JP2019506169A - ヘリコバクター・ピロリを判定するための方法 - Google Patents
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Abstract
Description
本発明のさらなる態様は、前記方法を実行するためのキットに関する。
現在、Hpは、世界人口の約半数の胃にコロニー形成する細菌であり、消化性潰瘍およびMALTリンパ腫における病因論的因子、胃腺癌についてのリスク因子ならびに他の胃内および胃外型病変と関連する因子とみなされている。
Hp感染は、ある者が属する人種ではなく、低い社会経済状態に相関することが周知である。実際、Hp感染は、発展途上国において極めて蔓延している。この細菌の伝染様式は依然として不明であるが、しかし、経口または糞便−経口経路が最も可能性が高いと考えられている。
最も一般的な非侵襲的方法の1つは、尿素呼気試験(UBT)である。この方法は、放射性炭素同位体で標識された尿素を含有する飲料を患者に飲用させることを必要とする。Hpの存在下において、ウレアーゼによって触媒される尿素は分裂し、呼気中のアンモニウムおよび顕著な二酸化炭素の形成および放出をもたらす。個体の呼気分析が顕著なCO2の存在を明らかにする場合、この試験は陽性であり、したがって個体はHpによって感染されているとみなされる。
血清学的試験は、Hpを標的化するIgG抗体を探索することを必要とする。しかし、これらの試験は、活動性感染を事前のHp感染から区別することを可能にしない。したがって、これらは、治療法の有効性のモニタリングについて理想的とみなされず、まして根絶を確認するための事後試験ともみなされない。
さらなる最小侵襲的方法は、糞便中の抗原(HpSA)についての試験に基づく。この場合、免疫酵素的試験が個体の糞便試料に対して実施される。
この方法は、呼気試験の妥当な代替試験であるが、特に治療法の効果を評価することが望まれる場合、低い感度および特異度を特徴とする。
Hp感染を根絶するための治療法に関して最も一般的なものとしては、抗生物質に伴うプロトンポンプ阻害剤(PPI)の投与が挙げられる。
特に、ファーストライン療法(ラインI)は、実際に、PPIおよびクラリスロマイシンの14日間の投与、次いでPPI、クラリスロマイシンおよびアモキシシリンまたはレボフロキサシンおよびメトロニダゾールの7〜10日間の投与を提供する三重療法を含む。あるいは、連続療法が利用可能であり、それは、1グラム×2回のアモキシシリンおよびPPIの5日間の投与、次いで次の5日間の500mgのクラリスロマイシン×2回、PPIおよび500mg×2回のチニダゾールを提供する。
残念ながら、抗生物質に対する耐性がこの治療アプローチの成功の欠落にとって最も重要な因子である。特に、呼吸器疾病ならびに婦人科および寄生虫感染症の治療のためのクラリスロマイシンの広範な使用は、この抗生物質に対する一次抵抗を増加させている。
クラリスロマイシンは、多くのマクロライドと同様に、細菌リボソームの50Sサブユニットに結合することにより、その抗菌作用を展開する。この結合は、(酵素トランスロカーゼを遮断することにより)リボソームのA部位からP部位へのペプチドのトランスロケーションを妨害し、(酵素トランスフェラーゼを遮断することにより)ペプチド鎖の延長の阻害を引き起こす。
レボフロキサシンおよびアモキシシリンに対する耐性もかなり蔓延している。
Hpの根絶のためのレボフロキサシンの使用が一般的慣行であり、それは、クラリスロマイシンベース治療の不成功後の「セカンドライン療法」レジメにおけるその役割のためである。フルオロキノロンは、DNAのらせん構造の維持に不可欠な酵素であるDNAギラーゼ(トポイソメラーゼII)のAサブユニットに結合することにより、用量依存的細菌効果を付与する。感受性株において、レボフロキサシンは、DNA合成を遮断し、高用量においてRNA合成も遮断する。
1)ベータラクタム環を開環させることによって抗生物質を不活性化させるベータラクタマーゼ酵素の産生、
2)分子に対する細菌の浸透性の低減、および
3)アモキシシリンに結合するタンパク質、またはペニシリン結合タンパク質(PBP)の改変。
アモキシシリンは、Hpを根絶するために使用すべき最初の抗生物質であり、その低い耐性率にも起因して依然として今日でも一般的な治療スキームで使用される。
実際、本出願人らは、予測外にも、下記の方法が、多くの偽陽性を生じさせるために低い特異度を特徴とする現在利用可能な非侵襲的方法と比較して極めて信頼性が高いことを見出した。
本発明の方法はまた、医療サービスについての利点を有する。なぜなら、本発明は、種々の利用可能な薬理学的療法を用いる実際の根絶試行に基づく、細菌を根絶するために設計された現在利用可能な治療アプローチに伴う浪費の排除を見込むためである。
したがって、本発明の主題は、添付の独立請求項に規定されるとおり、ヘリコバクター・ピロリを判定/モニタリングするための、および/または特に治療目的のために一般に使用される抗生物質に対するヘリコバクター・ピロリの耐性を判定するための方法に関する。
さらに、本発明の主題は、添付の独立請求項に規定されるとおり、方法を実行するためのキットにさらに関する。
本発明の方法およびキットの好ましい態様は、添付の従属請求項に定義される。
本発明の追加の特徴および利点は、添付の図面も参照する以下の詳細な説明および例示的で非限定的な実施例からより明らかになる。
(i)個体から単離された生物学的試料を得るステップ、
(ii)前記試料からDNAを精製(単離)するステップ、および
(iii)突然変異の場合に前記抗生物質に対する耐性を担う少なくとも1つのヌクレオチド部位を含むHp遺伝子の少なくとも1つの部分を増幅させるステップであって、前記増幅は、オリゴヌクレオチドの少なくとも1つのペア(プライマーのペア)および少なくとも2つのオリゴヌクレオチドプローブを使用するPCR、好ましくはリアルタイムPCRによって実施され、プライマーのペアは、前記突然変異部位を跨ぐ核酸の領域中で対合し、前記オリゴヌクレオチドプローブは、2つの異なるマーカーで標識されており、少なくとも1つのオリゴヌクレオチドプローブは、少なくとも1つの正常部位を含むHp遺伝子の少なくとも1つの部分に相補的かつ特異的(すなわち、前記遺伝子の正常/非突然変異アレルに相補的)であり、および少なくとも1つのオリゴヌクレオチドプローブは、前記抗生物質耐性を担う少なくとも1つの突然変異部位を含むHp遺伝子の少なくとも1つの部分に相補的かつ特異的(すなわち、前記遺伝子の突然変異アレルに相補的)である、ステップ(図1を参照)、
(iv)2つのマーカーのレベルを計測することにより、増幅された正常および/または突然変異DNAを定量するステップであって、
− 増幅DNAの不存在は、試料中のHpの不存在を意味し、
− 前記遺伝子の野生型アレルに相補的かつ特異的なプローブが標識されているマーカーのみの存在は、正常ホモ接合型ゲノタイプと、したがって前記抗生物質に耐性でない前記Hpの存在とを定義し、
− 前記遺伝子の突然変異アレルに相補的かつ特異的なプローブが標識されているマーカーのみの存在は、突然変異ホモ接合型ゲノタイプと、したがって前記抗生物質に耐性である前記Hpの存在とを定義し、
− 両方のマーカーの存在は、前記遺伝子の野生型アレルおよび突然変異アレルを有するヘテロ接合型ゲノタイプと、したがって前記抗生物質に耐性である前記Hpの存在とを定義する、ステップを含む方法に関する。
したがって、増幅産物の存在は、前記生物学的試料中のHp、したがってHpによる感染の存在を規定する一方、上記ゲノタイピングは、細菌が少なくとも1つの抗生物質に耐性であるか否かを判定することを可能にする。
したがって、本発明の方法は、個体におけるHp感染を判定/モニタリングすること、および同時に任意の判定/モニタリングされるHp株の抗生物質耐性を判定することを可能にする。結果的に、本発明の方法は、Hp感染に伴う病変、とりわけ胃系を冒す病変、好ましくは胃炎、消化性潰瘍、胃癌、またはMALTリンパ腫、消化不良、鉄欠乏性貧血、特発性血小板減少性紫斑病、および胃十二指腸外の病変の判定も可能にする。
糞便試料は、個体自身によって回収することができ、すなわち、本方法のステップ(i)は、個体によって自主的に実施することができる。
一般に、糞便試料は、糞便の回収に好適な任意の装置を使用して回収される。好ましくは、装置は、糞便を回収し、可溶化手段を収容する可溶化チャンバ中でそれらを可溶化させるための部分を含む。可溶化手段は、好ましくは、PBSのような生理食塩溶液である。可溶化は、糞便試料の均一化を可能にし、好ましくは、例えばVortexミキサ上で数秒間(約30秒間)にわたり試料を激しく振盪させることによって実施/促進される。
糞便は、好ましくは、本発明の方法を実行するために適切な量の糞便の回収に好適なブラシを用いて回収される。特に、本発明の方法を実行するために回収すべき量(したがって、本方法の出発材料の量)は、150〜250ミリグラム(mg)の範囲であり、好ましくは、それは約200mgの糞便である。
本発明の方法を実行する目的のため、約1mlの可溶化手段中で150〜250mg、好ましくは約200mgの糞便を可溶化させることが望ましい。
可溶化チャンバは、好ましくは、濾過エレメントによって回収チャンバから離隔されている。このように、可溶化された糞便は、例えば、重力によって回収チャンバ中のフィルタを通過し得る。フィルタの細孔よりも大きい寸法の可溶化糞便の部分は、回収チャンバ中へ通過しない。濾過された糞便は、回収チャンバから、好ましくは貫通可能な膜を介して、例えばシリンジを用いて回収され得る。
上記のとおり、個体から生物学的試料を得たら、または糞便を可溶化および/または濾過したら、生物学的試料または可溶化/濾過された糞便(以下、試料)を本方法のステップ(ii)に供する。
特に、本発明の抽出方法は、Trizolを試料に添加するステップを含む。好ましくは、Trizolと試料との比は、1:1である。次いで、Trizol:試料の混合物を好ましくは数秒間にわたり、例えばVortexミキサ上で均等に混合する。
好ましくは、Trizol:試料:クロロホルムの混合物を数秒間にわたり、例えばVortexミキサ上で均等に混合する。
好ましくは、均等に混合した後、Trizol:試料:クロロホルムの混合物を好ましくは遠心分離によって階層化する。10000〜14000g、好ましくは約12000gにおいて、好ましくは約10分間の時間にわたり遠心分離することが望ましい。階層化は、好ましくは低温、より好ましくは約4℃において実施する。
したがって、DNAを混合物の残りの部分から、すなわち有機相を表す中間相およびフェノール相から沈殿させる。
沈殿は、好ましくは、アルコール、例えばエタノール、より好ましくは100%のエタノールを有機相に添加することによって達成される。
DNAが沈殿したら(実際には、DNAはペレットを形成する)、表面相を除去することが好ましく、沈殿したDNAを生理食塩溶液、例えばクエン酸ナトリウムにより、好ましくは少なくとも1回、より好ましくは2〜3回処理する(このステップは、DNAペレットの洗浄の1種である)。このステップは、好ましくは室温において、より好ましくは約30分間にわたり実施する。
生理食塩溶液による全ての処理後、沈殿したDNAの沈降のステップを、好ましくは例えば約2000gにおける数分間の好ましくは低温(例えば、約4℃)での遠心分離によって行う。
アルコールによる処理の終了時、沈殿したDNAを、好ましくは例えば約2000gにおける数分間の好ましくは低温(例えば、約4℃)での遠心分離によって沈降させる。
乾燥したDNAを好ましくはアルカリ溶液中、より好ましくはNaOH(例えば、NaOH 8mM)中で再懸濁させる。
ステップ(I)の終了時、最終遠心分離ステップを最大速度(約14000g)において10分間程度、好ましくは室温において実施することが好ましい。上清(すなわち沈殿しなかった部分)を移し、緩衝液、例えばHEPES−EDTAを好ましくはpH7〜8においてそれに添加する。
リアルタイムPCR系において、増幅(増幅された)産物の蓄積のモニタリングは、オリゴヌクレオチドプローブの標識によって可能になる。
好ましくは、レポーターは、プローブの5’末端に結合しており、および/または好ましくは、クエンチャーは、プローブの3’末端に結合している。
DNAポリメラーゼは、標的DNAを複製するだけでなく、その5’−3’エンドヌクレアーゼ活性で、2つの蛍光マーカーを離隔し、したがってレポーターの発光を十分に検出可能にすることにより、それにハイブリダイズしたオリゴヌクレオチドプローブも分解する。リアルタイムPCR中に複製した全てのDNAペアについて、レポーター分子(蛍光マーカー)の解放が生じることを考慮すると、増幅プロセス中に蓄積する相対蛍光は、増幅されたDNAの量に常に比例する。リアルタイムPCR反応の全持続期間にわたり、発光スペクトル収集プログラム、例えば配列検出システム(SDS)を介して、プログラムによって計測されるレポーターの蛍光の変動を増幅カイネティクスのリアルタイム表示に変換することが可能である。
系の「バックグラウンドノイズ」のわずかな変動に起因するのではなく、特異的増幅イベントに起因してレポーターの蛍光閾値に達するPCRサイクルは、反応の閾値サイクル(Ct)として定義される。本発明の方法において、標的DNAは、閾値サイクルにおいて、したがってPCR反応が指数関数増殖期である場合に定量される。
したがって、増幅ステップは、細菌株のゲノタイピングを可能にし、すなわち、それは、不明試料のゲノタイプの判定を可能にする。本発明の増幅により、好ましくは単一ヌクレオチドの突然変異と関連する多型、すなわち点突然変異またはSNP(一塩基多型)を区別することが可能である。この場合、SNPは、突然変異の場合に抗生物質耐性を担うHp遺伝子内に収まる。あるいは、本発明の増幅は、前記ヌクレオチドが、正常タンパク質中に存在するものと異なるアミノ酸になるトリプレットの翻訳を決定する単一ヌクレオチドの突然変異を区別することを可能にする。
好ましくは、本発明に関して、一塩基多型(SNP)は、多型、すなわち単一ヌクレオチドに影響し、多型アレルが1%超の比率で集団中に存在するような遺伝子材料(DNA)の(遺伝的)変異を意味する。この閾値未満では、通常、レアバリアントと言われる。
好ましくは、遺伝的変異は、DNA中の塩基の置換、欠失または挿入によって引き起こされ得、コードおよび非コード領域を対象とし得る。多型遺伝子座は、集団の少なくとも2%がヘテロ接合型であるものである。これらの多型の結果は、タンパク質変異がそのタンパク質の機能も構造も変更しない場合、サイレントであり得る。あるいは、前記多型は、特に表現型の変化が観察される場合、例えばタンパク質が機能的に変更されている場合、非サイレント結果を有し得る。
前記遺伝子は、好ましくは、23S rRNA、gyrAおよびPBP−1の中から選択される。
23S rRNA遺伝子は、突然変異の場合にクラリスロマイシンに対する耐性を担う。特に、この場合、本発明の方法を用いると、クラリスロマイシン耐性のほとんどを担う23S rRNA遺伝子中に収まる最も広範な突然変異の少なくとも1つを判定することが可能である。好ましくは、クラリスロマイシン耐性を担う前記突然変異は、A2143G突然変異(すなわち2143位のアデニンがグアニンに改変されている)、A2142C突然変異およびA2142G突然変異の中から選択される。
具体的には、91位におけるトリプレット、すなわちGAT配列(アスパラギン酸をコードする)は、最初のヌクレオチド塩基の部位において、GGTトリプレット(グリシンをコードする)またはTATトリプレット(チロシンをコードする)で置換される。
したがって、本発明の方法を用いて判定されるレボフロキサシン耐性を担う突然変異は、好ましくは、G271A、G271TおよびA272Gから選択される。
好ましくは、本発明の方法を用いて判定されるアモキシシリン耐性を担う突然変異は、C413AおよびC413Gの中から選択される。
好ましくは、プライマーのペアは、配列番号5および配列番号6を含む。前記プライマーのペアは、配列番号1および/または2の配列、すなわちHpのクラリスロマイシン耐性を担う突然変異部位の少なくとも1つを含むHpの23S rRNA遺伝子の配列の部分の増幅を可能にする。
あるいは、プライマーのペアは、配列番号9および配列番号10を含む。前記プライマーのペアは、配列番号3の配列、すなわちHpのレキソフロキサシン(lexofloxacin)耐性を担う突然変異部位の少なくとも1つを含むHpのgyrA遺伝子の配列の部分の増幅を可能にする。
増幅は、プライマーのペアに加え、少なくとも2つのオリゴヌクレオチドプローブを使用して実施される。それぞれのオリゴヌクレオチドプローブは、一端、好ましくは5’末端において高強度マーカー(レポーター)で標識されており、かつ他端、好ましくは3’において非蛍光または低強度マーカー(クエンチャー)で標識されている。さらに、2つのオリゴヌクレオチドプローブのうちの一方は、前記遺伝子の正常アレルに相補的かつ特異的であり、および一方は、前記抗生物質耐性を担う突然変異アレルに相補的かつ特異的である(図1を参照されたい)。
特に、配列番号13および/または配列番号14は、プライマーのペア配列番号5および配列番号6と使用され、配列番号13は、抗生物質耐性を担う突然変異を有さない23S rRNA遺伝子、好ましくは配列番号1および/または2の少なくとも1つの部分に相補的であり、かつ配列番号14は、好ましくはA2143G突然変異、A2142C突然変異およびA2142G突然変異の中から選択される抗生物質耐性を担う突然変異を担持する23S rRNA遺伝子、好ましくは配列番号1および/または2の少なくとも1つの部分に相補的である。または配列番号3は、正常アレルに特異的であり、かつ配列番号4は、クラリスロマイシン耐性を担う突然変異を担持するものに特異的である。
本発明の配列を添付の配列表に提供する。添付の配列表に含有される配列は、詳細な説明に組み込まれるものと理解すべきである。
本発明の主題は、表Iに列記され、添付の配列表に全体として記載される配列番号1〜23と少なくとも70%、80%、85%、90%、または95%の同一性を特徴とする配列も含むとみなすべきである。
− リアルタイムPCRにより、前記抗生物質に対する耐性を担う少なくとも1つの突然変異部位を含む少なくとも1つのHp遺伝子の少なくとも1つの部分を増幅させるための少なくとも1つのプライマーのペアであって、23S rRNA遺伝子について配列番号5および6の中から、gyrA遺伝子について配列番号9および10の中から、かつpbp−1遺伝子について配列番号13および14の中から選択される、少なくとも1つのプライマーのペア、および
− 2つの異なるマーカーで標識された少なくとも2つのオリゴヌクレオチドプローブであって、少なくとも1つのオリゴヌクレオチドプローブは、前記抗生物質に対する耐性を担う少なくとも1つの突然変異部位を含む少なくとも1つのHp遺伝子の正常アレルの少なくとも1つの部分に相補的かつ特異的であり、および少なくとも1つのオリゴヌクレオチドプローブは、前記抗生物質に対する耐性を担う少なくとも1つの突然変異部位を含む少なくとも1つのHp遺伝子の突然変異アレルの少なくとも1つの部分に相補的かつ特異的であり、前記オリゴヌクレオチドプローブは、配列番号13〜23を含む群において選択される、少なくとも2つのオリゴヌクレオチドプローブ
を含み、
− 配列番号13および/または14は、プライマーのペア配列番号5および6と使用され、および配列番号13は、クラリスロマイシン耐性を担う突然変異を有さない23S rRNA遺伝子、好ましくは配列番号1および/または2の少なくとも1つの部分に相補的であり、かつ配列番号14は、A2143G、A2142CおよびA2142Gを含む群において選択されるクラリスロマイシン耐性を担う突然変異を有する23S rRNA遺伝子、好ましくは配列番号1および/または2の少なくとも1つの部分に相補的であり、
− 配列番号15、16および17は、プライマーのペア配列番号7および8と使用され、および配列番号15は、レボフロキサシン耐性を担う突然変異を有さないgyrA遺伝子、好ましくは配列番号3の少なくとも1つの部分に相補的であり、配列番号16および/または17は、レボフロキサシン耐性を担うAsn87Lys突然変異を有するgyrA遺伝子、好ましくは配列番号3の少なくとも1つの部分に相補的であり、
− 配列番号18、19および20は、プライマーのペア配列番号9および10と使用され、および配列番号18は、レボフロキサシン耐性を担う突然変異を有さないgyrA遺伝子、好ましくは配列番号3の少なくとも1つの部分に相補的であり、配列番号19は、Asp91Gly突然変異を有するgyrA遺伝子の少なくとも1つの部分に相補的であり、かつ/または配列番号20は、レボフロキサシン耐性を担うAsp91Ty突然変異を有するgyrA遺伝子、好ましくは配列番号3の少なくとも1つの部分に相補的であり、
− 配列番号21、22および23は、プライマーのペア配列番号11および12と使用され、および配列番号21は、アモキシシリン耐性を担う突然変異を有さないpbp−1遺伝子、好ましくは配列番号4の少なくとも1つの部分に相補的であり、かつ配列番号22および/または23は、アモキシシリン耐性を担うSer413Arg突然変異を有するpbp−1遺伝子の少なくとも1つの部分に相補的である。
<実施例>
約200mgの糞便を2mlのリン酸緩衝生理食塩水(PBS)中で可溶化させた。
続いて、可溶化した糞便をVortexミキサ上で約30秒間振盪させることによって均一化した。
次いで、500μlのホモジネートを無菌シリンジで抜き取り、新たな1.5mlの試験管中に移した。500μlのトリアゾル(Triazol)をホモジネートに添加し、それを数秒間にわたり激しく混合した。
続いて、100μlのクロロホルムをホモジネート−トリアゾル(Triazol)の混合物に添加し、それを15秒間にわたり激しく混合し、12000gにおいて4℃で15分間にわたり遠心分離した。
この処理は、3つの区別される相:水相(表面)、中間相(中間)およびフェノール相(底部)の形成をもたらす。
水相を廃棄する。
DNAを含有する残りの相(中間相およびフェノール相)に150μlの100%のエタノールを添加する。試料を反転によって混合し、室温において2〜3分間インキュベートする。
続いて、DNAを2000gにおいて4℃で2分間にわたり遠心分離することによって沈降させる。
次いで、タンパク質を含有する表面相を除去し、1mlのクエン酸ナトリウムをDNAペレットに添加し、それを室温において30分間インキュベートする。この処理後、試料を2000gにおいて4℃で5分間にわたり遠心分離し、上清を除去する。
このクエン酸ナトリウムステップを2回繰り返す。
次いで、2mlの75%のエタノールをペレットに添加し、それを室温において20分間インキュベートし、2000gにおいて4℃で5分間にわたり遠心分離する。エタノールを完全に除去し、DNAペレットを15〜20分間乾燥させておく。
DNAペレットを500μlの8mMのNaOH中で溶解させる。次いで、溶解させた試料を14000gにおいて室温で10分間にわたり遠心分離して不溶性材料を除去する。遠心分離ステップの終了時、上清を新たな試験管中に移し、DNAを60μlの0.1MのHEPESおよび5.5μlの100mMのEDTA中で再懸濁させる。
配列番号1は、ヘリコバクター・ピロリ(Helicobacter pylori)の23S rRNA遺伝子のヌクレオチド配列である。
この配列は、クラリスロマイシンに対する耐性を担う点突然変異の部位である。
ゲノタイピング実験は、不明試料のゲノタイプの判定に使用される終点実験である。このタイプの実験を用いると、ヘリコバクター・ピロリ(Helicobacter pylori)の場合のように、単一ヌクレオチドの突然変異に起因する多型(SNP)を区別することが可能である。
特にクラリスロマイシンに対する耐性の場合、ゲノタイピング実験は、不明試料が、
・Aについてホモ接合型(突然変異を担持しないヌクレオチド配列を有する試料)であるか、
・Gについてホモ接合型(突然変異を担持するヌクレオチド配列を有する試料)であるか、
・ヘテロ接合型(一方のアレル上の突然変異を担持し、他方のアレル上の突然変異を担持しないヌクレオチド配列を有する試料)であるか
を判定する目的を有する。
・陰性対照 − 試料の代わりに水または緩衝液を含有する標本(テンプレートなしの対照(NTC)としても公知)。陰性対照は、増幅を受けないはずである。
・陽性対照 − 既知のゲノタイプを含有する標本。
・試料 − 標的ゲノタイプが既知でない標本。
・レプリケート − 同一の構成要素および容量を含有する同一反応物。
(i)熱サイクル(PCR増幅)、および
(ii)シグナル終点検出
を必要とする。
ラージスケールでの突然変異のゲノタイピングのため、TaqMan(登録商標)化学物質を用いるリアルタイムPCRの方法を使用した。標的配列は、好適なプライマーで予備増幅させなければならない。2つのプライマー間に位置するプローブは、目的の突然変異を含有する配列を同定する。
プライマーの位置を太字で示し、プローブを灰色で強調する。理解され得るとおり、プライマーは、クラリスロマイシン耐性を担うと考えられる突然変異の部位を含有する領域を跨ぎ、プローブは、考えられる突然変異の部位が存在するこの領域の部分に正確に相補的である(すなわち、それと対合する)。
2アレル系において、対象の場合のように、同一反応において異なるフルオロフォア(この場合、正常アレルについてFAM(商標)および突然変異アレルについてVIC(商標))で標識された2つの異なるプローブが存在し、それぞれは分析中のSNPのアレルの1つに相補的である。対合(アニーリング)段階中、プローブのそれぞれは、その特異的鎖とハイブリダイズする。結果は、その所与のアレルについてのホモ接合型の状態と同等の2つの蛍光マーカー(フルオロフォア)の1つの特異的波長における蛍光の増加である一方、両方の波長における蛍光発光は、ヘテロ接合型の状態と同等である。
・正確な合成を確認するため、それぞれのプライマーおよびそれぞれのオリゴヌクレオチドプローブが質量分析によって個々に試験され、
・少なくとも1つの容易に解釈可能なアレル区別クラスタ、すなわち組成および/または位置の観点から互いに類似または近い少なくとも1つの単位群を産生しなければならず、例えば、この場合、それは同一の遺伝子構成を有する遺伝子クラスタまたは類似もしくは密接に相関する産物の群(例えば、突然変異ヘリコバクター・ピロリ(Helicobacter p.)を示す試料の群および/または正常/野生型ヘリコバクター・ピロリを有する群)であり、
・プライマーおよびオリゴヌクレオチドプローブが性能標準に達し得ないアッセイは、品質管理試験をパスせず、
・関連SNPに並行する配列は、フォーマット化され、バリデートされ、かつ順序付けられている。
それぞれのMGB TaqMan(登録商標)プローブは、
・全てのプローブの5’末端における蛍光色素レポーターであって、
− この場合、蛍光色素VIC(登録商標)は、野生型アレルのプローブの5’末端に結合しており、
− 蛍光色素FAM(商標)は、突然変異アレルのプローブの5’末端に結合している、蛍光色素レポーター、
・マイナーグルーブバインダー(MGB)(MGB化学物質は、プローブの融解温度(Tm)をそれらの長さを増加させずに増加させ(Afonina et al.,1997;Kutyavin et al.,1997)、したがってより短鎖のプローブの設計を可能にする。したがって、TaqMan MGBプローブは、対合および非対合プローブ間のTmの値のより大きい差を示し、Tmの値のより大きい差は正確なゲノタイピングを提供する)、
・プローブの3’末端における非蛍光クエンチャー(NFQ)
を含有する。
対象の場合において、以下の量の試料をそれぞれのウェルについて添加した96ウェル光学式読取プレート上でリアルタイムPCRを設定した。
SNPゲノタイピングアッセイは、2つのプライマー(フォワードおよびリバース)およびそれぞれのアレルについて特異的な2つのプローブを含有し、プローブの一方は、5’末端において蛍光マーカーFAM(商標)(赤色蛍光を有する)で標識されており、他方は、蛍光マーカーVIC(登録商標)(緑色蛍光を有する)で標識されている。
− 60℃において1分間、プレリード:初期の蛍光の発光を検出するため、
− 50℃において2分間、
− 95℃において10分間、
− 95℃において15秒間、
− 60℃において1分間、40サイクル、
− 60℃において1分間、ポストリード:3つの異なるゲノタイプのクラスタリングを検出するため。
提供されるSDSソフトウェアを使用して結果を分析し、読み取った。
上記試験を、H.p.感染の診断に現在利用可能な侵襲および非侵襲試験と比較することにより、本方法の感度および特異度を評価した。
Hpについて組織学的に陽性である患者群を分析した。
この目的のため、上記方法を、現在、Hpの診断における判断基準とみなされている試験、すなわち組織学的試験、および組織から抽出されたDNAと比較した。72人のHp陽性患者を分析した。
パラフィン中で封入された組織から細菌DNAを抽出し、耐性を担う突然変異の同定のために上記分子分析に供した。
2つの分子分析間の一致率は100%であった。
分子分析によってのみ検出可能であった数例の偽陰性の存在を考慮すると、組織学的診断との一致率は92%であった。
Claims (13)
- 個体から単離された生物学的試料中のヘリコバクター・ピロリを判定するための、および/または少なくとも1つの抗生物質に対する前記ヘリコバクター・ピロリの耐性を判定するためのインビトロ方法であって、
I.個体から単離された生物学的試料を得るステップ、
II.前記試料からDNAを精製(単離)するステップ、および
III.前記抗生物質に対する前記耐性を担う少なくとも1つの突然変異部位を含むヘリコバクター・ピロリ(Helicobacter pylori)の少なくとも1つの遺伝子の少なくとも1つの部分を増幅させるステップであって、前記増幅は、オリゴヌクレオチドの少なくとも1つのペア(プライマーのペア)および少なくとも2つのオリゴヌクレオチドプローブを使用するリアルタイムPCRによって実施され、前記プライマーのペアは、前記突然変異を跨ぐDNA領域中でハイブリダイズし、それぞれのオリゴヌクレオチドプローブは、5’および3’末端において2つの異なるマーカーで標識されており、少なくとも1つのオリゴヌクレオチドプローブは、前記遺伝子の野生型アレルの少なくとも1つの遺伝子部分に相補的かつ特異的であり、および少なくとも1つのオリゴヌクレオチドプローブは、前記抗生物質耐性を担う前記遺伝子の突然変異アレルの少なくとも1つの遺伝子部分に相補的かつ特異的である、ステップ、
IV.好ましくは、PCRサイクル閾値において、前記オリゴヌクレオチドプローブが標識されている前記マーカーのレベルを計測することにより、増幅された野生型および/または突然変異DNAを定量するステップであって、前記野生型アレルの前記少なくとも1つの遺伝子部分に相補的かつ特異的な前記プローブが標識されている前記マーカーのみの存在は、正常ホモ接合型ゲノタイプと、したがって前記抗生物質に耐性でない前記Hpの存在とを定義し、前記遺伝子の前記突然変異アレルの前記少なくとも1つの遺伝子部分に相補的かつ特異的な前記プローブが標識されている前記マーカーのみの存在は、突然変異ホモ接合型ゲノタイプと、したがって前記抗生物質に耐性である前記Hpの存在とを定義し、および両方のマーカーの存在は、前記遺伝子の野生型アレルおよび突然変異アレルを有するヘテロ接合型ゲノタイプと、したがって前記抗生物質に耐性である前記Hpの存在とを定義するステップを含む方法。 - 前記生物学的試料は、糞便試料である請求項1に記載の方法。
- 前記抗生物質は、クラリスロマイシン、レボフロキサシン、アモキシシリン、メトロニダゾール、チニダゾール、テトラサイクリン、リファブチンおよびそれらの組合せを含む群から選択される請求項1または2に記載の方法。
- それぞれのオリゴヌクレオチドプローブは、前記5’末端において高強度蛍光マーカー(レポーター)で標識されており、かつ前記3’末端において非蛍光または低強度マーカー(クエンチャー)で標識されている請求項1〜3のいずれか一項に記載の方法。
- 前記マーカーは、VIC、FAM、HEX、JOE、NED、SYBER、TAMRA、TETおよびROXから選択される請求項1〜4のいずれか一項に記載の方法。
- ヘリコバクター・ピロリの前記遺伝子は、23S rRNA、gyrAおよびpbp−1から選択される請求項1〜5のいずれか一項に記載の方法。
- 前記突然変異は、点突然変異または一塩基多型(SNP)である請求項1〜6のいずれか一項に記載の方法。
- 前記突然変異は、前記23S rRNA遺伝子についてA2143G、A2142CおよびA2142G、前記gyrA遺伝子についてC261A、C261G、G271A、G271TおよびA272G、ならびに前記pbp−1遺伝子についてC413AおよびC413Gから選択され、前記23S rRNA遺伝子の前記突然変異は、前記Hpのクラリスロマイシン耐性を担い、前記gyrA遺伝子の前記突然変異は、前記Hpのレボフロキサシン耐性を担い、および前記pbp−1遺伝子の前記突然変異は、前記Hpのアモキシシリン耐性を担う請求項1〜7のいずれか一項に記載の方法。
- ヘリコバクター・ピロリ(Helicobacter pylori)の少なくとも1つの遺伝子の前記少なくとも1つの部分は、配列番号1〜4またはそれらの組合せの中から選択され、配列番号1および2は、前記23S rRNA遺伝子を指し、配列番号3は、前記gyrA遺伝子を指し、および配列番号4は、前記pbp−1遺伝子を指す請求項1〜8のいずれか一項に記載の方法。
- 前記少なくとも1つのプライマーのペアは、配列番号5〜14を含む群から選択され、そのうちの配列番号5および6は、前記23S rRNA遺伝子、好ましくは配列番号1および/または2の前記少なくとも1つの部分を増幅させるためのものであり、配列番号9および10は、前記gyrA遺伝子、好ましくは配列番号3の前記少なくとも1つの部分を増幅させるためのものであり、かつ配列番号13および14は、前記pbp−1遺伝子、好ましくは配列番号4の前記少なくとも1つの部分を増幅させるためのものである請求項1〜9のいずれか一項に記載の方法。
- 前記オリゴヌクレオチドプローブは、マイナーグルーブバインダー化学物質で修飾されている請求項1〜10のいずれか一項に記載の方法。
- 前記オリゴヌクレオチドプローブは、配列番号13〜23を含む群から選択され、
−配列番号13および/または14は、前記プライマーのペア配列番号5および6と使用され、および配列番号13は、抗生物質耐性を担う前記突然変異を有さない前記23S rRNA遺伝子、好ましくは配列番号1および/または2の少なくとも1つの部分に相補的であり、かつ配列番号14は、A2143G、A2142CおよびA2142Gから選択されるクラリスロマイシン耐性を担う突然変異を有する前記23S rRNA遺伝子、好ましくは配列番号1および/または2の少なくとも1つの部分に相補的であり、
−配列番号15、16および17は、前記プライマーのペア配列番号7および8と使用され、および配列番号15は、レボフロキサシン耐性を担う前記突然変異を有さない前記gyrA遺伝子、好ましくは配列番号3の少なくとも1つの部分に相補的であり、かつ配列番号16および/または17は、レボフロキサシン耐性を担うAsn87Lys突然変異を有する前記gyrA遺伝子、好ましくは配列番号3の少なくとも1つの部分に相補的であり、
−配列番号18、19および20は、前記プライマーのペア配列番号9および10と使用され、および配列番号18は、レボフロキサシン耐性を担う前記突然変異を有さない前記gyrA遺伝子、好ましくは配列番号3の少なくとも1つの部分に相補的であり、配列番号19は、レボフロキサシン耐性を担うAsp91Gly突然変異を有する前記gyrA遺伝子の少なくとも1つの部分に相補的であり、かつ/または配列番号20は、レボフロキサシン耐性を担うAsp91Ty突然変異を有する前記gyrA遺伝子、好ましくは配列番号3の少なくとも1つの部分に相補的であり、
−配列番号21、22および23は、前記プライマーのペア配列番号11および12と使用され、および配列番号21は、アモキシシリン耐性を担う前記突然変異を有さない前記pbp−1遺伝子、好ましくは配列番号4の少なくとも1つの部分に相補的であり、かつ配列番号22および/または23は、アモキシシリン耐性を担うSer413Arg突然変異を有する前記pbp−1遺伝子の少なくとも1つの部分に相補的である請求項1〜11のいずれか一項に記載の方法。 - 個体から単離された生物学的試料中のヘリコバクター・ピロリを判定するための、ならびに/またはA2143G、A2142CおよびA2142Gを含む群において選択される23S rRNA遺伝子の突然変異によって引き起こされるクラリスロマイシンに対する、かつ/もしくはC261A、C261G、G271A、G271TおよびA272Gを含む群において選択されるgyrA遺伝子の突然変異によって引き起こされるレボフロキサシンに対する、かつ/もしくはC413AおよびC413Gを含む群において選択されるpbp−1遺伝子の突然変異によって引き起こされるアモキシシリンに対する前記ヘリコバクター・ピロリの耐性を判定するためのキットであって、
−リアルタイムPCRにより、前記抗生物質に対する前記耐性を担う少なくとも1つの突然変異部位を含む少なくとも1つのヘリコバクター・ピロリ遺伝子の少なくとも1つの部分を増幅させるための少なくとも1つのプライマーのペアであって、前記23S rRNA遺伝子について配列番号5および6から、前記gyrA遺伝子について配列番号9および10から、かつ前記pbp−1遺伝子について配列番号13および14から選択される、少なくとも1つのプライマーのペア、および
−2つの異なるマーカーで標識された少なくとも2つのオリゴヌクレオチドプローブであって、そのうちの少なくとも1つのオリゴヌクレオチドプローブは、前記抗生物質に対する前記耐性を担う少なくとも1つの突然変異部位を含むヘリコバクター・ピロリの少なくとも1つの遺伝子の野生型アレルの少なくとも1つの部分に相補的かつ特異的であり、および少なくとも1つのオリゴヌクレオチドプローブは、前記抗生物質に対する前記耐性を担う少なくとも1つの突然変異部位を含むヘリコバクター・ピロリの少なくとも1つの遺伝子の突然変異アレルの少なくとも1つの部分に相補的かつ特異的であり、前記オリゴヌクレオチドプローブは、配列番号13〜23を含む群において選択される、少なくとも2つのオリゴヌクレオチドプローブを含み、
−配列番号13および/または14は、前記プライマーのペア配列番号5および6と使用され、および配列番号13は、クラリスロマイシン耐性を担う前記突然変異を有さない前記23S rRNA遺伝子、好ましくは配列番号1および/または2の少なくとも1つの部分に相補的であり、かつ配列番号14は、A2143G、A2142CおよびA2142Gを含む群において選択されるクラリスロマイシン耐性を担う突然変異を有する前記23S rRNA遺伝子、好ましくは配列番号1および/または2の少なくとも1つの部分に相補的であり、
−配列番号15、16および17は、前記プライマーのペア配列番号7および8と使用され、および配列番号15は、レボフロキサシン耐性を担う前記突然変異を有さない前記gyrA遺伝子、好ましくは配列番号3の少なくとも1つの部分に相補的であり、かつ配列番号16および/または17は、レボフロキサシン耐性を担うAsn87Lys突然変異を有する前記gyrA遺伝子、好ましくは配列番号3の少なくとも1つの部分に相補的であり、
−配列番号18、19および20は、前記プライマーのペア配列番号9および10と使用され、および配列番号18は、レボフロキサシン耐性を担う前記突然変異を有さない前記gyrA遺伝子、好ましくは配列番号3の少なくとも1つの部分に相補的であり、配列番号19は、Asp91Gly突然変異を有する前記gyrA遺伝子の少なくとも1つの部分に相補的であり、かつ/または配列番号20は、レボフロキサシン耐性を担うAsp91Ty突然変異を有する前記gyrA遺伝子、好ましくは配列番号3の少なくとも1つの部分に相補的であり、
−配列番号21、22および23は、前記プライマーのペア配列番号11および12と使用され、および配列番号21は、アモキシシリン耐性を担う前記突然変異を有さない前記pbp−1遺伝子、好ましくは配列番号4の少なくとも1つの部分に相補的であり、かつ配列番号22および/または23は、アモキシシリン耐性を担うSer413Arg突然変異を有する前記pbp−1遺伝子の少なくとも1つの部分に相補的であるキット。
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