗原包含HCMV gB或其片段。

8.根据权利要求1-3或权利要求5或6中任一项所述的腺病毒载体，其中所述转基因编码来自流感病毒的核蛋白，并且附接到所述第二伴侣的抗原是流感血凝素或其片段。

9.根据权利要求8所述的腺病毒载体，其中所述血凝素片段包含受体结合结构域(RBD)。

10.根据权利要求1至6中任一项所述的腺病毒载体，其中所述转基因编码的抗原和附接到所述第二伴侣的抗原是来自SARS-CoV-2的S抗原或其片段。

11.根据权利要求10所述的载体，其中S抗原片段是受体结合结构域。

12.根据权利要求1至11中任一项所述的载体，其中所述修饰的衣壳蛋白是六邻体蛋白。

13.根据权利要求1至11所述的载体，其中所述修饰的衣壳蛋白是六邻体蛋白并在HVR环中修饰。

14.根据权利要求1至11所述的载体，其中所述修饰的衣壳蛋白是pIX蛋白。

15.根据权利要求1至14中任一项所述的载体，其中对所述衣壳蛋白的修饰是所述第一肽伴侣的插入或融合。

16.根据任一前述权利要求所述的载体，其中所述第一肽共价键合到所述第二肽，并且共价键是异肽键。

17.根据任一前述权利要求所述的载体，其中所述第一肽伴侣和所述第二肽伴侣选自第一和第二的对的组：

SpyCatcher和SpyTag；

SnoopCatcher和SnoopTag/SnoopTagJr

DogCatcher和DogTag

SnoopTagJr和SnoopCatcher

使用SnoopLigase的DogTag和SnoopTag/SnoopTagJr

SpyTag和SpyCatcher

前提是当所述修饰的衣壳蛋白是六邻体蛋白时，所述第一伴侣不是SpyCatcher。

18.根据任一前述权利要求所述的载体，其中附接到所述第二肽的抗原的尺寸超过15Kda、20Kda、30Kda、40Kda、60Kda、70Kda、80Kda、90Kda或100Kda。

19.一种疫苗，包含任一前述权利要求所述的腺病毒载体。

20.根据权利要求1至18中任一项所述的载体和根据权利要求19所述的疫苗，用于在医学中使用。

21.权利要求1至18中任一项所述的载体在制备用于治疗或预防疾病的药物中的用途。

22.一种治疗有相应需要的患者的方法，包括施用安全且有效的量的权利要求19所述的疫苗或权利要求1至18中任一项所述的载体。

23.一种产生权利要求1至18所述的载体的方法，包括：

i.将编码第一肽伴侣的核酸引入到编码腺病毒衣壳蛋白的核酸中

ii.将编码抗原的转基因引入到腺病毒基因组中

iii.用腺病毒感染细胞并收集子代

iv.将与抗原附接的第二肽伴侣附接到所述第一肽伴侣，其中由所述转基因编码的抗原具有至少一个T细胞表位，并且附接到所述第二肽伴侣的抗原具有至少一个B细胞表位。

24.一种制备权利要求19所述的疫苗的方法，包括将权利要求1至18中任一项所述的载体与药学上可接受的赋形剂混合。