ES2941339T3 - Vehículos de suministro derivados de la proteína de la cubierta adenovírica - Google Patents

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Frédéric Garzoni
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Europaisches Laboratorium fuer Molekularbiologie EMBL
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Abstract

La presente invención se refiere a nuevos vehículos de administración a base de proteína de cubierta adenoviral. Se basan en protómeros de base de pentón modificados que se ensamblan en VLP. Las áreas expuestas de las proteínas de la base pentona pueden modificarse para permitir que la VLP se una específicamente a cualquier diana y/o comprenda cualquier epítopo peptídico deseado. La carga adicional, por ejemplo, fármacos, proteínas o ácidos nucleicos, puede unirse de forma reversible o irreversible a la VLP a través de fragmentos de proteína de fibra manipulados. La presente invención se refiere a dichos protómeros de base de pentón diseñados, proteínas diseñadas que comprenden un fragmento N-terminal de proteína de fibra de adenovirus que se une específicamente a una hendidura de unión de proteína de fibra de adenovirus de un protómero de base de pentón, (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN
Vehículos de suministro derivados de la proteína de la cubierta adenovírica
CAMPO TÉCNICO DE LA INVENCIÓN
La presente invención se refiere a un protómero de base pentónica de adenovirus genomodificado como se define en la reivindicación 1, a una VLP como se define en la reivindicación 9, que comprende el protómero de base pentónica de adenovirus genomodificado de la invención, a un ácido nucleico como se define en la reivindicación 5, que codifica el protómero de base pentónica de adenovirus genomodificado, así como a un método de producción del protómero de base pentónica de adenovirus genomodificado y a un método para producir la VLP como se define en las reivindicaciones 10 y 11, respectivamente.
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN
Las enfermedades infecciosas siguen asolando y diezmando poblaciones en todo el mundo. Entre los medios a nuestra disposición para contrarrestar esta amenaza, la vacunación ha demostrado ser excepcionalmente poderosa. La viruela ha sido erradicada, el sarampión, la poliomielitis y el tétanos expulsados del mundo por la vacunación. No obstante, graves amenazas siguen desafiando a la salud humana, en particular también de virus emergentes que se han adaptado y surgido como nuevas enfermedades o cepas patógenas con atributos que facilitan la patogenicidad. Ejemplos recientes de ello son la grave amenaza que suponen los virus de Chikungunya y Zika transmitidos por insectos a los seres humanos a través de la picadura de un mosquito. Ambos virus se están extendiendo rápidamente a Asia y Europa, a través de su mosquito hospedador, causando una alarma considerable. Las enfermedades de Chikungunya y Zika pueden suponer elevados costes a las comunidades y economías afectadas, y sería muy deseable contar con una potente estrategia de vacunación para contrarrestar esta amenaza emergente. Sin embargo, hasta la fecha se carece por completo de vacunas potentes.
Lo ideal sería, una vacuna que sea segura, no replicativa, eficaz y ajustable. Así mismo, debería producirse fácilmente a escala industrial. Las partículas similivíricas (VLP, por las siglas del inglés Virus Like Partióles) recombinantes, pueden ser esas vacunas ideales y, por lo tanto, ser muy prometedoras. En esta propuesta, se creará una vacuna de VLP de este tipo. Se utilizará una plataforma multiproteica biosimilar asombrosamente versátil denominada ADDomer (por las siglas del inglés adenovirus dodeoahedron derived multimer, multímero derivado del dodecaedro de adenovirus). ADDomer servirá para crear vacunas candidatas para combatir enfermedades infecciosas causadas por virus (incluidos, entre otros, Chikungunya, Zika, otros).
ADDomer es un armazón sintético derivado de una partícula similivírica (VLP) que se produce por naturaleza durante el ciclo de replicación del adenovirus humano serotipo 3 (HAd3) que cataliza la internalización (Fender, P., et al. (2012)/Virol 86, 5380-5385. ADDomer es un biosimilar diseñado derivado de esta VLP natural, que conserva la aptitud de autoensamblarse de forma autónoma en un dodecaedro. ADDomer es especialmente adecuado para presentar múltiples epítopos peptídicos y proteicos mediante bucles totalmente flexibles y expuestos a disolventes. La genomodificación de estos bucles no destruye la arquitectura global de las partículas ADDomer. Estos bucles ofrecen opciones convenientes para insertar, usando métodos de biología sintética, múltiples copias de epítopos peptídicos muy inmunogénicos, por ejemplo, de patógenos víricos. ADDomer no se limita al desarrollo de vacunas contra enfermedades infecciosas. Una amplia gama de aplicaciones se beneficiará posiblemente de la tecnología ADDomer, incluyendo también la terapia del cáncer. Así mismo, ADDomer no solo puede presentar epítopos peptídicos. ADDomer también puede exponer proteínas o dominios proteicos, ampliando significativamente el ámbito de su aplicación.
SUMARIO DE LA INVENCIÓN
Los presentes inventores han identificado que ciertas regiones localizadas en el protómero de base pentónica son susceptibles a la introducción de una secuencia peptídica heteróloga sin alterar el ensamblaje de protómeros de base pentónica en subunidades pentónicas, que a su vez pueden autoensamblarse en dodecámeros pentónicos formando partículas similivíricas (VLP), también conocidas como ADDomers. El diseño es muy modular y permite una funcionalización rápida y flexible de bucles extendidos para la presentación de multipolipéptidos. La modularidad se mejora aún más utilizando un fragmento de la proteína de fibra de adenovirus que se une específicamente al protómero de base pentónica. Las VLP de la presente invención son seguras ya que no comprenden material genético. Los protómeros de base pentónica pueden recibir y presentar hasta 180 motivos polipeptídicos exógenos, incluidos antígenos, polipéptidos neutralizantes, polipéptidos oncoepitópicos, anticuerpos monocatenarios y nanocuerpos. Por consiguiente, en un primer aspecto, la presente invención se refiere a un protómero de base pentónica de adenovirus genomodificado como se define en la reivindicación 1, en donde dicho protómero de base pentónica comprende un primer bucle RGD, un segundo bucle RGD, un bucle variable (bucle V), una hendidura de unión a la proteína fibra de adenovirus y/o un dominio N terminal, y comprende uno o más péptidos no adenovíricos insertados en el primer, el segundo o tanto en el primer como en el segundo bucle RGD; y opcionalmente comprende uno o más de lo siguiente:
(i) al menos un dominio de unión específico de diana en el primer, el segundo o tanto en el primer como en el segundo bucle RGD, y/o en el bucle V; y/o
(ii) un polipéptido no adenovírico en el extremo N y/o C del protómero de base pentónica; y/o
(iii) al menos un residuo de acoplamiento heterólogo en el primer, en el segundo o tanto en el primer como en el segundo bucle RGD, en el bucle V y/o en el dominio N terminal del protómero de base pentónica, en donde el extremo N del dominio N terminal dentro del protómero de base pentónica se define de la siguiente manera: Xi-G-R-N-S-l-R (SEQ ID NO: 44)
y el extremo C terminal del dominio N terminal dentro del protómero de base pentónica se define de la siguiente manera:
D-X2-R-S-R-G (SEQ ID NO: 45),
en donde
Xi se selecciona del grupo que consiste en G y E, y
X2 se selecciona del grupo que consiste en D y E; y/o
(iv) un fármaco o polipéptido acoplado de manera covalente o no covalente a uno o más aminoácidos del primer, del segundo o tanto del primer como del segundo bucle RGD y/o uno o más aminoácidos del bucle V del protómero de base pentónica; y/o
(v) al menos un residuo de acoplamiento heterólogo en la hendidura de unión a la proteína fibra de adenovirus del protómero de base pentónica
y en donde el polipéptido genomodificado del primer aspecto tiene la capacidad de ensamblarse en las VLP.
En un aspecto adicional, la presente invención se refiere a un ácido nucleico que codifica el protómero de base pentónica de adenovirus genomodificado de la invención.
En un aspecto adicional, la presente invención se refiere a un vector de expresión que comprende el ácido nucleico de la invención.
También se desvela un vector de clonación que codifica: (i) un polipéptido que comprende un protómero de base pentónica de adenovirus, en donde dicho protómero de base pentónica comprende un primer bucle RGD, un segundo bucle RGD, un bucle variable y/o un sitio de unión para la proteína de fibra de adenovirus adaptado para introducir ácidos nucleicos que codifican polipéptidos no adenovíricos en los ácidos nucleicos que codifican el primer bucle RGD, el segundo bucle RGD y/o el bucle variable; o
(ii) un polipéptido que comprende un fragmento de la proteína de fibra de unión al protómero de base pentónica de adenovirus adaptado para introducir ácidos nucleicos que codifican polipéptidos no adenovíricos en el extremo C y/o N.
En un aspecto adicional, la presente invención se refiere a una célula hospedadora recombinante que comprende el vector de expresión de la invención.
En un aspecto adicional, la presente invención se refiere a un pentámero que comprende cinco protómeros de base pentónica de adenovirus genomodificado de la invención.
En un aspecto adicional, la presente invención se refiere a una partícula similivírica (VLP) que comprende 12 pentámeros de la invención.
En un aspecto adicional, la presente invención se refiere a un método para producir el protómero de base pentónica de adenovirus genomodificado de la invención, que comprende las etapas de:
(a) proporcionar una célula hospedadora recombinante de la invención;
(b) expresar el protómero de base pentónica de adenovirus genomodificado de la invención; y
(c) purificar el protómero de base pentónica de adenovirus genomodificado de la invención.
Como se define en la reivindicación 11, la presente invención también proporciona un método para producir una VLP de la invención.
En un aspecto adicional, la presente invención se refiere a una composición farmacéutica que comprende el protómero de base pentónica de adenovirus genomodificado de la invención, el ácido nucleico de la invención, el vector de expresión de la invención o la VLP de la invención, y un transportador y/o excipiente(s) adecuado(s) farmacéuticamente aceptable(s).
En un aspecto adicional, la presente invención se refiere a un protómero de base pentónica de adenovirus genomodificado de la invención, al ácido nucleico de la invención, al vector de expresión de la invención o a la VLP de la invención, para su uso en el tratamiento y/o la prevención de una enfermedad infecciosa, una enfermedad inmunitaria o cáncer.
FIGURAS
Figura 1: Muestra los armazones multiméricos autoensamblables sintéticos de la invención también denominados VLP. Cinco (5) protómeros forman una subunidad pentónica y 12 pentones se autoensamblan espontáneamente en una gran superestructura que se denomina alternativamente v Lp o ADDomer.
Figura 2: Muestra una vista lateral del pentón. El protómero pentónico contiene dos bucles RGD muy heteromorfos y un bucle variable (bucle V) de longitud y secuencia no consensuadas muy variadas. A este respecto, los presentes inventores determinaron que eran similares a las CDR de los anticuerpos y adecuados para introducir sitios de unión que permitieran que la VLP resultante se uniera a cualquier diana deseada. Es adecuado para la presentación de múltiples epítopos y puede presentar hasta 180 epítopos por VLP.
Figura 3: El protómero de base pentónica comprende una región - un parche adhesivo - que interacciona con la proteína de fibra de adenovirus. Este parche adhesivo puede unirse con afinidad subnanomolar a fragmentos de la fibra adenovírica - también denominados "PEGATINA" (STICKER). Se prefiere que estos fragmentos de fibra se multimericen para aumentar la afinidad de unión. La etiqueta PEGATINAn (teniendo n preferentemente un valor de 2 a 4) puede fusionarse al extremo C y/o N de una proteína para unirla con la VLP o puede acoplarse de manera covalente o no covalente a cualquier otra carga. La etiqueta PEGATINAn, proporciona así la capacidad de presentar, en la superficie de los péptidos de VLP, proteínas, ácidos nucleicos, liposomas y cualquier otra carga a suministrar por la VLP. Un ADDomer tiene 12 sitios para unirse a una carga etiquetada con PEGATINA. En una realización, el parche adhesivo en el protómero de la base pentónica se modifica para que comprenda un residuo de acoplamiento, preferentemente una Cys y la etiqueta PEGTINAn también se modifica para que comprenda una Cys de manera que, en condiciones no reductoras, la Cys en el parche adhesivo y en la etiqueta PEGTINAn pueden formar un enlace covalente, que se romperá en condiciones reductoras.
Figura 4: Muestra esquemáticamente el proceso de producción de los ADDomer. Los ADDomer se producen con alto rendimiento, son fáciles de purificar y excepcionalmente estables. El vector pACEBac-ADDOMER tiene tres regiones que codifican el primer y segundo bucle RGD, así como el bucle V que se puede reemplazar fácilmente por cualquier cadena peptídica deseada, p. ej., por un péptido que confiera actividades de unión específicas y/o un epítopo antigénico.
Figura 5: El protómero de base pentónica comprende una región que interacciona con el protómero adyacente cuando se ensambla en el dodecaedro, conocido coma "intercambio de hebra". La mutación de residuos de aminoácidos relevantes a cisteínas puede dar lugar a la estabilización de la superestructura de VLP mediante la formación de enlaces disulfuro covalentes, haciendo que el ADDomer sea termoestable. Se muestra un esquema que representa residuos de intercambio de hebra mutados a cisteína.
Figura 6: Las secuencias indicadas están muy conservadas en toda la especie. La alineación muestra secuencias base pentónicas de tipo silvestre de diferentes serotipos naturales. Las secuencias mostradas son: Subgrupo C Ad2, número de referencia P03276; subgrupo B Ad3, S41389; subgrupo B Ad7, AAR89958; subgrupo B AdI I, AAP49205; subgrupo F Ad41, AAF14179; subgrupo A Adl2, P36716; subgrupo D Adl7, NP_049379; subgrupo E Ad25, NP_478405; y subgrupo D Ad37, CAC82544 alineadas. El bucle V se resalta con un recuadro gris oscuro; los bucles RGD se resaltan con un recuadro gris claro. Los residuos de aminoácidos del protómero de base pentónica que se unen a la fibra se resaltan con un gris intermedio. Todos ellos están conservados entre los serotipos.
Figuras 7 y 8: Se muestra la estructura de dos vectores de clonación preferidos de la presente invención. Las secuencias de ácido nucleico de los vectores de clonación se proporcionan respectivamente en SEQ ID NO: 61 y 62.
Figura 9: Casete de expresión Plug&Play y plásmido de transferencia de baculovirus. El gen que codifica el ADDomer se diseñó para insertar los "epítopos de interés" en tres locus distintos (en gris oscuro) flanqueados por sitios de restricción únicos. Este casete se insertó en BamHI/HindIII del plásmido pACEBac. La inserción de la biopieza (BioBrick) utilizando ECoRI/Rsrll, BssHIl/Sall o SacI Xbal del epítopo de interés, puede realizarse fácilmente en la construcción pACEBac-ADDomer2.0.
Figura 10: Termoestabilidad del ADDomer2.0. El ADDomer purificado se conservó a diferentes temperaturas y después se observó con microscopía electrónica. La conservación a temperatura ambiente o a 37 °C dio como resultado la conservación completa de la partícula. La disociación en bloques de construcción (pentámero) se observó solo a temperaturas superiores a 45 °C. El ensayo de desplazamiento térmico (TSA, thermal shift assay) confirmó la estabilidad hasta 37 °C, un inicio de disociación menor por encima de 45 °C, y una desnaturalización total solo mediante incubación a 60 °C.
Figura 11: Inserción del epítopo de Chikungunya y modo de presentación del epítopo, (a) En la parte superior se muestra la secuencia de aminoácidos incorporada en un bucle de presentación de ADDomer2.0 (SEQ ID NO: 78). Se insertó el epítopo neutralizante principal de Chikungunya (resaltado en gris oscuro). El extremo N del péptido contenía aminoácidos extra que codificaban un sitio de escisión del TEV (Tobacco Etch Virus, virus del grabado del tabaco) (resaltado en gris claro), (b) Las posibilidades de presentación del epítopo se explican esquemáticamente. La expresión da como resultado ADDomer-TevCHIK, en el que ambos extremos del péptido estaban unidos al armazón ADDomer ('epítopos restringidos'). La incubación con proteasa TEV liberó el extremo N del péptido en una configuración 'similar a la natural' ('epítopos relajados'), mientras se mantuvo completamente la integridad de la VLP de ADDomer (ahora con varias mellas). (c) La escisión se comprobó a lo largo del tiempo mediante análisis SDS-PAGE que muestra que el ADDomer intacto (de aproximadamente 60 kDa) se escinde de manera eficaz, y como era de esperar, en dos bandas de aproximadamente 43 y 17 kDa (izquierda). A pesar de la escisión, la microscopía electrónica confirmó que el armazón ADDomer no se destruyó (derecha).
Figura 12: ELISA de reconocimiento del epítopo CHIK con sueros de ratón. Tres grupos de ocho ratones, recibieron las semanas 2 y 4, s2 y s4, una inyección de 10 mg de armazón ADDomer solo (sin epítopo antigénico en los bucles de presentación del epítopo), ADDomer-TevCHIKexp (epítopo antigénico de CHIK "similar al natural" expuesto en bucles de presentación de epítopo, extremo N terminal libre como en la glucoproteína viva de Chikungunya, extremo C terminal unido de manera covalente al armazón) o ADDomer-TevCHIKrestrin (epítopo antigénico de CHIK "restringido" en el bucle de presentación del epítopo, extremos N y C terminales unidos al armazón ADDomer. Los sueros se recogieron cada dos semanas y se analizaron con respecto al reconocimiento del epítopo antigénico de CHIK (dilución 1/100). ADDomer-TevCHIKexp con epítopo expuesto similar al natural suscita de manera eficaz una respuesta.
Figura 13: ADDomer con bucle de presentación de epítopo tremendamente extendido. Se insertó un epítopo lineal que abarcaba 200 aminoácidos en los bucles de presentación del epítopo del armazón ADDomer y se comparó con el armazón ADDomer únicamente (sin inserción). La electroforesis en gel de poliacrilamida con dodecilsulfato sódico, SDS-PAGE (del inglés sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis), pone de manifiesto la inserción reflejada por el desplazamiento a un peso molecular más alto (izquierda). El análisis de espectroscopia de masas confirmó los pesos moleculares (63,573 Da del armazón ADDomer sin inserción; 81,179 Da para el ADDomer "extendido" que comprende la inserción de 200 aminoácidos extra en los bucles de presentación del epítopo.
Figura 14: Acoplamiento covalente del péptido "PEGATINA" con ADDomer que contiene mutaciones de cisteína dirigidas. El ADDomer de tipo silvestre (ts) y el ADDomer con una mutación de cisteína (K363C, Q476C o A477C, respectivamente), se incubaron con péptidos PEGATINA (C20 (SEQ ID NO: 77) y C9 (SEQ ID NO: 75), respectivamente). El análisis mediante SDS-PAGE se realizó en condiciones reductoras (+bMeSH) y no reductoras (-bMeSH) y se transfirió a una membrana de PVDF. El ADDomer (gris oscuro) y el péptido PEGATINA (gris claro) se visualizaron mediante la unión del anticuerpo marcado y la unión a Avidina, respectivamente, poniendo de manifiesto la unión de PEGATINA al ADDomer con mutaciones de cisteína mediante la formación de un enlace disulfuro específico (marcado con un círculo blanco en el panel inferior)
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN
Antes de describir la presente invención con detalle a continuación, debe entenderse que esta invención no se limita a la metodología, protocolos y reactivos particulares descritos en el presente documento, ya que estos pueden variar. También ha de entenderse que la terminología utilizada en el presente documento tiene la finalidad de describir únicamente realizaciones particulares. Salvo que se defina de otro modo, todos los términos técnicos y científicos utilizados en el presente documento tienen el mismo significado que entiende normalmente un experto habitual en la materia.
A continuación, se describirán los elementos de la presente invención. Estos elementos se enumeran con realizaciones específicas, sin embargo, debe entenderse que pueden combinarse de cualquier manera y en cualquier número para crear realizaciones adicionales. Los diferentes ejemplos descritos y las realizaciones preferidas, no deben interpretarse como una limitación de la presente invención únicamente a las realizaciones descritas explícitamente. Debe entenderse que esta descripción respalda y abarca realizaciones que combinan las realizaciones explícitamente descritas con cualquier número de los elementos desvelados y/o preferidos. Por otro lado, a menos que el contexto indique lo contrario, todas las permutaciones y combinaciones de todos los elementos descritos en esta solicitud, deben considerarse divulgadas por la descripción de la presente solicitud.
A lo largo del texto de esta memoria descriptiva se citan varios documentos.
DEFINICIONES
Para poner en práctica la presente invención, a menos que se indique lo contrario, se emplean métodos convencionales de química, bioquímica y técnicas de ADN recombinante que se explican en la bibliografía relacionado con el campo (consultar, p. ej., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2a edición, J. Sambrook et al. eds., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor 1989).
A lo largo de la presente memoria descriptiva y de las reivindicaciones que siguen, a menos que el contexto requiera lo contrario, el término "comprender" y variantes tales como "comprende(n)" y "que comprende(n)", se entenderá que implican la inclusión de un número entero o etapa o grupo de números enteros o etapas pero no la exclusión de cualquier otro número entero o etapa o grupo de números enteros o etapas expresados. Como se usa en la presente memoria descriptiva y en las reivindicaciones adjuntas, las formas en singular "un", "uno(a) y "el/la", incluyen referencias en plural, a menos que el contenido indique claramente lo contrario.
En el presente documento, el término "polinucleótido" y la expresión "ácido nucleico" se utilizan indistintamente y se entienden como una macromolécula polimérica u oligomérica constituida por monómeros de nucleótidos. Los monómeros de nucleótidos se componen de una nucleobase, un azúcar de cinco carbonos (tales como, entre otros, ribosa o 2'-desoxirribosa) y de uno a tres grupos fosfato. Habitualmente, se forma un polinucleótido a través de enlaces fosfodiéster entre los monómeros de nucleótidos individuales. En el contexto de la presente invención, las moléculas de ácido nucleico a las que se hace referencia incluyen, entre otros, ácido ribonucleico (ARN), ácido desoxirribonucleico (ADN), y mezclas de los mismos, tales como p. ej., híbridos de ARN-ADN. Los ácidos nucleicos, pueden sintetizarse, p. ej., químicamente, p. ej., según el método de fosfotriéster (véase, por ejemplo, Uhlmann, E. y Peyman, A. (1990) Chemical Reviews, 90, 543-584). Los "aptámeros" son ácidos nucleicos que se unen con gran afinidad a un polipéptido. Los aptámeros pueden aislarse mediante métodos de selección tales como SELEmirl46-a (véase, p. ej., Jayasena (1999) Clin. Chem., 45, 1628-50; Klug and Famulok(1994) M. Mol. Biol. Rep., 20, 97-107; US 5.582.981) de un gran grupo de diferentes moléculas de ARN monocatenario. Los aptámeros también pueden sintetizarse y seleccionarse en su forma de imagen especular, por ejemplo como el L-ribonucleótido (Nolte et al. (1996) Nat. BiotechnoL, 14, 1116-9; Klussmann et al. (1996) Nat. Biotechnol., 14, 1112-5). Las formas así aisladas tienen la ventaja de que no son degradadas por ribonucleasas naturales y, por lo tanto, poseen mayor estabilidad.
En el presente documento, los términos "proteína" y "polipéptido" se usan indistintamente y se refieren a cualquier cadena de aminoácidos unida por enlaces peptídicos, independientemente de su longitud o modificación postraduccional. Las proteínas utilizables en la presente invención (incluyendo derivados de proteínas, variantes de proteínas, fragmentos de proteínas, segmentos de proteínas, epítopos de proteínas y dominios de proteínas) pueden modificarse adicionalmente mediante modificación química. Esto significa que dicho polipéptido modificado químicamente comprende otros grupos químicos además de los 20 aminoácidos naturales. Como ejemplos de dichos otros grupos químicos se incluyen, sin limitación, aminoácidos glucosilados y aminoácidos fosforilados. Las modificaciones químicas de un polipéptido pueden proporcionar propiedades ventajosas en comparación con el polipéptido original, p. ej., uno o más de estabilidad mejorada, aumento de la semivida biológica o aumento de la solubilidad en agua.
La expresión "proteína de base pentónica" o "protómero de base pentónica", como se usa en el contexto de la presente invención, se refiere a una proteína adenovírica que se ensambla en la denominada "proteína pentónica". Cada proteína pentónica comprende cinco proteínas de base pentónica. La proteína pentónica es una de las tres proteínas que forman la cubierta de los adenovirus. Las otras proteínas son hexón y fibra. En el ángulo superior izquierdo de la Fig. 1 se muestra la estructura de un adenovirus ensamblado. Las proteínas de base pentónica que se utilizan en la presente invención se originan de adenovirus específicos de cualquier especie de mamífero. Preferentemente, el adenovirus es un adenovirus de un homínido humano o no humano, preferentemente de chimpancé (Pan), gorila (Gorilla) y orangután (Pongo), más preferentemente de bonobo (Pan paniscus) y chimpancé común (Pan troglodytes). El experto entiende que las proteínas de base pentónica de diferentes adenovirus variarán en cuanto a su secuencia de aminoácidos, quedando todas estas variantes de origen natural incluidas en la expresión "proteína de base pentónica". Adicionalmente, la expresión incluye variantes artificiales que comprenden inserciones, deleciones y/o mutaciones de la secuencia de la proteína de base pentónica de origen natural. Estas mutaciones se suman a las modificaciones del dominio N terminal, bucle V, primer y segundo bucle RGD y/o de la región de parche adhesivo que se describe más adelante con más detalle. Se incluye cualquiera de estas variantes artificiales siempre que la proteína de base pentónica modificada artificialmente se ensamble en subunidades pentónicas y 12 de éstas se ensamblen en las VLP. Preferentemente, las variantes artificiales tienen al menos un 75 %, más preferentemente al menos un 80 %, más preferentemente al menos un 85 %, más preferentemente al menos un 90 %, más preferentemente al menos un 92 %, más preferentemente un 94 %, más preferentemente un 96 % y más preferentemente un 98 % de identidad de secuencia con un protómero de base pentónica de origen natural fuera del dominio N terminal, el bucle V, el primer y segundo bucle RGD como se define a continuación. Las proteínas de base pentónica preferidas son las que se indican en las SEQ ID NO: 1 a 14. Las proteínas de base pentónica como se definen anteriormente son la base de las proteínas de base pentónica genomodificadas de la presente invención. Por tanto, las proteínas de base pentónica genomodificadas difieren en cuanto a la secuencia de las proteínas de base pentónica de origen natural por inserciones, deleciones y mutaciones de aminoácidos como se indica más adelante con más detalle.
La expresión de que el "polipéptido genomodificado tiene la capacidad de ensamblarse en las VLP" o "se ensambla en una VLP", como se usa indistintamente en el contexto de la presente invención, se refiere a la capacidad de cinco protómeros de base pentónica para autoensamblarse en una proteína pentónica y, posteriormente, de doce proteínas pentónicas para autoensamblarse en una partícula pequeña de forma esférica, es decir, una partícula similivírica (VLP). La capacidad para ensamblar y mantener la proteína pentónica, o preferentemente, la estructura de VLP puede determinarse mediante métodos conocidos en la técnica y descritos en el presente documento, en particular por microscopia electrónica (ME). Las condiciones preferidas en las que se evalúa la capacidad de ensamblarse en las VLP son 20 °C y condiciones de tampón fisiológico. En una realización adicional preferida, la expresión incluye polipéptidos genomodificados que no solo se ensamblan en las VLP, sino que también mantienen la forma esférica a temperaturas superiores a 20 °C, preferentemente a temperaturas superiores a 30 °C, preferentemente a temperaturas superiores a 40 °C, más preferentemente superiores a 45 °C e incluso más preferentemente superiores a 50 °C. La integridad de la forma esférica puede evaluarse mediante ME, preferentemente en condiciones de tampón fisiológico.
La expresión "primer bucle RGD", como se usa en el contexto de la presente invención, se refiere a una secuencia polipeptídica de entre 10 a 40 aminoácidos que está ubicada en el N terminal del "motivo RGD comprendido en el protómero pentónico (véase la Fig. 6). Esta secuencia polipeptídica es muy divergente entre diferentes adenovirus. Por consiguiente, no puede definirse por homología, pero se define según la invención por la secuencia que está ubicada en el N terminal de su extremo N terminal como se caracteriza en la reivindicación 1. Como se define en la reivindicación 1, su extremo C terminal dentro del protómero pentónico está determinado por el motivo RGD.
El término "segundo bucle RGD", como se usa en el contexto de la presente invención, se refiere a una secuencia polipeptídica de entre 10 a 35 aminoácidos que está ubicada en el C terminal del "motivo RGD comprendido en el protómero pentónico (véase la Fig. 6). Esta secuencia polipeptídica es muy divergente entre diferentes adenovirus. Por consiguiente, no se puede definir por homología de secuencia. Como se define en la reivindicación 1, su extremo N terminal dentro del protómero pentónico está determinado por el motivo RGD. Como se caracteriza en la reivindicación 1, su extremo C terminal dentro del protómero se define por la secuencia que está ubicada en el C terminal de su extremo C terminal, que se conserva entre diferentes adenovirus.
El término "motivo RGD" como se usa en el contexto de la presente invención, se refiere a un polipéptido de tres aminoácidos de longitud compuesto por arginina, glicina y ácido aspártico. Este motivo se identificó originalmente en la fibronectina como mediador de la unión a las integrinas. El motivo RGD también está presente en muchos otros receptores y actúa como mediador en las interacciones célula-sustrato y célula-célula. El motivo RGD en los protómeros pentónicos de los polipéptidos genomodificados de la presente invención, puede estar intacto o puede estar mutado de manera que el protómero pentónico ya no se una a las integrinas.
El término "bucle variable" como se usa en el contexto de la presente invención, corresponde a una secuencia ubicada entre la lámina beta, lámina b3 y la lámina beta b4 de la base pentónica del adenovirus. Tanto la longitud como la composición de los aminoácidos de este bucle son muy variables entre los serotipos. Las secuencias correspondientes a los bucles variables se resaltan en verde en la Figura 6. La expresión "dominio N terminal", como se usa en el contexto de la presente invención, se refiere a una región muy conservada en el extremo N del protómero de base pentónica. Esta parte de la proteína comprende las hélices al y a2, las láminas B1 y B2, así como el dominio B y C (véase la Figura 6). Interviene en la interacción entre los protómeros de base pentónica y, por tanto es adecuada para la introducción de restos, p. ej., residuos de acoplamiento, que estabilizan la interacción entre los protómeros de base pentónica.
La expresión "hendidura de unión a la proteína fibra de adenovirus", como se usa en el contexto de la presente invención, se refiere a un pliegue de un protómero de base pentónica que forma la superficie de interacción con la proteína fibra de adenovirus. Como puede observarse en la Fig. 6, la hendidura de unión está formada por varios tramos no contiguos de secuencia polipeptídica que se conservan entre diferentes adenovirus.
La expresión "dominio de unión específico de diana", como se usa a lo largo de la memoria descriptiva, se refiere a un polipéptido que facilita la unión específica a una diana. Se considera que la unión de dicho dominio de unión específico de diana es específica para una diana dada, si se une con mayor afinidad a la diana respectiva y solo con menor afinidad, p. ej., con una afinidad al menos 10 veces menor, preferentemente al menos 100 veces menor a otras dianas, incluso a dianas con una secuencia de aminoácidos relacionada.
El término "diana", como se usa en la presente invención, se refiere a una estructura celular o molecular natural existente hacia la cual las moléculas tienen una cierta afinidad de unión o con la cual las moléculas se unen específicamente. Una diana puede comprender uno o más epítopos. Un antígeno es un ejemplo preferido de una diana.
El término "antígeno", como se usa en el contexto de la presente invención, se refiere a cualquier estructura reconocida por moléculas de la respuesta inmunitaria, p. ej., anticuerpos, receptores de linfocitos T (RLT) y similares. Un antígeno puede ser extraño o tóxico para el organismo o puede ser una proteína celular asociada a una enfermedad particular. Los antígenos son reconocidos por receptores de antígenos muy variables (receptor de células B o receptor de células T) del sistema inmunitario adaptativo y pueden suscitar una respuesta inmunitaria humoral o celular. Los antígenos que suscitan dicha respuesta también recibe el nombre de inmunógenos. Una fracción de las proteínas dentro de las células, independientemente de que sean extrañas o celulares, se procesa en péptidos más pequeños y se presentan por el complejo mayor de histocompatibilidad (CMH). Si el pequeño fragmento peptídico está unido por un receptor de linfocitos T, se suscita una respuesta inmunitaria celular. Los antígenos de la superficie celular pueden seleccionarse del grupo de receptores de citocinas, integrinas, moléculas de adhesión celular, antígeno de superficie celular específico del tipo de célula, antígeno de superficie celular específico de tejido, antígeno asociado a tumor expresado en la superficie celular, grupo de antígenos de diferenciación, o hidratos de carbono. La expresión "unión específica", como se usa en el contexto de la presente invención, significa que un resto de unión (p. ej., un anticuerpo) se une con mayor fuerza a una diana, tal como un epítopo, para el que es específico en comparación con la unión a otra diana si se une a la primera diana con una constante de disociación (Kd) que es menor que la constante de disociación de la segunda diana. Las dianas pueden reconocerse por sus ligandos que se unen con cierta afinidad a sus dianas y, por tanto, la unión del ligando con su diana respectiva da como resultado un efecto biológico. Preferentemente, la unión es específica y se produce con una alta afinidad, preferentemente con una Kd inferior a 10"7, 10"8, 10"9, 10"10 M o menor. Dicha afinidad se mide preferentemente a 37 °C. Los ensayos adecuados incluyen mediciones de resonancia de plasmón superficial (p. ej., Biacore), mediciones con microbalanza de cristal de cuarzo (p. ej., Attana) y ensayos de competición.
El término "anticuerpos", como se usa en el contexto de la presente invención, se refiere a glucoproteínas que pertenecen a la superfamilia de las inmunoglobulinas; los términos anticuerpo e inmunoglobulina a menudo se usan indistintamente. Un anticuerpo se refiere a una molécula de proteína producida por las células plasmáticas y el sistema inmunitario lo utiliza para identificar y neutralizar objetos extraños tales como bacterias y virus. El anticuerpo reconoce una parte única de la diana extraña, su antígeno.
La expresión "fragmento de anticuerpo", como se utiliza en el presente documento, se refiere a uno o más fragmentos de un anticuerpo que conservan la capacidad de unirse específicamente a un antígeno. Los ejemplos de fragmentos de unión incluidos en la expresión "fragmento de anticuerpo" incluyen un fragmento de unión a antígeno (Fab), un fragmento Fab', un fragmento F(ab')2, un anticuerpo de cadena pesada, un anticuerpo de un solo dominio (sdAb), una variable de fragmento monocatenario (scFv), una variable de fragmento (Fv), un dominio VH, un dominio VL, un anticuerpo de dominio único, un nanocuerpo, un IgNAR (inmunoglobulina con nuevo receptor de antígeno), un di-scFv, un acoplador biespecífico de linfocitos T (BITE), una molécula de redireccionamiento de doble afinidad (DART), un triple cuerpo, un diacuerpo, un diacuerpo monocatenario, una proteína estructural alternativa y una proteína de fusión de la misma.
El término "diacuerpo", tal como se utiliza en esta memoria descriptiva, se refiere a una proteína de fusión o a un anticuerpo bivalente que puede unirse a diferentes antígenos. Un diacuerpo se compone de dos cadenas de proteínas individuales que comprenden fragmentos de un anticuerpo, en concreto, fragmentos variables. Los diacuerpos comprenden un dominio variable de cadena pesada (VH, heavy chain) conectado a un dominio variable de cadena ligera (VL, light chain) en la misma cadena polipeptídica (VH-VL o VL-VH). Utilizando un péptido corto que conecte los dos dominios variables, los dominios se ven obligados a emparejarse con el dominio complementario de otra cadena y, por tanto, a crear dos sitios de unión al antígeno. Los diacuerpos pueden dirigirse al mismo antígeno (monoespecíficos) o a diferentes antígenos (biespecíficos).
La expresión "anticuerpo de un solo dominio", como se usa en el contexto de la presente invención, se refiere a fragmentos de anticuerpo que consisten en un solo dominio variable monomérico de un anticuerpo. Simplemente, solo comprenden las regiones variables monoméricas de cadena pesada de los anticuerpos de cadena pesada producidos por camélidos o peces cartilaginosos. Debido a sus diferentes orígenes, también se denominan fragmentos VHH o VNAR (nuevo receptor de antígeno variable). Como alternativa, los anticuerpos de un solo dominio pueden obtenerse mediante la monomerización de dominios variables de anticuerpos de ratón o humanos convencionales utilizando genomodificación. Muestran una masa molecular de aproximadamente 12-15 kDa y por tanto, son los fragmentos de anticuerpo más pequeños capaces de reconocer antígenos. Otros ejemplos incluyen nanocuerpos o nanoanticuerpos.
La expresión "anticuerpo mimético", como se usa en el contexto de la presente memoria descriptiva, se refiere a compuestos, similares a un anticuerpo, que pueden unirse específicamente a antígenos, pero que no están relacionados estructuralmente con los anticuerpos. Normalmente, los miméticos de anticuerpos son péptidos o proteínas artificiales con una masa molar de aproximadamente 3 a 20 kDa que comprenden uno, dos o más dominios expuestos que se unen específicamente a un antígeno. Los ejemplos incluyen, entre otros, LACI-D1 (inhibidor de la coagulación asociado a lipoproteínas); afilinas, p. ej., ubiquitina humana-y B cristalina o humana; cistatina; Sac7D de Sulfolobus acidocaldarius; lipocalina y anticalinas derivadas de lipocalinas; DARPins (dominios con repeticiones de anquirina diseñados); dominio SH3 de Fyn; dominios de Kunit de inhibidores de proteasa; monocuerpos, p. ej., el 10° dominio de tipo III de fibronectina; adnectinas: knotinas (miniproteínas de nudos de cisteína); atrímeros; evicuerpos, p.ej., aglutinantes basados en CTLA4, aficuerpos, p.ej. haz de tres hélices del dominio Z de la proteína A de Staphylococcus aureus; transcuerpos, p.ej., transferrina humana; tetranectinas, p.ej., dominio de lectina de tipo C humano monomérico o trimérico; microcuerpos, p.ej., inhibidor II de tripsina; afilinas; proteínas con repeticiones de armadillo. Los ácidos nucleicos y las moléculas pequeñas a veces también se consideran miméticos de anticuerpos (aptámeros), pero no anticuerpos artificiales, fragmentos de anticuerpo y proteínas de fusión compuestas por estos. Las ventajas comunes sobre los anticuerpos son una mejor solubilidad, penetración tisular, estabilidad frente al calor y las enzimas, y costes de producción comparativamente bajos.
Como se utiliza en el presente documento, el término "Kd" (normalmente medido en "mol/l", a veces abreviado como "M") se refiere a la constante de equilibrio de disociación de la interacción particular entre un resto de unión (p. ej., un anticuerpo o fragmento del mismo) y una molécula diana (p. ej., un antígeno o un epítopo del mismo). Los métodos para determinar la Kd incluyen, sin limitación, ensayos ELISA y de resonancia de plasmón superficial.
El término "epítopo", también conocido como determinante antigénico, como se usa en el contexto de la presente invención, es la parte de una macromolécula que reconoce el sistema inmunitario, específicamente los anticuerpos, los linfocitos B o los linfocitos T. Como se utiliza en el presente documento, un "epítopo" es la parte de una macromolécula capaz de unirse a un anticuerpo (p. ej., un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo) como se describe en el presente documento. Los epítopos consisten habitualmente en agrupaciones de moléculas de superficie químicamente activas, tales como cadenas laterales de aminoácidos o glucídicas y, normalmente, tienen características estructurales tridimensionales específicas, así como características de carga específicas. Los epítopos conformacionales y no conformacionales pueden distinguirse en que la unión a los primeros, pero no a los segundos, se pierde en presencia de disolventes desnaturalizantes.
Como se utiliza en el presente documento, un "epítopo conformacional" se refiere a un epítopo de una macromolécula lineal (p. ej., un polipéptido) que está formado por la estructura tridimensional de dicha macromolécula. En el contexto de la presente solicitud, un "epítopo conformacional" es un "epítopo discontinuo", es decir, el epítopo conformacional de la macromolécula (p. ej., un polipéptido) que se forma a partir de al menos dos regiones distintas en la secuencia primaria de la macromolécula (p. ej., la secuencia de aminoácidos de un polipéptido). En otras palabras, en el contexto de la presente invención, se considera que un epítopo es un "epítopo conformacional", si el epítopo consiste en al menos dos regiones distintas en la secuencia primaria a las que se une simultáneamente un anticuerpo de la invención (o un fragmento de unión a antígeno del mismo), en donde estas al menos dos regiones distintas están interrumpidas por una o más regiones en la secuencia primaria a la que no se une un anticuerpo de la invención (o un fragmento de unión a antígeno del mismo). Preferentemente, dicho "epítopo conformacional" está presente en un polipéptido, y las dos regiones distintas en la secuencia primaria son dos secuencias de aminoácidos distintas a las que se une un anticuerpo de la invención (o un fragmento de unión a antígeno del mismo), en donde estas al menos dos secuencias de aminoácidos distintas están interrumpidas por una o más secuencias de aminoácidos en la secuencia primaria a la que no se une un anticuerpo de la invención (o un fragmento de unión a antígeno del mismo). Preferentemente, la secuencia de aminoácidos de interrupción es una secuencia de aminoácidos contigua que comprende dos o más aminoácidos a los que no se une el anticuerpo (o el fragmento de unión a antígeno del mismo). Las al menos dos secuencias de aminoácidos distintas a las que se une un anticuerpo de la invención (o un fragmento de unión a antígeno del mismo) no están particularmente limitadas con respecto a su longitud. Dicha secuencia de aminoácidos distinta puede consistir en un solo aminoácido siempre que el número total de aminoácidos dentro de dichas al menos dos secuencias de aminoácidos distintas sea lo suficientemente grande para efectuar la unión específica entre el anticuerpo (o el fragmento de unión al antígeno del mismo) y el epítopo conformacional.
La expresión "proteína fibra de adenovirus", como se usa en el contexto de la presente invención, se refiere a una proteína adenovírica que se une de manera no covalente a un protómero pentónico y ayuda a la adhesión del adenovirus a la célula hospedadora.
La expresión "identidad de secuencia" se usa a lo largo de la memoria descriptiva con respecto a las comparaciones de secuencias de polipéptidos y polinucleótidos. En caso de que se comparen dos secuencias y no se especifique la secuencia de referencia en comparación con la que se calculará el porcentaje de identidad de secuencia, la identidad de secuencia debe calcularse con referencia a la más larga de las dos secuencias a comparar, si no se indica específicamente lo contrario. Si se indica la secuencia de referencia, la identidad de secuencia se determina basándose en la longitud completa de la secuencia de referencia indicada por SEQ ID, si no se indica específicamente lo contrario. Por ejemplo, una secuencia polipeptídica que consiste en 200 aminoácidos en comparación con una secuencia polipeptídica de referencia de 300 aminoácidos de longitud, puede mostrar un porcentaje máximo de identidad de secuencia del 66,6 % (200/300), mientras que una secuencia con una longitud de 150 aminoácidos puede mostrar un porcentaje máximo de identidad de secuencia del 50 %> (150/300). Si 15 de esos 150 aminoácidos son diferentes de los aminoácidos respectivos de la secuencia de referencia larga de 300 aminoácidos, el nivel de identidad de secuencia disminuye al 45 %. La similitud de las secuencias de nucleótidos y aminoácidos, es decir, el porcentaje de identidad de secuencia, puede determinarse mediante alineaciones de secuencia. Dichas alineaciones pueden realizarse con varios algoritmos conocidos en la técnica, preferentemente con el algoritmo matemático de Karlin y Altschul (Karlin & Altschul (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 5873-5877), con hmmalign (paquete HMMER, http://hmmer.wustl.edu/) o con el algoritmo CLUSTAL (Thompson, J. D., Higgins, D. G. y Gibson, T. J. (1994) Nucleic Acids Res. 22, 4673-80) disponible, p. ej., en http://www.ebi.ac.uk/Tools/clustalw/ o en http://www.ebi.ac.uk/Tools/clustalw2/index.html o en http://npsa-pbil.ibcp.fr/cgibin/npsa_automat.pl?page=/NPSA/npsa_clustalw.html. Los parámetros preferidos que se utilizan son los parámetros predeterminados tal como se establecen en http://www.ebi.ac.uk/Tools/clustalw/ o en http://www.ebi.ac.uk/Tools/clustalw2/index.html. El grado de identidad de secuencia (emparejamiento de secuencias) puede calcularse usando, p. ej., BLAST, BLAT o BlastZ (o BlastX). Un algoritmo similar está incorporado en los programas BLASTN y BLa St P de Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215: 403-410. Las búsquedas de polinucleótidos con BLAST se realizan con el programa BLASTN, puntuación = 100, longitud de palabra = 12. Las búsquedas de proteínas con BLAST se realizan con el programa BLASTP, puntuación = 50, longitud de palabra = 3. Para obtener alineaciones con huecos con fines comparativos, puede utilizarse Gapped BLAST como se describe en Altschul et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25: 3389-3402. Cuando se utilizan los programas BLAST y Gapped BLAST, se utilizan los parámetros predeterminados de los respectivos programas. El análisis de emparejamiento de secuencias puede complementarse con técnicas de mapeo de homología establecidas como Shuffle-LAGAN (Brudno M., Bioinformatics 2003b, 19 Supl 1: 154-162) o campos aleatorios de Markov. Cuando en la presente solicitud se hace referencia a los porcentajes de identidad de secuencia, estos porcentajes se calculan en relación con la longitud total de la secuencia más larga, si no se indica específicamente lo contrario. La "hibridación" también puede utilizarse como una medida de identidad u homología de secuencia entre dos secuencias de ácido nucleico. Una secuencia de ácido nucleico que codifica las proteínas F, N o M2-1, o una parte de cualquiera de estas, puede usarse como sonda de hibridación según técnicas de hibridación estándar. Los expertos en la materia saben cuáles son las condiciones de hibridación y pueden encontrarse, por ejemplo, en Current Protocols en Molecular Biology, John Wiley & Sons, N. Y., 6.3.1-6.3.6, 1991. Las "condiciones de hibridación moderadas" se definen como equivalentes a la hibridación en 2X cloruro sódico/citrato sódico (SSC) a 30 °C, seguido de un lavado en 1X SSC, SDS al 0,1 % a 50 °C. Las "condiciones muy rigurosas" se definen como equivalentes a la hibridación en 6X cloruro sódico/citrato sódico (SSC) a 45 °C, seguido de un lavado utilizando 0,2 X SSC, SDS al 0,1 % a 65 °C.
La expresión "residuo de acoplamiento", como se usa en el contexto de la presente invención, se refiere a un aminoácido natural o no natural que tiene una cadena lateral, capaz de formar un enlace covalente. Los residuos de acoplamiento pueden insertarse en un polipéptido de la presente invención. Si el residuo de acoplamiento es un aminoácido de origen natural que está codificado por ADN, la inserción de un residuo de acoplamiento simplemente requiere la modificación del ADN que dirige la expresión del polipéptido de la invención, p. ej., la inserción de un codón que codifica dicho aminoácido o la mutación de un codón existente. Son ejemplos preferidos de aminoácidos de origen natural, que son residuos de acoplamiento en el sentido de este término, Asp, Glu, Lys y Cys. Se prefiere particularmente la cisteína, Cys, ya que formará un enlace disulfuro con otra Cys dependiendo del estado redox del entorno. En particular, esta última permite la formación de una interconexión estable entre dos polipéptidos distintos.
El término "marcador", como se usa en el contexto de la presente invención, se refiere a cualquier tipo de compuesto que es adecuado con fines de diagnóstico. Los compuestos preferidos se seleccionan de un colorante fluorescente, un radioisótopo y un agente de contraste. Un agente de contraste es un colorante u otra sustancia que ayuda a mostrar zonas anómalas dentro del organismo. En una realización, el término marcador se refiere a un compuesto que comprende un agente quelante que forma un complejo con cationes metálicos divalentes o trivalentes. Los radioisótopos/isótopos emisores de fluorescencia preferidos se seleccionan del grupo que consiste en isótopos emisores de radiación alfa, isótopos emisores de radiación gamma, Isótopos emisores de electrones Auger, isótopos emisores de rayos X, isótopos emisores de fluorescencia, tales como 18 F, 51 Cr, 67 Ga, 68 Ga, m In, 99m Tc, 140 La, 175 Yb, 153 Sm, 166 Ho, 88 Y, 90 Y, 149 Pm, 177 Lu, 47 Sc, 142 Pr, 159 Gd, 212 Bi, 72 As, 72 Se, 97 Ru, 109 Pd, 105 Rh, 101ml5 Rh, 119 Sb, 128 Ba, 1231, 1241, 131 1, 197 Hg, 211 At, 169 Eu, 203 Pb, 212 Pb, 64 Cu, 67 Cu, 188 Re, 186 Re, 198 Au and 199 Ag. Los colorantes fluorescentes preferidos se seleccionan de las siguientes clases de colorantes: Xantenos (p. ej., Fluoresceína), Acridinas (p. ej., Amarillo de Acridina), Oxazinas (p. ej., Oxazina 1), Cininas (p. ej., Cy7 I Cy 3), Colorantes estirílicos (p. ej., Colorante-28), Cumarinas (p. ej., Alexa Fluor350), Porfirinas (p. ej, Clorofila B), Complejos de metal-ligando (p. ej., PtOEPK), Proteínas fluorescentes (p. ej., APC, R-Ficoeritrina), Nanocristales (p. ej., QuantumDot705), Perilenos (p. ej., Lumogen Red F300) y Ftalocianinas (p. ej., IRDYE™700DX), así como conjugados y combinaciones de estas clases de colorantes. Los agentes de contraste preferidos se seleccionan de agentes paramagnéticos, p. ej., Gd, Eu, W y Mn, preferentemente formando un complejo con un agente quelante. Otras opciones son los complejos y partículas de hierro (Fe) supramagnético, compuestos que contienen átomos de alto número atómico, es decir, yodo para tomografía computarizada (TC), microburbujas y transportadores tales como liposomas que contienen estos agentes de contraste.
El término "fármaco" debe entenderse en el contexto de la presente invención, en su sentido más amplio, que se refiere a cualquier compuesto que provoque un efecto profiláctico, terapéutico o paliativo en un paciente. Preferentemente, es una molécula pequeña, p. ej. con un tamaño molecular por debajo de 500 D.
Un "enlazador" en el contexto de la presente invención se refiere a cualquier resto químico que sea flexible y separe estéricamente dos restos químicos, p. ej. un polipéptido genomodificado del primer aspecto de la invención a partir de un fármaco o marcador. Los enlazadores preferidos son restos que tienen una relación de longitud a anchura de al menos 10: 1, preferentemente, de al menos 20: 1, más preferentemente de al menos 50: 1. Preferentemente, los enlazadores son moléculas lineales. Se prefiere que los dos restos unidos por un enlazador estén unidos de manera covalente o no covalente, preferentemente de manera covalente, a los extremos respectivos del enlazador.
Un "enlazador peptídico", en el contexto de la presente invención, se refiere a una secuencia de aminoácidos, es decir, a un polipéptido, que separa estéricamente dos partes dentro de los polipéptidos genomodificados de la presente invención. Habitualmente, dicho enlazador consiste en entre 1 y 100, preferentemente de 3 a 50, más preferentemente de 5 a 20 aminoácidos. Por tanto, dichos enlazadores tienen una longitud mínima de al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 o 30 aminoácidos, y una longitud máxima de al menos 100, 95, 90, 85, 80, 75, 70, 65, 60, 55, 50, 45, 40, 35, 34, 33, 32, 31, 30, 29, 28, 27, 26, 25,24,23,22,21,20, 19, 18, 17, 16 o 15 aminoácidos o menor. Los enlazadores peptídicos también pueden proporcionar flexibilidad entre las dos partes que están unidas entre sí. Esta flexibilidad generalmente aumenta, si los aminoácidos son pequeños. Por consiguiente, los enlazadores peptídicos flexibles comprenden un mayor contenido de aminoácidos pequeños, en particular de glicinas y/o alaninas, y/o aminoácidos hidrófilos tales como serinas, treoninas, asparaginas y glutaminas. Preferentemente, más del 20 %, 30 %>, 40 %>, 50 %>, 60 %> o más de los aminoácidos del enlazador peptídico son aminoácidos pequeños.
Los términos "preparación" y "composición" pretenden incluir la formulación del compuesto activo, p.ej., las VLP de la presente invención con un transportador y/o excipiente.
"Farmacéuticamente aceptable" significa aprobado por una agencia reguladora del gobierno federal o de un estado o registrado en la farmacopea de Estados Unidos u otra farmacopea generalmente reconocida para su uso en animales y, más particularmente, en seres humanos. El término "transportador", como se utiliza en el presente documento, se refiere a una sustancia farmacológicamente inactiva tal como, entre otras, un diluyente, excipiente, tensioactivos, estabilizantes, soluciones tampón fisiológicas o vehículos con los que se administra el principio terapéuticamente activo. Dichos transportadores farmacéuticos pueden ser líquidos o sólidos. Como transportadores líquidos se incluyen, pero sin limitación, líquidos estériles, tales como soluciones salinas en agua y aceites, incluyendo, pero sin limitación, los de origen petrolífero, animal, vegetal o sintético, tales como aceite de cacahuete, aceite de soja, aceite mineral, aceite de sésamo y similares. Como transportadores líquidos también pueden emplearse soluciones salinas y soluciones acuosas de dextrosa y glicerol, particularmente para soluciones inyectables. Una solución salina es un transportador preferido cuando la composición farmacéutica se administra por vía intravenosa. En "Remington's Pharmaceutical Sciences" de E. W. Martin, se describen ejemplos de transportadores farmacéuticos adecuados. Como "excipientes" farmacéuticos adecuados se incluyen almidón, glucosa, lactosa, sacarosa, gelatina, malta, arroz, harina, creta, gel de sílice, estearato sódico, monoestearato de glicerol, talco, cloruro sódico, leche desnatada en polvo, glicerol, propileno, glicol, agua, etanol y similares.
Como "tensioactivos" se incluyen tensioactivos aniónicos, catiónicos y no iónicos, tales como, pero sin limitación, desoxicolato sódico, dodecilsulfato sódico, Triton X-100 y polisorbatos tales como polisorbato 20, polisorbato 40, polisorbato 60, polisorbato 65 y polisorbato 80.
Como "estabilizantes" se incluyen, pero sin limitación, manitol, sacarosa, trehalosa, albúmina, así como antagonistas de proteasas y/o nucleasas.
Como "solución tampón fisiológica" que puede utilizarse en el contexto de la presente invención se incluye, pero sin limitación, solución de cloruro sódico, agua desmineralizada, así como soluciones tampón orgánicas o inorgánicas adecuadas tales como, pero sin limitación, tampón fosfato, tampón citrato, tampón tris (tris(hidroximetil)aminometano), tampón HEPES (ácido [4 (2 hidroxietil)piperazino]etanosulfónico) o tampón MOPS (ácido 3 morfolino-1 propanosulfónico). La elección del tampón respectivo en general depende de la molaridad del tampón deseada. El tampón fosfato es adecuado, por ejemplo, para soluciones inyectables y de perfusión.
El término "adyuvante" se refiere a agentes que aumentan, estimulan, activan, potencian o modulan la respuesta inmunitaria con respecto al principio activo de la composición a nivel celular o humoral, por ejemplo, los adyuvantes inmunológicos estimulan la respuesta del sistema inmunitario contra el antígeno real, pero por sí mismos no tienen ningún efecto inmunológico. Como ejemplos de dichos adyuvantes se incluyen, pero sin limitación, adyuvantes inorgánicos (p. ej., sales metálicas inorgánicas tales como fosfato de aluminio o hidróxido de aluminio), adyuvantes orgánicos (p. ej., saponinas o escualeno), adyuvantes basados en aceite (p. ej., adyuvante completo de Freund y adyuvante incompleto de Freund), citocinas (p. ej., IL-1p, IL-2, IL-7, IL-l2, IL-18, Gm -CFS e iNf-y), adyuvantes particulados (p. ej., complejos inmunoestimuladores (ISCOMS), liposomas o microesferas biodegradables), virosomas, adyuvantes bacterianos (p. ej., monofosforil lípido A o péptidos de muramilo), adyuvantes sintéticos (p. ej., copolímeros en bloque no iónicos, análogos de péptidos de muramilo, o lípido A sintético), o adyuvantes de polinucleótidos sintéticos (p. ej., poliarginina o polilisina).
Una "cantidad eficaz" o "cantidad terapéuticamente eficaz", es una cantidad de un agente terapéutico suficiente para lograr el propósito previsto. La cantidad eficaz de un agente terapéutico dado variará en función de factores tales como la naturaleza del agente, la vía de administración, el tamaño y la especie del animal que va a recibir el agente terapéutico, y la finalidad de la administración. La cantidad eficaz en cada caso individual puede determinarla empíricamente un experto según métodos establecidos en la técnica.
REALIZACIONES
La presente invención proporciona, entre otras, las siguientes ventajas sobre la técnica anterior: (i) un armazón fácilmente modificable para la inserción/presentación de antígenos y/o dominios de unión específicos de diana, que puede adaptarse a las necesidades de un paciente o adaptarse fácilmente a los antígenos de superficie cambiantes de los virus, (ii) una composición estable que puede utilizarse para, p. ej., la vacunación, incluso en condiciones de conservación adversas, p. ej., temperatura elevada, (iii) un vehículo de densidad extremadamente alta para presentar uno o múltiples antígenos, (iv) el uso de una proteína fibra (PEGATINA) para añadir antígenos adicionales u otras actividades sobre la marcha.
Por consiguiente, en un primer aspecto, la presente invención se refiere a un protómero de base pentónica de adenovirus genomodificado como se define en la reivindicación 1, en donde dicho protómero de base pentónica comprende un primer bucle RGD, un segundo bucle RGD, un bucle variable (bucle V), una hendidura de unión a la proteína fibra de adenovirus y/o un dominio N terminal, y que comprende uno o más polipéptidos no adenovíricos insertados en el primer, el segundo o tanto en el primer como en el segundo bucle RGD y, opcionalmente, comprende uno o más de lo siguiente:
(i) al menos un dominio de unión específico de diana en el primer, el segundo o tanto en el primer como en el segundo bucle RGD, y/o en el bucle V; y/o
(ii) un polipéptido no adenovírico en el extremo N y/o C del protómero de base pentónica; y/o
(iii) al menos un residuo de acoplamiento heterólogo en el primer, en el segundo o tanto en el primer como en el segundo bucle RGD, en el bucle V y/o en el dominio N terminal del protómero de base pentónica, en donde el extremo N del dominio N terminal dentro del protómero de base pentónica se define de la siguiente manera: X-i-G-R-N-S-I-R (SEQ ID NO: 44) y el extremo C del dominio N terminal dentro del protómero de base pentónica se define de la siguiente manera:
D-X2-R-S-R-G (SEQ ID NO: 45),
en donde
Xi se selecciona del grupo que consiste en G y E, preferentemente E, y
X2 se selecciona del grupo que consiste en D y E, preferentemente E; y/o
(iv) un fármaco, marcador y/o polipéptido acoplado de manera covalente o no covalente a uno o más aminoácidos del primer, del segundo o tanto del primer como del segundo bucle RGD y/o a uno o más aminoácidos del bucle V del protómero de base pentónica; y/o
(v) al menos un residuo de acoplamiento heterólogo en la hendidura de unión a la proteína fibra de adenovirus del protómero de base pentónica
y en donde el polipéptido genomodificado es preferentemente capaz de ensamblarse en las VLP.
El protómero de base pentónica de adenovirus genomodificado de la invención puede comprender uno o más péptidos no adenovíricos en el bucle V
Si en una de las realizaciones anteriores se indica que uno o más polipéptidos no adenovíricos están comprendidos en el primer o el segundo, o tanto en primer como en el segundo bucle RGD como se define en la reivindicación 1, dichos uno o más polipéptidos no adenovíricos se insertan dentro del primer o segundo, o tanto en el primer como en el segundo bucle Rg D de la proteína de base pentónica, sin que ello influya en la capacidad de ensamblarse en las VLP.
El al menos un dominio de unión específico de diana en el primer, el segundo o tanto en el primer como el segundo bucle RGD, y/o en el bucle V, proporciona al protómero de base pentónica y, por consiguiente, a la VLP ensamblada, la capacidad de unirse específicamente a una estructura diana, p. ej., un receptor celular en la superficie de una célula. Es un descubrimiento sorprendente de los presentes inventores, que estas partes del protómero de base pentónica puedan comprender un dominio de unión específico de diana de longitud considerable sin alterar la formación del pentón o de la VLP. Adicionalmente, el dominio de unión específico de diana comprendido en estas regiones es libre para interaccionar y unirse a las dianas. El uno o más dominios de unión específicos de diana pueden insertarse en cualquier punto en los bucles respectivos, es decir, sin eliminar ninguno de los aminoácidos del bucle. Como alternativa, todos o parte de los aminoácidos del bucle respectivo pueden reemplazarse por los aminoácidos del dominio de unión específico de diana. El dominio de unión específico de diana puede estar flanqueado en el extremo N y/o C por enlazadores peptídicos.
Si el protómero de base pentónica comprende más de un dominio de unión específico de diana, se prefiere que estos estén comprendidos en diferentes bucles del protómero base pentónica, p.ej., en el primer y segundo bucle RGD, en el primer bucle RGD y el bucle V, o en el segundo bucle RGD y el bucle V. Si el protómero de base pentónica comprende más de un dominio de unión específico de diana, también se prefiere que se unan a diferentes dianas, p. ej., a una diana en un primer tipo de célula y a una diana diferente en un segundo tipo de célula. Dichas especificidades duales o múltiples pueden utilizarse para unir células que normalmente no interaccionan entre sí o lo hacen con poca frecuencia. Son ejemplos de dichas células, las células tumorales y las células del sistema inmunitario, en particular, los linfocitos T citotóxicos.
Según la invención, el primer, el segundo o tanto el primer como el segundo bucle RGD, comprende uno o más polipéptidos no adenovíricos insertados. Esta realización también se basa en la sorprendente observación de que los polipéptidos insertados en una o más de estas regiones del protómero de base pentónica, están suficientemente expuestos para ser reconocidos por las células del sistema inmunitario y, por tanto, para suscitar una respuesta inmunitaria. La expresión polipéptido "no adenovírico" se refiere a un polipéptido que no tiene identidad de secuencia con ningún polipéptido presente en un adenovirus, en particular en protómeros de base pentónica de adenovirus de origen natural sobre una longitud de al menos 5 aminoácidos. Preferentemente, el polipéptido no adenovírico no tiene identidad de secuencia con ningún polipéptido presente en el adenovirus en un tramo de al menos 10, preferentemente al menos 15 aminoácidos. El uno o más polipéptidos no adenovíricos pueden insertarse en cada caso de forma independiente en cualquier punto de los respectivos bucles RDG, es decir, sin eliminar ninguno de los aminoácidos del bucle. El polipéptido no adenovírico comprendido en uno o más de los bucles puede estar flanqueado en el extremo N y/o C por enlazadores peptídicos. Esto puede preferirse para aumentar la exposición del polipéptido no adenovírico en la superficie de la VLP. Si se inserta al menos un polipéptido no adenovírico en cada bucle RGD, y en el bucle V, entonces cada protómero de base pentónica comprende al menos tres polipéptidos no adenovíricos idénticos o diferentes en su superficie. Una vez ensamblados en las VLP, en la superficie de las VLP de la presente invención, pueden presentarse al menos 180 polipéptidos no adenovíricos.
Los presentes inventores han descubierto sorprendentemente que secuencias largas de aminoácidos de 50 o más, 100 o más, 150 o más, 200 o más, 250 o más o 300 o más aminoácidos, pueden introducirse en el primer, el segundo o tanto en el primer como en el segundo bucle RGD, y opcionalmente en el bucle V, sin alterar la capacidad de los protómeros de base pentónica para ensamblarse en proteínas pentónicas y posteriormente en las VLP. Por tanto, en la realización indicada en el punto (i) y/o (ii), pueden insertarse secuencias de aminoácidos de la longitud indicada anteriormente (con o sin deleción de algunos de los aminoácidos con los bucles respectivos).
Si la inserción de uno o más polipéptidos no adenovíricos en el bucle o en los bucles RGD según la invención, se combina con la realización opcional indicada en el punto (i), se prefiere además que la proteína no adenovírica se inserte en un bucle diferente al del dominio de unión específico diana.
Los presentes inventores han observado que los polipéptidos colocados en el extremo N y/o C del protómero de base pentónica no interfieren con el ensamblaje del pentón y, posteriormente, de la VLP y están expuestos en la superficie en una VLP ensamblada. Por tanto, en una realización alternativa adicional (ii) un polipéptido no adenovírico puede unirse con o sin un enlazador peptídico intermedio al extremo N y/o C del protómero de base pentónica. Por consiguiente, un protómero de base pentónica genomodificado de la invención puede comprender polipéptidos no adenovíricos en el primer o el segundo bucle RGD o tanto en el primer como en el segundo bucle RGD, y opcionalmente en el bucle V, preferentemente en los tres bucles, y en el extremo N, en el extremo C o en el extremo N y C. Se prefiere que esta realización alternativa se combine con al menos una de las otras realizaciones alternativas (i), (iii), (iv) y/o (v).
Las observaciones de los presentes inventores con respecto a la posibilidad de insertar una secuencia peptídica heteróloga en el primer bucle RGD y/o en el segundo bucle RGD, y opcionalmente en el bucle V, condujeron a una realización alternativa adicional que podía combinarse con una o más de las realizaciones alternativas indicadas anteriormente. En esta realización, se introduce al menos un residuo de acoplamiento heterólogo en el primer, el segundo, o tanto el primer como el segundo bucle RGD y/o en el bucle V. Mediante la inserción de uno o más residuos de acoplamiento es posible acoplar de manera covalente otras moléculas a los bucles. Se contempla, por ejemplo, que una VLP se ensamble primero a partir del polipéptido genomodificado del primer aspecto que comprende uno o más residuos de acoplamiento en uno o más de los bucles y que posteriormente un polipéptido que también comprende un residuo de acoplamiento se acople de manera covalente a la VLP. Usando esta estrategia es posible "decorar" la superficie de la VLP con polipéptidos. Dichas VLP pueden utilizarse para suscitar una respuesta inmunitaria humoral y/o celular contra dichos polipéptidos.
Por otro lado, los presentes inventores han identificado una región dentro del protómero de base pentónica denominada "dominio N terminal del protómero de base pentónica". Este dominio interviene en la interacción entre los protómeros de base pentónica dentro del pentón y también en la interacción entre pentones que forman una VLP. La inserción de residuos de acoplamiento en esta región permite la formación de enlaces covalentes entre dos o más protómeros de base pentónica dentro del mismo pentón o diferentes pentones. La formación de dichos enlaces covalentes estabiliza el pentón así como la VLP ensamblada. El dominio N terminal está muy conservado entre diferentes especies de adenovirus. Por lo tanto, es posible definir adicionalmente el extremo N terminal y C terminal de este dominio dentro del protómero de base pentónica. Por tanto, se prefiere que uno o más de los residuos de acoplamiento estén comprendidos en el dominio N terminal. El residuo de acoplamiento puede reemplazar a un aminoácido existente o puede insertarse además de los aminoácidos que forman el dominio N terminal. Se prefiere que uno o más de los residuos de acoplamiento reemplacen a un residuo dentro del dominio N terminal. El extremo N del dominio N terminal dentro del protómero de base pentónica se define preferentemente de la siguiente manera: X1-GRNSIR (SEQ ID NO: 44)
y el extremo C del dominio N terminal dentro del protómero de base pentónica se define preferentemente de la siguiente manera: D-X2-R-S-R-G (SEQ ID NO: 45), en donde
X1 se selecciona del grupo que consiste en G y E, preferentemente E, y
X2 se selecciona del grupo que consiste en D y E.
Por consiguiente, en esta realización alternativa, uno o más residuos de acoplamiento están comprendidos dentro de la secuencia de aminoácidos del protómero de base pentónica comprendido en el polipéptido genomodificado de la presente invención delimitado por la región N y C terminal anterior. El experto entenderá que, en esta realización, también es posible reemplazar uno o más residuos de aminoácidos dentro de la SEQ ID NO: 44 o 45. El residuo de acoplamiento puede situarse en cualquier lugar dentro del dominio N terminal siempre que no interfiera con el ensamblaje de pentón o de la VLP.
Una secuencia de aminoácidos protomérica preferida que puede modificarse según las alternativas (i) a (v) de la primera realización, es la SEQ ID NO: 64 (la secuencia de nucleótidos codificante se indica en la SEQ ID NO: 63). Se prefiere que las inserciones de al menos un dominio de unión específico de diana según la realización (i), y/o la inserción de al menos un residuo de acoplamiento heterólogo según la realización (iii), y/o el acoplamiento covalente o no covalente del fármaco o polipéptido a uno o más aminoácidos del primer, del segundo o tanto del primer como del segundo bucle RGD y/o uno o más aminoácidos del bucle V según la realización (iv), se produzcan en el primer bucle RGD entre los aminoácidos 312 a 339 de la SEQ ID NO: 64 y/o en el segundo bucle RGD entre los aminoácidos 343 a 367 de la SEQ ID NO: 64 y, opcionalmente en el bucle V entre los aminoácidos 150 a 178 de la SEQ ID NO: 64. Dicha(s) inserción(es) puede(n) delecionar toda o parte de los aminoácidos respectivamente indicados pertenecientes al bucle V.
Preferentemente, tiene que haber un PAR de residuos de acoplamiento, preferentemente mutaciones a cisteínas para permitir la formación de enlaces disulfuro. La VLP estabilizada resultante contiene hasta 120 enlaces disulfuro y es hiperestable a 37 °C e incluso a 42 °C, al menos durante varios meses. En una realización particularmente preferida, los residuos de acoplamiento están ubicados en la posición de aminoácido 51 y 54 con referencia a la SEQ ID NO: 64, es decir, una secuencia de aminoácidos del protómero de base pentónica preferida basada en Ad B3 humano o en posiciones análogas de un protómero de base pentónica de otro adenovirus, o en la posición de aminoácido 54 y 114 con referencia a la SEQ ID NO: 64 o en posiciones análogas de un protómero de base pentónica de otro adenovirus.
Se ha descubierto además que un residuo de acoplamiento en la posición de aminoácido 53 (con referencia a la SEQ ID NO: 1) puede formar un enlace covalente con un residuo de acoplamiento en la posición de aminoácido 543 (con referencia a la SEQ ID NO: 64) o en posiciones análogas de un protómero de base pentónica de otro adenovirus. El último residuo está fuera del dominio N terminal. Por tanto, si se inserta un residuo de acoplamiento en la posición 53, se prefiere que un segundo residuo de acoplamiento se coloque en el aminoácido 541 con referencia a la SEQ ID NO: 64 o en posiciones análogas de un protómero de base pentónica de otro adenovirus. Con referencia a la Fig. 6 y al incluir proteínas de base pentónica adicionales en la alineación, el experto puede determinar fácilmente aquellos residuos en el protómero de base pentónica respectivo que ocupan una posición análoga a la de los aminoácidos.
51,53, 54, 114 y 541 de la SEQ ID NO: 64.
Se prefiere en esta realización del polipéptido genomodificado de la presente invención que el protómero de base pentónica comprenda las siguientes secuencias:
P-T-X-i-Xc-R-N-Xc-l-R (SEQ ID NO: 50);
P-T-X-i-G-R-Xc-S-I-R (SEQ ID NO: 51) y T-Q-T-I-N-X60-Xc-X61 (SEQ ID NO: 52) o
P-T-X1-G-R-N-Xc-I-R (SEQ ID NO: 53) y
T-C-P-Xc-V-X62-K-A-L-G (SEQ ID NO: 54)
en donde
X1 se selecciona del grupo que consiste en G y E, preferentemente E
Xc es, en cada caso, un residuo de acoplamiento, preferentemente C; D, E y K, lo más preferentemente C; X60 se selecciona del grupo que consiste en F, I y L, preferentemente F y L, lo más preferentemente F,
X61 se selecciona del grupo que consiste en D y E, preferentemente E; y
X62 se selecciona del grupo que consiste en H e Y, preferentemente Y.
En particular, los protómeros de base pentónica estabilizados preferidos comprenden, o consisten en, las secuencias de aminoácidos según la SEQ ID NO: 65 a 67. Se prefiere además que estas secuencias de aminoácidos comprendan una o más de las modificaciones según las realizaciones alternativas (i), (ii), (iii) en la medida en que esta realización alternativa no esté relacionada con el dominio N terminal, (iv) o (v) del primer aspecto de la invención descrito anteriormente.
Se prefiere que las inserciones de al menos un dominio de unión específico de diana según la realización (i), y/o la inserción de al menos un residuo de acoplamiento heterólogo según la realización (iii), y/o el acoplamiento covalente o no covalente del fármaco o polipéptido a uno o más aminoácidos del primer, del segundo o tanto del primer como del segundo bucle RGD y/o uno o más aminoácidos del bucle V según la realización (iv), se produzca en el primer bucle RGD entre los aminoácidos 312 a 339 de SEQ ID NO: 65 a 67 y/o que la inserción en el segundo bucle RGD se produzca entre los aminoácidos 343 a 367 de SEQ ID NO: 65 a 67 y, opcionalmente que la inserción en el bucle V se produzca entre los aminoácidos 150 a 178 de SEQ ID NO: 65 a 67. Dicha(s) inserción(es) puede(n) delecionar(n) todo o parte de los aminoácidos respectivamente indicados pertenecientes al primer y segundo bucle RGD y al bucle V. La estabilización térmica del pentón y de las VLP formadas por las proteínas genomodificadas de la presente invención también es deseable en el contexto de cualquiera de las otras realizaciones alternativas de la proteína genomodificada de la presente invención. Por consiguiente, la realización alternativa mencionada en (iii) anterior en relación con el dominio N terminal se combina preferentemente con una o más realizaciones alternativas (i), (ii), (iii) en la medida en que esta realización alternativa no esté relacionada con el dominio N terminal, (iv) o (v). También se prefiere que las realizaciones alternativas mencionadas en (iii) y (v) estén presentes en el protómero base pentónica genomodificado y se combinen con uno o más de (i), (ii), (iii), en la medida en que esta realización alternativa no esté relacionada con el dominio N terminal, o (iv).
En otra realización alternativa (iv) del primer aspecto de la invención que puede combinarse con una o más de las otras realizaciones alternativas del primer aspecto de la invención, un fármaco, marcador y/o polipéptido se acopla de manera covalente o no covalente a uno o más aminoácidos del primer, del segundo o tanto del primer como del segundo bucle RGD y/o a uno o más aminoácidos del bucle V del protómero de base pentónica. De nuevo, esta realización se basa en la observación de que el acoplamiento de los restos a estas regiones no interfiere con el ensamblaje del pentón y la VLP y conduce a la decoración de la VLP con estos restos. En una realización preferida, el fármaco o el marcador se une al protómero de base pentónica a través de un enlazador, preferentemente mediante un enlazador peptídico, que es escindible en condiciones fisiológicas, p. ej., una proteasa, liberando de este modo el fármaco de la VLP en el sitio de acción. En esta realización preferida, el enlazador, preferentemente el enlazador peptídico, comprende un sitio de escisión de endopeptidasa.
En una realización preferida, se utiliza un fragmento de fibra adenovírica para unir de manera no covalente un resto, p. ej., un polipéptido, fármaco o marcador, etc. al protómero de base pentónica, al pentón ensamblado y/o a la VLP ensamblada. Esta interacción está mediada por la hendidura de unión a la proteína fibra de adenovirus del protómero de base pentónica que está presente en el polipéptido genomodificado del primer aspecto de la invención. En una realización preferida descrita más adelante, el fragmento de fibra comprende un residuo de acoplamiento heterólogo para la unión covalente del fragmento de fibra al protómero de base pentónica. Dado que un residuo de acoplamiento requiere un homólogo, es decir, un residuo con el que pueda formar un enlace covalente, es una realización alternativa preferida adicional (v) de la proteína genomodificada del primer aspecto de la invención, que al menos un residuo de acoplamiento heterólogo esté comprendido en la hendidura de unión a la proteína fibra de adenovirus del protómero de base pentónica. El residuo de acoplamiento en la hendidura de unión y el fragmento de la proteína fibra se colocan de manera que se permita la formación de un enlace covalente una vez que el fragmento de la proteína fibra se une en la hendidura del protómero de base pentónica.
Cada protómero de base pentónica interacciona con una proteína fibra de adenovirus a través de la región muy conservada denominada en el presente documento "hendidura de unión a la proteína fibra de adenovirus del protómero de base pentónica". Esta interacción se utiliza para unir indirectamente un resto adicional, preferentemente un polipéptido, un fármaco o marcador al protómero de base pentónica y para presentar tras el ensamblaje de 60 protómeros de base pentónica de la presente invención hasta 60 restos adicionales en la superficie de la VLP ensamblada.
La mayor parte de la población humana ha estado expuesta al Ad5 humano y tiene linfocitos B de memoria capaces de generar una respuesta inmunitaria contra el Ad5 humano. Por consiguiente, si los protómeros basados en Ad5 humano están comprendidos en las proteínas genomodificadas del primer aspecto de la invención, es más probable que las VLP resultantes sean eliminadas de la circulación por una inmunidad preexistente. Por tanto, en una realización preferida, el protómero de base pentónica adenovírico genomodificado según el primer aspecto de la invención, se basa en proteínas pentónicas de adenovirus procedentes de adenovirus de homínidos humanos o no humanos, preferentemente de adenovirus de chimpancé (Pan), de adenovirus de gorila (Gorilla) y adenovirus de orangután (Pongo), más preferentemente de Bonobo (Pan paniscus) y chimpancé común (Pan troglodytes).
Se prefiere particularmente que el protómero de base pentónica de adenovirus genomodificado esté basado en proteínas pentónicas de adenovirus seleccionados del grupo que consiste en hAd3, hAd4, hAd5, hAd7, hAdl 1, hAd26, hAd35 y hAd49, ChAd3, ChAd4, ChAd5, ChAd6, ChAd7, ChAd8, ChAd9, ChAd10, ChAdl I, ChAdl6, ChAdl7, ChAdl9, ChAd20, ChAd22, ChAd24, ChAd26, ChAd30, ChAd31, ChAd37, ChAd38, ChAd44, ChAd63 y ChAd82, PanAdI, PanAd2, PanAd3, ChAd55, ChAd73, ChAd83, ChAdl46 y ChAdl47 descritos en los documentos WO 2005/071093 y WO 2010/086189. El protómero de base pentónica de adenovirus genomodificado de la invención se basa preferentemente en el protómero de base pentónica de tipo silvestre de SEQ ID NO: 1 a 14, es decir, SEQ ID NO: 1 a 14 refleja la secuencia de la proteína antes de la modificación según las realizaciones alternativas (i) a (v) resumidas anteriormente. El experto entenderá que la inserción de un dominio de unión específico de diana en el bucle V, en el primer y/o segundo bucle RGD, alterará la secuencia en esa parte de SEQ ID NO: 1 a 14. De manera similar, el reemplazo de aminoácidos por residuos de acoplamiento también alterará la secuencia de aminoácidos.
Las modificaciones en la proteína de base pentónica de adenovirus genomodificada de la invención requieren la modificación de uno o de los dos bucles RGD según la definición de la reivindicación 1 y, opcionalmente del bucle V. En una realización preferida del polipéptido genomodificado de la invención, la región a modificar se define mediante secuencias consenso comunes a la mayoría de los adenovirus. Por tanto, estas secuencias consenso se basan en la alineación de varias secuencias de aminoácidos de protómero de base pentónica preferidas de especies adenovíricas y son adecuadas para determinar el extremo N y C-terminal respectivamente, de la parte de la proteína de base pentónica a modificar según la realización (i) o (ii) indicada anteriormente. El extremo N del primer bucle RGD dentro del protómero de base pentónica se define de la siguiente manera:
X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-X10-X11 (SEQ ID NO: 15)
en donde
X3 se selecciona del grupo que consiste en D, E y N, y es preferentemente D;
X4 se selecciona del grupo que consiste en V, L e I, y es preferentemente V;
X5 es cualquier aminoácido, preferentemente seleccionado del grupo que consiste en A, D, E, K, S y T, y más preferentemente es T;
X6 es cualquier aminoácido, preferentemente seleccionado del grupo que consiste en A, D, E y K, y más preferentemente es A;
X7 se selecciona del grupo que consiste en F, Y y W, y es preferentemente Y;
X8 se selecciona del grupo que consiste en A, D, E, N y Q, es preferentemente E o Q, y más preferentemente es E;
Xg es cualquier aminoácido, preferentemente seleccionado del grupo que consiste en A, D, E, N y K, y más preferentemente es E;
X10 se selecciona del grupo que consiste en S o T, y es preferentemente S; y
X11 es cualquier aminoácido y constituye el aminoácido N terminal del primer bucle RGD; y la siguiente secuencia define el extremo C del primer bucle RGD y, al mismo tiempo, el extremo N del segundo bucle RGD dentro del protómero de base pentónica:
X12-X13-X14-X15-X16 (SEQ ID NO: 16) en donde
X12 es cualquier aminoácido y constituye el aminoácido C terminal del primer bucle RGD;
X13 es R;
X14 es G;
X15 es D; y
X16 es cualquier aminoácido y constituye el aminoácido N terminal del segundo bucle RGD;
y
la siguiente secuencia define el extremo C del segundo bucle RGD dentro del protómero de base pentónica: X17-X18-X19-X20-X21-X22-X23-X24 (SEQ ID NO: 17); en donde
X17 es cualquier aminoácido y constituye el aminoácido C terminal del segundo bucle RGD;
X18 se selecciona del grupo que consiste en I, L y V, y es preferentemente I;
X19 se selecciona del grupo que consiste en D, E, K, N, Q y V, es preferentemente Q o K, y más preferentemente es Q;
X20 se selecciona del grupo que consiste en C, G y P, y es preferentemente P;
X21 se selecciona del grupo que consiste en I, L y V, es preferentemente L o V y más preferentemente es L; X22 se selecciona del grupo que consiste en D, E, S y T, es preferentemente E o T y más preferentemente es E; X23 se selecciona del grupo que consiste en D, E, K, S y T, es preferentemente E, K o T, y más preferentemente es K; y
X24 se selecciona del grupo que consiste en D y E, y es preferentemente D.
Preferentemente, la siguiente secuencia define el extremo N del bucle V:
X25-X26-X27-X28-X29-X30-X31-X32 (SEQ ID NO: 18).
en donde
X25 se selecciona del grupo que consiste en F, Y y W, y es preferentemente F;
X26 se selecciona del grupo que consiste en H, K y R, y es preferentemente K;
X27 se selecciona del grupo que consiste en A, V, I y L, y es preferentemente A;
X28 se selecciona del grupo que consiste en H, K y R, y es preferentemente R;
X29 se selecciona del grupo que consiste en A, V, I y L, y es preferentemente V;
X30 se selecciona del grupo que consiste en A, V, I, L y M, y es preferentemente M;
X31 se selecciona del grupo que consiste en A, V, I y L, y es preferentemente V; y
X32 es cualquier aminoácido y constituye el aminoácido N terminal del bucle V;
y/o
la siguiente secuencia define el término C del bucle V
X33-X34-X35-X36-X37-X38-X39 (SEQ ID NO: 19)
en donde
X33 es cualquier aminoácido y constituye el aminoácido C terminal del bucle V;
X34 se selecciona del grupo que consiste en F, Y y W, y es preferentemente Y;
X35 se selecciona del grupo que consiste en D, E, S y T, es preferentemente E o T y más preferentemente es E; X36 se selecciona del grupo que consiste en F, Y y W, y es preferentemente W;
X37 se selecciona del grupo que consiste en A, F, V, Y y W, es preferentemente F o V y más preferentemente es F;
X38 se selecciona del grupo que consiste en D, E, S y T, es preferentemente D o E y más preferentemente es E; y X39 se selecciona del grupo que consiste en F, Y y W, y es preferentemente F;
y/o uno o más de los siguientes péptidos no continuos dentro del protómero de base pentónica, forman la hendidura de unión a la proteína fibra de adenovirus (los aminoácidos en negrita interaccionan directamente con la proteína fibra)
M-T-l-D-L-M-N-N-A-l-X40-X41-X42-Y-L-X43-X44-G-R-Q-X45-G-V-L-E-S (SEQ ID NO: 20);
W-D-P-X46-T-X47-X48-P-G (SEQ ID NO: 46);
X49-V-X50-X51-Y-X52-X53 (SEQ ID NO: 47);
X54-X55-R-S-Y (SEQ ID NO: 48); y/o
L-T-X56-V-F-N-R-F-P-X57 (SEQ ID NO: 49)
en donde
X40 se selecciona del grupo que consiste en V, I y L;
X41 se selecciona del grupo que consiste en E y D;
X42 se selecciona del grupo que consiste en H, N y Q, preferentemente H y N;
X43 se selecciona del grupo que consiste en K, E, R, Q y A;
X44 se selecciona del grupo que consiste en V, L e I, preferentemente V e I;
X45 se selecciona del grupo que consiste en H, N y Q, preferentemente H y N;
X46 se selecciona del grupo que consiste en V, I, L, E o D, preferentemente V y E;
X47 se selecciona del grupo que consiste en V, L e I, preferentemente V e I;
X48 se selecciona del grupo que consiste en M, T y S, preferentemente M y T;
X49 se selecciona del grupo que consiste en D, E, N y Q, preferentemente D y N;
X50 es cualquier aminoácido, preferentemente seleccionado del grupo que consiste en A, D, P, K y T;
X51 se selecciona del grupo que consiste en A, D, E, K y R, preferentemente A, E y K;
X52 se selecciona del grupo que consiste en D, E, L, I, Q, y N, preferentemente, E, L y Q;
X53 se selecciona del grupo que consiste en A, D, E, K, N, Q y R, preferentemente A, E, N y K;
X54 se selecciona del grupo que consiste en K, R, S y T, preferentemente K, S y T;
X55 se selecciona del grupo que consiste en A, D, E, G, K, N, Q, R, S y T, preferentemente D, G, K, N y S;
X56 se selecciona del grupo que consiste en H, K y R, preferentemente H y R; y
X57 se selecciona del grupo que consiste en D y E.
En una realización preferida del polipéptido genomodificado de la invención, la secuencia de aminoácidos de X3 a X10 se selecciona independientemente entre sí del grupo que consiste en DVTAYEES (SEQ ID NO: 21), DVDAYENS (SEQ ID NO: 22), DVAEYEKS (SEQ ID NO: 23), DVEAYEKS (SEQ ID NO: 24), DVDAYEKS (SEQ ID NO: 25), DVSKYEAS (SEQ ID NO: 26), NVKAYEDS (SEQ ID NO: 27), DVKKYENS (SEQ ID NO: 28), DVDAYQAS (SEQ ID NO: 29) y DVDAYQAS (SEQ ID NO: 30), la secuencia de aminoácidos de Xis a X24 se selecciona del grupo que consiste en IQPLEKD (SEQ ID NO: 31), IQPVEKD (SEQ ID NO: 32), IKPLEKD (SEQ ID NO: 33), IVPLTKD (SEQ ID NO: 34), IEPVETD (SEQ ID NO: 35) e IKPLTED (SEQ ID NO: 36), la secuencia de aminoácidos de X25 a X31 se selecciona del grupo que consiste en FKARVMV (SEQ ID NO: 37), FRAKLMV (SEQ ID NO: 38) y FRAKVMV (SEQ ID NO: 39), la secuencia de aminoácidos de X33 a X39 se selecciona del grupo que consiste en YEWFEF (SEQ ID NO: 40), YEVWEF (SEQ ID NO: 41) y YEWAEF (SEQ ID NO: 42).
Sorprendentemente, se ha descubierto que pueden insertarse polipéptidos heterólogos grandes y o reemplazar el primer y/o el segundo bucle RGD, sin alterar el ensamblaje del pentón y, posteriormente, las VLP de la invención.
En una realización preferida del polipéptido genomodificado de la invención, cada uno de los dominios de unión específicos diana del primer bucle RGD, independientemente entre sí, tiene una longitud de entre 5 a 300 aminoácidos, preferentemente, entre 6 a 200 aminoácidos; el dominio de unión específico de diana del segundo bucle RGD tiene una longitud de entre 5 a 300 aminoácidos, preferentemente, entre 10 a 200 aminoácidos; y, opcionalmente, el dominio de unión específico de diana en el bucle V tiene una longitud de entre 5 a 300 aminoácidos, preferentemente, entre 10 a 200 aminoácidos.
En una alternativa, la diana unida por el dominio de unión específico de diana es un resto presente en la superficie de una célula o en la matriz extracelular. Se elige la especificidad del dominio de unión específico de diana, si las VLP se dirigen a un tipo de célula específico para suministrar su carga útil, p. ej., un fármaco o marcador. En una realización preferida alternativa del polipéptido genomodificado de la invención, el al menos un dominio de unión específico de diana tiene la capacidad de unirse específicamente a un péptido inmunogénico, péptido neutralizante de patógenos, péptido vírico, péptido bacteriano, péptido inmunomodulador, péptido del cáncer, en la superficie de una célula, preferentemente un receptor celular, una etiqueta de bajo peso molecular, preferentemente biotina o quitina. Esto proporciona una forma alternativa y rápida de unir varios péptidos a la superficie de las VLP.
En una realización preferida del polipéptido genomodificado del primer aspecto de la invención, el polipéptido no adenovírico se selecciona del grupo que consiste en péptidos inmunogénicos, péptidos neutralizantes de patógenos, péptidos víricos, péptidos bacterianos, péptidos inmunomoduladores y péptidos del cáncer. Son particularmente preferidos los péptidos víricos del virus del Dengue HAK QDVVVLGSQeGa M (SEQ ID NO: 55), del virus Chikungunya STKDNFNVYKATRPYLAH (SEQ ID NO: 56) y del virus Zika STKDNFNVYKATRPLAH (SEQ ID NO: 57). Los ejemplos preferidos de dominios de unión específicos de diana son anticuerpos, anticuerpos monocatenarios, fragmentos de anticuerpo, nanocuerpos, cadenas ligeras o pesadas, cadenas ligeras variables o cadenas pesadas variables, diacuerpos o miméticos de anticuerpos. Los fragmentos de anticuerpos preferidos comprenden un fragmento de unión a antígeno (Fab), un fragmento Fab', un fragmento F(ab')2, un anticuerpo de cadena pesada, un anticuerpo de un solo dominio (sdAb), una variable de fragmento monocatenario (scFv), una variable de fragmento (Fv), un dominio VH, un dominio VL, un anticuerpo de dominio único, un nanocuerpo, un IgNAR (inmunoglobulina con nuevo receptor de antígeno), un di-scFv, un acoplador biespecífico de linfocitos T (BITE), una molécula de redireccionamiento de doble afinidad (DART), un triple cuerpo, un diacuerpo, un diacuerpo monocatenario, una proteína estructural alternativa y una proteína de fusión de la misma.
Si se inserta un péptido no adenovírico en el primer bucle RGD este tiene preferentemente una longitud de entre 5 a 60 aminoácidos, preferentemente de entre 6 a 45 aminoácidos. Si el péptido no adenovírico se inserta en el segundo bucle RGD este puede una longitud de entre 5 a 50 aminoácidos, preferentemente, entre 10 a 36 aminoácidos. Si se inserta un péptido no adenovírico o el péptido en el bucle V este puede tener una longitud de entre 5 a 30 aminoácidos, preferentemente, entre 10 a 21 aminoácidos.
En una realización preferida del polipéptido genomodificado del primer aspecto de la invención, el polipéptido no adenovírico insertado comprende un sitio de escisión de proteasa, preferentemente un sitio de escisión de endopeptidasa específico de secuencia, más preferentemente un sitio de escisión de TEV. Un ejemplo preferido de dicho sitio de escisión de TEV es ENLYFQG (SEQ ID NO: 60). Dicho sitio de escisión permite la escisión del polipéptido del primer aspecto de la invención una vez ensamblado en el pentón o en la VLP. Algunos antígenos requieren la exposición del extremo N y/o C libre para suscitar una respuesta inmunitaria. Por tanto, si las proteínas pentoméricas o las VLP se han ensamblado, el tratamiento de éstas con una proteasa expondrá la secuencia N y/o C terminal de dichos antígenos, si el sitio de escisión está situado en el extremo N y/o C terminal de dicho polipéptido no adenovírico. Sorprendentemente, los presentes inventores han descubierto que dicha escisión no altera el pentón o la VLP ensamblados. Esto es extremadamente útil en situaciones en las que una fuerte respuesta inmunitaria específica de antígeno requiere la exposición de los extremos N y/o C libres del antígeno. Como alternativa, el sitio de escisión puede estar comprendido en un polipéptido genomodificado del primer aspecto de la invención para facilitar la purificación del polipéptido genomodificado, p. ej., puede colocarse en el extremo N o C del respectivo polipéptido genomodificado separando la base pentónica del adenovirus genomodificado de la invención de una etiqueta de afinidad, p. ej., biotina, proteína de unión a quitina, etiqueta Myc. Dicha etiqueta de afinidad permite la inmovilización del polipéptido genomodificado en una matriz de afinidad adecuada y la liberación del polipéptido genomodificado purificado de la matriz. En una realización preferida del polipéptido genomodificado del primer aspecto de la invención, el residuo de acoplamiento se selecciona del grupo que comprende Lys, Cys, Asp y Glu, preferentemente Cys. En una realización preferida del polipéptido genomodificado del primer aspecto de la invención, el fármaco se selecciona del grupo de fármaco quimioterápico, fármaco antipatógeno, fármaco inmunomodulador y fármaco antiinflamatorio.
Como se ha expuesto anteriormente, según la realización alternativa (v), se prefiere que uno o más residuos de acoplamiento estén comprendidos en la hendidura de unión del protómero de base pentónica de la invención. Como se ha expuesto anteriormente, los residuos de acoplamiento deben formar enlaces covalentes con los residuos de acoplamiento correspondientes. Una vez que dos polipéptidos interaccionan, se prefiere que el residuo de acoplamiento de un polipéptido esté estéricamente cerca del residuo de acoplamiento del otro polipéptido. En una realización preferida de la realización alternativa (v), el residuo de acoplamiento se coloca en el protómero de base pentónica de adenovirus genomodificado de la invención en la posición de aminoácido 476 y/o 477 (con referencia a la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 64) o en una posición de aminoácido análoga de un protómero de base pentónica de otro adenovirus. La posición análoga en otro protómero de base pentónica de adenovirus puede determinarse con una herramienta de alineación estándar, tal como, p. ej., CLUSTAL, alineando la secuencia según la SEQ ID NO: 64 con otras secuencias protoméricas de base pentónica de adenovirus. El experto puede determinar fácilmente el aminoácido que ocupa una posición análoga a la de los aminoácidos 476 o 477 en otra proteína pentónica de adenovirus. Se prefiere que el protómero de base pentónica de adenovirus genomodificado de la invención y según la realización alternativa (v) comprenda la secuencia
KSFX64NXciXc2 AVY (SEQ ID NO: 68)
en donde
X64 se selecciona del grupo que consiste en Y y F, preferentemente Y;
Xc1 se selecciona del grupo que consiste en D, E y un residuo de acoplamiento, preferentemente Cys;
Xc2 se selecciona del grupo que consiste en L, Q y un residuo de acoplamiento, preferentemente Cys; y en donde al menos uno, preferentemente, tanto Xc1 como Xc2, sea un residuo de acoplamiento, preferentemente Cys. En una realización preferida alternativa de la realización alternativa (v), el residuo de acoplamiento se coloca en el protómero de base pentónica comprendido en el protómero de base pentónica de adenovirus genomodificado de la invención en la posición Lys376 del protómero de base pentónica según la SEQ ID NO: 64 o en una posición análoga de un protómero de base pentónica de otro adenovirus. El protómero de base pentónica de adenovirus genomodificado de la invención comprende preferentemente la siguiente secuencia:
Xc-X65-R-S-Y-N (SEQ ID NO: 73)
en donde
Xc es un residuo de acoplamiento, preferentemente C, D, E y K, lo más preferentemente C; y X65 es cualquier aminoácido, preferentemente seleccionado del grupo que consiste en D, E, G, K, N o S, más preferentemente S o N. En algunas realizaciones del protómero de base pentónica de adenovirus gemodificado de la invención, se desea que el motivo RGD, colocado entre el primer y el segundo bucle RGD, esté intacto para facilitar la unión del protómero de base pentónica, del pentón o de la VLP a ciertas estructuras celulares y extracelulares presentes en un paciente. Como alternativa, si en una aplicación particular del protómero de base pentónica de adenovirus gemodificado de la invención, no se desea dicho direccionamiento, el motivo RGD puede mutarse de manera que pierda su capacidad para unirse a la integrina.
En un aspecto adicional, la presente invención se refiere a un ácido nucleico que codifica el protómero de base pentónica de adenovirus genomodificado de la invención.
En un aspecto adicional, la presente invención se refiere a un vector de expresión que comprende el ácido nucleico de la invención. Los vectores de expresión comprenden plásmidos así como vectores víricos y contienen una secuencia codificante que codifica la proteína genomodificada del primer y/o segundo aspecto de la invención y secuencias de ADN apropiadas necesarias para la expresión de la secuencia codificante unida operativamente en un organismo hospedador particular (p. ej., una bacteria, levadura, planta, insecto o mamífero) o en sistemas de expresión in vitro. Los vectores de clonación se utilizan generalmente para diseñar y amplificar un determinado fragmento de ADN deseado y pueden carecer de las secuencias funcionales necesarias para la expresión de los fragmentos de ADN deseados. Se ha observado en la técnica que la inmunización contra enfermedades que cambian rápidamente sus epítopos antigénicos, p. ej., la gripe, o que se caracterizan por una mezcla de epítopos específicos del paciente, requieren una rápida adaptación o individualización de la vacuna. Las VLP de la presente invención pueden adaptarse rápidamente para presentar los antígenos deseados respectivamente. Por consiguiente, se desvela un vector de clonación susceptible de una inserción rápida de segmentos de ácido nucleico en el primer y/o segundo bucle RGD, y, opcionalmente en el bucle V, que codifica uno o más antígenos deseados. El vector de clonación desvelado comprende:
(i) un polipéptido que comprende un protómero de base pentónica de adenovirus, en donde dicho protómero de base pentónica comprende un primer bucle RGD, un segundo bucle RGD, un bucle variable y/o un sitio de unión para la proteína fibra de adenovirus adaptado para insertar ácidos nucleicos que codifican péptidos no adenovíricos en los ácidos nucleicos que codifican el primer bucle RGD o el segundo bucle RGD o tanto el primer como el segundo bucle RGD, y, opcionalmente el bucle variable.
Los vectores de clonación para su uso en la práctica de la invención, comprenden uno o más sitios de enzimas de restricción, preferentemente BamHI, Kpnl, Kasl, Narl, Sfdl, EcoRI y Rsrll, Pfol, BssHII, Sail, SacI, Xbal, BstEII y Hindlll. La secuencia de ácido nucleico de los ejemplos preferidos de dicho vector de clonación se proporciona en la SEQ ID NO: 61 y 62. La estructura de estos vectores denominados pACEBac-ADDOmer1.0 y pACEBac-ADDOmer2.0 se proporciona en las Figuras 7 y 8. La secuencia del vector de clonación pACEBac-ADDOmer2.0 que comprende el epítopo antigénico preferido del virus Chikungunya se proporciona en la SEQ ID NO: 71 y 72.
En otro aspecto, la presente invención se refiere a una célula hospedadora recombinante que comprende el vector de expresión de la presente invención. El vector de expresión de la presente invención puede encontrarse dentro de la célula hospedadora (i) libremente dispersado como tal, o (ii) integrado en el genoma de la célula hospedadora o en el ADN mitocondrial. La célula hospedadora recombinante se utiliza para la expresión del protómero de base pentónica de adenovirus genomodificado de la invención. La expresión "célula hospedadora recombinante" incluye la descendencia de la célula original que se ha transformado, transfectado o infectado con el polinucleótido o el vector recombinante de la invención. Una célula hospedadora recombinante puede ser una célula bacteriana tal como una célula de E. coli, una célula de levadura tal como Saccharomyces cerevisiae o Pichia pastoris, una célula vegetal, una célula de insecto, tal como una célula SF9 o Hi5, o una célula de mamífero. Son ejemplos preferidos de células de mamífero células de ovario de hámster chino (CHO), células de riñón de mono verde africano (COS), células de riñón embrionario humano (HEK293), células HELA, y similares.
En comparación con los protómeros de base pentónica de tipo silvestre respectivos, los protómeros de base pentónica de adenovirus genomodificado de la presente invención tienen la capacidad, a pesar de su modificación según las realizaciones alternativas (i) a (v), de ensamblarse en una subunidad pentónica, es decir, de formar un pentámero. Puede evaluarse fácilmente si un protómero de base pentónica de adenovirus gemodificado determinado de la invención, se ensambla en pentámeros, mediante métodos bien conocidos por el experto, que comprenden electroforesis en gel de poliacrilamida no desnaturalizante, cromatografía de exclusión por tamaño, espectroscopia de masas o similares. Por tanto, en un séptimo aspecto, la presente invención se refiere a un pentámero que comprende cinco protómeros de base pentónica de adenovirus genomodificado de la invención.
Los pentámeros de la presente invención también pueden ensamblarse en una VLP. Por consiguiente, en un aspecto adicional, la presente invención se refiere a una partícula similivírica (VLP) que comprende 12 pentámeros de la presente invención. La VLP es estable y la composición es la más adecuada para su administración a un paciente. Preferentemente, la VLP se ensambla y/o conserva en condiciones no reductoras para permitir la formación de enlaces covalentes entre los residuos de acoplamiento en los protómeros de base pentónica.
Como se define en la reivindicación 12, la presente invención se refiere, en un aspecto adicional, a un método para producir un protómero de base pentónica de adenovirus genomodificado de la presente invención, que comprende las etapas de:
(a) proporcionar una célula hospedadora recombinante de la presente invención;
(b) expresar el protómero de base pentónica de adenovirus genomodificado; y
(c) purificar el protómero de base pentónica de adenovirus genomodificado.
En un aspecto adicional, se proporciona un método como se define en la reivindicación 13 para producir una VLP de la invención, que comprende las etapas del método de la reivindicación 12 y la etapa adicional de permitir que los protómeros de base pentónica de adenovirus genomodificado se ensamblen en una VLP.
El método de la reivindicación 13 puede comprender además la etapa de incubar la VLP con una proteasa, preferentemente un sitio de escisión de endopeptidasa específico de secuencia, más preferentemente TEV. Se desvela además un método para producir una VLP de la invención que comprende péptidos no adenovíricos específicos de la enfermedad y/o del paciente, que comprende las etapas de:
(a) proporcionar un vector de clonación de la invención;
(b) determinar la secuencia de aminoácidos de péptidos no adenovíricos específicos de la enfermedad o del paciente;
(c) insertar ácidos nucleicos que codifiquen al menos uno de dichos péptidos no adenovíricos en ácidos nucleicos que codifiquen el primer bucle RGD, el segundo bucle RGD y/o el bucle variable del protómero de base pentónica de adenovirus, y/o en la posición de ácido nucleico anterior o posterior a
los ácidos nucleicos que codifican el extremo N o C del polipéptido genomodificado que comprende un fragmento de la proteína de fibra que se une al protómero de base pentónica de adenovirus;
(d) expresar el protómero de base pentónica de adenovirus genomodificado en una célula hospedadora, opcionalmente junto con el polipéptido genomodificado que comprende un fragmento de la proteína de fibra que se une al protómero de base pentónica de adenovirus; y
(e) purificar dicha VLP que comprende opcionalmente un fragmento de la proteína de fibra que se une al protómero de base pentónica de adenovirus, o dicho polipéptido genomodificado que comprende un fragmento de la proteína de fibra que se une al protómero de base pentónica de adenovirus.
En un aspecto adicional, la presente invención se refiere a una VLP que se puede producir mediante un método de producción de una VLP de la invención.
En un aspecto adicional, la presente invención se refiere a una composición farmacéutica que comprende el protómero de base pentónica de adenovirus genomodificado de la invención, el ácido nucleico que codifica uno o más de los protómeros de base pentónica de adenovirus genomodificado de la invención, el vector de expresión de la invención o la VLP de la invención, y un transportador y/o excipiente(s) adecuado(s) farmacéuticamente aceptable(s). Preferentemente, dicha composición es una composición farmacéutica. En realizaciones preferidas, la composición farmacéutica comprende además un transportador y/o excipiente farmacéuticamente aceptable y, opcionalmente, una o más sustancias activas adicionales. Preferentemente, la composición contiene una cantidad terapéuticamente eficaz del compuesto, preferentemente en forma purificada, junto con una cantidad adecuada de transportador y/o excipiente para proporcionar la forma de administración adecuada al paciente. La formulación debe adecuarse al modo de administración.
Las composiciones farmacéuticas pueden estar en forma de soluciones, suspensiones, emulsión, comprimidos, pastillas, cápsulas, polvos, formulaciones de liberación sostenida y similares. La composición farmacéutica puede formularse como un supositorio, con aglutinantes y transportadores convencionales, tales como triglicéridos.
Para preparar las composiciones farmacéuticas de la presente invención, los transportadores farmacéuticamente aceptables pueden ser sólidos o líquidos. Las composiciones en forma sólida incluyen polvos, comprimidos, pastillas, cápsulas, pastillas para chupar, obleas, supositorios y gránulos dispersables. Un excipiente sólido puede ser una o más sustancias, que también pueden actuar como diluyentes, agentes aromatizantes, aglutinantes, conservantes, agentes disgregantes de comprimidos o un material encapsulante. En los polvos, el excipiente es preferentemente un sólido finamente dividido, que está en una mezcla con el inhibidor finamente dividido de la presente invención. En los comprimidos, el principio activo se mezcla con el transportador que tiene las propiedades de unión necesarias en proporciones adecuadas y se compacta en la forma y tamaño deseados. Los excipientes adecuados son carbonato de magnesio, estearato de magnesio, talco, azúcar, lactosa, pectina, dextrina, almidón, gelatina, tragacanto, metilcelulosa, carboximetilcelulosa sódica, una cera de bajo punto de fusión, manteca de cacao y similares. Para preparar supositorios, una cera de bajo punto de fusión, tal como una mezcla de glicéridos de ácidos grasos o manteca de cacao, se funde primero y el componente activo se dispersa de forma homogénea en ella, por agitación. La mezcla fundida, homogénea, se vierte después en moldes de tamaño conveniente, se deja enfriar, y por tanto solidificar. Los comprimidos, polvos, cápsulas, pastillas, obleas y pastillas para chupar, pueden usarse como formas farmacéuticas sólidas adecuadas para administración oral.
Las composiciones en forma líquida incluyen soluciones, suspensiones y emulsiones, por ejemplo, agua, soluciones salinas, dextrosa acuosa, soluciones de glicerol o soluciones de agua/propilenglicol. Para inyecciones parenterales (p. ej., intravenosas, intraarterial, infusión intraósea, intramuscular, subcutánea, intraperitoneal, inyecciones intradérmicas e intratecales), las preparaciones líquidas pueden formularse en solución, p. ej., en solución acuosa de polietilenglicol. Una solución salina es un transportador preferido cuando la composición farmacéutica se administra por vía intravenosa.
Preferentemente, la composición farmacéutica está en una forma farmacéutica unitaria. En dicha forma, la preparación se subdivide en dosis unitarias que contienen cantidades apropiadas del componente activo. La forma farmacéutica unitaria puede ser una preparación envasada, conteniendo el envase distintas cantidades de la preparación, tales como comprimidos, cápsulas y polvos envasados en viales o ampollas. Además, la forma farmacéutica unitaria puede ser una cápsula, un vial de inyección, un comprimido, una oblea o una pastilla para chupar propiamente dicha, o puede ser el número apropiado de cualquiera de ellos en forma envasada.
La composición, si se desea, también puede contener pequeñas cantidades de agentes humectantes o emulsionantes o agentes tamponadores de pH.
Por otro lado, dicha composición farmacéutica también puede comprender otra sustancia farmacológicamente activa tal como, entre otros, adyuvantes y/o principios activos adicionales. Los adyuvantes en el contexto de la presente invención incluyen, entre otros, adyuvantes inorgánicos, adyuvantes orgánicos, adyuvantes a base de aceite, citocinas, adyuvantes particulados, virosomas, adyuvantes bacterianos, adyuvantes sintéticos o adyuvantes de polinucleótidos sintéticos.
En un aspecto adicional, la presente invención se refiere a un protómero de base pentónica de adenovirus genomodificado de la invención, al ácido nucleico que codifica uno o más de los protómeros de base pentónica de adenovirus genomodificado de la invención, al vector de expresión de la invención o a la VLP de la invención para el tratamiento y/o la prevención de una enfermedad infecciosa, una enfermedad inmunitaria o cáncer.
EJEMPLOS
Se diseñaron y produjeron ADDomer con rendimientos muy altos (decenas de gramos por litro de cultivo de expresión). Se estableció un protocolo genérico de tres etapas para purificar el ADDomer hasta la homogeneidad (véase más adelante). En un proyecto preliminar de eficacia, se estableció experimentalmente que podían insertarse epítopos de Chikungunya muy inmunogénicos en los bucles funcionalizados del ADDomer, sin perturbar la formación de partículas o disminuir notablemente el rendimiento. Los ADDomer que contenían epítopos de Chikungunya se purificaron hasta la homogeneidad y se iniciaron estudios basados en células y en animales para establecer su fuerza como vacunas candidatas. Los ADDomer se validaron con una serie de técnicas, incluida la microscopia electrónica, en la que se observaron distintos multímeros de estructura homogénea (dodecaedros). Se aplicó la química de disulfuro de cisteína para aumentar aún más la ya notable termoestabilidad del ADDomer (eliminación de la necesidad de una cadena de frío). Así mismo, se prepararon ADDomer que no solo contenían epítopos peptídicos sino también dominios de proteínas y proteínas completas, incluidos aglutinantes de alta afinidad (nanocuerpos DARPins, fragmentos de anticuerpos) y se están estableciendo protocolos eficaces para fabricarlos a gran escala. Motivados por la reciente aparición del virus Zika, se diseñaron vacunas candidatas contra el Zika basadas en ADDomer y también los ADDomer para combatir posiblemente más de una enfermedad simultáneamente (vacuna combinada). Se realizan experimentos basados en células y animales para validarlas.
A continuación, se describen experimentos y protocolos para producir y validar las VLP de ADDomer y vacunas de VLP y ADDomer.
1. Diseño de ADDomer
La estructura atómica de la especie dodecamérica de origen natural (p. ej., derivada del serotipo Ad3 de adenovirus) se ha determinado mediante cristalografía de rayos X (Szolajska E et al, PLoS One. 2012;7(9):e46075 y Zubieta C et al, Mol. Cell 2005: 17(1): 121-35). La inspección cuidadosa de las estructuras atómicas reveló la presencia de estructuras de bucle extendidas. De manera más precisa, un bucle variable (denominado bucle V) y dos regiones en el denominado bucle RGD del dodecaedro de tipo silvestre se identificaron como posibles sitios de funcionalización. La comparación de diversos protómeros de dodecaedro reveló una amplia variabilidad del bucle V y de las dos regiones de bucle RGD en toda la especie, tanto en la longitud como en la composición de las secuencias, enfatizando su potencial. Utilizando esta información, se diseñó de nuevo una secuencia de ADN que codificaba un promotor de dodecaedro de diseño sintético. Se aplicó el diseño de biopieza (Shetty et al. J. Biol. End. 2008) introduciendo secuencias de ADN que representaban sitios de escisión de endonucleasas, para facilitar las variaciones diseñadas (e incluso la aleatorización) de los aminoácidos que representan el bucle V y las dos regiones de bucle RGD (RGDbucle2, RGDbucle2). El diseño del protómero se optimizó repetidamente hasta que se identificó un protómero que daría lugar a dodecaedros recombinantes (ADDomer) caracterizados por un diseño completo de biopieza de las regiones de bucle descritas anteriormente, conservando la alta solubilidad y la integridad de la estructura del dodecaedro del serotipo Ad3 humano de tipo silvestre.
2. Genomodificación de ADDomer hiperestable
ADDomer ya es notablemente termoestable y puede conservarse a 37 °C durante períodos de tiempo prolongados, lo que indica que no se requiere una cadena de frío en zonas remotas con infraestructuras deficientes. La inspección de las coordenadas cristalinas de las partículas originales de Ad3 reveló una región denominada 'intercambio de hebra', donde segmentos de los protómeros se extendían hasta las proximidades de los protómeros adyacentes dando lugar a la yuxtaposición de aminoácidos que se encontraban a una distancia que podía permitir la formación de enlaces covalentes. Se sustituyó genéticamente estos aminoácidos en el ADDomer por cisteínas, de manera que dos cisteínas, cada una procedente de distintos protómeros, estaban dentro de la distancia necesaria para la formación de enlaces disulfuro.
3. Expresión de ADDomer basada en MultiBac
A continuación, los ADDomer se expresaron utilizando el sistema MultiBac. El gen que codifica ADDomer se sintetizó desde cero (SEQ ID NO: 63 y el ADDomer codificado se proporciona en la SEQ ID NO: 64) y se insertó mediante métodos de clonación clásicos (restricción/ligamiento) en pACEBac, un plásmido de transferencia del sistema MultiBac. MultiBac lo desarrolló uno de los inventores (Berger) específicamente para la producción de productos biológicos complejos tales como ADDomer. Se preparó el virus MultiBac compuesto que contenía el gen ADDomer (véanse las Figuras 7 y 8) y se infectaron cultivos de células de insecto siguiendo los protocolos descritos anteriormente (Berger I et al. J Vis Exp. (2013) (77):e50159 y Fitzgerald DJ et al. Nat Methods. (2006) 3(12): 1021). Como se describe, se prepararon sedimentos celulares que contenían la proteína ADDomer mediante centrifugación. Los sedimentos celulares se conservaron a -80 grados. La expresión de ADDomer con epítopos peptídicos o proteicos insertados, y también la expresión de ADDomer hiperestable, dieron lugar a rendimientos comparables, muy elevados y a partículas dodecaédricas de estructura homogénea.
3. Epítopo neutralizante
Se construyó un ejemplo de vacuna candidata con VLP basada en ADDomer-CHIKADDomer que presentaba múltiples copias del principal epítopo inmunitario neutralizante de Chikungunya HAKKQDVVVLGSQEGAM (SEQ ID NO: 55). El principal epítopo inmunitario neutralizante es parte de una proteína de la envoltura de Chikungunya y es un epítopo peptídico lineal ubicado en el extremo N terminal (Kam YW et al. EM BO Mo I Med. (2012); 4(4):330-4). En una abrumadora mayoría de sueros de pacientes, se encuentran anticuerpos que reaccionan con este epítopo peptídico lineal. ADDomer proporciona los medios para presentar epítopos lineales ya sea de manera restringida (ambos extremos N y C unidos de manera covalente al armazón ADDomer), o de manera no restringida (extremos N liberados por escisión con una proteasa específica) o una combinación de epítopos restringidos o no restringidos, preservando al mismo tiempo la integridad estructural del armazón ADDomer. Las disposiciones preferidas utilizadas fueron las siguientes:
AKRARLSTSFNPVPYEDESSTKDNFNVYKATRPYLAH (SEQ ID NO: 58),
AKRARLSTSFNP VP YEDEC S STKDNFNVYKATRP YL AH (SEQ ID NO: 59) y AKRARLSTCFNPVPYEDESSTKDNFNVYKATRPYLAH (SEQ ID NO: 60). La presentación similar a la natural del epítopo neutralizante principal de Chikungunya, se logró mediante escisión mediada con proteasa TEV de ADDomer que presenta múltiples copias del epítopo, conteniendo cada una de ellas un sitio de escisión de TEV específico que precede a la secuencia del epítopo neutralizante, preservando el extremo N original. Pueden utilizarse estrategias similares para cualquier dominio de epítopo, péptido o proteína presentado por ADDomer. 4. Purificación de ADDomer y variantes Sedimentos de células de insecto Sf21 de Spodoptera frugiperda se sometieron a lisis mediante congelación-descongelación. El lisado se aclaró mediante centrifugación siguiendo los protocolos estándar para células de insecto (Berger I et al. J Vis Exp. (2013) (77):e50159 y Fitzgerald DJ et al. Nat Methods. 2006 3(12): 1021). El sobrenadante aclarado se cargó en un gradiente de sacarosa del 15 al 40 % y se centrifugó utilizando un rotor Beckman SW41 durante la noche. Se recogieron fracciones de 1,1 ml de la parte superior del gradiente y se cargaron en geles de poliacrilamida SDS (SDS-PAGE) desnaturalizantes para analizar el contenido de proteínas e identificar las fracciones que contenían los ADDomer para su agrupación. A continuación, se realizó cromatografía de exclusión por tamaño (SEC) y/o intercambio iónico (IEX) después de dializar la sacarosa.
5. Validación de ADDomer mediante microscopia electrónica El ADDomer purificado y las variantes de ADDomer se visualizaron mediante microscopia electrónica (ME) de tinción negativa para evaluar su estado de ensamblaje y su integridad estructural. Se utilizó una preparación estándar de mica-carbono con ADDomer a una concentración de aproximadamente 0,1 mg/ml antes de la deposición sobre el material de soporte. Las muestras se tiñeron con silicotungstato sódico al 1 % (peso/vol) (H 7,0) y se visualizaron en un microscopio electrónico JEOL a 100 kV. Las imágenes se registraron y analizaron utilizando un programa informático suministrado por Gatan.
Para experimentos de termoestabilidad, Los ADDomer se conservaron congelados, a 4 °C, a temperatura ambiente (TA) o a 37 °C durante una semana. La microscopia electrónica mostró que la conservación a TA o a 37 °C dio como resultado partículas correctamente autoensambladas que lo que demostraba su termoestabilidad. La incubación del ADDomer (SEQ ID NO: 64) durante 2 H a 45 °C dio como resultado un desensamblaje reversible de las partículas que volvieron a ensamblarse cuando se volvieron a llevar a TA. Esta disociación reversible también se observó mediante el ensayo de desplazamiento térmico (Fig. 10, véase la flecha), pero la disociación irreversible solo se observó con temperaturas superiores a 50 °C.
6. Diseño de experimentos con animales (murinos) para evaluar la inmunogenicidad de ADDomer Para el análisis inmunitario murino de vacunas candidatas con VLP basadas en ADDomer-CHIKADDomer de Chikungunya, se tilizaron ratones hembra BALB/c de seis semanas de vida. Se designaron cuatro grupos de ocho ratones por inmunización con especies de ADDomer (p. ej., en el caso de la vacuna candidata con VLP contra Chikungunya: i) ADDomer, ii) epítopo no restringido de ADDomer CHIK, iii) epítopo restringido de ADDomer CHIK, iv) epítopo peptídico neutralizante principal de CHIK aislado entrecruzado con KLH como control positivo). A cada animal se le inyectaron 10 pg de ADDomer y variantes de ADDomer a intervalos de 2 semanas. Los anticuerpos IgA, IgM, IgG total, IgGI lgG2a y anti-CHIK, se titularon a partir de sueros de ratón mediante ELISA. El análisis inmunitario de otras vacunas candidatas con VLP ADDomer, se diseñó de manera análoga. Se probaron dos tipos de presentación de epítopos en la superficie de ADDomer (restringida y relajada, véase más adelante: punto 7). Se observó una respuesta dependiente del tiempo (semana 0 a 6). Se mostró el potencial superior de la forma relajada del epítopo sobre la forma restringida para desencadenar una respuesta del epítopo anti-Chik (Fig. 12). 7. Exposición del epítopo de interés en la superficie de ADDomer
La adición de un sitio de escisión con TEV secuencia arriba del epítopo de interés, permite su presentación en dos configuraciones diferentes: restringida o relajada. Después de la purificación, los epítopos están naturalmente restringidos en los bucles de ADDomer. Mediante la adición de la proteasa TEV (Virus del grabado del tabaco) (1/100 p:p) durante 2 H a TA, el epítopo puede relajarse y presentarse en una forma lineal en la superficie del armazón. La eficacia de la escisión se controla fácilmente mediante SDS-PAGE. Cabe destacar que, el armazón general de ADDomer no se ve afectado por esta escisión (Fig. 11).
8. Ampliación de la capacidad de inserción de epítopos en ADDomer Se evaluó la capacidad de ADDomer para transportar una secuencia de epítopos larga. Para este fin, se insertó un epítopo artificial de 200 aminoácidos de longitud en ADDomer (denominado ADDomer extendido). Esto dio como resultado un ADDomer correctamente autoensamblado. La inserción se confirmó mediante análisis SDS-PAGE y espectroscopia de masas, como se muestra en la Figura 13.
9. Enlace covalente del epítopo en la superficie del ADDomer
Para ampliar el potencial del ADDomer, se desarrolló un sistema que permitía la adición de epítopos extra en el ADDomer. Se insertaron cisteínas individuales en ubicaciones específicas de la secuencia ADDomer (ya sea K363C o Q476C o A477C). K363C se diseñó para formar un puente disulfuro covalente con un fragmento de la proteína fibra de 20 aminoácidos de longitud (péptido C20 (SEQ iD NO: 77) derivado de SEQ ID NO: 59) mientras que Q476C o A477C se diseñaron para hacer lo mismo con otro fragmento de la proteína fibra (péptido C9 (SEQ ID NO: 75) derivado de SEQ ID NO 60). La interacción covalente de los péptidos con su ADDomer correspondiente modificado con Cys, se comprobó incubando la partícula con su péptido correspondiente en condiciones oxidativas (es decir, sin betamercaptoetanol) o en condiciones reductoras (con la adición de beta-mercaptoetanol). Los complejos se procesaron en SDS-PAGE y el ADDomer se detectó con un anticuerpo específico y un anticuerpo secundario marcado con Cy3, mientras que el péptido biotinilado se detectó con avidina marcada con Alexa488. Cuando se utilizó el péptido/Cys-ADDomer correcto, la presencia del péptido se detectó en el tamaño de banda de ADDomer (círculo de la Fig. 14). Esta interacción era específica del puente disulfuro creado entre el Cys-ADDomer y el péptido, ya que la interacción se impedía en condiciones reductoras.

Claims (13)

REIVINDICACIONES
1. Un protómero de base pentónica de adenovirus genomodificado, en donde dicho protómero de base pentónica comprende un primer bucle RGD, un segundo bucle RGD, un bucle variable (bucle V), una hendidura de unión a la proteína fibra de adenovirus y/o un dominio N terminal, y comprende uno o más péptidos no adenovíricos insertados en el primer, el segundo o tanto en el primer como en el segundo bucle RGD; y opcionalmente uno o más de lo siguiente
(i) al menos un dominio de unión específico de diana en el primer, en el segundo o tanto en el primer como en el segundo bucle RGD, y/o en el bucle V; y/o
(ii) un péptido no adenovírico en el extremo N y/o C terminal del protómero de base pentónica; y/o
(iii) al menos un residuo de acoplamiento heterólogo en el primer, en el segundo o tanto en el primer como en el segundo bucle RGD, en el bucle V y/o en el dominio N terminal del protómero de base pentónica, en donde el extremo N del dominio N terminal dentro del protómero de base pentónica se define de la siguiente manera: X1-G-R-N-S-I-R (SEQ ID NO: 44)
y el extremo C terminal del dominio N terminal dentro del protómero de base pentónica se define de la siguiente manera:
D-X2-R-S-R-G (SEQ ID NO: 45),
en donde
X1 se selecciona del grupo que consiste en G y E, y
X2 se selecciona del grupo que consiste en D y E; y/o
(iv) un fármaco, marcador o polipéptido acoplado de manera covalente o no covalente a uno o más aminoácidos del primer, del segundo o tanto del primer como del segundo bucle RGD y/o a uno o más aminoácidos del bucle V del protómero de base pentónica; y/o
(v) al menos un residuo de acoplamiento heterólogo en la hendidura de unión a la proteína fibra de adenovirus del protómero de base pentónica,
en donde la siguiente secuencia define el extremo N del primer bucle RGD dentro del protómero de base pentónica: X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-X10-X11 (SEQ ID NO: 15)
en donde
X3 se selecciona del grupo que consiste en D, E y N, y es preferentemente D;
X4 se selecciona del grupo que consiste en V, L e I, y es preferentemente V;
X5 es cualquier aminoácido, preferentemente seleccionado del grupo que consiste en A, D, E, K, S y T, y más preferentemente es T;
X6 es cualquier aminoácido, preferentemente seleccionado del grupo que consiste en A, D, E y K, y más preferentemente es A;
X7 se selecciona del grupo que consiste en F, Y y W, y es preferentemente Y;
X8 se selecciona del grupo que consiste en A, D, E, N y Q, es preferentemente E o Q, y más preferentemente es E;
X9 es cualquier aminoácido, preferentemente seleccionado del grupo que consiste en A, D, E, N y K, y más preferentemente es E;
X10 se selecciona del grupo que consiste en S o T, y es preferentemente S; y
X11 es cualquier aminoácido y constituye el aminoácido N terminal del primer bucle RGD;
en donde la siguiente secuencia define el extremo C terminal del primer bucle RGD y el extremo N terminal del segundo bucle RGD dentro del protómero de base pentónica:
X12-X13-X14-X15-X16 (SEQ ID NO: 16)
en donde
X12 es cualquier aminoácido y constituye el aminoácido C terminal del primer bucle RGD;
X13 es R;
X14 es G;
X15 es D; y
X16 es cualquier aminoácido y constituye el aminoácido N terminal del segundo bucle RGD;
en donde la siguiente secuencia define el extremo C terminal del segundo bucle RGD dentro del protómero de base pentónica:
X17-X18-X19-X20-X21-X22-X23-X24 (SEQ ID NO: 17);
en donde
X17 es cualquier aminoácido y constituye el aminoácido C terminal del segundo bucle RGD;
X18 se selecciona del grupo que consiste en I, L y V, y es preferentemente I;
X19 se selecciona del grupo que consiste en D, E, K, N, Q y V, es preferentemente Q o K, y más preferentemente es Q;
X20 se selecciona del grupo que consiste en C, G y P, y es preferentemente P;
X21 se selecciona del grupo que consiste en I, L y V, es preferentemente L o V y más preferentemente es L; X22 se selecciona del grupo que consiste en D, E, S y T, es preferentemente E o T y más preferentemente es E; X23 se selecciona del grupo que consiste en D, E, K, S y T, es preferentemente E, K o T, y más preferentemente es K; y
X24 se selecciona del grupo que consiste en D y E, y es preferentemente D;
y en donde el protómero de base pentónica de adenovirus genomodificado tiene la capacidad de ensamblarse en las VLP.
2. El protómero de base pentónica de adenovirus genomodificado según la reivindicación 1, que comprende además uno o más péptidos no adenovíricos en el bucle V.
3. El protómero de base pentónica de adenovirus genomodificado según la reivindicación 1 o 2, en donde la siguiente secuencia define el extremo N del bucle V:
X25-X26-X27-X28-X29-X30-X31-X32 (SEQ ID NO: 18).
en donde
X25 se selecciona del grupo que consiste en F, Y y W, y es preferentemente F;
X26 se selecciona del grupo que consiste en H, K y R, y es preferentemente K;
X27 se selecciona del grupo que consiste en A, V, I y L, y es preferentemente A;
X28 se selecciona del grupo que consiste en H, K y R, y es preferentemente R;
X29 se selecciona del grupo que consiste en A, V, I y L, y es preferentemente V;
X30 se selecciona del grupo que consiste en A, V, I, L y M, y es preferentemente M;
X31 se selecciona del grupo que consiste en A, V, I y L, y es preferentemente V; y
X32 es cualquier aminoácido y constituye el aminoácido N terminal del bucle V;
y/o
la siguiente secuencia define el extremo C terminal del bucle V
X33-X34-X35-X36-X37-X38-X39 (SEQ ID NO: 19)
en donde
X33 es cualquier aminoácido y constituye el aminoácido C terminal del bucle V;
X34 se selecciona del grupo que consiste en F, Y y W, y es preferentemente Y;
X35 se selecciona del grupo que consiste en D, E, S y T, es preferentemente E o T y más preferentemente es E;
X36 se selecciona del grupo que consiste en F, Y y W, y es preferentemente W;
X37 se selecciona del grupo que consiste en A, F, V, Y y W, es preferentemente F o V y más preferentemente es F;
X38 se selecciona del grupo que consiste en D, E, S y T, es preferentemente D o E y más preferentemente es E; y
X39 se selecciona del grupo que consiste en F, Y y W, y es preferentemente F;
y/o uno o más de los siguientes péptidos no continuos dentro del protómero de base pentónica forman la hendidura de unión a la proteína fibra de adenovirus (los aminoácidos en negrita interaccionan directamente con la fibra) M-T-l-D-L-M-N-N-A-l-X40-X41-X42-Y-L-X43-X44-G-R-Q-X45-G-V-L-E-S (SEQ ID NO: 20);
W-D-P-X46-T-X47-X48-P-G (SEQ ID NO: 46);
X49-V-X50-X51-Y-X52-X53 (SEQ ID NO: 47);
X54-X55-R-S-Y (SEQ ID NO: 48); y/o
L-T-X56-V-F-N-R-F-P-X57 (SEQ ID NO: 49)
en donde
X40 se selecciona del grupo que consiste en V, I y L;
X41 se selecciona del grupo que consiste en E y D;
X42 se selecciona del grupo que consiste en H, N y Q, preferentemente H y N;
X43 se selecciona del grupo que consiste en K, E, R, Q y A;
X44 se selecciona del grupo que consiste en V, L e I, preferentemente Ve I;
X45 se selecciona del grupo que consiste en H, N y Q, preferentemente H y N;
X46 se selecciona del grupo que consiste en V, I, L, E o D, preferentemente V y E;
X47 se selecciona del grupo que consiste en V, L e I, preferentemente V e I;
X48 se selecciona del grupo que consiste en M, T y S, preferentemente M y T;
X49 se selecciona del grupo que consiste en D, E, N y Q, preferentemente D y N;
X50 es cualquier aminoácido, seleccionado preferentemente del
grupo que consiste en A, D, P, K y T;
X51 se selecciona del grupo que consiste en A, D, E, K y R, preferentemente A, E y K;
X52 se selecciona del grupo que consiste en D, E, L, I, Q y N, preferentemente, E, L y Q;
X53 se selecciona del grupo que consiste en A, D, E, K, N, Q y R, preferentemente A, E, N y K;
X54 se selecciona del grupo que consiste en K, R, S y T, preferentemente K, S y T;
X55 se selecciona del grupo que consiste en A, D, E, G, K, N, Q, R, S y T, preferentemente D, G, K, N y S;
X56 se selecciona del grupo que consiste en H, K y R, preferentemente H y R; y
X57 se selecciona del grupo que consiste en D y E.
4. El protómero de base pentónica de adenovirus genomodificado según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde el uno o más polipéptidos no adenovíricos se selecciona(n) del grupo que consiste en péptidos inmunogénicos, péptidos neutralizantes de patógenos, péptidos víricos, péptidos bacterianos, péptidos inmunomoduladores y péptidos del cáncer.
5. Un ácido nucleico que codifica el protómero de base pentónica de adenovirus según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4.
6. Un vector de expresión que comprende el ácido nucleico de la reivindicación 5.
7. Una célula hospedadora recombinante que comprende el vector de expresión de la reivindicación 6.
8. Un pentámero que comprende cinco protómeros de base pentónica de adenovirus genomodificado según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4.
9. Una partícula similivírica (VLP) que comprende 12 pentámeros según la reivindicación 8.
10. Un método para producir un protómero de base pentónica de adenovirus genomodificado según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, que comprende las etapas de:
(a) proporcionar una célula hospedadora recombinante de la reivindicación 7;
(b) expresar el protómero de base pentónica de adenovirus genomodificado; y
(c) purificar el protómero de base pentónica de adenovirus genomodificado.
11. Un método para producir una VLP según la reivindicación 9, que comprende las etapas del método de la reivindicación 10 y la etapa adicional de permitir que los protómeros de base pentónica de adenovirus genomodificado se ensamblen en una VLP.
12. Una composición farmacéutica que comprende los protómeros de base pentónica de adenovirus genomodificado según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, el ácido nucleico de la reivindicación 5, el vector de expresión de la reivindicación 6 o la VLP según la reivindicación 9, y un transportador y/o excipiente(s) adecuado(s) farmacéuticamente aceptable(s).
13. Un protómero de base pentónica de adenovirus genomodificado según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, el ácido nucleico de la reivindicación 5, el vector de expresión de la reivindicación 6 o la VLP según la reivindicación 9, para su uso en el tratamiento y/o la prevención de una enfermedad infecciosa, una enfermedad inmunitaria o cáncer.
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