RS64059B1 - Protein adenoviralnog omotača izveden iz vehikuluma za isporuku - Google Patents

Protein adenoviralnog omotača izveden iz vehikuluma za isporuku

Info

Publication number
RS64059B1
RS64059B1 RS20230209A RSP20230209A RS64059B1 RS 64059 B1 RS64059 B1 RS 64059B1 RS 20230209 A RS20230209 A RS 20230209A RS P20230209 A RSP20230209 A RS P20230209A RS 64059 B1 RS64059 B1 RS 64059B1
Authority
RS
Serbia
Prior art keywords
group
protomer
loop
penton base
rgd
Prior art date
Application number
RS20230209A
Other languages
English (en)
Inventor
Imre Berger
Frédéric Garzoni
Pascal Fender
Original Assignee
The European Molecular Biology Laboratory
Centre Nat Rech Scient
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by The European Molecular Biology Laboratory, Centre Nat Rech Scient filed Critical The European Molecular Biology Laboratory
Publication of RS64059B1 publication Critical patent/RS64059B1/sr

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • A61K48/0008—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy characterised by an aspect of the 'non-active' part of the composition delivered, e.g. wherein such 'non-active' part is not delivered simultaneously with the 'active' part of the composition
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/86—Viral vectors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/10011—Adenoviridae
    • C12N2710/10022—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/10011—Adenoviridae
    • C12N2710/10023—Virus like particles [VLP]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/10011—Adenoviridae
    • C12N2710/10034—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/10011—Adenoviridae
    • C12N2710/10311—Mastadenovirus, e.g. human or simian adenoviruses
    • C12N2710/10322—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/10011—Adenoviridae
    • C12N2710/10311—Mastadenovirus, e.g. human or simian adenoviruses
    • C12N2710/10323—Virus like particles [VLP]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/10011—Adenoviridae
    • C12N2710/10311—Mastadenovirus, e.g. human or simian adenoviruses
    • C12N2710/10334—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
    • C12N2770/00011—Details
    • C12N2770/36011—Togaviridae
    • C12N2770/36111—Alphavirus, e.g. Sindbis virus, VEE, EEE, WEE, Semliki
    • C12N2770/36122—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
    • C12N2770/00011—Details
    • C12N2770/36011—Togaviridae
    • C12N2770/36111—Alphavirus, e.g. Sindbis virus, VEE, EEE, WEE, Semliki
    • C12N2770/36134—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)

Description

Opis
OBLAST TEHNIKE
[0001] Predmetni pronalazak se odnosi na projektovani protomer baze pentona adenovirusa kako je definisano u patentnom zahtevu 1, VLP kako je definisano u patentnom zahtevu 9 koji sadrži projektovani protomer baze pentona adenovirusa prema pronalasku, nukleinsku kiselinu kako je definisano u 5, koja kodira projektovani protomer baze pentona adenovirusa, kao i postupak za proizvodnju projektovanog protomera baze pentona adenovirusa i postupak za proizvodnju VLP kao što je definisano u patentnim zahtevima 10 i 11, respektivno.
STANJE TEHNIKE
[0002] Zarazne bolesti nastavljaju da muče i desetkuju stanovništvo širom sveta. Među sredstvima koja su nam na raspolaganju da se suprotstavimo ovoj pretnji, vakcinacija se pokazala izuzetno moćnom. Velike boginje su iskorenjene, male boginje, dečija paraliza i tetanus su ograničeni u svetu vakcinacijom. Bez obzira na to, ozbiljne pretnje i dalje predstavljaju izazov za zdravlje ljudi, posebno usled pojave virusa koji su se prilagodili i koji su se pojavili kao nove bolesti ili patogeni sojevi sa atributima koji olakšavaju patogenost.
[0003] Skorašnji takvi primeri su ozbiljna pretnja koju predstavljaju Čikungunja i Zika, virusi koje prenose insekti koji se prenose na ljude ujedom komarca. Oba virusa se brzo šire u Aziju i Evropu, uz pomoć svog domaćina komaraca, izazivajući značajnu uzbunu. Čikungunja i Zika bolest potencijalno može izazvati ozbiljne troškove za pogođene zajednice i privrede, a moćna strategija vakcinacije za suzbijanje ove nove pretnje bila bi veoma poželjna. Međutim, do danas u potpunosti nedostaju moćne vakcine.
[0004] U idealnom slučaju, vakcina će biti bezbedna, nereplikativna, efikasna i podesiva. Štaviše, lako se može proizvoditi u industrijskom obimu. Rekombinantne čestice slične virusu (VLP) mogu biti stoga idealne vakcine i stoga značajno obećavaju. U ovom predlogu ćemo stvoriti jednu takvu VLP vakcinu. Koristićemo neverovatno svestranu bio-sličnu multiproteinsku platformu pod nazivom ADDomer (multimer izveden iz dodekaedarskog adenovirusa). ADDomer će služiti za kreiranje kandidata za vakcinu za borbu protiv zaraznih bolesti izazvanih virusima (uključujući, ali ne ograničavajući se na Čikungunja, Zika i druge).
[0005] ADDomer je sintetički skelet izveden iz čestice slične virusu (VLP) koja se u prirodi javlja tokom ciklusa replikacije humanog adenovirusa serotipa 3 (HAd3) koji katalizuje internalizaciju (Fender, P., et al. (2012) / Virol 86, 5380-5385). ADDomer je dizajnirani bio-sličan izveden iz ovog prirodnog VLP-a, koji zadržava sposobnost autonomnog samosastavljanja u dodekaedar. ADDomer je jedinstveno prilagođen za ispoljavanje više epitopa peptida i proteina pomoću potpuno fleksibilnih petlji izloženih rastvaraču. Inženjering ovih petlji ne uništava globalnu arhitekturu ADDomer čestica. Ove petlje nude pogodne opcije za umetanje, korišćenjem postupaka iz sintetičke biologije, više kopija visoko imunogenih peptidnih epitopa, na primer, iz virusnih patogena. ADDomer nije ograničen na razvoj vakcine protiv zaraznih bolesti. Širok spektar primena potencijalno će imati koristi od ADDomer tehnologije, uključujući i terapiju raka. Štaviše, ADDomer ne mora samo da prikaže peptidne epitope. ADDomer, takođe, može da izloži proteine ili proteinske domene, što značajno proširuje obim njegove primene.
SUŠTINA PRONALASKA
[0006] Predmetni pronalazači su identifikovali da su određeni regioni u protomeru baze pentona podložni uvođenju heterologne peptidne sekvence bez ometanja sklapanja protomera baze pentona u pentonske podjedinice, koje se zauzvrat mogu samostalno sastaviti u dodekamere pentona formirajući čestice slične virusu (VLP) takođe nazvane ADDomeri. Dizajn je veoma modularan i omogućava brzu i fleksibilnu funkcionalizaciju proširenih petlji za multipolipeptidni prikaz. Modularnost je još dodatno poboljšana korišćenjem fragmenta fibrilarnog proteina adenovirusa koji se specifično vezuje za protomer baze pentona. VLP-ovi predmetnog pronalaska su bezbedni jer ne sadrže genetski materijal. Protomeri baze pentona mogu da prime i prikažu do 180 stranih polipeptidnih motiva uključujući antigene, neutrališuće polipeptide, onkoepitopne polipeptide, jednolančana antitela i nanotela.
[0007] Shodno tome, u prvom aspektu, predmetni pronalazak se odnosi na projektovani protomer baze pentona adenovirusa kao što je definisano u patentnom zahtevu 1, pri čemu pomenuti protomer baze pentona sadrži prvu RGD-petlju, drugu RGD-petlju, varijabilnu petlju (V petlju), rascep za vezivanje fibrilarnog proteina adenovirusa i/ili N-terminalni domen, i obuhvata jedan ili više neadenovirusnih peptida ubačenih (insertovanih) u prvu, drugu ili i u prvu i u drugu RGD-petlju; i opciono sadrži jedno ili više od sledećeg:
(i) najmanje jedan ciljno specifični domen vezivanja u prvoj, drugoj ili i u prvoj i u drugoj RGD-petlji, i/ili u V petlji; i/ili
(ii) neadenovirusni polipeptid na N- i/ili C-kraju protomera baze pentona; i/ili
(iii) najmanje jedan heterologni ostatak kuplovanja u prvoj, drugoj, ili i u prvoj i u drugoj RGD-petlji, u V petlji i/ili u N-terminalnom domenu protomera baze pentona, pri čemu je N-kraj N-terminalnog domena unutar protomera baze pentona definisan na sledeći način: X1-G-R-N-S-I-R (SEQ ID NO: 44)
a C-kraj N-terminalnog domena unutar protomera baze pentona je definisan na sledeći način:
D-X2-R-S-R-G (SEQ ID NO: 45),
pri čemu
X1je izabran iz grupe koju čine G i E, i
X2je izabran iz grupe koju čine D i E; i/ili
(iv) lek ili polipeptid koji je kovalentno ili nekovalentno vezan sa jednom ili više aminokiselina prve, druge ili i prve i druge RGD-petlje i/ili sa jednom ili više aminokiselina V petlje protomera baze pentona; i/ili
(v) najmanje jedan heterologni ostatak kuplovanja u rascepu za vezivanje fibrilarnog proteina adenovirusa protomera baze pentona
i pri čemu je projektovani polipeptid iz prvog aspekta sposoban da se sklopi u VLP.
[0008] U daljem aspektu, predmetni pronalazak se odnosi na nukleinsku kiselinu koja kodira projektovani protomer baze pentona adenovirusa pronalaska.
[0009] U daljem aspektu, predmetni pronalazak se odnosi na ekspresioni vektor koji sadrži nukleinsku kiselinu pronalaska.
[0010] Takođe je stavljen na uvid javnosti vektor za kloniranje koji kodira: (i) polipeptid koji sadrži protomer baze pentona adenovirusa, pri čemu dati protomer baze pentona sadrži prvu RGD-petlju, drugu RGD-petlju, varijabilnu petlju i/ili mesto vezivanja za fibrilarni protein adenovirusa prilagođen za uvođenje nukleinskih kiselina koje kodiraju neadenovirusne polipeptide u nukleinske kiseline koje kodiraju prvu RGD-petlju, drugu RGD-petlju i/ili varijabilnu petlju; ili (ii) polipeptid koji sadrži protomer baze pentona adenovirusa koji vezuje fragment fibrilarnog proteina prilagođenog za uvođenje nukleinskih kiselina koje kodiraju neadenovirusne polipeptide na C- i/ili N-kraju.
[0011] U daljem aspektu, predmetni pronalazak se odnosi na rekombinantnu ćeliju domaćina koja sadrži ekspresioni vektor prema pronalasku.
[0012] U daljem aspektu, predmetni pronalazak se odnosi na pentamer koji sadrži pet projektovanih protomera baze pentona adenovirusa pronalaska.
[0013] U daljem aspektu, predmetni pronalazak se odnosi na česticu sličnu virusu (VLP) koja sadrži 12 pentamera pronalaska.
[0014] U daljem aspektu, predmetni pronalazak se odnosi na postupak za proizvodnju projektovanog protomera baze pentona adenovirusa pronalaska, koji obuhvata korake:
(a) obezbeđivanje rekombinantne ćelije domaćina prema pronalasku;
(b) ekspresije projektovanog protomera baze pentona adenovirusa pronalaska; i
(c) prečišćavanje projektovanog protomera baze pentona adenovirusa pronalaska.
[0015] Kao što je definisano u patentnom zahtevu 11, predmetni pronalazak, takođe, obezbeđuje postupak za proizvodnju VLP-a prema pronalasku.
[0016] U daljem aspektu, predmetni pronalazak se odnosi na farmaceutsku kompoziciju koja se sastoji od projektovanog protomera baze pentona adenovirusa pronalaska, nukleinske kiseline pronalaska, ekspresionog vektora pronalaska ili VLP pronalaska i farmaceutski prihvatljivog nosača i/ ili odgovarajućeg ekscipijensa(asa).
[0017] U daljem aspektu, predmetni pronalazak se odnosi na projektovani protomer baze pentona adenovirusa pronalaska, nukleinsku kiselinu pronalaska, ekspresioni vektor pronalaska ili VLP pronalaska za upotrebu u lečenju i/ili prevenciji zarazne bolesti, imunološke bolesti ili raka.
SLIKE
[0018]
Slika 1: Prikazuje sintetičke samosastavljive multimerne skelete (strukture) pronalaska koje se, takođe, nazivaju VLP. 5 protomera formira jednu pentonsku podjedinicu i 12 pentona se spontano samosastavljaju u veliku superstrukturu koja se alternativno naziva VLP ili ADDomer.
Slika 2: Prikazuje pogled sa strane na penton. Pentonski protomer sadrži dve visoko heteromorfne RGD-petlje i jednu varijabilnu petlju (V petlja) neusaglašene, široko varirane dužine i sekvence. U tom pogledu, predmetni pronalazači su utvrdili da su oni slični CDR-ovima antitela i da su pogodni za uvođenje mesta vezivanja koja omogućavaju da se dobijeni VLP veže za bilo koju željenu metu. Pogodan je za prikaz više epitopa i može prikazati do 180 epitopa po VLP-u.
Slika 3: Protomer baze pentona se sastoji od regiona – lepljive zakrpe - koji je u interakciji sa fibrilarnim proteinom adenovirusa. Ova lepljiva zakrpa može da se veže sa subnanomolarnim afinitetom za fragmente adenovirusnog vlakna - takođe se naziva „STICKER”. Poželjno je da se ovi fragmenti vlakana multimerizuju da bi se povećao afinitet vezivanja. Oznaka STICKERn (n je poželjno 2 do 4) može da bude fuzionisana za C- i/ili N-kraj proteina koji treba da bude vezan za VLP ili može da bude kovalentno ili nekovalentno spojena sa bilo kojim drugim teretom. Oznaka STICKERn, stoga, obezbeđuje mogućnost prikazivanja na površini VLP peptida, proteina, nukleinskih kiselina, lipozoma i bilo kog drugog tereta koji će VLP isporučiti. ADDomer ima 12 mesta za vezivanje za teret označen STICKER-om. U jednoj realizaciji, lepljiva zakrpa na protomeru baze pentona je modifikovan tako da sadrži ostatak kuplovanja, poželjno Cys i oznaku STICKERn je, takođe, modifikovan da sadrži Cys na način da pod uslovima bez redukcije Cys u lepljivoj zakrpi i oznaka STICKERn može da formira kovalentnu vezu, koja će biti prekinuta pod redukcionim uslovima.
Slika 4: Dijagramski prikazuje proces proizvodnje ADDomera. ADDomeri se proizvode sa visokim prinosom, jednostavni su za prečišćavanje i izuzetno su stabilni. Vektor pACEBac-ADDOMER ima tri regiona koji kodiraju prvu i drugu RGD petlju, kao i V petlju koja se lako može zameniti bilo kojim željenim peptidnim lancem, npr. peptidom koji daje specifične aktivnosti vezivanja i/ili antigenski epitop.
Slika 5: Protomer baze pentona obuhvata region koji je u interakciji sa susednim protomerom kada se sklapa u dodekaedar, poznat kao „zamena lanaca”. Mutacija relevantnih ostataka aminokiselina u cisteine može dovesti do stabilizacije VLP superstrukture formiranjem kovalentne disulfidne veze, čineći ADDomer termostabilnim. Prikazana je shema koja predstavlja ostatke zamene lanaca mutiranih u cistein.
Slika 6: Navedene sekvence su visoko očuvane u celoj vrsti. Poravnanje pokazuje sekvence baze pentona divljeg tipa iz različitih prirodnih serotipova. Prikazane sekvence su: Podgrupa C Ad2, pristupni broj P03276; podgrupa B Ad3, S41389; podgrupa B Ad7, AAR89958; podgrupa B Adl l, AAP49205; podgrupa F Ad41, AAF14179; podgrupa A Adl2, P36716; podgrupa D Adl7, NP_049379; podgrupa E Ad25, NP_478405; i podgrupa D Ad37, CAC82544 su poravnate. V petlja je istaknuta tamno sivim okvirom; RGD-petlje su istaknute svetlosivim okvirom. Oni ostaci aminokiselina protomera baze pentona koji se vezuju za vlakna označeni su srednje sivom bojom. Svi su konzervirani među serotipovima.
Slike 7 i 8: Prikazana je struktura dva poželjna vektora za kloniranje predmetnog pronalaska. Sekvence nukleinskih kiselina vektora za kloniranje su respektivno obezbeđene u SEQ ID NO: 61 i 62.
Slika 9: Plug&Play ekspresiona kaseta i plazmid za prenos bakulo virusa. Gen koji kodira ADDomer je dizajniran da ubaci „epitope od interesa” na tri različita lokusa (tamno siva) okružena jedinstvenim mestima restrikcije. Ova kaseta je ubačena u BamHI/Hindlll plazmida pACEBac. Umetanje BioBrick-a pomoću ili ECoRI/RsrII, BssHII/Sall ili Sacl Xbal epitopa od interesa može se lako izvršiti u konstruktu pACEBac-ADDomer2.0. Slika 10: ADDomer2.0 termostabilnost. Prečišćeni ADDomer je čuvan na različitim temperaturama nakon čega je izvršena elektronska mikroskopija. Čuvanje na sobnoj temperaturi ili 37°C rezultiralo je potpunim očuvanjem čestica. Disocijacija u gradivnim blokovima (pentamer) je primećena samo za temperaturu iznad 45°C. Test termičkog pomeranja (TSA) potvrdio je stabilnost do 37°C, početak manje disocijacije iznad 45°C i potpunu denaturaciju samo inkubacijom na 60°C.
Slika 11: Umetanje Čikungunja epitopa i način prikaza epitopa, (a) Sekvenca aminokiselina ugrađena u petlju za prikaz ADDomer2.0 prikazana je na vrhu (SEQ ID NO: 78). Glavni epitop za neutralizaciju Čikungunja (istaknut tamno sivom) je ubačen. N-kraj peptida je sadržao dodatno kodiranje aminokiselinama za mesto cepanja TEV (označeno svetlo sivom), (b) Mogućnosti prikaza epitopa su objašnjene shematski. Ekspresija rezultira u ADDomer-TevCHIK, gde su oba kraja peptida povezana sa ADDomer skeletom (‘ograničeni epitopi’ – eng. constrained). Inkubacija sa TEV proteazom je oslobodila N-kraj peptida u konfiguraciji „sličnoj prirodoj” (’opušteni epitopi’ – eng. relaxed), dok je u potpunosti održavao integritet (sada višestruko isečene) ADDomer VLP. (c) Cepanje je praćeno tokom vremena pomoću SDS-PAGE analize koja pokazuje da se intaktni ADDomer (oko 60 kDa) efikasno cepa u dva pojasa oko 43 i 17 kDa kao što se očekivalo (levo). Uprkos cepanju, elektronska mikroskopija je potvrdila da skelet ADDomer-a nije uništen (desno).
Slika 12: ELISA za prepoznavanje CHIK epitopa mišjim serumom. Trima grupama od osam miševa su injektirane na nedelju 2 i ned.4 po 10 mg ili samo ADDomer skeleta (bez antigenskog epitopa u petljama koje predstavljaju epitop), ADDomer-TevCHIKexp (izložen CHIK antigenski epitopu „sličnom prirodom” u petljama koje predstavljaju epitop, slobodni N-terminalni kraj kao kod živog Čikungunja glikoproteina, C-terminalni kraj kovalentno vezan za skelet) ili ADDomer-TevCHIKconstr („ograničeni” CHIK antigenski epitop u petlji koja predstavlja epitop, N- i C-terminalni krajevi pričvršćeni za ADDomer skelet svaki. Serumi su sakupljeni svake dve nedelje i testirani na prepoznavanje CHIK antigenskog epitopa (razblaživanje 1/100). ADDomer-TevCHIKexp sa izloženim epitopom sličnim prirodnom efikasno izaziva odgovor.
Slika 13: ADDomer sa masivno proširenom petljom koja predstavlja epitop. Linearni epitop koji obuhvata 200 aminokiselina je ubačen u petlje koje predstavljaju epitop ADDomer skeleta i upoređen samo sa ADDomer skeletom (bez umetanja). SDS-PAGE gel dokazuje umetanje što se ogleda u pomeranju na veću molekulsku težinu (levo). Analiza masene spektroskopije potvrdila je molekularne težine (63,573 Da za ADDomer skelet bez umetanja; 81,179 Da za „prošireni” ADDomer koji sadrži dodatnih 200 aminokiselina umetanja u petlje koje predstavljaju epitop.
Slika 14: Kovalentno kuplovanje „STICKER” peptida na ADDomer koji sadrži ciljane mutacije cisteina. ADDomer divljeg tipa (wt) i ADDomer sa jednom mutacijom cisteina (K363C, Q476C ili A477C, respektivno) su inkubirani sa STICKER peptidima (C20 (SEQ ID NO: 77) i C9 (SEQ ID NO: 75), respektivno). SDS-PAGE analiza je izvedena u redukcionim (+bMeSH) i neredukcionim (-bMeSH) uslovima i prebačena na PVDF membranu. ADDomer (tamno sivi) i STICKER peptid (svetlo sivi) su vizuelizovani vezivanjem obeleženog antitela i vezivanjem avidina, respektivno, što je dokaz vezivanja STICKER-a za cistein-mutantni ADDomer formiranjem specifične disulfidne veze (označeno belim krugom u donjem panelu)
DETALJNI OPIS PRONALASKA
[0019] Pre nego što predmetni pronalazak bude detaljno opisan u nastavku, trebalo bi da se razume da predmetni pronalazak nije ograničen na određenu metodologiju, protokole i reagense koji su ovde opisani jer oni mogu da variraju. Takođe podrazumeva se da je terminologija korišćena ovde samo u svrhu opisa određenih realizacija. Osim ako nije drugačije definisano, svi tehnički i naučni izrazi korišćeni ovde imaju ista značenja koja su obično poznata stručnjacima iz ove oblasti.
[0020] U nastavku će biti opisani elementi predmetnog pronalaska. Ovi elementi su navedeni sa specifičnim realizacijama, međutim, treba razumeti da se mogu kombinovati na bilo koji način i u bilo kom broju da bi se stvorile dodatne realizacije. Različito opisani primeri i poželjne realizacije ne bi trebalo da se tumače tako da ograničavaju predmetni pronalazak samo na eksplicitno opisane realizacije. Ovaj opis treba razumeti tako da podržava i obuhvata realizacije koje kombinuju eksplicitno opisane realizacije sa bilo kojim brojem stavljenih na uvid i/ili poželjnih elemenata. Štaviše, sve permutacije i kombinacije svih opisanih elemenata u ovoj prijavi treba smatrati stavljenim na uvid javnosti u opisu ove prijave osim ako kontekst ne ukazuje drugačije.
[0021] Nekoliko dokumenata se citira u celom tekstu ove specifikacije.
DEFINICIJE
[0022] Za primenu predmetnog pronalaska, osim ako nije drugačije naznačeno, koriste se konvencionalni postupci hemije, biohemije i tehnike rekombinantne DNK koje su objašnjene u literaturi u ovoj oblasti (up., npr. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Edition, J. Sambrook et al. eds., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor 1989).
[0023] U celoj ovoj specifikaciji i zahtevima koji slede, osim ako kontekst ne zahteva drugačije, reč „sadržati” i varijacije kao što su „sadrži” i „koji sadrži”, podrazumevaće uključivanje navedenog celog broja ili koraka ili grupe celih brojeva ili koraka, ali ne isključivanje bilo kog drugog celog broja ili koraka ili grupe celih brojeva ili koraka. Kao što se koristi u ovoj specifikaciji i priloženim zahtevima, oblici jednine „a”, „an” i „the” (u eng. verziji) uključuju reference za množinu, osim ako sadržaj jasno ne nalaže drugačije.
[0024] Izrazi „polinukleotid” i „nukleinska kiselina” se ovde koriste naizmenično i podrazumevaju se kao polimerni ili oligomerni makromolekul napravljen od nukleotidnih monomera. Nukleotidni monomeri su sastavljeni od nukleobaze, šećera sa pet ugljenika (kao što su, ali ne ograničavajući se na ribozu ili 2’-deoksiriboza), i jedne do tri fosfatne grupe. Obično, polinukleotid se formira preko fosfodiestarskih veza između pojedinačnih nukleotidnih monomera. U kontekstu predmetnog pronalaska, molekuli nukleinske kiseline obuhvataju, ali nisu ograničeni na ribonukleinsku kiselinu (RNK), deoksiribonukleinsku kiselinu (DNK), i njihove smeše kao što su npr. RNK-DNK hibridi. Nukleinske kiseline, mogu npr. da budu hemijski sintetizovane, npr. u skladu sa postupkom fosfotriestara (videti, npr. Uhlmann, E. & Peyman, A. (1990) Chemical Reviews, 90, 543-584„). „Aptameri” su nukleinske kiseline koje se vezuju sa visokim afinitetom za polipeptid. Aptameri se mogu izolovati postupcima selekcije kao što je SELEmirl46-a (videti, npr. Jayasena (1999) Clin. Chem., 45, 1628-50; Klug and Famulok (1994) M. Mol. Biol. Rep., 20, 97-107; US 5,582,981) iz velikog skupa različitih jednolančanih RNK molekula. Aptameri se, takođe, mogu sintetizovati i izabrati u svom obliku kao u ogledalu, na primer kao L-ribonukleotid (Nolte et al. (1996) Nat. BiotechnoL, 14, 1116-9; Klussmann et al. (1996) Nat. Biotechnol., 14, 1112-5). Oblici koji su izolovani na ovaj način uživaju prednost u tome što se ne razgrađuju ribonukleazama koje se javljaju u prirodi i stoga poseduju veću stabilnost.
[0025] Izrazi „protein” i „polipeptid” se ovde koriste naizmenično i odnose se na bilo koji lanac aminokiselina vezan peptidnom vezom, bez obzira na dužinu ili posttranslacionu modifikaciju. Proteini koji se mogu koristiti u predmetnom pronalasku (uključujući proteinske derivate, varijante proteina, proteinske fragmente, proteinske segmente, proteinske epitope i proteinske domene) mogu se dalje modifikovati hemijskom modifikacijom. To znači da takav hemijski modifikovan polipeptid sadrži druge hemijske grupe od 20 prirodnih aminokiselina. Primeri takvih drugih hemijskih grupa uključuju bez ograničenja glikozilovane aminokiseline i fosforilovane aminokiseline. Hemijske modifikacije polipeptida mogu da obezbede povoljna svojstva u poređenju sa roditeljskim polipeptidom, npr. jedan ili više od poboljšane stabilnosti, produženog biološkog poluživota ili povećane rastvorljivosti u vodi.
[0026] Izraz „protein baze pentona” ili „protomer baze pentona” kako se koristi u kontekstu predmetnog pronalaska odnosi se na adenovirusni protein koji se sastavlja u takozvani „pentonski protein”. Svaki pentonski protein sadrži pet proteina baze pentona. Pentonski protein je jedan od tri proteina koji formiraju omotač adenovirusa. Ostali proteini su heksonski i fibrilarni. Struktura sastavljenog adenovirusa je prikazana na Slici 1 u gornjem levom uglu. Proteini baze pentona koji se koriste u predmetnom pronalasku potiču od adenovirusa specifičnog za bilo koju vrstu sisara. Poželjno je da je adenovirus humani ili ne-humani adenovirus majmuna, poželjno šimpanze (Pan), gorile (Gorilla) i orangutana (Pongo), poželjnije bonobo (Pan paniscus) i obične šimpanze (Pan troglodytes). Stručnjak razume da proteini baze pentona različitih adenovirusa varirati u svojoj aminokiselinskoj sekvenci, i da su sve takve varijante koje se javljaju u prirodi obuhvaćene izrazom „protein baze pentona”. Dodatno, izraz obuhvata veštačke varijante koje obuhvataju inserciju, delecije i/ili mutacije prirodno prisutne sekvence proteina baze pentona. Ove mutacije su dodatak modifikacijama N-terminalnog domena, V petlje, prve RGD, druge RGD petlje i/ili regiona lepljive zakrpe koji su detaljnije opisani u nastavku. Obuhvaćene su bilo koje takve veštačke varijante, sve dok se veštački modifikovani protein baze pentona sklapa u pentonske podjedinice i 12 od njih se sklapa u VLP. Poželjnije, veštačke varijante imaju najmanje 75%, poželjnije najmanje 80%, poželjnije najmanje 85%, poželjnije najmanje 90%, poželjnije najmanje 92%, poželjnije 94%, poželjnije 96%, i poželjnije 98% identitet sekvence sa protomerom baze pentona koji se prirodno pojavljuje izvan N-terminalnog domena, V petlje, prve RGD i druge RGD petlje kao što je definisano u nastavku. Poželjni proteini baze pentona su oni naznačeni u SEQ ID NO: 1 do 14. Proteini baze pentona kao što je gore definisano su osnova za projektovane proteine baze pentona predmetnog pronalaska. Dakle, projektovani proteini baze pentona se razlikuju po sekvenci od prirodnih penton baznih proteina po insercijama, delecijama i mutacijama aminokiselina, kao što je detaljnije navedeno u nastavku.
[0027] Fraza da je „projektovani polipeptid sposoban da se sklopi u VLP” ili „sastavlja u VLP” kako se naizmenično koristi u kontekstu predmetnog pronalaska odnosi se na sposobnost pet protomera baze pentona da se samosastavljaju u pentonski protein i da se kasnije dvanaest pentonskih proteina sami sastave u malu česticu sfernog oblika, tj. česticu nalik virusu (VLP). Sposobnost sastavljanja i održavanja pentonskih proteina ili poželjno strukture VLP može se utvrditi postupcima poznatim u tehnici i ovde opisanim, posebno elektronskom mikroskopijom (EM). Poželjni uslovi pri kojima se procenjuje sposobnost sklapanja u VLP je 20°C i fiziološkim puferskim uslovima. U daljoj poželjnoj realizaciji, izraz obuhvata projektovane polipeptide koji ne samo da se sklapaju u VLP, već zadržavaju sferni oblik na temperaturama iznad 20°C, poželjno na temperaturama iznad 30°C, poželjno na temperaturama iznad 40°C, poželjnije iznad 45°C a još poželjnije iznad 50°C. Integritet sfernog oblika može se proceniti pomoću EM, poželjno u fiziološkim puferskim uslovima.
[0028] Izraz „prva RGD-petlja” kako se koristi u kontekstu predmetnog pronalaska odnosi se na polipeptidnu sekvencu od između 10 do 40 aminokiselina koja se nalazi na N-terminalnom delu na „RGD motivu koji se nalazi u protomeru pentona (videti Sliku 6). Ova polipeptidna sekvenca je veoma divergentna između različitih adenovirusa. Shodno tome, ne može se definisati homologijom, već je definisana prema pronalasku sekvencom koja se nalazi na N-terminalnom delu njenog N-terminalnog kraja kako je opisano u patentnom zahtevu 1. Kako je definisano u patentnom zahtevu 1, njen C-terminalni kraj unutar protomera pentona je određen RGD motivom.
[0029] Izraz „druga RGD-petlja” kako se koristi u kontekstu predmetnog pronalaska odnosi se na polipeptidnu sekvencu od između 10 do 35 aminokiselina koja se nalazi na C-terminalnom delu na „RGD motivu koji se nalazi u protomeru pentona (videti sliku 6). Ova polipeptidna sekvenca je veoma divergentna između različitih adenovirusa. Shodno tome, ne može se definisati homologijom sekvence. Kao što je definisano u patentnom zahtevu 1, njen N-terminalni kraj unutar protomera pentona je određen RGD motivom. Kao što je naznačeno u patentnom zahtevu 1, njen C-terminalni kraj unutar protomera je definisan sekvencom koja se nalazi na C-terminalnom kraju njenog C-terminalnog kraja, koja je sačuvana među različitim adenovirusima.
[0030] Izraz „RGD motiv” kako se koristi u kontekstu predmetnog pronalaska odnosi se na polipeptid dug tri aminokiseline koji se sastoji od arginina, glicina i asparaginske kiseline. Ovaj motiv je prvobitno identifikovan u fibronektinu kao posrednik u vezivanju za integrina. RGD-motiv je, takođe, prisutan u mnogim drugim receptorima i posreduje i u interakcijama ćelijasupstrat i ćelija-ćelija. RGD-motiv u protomerima pentona projektovanih polipeptida predmetnog pronalaska može da bude netaknut ili može da bude mutiran na način na koji se protomer pentona više ne vezuje za integrine.
[0031] Izraz „promenljiva petlja” kako se koristi u kontekstu predmetnog pronalaska odgovara sekvenci koja se nalazi između beta lista b3 i beta lista b4 baze pentona adenovirusa. I dužina i sastav aminokiselina ove petlje su veoma varijabilni među serotipovima. Sekvence koje odgovaraju varijabilnim petljama su označene zelenom bojom na Slici 6. Izraz „N-terminalni domen” kako se koristi u kontekstu predmetnog pronalaska odnosi se na visoko konzervirani region u N-kraju protomera baze pentona. Ovaj deo proteina obuhvata al i a2 spirale, B1 i B2 listove kao i B i C domen (videti Sliku 6). Uključen je u interakciju između protomera baze pentona i, stoga, pogodan za uvođenje delova, npr. ostataka kuplovanja koji stabilizuju interakciju između protomera baze pentona.
[0032] Izraz „rascep za vezivanje fibrilarnog proteina adenovirusa” kako se koristi u kontekstu predmetnog pronalaska odnosi se na nabor protomera baze pentona koji formira površinu interakcije sa fibrilarnim proteinom adenovirusa. Kao što se može videti na Slici 6, rascep vezivanja je formiran od nekoliko nesusednih delova polipeptidne sekvence koji su konzervirani među različitim adenovirusima.
[0033] Izraz „ciljno specifični domen vezivanja ” kako se koristi u celoj specifikaciji odnosi se na polipeptid koji olakšava specifično vezivanje za cilj/metu. Vezivanje takvog ciljno specifičnog domena vezivanja se smatra specifičnim za datu metu, ako se vezuje sa najvećim afinitetom za odgovarajuću metu i samo sa nižim afinitetom, npr. najmanje 10 puta manji, poželjno najmanje 100 puta manjim afinitetom prema drugim metama čak i prema metama sa srodnom sekvencom aminokiselina.
[0034] Izraz „cilj (meta)” kako se koristi u predmetnom pronalasku odnosi se na ćelijsku ili molekularnu strukturu koja postoji u prirodi, a prema kojoj molekuli imaju određeni afinitet vezivanja ili za koju se molekuli specifično vezuju. Cilj može da sadrži jedan ili više epitopa. Antigen je poželjan primer mete/cilja.
[0035] Izraz „antigen” kako se koristi u kontekstu predmetnog pronalaska se odnosi na bilo koju strukturu koju prepoznaju molekuli imunog odgovora, npr. antitela, receptore T ćelija (TCR) i slično. Antigen može da bude stran ili toksičan za telo ili može da bude ćelijski protein koji je povezan sa određenom bolešću. Antigene prepoznaju veoma varijabilni antigenski receptori (B-ćelijski receptor ili T-ćelijski receptor) adaptivnog imunog sistema i mogu izazvati humoralni ili ćelijski imuni odgovor. Antigeni koji izazivaju takav odgovor se, takođe, nazivaju imunogenima. Deo proteina unutar ćelija, bez obzira da li su strani ili ćelijski, obrađuje se u manje peptide i predstavlja glavnim kompleksom histokompatibilnosti (MHC). Ćelijski imuni odgovor se izaziva ako je mali peptidni fragment vezan za T-ćelijski receptor. Antigeni ćelijske površine mogu da budu izabrani iz grupe receptora citokina, integrina, molekula ćelijske adhezije, antigena ćelijske površine specifičnog za tip ćelije, antigena ćelijske površine specifičnog za tkivo, antigena povezanog sa tumorom koji je eksprimovan na površini ćelije, klastera antigena diferencijacije ili ugljenih hidrata. Izraz „specifično vezivanje” kako se koristi u kontekstu predmetnog pronalaska da označi da se vezujući deo (npr. antitelo) jače vezuje za metu/cilj, kao što je epitop, za koji je specifičan u poređenju sa vezivanjem za drugu metu ako se vezuje za prvu metu sa konstantom disocijacije (Kd) koja je niža od konstante disocijacije za drugu metu. Ciljevi se mogu prepoznati po njihovim ligandima koji se vezuju sa određenim afinitetom za svoje mete/ciljeve i tako vezivanje liganda za odgovarajuću metu rezultira biološkim efektom. Poželjno, vezivanje je i specifično i javlja se sa visokim afinitetom, poželjno sa Kd manjim od 10”7, 10”8, 10”9, 10”10 M ili manjim. Takav afinitet se poželjno meri na 37°C. Pogodni testovi uključuju merenja rezonancije površinskog plazmona (npr. Biacore), merenja mikrobalansa kristala kvarca (npr. Attana) i testove konkurencije.
[0036] Izraz „antitela” kako se koristi u kontekstu predmetnog pronalaska su glikoproteini koji pripadaju superfamiliji imunoglobulina; izrazi antitelo i imunoglobulin se često koriste naizmenično. Antitelo se odnosi na proteinski molekul koji proizvode plazma ćelije i koga koristi imuni sistem da identifikuje i neutrališe strane objekte kao što su bakterije i virusi. Antitelo prepoznaje jedinstveni deo stranog cilja (mete), njegov antigen.
[0037] Izraz „fragment antitela” kako se ovde koristi, odnosi se na jedan ili više fragmenata antitela koji zadržavaju sposobnost specifičnog vezivanja za antigen. Primeri vezujućih fragmenata obuhvaćenih izrazom „fragment antitela” uključuju fragment vezujući antigen (Fab), Fab’ fragment, F(ab’)2 fragment, antitelo teškog lanca, jednodomensko antitelo (sdAb), varijablu fragmenta jednog lanca (scFv), varijablu fragmenta (Fv), VH domen, VL domen, jednodomensko antitelo, nanotelo, IgNAR (receptor novog antigena imunoglobulina), di-scFv, bispecifični aktivatori T-ćelija (BITEs), molekul sa dvostrukim afinitetom za ponovno ciljanje (DART), trostruko telo, dijatelo, jednolančano dijatelo, alternativni protein skeleta i njihov fuzioni protein.
[0038] Izraz „dijatelo” kako se koristi u ovoj specifikaciji odnosi se na fuzioni protein ili dvovalentno antitelo koje može da veže različite antigene. Dijatelo se sastoji od dva pojedinačna proteinska lanca koji sadrže fragmente antitela, odnosno varijabilne fragmente. Dijatela obuhvataju varijabilni domen teškog lanca (VH) povezan sa varijabilnim domenom lakog lanca (VL) na istom polipeptidnom lancu (VH-VL, ili VL-VH). Korišćenjem kratkog peptida koji povezuje dva varijabilna domena, domeni su primorani da se upare sa komplementarnim domenom drugog lanca i tako stvaraju dva mesta za vezivanje antigena. Dijatela mogu da ciljaju iste (monospecifične) ili različite antigene (bispecifične).
[0039] Izraz „jednodomensko antitelo” kako se koristi u kontekstu predmetnog pronalaska odnosi se na fragmente antitela koji se sastoje od jednog, monomernog varijabilnog domena antitela. Jednostavno, oni sadrže samo monomerne varijabilne regione teškog lanca antitela teškog lanca koje proizvode kamile ili hrskavične ribe. Zbog njihovog različitog porekla oni se, takođe, nazivaju VHH ili VNAR (varijabilni novi antigeski receptorski)-fragmenti. Alternativno, jednodomenska antitela se mogu dobiti monomerizacijom varijabilnih domena konvencionalnih mišjih ili humanih antitela primenom genetskog inženjeringa. Oni pokazuju molekulsku masu od približno 12-15 kDa i stoga su najmanji fragmenti antitela sposobni za prepoznavanje antigena. Dalji primeri uključuju nanotela ili nanoantitela.
[0040] Izraz „mimetik antitela” kako se koristi u kontekstu ove specifikacije odnosi se na jedinjenja koja mogu specifično da vežu antigene, slično antitelu, ali nisu strukturno srodna sa antitelima. Obično, mimetici antitela su veštački peptidi ili proteini sa molarnom masom od oko 3 do 20 kDa koji sadrže jedan, dva ili više izloženih domena koji se specifično vezuju za antigen. Primeri uključuju, između ostalog, LACI-D1 (inhibitor koagulacije povezan sa lipoproteinom); afilini, npr. human-y B kristalni ili humani ubikvitin; cistatin; Sac7D iz Sulfolobus acidocaldarius; lipokalin i antikaline izvedene iz lipokalina; DARPins (dizajnirani domeni ponavljanja ankirina); SH3 domen Fyn; Kunits domen inhibitora proteaze; monotela, npr.10. tip III domena fibronektina; adnektini: ICK (miniproteini cisteinskog čvora); atrimeri; evitela, npr. veziva na bazi CTLA4, afitela, npr. snop sa tri spirale iz Z-domena proteina A iz Staphilococcus aureus; Trans-tela, npr. humani transferin; tetranektini, npr. monomerni ili trimerni humani lektinski domen C-tipa; mikrotela, npr. tripsin-inhibitor-II; afilini; armadilo ponavljajući proteini. Nukleinske kiseline i mali molekuli se ponekad smatraju i mimeticima antitela (aptamerima), ali ne i veštačka antitela, fragmenti antitela i fuzioni proteini sastavljeni od njih. Zajedničke prednosti u odnosu na antitela su bolja rastvorljivost, penetracija u tkivo, stabilnost prema toploti i enzimima i relativno niski troškovi proizvodnje.
[0041] Kako se ovde koristi, izraz „Kd” (obično meren u „mol/L”, ponekad skraćeno kao „M”) se odnosi na konstantu ravnoteže disocijacije određene interakcije između vezujućeg dela (npr. antitela ili njegovog fragmenta) i ciljnog molekula (npr. antigena ili njegovog epitopa). Postupci za određivanje Kd uključuju, bez ograničenja, ELISA i testove površinske rezonancije plazmona.
[0042] Izraz „epitop”, takođe, poznat kao antigenska determinanta, kako se koristi u kontekstu predmetnog pronalaska je deo makromolekula koga prepoznaje imuni sistem, posebno antitela, B ćelije ili T ćelije. Kako se ovde koristi, „epitop” je deo makromolekula koji je sposoban da se veže za antitelo (npr. antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen) kao što je ovde opisano. Epitopi se obično sastoje od hemijski aktivnih površinskih grupa molekula kao što su aminokiseline ili bočni lanci šećera i obično imaju specifične trodimenzionalne strukturne karakteristike, kao i specifične karakteristike naelektrisanja. Konformacioni i nekonformacioni epitopi se mogu razlikovati po tome što se vezivanje za prve, ali ne i za druge, gubi u prisustvu denaturišućih rastvarača.
[0043] Kako se ovde koristi, „konformacioni epitop” se odnosi na epitop linearnog makromolekula (npr. polipeptida) koji je formiran trodimenzionalnom strukturom datog makromolekula. U kontekstu predmetne prijave, „konformacioni epitop” je „diskontinuirani epitop”, tj. konformacioni epitop na makromolekulu (npr. polipeptidu) koji je formiran iz najmanje dva odvojena regiona u primarnoj sekvenci makromolekula (npr. sekvenca aminokiseline polipeptida). Drugim rečima, epitop se smatra „konformacionim epitopom” u kontekstu predmetnog pronalaska, ako se epitop sastoji od najmanje dva odvojena regiona u primarnoj sekvenci za koje se antitelo prema pronalasku (ili antigen koji se vezuje za njegov fragment) vezuje istovremeno, pri čemu su ova najmanje dva odvojena regiona prekinuta jednim ili više regiona u primarnoj sekvenci za koju se antitelo pronalaska (ili njegov fragment koji vezuje antigen) ne vezuje. Poželjno, takav „konformacioni epitop” je prisutan na polipeptidu, a dva odvojena regiona u primarnoj sekvenci su dve odvojene sekvence aminokiseline za koje se vezuje antitelo pronalaska (ili njegov fragment koji vezuje antigen), pri čemu su ove najmanje dve odvojene sekvence aminokiseline prekinute sa još jednom sekvencom aminokiseline u primarnoj sekvenci za koju se antitelo pronalaska (ili njegov fragment koji vezuje antigen) ne vezuje. Poželjno, prekidajuća sekvenca aminokiseline je neprekidna sekvenca aminokiseline koja sadrži dve ili više aminokiselina za koje se antitelo (ili njegov fragment koji vezuje antigen) ne vezuje. Najmanje dve odvojene sekvence aminokiseline za koje se vezuje antitelo pronalaska (ili njegov fragment koji vezuje antigen) nisu posebno ograničene u pogledu njihove dužine. Takva odvojena sekvenca aminokiseline može da se sastoji od samo jedne aminokiseline sve dok je ukupan broj aminokiselina unutar date najmanje dve odvojene sekvence aminokiseline dovoljno velik da utiče na specifično vezivanje između antitela (ili njegovog fragmenta koji vezuje antigen) i konformacioni epitop.
[0044] Izraz „fibrilarni protein adenovirusa” kako se koristi u kontekstu predmetnog pronalaska odnosi se na adenovirusni protein koji se nekovalentno vezuje za protomer pentona i pomaže u vezivanju adenovirusa za ćeliju domaćina.
[0045] Izraz „identitet sekvence” se koristi u celoj specifikaciji u pogledu poređenja sekvenci polipeptida i polinukleotida. U slučaju kada se dve sekvence upoređuju i referentna sekvenca nije specificirana u poređenju sa kojom će se izračunavati procenat identiteta sekvence, identitet sekvence treba izračunati u odnosu na dužu od dve sekvence koja će se porediti, ako nije posebno naznačeno drugačije. Ako je referentna sekvenca naznačena, identitet sekvence se određuje na osnovu pune dužine referentne sekvence naznačene SEQ ID-om, ako nije drugačije naznačeno. Na primer, polipeptidna sekvenca koja se sastoji od 200 aminokiselina u poređenju sa referentnom polipeptidnom sekvencom dugačkom 300 aminokiselina može pokazati maksimalni procenat identiteta sekvence od 66,6% (200/300), dok sekvenca dužine 150 aminokiselina može da pokaže maksimalni procenat identiteta sekvence od 50%> (150/300). Ako se 15 od tih 150 aminokiselina razlikuje od odgovarajućih aminokiselina u referentnoj sekvenci dugačkoj 300 aminokiselina, nivo identiteta sekvence se smanjuje na 45%. Sličnost nukleotidnih i aminokiselinskih sekvenci, tj. procenat identiteta sekvence, može se odrediti pomoću poravnanja sekvenci. Takva poravnanja se mogu izvesti sa nekoliko algoritama poznatih u tehnici, poželjno sa matematičkim algoritmom Karlina i Alčula (Karlin & Altschul (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 5873-5877), sa hmmalign (HMMER paket, http://hmmer.wustl.edu/) ili sa CLUSTAL algoritmom (Thompson, J. D., Higgins, D. G. & Gibson, T. J. (1994) Nucleic Acids Res. 22, 4673-80) dostupno npr. na http://www.ebi.ac.uk/Tools/clustalw/ ili na http://npsa-pbil.ibcp.fr/cgibin/ npsa_automat.pl?page=/NPSA/npsa_clustalw.html. Poželjni parametri koji se koriste su podrazumevani parametri pošto su postavljeni na http://www.ebi.ac.uk/Tools/clustalw/ ili http://www.ebi.ac.uk/Tools/clustalw2/index.html. Stepen identiteta sekvence (podudaranje sekvence) može se izračunati korišćenjem npr. BLAST, BLAT ili BlastZ (ili BlastX). Sličan algoritam je ugrađen u BLASTN i BLASTP programe Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215: 403-410. BLAST pretrage polinukleotida se izvode sa BLASTN programom, rezultat = 100, dužina reči = 12. BLAST pretrage proteina se izvode sa BLASTP programom, rezultat = 50, dužina reči = 3. Da bi se dobila poravnanja praznina za uporedne svrhe, koristi se Gapped BLAST kako je opisano u Altschul et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25: 3389-3402. Kada se koriste BLAST i Gapped BLAST programi, koriste se podrazumevani parametri odgovarajućih programa. Analiza podudaranja sekvenci može da bude dopunjena uspostavljenim tehnikama mapiranja homologije kao što je Shuffle-LAGAN (Brudno M., Bioinformatics 2003b, 19 Suppl 1:154-162) ili Markovljeva nasumična polja. Kada se u ovoj prijavi pominju procenti identiteta sekvence, ovi procenti se izračunavaju u odnosu na punu dužinu duže sekvence, ako nije drugačije naznačeno. „Hibridizacija” se, takođe, može koristiti kao mera identiteta sekvence ili homologije između dve sekvence nukleinske kiseline. Sekvenca nukleinske kiseline koja kodira F, N, ili M2-1, ili deo bilo kog od njih, može se koristiti kao hibridizaciona sonda u skladu sa standardnim tehnikama hibridizacije. Uslovi hibridizacije su poznati stručnjacima u tehnici i mogu se naći, na primer, u Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N.Y., 6.3.1-6.3.6, 1991. „Uslovi umerene hibridizacije” su definisani kao ekvivalentni hibridizaciji u 2X natrijum hlorid/natrijum citrat (SSC) na 30°C, nakon čega sledi ispiranje u IX SSC, 0,1% SDS na 50°C. „Veoma strogi uslovi” su definisani kao ekvivalentni hibridizaciji u 6X natrijum hlorid/natrijum citrat (SSC) na 45°C, nakon čega sledi ispiranje u 0,2 X SSC, 0,1 % SDS na 65°C.
[0046] Izraz „ostatak kuplovanja” kako se koristi u kontekstu predmetnog pronalaska odnosi se na aminokiselinu se javlja ili se ne javlja u prirodi, a koja ima bočni lanac, sposoban da formira kovalentnu vezu. Ostaci kuplovanja se mogu umetnuti u polipeptid predmetnog pronalaska. Ako je ostatak kuplovanja prirodna aminokiselina koja je kodirana od DNK, umetanje ostatka kuplovanja zahteva samo modifikaciju DNK koja usmerava ekspresiju polipeptida pronalaska, npr. umetanje kodona koji kodira takvu aminokiselinu ili mutaciju postojećeg kodona. Poželjni primeri aminokiselina koje se javljaju u prirodi a koje su ostaci kuplovanja u smislu ovog termina su Asp, Glu, Lys i Cys. Cys je posebno poželjan jer će formirati disulfidnu vezu sa drugim Cys u zavisnosti od redoks statusa sredine. Posebno, ovo poslednje omogućava formiranje stabilne interkonekcije između dva odvojena polipeptida.
[0047] Izraz „oznaka” kako se koristi u kontekstu predmetnog pronalaska odnosi se na bilo koju vrstu jedinjenja pogodnog za dijagnostičke svrhe. Poželjna jedinjenja se biraju iz fluorescentne boje, radioizotopa i kontrastnog sredstva. Kontrastno sredstvo je boja ili druga supstanca koja pomaže da se pokažu abnormalna područja unutar tela. U jednoj realizaciji, izraz oznaka se odnosi na jedinjenje koje sadrži helatno sredstvo koje formira kompleks sa dvovalentnim ili trovalentnim katjonima metala. Poželjni radioizotopi / izotopi koji emituju fluorescenciju se biraju iz grupe koju čine izotopi koji emituju alfa zračenje, izotopi koji emituju gama zračenje, izotopi koji emituju Ožerove elektrone, izotopi koji emituju rendgenske zrake, fluorescentni izotopi koji emituju fluorescenciju, kao što su 18 F,51 Cr,67 Ga,68 Ga,m In,99m Tc,140 La,175 Yb,153 Sm,166 Ho,88 Y,90 Y,149 Pm,177 Lu,47 Sc,142 Pr,159 Gd,212 Bi,72 As,72 Se,97 Ru,109 Pd, 105 Rh,101ml5 Rh, 119 Sb,128 Ba,123 1,124 1,131 1,197 Hg,211 At, 169 Eu,203 Pb,212 Pb,64 Cu,67 Cu,188 Re,186 Re,198 Au i 199 Ag. Poželjne fluorescentne boje izabrane su iz sledećih klasa boja: Ksanteni (npr. Fluorescein), Akridini (npr. Akridin žuta), Oksazini (npr. Oksazin 1), Cinini (npr. Cy7 / Cy 3), Stirilne boje (npr. Boja – 28), Kumarini (npr. Alexa Fluor 350), Porfini (npr. hlorofil B), kompleksi metala-liganda (npr. PtOEPK), fluorescentni proteini (npr. APC, R-fikoeritrin), nanokristali (npr. QuantumDot 705), perilena (npr. Lumogen Crvena F300) i ftalocijanini (npr. IRDYE<™>700DX), kao i konjugata i kombinacije ovih klasa boja. Poželjna kontrastna sredstva su izabrana iz paramagnetnih sredstava, npr. Gd, Eu, W i Mn, poželjno u kompleksu sa helatnim sredstvom. Dalje opcije su supramagnetni kompleksi i čestice gvožđa (Fe), jedinjenja koja sadrže atome visokog atomskog broja, tj. jod za kompjutersku tomografiju (CT), mikromehurići i nosači kao što su lipozomi koji sadrže ova kontrastna sredstva.
[0048] Izraz „lek” treba razumeti u kontekstu predmetnog pronalaska u njegovom najširem smislu da se odnosi na bilo koje jedinjenje koje izaziva profilaktički, terapeutski ili palijativni efekat kod pacijenta. Poželjno, to je mali molekul, npr. sa molekulskom veličinom ispod 500 D.
[0049] „Linker” u kontekstu predmetnog pronalaska se odnosi na bilo koji hemijski deo koji je fleksibilan i sterično razdvaja dva hemijska dela, npr. projektovani polipeptid prvog aspekta pronalaska leka ili oznake. Poželjni linkeri su delovi sa odnosom dužine i širine od najmanje 10:1, poželjno od najmanje 20:1, poželjnije od najmanje 50:1. Poželjno, linkeri su linearni molekuli. Poželjno je da su dva dela povezana linkerom kovalentno ili nekovalentno, poželjno kovalentno vezana za odgovarajuće krajeve linkera.
[0050] „Peptidni linker” u kontekstu predmetnog pronalaska se odnosi na sekvencu aminokiseline, tj. polipeptid, koji sterično razdvaja dva dela unutar projektovanih polipeptida predmetnog pronalaska. Obično, takav linker se sastoji od između 1 i 100, poželjno 3 do 50, poželjnije 5 do 20 aminokiselina. Dakle, takvi linkeri imaju minimalnu dužinu od najmanje 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 , 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 ili 30 aminokiselina i maksimalnu dužinu od najmanje 100, 95, 90, 85, 80, 75, 70, 65, 60, 55 , 50, 45, 40, 35, 34, 33, 32, 31, 30, 29, 28, 27, 26, 25, 24, 23, 22, 21, 20, 19, 18, 17, 16, ili 15 aminokiselina ili manje. Peptidni linkeri, takođe, mogu da obezbede fleksibilnost između dva dela koja su povezana zajedno. Takva fleksibilnost se generalno povećava ako su aminokiseline male. Shodno tome, fleksibilni peptidni linkeri sadrže povećan sadržaj malih aminokiselina, posebno glicina i/ili alanina, i/ili hidrofilnih aminokiselina kao što su serini, treonini, asparagini i glutamini. Poželjno, više od 20%, 30%>, 40%>, 50%>, 60%> ili više aminokiselina peptidnog linkera su male aminokiseline.
[0051] Izrazi „preparat” i „kompozicija” imaju za cilj da uključe formulaciju aktivnog jedinjenja, npr. VLP-ove predmetnog pronalaska sa nosačem i/ili ekscipijensom.
[0052] „Farmaceutski prihvatljivo” označava odobrenje od strane regulatorne agencije savezne ili državne vlade ili je navedeno u Farmakopeji SAD ili drugoj opšte priznatoj farmakopeji za upotrebu kod životinja, a posebno kod ljudi. Izraz „nosač”, kako se ovde koristi, odnosi se na farmakološki neaktivnu supstancu kao što su, ali bez ograničenja na, razblaživač, ekscipijens, surfaktanti, stabilizatori, fiziološki puferski rastvori ili vehikulumi sa kojima se primenjuje terapeutski aktivni sastojak. Takvi farmaceutski nosači mogu biti tečni ili čvrsti. Tečni nosači uključuju, ali nisu ograničeni na sterilne tečnosti, kao što su slani rastvori u vodi i uljima, uključujući, ali ne ograničavajući se na one naftnog, životinjskog, biljnog ili sintetičkog porekla, kao što su ulje od kikirikija, sojino ulje, mineralno ulje, susamovo ulje i slično. Slani rastvori i vodeni rastvori dekstroze i glicerola takođe se mogu koristiti kao tečni nosači, posebno za rastvore za injekcije. Slani rastvor je poželjan nosač kada se farmaceutska kompozicija primenjuje intravenozno. Primeri pogodnih farmaceutskih nosača su opisani u „Remington’s Pharmaceutical Sciences” E.V. Martina.
[0053] Pogodni farmaceutski „ekscipijensi” uključuju skrob, glukozu, laktozu, saharozu, želatin, slad, pirinač, brašno, kredu, silika gel, natrijum stearat, glicerol monostearat, talk, natrijum hlorid, obrano mleko u prahu, glicerol, propilen, glikol, vodu, etanol i sl.
[0054] „Surfaktanti” obuhvataju anjonske, katjonske i nejonske površinski aktivne materije kao što su, ali ne ograničavajući se na natrijum deoksiholat, natrijum dodecilsulfat, Triton X-100, i polisorbate kao što su polisorbat 20, polisorbat 40, polisorbat 60, polisorbat 65 i polisorbat 80.
[0055] „Stabilizatori” uključuju, ali nisu ograničeni na manitol, saharozu, trehalozu, albumin, kao i antagoniste proteaze i/ili nukleaze.
[0056] „Fiziološki puferski rastvor” koji se može koristiti u kontekstu predmetnog pronalaska obuhvata, ali nije ograničen na rastvor natrijum hlorida, demineralizovanu vodu, kao i pogodne organske ili neorganske puferske rastvore kao što su, ali bez ograničenja na, fosfatni pufer, citratni pufer, tris pufer (tris(hidroksimetil)aminometan), HEPES pufer ([4 (2 hidroksietil)piperazino]etansulfonska kiselina) ili MOPS pufer (3 morfolino-1 propansulfonska kiselina). Izbor odgovarajućeg pufera uopšteno zavisi od željene molarnosti pufera. Fosfatni puferi su pogodni, na primer, za injekcije i rastvore za infuziju.
[0057] Izraz „adjuvans” se odnosi na agense koji povećavaju, stimulišu, aktiviraju, potenciraju ili moduliraju imuni odgovor na aktivni sastojak kompozicije bilo na ćelijskom ili humoralnom nivou, npr. imunološki adjuvansi stimulišu odgovor imunog sistema na stvarni antigen, ali sami nemaju imunološki efekat. Primeri takvih pomoćnih sredstava uključuju, ali nisu ograničeni na, neorganske adjuvanse (npr. neorganske soli metala kao što su aluminijum fosfat ili aluminijum hidroksid), organske adjuvanse (npr. saponini ili skvalen), pomoćne supstance na bazi ulja (npr. Freundov poptuni adjuvans ili Freundovn nepotpuni adjuvans), citokine (npr. IL-Iβ, IL-2, IL-7, IL-12, IL-18, GM-CFS i INF-γ) čestice adjuvansa (npr. imunostimulacioni kompleksi (ISCOMS), lipozomi ili biorazgradive mikrosfere), virosome, bakterijske adjuvanse (npr. monofosforil lipid A ili muramil peptidi), sintetičke adjuvanse (npr. nejonski blok kopolimeri, analozi muramilnih peptida ili sintetički lipid A), ili sintetičke polinukleotidne adjuvanse (npr. poliliarginin ili polilizin).
[0058] „Efikasna količina” ili „terapeutski efikasna količina” je količina terapeutskog sredstva dovoljna da se postigne predviđena svrha. Efikasna količina datog terapeutskog sredstva će varirati u zavisnosti od faktora kao što su priroda sredstva, način primene, veličina i vrsta životinje koja dobija terapeutsko sredstvo i svrha primene. Efektivnu količinu u svakom pojedinačnom slučaju može empirijski odrediti kvalifikovan stručnjak prema utvrđenim postupcima u tehnici.
REALIZACIJE
[0059] Predmetni pronalazak obezbeđuje, između ostalog, sledeće prednosti u odnosu na stanje tehnike: (i) lako modifikovani skelet za antigen i/ili umetanje/prezentaciju ciljno specifičnog domena vezivanja, koja se može prilagoditi potrebama pacijenta ili lako prilagoditi antigenima sa promenljivim površinama virusa, (ii) stabilnu kompoziciju koja se može koristiti za, npr. vakcinaciju čak i pod nepovoljnim uslovima skladištenja, npr. visoka toplota, (iii) vehikulum izuzetno velike gustine za predstavljanje jednog ili više antigena, (iv) upotrebu fibrilarnog proteina (STICKER) za dodavanje daljih antigena ili druge aktivnosti u hodu.
[0060] Shodno tome, u prvom aspektu, predmetni pronalazak se odnosi na projektovani protomer baze pentona adenovirusa kao što je definisano u patentnom zahtevu 1, pri čemu dati protomer baze pentona sadrži prvu RGD-petlju, drugu RGD-petlju, varijabilnu petlju (V petlju), rascep za vezivanje fibrilarnog proteina adenovirusa i/ili N-terminalni domen, i sadrži jedan ili više neadenovirusnih polipeptida ubačenih u prvu, drugu ili i u prvu i u drugu RGD-petlje i opciono sadrži jedno ili više od sledećeg:
(i) najmanje jedan ciljno specifični domen vezivanja u prvoj, drugoj ili i u prvoj i u drugoj RGD-petlji, i/ili u V petlji; i/ili
(ii) neadenovirusni polipeptid na N- i/ili C-kraju protomera baze pentona; i/ili
(iii) najmanje jedan heterologni ostatak kuplovanja u prvoj, drugoj, ili i u prvoj i u drugoj RGD-petlji, u V petlji i/ili u N-terminalnom domenu protomera baze pentona, pri čemu je N- kraj N-terminalnog domena unutar protomera baze pentona definisan na sledeći način: X1-G-R-N-S-I-R (SEQ ID NO: 44) i C-kraj N-terminalnog domena unutar protomera baze pentona je definisan na sledeći način:
D-X2-R-S-R-G (SEQ ID NO: 45),
pri čemu
Xi je izabran iz grupe koju čine G i E, poželjno E, i
X2 je izabran iz grupe koju čine D i E, poželjno E; i/ili
(iv) lek, oznaka i/ili polipeptid koji je kovalentno ili nekovalentno kuplovan sa jednom ili više aminokiselina prve, druge ili i prve i druge RGD-petlje i/ili jednom ili više aminokiselina iz V petlje protomera baze pentona; i/ili
(v) najmanje jedan heterologni ostatak kuplovanja u rascepu za vezivanje fibrilarnog proteina adenovirusa protomera baze pentona
i pri čemu je projektovani polipeptid poželjno sposoban da se sklopi u VLP.
[0061] Projektovani adenovirus protomera baze pentona pronalaska može da sadrži jedan ili više neadenovirusnih peptida u V petlji.
[0062] Ako je u jednoj od gornjih realizacija naznačeno da se jedan ili više neadenovirusnih polipeptida nalazi u prvoj ili drugoj ili i u prvoj i u drugoj RGD petlji kao što je definisano u patentnom zahtevu 1, navedeni jedan ili više neadenovirusnih polipeptida su umetnuti u prvu ili drugu ili i u prvu i u drugu RGD petlju proteina baze pentona bez uticaja na sposobnost sklapanja u VLP.
[0063] Najmanje jedan ciljno specifični domen vezivanja u prvoj, drugoj ili i u prvoj i u drugoj RGD-petlji, i/ili u V petlji obezbeđuje protomer baze pentona i shodno tome sastavljeni VLP sa mogućnošću da se specifično vezuje za ciljnu strukturu, npr. ćelijski receptor na površini ćelije. Iznenađujuće je otkriće predmetnih pronalazača da ovi delovi protomera baze pentona mogu da sadrže ciljno specifični domen vezivanja značajne dužine bez ometanja formiranja pentona ili VLP. Pored toga, ciljno specifični domen vezivanja koji se nalazi u ovim regionima je slobodan da stupa u interakciju sa ciljevima i vezuje se za njih. Jedan ili više ciljno specifičnih domena vezivanja mogu biti umetnuti u bilo kojoj tački u odgovarajućim petljama, tj. bez uklanjanja bilo koje od aminokiselina petlje. Alternativno, sve ili deo dotične aminokiseline u petlji mogu biti zamenjeni aminokiselinama ciljno specifičnog domena vezivanja. Ciljno specifični domen vezivanja može da bude okružen N- i/ili C-terminalnim peptidnim linkerima.
[0064] Ako protomer baze pentona sadrži više od jednog ciljno specifičnog domena vezivanja, poželjno je da se oni nalaze u različitim petljama protomera baze pentona, npr. u prvoj i drugoj RGD-petlji, u prvoj RGD-petlji i V-petlji, ili drugoj RGD-petlji i V-petlji. Ako protomer baze pentona sadrži više od jednog ciljno specifičnog domena vezivanja, takođe je poželjno da se vezuju za različite ciljeve/mete, npr. za cilj na prvom tipu ćelije i za drugi cilj na drugom tipu ćelije. Takve dvostruke ili višestruke specifičnosti mogu se koristiti za spajanje ćelija koje obično ne stupaju u interakciju ili nedovoljno često stupaju u interakciju jedna sa drugom. Primeri takvih ćelija su tumorske ćelije i ćelije imunog sistema, posebno citotoksične T ćelije.
[0065] U skladu sa pronalaskom, prva, druga ili i prva i druga RGD-petlja sadrže jedan ili više umetnutih neadenovirusnih polipeptida. Ova realizacija je, takođe, zasnovana na iznenađujućem zapažanju da su polipeptidi umetnuti u jedan ili više ovih regiona protomera baze pentona dovoljno izloženi da ih ćelije imunog sistema prepoznaju i, na taj način, da izazovu imuni odgovor. Izraz „neadenovirusni” polipeptid se odnosi na polipeptid koji nema sekvencu identiteta sa bilo kojim polipeptidom prisutnim u adenovirusu, posebno u protomerima baze pentona adenovirusa koji se javljaju u prirodi, u dužini od najmanje 5 aminokiselina. Poželjno je da neadenovirusni polipeptid nema identitet sekvence sa bilo kojim polipeptidom prisutnim u adenovirusu u dužini od najmanje 10, poželjno najmanje 15 aminokiselina. Jedan ili više neadenovirusnih polipeptida mogu biti umetnuti u svakom slučaju nezavisno u bilo kojoj tački u odgovarajućim RDG petljama, tj. bez uklanjanja bilo koje od aminokiselina iz petlje. Neadenovirusni polipeptid koji se nalazi u jednoj ili više petlji može da bude okružen N- i/ili C-terminalnim peptidnim linkerima. Ovo može da bude poželjno da se poveća izloženost neadenovirusnog polipeptida na površini VLP. Ako je najmanje jedan neadenovirusni polipeptid umetnut u svaku RGD petlju, i u V petlju, tada svaki protomer baze pentona sadrži najmanje tri identična ili različita neadenovirusna polipeptida na svojoj površini. Kada se jednom sastave u VLP, najmanje 180 neadenovirusnih polipeptida može da bude prikazano na površini VLP-a predmetnog pronalaska.
[0066] Sadašnji pronalazači su iznenađujuće otkrili da duge sekvence aminokiseline od 50 ili više, 100 ili više, 150 ili više, 200 ili više, 250 ili više ili 300 ili više aminokiselina mogu biti uvedene u prvu, drugu ili i u prvu i u drugu RGD-petlju, i opciono u V petlji bez narušavanja sposobnosti protomera baze pentona da se sklapaju u pentonske proteine i potom u VLP. Dakle, u realizaciji naznačenoj pod (i) i/ili (ii) sekvence aminokiselina gore naznačene dužine mogu biti umetnute (sa ili bez delecije neke od aminokiselina sa odgovarajućim petljama).
[0067] Ako se umetanje jednog ili više neadenovirusnih polipeptida u RGD petlju prema pronalasku kombinuje sa opcionom realizacijom navedenom pod (i), dalje je poželjno da se neadenovirusni protein ubaci u drugu petlju u odnosu na ciljno specifični domen vezivanja.
[0068] Predmetni pronalazači su primetili da polipeptidi koji se nalaze na N- i/ili C-kraju protomera baze pentona ne ometaju sklapanje pentona i kasnije VLP i da su površinski izloženi u sastavljenom VLP-u. Prema tome, u daljoj alternativnoj realizaciji (ii) neadenovirusni polipeptid može da bude povezan sa ili bez interventnog peptidnog linkera na N- i/ili C-kraju protomera baze pentona. Shodno tome, projektovani protomer baze pentona pronalaska može da sadrži neadenovirusne polipeptide u prvoj ili drugoj RGD petlji ili i u prvoj i u drugoj RGD petlji, i opciono u V petlji, poželjno u sve tri petlje, i na N-kraju, C-kraju ili N- i C-krajevima. Poželjno je da se ova alternativna realizacija kombinuje sa najmanje jednom od drugih alternativnih realizacija (i), (iii), (iv) i/ili (v).
[0069] Zapažanja predmetnih pronalazača koja se odnose na mogućnost umetanja heterologne peptidne sekvence u prvu RGD-petlju i/ili drugu RGD-petlju, i opciono u V petlju, dovela su do dalje alternativne realizacije koja se može kombinovati sa jednom ili više od prethodno diskutovanih alternativnih realizacija. U ovoj realizaciji, najmanje jedan heterologni ostatak kuplovanja je uveden u prvu, drugu ili i u prvu i u drugu RGD-petlju i/ili u V petlju. Umetanjem jednog ili više ostataka kuplovanja postaje moguće kovalentno kuplovati dalje molekule u petlje.
Predviđeno je, na primer, da se VLP prvo sastavi od projektovanog polipeptida iz prvog aspekta koji sadrži jedan ili više ostataka kuplovanja u jednoj ili više petlji i da se zatim polipeptid koji takođe sadrži ostatak kuplovanja kovalentno vezuje za VLP. Korišćenjem ove strategije moguće je „ukrasiti” površinu VLP polipeptidima. Takvi VLP se mogu koristiti za izazivanje humoralnog i/ili ćelijskog imunog odgovora protiv takvih polipeptida.
[0070] Štaviše, predmetni pronalazači su identifikovali region unutar protomera baze pentona koji se naziva „N-terminalni domen protomera baze pentona”. Ovaj domen je uključen u interakciju između protomera baze pentona unutar pentona i, takođe, u interakciju između pentona koji formiraju VLP. Umetanje ostataka kuplovanja u ovaj region omogućava formiranje kovalentnih veza između dva ili više protomera baze pentona unutar istih ili odvojenih pentona. Formiranje takvih kovalentnih veza stabilizuje penton kao i sastavljeni VLP. N-terminalni domen je visoko očuvan među različitim vrstama adenovirusa. Stoga je moguće dalje razgraničiti N-terminalni i C-terminalni kraj ovog domena unutar protomera baze pentona. Prema tome, poželjno je da se jedan ili više ostataka kuplovanja nalaze u N-terminalnom domenu. Ostatak kuplovanja može da zameni postojeću aminokiselinu ili može da bude umetnut kao dodatak aminokiselinama koje formiraju N-terminalni domen. Poželjno je da jedan ili više ostataka kuplovanja zamene ostatak unutar N-terminalnog domena. N-kraj N-terminalnog domena unutar protomera baze pentona je poželjno definisan na sledeći način:
X1-G-R-N-S-I-R (SEQ ID NO: 44)
a C-kraj N-terminalnog domena unutar protomera baze pentona je poželjno definisan na sledeći način:
D-X2-R-S-R-G (SEQ ID NO: 45), pri čemu
X1je izabran iz grupe koju čine G i E, poželjno E, i
X2je izabran iz grupe koju čine D i E.
[0071] Shodno tome, u ovoj alternativnoj realizaciji jedan ili više ostataka kuplovanja se nalaze unutar sekvence aminokiseline protomera baze pentona koja se nalazi u projektovanom polipeptidu predmetnog pronalaska koji je razgraničen gornjim N- i C-terminalnim regionom. Stručnjak u tehnici će razumeti da je u ovoj realizaciji takođe moguće zameniti jedan ili više aminokiselinskih ostataka unutar SEQ ID NO: 44 ili 45. Ostatak kuplovanja može da bude pozicioniran bilo gde unutar N-terminalnog domena sve dok ne ometa sastavljanje pentona ili VLP-a.
[0072] Poželjna sekvenca aminokiselina protomera koja se može modifikovati u skladu sa alternativama (i) do (v) prve realizacije je SEQ ID NO: 64 (kodirajuća nukleotidna sekvenca je naznačena u SEQ ID NO: 63). Poželjno je da se insercije najmanje jednog ciljno specifičnog domena vezivanja prema realizaciji (i) i/ili insercija najmanje jednog heterolognog ostatka kuplovanja prema realizaciji (iii), i/ili kovalentno ili nekovalentno kuplovanja leka ili polipeptida na jednu ili više aminokiselina prve, druge ili i prve i druge RGD-petlje i/ili jednu ili više aminokiselina V petlje prema realizaciji (iv) se javlja u prvoj RGD-petlji između aminokiselina 312 do 339 SEQ ID NO: 64 i/ili u drugoj RGD-petlji između aminokiselina 343 do 367 SEQ ID NO: 64 i, opciono u V petlji između aminokiselina 150 do 178 SEQ ID NO: 64. Takva insercija(e) može da izbriše sve ili deo respektivno naznačenih aminokiselina koje pripadaju V petlji.
[0073] Poželjno, mora postojati PAIR ostataka kuplovanja, poželjno mutacija na cisteinima da bi se omogućilo formiranje disulfidne veze. Dobijeni stabilizovani VLP sadrži do 120 disulfidnih veza i hiperstabilan je na 37°C, pa čak i na 42°C, tokom najmanje nekoliko meseci. U posebno poželjnoj realizaciji, ostaci kuplovanja su locirani na aminokiselinskim pozicijama 51 i 54 u odnosu na SEQ ID NO: 64, tj. poželjnu sekvencu aminokiseline protomera baze pentona zasnovanu na humanom Ad B3 ili na analognim pozicijama protomera baze pentona drugog adenovirusa, ili na aminokiselinskim pozicijama 54 i 114 u odnosu na SEQ ID NO: 64 ili na analognim pozicijama protomera baze pentona drugog adenovirusa.
[0074] Dalje je otkriveno da ostatak kuplovanja na aminokiselinskoj poziciji 53 (u odnosu na SEQ ID NO: 1) može formirati kovalentnu vezu sa ostatkom kuplovanja na poziciji aminokiseline 543 (u odnosu na SEQ ID NO: 64) ili na analognoj poziciji protomera baze pentona drugog adenovirusa. Poslednji ostatak je izvan N-terminalnog domena. Prema tome, ako je ostatak kuplovanja umetnut na poziciju 53, poželjno je da se drugi kuplovani ostatak postavi na aminokiselinu 541 u odnosu na SEQ ID NO: 64 ili na analogne pozicije protomera baze pentona drugog adenovirusa. Uz upućivanje na Sliku 6 i uključivanjem dodatnih proteina baze pentona u poravnanje, stručnjak može lako da odredi one ostatke u odgovarajućem protomeru baze pentona koji zauzimaju analognu poziciju kao aminokiseline. 51, 53, 54, 114 i 541 SEQ ID NO: 64.
[0075] Poželjno je u ovoj realizaciji projektovanog polipeptida predmetnog pronalaska da protomer baze pentona sadrži sledeće sekvence:
P-T-X1-Xc-R-N-Xc-I-R (SEQ ID NO: 50);
P-T-X1-G-R-Xc-S-I-R (SEQ ID NO: 51) i T-Q-TI-N-X60-Xc-X61(SEQ ID NO: 52) ili P-T-X1-G-R-N-Xc-I-R (SEQ ID NO: 53) i
T-C-P-Xc-V-X62-K-A-L-G (SEQ ID NO: 54)
pri čemu
X1je izabran iz grupe koju čine G i E, poželjno E
Xc je u svakom slučaju ostatak kuplovanja, poželjno C; D, E i K, najpoželjnije C;
X60je izabran iz grupe koju čine F, I i L, poželjno F i L, najpoželjnije F,
X61je izabran iz grupe koju čine D i E, poželjno E; i
X62je izabran iz grupe koju čine H i Y, poželjno Y.
[0076] Posebno, poželjni stabilizovani protomeri baze pentona sadrže ili se sastoje od sekvenci aminokiselina prema SEQ ID NO: 65 do 67. Dalje je poželjno da ove sekvence aminokiselina sadrže jednu ili više modifikacija prema alternativnim realizacijama (i), ( ii), (iii) ukoliko se ova alternativna realizacija ne odnosi na N-terminalni domen, (iv) ili (v) prvog aspekta pronalaska koji je gore opisan.
[0077] Poželjno je da se insercije najmanje jednog ciljno specifičnog domena vezivanja prema realizaciji (i) i/ili insercija najmanje jednog heterolognog ostatka kuplovanja prema realizaciji (iii), i/ili kovalentno ili nekovalentno kuplovanja leka ili polipeptida na jednu ili više aminokiselina prve, druge ili i u prvu i u drugu RGD-petlju i/ili jednu ili više aminokiselina V petlje prema realizaciji (iv) javlja u prvoj RGD-petlji i da se dešava između aminokiselina 312 do 339 SEQ ID NO: 65 do 67 i/ili da se insercija u drugu RGD petlju dešava između aminokiselina 343 do 367 SEQ ID NO: 65 do 67 i, opciono da se insercija u V petlju dešava između aminokiselina 150 do 178 SEQ ID NO: 65 do 67. Takva insercija(e) može izbrisati sve ili deo respektivno naznačenih aminokiselina koje pripadaju prvoj i drugoj RGD petlji i V petlji.
[0078] Termička stabilizacija pentona i VLP-a formiranih od strane projektovanih proteina predmetnog pronalaska je poželjna, takođe, u kontekstu bilo koje druge alternativne realizacije projektovanog proteina predmetnog pronalaska. Shodno tome, alternativna realizacija pomenuta pod (iii) iznad u vezi sa N-terminalnim domenom je poželjno kombinovana sa jednom ili više alternativnih realizacija (i), (ii), (iii) u meri u kojoj se ova alternativna realizacija ne odnosi na N-terminalni domen, (iv) ili (v). Takođe je poželjno da su alternativne realizacije pomenute pod (iii) i (v) prisutne u projektovanom protomeru baze pentona i kombinovane sa jednim ili više od (i), (ii), (iii), u meri u kojoj se ova alternativna realizacija ne odnosi na N-terminalni domen, ili (iv).
[0079] U daljoj alternativnoj realizaciji (iv) prvog aspekta pronalaska koji se može kombinovati sa jednom ili više drugih alternativnih realizacija prvog aspekta pronalaska, lek, oznaka i/ili polipeptid su kovalentno ili nekovalentno kuplovani na jednu ili više aminokiselina prve, druge ili i prve i druge RGD-petlje i/ili jednu ili više aminokiselina V petlje protomera baze pentona. Ponovo, ova realizacija je zasnovana na zapažanju da kuplovanje delova sa ovim regionima ne ometa sastavljanje pentona i VLP i dovodi do dekoracije VLP ovim delovima. U poželjnoj realizaciji, lek ili oznaka je vezana za protomer baze pentona preko linkera, poželjno peptidnog linkera, koji se može cepati u fiziološkim uslovima, npr. proteazom, čime oslobađa lek iz VLP-a na mestu delovanja. U ovoj poželjnoj realizaciji, linker, poželjno peptidni linker, sadrži mesto cepanja endopeptidaze.
[0080] U poželjnoj realizaciji, fragment adenovirusnog vlakna se koristi za nekovalentno vezivanje dela, npr. polipeptida, leka ili oznake, itd. na protomer baze pentona, sastavljeni penton i/ili sastavljeni VLP. Ova interakcija je posredovana preko rascepa za vezivanje fibrilarnih proteina adenovirusa protomera baze pentona koji je prisutan u projektovanom polipeptidu iz prvog aspekta pronalaska. U poželjnoj realizaciji opisanoj u nastavku, fibrilarni fragment sadrži heterologni ostatak kuplovanja za kovalentno vezivanje fibrilarnog fragmenta za protomer baze pentona. Pošto ostatak kuplovanja zahteva suprotan deo, tj. ostatak sa kojim može da formira kovalentnu vezu, dalje je poželjna alternativna realizacija (v) projektovanog proteina prvog aspekta pronalaska da se najmanje jedan heterologni ostatak kuplovanja nalazi u rascepu za vezivanje fibrilarnih proteina adenovirusa protomera baze pentona. Ostatak kuplovanja u rascepu vezivanja i fibrilarni fragment proteina postavljeni su tako da omogućavaju formiranje kovalentne veze kada se fibrilarni fragment proteina vezuje u rascepu protomera baze pentona.
[0081] Svaki protomer baze pentona stupa u interakciju sa jednim fibrilarnim proteinom adenovirusa preko visoko konzerviranog regiona koji se ovde pominje kao „rascep za vezivanje fibrilarnih proteina adenovirusa protomera baze pentona”. Ova interakcija se koristi za indirektno vezivanje daljeg dela, poželjno polipeptida, leka ili oznake za protomer baze pentona i da se nakon sklapanja 60 protomera baze pentona predmetnog pronalaska predstavi do 60 dodatnih delova na površini sastavljene VLP.
[0082] Većina ljudske populacije bila je izložena ljudskom Ad5 i ima memorijske B ćelije sposobne da pokrenu imuni odgovor protiv humanog Ad5. Shodno tome, ako se humani protomeri zasnovani na Ad5 nalaze u projektovanim proteinima iz prvog aspekta pronalaska, veća je verovatnoća da će rezultujuće VLP biti očišćene iz cirkulacije pomoću već postojećeg imuniteta. Prema tome, u poželjnoj realizaciji, projektovani protomer baze pentona adenovirusa prema prvom aspektu pronalaska je zasnovan na pentonskim proteinima adenovirusa iz humanih ili ne-humanih adenovirusa velikih majmuna, poželjno iz adenovirusa šimpanze (Pan), adenovirusa gorila (Gorilla) i adenovirusa orangutana (Pongo), poželjnije bonoboa (Pan paniscus) i obične šimpanze (Pan troglodites).
[0083] Posebno je poželjno da se projektovani protomer baze pentona adenovirusa zasniva na pentonskim proteinima adenovirusa izabranim iz grupe koju čine hAd3, hAd4, hAd5, hAd7, hAdl 1, hAd26, hAd35 i hAd49, ChAd3, ChAd4, ChAd5, ChAd6, ChAd7, ChAd8, ChAd9, ChAdlO, ChAdl l, ChAdl6, ChAdl7, ChAdl9, ChAd20, ChAd22, ChAd24, ChAd26, ChAd30, ChAd31, ChAd37, ChAd38, ChAd44, ChAd63 i ChAd82, Pan-Adl, PanAd2, PanAd3, ChAd55, ChAd73, ChAd83, ChAdl46, i ChAdl47 opisanim u WO 2005/071093 i WO 2010/086189. Projektovani protomer baze pentona adenovirusa prema pronalasku je poželjno zasnovan na protomeru baze pentona divljeg tipa SEQ ID NO: 1 do 14, tj. SEQ ID NO: 1 do 14 odražava sekvencu proteina pre modifikacije prema alternativnim realizacijama (i) do (v) gore navedenim. Stručnjak će razumeti da će insercija ciljno specifičnog domena vezivanja u V-petlju, prvu i/ili drugu RGD petlju promeniti sekvencu u tom delu SEQ ID NO: 1 do 14. Slično tome, zamena aminokiselina sa ostacima kuplovanja će, takođe, promeniti sekvencu aminokiselina.
[0084] Modifikacije u projektovanom proteinu baze pentona adenovirusa prema pronalasku zahtevaju modifikaciju jedne ili obe RGD petlje u skladu sa definicijom u zahtevu 1 i, opciono, V petlje. U poželjnoj realizaciji projektovanog polipeptida pronalaska, region koji se modifikuje je definisan konsenzusnim sekvencama zajedničkim za većinu adenovirusa. Prema tome, ove konsenzusne sekvence su zasnovane na poravnanju nekoliko poželjnih sekvenci aminokiselina protomera baze pentona iz adenovirusnih vrsta i pogodne su za određivanje N- i C-kraja, respektivno, dela proteina baze pentona za modifikovanje u skladu sa realizacijom (i) ili (ii) gore navedenom. N-kraj prve RGD-petlje unutar protomera baze pentona je definisan na sledeći način: X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-X10-X11(SEQ ID NO: 15)
pri čemu
X3je izabran iz grupe koju čine D, E i N, a poželjno je D;
X4je izabran iz grupe koju čine V, L i I, a poželjno je V;
X5je bilo koja aminokiselina, poželjno izabrana iz grupe koju čine A, D, E, K, S i T, a poželjnije je T;
X6je bilo koja aminokiselina, poželjno izabrana iz grupe koju čine A, D, E i K, a poželjnije je A;
X7je izabran iz grupe koju čine F, Y i W, i poželjno je Y;
X8je izabran iz grupe koju čine A, D, E, N i Q, poželjno je E ili Q, a poželjnije je E; X9je bilo koja aminokiselina, poželjno izabrana iz grupe koju čine A, D, E, N i K, a poželjnije je E;
X10je izabran iz grupe koju čine S ili T, a poželjno je S; i
X11je bilo koja aminokiselina i čini N-terminalnu aminokiselinu prve RGD petlje; a sledeća sekvenca definiše C-kraj prve RGD-petlje i istovremeno N-termkrajinus druge RGD-petlje unutar protomera baze pentona:
X12-X13-X14-X15-X16(SEQ ID NO: 16)
pri čemu
X12je bilo koja aminokiselina i čini C-terminalnu aminokiselinu prve RGD petlje; X13je R;
X14je G;
X15je D; i
X16je bilo koja aminokiselina i čini N-terminalnu aminokiselinu druge RGD petlje; i
sledeća sekvenca definiše C-kraj druge RGD-petlje unutar protomera baze pentona: X17-X18-X19-X20-X21-X22-X23-X24(SEQ ID NO: 17);
pri čemu
X17je bilo koja aminokiselina i čini C-terminalnu aminokiselinu druge RGD petlje;
X18je izabran iz grupe koju čine I, L i V, a poželjno je I;
X19je izabran iz grupe koju čine D, E, K, N, Q i V, poželjno je Q ili K, a poželjnije je Q; X20je izabran iz grupe koju čine C, G i P, a poželjno je P;
X21je izabran iz grupe koju čine I, L i V, poželjno je L ili V i poželjnije je L;
X22je izabran iz grupe koju čine D, E, S i T, poželjno je E ili T i poželjnije je E;
X23je izabran iz grupe koju čine D, E, K, S i T, poželjno je E, K ili T, a poželjnije je K; i X24je izabran iz grupe koju čine D i E, a poželjno je D.
[0085] Poželjno, sledeća sekvenca definiše N-terminus V petlje:
X25-X26-X27-X28-X29-X30-X31-X32(SEQ ID NO: 18).
pri čemu
X25je izabran iz grupe koju čine F, Y i W, a poželjno je F;
X26je izabran iz grupe koju čine H, K i R, a poželjno je K;
X27je izabran iz grupe koju čine A, V, I i L, i poželjno je A;
X28je izabran iz grupe koju čine H, K i R, a poželjno je R;
X29je izabran iz grupe koju čine A, V, I i L, a poželjno je V;
X30je izabran iz grupe koju čine A, V, I, L i M, i poželjno je M;
X31je izabran iz grupe koju čine A, V, I i L, a poželjno je V; i
X32je bilo koja aminokiselina i čini N-terminalnu aminokiselinu V petlje;
i/ili
sledeća sekvenca definiše C-kraj V petlje
X33-X34-X35-X36-X37-X38-X39(SEQ ID NO: 19)
pri čemu
X33je bilo koja aminokiselina i čini C-terminalnu aminokiselinu V petlje;
X34je izabran iz grupe koju čine F, Y i W, a poželjno je Y;
X35je izabran iz grupe koju čine D, E, S i T, poželjno je E ili T, a poželjnije je E;
X36je izabran iz grupe koju čine F, Y i W, i poželjno je W;
X37je izabran iz grupe koju čine A, F, V, Y i W, poželjno je F ili V, a poželjnije je F; X38je izabran iz grupe koju čine D, E, S i T, poželjno je D ili E, a poželjnije je E; i X39je izabran iz grupe koju čine F, Y i W, a poželjno je F;
i/ili jedan ili više od sledećih nekontinuiranih peptida unutar protomera baze pentona formiraju rascep za vezivanje fibrilarnih proteina adenovirusa (podebljane aminokiseline direktno stupaju u interakciju sa vlaknima)
M-T-I-D-L-M-N-N-A-I-X40-X41-X42-YL-X43-X44-G-R-Q-X45-G-V-L-E-S (SEQ ID NO:
20);
W-D-P-X46-T-X47-X48-P-G (SEQ ID NO: 46);
X49-V-Ks50-X51-Y-X52-X53(SEQ ID NO: 47);
X54-X55-R-S-Y (SEK II NO: 48); i/ili
L-T-X56-V-F-N-R-F-P-X57(SEQ ID NO: 49)
pri čemu
X40je izabran iz grupe koju čine V, I i L;
X41je izabran iz grupe koju čine E i D;
X42je izabran iz grupe koju čine H, N i Q, poželjno H i N;
X43je izabran iz grupe koju čine K, E, R, Q i A;
X44je izabran iz grupe koju čine V, L i I, poželjno V i I;
X45je izabran iz grupe koju čine H, N i Q, poželjno H i N;
X46je izabran iz grupe koju čine V, I, L, E ili D, poželjno V i E;
X47je izabran iz grupe koju čine V, L i I, poželjno V i I;
X48je izabran iz grupe koju čine M, T i S, poželjno M i T;
X49je izabran iz grupe koju čine D, E, N i Q, poželjno D i N;
X50je bilo koja aminokiselina, poželjno izabrana iz grupe koju čine A, D, P, K i T;
X51je izabran iz grupe koju čine A, D, E, K i R, poželjno A, E i K;
X52je izabran iz grupe koju čine D, E, L, I, Q i N, poželjno E, L i Q;
X53je izabran iz grupe koju čine A, D, E, K, N, Q i R, poželjno A, E, N i K;
X54je izabran iz grupe koju čine K, R, S i T, poželjno K, S i T;
X55je izabran iz grupe koju čine A, D, E, G, K, N, Q, R, S i T, poželjno D, G, K, N i S; X56je izabran iz grupe koju čine H, K i R, poželjno H i R; i
X57je izabran iz grupe koju čine D i E.
[0086] U poželjnoj realizaciji projektovanog polipeptida pronalaska svaka od sekvenci aminokiseline od X3 do X10 je nezavisno izabrana iz grupe koju čine DVTAYEES (SEQ ID NO: 21), DVDAYENS (SEQ ID NO: 22), DVAEYEKS (SEQ ID NO: 23), DVEAYEKS (SEQ ID NO: 24), DVDAYEKS (SEQ ID NO: 25), DVSKYEAS (SEQ ID NO: 26), NVKAYEDS (SEQ ID NO: 27), DVKKYENS (SEQ ID NO: 28), DVDAYQAS (SEQ ID NO: 29), i DVDAYQAS (SEQ ID NO: 30), sekvenca aminokiseline od Xis do X24 je izabrana iz grupe koju čine IQPLEKD (SEQ ID NO: 31), IQPVEKD (SEQ ID NO: 32), IKPLEKD (SEQ ID NO: 33), IVPLTKD (SEQ ID NO: 34), IEPVETD (SEQ ID NO: 35) i IKPLTED (SEQ ID NO: 36), sekvenca aminokiseline od X25 do X31 je izabrana iz grupe koju čine FKARVMV (SEQ ID NO: 37), FRAKLMV (SEQ ID NO: 38), i FRAKVMV (SEQ ID NO: 39), sekvenca aminokiseline od X33 do X39 je izabrana iz grupe koju čine YEWFEF (SEQ ID NO: 40), YEWVEF (SEQ ID NO: 41), i YEWAEF (SEQ ID NO: 42).
[0087] Iznenađujuće je pronađeno da veliki heterologni polipeptidi mogu da se umetnu i ili zamene prvu i/ili drugu RGD petlju bez ometanja sklapanja pentona, a zatim i VLP-ova pronalaska.
[0088] U poželjnoj realizaciji projektovanog polipeptida pronalaska, svaki ciljno specifični domen vezivanja prve RGD petlje nezavisno jedan od drugog ima dužinu između 5 do 300 aminokiselina, poželjno između 6 do 200 aminokiselina; ciljno specifični domen vezivanja druge RGD petlje ima dužinu između 5 do 300 aminokiselina, poželjno između 10 do 200 aminokiselina; i, opciono, ciljno specifični domen vezivanja u V petlji ima dužinu između 5 do 300 aminokiselina, poželjno između 10 do 200 aminokiselina.
[0089] U jednoj alternativi, cilj vezan ciljno specifičnim domenom vezivanja je deo prisutan na površini ćelije ili u ekstracelularnom matriksu. Specifičnost ciljno specifičnog domena vezivanja se bira, ako su VLP-ovi usmereni na određeni tip ćelije da bi isporučili svoj korisni teret, npr. lek ili oznaku. U alternativnoj poželjnoj realizaciji projektovanog polipeptida pronalaska, najmanje jedan ciljno specifičnog domena vezivanja je sposoban da se specifično veže za imunogeni peptid, peptid za neutralizaciju patogena, virusni peptid, bakterijski peptid, imunomodulirajući peptid, peptid raka, za površinu ćelije, poželjno ćelijski receptor, oznaku niske molekulske težine, poželjno biotin ili hitin. Ovo obezbeđuje alternativni i brz način vezivanja različitih peptida na površinu VLP-a.
[0090] U poželjnoj realizaciji projektovanog polipeptida iz prvog aspekta pronalaska, neadenovirusni polipeptid je izabran iz grupe koju čine imunogeni peptidi, peptidi za neutralizaciju patogena, virusni peptidi, bakterijski peptidi, imunomodulirajući peptidi i peptidi raka. Naročito su poželjni virusni peptidi denge HAK QDVVVLGSQEGAM (SEQ ID NO: 55), Čikungunja STKDNFNVYKATRPLAH (SEQ ID NO: 56) i zika virusa STKDNFNVIKATRPLAH (SEQ ID NO: 57). Poželjni primeri ciljno specifičnog domena vezivanja su antitela, jednolančana antitela, fragmenti antitela, nanotela, laki ili teški lanci, varijabilni laki ili varijabilni teški lanci, dijatela ili mimetici antitela. Poželjni fragmenti antitela obuhvataju fragment vezujući antigen (Fab), Fab’ fragment, F(ab’)2 fragment, antitelo teškog lanca, jednodomensko antitelo (sdAb), varijabla jednolančanog fragmenta (scFv), varijabla fragmenta (Fv), VH domen, VL domen, jednodomensko antitelo, nanotelo, IgNAR (receptor novog antigena imunoglobulina), di-scFv, bispecifični aktivatori T-ćelijski (BITEs), molekul sa dvostrukim afinitetom za ponovno ciljanje (DART), trostruko telo, dijatelo, jednolančano dijatelo, alternativni protein skeleta i njegov fuzioni protein.
[0091] Ako je neadenovirusni peptid umetnut u prvu RGD petlju, poželjno je da ima dužinu između 5 do 60 aminokiselina, poželjno između 6 do 45 aminokiselina. Ako se neadenovirusni peptid ubaci u drugu RGD petlju, on može imati dužinu između 5 do 50 aminokiselina, poželjno između 10 do 36 aminokiselina. Ako je neadenovirusni peptid ili peptid umetnut u V petlju, on može imati dužinu između 5 do 30 aminokiselina, poželjno između 10 do 21 aminokiseline.
[0092] U poželjnoj realizaciji projektovanog polipeptida iz prvog aspekta pronalaska, umetnuti neadenovirusni polipeptid sadrži mesto cepanja proteazom, poželjno mesto cepanja endopeptidazom specifično za sekvencu, poželjnije mesto cepanja TEV. Poželjan primer takvog mesta cepanja TEV je ENLYFQG (SEQ ID NO: 60). Takvo mesto cepanja omogućava cepanje polipeptida iz prvog aspekta pronalaska kada se jednom sastavi u penton ili VLP. Neki antigeni zahtevaju izlaganje slobodnom N- i/ili C-kraju da bi izazvali imuni odgovor. Dakle, ako su pentonski proteini ili VLP sastavljeni, njihov tretman proteazom će otkriti N- i/ili C-terminalnu sekvencu takvih antigena, ako je mesto cepanja pozicionirano na N- i/ili C-terminalnom kraju takvog neadenovirusnog polipeptida. Prilično je iznenađujuće da su predmetni pronalazači otkrili da takvo cepanje ne remeti sastavljeni penton ili VLP. Ovo je izuzetno korisno u situacijama u kojima jak imuni odgovor specifičan za antigen zahteva izlaganje slobodnih N- i/ili C-krajeva antigena. Alternativno, mesto cepanja može da se nalazi u projektovanom polipeptidu prvog aspekta pronalaska da bi se olakšalo prečišćavanje projektovanog polipeptida, npr. može se postaviti na N- ili C-kraj odgovarajućeg projektovanog polipeptida odvajajući projektovanu penton bazu adenovirusa pronalaska od afinitetne oznake, npr. biotina, proteina koji vezuje hitin, Myc-taq. Takva afinitetna oznaka omogućava imobilizaciju projektovanog polipeptida na pogodnoj matrici afiniteta i oslobađanje prečišćenog projektovanog polipeptida iz matrice. U poželjnoj realizaciji projektovanog polipeptida iz prvog aspekta pronalaska, ostatak kuplovanja je izabran iz grupe koja sadrži Lys, Cys, Asp i Glu, poželjno Cys.
[0093] U poželjnoj realizaciji projektovanog polipeptida iz prvog aspekta pronalaska, lek je izabran iz grupe hemoterapijskog leka, antipatogenog leka, imunomodulacionog leka i antiinflamatornog leka.
[0094] Kao što je gore navedeno, poželjno je prema alternativnoj realizaciji (v) da se jedan ili više ostataka kuplovanja nalaze u rascepu vezivanja protomera baze pentona pronalaska. Kao što je gore navedeno, ostaci kuplovanja moraju da formiraju kovalentne veze sa odgovarajućim ostacima kuplovanja. Kada dva polipeptida stupe u interakciju, poželjno je da ostatak kuplovanja jednog polipeptida bude sterično blizak ostatku kuplovanja u drugom polipeptidu. U poželjnoj realizaciji alternativne realizacije (v) ostatak kuplovanja je pozicioniran u projektovanom protomeru baze pentona adenovirusa pronalaska na aminokiselinskoj poziciji 476 i/ili 477 (u odnosu na sekvencu aminokiselina SEQ ID NO: 64) ili na analognoj aminokiselinskoj poziciji protomera baze pentona drugog adenovirusa. Analogna pozicija u drugom protomeru baze pentona adenovirusa može se odrediti poravnavanjem sekvence prema SEQ ID NO: 64 sa drugim sekvencama protomera baze pentona adenovirusa pomoću standardnog alata za poravnanje, kao što je, npr. CLUSTAL. Stručnjak može lako odrediti aminokiselinu koja zauzima analognu poziciju sa aminokiselinama 476 ili 477 u drugom pentonskom proteinu adenovirusa. Poželjno je da projektovani protomer baze pentona adenovirusa pronalaska i prema alternativnoj realizaciji (v) sadrži sekvencu KSFX64NXc1Xc2AVY (SEQ ID NO: 68)
pri čemu
X64je izabran iz grupe koju čine Y i F, poželjno Y;
Xc1je izabran iz grupe koju čine D, E i kuplovani ostatak, poželjno Cys;
Xc2je izabran iz grupe koju čine L, Q i kuplovani ostatak, poželjno Cys; i gde su najmanje jedan, poželjno i Xci i Xc2, ostatak kuplovanja, poželjno Cys.
[0095] U alternativnoj poželjnoj realizaciji alternativne realizacije (v) ostatak kuplovanja je pozicioniran u protomer baze pentona koji se nalazi u projektovanom protomeru baze pentona adenovirusa pronalaska na Lys376 protomera baze pentona prema SEQ ID NO: 64 ili na analognom položaju protomera baze pentona drugog adenovirusa. Projektovani protomer baze pentona adenovirusa prema pronalasku poželjno sadrži sledeću sekvencu: Xc-X65-R-S-Y-N (SEQ ID NO: 73)
pri čemu
Xc je ostatak kuplovanja, poželjno C, D, E i K, najpoželjnije C; i X65je bilo koja aminokiselina, poželjno je izabrana iz grupe koju čine D, E, G, K, N ili S, poželjnije S ili N.
[0096] U nekim realizacijama projektovanog protomera baze pentona adenovirusa pronalaska, poželjno je da RGD motiv pozicioniran između prve i druge RGD petlje bude netaknut da bi se olakšalo vezivanje protomera baze pentona, pentona ili VLP-a za određene ćelijske i vanćelijske strukture prisutne kod pacijenta. Alternativno, ako takvo ciljanje nije poželjno u određenoj primeni projektovanog protomera baze pentona adenovirusa pronalaska, RGD motiv može da bude mutiran tako da izgubi sposobnost da se vezuje za integrin.
[0097] U daljem aspektu, predmetni pronalazak se odnosi na nukleinsku kiselinu koja kodira projektovani protomer baze pentona adenovirusa pronalaska.
[0098] U daljem aspektu, predmetni pronalazak se odnosi na ekspresioni vektor koji sadrži nukleinsku kiselinu pronalaska. Ekspresioni vektori obuhvataju plazmide kao i virusne vektore i sadrže kodirajuću sekvencu koja kodira projektovani protein iz prvog i/ili drugog aspekta pronalaska i odgovarajuće DNK sekvence neophodne za ekspresiju operativno povezane kodirajuće sekvence u određenom organizmu domaćina (npr. bakteriji, kvascu, biljci, insektu ili sisaru) ili u in vitro sistemima ekspresije. Vektori za kloniranje se generalno koriste za kreiranje i amplifikaciju određenog željenog DNK fragmenta i mogu da nedostaju funkcionalne sekvence potrebne za ekspresiju željenih DNK fragmenata. U tehnici je uočeno da imunizacija protiv bolesti koje brzo menjaju svoje antigene epitope, npr. gripa, ili koje karakteriše mešavina epitopa specifična za pacijenta, zahtevaju brzu adaptaciju ili individualizaciju vakcine. VLP-ovi predmetnog pronalaska mogu se brzo prilagoditi da predstave respektivno željene antigene. Shodno tome, stavljen je na uvid javnosti vektor za kloniranje koji je podložan brzom umetanju segmenata nukleinske kiseline u prvu i/ili drugu RGD-petlju, i opciono u V-petlju, koji kodiraju jedan ili više željenih antigena. Otkriveni vektor za kloniranje sadrži:
(i) polipeptid koji sadrži protomer baze pentona adenovirusa, pri čemu dati protomer baze pentona sadrži prvu RGD-petlju, drugu RGD-petlju, varijabilnu petlju i/ili mesto vezivanja za fibrilarnog proteina adenovirusa prilagođenog za umetanje nukleinskih kiselina koje kodiraju neadenovirusne peptide u nukleinske kiseline koje kodiraju prvu RGD-petlju ili drugu RGD-petlju ili i prvu i drugu RGD petlju, i, opciono, varijabilnu petlju.
[0099] Vektori za kloniranje za upotrebu u primeni pronalaska obuhvataju jedno ili više restrikcionih enzimskih mesta, poželjno BamHI, Kpnl, Kasl, Narl, Sfdl, EcoRI and RsrII, Pfol, BssHII, Sail, Sacl, Xbal, BstEII, i Hindlll. Sekvenca nukleinske kiseline poželjnih primera takvog vektora za kloniranje je data u SEQ ID NO: 61 i 62. Struktura ovih vektora nazvanih pACEBac-ADDOmerl .O i pACEBac-ADDOmer2.0 je data na slikama 7 i 8. Sekvenca vektora za kloniranje pACEBac-ADDOmer2.0 koji sadrži poželjni antigenski epitop virusa Čikungunja je dat u SEQ ID NO: 71 i 72.
[0100] U daljem aspektu, predmetni pronalazak se odnosi na rekombinantnu ćeliju domaćina koja sadrži ekspresioni vektor predmetnog pronalaska. Ekspresioni vektor predmetnog pronalaska može se naći unutar ćelije domaćina (i) slobodno dispergovan kao takav, ili (ii) integrisan u genom ćelije domaćina ili mitohondrijalnu DNK. Rekombinantna ćelija domaćin se koristi za ekspresiju projektovanog protomera baze pentona adenovirusa pronalaska. Izraz „rekombinantna ćelija domaćin” uključuje potomstvo originalne ćelije koja je transformisana, transfektovana ili inficirana polinukleotidom ili rekombinantnim vektorom pronalaska. Rekombinantna ćelija domaćin može da bude bakterijska ćelija kao što je ćelija E. coli, ćelija kvasca kao što je Saccharomyces cerevisiae ili Pichia pastoris, biljna ćelija, ćelija insekata kao što su ćelije SF9 ili Hi5, ili ćelija sisara. Poželjni primeri ćelija sisara su ćelije jajnika kineskog hrčka (CHO), ćelije bubrega zelenog afričkog majmuna (COS), ćelije humanog embrionalnog bubrega (HEK293), HELA ćelije i slično.
[0101] Projektovani protomeri baze pentona adenovirusa predmetnog pronalaska su sposobni uprkos njihovoj modifikaciji prema alternativnim realizacijama (i) do (v) u poređenju sa odgovarajućim protomerima baze pentona divljeg tipa da se sastave u pentonsku podjedinicu, tj. pentamer. Da li se dati projektovani protomer baze pentona adenovirusa pronalaska sklapa u pentamere može se lako proceniti postupcima dobro poznatim stručnjaku koji obuhvataju elektroforezu u nedenaturišućem poliakrilamidnom gelu, hromatografiju sa isključenjem veličine, masenu spektroskopiju ili slično. Dakle, u sedmom aspektu, predmetni pronalazak se odnosi na pentamer koji sadrži pet projektovanih protomera baze pentona adenovirusa pronalaska.
[0102] Pentameri predmetnog pronalaska su dalje sposobni za sklapanje u VLP. Shodno tome, u daljem aspektu, predmetni pronalazak se odnosi na česticu sličnu virusu (VLP) koja sadrži 12 pentamera predmetnog pronalaska. VLP je stabilan i najpogodniji sastav za davanje pacijentu. Poželjno je da se VLP sastavlja i/ili skladišti u neredukcionim uslovima da bi se omogućilo formiranje kovalentnih veza između ostataka kuplovanja u protomerima baze pentona.
[0103] Kao što je definisano u patentnom zahtevu 12, predmetni pronalazak se u daljem aspektu odnosi na postupak za proizvodnju projektovanog protomera baze pentona adenovirusa predmetnog pronalaska, koji obuhvata korake:
(a) obezbeđivanje rekombinantne ćelije domaćina predmetnog pronalaska;
(b) ekspresiju projektovanog protomera baze pentona adenovirusa; i
(c) prečišćavanje projektovanog protomera baze pentona adenovirusa.
[0104] U daljem aspektu obezbeđen je postupak kao što je definisan u patentnom zahtevu 13 za proizvodnju VLP prema pronalasku koji obuhvata korake postupka prema patentnom zahtevu 12 i dalji korak omogućavanja projektovanim protomerima baze pentona adenovirusa da se sastave u VLP.
[0105] Postupak prema patentnom zahtevu 13 može dalje da obuhvata korak inkubacije VLP-a sa proteazom, poželjno mesto cepanja endopeptidazom specifičnim za sekvencu, poželjnije TEV. Dalje je stavljen na uvid javnosti postupak za proizvodnju VLP prema pronalasku koji sadrži neadenovirusne peptide specifične za bolest i/ili za pacijenta, koji obuhvata korake:
(a) obezbeđivanje vektora za kloniranje pronalaska;
(b) određivanje sekvence aminokiseline neadenovirusnih peptida specifičnih za bolest ili pacijenta;
(c) umetanje nukleinskih kiselina koje kodiraju najmanje jedan od navedenih neadenovirusnih peptida u nukleinske kiseline koje kodiraju prvu RGD-petlju, drugu RGD-petlju i/ili varijabilnu petlju protomera baze pentona adenovirusa, i/ili na poziciju nukleinske kiseline pre ili posle
[0106] nukleinskih kiselina koje kodiraju N- ili C-kraj projektovanog polipeptida koji sadrži protomer baze pentona adenovirusa koji vezuje fibrilarni fragment proteina;
(d) ekspresiju projektovanog protomera baze pentona adenovirusa u ćeliji domaćinu, opciono zajedno sa projektovanim polipeptidom koji sadrži protomer baze pentona adenovirusa koji vezuje fibrilarni fragment proteina; i
(e) prečišćavanje date VLP koja opciono sadrži fragment fibrilarnog proteina koji vezuje protomer baze pentona adenovirusa, ili dati projektovani polipeptid koji sadrži fragment fibrilarnog proteina koji vezuje protomer baze pentona adenovirusa.
[0107] U daljem aspektu, predmetni pronalazak se odnosi na VLP koja se može proizvesti postupkom proizvodnje VLP prema pronalasku.
[0108] U daljem aspektu, predmetni pronalazak se odnosi na farmaceutsku kompoziciju koja sadrži projektovani protomer baze pentona adenovirusa pronalaska, nukleinsku kiselinu koja kodira jedan ili više projektovanih protomera baze pentona adenovirusa pronalaska, ekspresioni vektor pronalaska ili VLP pronalaska, i farmaceutski prihvatljiv nosač i/ili odgovarajući ekscipijens(e). Poželjno, takva kompozicija je farmaceutska kompozicija. U poželjnim realizacijama, farmaceutska kompozicija dalje sadrži farmaceutski prihvatljiv nosač i/ili ekscipijens i opciono jednu ili više dodatnih aktivnih supstanci. Poželjno, kompozicija sadrži terapeutski efikasnu količinu jedinjenja, poželjno u prečišćenom obliku, zajedno sa odgovarajućom količinom nosača i/ili ekscipijensa kako bi se obezbedio oblik za pravilno davanje pacijentu. Formulacija treba da odgovara načinu primene.
[0109] Farmaceutske kompozicije mogu da budu u obliku rastvora, suspenzija, emulzija, tableta, pilula, kapsula, praškova, formulacija sa produženim oslobađanjem i slično. Farmaceutska kompozicija se može formulisati kao supozitorija, sa tradicionalnim vezivnim sredstvima i nosačima kao što su trigliceridi.
[0110] Za pripremu farmaceutskih kompozicija predmetnog pronalaska, farmaceutski prihvatljivi nosači mogu biti ili čvrsti ili tečni. Kompozicije u čvrstom obliku uključuju praškove, tablete, pilule, kapsule, pastile, vrećice, supozitorije i disperzibilne granule. Čvrsti ekscipijens može da bude jedna ili više supstanci, koje takođe mogu delovati kao razblaživači, sredstva za ukus, veziva, konzervansi, sredstva za dezintegraciju tableta ili materijal za kapsuliranje. U praškovima, ekscipijens je poželjno fino podeljena čvrsta supstanca, koja je u smeši sa fino podeljenim inhibitorom predmetnog pronalaska. U tabletama, aktivni sastojak je pomešan sa nosačem koji ima neophodna svojstva vezivanja u odgovarajućim razmerama i sabijen je u željenom obliku i veličini. Pogodni ekscipijensi su magnezijum karbonat, magnezijum stearat, talk, šećer, laktoza, pektin, dekstrin, skrob, želatin, tragakant, metilceluloza, natrijum karboksimetilceluloza, vosak niskog topljenja, kakao puter i slično. Za pripremu supozitorija, vosak niskog topljenja, kao što je mešavina glicerida masnih kiselina ili kakao putera, se prvo topi i aktivna komponenta se homogeno disperguje u njemu, uz mešanje. Rastopljena homogena smeša se zatim sipa u kalupe pogodne veličine, ostavi da se ohladi i time očvrsne. Tablete, praškovi, kapsule, pilule, vrećice i pastile mogu se koristiti kao čvrsti dozni oblici pogodni za oralnu primenu.
[0111] Kompozicije u tečnom obliku uključuju rastvore, suspenzije i emulzije, na primer, vodu, fiziološke rastvore, vodene rastvore dekstroze, rastvore glicerola ili rastvore vode/propilen glikola. Za parenteralne injekcije (npr. intravenske, intraarterijske, intraozne infuzije, intramuskularne, supkutane, intraperitonealne, intradermalne i intratekalne injekcije), tečni preparati se mogu formulisati u rastvoru u, npr. vodenom rastvoru polietilen glikola. Slani rastvor je poželjan nosač kada se farmaceutska kompozicija primenjuje intravenozno.
[0112] Poželjno, farmaceutska kompozicija je u obliku jedinične doze. U takvom obliku kompozicija se može podeliti na jedinične doze koje sadrže odgovarajuće količine aktivne komponente. Jedinični dozni oblik može da bude upakovana kompozicija, pri čemu pakovanje sadrži diskretne količine kompozicije, kao što su upakovane tablete, kapsule i praškovi u bočicama ili ampulama. Takođe, jedinični dozni oblik može da bude kapsula, bočica za injekciju, tableta, kapsula ili sama pastila, ili može da bude odgovarajući broj bilo kog od ovih u upakovanom obliku.
[0113] Kompozicija, po želji, takođe može da sadrži manje količine sredstava za vlaženje ili emulgovanje, ili pH puferskih sredstava.
[0114] Štaviše, takva farmaceutska kompozicija može, takođe, da sadrži drugu farmakološki aktivnu supstancu kao što su, ali ne ograničavajući se na, pomoćne supstance i/ili dodatne aktivne sastojke. Adjuvansi u kontekstu predmetnog pronalaska uključuju, ali nisu ograničeni na, neorganske adjuvanse, organske adjuvanse, adjuvanse na bazi ulja, citokine, čestične adjuvanse, virozome, bakterijske adjuvanse, sintetičke adjuvanse ili sintetičke polinukleotidne adjuvanse.
[0115] U daljem aspektu, predmetni pronalazak se odnosi na projektovani protomer baze pentona adenovirusa prema pronalasku, nukleinsku kiselinu koja kodira jedan ili više projektovanih protomera baze pentona adenovirusa pronalaska, ekspresioni vektor pronalaska ili VLP pronalaska za lečenje i/ili prevenciju zarazne bolesti, imunološke bolesti ili raka.
PRIMERI
[0116] ADDomeri su dizajnirani i proizvedeni u veoma visokim prinosima (desetine grama po litru ekspresione kulture). Uspostavljen je generički protokol u tri koraka za prečišćavanje ADDomera do homogenosti (vidi u daljem tekstu). U projektu dokaza koncepta, eksperimentalno je ustanovljeno da se visoko imunogeni Čikungunja epitopi mogu ubaciti u funkcionalizovane petlje ADDomera, bez ometanja formiranja čestica ili primetnog smanjenja prinosa. ADDomeri koji sadrže Čikungunja epitope su prečišćeni do homogenosti i započete su studije na ćelijama i životinjama kako bi se utvrdila njihova moć kao kandidata za vakcinu. ADDomeri su potvrđeni nizom tehnika uključujući elektronsku mikroskopiju, dokazujući homogeno strukturirane, diskretne multimere (dodekaedre). Cistein-disulfidna hemija je primenjena da bi se još više povećala ionako izuzetna termostabilnost ADDomera (eliminisanje zahteva za hladnim lancem). Štaviše, pripremljeni su ADDomeri koji sadrže ne samo peptidne epitope već i proteinske domene i čitave proteine uključujući veziva visokog afiniteta (nanotela DARPins, fragmenti antitela) i uspostavljaju efikasne protokole za proizvodnju ovih u velikom obimu. Pokrenuti nedavnom pojavom zika virusa, dizajnirani su kandidati za zika vakcinu zasnovani na ADDomer-u, kao i ADDomeri za potencijalnu borbu protiv više od jedne bolesti istovremeno (kombinovana vakcina). Izvode se eksperimenti na ćelijama i na životinjama da bi se ovo potvrdilo.
[0117] U nastavku su opisani eksperimenti i protokoli za proizvodnju i validaciju ADDomer VLP-a i ADDomer VLP vakcina.
1. Dizajn ADDomer-a
[0118] Atomska struktura dodekamernih vrsta koje se javljaju u prirodi (npr. izvedene iz Adenovirusa Ad3 serotipa) je određena rendgenskom kristalografijom (Szolajska E et al, PLoS One. 2012;7(9):e46075 and Zubieta C et al, Mol. Cell 2005: 17(1): 121-35). Pažljiva inspekcija atomskih struktura otkrila je prisustvo proširenih struktura petlje. Tačnije, jedna varijabilna petlja (nazvana V-petlja) i dva regiona u takozvanoj RGD-petlji divljeg tipa dodekaedra su identifikovani kao potencijalna mesta funkcionalizacije. Poređenje brojnih protomera dodekaedra otkrilo je široku varijabilnost V-petlje i dva regiona RGD-petlje širom vrste, kako po dužini tako i po sastavu sekvence, naglašavajući njihov potencijal. Koristeći ove informacije, dizajnirali smo de novo DNK sekvencu koja kodira za sintetički dizajnerski promoter dodekaedra. BioBrick dizajn (Shetty et al. J. Biol. End. 2008) primenjen je uvođenjem DNK sekvenci koje predstavljaju mesta cepanja endonukleazom, da bi se olakšale dizajnirane varijacije (pa čak i randomizacija) aminokiselina koje predstavljaju V-petlju i dva regiona RGD-petlji (RGDloop2, RGDloop2). Dizajn protomera je optimizovan iterativno sve dok nije identifikovan protomer koji bi doveo do rekombinantnog dodekaedra (ADDomer-a) koji je karakterisan kompletnim BioBrick dizajnom gore opisanih regiona petlje, uz održavanje visoke rastvorljivosti i integriteta strukture divljeg tipa humanog Ad3 serotipa dodekaedra.
2. Inženjering hiperstabilnog ADDomer-a
[0119] ADDomer je već izuzetno termostabilan i može da se skladišti na 37°C duže vreme, što ukazuje da ne zahteva hladni lanac u udaljenim oblastima sa lošom infrastrukturom. Inspekcija kristalnih koordinata nativnih Ad3 čestica otkrila je takozvani region ‘zamene lanaca’, gde su se segmenti protomera protezali u okolinu susednih protomera što je dovelo do jukstapozicije aminokiselina koje su bile na udaljenosti koja bi mogla da omogući formiranje kovalentne veze. Ove aminokiseline u ADDomeru smo genetski supstituisali cisteinima, tako da su dva cisteina, od kojih svaki dolazi iz različitih protomera, bila na udaljenosti koja je potrebna za formiranje disulfidne veze.
3. ADDomer ekspresija zasnovana na MultiBac-u
[0120] Zatim, ADDomeri su eksprimovani korišćenjem sistema MultiBac. Gen koji kodira ADDomer je sintetizovan od nule (SEQ ID NO: 63 i kodirani ADDomer je dat u SEQ ID NO: 64) i ubačen klasičnim postupcima kloniranja (restrikcija/ligacija) u pACEBac, transfer plazmid sistema MultiBac. MultiBac je razvio jedan od pronalazača (Berger) posebno za proizvodnju složenih biologija kao što je ADDomer. Pripremljen je kompozitni MultiBac virus koji sadrži ADDomer gen (videti slike 7 i 8) i kulture ćelija insekata inficirane prema prethodno opisanim protokolima Berger I et al. J Vis Exp. (2013) (77):e50159 and Fitzgerald DJ et al. Nat Methods.
(2006) 3(12): 1021). ćelijske pelete koje sadrže ADDomer protein su pripremljene centrifugiranjem kako je opisano. Ćelijske pelete su čuvane na -80 stepeni. Ekspresija ADDomera sa umetnutim peptidnim ili proteinskim epitopima, kao i ekspresija hiperstabilnog ADDomera, sve je dovelo do uporedivih, veoma visokih prinosa i homogeno strukturiranih dodekaedarskih čestica.
3. Neutralizujući epitop
[0121] Primer kandidata za VLP vakcinu zasnovanog na ADDomer-CHIKADDomer-u koji predstavlja višestruke kopije glavnog neutralizirajućeg Čikungunja imunog epitopa HAKKQDVVVLGSQEGAM (SEQ ID NO: 55) je konstruisan. Glavni neutralizujući imuni epitop je deo proteina omotača Čikungunja, i linearni je peptidni epitop koji se nalazi na ekstremnom N-kraju (Kam YW et al. EM BO Mo I Med. (2012); 4(4):330-4). U ogromnoj većini seruma pacijenata, pronađena su antitela koja reaguju sa ovim linearnim peptidnim epitopom. ADDomer obezbeđuje sredstva za predstavljanje linearnih epitopa bilo na ograničen način (i N- i C-krajevi kovalentno povezani sa ADDomer skeletom), ili na neograničeni način (N-krajevi oslobođeni cepanjem sa specifičnom proteazom) ili kombinacijom ograničenih ili neograničenih epitopa, sve dok se čuva strukturni integritet ADDomer skeleta. Poželjni aranžmani koji su korišćeni su sledeći:
AKRARLSTSFNPVPYEDESSTKDNFNVYKATRPYLAH
(SEQ ID NO: 58),
AKRARLSTSFNP VP YEDEC S STKDNFNVYKATRP YL AH (SEQ ID NO: 59) i
AKRARLSTCFNPVPYEDESSTKDNFNVYKATRPYLAH
(SEQ ID NO: 60) Prezentacija nalik prirodnoj Čikungunja glavnog neutralizujućeg epitopa postignuta je cepanjem ADDomera posredovanim TEV proteazom, predstavljajući više kopija epitopa, od kojih svaka sadrži specifično mesto cepanja TEV koje prethodi sekvenci neutralizujućeg epitopa, čuvajući svoj prirodni N-kraj. Slični pristupi se mogu koristiti za bilo koji epitop ili peptidni ili proteinski domen koji prikazuje ADDomer.
[0122] 4. Prečišćavanje ADDomera i varijanti Spodoptera frugiperda Sf21 pelete ćelija insekata su lizirane zamrzavanjem-odmrzavanjem. Lizat je očišćen centrifugiranjem prema standardnim protokolima za ćelije insekata (Berger I et al. J Vis Exp. (2013) (77):e50159 and Fitzgerald DJ et al. Nat Methods. 20063(12): 1021). Očišćeni supernatant je stavljen na gradijent od 15 do 40% saharoze i centrifugiran korišćenjem Beckman SW41 rotora preko noći. Frakcije od 1,1 mL su sakupljene sa vrha gradijenta i stavljene na denaturirajuće SDS poliakrilamidne gelove (SDS-PAGE) za analizu sadržaja proteina i identifikaciju frakcija koje sadrže ADDomere za objedinjavanje hromatografije sa isključivanjem po veličini (SEC) i/ili jonske razmene (IEX) je zatim sprovedeno nakon dijalize saharoze.
[0123] 5. Validacija ADDomera elektronskom mikroskopijom varijanti Prečišćenog ADDomer-a i ADDomer-a su vizuelizovane elektronskom mikroskopijom sa negativnim mrljama (EM) da bi se procenio njihov status sklapanja i njihov strukturni integritet. Standardni preparat liskuna i ugljenika je korišćen sa ADDomerom u koncentraciji od približno 0,1 mg/ml pre nanošenja na materijal podloške. Uzorci su obojeni upotrebom 1% (wt/vol) natrijum silikotungstata (H 7.0) i vizuelizovani na JEOL elektronskom mikroskopu na 100 kV. Slike su snimljene i analizirane su pomoću softvera koji je isporučio Gatan.
[0124] Za eksperimente termostabilnosti, ADDomeri su čuvani ili zamrznuti, na 4°C, na sobnoj temperaturi (RT) ili na 37°C tokom jedne nedelje. Elektronska mikroskopija je pokazala da je skladištenje na sobnoj temperaturi ili na 37°C rezultiralo pravilno samosastavljenim česticama koje pokazuju svoju termostabilnost. Inkubacija ADDomera (SEQ ID NO: 64) tokom 2 h na 45°C je rezultirala reverzibilnim rastavljanjem čestica koje se ponovo sklapaju kada se vrate na sobnu temperaturu. Ova reverzibilna disocijacija je takođe primećena testom termičkog pomeranja (slika 10, videti strelicu), ali je ireverzibilna disocijacija primećena samo za temperaturu iznad 50°C.
6. Dizajn eksperimenata na životinjama (miševima) za procenu imunogenosti ADDomera
[0125] Za imunološku analizu miševa kandidata za vakcinu ADDomer-CHIK Čikungunja ADDomer VLP, korišćene su šest nedelja stare BALB/c ženke miševa. Četiri grupe od osam miševa su određene po imunizaciji sa vrstama ADDomer-a (npr. u slučaju kandidata za vakcinu Čikungunja VLP: i) ADDomer, ii) neograničeni epitop ADDomer-a CHIK, iii) ograničeni epitop ADDomer-a CHIK, iv) izolovani glavni CHIK epitop neutrališućeg peptida povezan sa KLH kao pozitivna kontrola). Svakoj životinji je ubrizgano 10 µg ADDomer-a i ADDomer varijanti u intervalima od 2 nedelje. IgA, IgM, ukupni IgG, IgGl IgG2a i anti-CHIK antitela su titrirani iz mišjih seruma pomoću ELISA. Imunska analiza drugih kandidata za ADDomer VLP vakcine dizajnirana je na analogan način. Testirane su dve vrste prikaza epitopa na površini ADDomera (Ograničen i Opušten, videti dole: tačka 7). Uočen je vremenski zavisan odgovor (od 0 do 6 nedelje). Prikazan je superiorni potencijal opuštenog oblika epitopa u odnosu na ograničeni oblik da izazove odgovor anti-Chik epitopa (Slika 12).
7. Ekspozicija epitopa od interesa na površini ADDomera
[0126] Dodavanje TEV mesta cepanja uzvodno od epitopa od interesa omogućava njegovo prikazivanje pod dve različite konfiguracije: ograničeno ili opušteno. Nakon prečišćavanja, epitopi su prirodno ograničeni u ADDomer petljama. Dodatkom TEV (Virus jetkanja duvana) proteaze (1/100 w:w) tokom 2H na sobnoj temperaturi, epitop se može opustiti i prikazati u linearnom obliku na površini skeleta. Efikasnost cepanja se lako prati pomoću SDS-PAGE. Treba napomenuti da ovo cepanje ne utiče na ukupni ADDomer skelet (slika 11).
[0127] 8. Proširenje kapaciteta insercije epitopa u ADDomer. Procenjen je kapacitet ADDomera da nosi veliku sekvencu epitopa. U tu svrhu, veštački epitop dužine 200 aminokiselina je ubačen u ADDomer (nazvan prošireni ADDomer). Ovo je rezultiralo ispravno samosastavljenim ADDomerom. Ubacivanje je potvrđeno i SDS-PAGE analizom i masenom spektroskopijom kao što je prikazano na slici 13.
9. Kovalentna veza epitopa na površini ADDomera
[0128] Da bi se proširio potencijal ADDomera, razvijen je sistem koji omogućava dodavanje dodatnih epitopa na ADDomer. Pojedinačni cisteini su umetnuti na specifičnu lokaciju ADDomer sekvence (bilo K363C ili Q476C ili A477C). K363C je dizajniran da formira kovalentni disulfidni most sa fibrilarnim fragmentom proteina dužine 20 aminokiselina (peptid C20 (SEQ ID NO: 77) izveden iz SEQ ID NO: 59) dok su Q476C ili A477C dizajnirani da urade isto sa drugim fibrilarnim fragmentom proteina (peptid C9 (SEQ ID NO: 75) izveden iz SEQ ID NO 60). Kovalentna interakcija peptida sa njihovim odgovarajućim Cys modifikovanim ADDomerom proverena je inkubacijom čestice sa njihovim odgovarajućim peptidom u oksidativnim uslovima (tj. odsustvo beta-merkaptoetanola) ili redukcionim uslovima (dodatak beta-merkaptoetanola). Kompleksi su provereni na SDS-PAGE i ADDomer je detektovan pomoću specifičnog antitela i sekundarnog antitela obeleženog sa Cy3, dok je biotinilovani peptid detektovan pomoću Alexa488 obeleženog avidina. Kada je korišćen pravi Cys-ADDomer/peptid, detektovano je prisustvo peptida na veličini ADDomer trake (krug na Slici 14). Ova interakcija je bila specifična za disulfidni most stvoren između Cys-ADDomera i peptida pošto je interakcija sprečena u redukcionim uslovima.

Claims (13)

Patentni zahtevi
1. Projektovani protomer baze pentona adenovirusa, pri čemu dati protomer baze pentona sadrži prvu RGD-petlju, drugu RGD-petlju, varijabilnu petlju (V petlju), rascep za vezivanje fibrilarnog proteina adenovirusa i/ili N-terminalni domen, i sadrži jedan ili više neadenovirusnih peptida ubačenih u prvu, drugu ili i u prvu i u drugu RGD-petlju; i opciono jedno ili više od sledećeg (i) najmanje jedan ciljno specifični domen vezivanja u prvoj, drugoj ili i u prvoj i u drugoj RGD-petlji, i/ili u V petlji; i/ili
(ii) neadenovirusni peptid na N- i/ili C-kraju protomera baze pentona; i/ili
(iii) najmanje jedan heterologni ostatak kuplovanja u prvoj, drugoj, ili i u prvoj i u drugoj RGD-petlji, u V petlji i/ili u N-terminalnom domenu protomera baze pentona, pri čemu je N-kraj N-terminalnog domena unutar protomera baze pentona definisan na sledeći način:
X1-G-R-N-S-I-R (SEQ ID NO: 44),
i C-kraj N-terminalnog domena unutar protomera baze pentona je definisan na sledeći način:
D-X2-R-S-R-G (SEQ ID NO: 45),
pri čemu
X1je izabran iz grupe koju čine G i E, i
X2je izabran iz grupe koju čine D i E; i/ili
(iv) lek, oznaka ili polipeptid koji je kovalentno ili nekovalentno kuplovan sa jednom ili više aminokiselina prve, druge ili i prve i druge RGD-petlje i/ili jednom ili više aminokiselina V petlje protomera baze pentona; i/ili
(v) najmanje jedan heterologni ostatak kuplovanja u rascepu za vezivanje fibrilarnog proteina adenovirusa protomera baze pentona,
pri čemu sledeća sekvenca definiše N-kraj prve RGD-petlje unutar protomera baze pentona:
X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-X10-X11(SEQ ID NO: 15)
pri čemu
X3je izabran iz grupe koju čine D, E i N, a poželjno je D;
X4je izabran iz grupe koju čine V, L i I, a poželjno je V;
X5je bilo koja aminokiselina, poželjno je izabrana iz grupe koju čine A, D, E, K, S i T, a poželjnije je T;
X6je bilo koja aminokiselina, poželjno je izabrana iz grupe koju čine A, D, E i K, a poželjnije je A;
X7je izabran iz grupe koju čine F, Y i W, a poželjno je Y;
X8je izabran iz grupe koju čine A, D, E, N i Q, poželjno je E ili Q, a poželjnije je E;
X9je bilo koja aminokiselina, poželjno izabrana iz grupe koju čine A, D, E, N i K, a poželjnije je E;
X10je izabran iz grupe koju čine S ili T, a poželjno je S; i
X11je bilo koja aminokiselina i čini N-terminalnu aminokiselinu prve RGD petlje; pri čemu sledeća sekvenca definiše C-kraj prve RGD-petlje i N-kraj druge RGD-petlje unutar protomera baze pentona:
X12-X13-X14-X15-X16(SEQ ID NO: 16)
pri čemu
X12je bilo koja aminokiselina i čini C-terminalnu aminokiselinu prve RGD petlje; X13je R;
X14je G;
X15je D; i
X16je bilo koja aminokiselina i čini N-terminalnu aminokiselinu druge RGD petlje;
pri čemu sledeća sekvenca definiše C-kraj druge RGD-petlje unutar protomera baze pentona:
X17-X18-X19-X20-X21-X22-X23-X24(SEQ ID NO: 17);
pri čemu
X17je bilo koja aminokiselina i čini C-terminalnu aminokiselinu druge RGD petlje;
X18je izabran iz grupe koju čine I, L i V, a poželjno je I;
X19R3 je izabran iz grupe koju čine D, E, K, N, Q i V, poželjno je Q ili K, a poželjnije je Q;
X20je izabran iz grupe koju čine C, G i P, a poželjno je P;
X21je izabran iz grupe koju čine I, L i V, poželjno je L ili V i poželjnije je L;
X22je izabran iz grupe koju čine D, E, S i T, poželjno je E ili T i poželjnije je E;
X23je izabran iz grupe koju čine D, E, K, S i T, poželjno je E, K ili T, a poželjnije je K; i X24je izabran iz grupe koju čine D i E, a poželjno je D;
i pri čemu je projektovani protomer baze pentona adenovirusa sposoban da se sklopi u VLP.
2. Projektovani protomer baze pentona adenovirusa prema zahtevu 1 koji dalje sadrži jedan ili više neadenovirusnih peptida u V-petlji.
3. Projektovani protomer baze pentona adenovirusa prema zahtevu 1 ili 2, pri čemu sledeća sekvenca definiše N-kraj V petlje:
X25-X26-X27-X28-X29-X30-X31-X32(SEQ ID NO: 18).
pri čemu
X25je izabran iz grupe koju čine F, Y i W, a poželjno je F;
X26je izabran iz grupe koju čine H, K i R, a poželjno je K;
X27je izabran iz grupe koju čine A, V, I i L, a poželjno je A;
X28je izabran iz grupe koju čine H, K i R, a poželjno je R;
X29je izabran iz grupe koju čine A, V, I i L, a poželjno je V;
X30je izabran iz grupe koju čine A, V, I, L i M, a poželjno je M;
X31je izabran iz grupe koju čine A, V, I i L, a poželjno je V; i
X32je bilo koja aminokiselina i čini N-terminalnu aminokiselinu V petlje; i/ili
sledeća sekvenca definiše C-kraj V petlje
X33-X34-X35-X36-X37-X38-X39(SEQ ID NO: 19)
pri čemu
X33je bilo koja aminokiselina i čini C-terminalnu aminokiselinu V petlje;
X34je izabran iz grupe koju čine F, Y i W, a poželjno je Y;
X35je izabran iz grupe koju čine D, E, S i T, poželjno je E ili T, a poželjnije je E; X36je izabran iz grupe koju čine F, Y i W, a poželjno je W;
X37je izabran iz grupe koju čine A, F, V, Y i W, poželjno je F ili V, a poželjnije je F;
X38je izabran iz grupe koju čine D, E, S i T, poželjno je D ili E, a poželjnije je E; i
X39je izabran iz grupe koju čine F, Y i W, a poželjno je F;
i/ili jedan ili više od sledećih nekontinuiranih peptida unutar protomera baze pentona formiraju rascep za vezivanje fibrilarnih proteina adenovirusa (podebljane aminokiseline direktno stupaju u interakciju sa vlaknima)
M-T-I-D-L-M-N-N-A-I-X40-X41-X42-YL- X43-X44-G-R-Q-X45-G-V-L-E-S (SEQ ID NO: 20);
W-D-P-X46-T-X47-X48-P-G (SEQ ID NO: 46);
X49-V-X50-X51-Y-X52-X53(SEQ ID NO: 47);
X54-X55-R-S-Y (SEQ II NO: 48); i/ili
L-T-X56-V-F-N-R-F-P-X57(SEQ ID NO: 49)
pri čemu
X40je izabran iz grupe koju čine V, I i L;
X41je izabran iz grupe koju čine E i D;
X42je izabran iz grupe koju čine H, N i Q, poželjno H i N;
X43je izabran iz grupe koju čine K, E, R, Q i A;
X44je izabran iz grupe koju čine V, L i I, poželjno V i I;
X45je izabran iz grupe koju čine H, N i Q, poželjno H i N;
X46je izabran iz grupe koju čine V, I, L, E ili D, poželjno V i E;
X47je izabran iz grupe koju čine V, L i I, poželjno V i I;
X48je izabran iz grupe koju čine M, T i S, poželjno M i T;
X49je izabran iz grupe koju čine D, E, N i Q, poželjno D i N;
X50je bilo koja aminokiselina, poželjno izabrana iz grupe koju čine A, D, P, K i T;
X51je izabran iz grupe koju čine A, D, E, K i R, poželjno A, E i K;
X52je izabran iz grupe koju čine D, E, L, I, Q i N, poželjno E, L i Q;
X53je izabran iz grupe koju čine A, D, E, K, N, Q i R, poželjno A, E, N i K;
X54je izabran iz grupe koju čine K, R, S i T, poželjno K, S i T;
X55je izabran iz grupe koju čine A, D, E, G, K, N, Q, R, S i T, poželjno D, G, K, N i S; X56je izabran iz grupe koju čine H, K i R, poželjno H i R; i
X57je izabran iz grupe koju čine D i E.
4. Projektovani protomer baze pentona adenovirusa prema bilo kom od zahteva 1 do 3, gde je jedan ili više neadenovirusnih polipeptida izabrano iz grupe koju čine imunogeni peptidi, peptidi za neutralisanje patogena, virusni peptidi, bakterijski peptidi, imunomodulirajući peptidi i peptidi raka.
5. Nukleinska kiselina koja kodira protomer baze pentona adenovirusa prema bilo kom od zahteva 1 do 4.
6. Ekspresioni vektor koji sadrži nukleinsku kiselinu prema zahtevu 5.
7. Rekombinantna ćelija domaćin koja sadrži ekspresioni vektor prema zahtevu 6.
8. Pentamer koji sadrži pet projektovanih protomera baze penton adenovirusa prema bilo kom od zahteva 1 do 4.
9. Virusu slična čestica (VLP) koja sadrži 12 pentamera prema zahtevu 8.
10. Postupak za proizvodnju projektovanog protomera baze pentona adenovirusa prema bilo kom od zahteva 1 do 4, koji sadrži korake:
(a) obezbeđivanja rekombinantne ćelije domaćina prema zahtevu 7;
(b) ekspresije projektovanog protomera baze pentona adenovirusa; i
(c) prečišćavanje projektovanog protomera baze pentona adenovirusa.
11. Postupak za proizvodnju VLP prema zahtevu 9, koji sadrži korake postupka prema zahtevu 10 i dalji korak omogućavanja projektovanim protomerima baze pentona adenovirusa da se sastave u VLP.
12. Farmaceutska kompozicija koja sadrži projektovane protomere baze pentona adenovirusa prema bilo kom od zahteva 1 do 4, nukleinsku kiselinu prema zahtevu 5, ekspresioni vektor prema zahtevu 6 ili VLP prema zahtevu 9, i farmaceutski prihvatljiv nosač i/ili pogodan ekscipijens(e).
13. Projektovani protomer baze pentona adenovirusa prema bilo kom od zahteva 1 do 4, nukleinska kiselina prema zahtevu 5, ekspresioni vektor prema zahtevu 6 ili VLP prema zahtevu 9 za upotrebu u lečenju i/ili prevenciji zarazne bolesti, imune bolesti ili raka.
RS20230209A 2016-03-31 2017-03-31 Protein adenoviralnog omotača izveden iz vehikuluma za isporuku RS64059B1 (sr)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP16163372 2016-03-31
PCT/EP2017/057747 WO2017167988A1 (en) 2016-03-31 2017-03-31 Adenoviral coat protein derived delivery vehicles
EP17715444.0A EP3436591B1 (en) 2016-03-31 2017-03-31 Adenoviral coat protein derived delivery vehicles

Publications (1)

Publication Number Publication Date
RS64059B1 true RS64059B1 (sr) 2023-04-28

Family

ID=55650297

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RS20230209A RS64059B1 (sr) 2016-03-31 2017-03-31 Protein adenoviralnog omotača izveden iz vehikuluma za isporuku

Country Status (17)

Country Link
US (2) US11274127B2 (sr)
EP (2) EP3436591B1 (sr)
JP (4) JP7466271B2 (sr)
CN (2) CN117534735A (sr)
CA (1) CA3018427C (sr)
DK (1) DK3436591T5 (sr)
ES (2) ES2941339T3 (sr)
FI (1) FI3436591T3 (sr)
HR (1) HRP20230197T1 (sr)
HU (2) HUE061690T2 (sr)
LT (1) LT3436591T (sr)
PL (1) PL3436591T3 (sr)
PT (1) PT3436591T (sr)
RS (1) RS64059B1 (sr)
SI (1) SI3436591T1 (sr)
SM (1) SMT202300106T1 (sr)
WO (1) WO2017167988A1 (sr)

Families Citing this family (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP3436591B1 (en) 2016-03-31 2023-01-04 The European Molecular Biology Laboratory Adenoviral coat protein derived delivery vehicles
CA3070040A1 (en) 2017-08-29 2019-03-07 Ruprecht-Karls-Universitat Heidelberg Rationally designed virus-like particles for modulation of chimeric antigen receptor (car)-t-cell therapy
US20210332088A1 (en) * 2018-07-31 2021-10-28 Imophoron Limited Multimerizing Polypeptides Derived From Jelly Roll Fold Domain of Adenovirus Penton Base
CA3166852A1 (en) * 2020-02-05 2021-08-12 Frederic Garzoni Engineered polypeptides derived from variable domain of adenovirus penton base
CN114617972B (zh) * 2020-12-11 2023-12-01 康希诺生物股份公司 一种药物组合物及其应用
WO2022218997A1 (en) 2021-04-12 2022-10-20 Centre National De La Recherche Scientifique (Cnrs) Novel universal vaccine presenting system
CN114805599B (zh) * 2022-03-29 2023-08-04 华南农业大学 一种基于ADDomer嵌合猪O型口蹄疫病毒抗原表位的VLPs及应用
WO2024042100A1 (en) 2022-08-22 2024-02-29 Imophoron Limited Adenovirus penton-based virus-like particles
WO2024192321A2 (en) * 2023-03-16 2024-09-19 Brown University Sulfine-based compounds for generating hydrogen persulfide
CN118459559B (zh) * 2024-07-10 2024-11-15 首都儿科研究所 用于制备多型腺病毒通用检测抗体的多肽、人工抗原、多克隆抗体及应用

Family Cites Families (17)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5582981A (en) 1991-08-14 1996-12-10 Gilead Sciences, Inc. Method for identifying an oligonucleotide aptamer specific for a target
EP0861329B1 (fr) * 1995-11-13 2005-03-16 Commissariat A L'energie Atomique Complexe proteique dodecaedrique adenoviral, composition le contenant et ses applications
WO1997020575A1 (en) * 1995-12-08 1997-06-12 The University Of Alabama At Birmingham Research Foundation Targeted adenovirus vectors
JP2003534806A (ja) * 2000-05-31 2003-11-25 ジェンベク、インコーポレイティッド アデノウイルスベクターのターゲティングの方法および組成物
WO2005075506A1 (en) * 2004-01-09 2005-08-18 The Scripps Research Institute Identification of endogenous trimerization domains in the adenovirus fiber protein that allow detargeting and retargeting of viral vectors
DK1711518T3 (da) 2004-01-23 2010-04-06 Angeletti P Ist Richerche Bio Vaccinebærere for chimpanse-adenovirus
WO2007027860A2 (en) * 2005-08-31 2007-03-08 Genvec, Inc. Adenoviral vector-based malaria vaccines
WO2007094653A1 (en) * 2006-02-13 2007-08-23 Vereniging Voor Christelijk Hoger Onderwijs, Wetenschappelijk Onderzoek En Patientenzorg Adenovirus particles having a chimeric adenovirus spike protein, use thereof and methods for producing such particles.
AU2010209938A1 (en) 2009-02-02 2011-08-25 Glaxosmithkline Biologicals Sa Simian adenovirus nucleic acid- and amino acid-sequences, vectors containing same, and uses thereof
PL222496B1 (pl) * 2009-04-10 2016-08-31 Inst Biochemii I Biofizyki Pan Wektorowa cząsteczka wirusopodobna, sposób jej wytwarzania oraz kompozycja farmaceutyczna zawierająca wektorową cząsteczkę wirusopodobną
PL222497B1 (pl) * 2009-06-26 2016-08-31 Inst Biochemii I Biofizyki Pan Wektorowa cząsteczka wirusopodobna, sposób jej wytwarzania, kompozycja farmaceutyczna oraz zastosowanie wektorowej cząsteczki wirusopodobnej
EP2563387B1 (en) * 2010-04-28 2014-02-26 Institut Gustave Roussy Medical use of adenovirus vaccine vectors
CA2863523A1 (en) * 2012-02-02 2013-08-08 Board Of Regents, The University Of Texas System Recombinant adenovirus expressing cancer antigens
WO2016118433A1 (en) * 2015-01-20 2016-07-28 Shayakhmetov Dmitry M Detargeted adenovirus variants and related methods
US11000559B2 (en) * 2015-04-30 2021-05-11 Psioxus Therapeutics Limited Oncolytic adenovirus encoding a B7 protein
GB201513176D0 (en) * 2015-07-27 2015-09-09 Glaxosmithkline Biolog Sa Novel methods for inducing an immune response
EP3436591B1 (en) 2016-03-31 2023-01-04 The European Molecular Biology Laboratory Adenoviral coat protein derived delivery vehicles

Also Published As

Publication number Publication date
SMT202300106T1 (it) 2023-05-12
JP2019512261A (ja) 2019-05-16
ES3044922T3 (en) 2025-11-27
PL3436591T3 (pl) 2023-06-26
HUE061690T2 (hu) 2023-08-28
HRP20230197T1 (hr) 2023-03-31
EP4190906B1 (en) 2025-08-20
EP3436591B1 (en) 2023-01-04
JP7466271B2 (ja) 2024-04-12
DK3436591T3 (da) 2023-03-20
US20200325179A1 (en) 2020-10-15
WO2017167988A1 (en) 2017-10-05
CN109415739A (zh) 2019-03-01
SI3436591T1 (sl) 2023-05-31
JP2022166109A (ja) 2022-11-01
EP3436591A1 (en) 2019-02-06
JP2022166110A (ja) 2022-11-01
US12122806B2 (en) 2024-10-22
EP4190906A1 (en) 2023-06-07
DK3436591T5 (da) 2024-09-16
EP4190906C0 (en) 2025-08-20
US20220162267A1 (en) 2022-05-26
CN117534735A (zh) 2024-02-09
ES2941339T3 (es) 2023-05-22
US11274127B2 (en) 2022-03-15
LT3436591T (lt) 2023-04-11
FI3436591T3 (fi) 2023-03-30
CA3018427C (en) 2025-11-18
PT3436591T (pt) 2023-04-11
JP2024160245A (ja) 2024-11-13
HUE072880T2 (hu) 2025-12-28
CA3018427A1 (en) 2017-10-05

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US12122806B2 (en) Adenoviral coat protein derived delivery vehicles
CN106573966B (zh) 用于治疗代谢异常的组合物和方法
AU2014301777A1 (en) High-stability T-cell receptor and preparation method and application thereof
KR20210110321A (ko) 접합된 바이러스-유사 입자 및 항-종양 면역 재유도제로서의 이의 용도
US11236132B2 (en) Nepovirus coat protein fusion polypeptides and their use
US20240228549A1 (en) Prefusion-stabilized lassa virus glycoprotein complex and its use
JP7801221B2 (ja) 流行性耳下腺炎ウイルスおよび麻疹ウイルスの免疫原およびそれらの使用
WO2024042100A1 (en) Adenovirus penton-based virus-like particles
TW201627005A (zh) 用於免疫作用中有效抗體生產的新穎蛋白質結構
CN106337038B (zh) 一种通过转肽酶剪切制备疫苗的方法及其应用
JP2023513512A (ja) アデノウイルス ペントンベースの可変ドメイン由来の操作されたポリペプチド
US20260077032A1 (en) KARI Nanoparticle
US20220372079A1 (en) Resurfaced dengue virus and ziki virus glycoprotein e diii variants and uses thereof
HK40005544A (en) Adenoviral coat protein derived delivery vehicles
CA2996463C (en) Nepovirus coat protein fusion polypeptides and their use
EP3347459B1 (en) Nepovirus coat protein fusion polypeptides and their use
WO2026019819A1 (en) Development and optimization of an mrna-vectored single-chain iga1 isotype monoclonal antibody to treat or prevent dengue virus infection
CN121568951A (zh) 冠状病毒刺突糖蛋白受体结合结构域及其用途