JP2019505571A - インドール誘導体を含む医薬組成物、その調製方法及びその使用 - Google Patents

Abstract

本発明は、一般式１のインドール誘導体を含む明確かつ安定な医薬組成物、工業的生産に適した薬理学的に活性な異性体の高含量を含む二塩酸塩の調製のための方法、及び医薬組成物におけるこれらの使用を提供する。本発明は、癌の治療のための前記組成物の使用のための方法をさらに提供する。本発明はまた、これらの化合物を癌疾患を治療するために一般的に使用される他の治療と併用する方法を提供する。【選択図】なし

Description

本発明は、その高い薬理学的に活性な異性体の高い内容を含む、インドール誘導体の改善された安定な医薬組成物に関する。本発明はまた、組成物の使用による癌の治療の方法及びその調製方法に関する。本発明はまた、組成物の使用による癌の治療のための方法及びその調製のための方法に関する。本発明はさらに、薬理学的に活性な化合物の大規模合成を可能にすることに関する。

インドール誘導体及びその薬学的に許容可能な塩は、Ｎ−メチリデン実体におけるシス／トランス異性体（Ｚ／Ｅ異性体）の混合物の形態で、ＷＯ２０１２／１２８６８９及びＷＯ２０１４／０４６５８９に開示される。これらの化合物は、固形癌の治療で有用である。抗癌効果は、化合物の鉄−キレート化特性に基づくと考えられている。生理学的条件における異性化の速度は、実質的であると思われたので、異性体の薬理学的効果は、実質的に類似しているか、又は同一であるとさえ推定された。

Ｅｓｈｂａらは、Ｎ−（１−ピリジン−２−イル−メチリデン）−Ｎ−（９Ｈ−１，３，４，９−テトラザ−フルオレン−２−イル）−ヒドラジン誘導体を抗ウイルス及び抗癌剤として開示し、ここで、１つの化合物のみが細胞傷害活性を示す。医薬組成物は、特にその薬理学的に活性な成分が明確に定義されていることが望ましい。したがって、化合物は、２つの異性体に存在する場合、前記化合物のより活性な異性体が、その医薬組成物において支配的でなければならないことが不可欠である。また、医薬組成物は、その成分の顕著な変化なしに、長期間保存するのに十分なほど安定でなければならない。

新たしく効果的な抗癌剤は、癌に罹患している患者のために開発が必要である。最終的な製品に到達するまで、全面的な薬物開発は、多くの困難に関連している。当初、有望な化合物が同定され、異なるインビトロモデルにおいて実験的に試験され、その後、異なるマウスモデルの使用によって全臨床試験が最も頻繁に開始される。この点までは、少量の化合物しか合成する必要がなく、純度の要求は、ヒトで行われる臨床研究で必要とされるものよりも低い。例えば、活性化合物を同定及び単離し、特定の異性体が他のものよりも強力であるかどうか、純度、安定性の許容される程度をさらに有し、前記化合物が、大規模で製造されることができるかどうかを調査し、重要である薬剤開発における多くのステップがある。これらは、些細なステップではなく、上記のような製造上の問題により、多くの有望な化合物／薬剤が市場に出回っていない。

発明の概要
本発明は、式１のＥ及びＺ形態の混合物が、高立体純度のそれらの二塩酸塩のＥ形態に移すことができるこという洞察に基づく

本発明の第１の目的は、一般式１で表される化合物又は薬学的に許容される塩の薬学的に活性な異性体（Ｅ）の高含量を含む明確で安定な医薬組成物を提供することであり、式中：
ＲはＨ又はメチル又はＣ_１−Ｃ_４直鎖又は分枝アルキルで置換されるメチレンであり、
Ｒ^１は、Ｈ、Ｃ_１−Ｃ_４直鎖又は分枝アルキル、メトキシ、１〜３個のフッ素、臭素、ハロゲンで置換されるメトキシからなる群から選択され；
Ｒ^２は、Ｈ又はＣ_１−Ｃ_４直鎖又は分枝アルキルであり；
Ｘは、ＣＨ又はＮであり、
Ｙは、ＣＨ又はＮであり、及び
ここで、薬理学的に活性な化合物又は薬学的に許容可能な塩の少なくとも９５重量％（ｗ／ｗ）は、本請求項１に記載のＥ異性体の形態である。

医薬組成物は、癌の治療に使用されることが意図される。１つの側面において、前記化合物の少なくとも９６重量％、又は９７重量％、又は９８重量％、又は少なくとも９８．５重量％は、Ｅ型である。別の側面において、薬理学的に活性な化合物の少なくとも９９重量％、好ましくは少なくとも９９．５重量％、最も好ましくは少なくとも９９．８重量％がＥ異性体の形態である。理想的には、前記化合物の１００重量％は、Ｅ異性体の形態である。本発明の医薬組成物はまた、少なくとも１つの薬理学的に許容可能な添加剤及び／又は担体をさらに含み得る。

本発明の好ましい態様によれば、一般式１の化合物は、Ｒ^１によって置換されていないモノ−、ジ−又はトリ−アザカルバゾリルの６、７、７、９位の１つで、Ｃ_１−Ｃ_４直鎖又は分枝アルキルによってさらに置換され得る。

一般式１、並びに１ａ及び１ｂの好ましい化合物を表１に列挙する。
１つの態様において、Ｒ及びＲ^１は、ＣＨ_３であり、Ｒ^２は、Ｈである。好ましくは、ＲはＣＨ_３であり、Ｒ^１は６−ＣＨ_３であり、Ｒ^２はＨである。より好ましくはＸ及びＹは、Ｎである。

また別の態様において、ＲはＣＨ_２Ｃ（ＣＨ_３）_３であり、Ｒ^１はＣＨ_３であり、Ｒ^２はＨである。好ましくは、ＲはＣＨ_２Ｃ（ＣＨ_３）_３であり、Ｒ^１は、６−ＣＨ_３である、Ｒ^２はＨである。より好ましくは、Ｘ及びＹはＮである。
本発明の最も好ましい化合物は、化合物Ａ、Ｂ及びＣである（表１参照）。

１つの態様において、本発明の医薬組成物は、結晶形態の薬学的に許容可能な塩の形態の一般式１の薬理学的に活性な化合物を含む。塩は、式１の遊離塩基の安定化に適した任意の塩、すなわち、例えば塩化物、硝酸塩及び硫酸塩などの酸性塩であり得る。塩は、モノ又はジ塩であり得る。好ましくは、塩は、モノ塩又は二塩酸塩である。最も好ましくは、二塩酸塩である。

添加剤（複数可）は、マンニトール、グルコース、スクロース又は他の適切な糖誘導体のいずれかであり得る。好ましい態様において、添加剤は、Ｄ−マンニトールである。Ｄ−マンニトールの濃度は、０．５〜２０％（ｗ／ｖ）の範囲であり得る。好ましくは、濃度は、１．０〜１５重量％（ｗ／ｖ）の範囲である。より好ましくは、濃度は、３〜１０％（ｗ／ｖ）の範囲である。最も好ましくは、濃度は、４〜６％（ｗ／ｖ）の範囲である。Ｄ−マンにトールの濃度は、別の側面において、約５％（ｗ／ｖ）であることがより好ましい。

本発明は、上記医薬組成物を調製する方法をさらに
提供する。方法は、以下のステップを含む：
ｉ．遊離塩基として一般式１の化合物の溶液を提供するステップ、
ｉｉ. 溶液を一般式１ｂの化合物、すなわち、二塩酸塩を形成するのに十分な量のエタノール中の塩酸と反応させるステップであって、二塩酸塩が自発的に析出するステップ；
ｉｉｉ.溶媒のステップ（ｉｉ）で得られた二塩酸塩を含む沈殿物をストリッピングするステップ、
ｉｖ.任意には、薬学的に許容可能な添加剤を含む、水性溶媒中にステップ（ｉｉｉ）の二塩酸塩を含む沈殿物を溶解するステップ、及び
ｖ.混合物を凍結乾燥させ、それによって凍結乾燥粉末又はケーキを得るステップ。

一般式１の遊離塩基の溶媒は、例えばメタノールであり得る。沈殿物のストリッピング、すなわちステップ（ｉｉｉ）は、例えば空気又は不活性ガスブリードによって真空でされ得る。
Ｅ異性体の量は、上記医薬組成物と同じ範囲である。
１つの態様において、水性溶媒は水である。好ましくは、滅菌水である。

添加剤（複数可）は、上記の通りであることができる。沈殿物を溶解させる順序は、プロセスにおいて限定されず、変更され得る。沈殿物は、例えば、固体形態であり得、添加剤と例えば固体形態で混合され得、撹拌しながら水性溶媒に添加され得る。あるいは、添加剤は、固体沈殿物が添加され、撹拌しながら溶解される水溶液に溶解され得る。

さらなる目的は、前記貯蔵安定性医薬組成物の水溶液の形態の注射又は点滴のための医薬製剤を提供することである。
水性溶媒においてステップ（ｖ）の凍結乾燥粉末を再構成することにより、例えば、注射用水（ＷＦＩ）として、医薬製剤が得られる。

薬理学的に活性な化合物の濃度は、０．０５〜４０ｍｇ／ｍｌの範囲であり得る。１つの態様において、薬理学的に活性な化合物の濃度は、０．１〜３０ｍｇ／ｍｌの範囲である。より好ましくは、薬理学的に活性な化合物は、０．５〜２０ｍｇ／ｍｌの範囲であり得る。さらにより好ましくは、薬理学的に活性な化合物は、０．７５〜１０ｍｇ／ｍｌの範囲であり得る。前記薬理学的に活性な化合物の濃度は、最も好ましくは、約１ｍｇ／ｍｌであり得る。

製剤のｐＨは４未満である。前記製剤のｐＨは、薬理学的に活性な化合物の濃度に依存し、通常、０．５〜４の範囲である。例えば、薬理学的に活性な化合物の１ｍｇ／ｍｌの濃度を有する製剤は、２〜３の範囲のｐＨを有する。

再構成は、第１の量の溶媒を添加することによって凍結乾燥物を溶解させ、その後所望の最終濃度まで溶媒を添加するなど、１つ以上のステップで実施され得る。
前記薬理学的に活性な化合物を含む凍結乾燥粉末を再構築するための水性溶媒はまた、上記のような薬理学的に許容可能な添加剤を含み得る。

本発明の別の目的は、本発明の医薬組成物を単独で、又は別の抗癌治療と組み合わせて、本発明の医薬組成物を使用することによって対象の癌を緩和、軽減又は治療するための方法を提供することである。

医薬製剤の投与経路は、点滴入又は注射によるものであり得る。しかしながら、製剤又は組成物の投与のための任意の適切な経路を使用し得る。製剤又は組成物は、例えば、動脈内、筋肉内、胸膜内、経口、直腸、経腸、病変内又は腫瘍内、及び髄腔内投与で投与され得る。

本発明の別の目的は、一般式１ｂで例示される沈殿物を提供することであり、

式中、一般式１ｂの少なくとも９５重量％（ｗ／ｗ）の薬理学的に活性な化合物は、Ｅ異性体の形態である。

Ｅ異性体の量は、上記の医薬組成物の範囲と同じであり得る。
一般式１ｂの化合物は、式１のインドール誘導体の沈殿物であり、ここで置換Ｒ、Ｒ^１、Ｒ^２、Ｘ及びＹは、式１について上記で定義した通りである。一般式１ｂの好ましい化合物を表１に列挙する。一般式１ｂの最も好ましい化合物は、表１の化合物Ａ、Ｂ及びＣとして置換される。

本発明の別の目的は、上記の前記化合物又はその薬学的に許容可能な塩を含む沈殿物を調製する方法を提供することであり、前記方法は、医薬組成物について上記のプロセスステップｉ）〜ｉｉｉ）に対応する。

１つの側面において、エタノール中の二塩酸（すなわち、ステップｉｉ）を２つのステップで添加し、エタノール中の塩酸の１．０〜１．１５当量を第１のステップで添加し、エタノール中の塩酸の２．０〜２．５当量を第２ステップで添加する。あるいは、１つのステップ又は複数のステップで添加を行い得る。塩は、ステップ（ｉｉ）において自発的に沈殿する。
上記の沈殿物はまた、医薬組成物中で使用されることができる。

沈殿物を直接的に、又は凍結乾燥物へのさらなる加工前の乾燥後に使用されることができる。
前記沈殿物のエタノール含量は、前記沈殿物の２〜１５重量％の範囲である。好ましくは、前記沈殿物の４〜１３重量％又は、９〜１１重量％の範囲である。１つの態様において、エタノールの量は、前記沈殿物の１０．４〜１０．６重量％である。

本発明は、一般式１ａの化合物を含む凍結乾燥物をさらに提供し、

式中、一般式１ａの薬理学的に活性な化合物の少なくとも９５重量％（ｗ／ｗ）は、Ｅ異性体の形態である。Ｅ異性体の量は、上記の医薬組成物について同じ範囲であり得る。

一般式１ａの化合物は、式Ｉについて上記インドール誘導体の二塩酸塩である。
最も好ましい化合物は、上記式１及び１ｂについて記載されるような置換基である。

本発明は、前記凍結乾燥物を調製する方法をさらに提供し、その方法は、以下のステップを含む：
ａ）一般式１ｂの沈殿物を水性溶媒に溶解するステップ、
ｂ）得られた溶液をろ過するステップ、
ｃ）ステップｂ）の溶液を凍結乾燥させて、一般式１ａの化合物を含む凍結乾燥物を得るステップ。

１つの側面において、沈殿物は、ステップａ）で撹拌しながら水性溶媒に溶解され得る。この方法は、詳細な説明でさらに記載される。
ステップａ）の沈殿物は、式１又は１ｂについて記載される化合物のいずれかとして置換され得る。別の側面において、沈殿物は、記載された化合物の１つ又は組み合わせを含み得る。さらに別の態様において、本発明の異なる化合物を含む別個の沈殿物を混合し得る。

水性溶媒は、少なくとも１つの薬理学的に許容可能な添加剤をさらに含み得る。添加剤及び添加剤の濃度、上記のように記載され得る。
ステップｂ）の得られた溶液を、好ましくは、少なくとも１つの滅菌フィルターを通してろ過することができ、いくつかの態様において、ステップｂ）の得られた溶液を、２つの滅菌フィルターでろ過する。得られた溶液は、例えば、ステップｃ）の前に滅菌バルク中に回収され得る。ステップｂ）の溶液はまた、凍結乾燥に適したバイアルに充填され得る。

本発明のさらに別の目的は、医薬組成物での使用のための上記のような沈殿物又は凍結乾燥物を提供することである。
本発明の医薬組成物（すなわち、凍結乾燥物）及び沈殿物は、室温で少なくとも１２ヶ月間安定である。好ましくは、医薬組成物（すなわち、凍結乾燥物）は、室温で少なくとも２４ヶ月間安定である。

本発明のさらに別の目的は、医薬組成物、すなわち、癌の治療において使用のための前記化合物を含む凍結乾燥物を提供することである。
１つの側面において、本発明の凍結乾燥物は、例えば化合物Ａ２、Ｂ２又はＣ２などの本発明の薬理学的に活性な化合物の１つだけを含み得る。別の側面において、本発明の凍結乾燥物は、本発明の化合物の組み合わせを含み得る。さらに別の側面において、本発明の前記化合物又は薬学的に許容可能な塩を含む凍結乾燥物は、癌治療で使用のための少なくとも１つの他の薬理学的に活性な化合物と組み合わせて本発明の化合物の少なくとも１つを含み得る。

本発明の化合物は、別々に又は混合物として投与され得る。化合物は、別の薬剤又は抗癌治療と同時に、又はその前後にさらに投与され得る。
上記の医薬組成物、沈殿物又は製剤は、例えば、病理学的に増殖する細胞によって特徴付けられる疾患又は障害の予防又は治療に使用され得る。

医薬製剤は、水性溶媒中に前記組成物を再構成することにより、点滴又は注射に適し得る。好ましくは、製剤は、点滴のために使用される。
薬理学的に活性な化合物の最終濃度は、０．５〜３０ｍｇ／ｍｌの範囲であり得る。

医薬組成物及び製剤は、０．５〜４の範囲のｐＨを有し得る。好ましくは、ｐＨは、１〜３の範囲である。上記のように、ｐＨは、薬学的に活性な化合物の濃度に依存し、例えば、１ｍｇ／ｍｌの製剤のｐＨは、２〜３の範囲である。
医薬組成物又は製剤は、共治療剤をさらに含み得る。
好ましくは、本発明の医薬組成物及び製剤は、癌を治療するために使用される。
癌は、固形腫瘍、液体腫瘍及び血液腫瘍であり得る。

さらに、上記の医薬、医薬製剤、組成物、沈殿物又は凍結乾燥物は、化学療法、免疫療法又は免疫調節療法、ホルモン療法、腫瘍の外科的除去、光線力学療法、レーザー療法、温熱療法、凍結療法、血管新生阻害、放射線療法、又はそれらの組み合わせなどの別の抗癌治療と組み合わせて使用され得る。

本発明は、本発明の薬理学的に活性な化合物をそのような治療を必要とする対象に投与する、癌などの病理学的に増殖する細胞によって特徴付けられる疾患又は障害を治療する方法をさらに提供する。

前記薬理学的に活性な化合物（複数可）の有効量は、個体及び癌の形態によって異なる。例えば、その量は、約０．１〜１０ｍｇ／ｋｇ体重、好ましくは０．５〜５ｍｇ／ｋｇ、より好ましくは１〜４ｍｇ／ｋｇ体重である。対象に与えられる総用量は、対象の状態及び癌の形態に依存し、前記対象の体重とは無関係に、５〜８００ｍｇの範囲であり得る。１つの側面において、対象に投与される用量は、３０〜３００ｍｇの範囲である。用量は、以下に例示されるような別の癌治療と組み合わせて投与される場合、さらにより低いことができる。

別の側面において、本発明は、上記の癌を別の抗癌治療と組み合わせて治療する方法を提供する。
上記の異なる態様は、互いに組み合わせることができ、又は別々に使用されることができる。

本発明の１つ以上の態様の詳細は、以下の詳細な説明に記載される。本発明の他の特徴、目的、及び利点は、参照により組み込まれることにより、明細書及び図面、並びに添付の特許請求の範囲から明らかであるだろう。

以下の図は、本発明の側面の例示であり、特許請求の範囲によって包含されるような本発明の範囲を限定することを意味しない。
図１は、化合物Ａの沈殿物（Ａ１）の合成のための合成経路、及び沈殿物の対応する塩、すなわち凍結乾燥物の塩形成ステップ（Ａ２）を示す。 図２ａは、化合物Ａ１の９９．８％の純度を示すＨＰＬＣクロマトグラムを示し、図２ｂは、Ｘ線クロマトグラフィーによって確認された化合物Ａ１のＥ異性体構造を示す。 図３は、様々な細胞株における化合物Ａの用量−反応曲線を示す。 図４ａ〜ｄは、化合物Ａ、Ｂ及びＣについてＨＣＴ１１６細胞（Ａ）における、及び化合物Ａ（ｂ）について、化合物Ｂ（ｃ）について及び化合物Ｃ（ｄ）についてＨｅｐＧ２細胞、ＲＫＯ細胞、ＨｅＬａ細胞、ＣＥＭ細胞及びＴＨＰ−１細胞における用量−反応曲線を示す。

本発明は、構成、プロセスステップ、及び材料などの本明細書中に開示される特定の構成、プロセスステップ、及び材料に限定されないが、材料は、幾分変化し得ることを理解すべきである。本明細書中で使用される用語は、特定の態様のみを記載する目的のために使用され、本発明の範囲が添付の特許請求の範囲及びその等価物によってのみ限定されるので、限定することを意図するものではないことも理解されたい。

引用された全ての参考文献は、参照によってそれらの全体及び個々の刊行物又は特許又は特許出願がすべての目的のためにその全体が参照として組み込まれるように具体的かつ個々に示されているのと同じ程度に全ての目的について本明細書中に組み込まれる。
本発明は、本明細書中で提供される以下の定義、図及び例示的開示を参照することによって最もよく理解される。

本明細書において、一般式１の化合物は、その任意の薬学的に適した沈殿物、溶媒和物、塩又はプロドラッグを含むことが意図される。
本明細書において、用語沈殿物は、例えば、図１の反応４の沈殿ステップの生成物である、沈殿によって得られる二塩酸塩エタノール共結晶化合物、又は二塩酸エタノール溶媒和物を意味する。化合物は、本発明の式１の任意の化合物の沈殿物であり得る。

本明細書において、薬学的に許容可能な化合物は、本明細書に記載される化合物の沈殿物、溶媒和物及び凍結乾燥物を含む。
本明細書において、用語「異性体」は、同じ組成及び分子量を有するが、物理的及び／又は化学的特性が異なる化合物を指す。そのような物質は、原子の同じ数と種類を有するが、構造は異なる。構造上の相違は、構成（幾何異性体）又は偏光面を回転させる能力（立体異性体）であり得る。用語「立体異性体」は、空間におけるそれらの原子の配置が異なる同一の構成の異性体をいう。

本明細書において、特に記載されない限り、用語「薬学的に許容可能な添加剤」は、任意のタイプの非毒性、不活性固体、半固体又は液体充填剤、希釈剤、カプセル化材料又は製剤補助剤を意味する。
本明細書において、特に記載されない限り、用語「薬学的に活性な化合物」は、ヒト及び動物の両方を含む宿主に投与される場合、治療上有効な薬理学的応答を生じる任意の物質を包含する。

本明細書において、用語「投与（ａｄｍｉｎｉｓｔｅｒｉｎｇ）」又は「投与（ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ）」は、薬理学的に有用である様式で対象に薬物を提供することを意味する。
本明細書において、特に記載されない限り、用語「細胞傷害性化合物」は、細胞の増殖を停止させるか、又は死滅させる能力を有する、すなわち、高い細胞傷害活性を有する化合物を指す。

本明細書において、特に記載されない限り、用語「誘導体」は、元の構造の化学反応によって、又は元の構造の部分的な置換である「修飾」によって、又は設計及び新規合成によって直接的に元の構造から形成される化合物を指す。誘導体は、合成であり得るか、又は細胞の代謝産物若しくはインビトロ酵素反応であり得る。

本明細書において、用語「癌」は、任意の悪性新生物疾患、すなわち、異常な及び制御されない細胞分裂によって引き起こされる任意に悪性増殖又は腫瘍を意味することを意味する。用語「癌」は、特に、固体、局在化腫瘍、及び非固形癌形態の両方を含むことを意味する。例えば、前記癌形態は、白血病（ＡＬＬ、ＡＭＬ、ＣＬＬ、ＣＭＬ、ＣＭＭＬ）、Ｔ細胞白血病、多発性骨髄腫、卵巣癌、前立腺癌、子宮頚部腺癌、扁平上皮癌、乳癌、大腸癌、小腸癌、肛門癌、胃癌、腎臓癌、腎盂及び尿管の悪性黒色癌、尿道癌、膀胱癌、肝臓癌、虫垂癌、膵臓癌、肺癌、食道癌、口唇／口腔癌、鼻癌、喉頭癌、脳／中枢神経系癌、皮膚癌、甲状腺及び胸腺癌、肉腫、頭頸部癌、非ホジキンリンパ種（ＮＨＬ）、ホジキンリンパ種、及び偽性腹膜炎からなる群から選択され得る。

本発明は、Ｅ異性体に有利である医薬組成物を調製するための方法を提供する。単結晶Ｘ線は、Ｅ異性体が固体状態で支配的であることを確認した。
本発明の方法を使用することによって、少なくとも９５重量％（ＨＰＬＣによって確認、図２参照）の薬学的に活性な化合物（Ｅ異性体）を含む明確で安定な医薬組成物を得る。

例１ 化合物Ａの合成
第１の実験において、化合物Ａ（遊離塩基）を、アセトン／アセチレート／アセトンニトリルで希釈し、Ｚ異性体ではなくＥ異性体は、溶媒の組み合わせに溶解し、容易にろ過した。この溶媒の組み合わせを使用することによって最終的なＥ異性体含量は、約９２％であった。記載された溶媒の組み合わせは、少量生産中にはうまくいったが、必要とされる溶媒の量が多いため、生産を拡大することはできなかった。したがって、Ｋｇｏｋｏｎｇら、２００５年によって記載される１，２，４−トリアジノ［５，６−ｂ］インドール誘導体の合成に基づく化合物Ａの合成は、本発明者らによって開発された（図１参照）。本発明者らは、溶媒としてメタノール（ＭｅＯＨ）、ＨＣｌの担体としてエタノール中の塩酸（ＨＣｌ／ＥｔＯＨ）（ＥｔＯＨは、抗溶媒としても作用する）を使用する手順を開発した。スケールアッププロセスのその後の開発において、反応容積効率が改善された。さらに、遊離塩基（Ａ）を最終的な塩酸沈殿物（Ａ１）に大規模に変換するための適切な方法も開発された（図１、例１及び２参照）。遊離塩基（Ａ）はＭｅＯＨ単独では溶解しなかったが、約１当量のＨＣｌ／ＥｔＯＨを添加すると、透明な溶液が得られた。

観察されたジスルフィド種により、反応は、窒素下、空気酸化を避けるために実施され得る。反応ステップ１によって生成されたウェットケーキもまた、真空中で乾燥されて得るか、又はウェットケーキは、前もって乾燥することなくさらに処理され得る。不純物は、通気乾燥中に発生しうるので、真空中で乾燥させることによって、不純物の発生は、最小化される。反応ステップ２の生成物化合物が得られる。反応ステップ２の生成物化合物を５０℃でエタノール（２０ｍＬ／ｇ化合物）中のわずかなに過剰の２−アセチルピリジン（１．５当量）と反応さることは、生成物形成が得られたが、５時間後非常にゆっくり変換された（約８％）。

図１は、化合物Ａ（Ｅ及びＺ異性体の混合物；ＩＵＰＡＣ系統名：２−［（１Ｅ，Ｚ）−１−（２−｛６−メチル−５Ｈ−［１，２，４］トリアジノ［５，６−ｂ］インドール−３−イル｝ヒドラジン−１−イリデン）エチル］−ピリジン）の合成の反応ステップ１〜３を示す。

ステップ１ ７−メチルイサチン（４．７５ｋｇ、２９．５ｍｏｌ）の水性懸濁液に、２．８５ｋｇ（３１．３ｍｏｌ）のチオセミカルバジド及び６．１５ｋｇ（４４．５ｍｏｌ）の炭酸カリウムを加えた。撹拌した混合物を、還流下で約３時間加熱し、次に室温に冷却した。７．１のｐＨに到達するまで、酢酸（１００％、３．３ｋｇ、５５．０ｍｏｌ）をゆっくりと加えた。懸濁液を加圧ろ過器でろ過し、ろ過ケーキを水（１９．４ｋｇ）で洗浄し、７．６ｋｇの湿った６−メチル−２Ｈ，３Ｈ，５Ｈ−［１，２，４］トリアジノ［５，６−ｂ］インドール−３−チオンを得た。

ステップ２ 約４．６ｋｇの乾燥６−メチル−２Ｈ，３Ｈ，５Ｈ−［１，２，４］トリアジノ［５，６−ｂ］インドール−３−チオンに対応する先のステップからの湿潤ろ過ケーキは、５７．１ｋｇのヒドラジン一水和物中に懸濁し、混合物を８９℃で１８時間撹拌した。反応混合物を室温に冷却して、生成物を遠心分離により単離し、水（１５．９ｋｇ）及びエタノール（１８．４ｋｇ）で洗浄し、１４５０ＲＰＭで排出した。３−ヒドラジニル−６−メチル−５Ｈ−［１，２，４］トリアジノ［５，６−ｂ］インドールの湿潤ろ過ケーキ（乾燥重量３．８ｋｇに相当する７．８ｋｇ）を洗浄した反応器に戻し、真空下で乾燥させた。

ステップ３ ステップ２から乾燥した３−ヒドラジル−６−メチル−５Ｈ−［１，２，４］トリアジノ［５，６−ｂ］インドールを、水（７６．８５ｋｇ）、酢酸（１００％、６．７０ｋｇ、１１１．６ｍｏｌ）及び２−アセチルピリジン（１０．７５ｋｇ、８８．７ｍｏｌ）を加えた。混合物を３時間、４８．５℃で撹拌して、室温に冷却し、ＮａＯＨ（２７％、６．３ｋｇ、１１０ｍｏｌ）をゆっくりと添加してｐＨ７．０に到達し、２０と２５℃の間の温度に維持した。混合物をこの温度で１ １／４時間さらに撹拌し、生成物を遠心分離により単離した。水（７．３ｋｇ）及びエタノール（５．８ｋｇ）の混合物で洗浄後、ケーキを１４５０ＲＰＭで排出し、次に４７℃で６６時間真空オーブンで乾燥させて、ベージュ／緑色の固体材料の形態で５．８２ｋｇの表題化合物を得た。

図１のステップ４は、化合物Ａ１、化合物Ａのエタノール共結晶（ＩＵＰＡＣ系統名：２−［（１Ｅ）−１−（２−｛６−メチル−５Ｈ−［１，２，４］トリアジノ［５，６−ｂ］インドール−３−イル｝ヒドラジン−１−イリデン）エチル］−ピリジン二塩酸塩）の合成を示す。
２−［（１Ｅ，Ｚ）−１−（２−｛６−メチル−５Ｈ−［１，２，４］トリアジノ［５，６−ｂ］インドール−３−イル｝ヒドラジン−１−イリデン）エチル］ピリジン（５．８０ｋｇ）にエタノール性ＨＣｌ（１２．４ｋｇ、１．０５当量）を加え、透明な溶液が得られるまで、混合物を２８〜３０℃で３０分間撹拌した。溶液をろ過し、追加のエタノール性ＨＣｌ（２８．９５ｋｇ、２．４５当量）を撹拌下で２５℃で１時間４０分かけて加えた。１．０５当量のＨＣｌ／ＥｔＯＨの最初の添加の間に、存在するＺ異性体の大部分は、Ｅ異性体に変換し、一部の一塩酸塩が形成される。二塩酸塩は、ＥｔＯＨ中２．４５当量のＨＣｌの添加によって自然に沈殿する。０．１ＭのＮａＯＨフェノロフタレイン指示薬を用いた滴定によるＥｔＯＨ中のＨＣｌのモル濃度の決定は、約１．１〜１．４ＭのＨＣｌであると計算された。同じ温度で１５分間撹拌を続け、エタノール（４５．８ｋｇ）を加えた。そのように形成された懸濁液を約０〜−５℃に冷却し、１時間撹拌した。遠心分離によって単離された生成物をエタノール（０〜５℃、４５ｋｇ）で洗浄し、次に１４５０ＲＰＭで排出した。ケーキを真空下で３７℃で４２時間乾燥させ、７．５７ｋｇの表題化合物（残留溶剤を含まない場合は約１０８％、又はモノ−ＥｔＯＨ、二塩酸塩に基づいて９８％を、黄色〜橙色の固体として得た。

得られたエタノール共結晶二塩酸塩沈殿物は、約２重量％〜２０重量％のエタノール含量を有する。
図１の反応ステップ５は、一般式１ａの化合物を含む凍結乾燥組成物の形成を示す。

ＨＰＬＣによる異性体含量の分析
プロセス開発中、化合物Ａ及び化合物Ａ１の分析は、例えばサンプルの不安定性、溶解性不良、異性化、ＨＰＬＣ等による分析上の問題を引き起こした。したがって、より強固なＨＰＬＣ法は、ＸＢｒｉｄｇｅ Ｃ１８、３．５μｍ、１５０×４．６ｍｍカラムに基づいて発明者らにより開発された。この問題は、希釈剤としてＭｅＯＨ中の２％ギ酸を使用し、コーティングされていない標準ＨＰＬＣサンプルバイアルからＡｇｉｌｅｎｔのコーティング（シラン処理）バイアルに切り替えることによって、さらに解決された。
Ａｇｉｌｅｎｔ １２００／１２６０クロマトグラフィーシステム又は同等品を使用した。

酸性ＨＰＬＣを用いて化合物Ａを分析する場合、約７％は、Ｚ異性体の形態（０．１のＴＥＡ／Ｈ_２Ｏ中のサンプル調製物）であったことがわかった。２日後、同じサンプルを再分析して、Ｚ異性体の約２％、及び化合物Ａ１の加水分解の開始を示した（約１％が検出された）。これは、酸性条件（１〜４の範囲のｐＨ）が、望ましくないＺ異性体を所望のＥ異性体に変換することを示した。その後の塩形成（反応ステップ４）（エタノール中のＨＣｌを使用して）を行う場合、異性体含量は、＜０．５％に低下した。これは、エタノール中のＨＣｌの添加の際、所望の異性体に変換されているので、化合物Ａ、Ｂ又はＣの望ましくない異性体の比較的大きな含量（例えば５％）を許容することができることを意味する。エタノール中のＨＣｌの添加は、二塩酸塩沈殿物（化合物Ａ１、Ｂ１及びＣ１など）を形成する。

ＨＰＬＣ純度
ＨＰＬＣ純度は、全不純物として１００％と計算された。０．０５％未満の全てのピーク及びマトリックス中に存在するピークは、計算から除外される。各不純物の含量は、全ピーク面積（面積％）のパーセンテージとして計算した。全不純物は、不純物の合計≧０．０５％である。

不純物
各不純物の最終結果は、４つの結果の平均である。全不純物は、不純物の合計≧０．０５％として報告される。

残留溶媒
化合物Ａ１の分析は、それが二塩酸塩エタノール共結晶組成物（沈殿物）であることを示した。化合物Ａ１の理論的エタノール含量は１０．６％であり、これは、上記のようなエタノール共結晶（沈殿物）の形成と一致する。

化合物Ａを含む組成物のプロセス開発の間、二塩酸塩エタノール共結晶（例えばＡ１）は、吸湿性が低く、異性体純度の加水分解よび分解に対して有意により安定であることが驚くべきことに示された。
高いレベルのエタノールは、最終製剤（凍結乾燥物）の製造プロセスの一部であるその後の凍結乾燥の間に除去されるので、製剤原料（沈殿物）において許容されることができたと結論付けられた。

メタノールレベルは、比較的高いことを示し；典型的には、組成物Ａ１のメタノール含有量は、１．４〜１．８％であった。長時間の乾燥サイクルは、メタノール含有量を有意に減少させなかった。しかしながら、エタノールの場合のような、最終製剤（例えば、Ａ２）の製造の間に使用されるその後の凍結乾燥サイクルは、ＩＣＨ Ｑ３Ｂガイドラインより低いレベルにメタノールを効率的に除去する。

結論
エタノール及びメタノールレベルの両方は、最終製剤でＩＣＨ Ｑ３Ｃガイドラインよりも十分に低く、これは、注意深くモニターされるという事実に基づいて、より高いレベルは、製剤原料（すなわち、化合物Ａ１の沈殿物）で許容されることができたと結論付けられた。本明細書に記載される全ての他の制限は、Ｐｈ． Ｅｕｒ又はＵＳＰ標準の範囲内である。

同定
サンプルの同一性は、サンプル調製物のメインピーク及び同定のためのサンプル調製物のメインピークの目視検査に基づいた。化合物Ａ１は、クロマトグラムにおいて単一のピークによって表される（図２ａ参照）。

例２ 安定性
二塩酸塩エタノール共結晶沈殿物及び凍結乾燥二塩酸塩の安定性試験を、製剤原料及び生成物の国際調和会議（ＩＣＨ）ガイドラインＱ１Ａ（Ｒ２）安定性試験にしたがって実施した。研究中の安定性サンプルを分析するために使用される全ての分析機器は、現行のｃＧＭＰに適合している。
安定性試験は、１つの長期間試験（５℃、２４、３６ヶ月）及び加速試験（２５℃／６０％ＲＨ、６ヶ月）の２つの部分から構成される。

化合物Ａ（Ａ１）の二塩酸塩エタノール共結晶沈殿物は、密閉したＨＤＰＥ容器に入れたヒートシールされたホイルラミネートパウチ内のヒートシールされた二重ポリエチレンバッグに充填した。サンプルを、長期条件５℃及び加速条件２５℃／６０％ＲＨで保存した。試験期間中、外観は、黄色〜橙色の固体であった。予期しない低レベルの結晶化度を有する２５℃／６０％ＲＨサンプルについてのＸ線粉末回折結果に基づいて分析を行った。結晶化度のレベルは、製剤原料の品質又は安定性に直接影響を有さないが、開発作業の一環として管理される。得られた３６ヶ月の安定性データを以下の表２ａに要約する。

表２ｂは、２５℃及び６０％で、６ヶ月間にわたる二塩酸塩エタノール共結晶沈殿物の安定性データを示す。外観は、全期間の間、黄色〜橙色の固体であった。

結論
化合物Ａ１を含む本組成物は、少なくとも２４ｋ月間安定である（表２ａ）。この期間中、化合物Ａ１の有意な分解は、２〜８℃又は２５℃／６０％ＲＨ（６ヶ月）のいずれにおいても起こらなかった。化合物Ａ１の組成物を、２〜８℃で保存し、輸送することが推奨される。しかしながら、２５℃までの温度で２４時間の保存は、問題にならないはずである。

例３ ２−［（１）−１−（２−｛６−メチル−５Ｈ−［１，２，４］トリアジノ［５，６−ｂ］インドール−３−イル｝ヒドラジン−１−イリデン）エチル］−ピリジン二塩酸塩のエタノール共結晶沈殿物の医薬組成物の製造
主に２−［（１Ｅ）−１−（２−｛６−メチル−５Ｈ−［１，２，４］トリアジノ［５，６−ｂ］インドール−３−イル｝ヒドラジン−１−イリデン）エチル］−ピリジン二塩酸塩（Ａ１）（１６０ｍｇの遊離塩基に対応する、Ａ）のエタノール共結晶沈殿物の２２５．６ｍｇの倍数は、注射用水（Ｐｈ．Ｅｕｒ.、１０ｍｌ）中のマンニトール（５００ｍｇ）の溶液に溶解させ、溶液を２つの０．２μｍフィルターを通してろ過することによって滅菌し、対応する数の滅菌バイアルに充填し、次に凍結乾燥させた（化合物Ａ２の塩を得る）。

本発明者らは、先行技術によって使用される通常の方法が３００時間以上の乾燥を必要とするので、新しい凍結乾燥プロセスを開発した。新しい方法は、より積極的であり、以下の表３に概説される。

サンプル調製及びＨＰＬＣ分析は、別の分析者によって繰り返され、結果を確認した。この不純物のピーク面積の変動は、試験法のバリデーション中に観察された。
最大負圧及び比較的高い温度を有し、表３のように温度をアニーリングすることにより、凍結乾燥ステップは、１９時間に短縮された。
金属表面との接触は避けられた。存在するエタノール及び少量のメタノールは、凍結乾燥プロセスによって除去された。

バイアルを窒素下でクリップシールし、５℃で保存した；２４ヶ月間保存後、分解は見られなかった。
グルコース及びマンニトールを、単独で及びＮａＣｌと組み合わせて、添加剤として評価した。溶解度、凍結乾燥ケーキのテクスチャー及び不純物形成の抑制に関する最良の結果は、添加剤として５％（ｗ／ｖ）マンニトールを用いて得られた。凍結乾燥ケーキのより高い程度の崩壊が、充填剤としてグルコースで観察された。ＮａＣｌによって生成されるｐＨの上昇は、化合物Ａ２の溶解度を減少させたので、ＮａＣｌの添加は、溶解度の問題を引き起こした。

再構成及び注射のための凍結乾燥粉末（化合物Ａの１６０ｍｇの遊離塩基に相当）を２〜８℃、２４ヶ月までの条件で保存した。外観は、全試験期間中、及び目に見える粒子のない黄色〜橙色溶液の再構築後、黄色〜橙色の凍結乾燥ケーキであった。

２５℃／６０％ＲＨのＸ線粉末回折結果のために行われた分析は、予想外の低レベルの結晶化度を有した。結晶化度のレベルは、製剤原料の品質又は安定性に直接影響を与えないが、開発作業の一部として管理される。再構成時間は、最大３分であった。細菌の増殖は検出されず、製品の無菌性は、室温で２４ヶ月の間影響を受けなかった。得られた安定性データを以下の表４ａに要約する。

ＬＯＱは、０．０５％であり、ピーク＜ＬＯＱを、＜０．０５％として記録した。
再構成及び注射のための凍結乾燥粉末（化合物Ａの１６０ｍｇの遊離塩基に相当）を加速条件２５℃／６０％ＥＨで保存した（表４ｂ参照）。外観は、全試験期間中、及び目に見える粒子なく黄色〜橙色の溶液の再構築後、黄色〜橙色の凍結乾燥ケーキであった。２５℃／６０％ＲＨでのＸ線粉末回折結果のために行われた分析は、結晶化度の予想外の低いレベルを有した。結晶化度のレベルは、製剤原料の品質又は安定性に直接影響を与えないが、開発作業の一部として管理される。再構成時間は、最大３分であった。細菌の増殖は検出されず、製品の無菌性は、室温で２４ヶ月間影響を受けなかった。驚くべきことに、凍結乾燥物は、室温で少なくとも２４ヶ月安定であることを示した。得られた安定性データを、以下の表４ｂに要約する。

ＬＯＱは、０．０５％であり、ピーク＜ＬＯＱを、＜０．０５％として記録した。ｐＨは、０．５〜４の範囲でなければならず、上記の例において、濃度は、約１６ｍｇ／ｍｌであり、ｐＨは、１．３〜２．３の範囲であり、含水量は１％未満である。Ｚ異性体は、好ましくは２％未満であるが、しかしながら、本発明者らは、驚くべきことに、酸性条件は、Ｅ異性体に有利であることを見出した。

化合物Ａ２を含む凍結乾燥物は、驚くべきことに、凍結乾燥後の方が水を溶解する前よりも溶解性が低いことを示した。このため、構造的研究が行われ、この研究は、化合物Ａ２は、凍結乾燥中のその結晶形態を変化させることを示した。新しい結晶形態は、水に溶けにくく、これは、二塩酸塩エタノール共結晶沈殿物（Ａ１）及び二塩酸塩（Ａ２）の間の溶解度の差異を説明する。実験は、沈殿物のこの枯渇が、形態学的形態の変化を誘導することを示した。実験の結果はまた、添加剤（Ｄ−マンニトール）は、新しい形態（ｍｏｒｐｈｉｃ ｆｏｒｍ）の形成について影響を与えないことを示した。凍結乾燥ケーキの不純物及びテクスチャーの形成に関する最良の結果は、表３に記載の凍結乾燥サイルから得られ、マンニトール含量は５％に設定した。

例４ 医薬製剤の調製
化合物Ａ２は、１ｍｇ／ｍｌで２４時間までの副生成物の形成を抑制するために水性媒体中で処方されることができたことが見出された。また、ｐＨは、１〜４付近の最良の安定性を有する水性媒体中の化合物Ａ２の安定性にとって重要であることが理解され、物質のより高い濃度は、より低いｐＨをもたらした。１ｍｇ／ｍｌの前記水溶液は、ｐＨ２〜３を有する。
得られた化合物Ａ２は、滅菌凍結乾燥粉末として処方され、注射又は点滴用の溶液を、注射用水などの水性溶媒中で上記の凍結乾燥粉末を溶解することによって調製した。各バイアルは、２２５．５ｍｇの製剤原料、及び５％のマンニトール（ｗ／ｖ）の溶液から調製された１６０ｍｇの遊離塩基（Ａ）に相当する薬理学的に活性な化合物の量を含む。

凍結乾燥物は、１０ｍｌの水性溶媒中で再構成し得、その後、点滴のために、薬理学的に許容可能な添加剤、好ましくは５％マンニトール（ｗ／ｖ）を任意に含む水性溶媒中で１０ｍｇ／ｍｌに希釈した。

例５
化合物Ｂ；２−［（１Ｅ）−１−（２｛６−メチル−５Ｈ−［１，２，４］トリアジノ［５，６−ｂ］インドール−３−イル｝ヒドラジン−１−イリデン）プロピル］ピリジンの合成
１−（ピリジン−２−イル）プロパン−１−オン（３５ｍｇ、０．２６ｍｍｏｌ）を水−酢酸混合物（２０：１、１０ｍＬ）に溶解し、次に、３−ヒドラジニル−６−メチル−５Ｈ−［１，２，４］トリアジノ［５，６−ｂ］インドール（５０ｍｇ、０．２３ｍｍｏｌ）を添加した。反応混合物を２時間、５０℃で撹拌した。溶媒を蒸発させた後、暗緑色固体を得た（７０ｍｇ）。ＬＣは、９５：５の異性体比を有する純粋な生成物を示す。

例６
化合物Ｃ；２−（３，３−ジメチル−Ｎ−｛６−メチル−５Ｈ−［１，２，４］トリアジノ［５，６−ｂ］インドール−３−イル｝ブタンヒドラゾノイル）ピリジンの合成
３，３−ジメチル−１−（ピリジン−２−イル）ブタン−１−オン（４６ｍｇ、０．２６ｍｍｏｌ）を水−酢酸混合物（２０：１、１０ｍＬ）中で測定し、次に３−ヒドラジニル−６−メチル−５Ｈ−［１，２，４］トリアジノ［５，６−ｂ］インドール（４８ｍｇ、０．２３ｍｍｏｌ）を加えた。反応混合物を５０℃で一晩撹拌した。溶媒を蒸発させた後、緑がかった黄色の固体が得られた（７８ｍｇ）。ＬＣは、９２：８の異性体比を有する純粋な生成物を示した。

例７
化合物Ｂ１のその二塩酸塩（Ｂ２）への変換を、以下の手順によって調製した：
２−［（１Ｅ）−１−（２−｛６−メチル−５Ｈ−［１，２，４］トリアジノ［５，６−ｂ］インドール−３−イル｝ヒドラジン−１−イリデン）プロピル］ピリジン（３０ｍｇ、０．０９ｍｍｏｌ）をメタノール（０．６ｍＬ）中に懸濁し、次にエタノール中ＨＣｌ（１．０４当量、１．２５Ｍ、７５μＬ）を滴下した。すべての固体を溶解後、エタノール中のより多くのＨＣｌ（２．０８当量、１．２５Ｍ、１５０μＬ）及びエタノール（０．６ｍＬ）を添加した。明褐色の沈殿物が現われた。懸濁液を−１０℃で３時間維持し、次に固体をろ過し、冷エタノールで洗浄し、乾燥させた。生成物は明るい黄色固体（１０ｍｇ）であった。ＬＣは、１つの異性体のみを示し、少量の異性体は、生成物をそのＨＣｌ塩に変換後、検出されない。

例８
化合物Ｃ１のその二塩酸塩Ｃ２への変換を、以下の手順によって調製した：２−［（１Ｅ）−１−（２−｛６−メチル−５Ｈ−［１，２，４］トリアジノ［５，６−ｂ］インドール−３−イル｝ヒドラジン−１−イリデン）プロピル］−ピリジン（３０ｍｇ、０．０９ｍｍｏｌ）を、メタノール（０．６ｍＬ）に懸濁し、次にエタノール中ＨＣｌ（１．０４当量、１．２５Ｍ、７５μＬ）を滴下した。全ての固体を溶解後、エタノール中より多くのＨＣｌ（２．０８当量、１．２５Ｍ、１５０μＬ）及びエタノール（０．６ｍＬ）を添加した。懸濁液を−１０℃で３時間保持した後のみ、生成物は、直ちに沈殿しなかった。固体をろ過し、冷エタノールで洗浄し、乾燥させた。生成物は、明るい黄色固体（２０ｍｇ）であった。ＬＣは１つの異性体（Ｅ）のみを示し、生成物をそのＨＣｌ塩に変換した後、少ない異性体（Ｚ）は検出されない。

特徴
単結晶Ｘ線は、Ｅ異性体は、固体状態で支配的であることを示した。
単結晶Ｘ線を、スウェーデンのＳＡＲｏｍｉｃｓ Ｂｉｏｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ ＡＢで実施した。約１００×３０μｍを測定する化合物Ａ１の結晶を、タンパク質結晶に通常使用される種類の標準的な低温ループで取り出し、パラフィン油に浸漬し、液体窒素中でフラッシュ冷却した。データは、２２５ｍｍ ｍａｒ ＣＣＤ検出器を備えたＭＡＸ−ｌａｂ（λ＝０．９１９８Ａ）のステーションＩ１９１１−３で１００Ｋで集めた。ビームサイズは、５０×５０μｍであった。Ｘ線結果は、化合物Ａ１がＥ−ヒドラジン異性体であることを確認する。予測される構造は、図２ｂに示され、Ｎは窒素原子、Ｈは水素原子、ＣＬは塩素原子、Ｈ_２Ｏは水分子である。
全ての試験は、参照標準を使用して実施し、全ての分析は、提案された構造と一致する。

結論
生成物化合物Ａ２は、容易に、水性溶媒中で加水分解するにもかかわらず、化合物Ａの出発材料で４〜７％の含水量が許容された。
母液中に異性体の痕跡がなく、適用された沈殿条件がＺ異性体を標的異性体に変換することを示す。好ましくは、生成物は、酸感受性であるので、塩形成は、数時間以内に実施されるべきである。

組成物開発作業は、上述の水性溶媒安定線試験及び添加剤評価によって開始された。これらの結果に基づいて、製剤の不純物形成及び薬物生成物の溶解性に対する効果（すなわち、二塩酸塩、例えば化合物Ａ２）に関して、組成物（すなわち、製剤原料−エタノール共結晶沈殿物−添加剤の濃度及びタイプ及び量）を最適化することによって継続した。最適化の結果、バイアル当たりの遊離塩基（化合物Ａ）の量は、１００〜１６０ｍｇに増加した。

例９ 細胞傷害活性
化合物Ａによる、生存指数（ＩＣ５０）として表される細胞傷害活性は、様々な細胞株で示され（図３）、ヒト腫瘍の初代培養に示される（表５）。Ｆｌｕｏｒｏｍｅｔｒｉｃ Ｍｉｃｒｏｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ Ａｓｓａｙ （ＦＭＣＡ), (Ｌｉｎｄｈａｇｅｎら、２００８年)を、様々な細胞株及びヒト腫瘍の初代培養において化合物の細胞毒性効果の測定のために使用した。ピペット操作ロボットＰｒｅｃｉｓｉｏｎ ２０００（Ｂｉｏ−Ｔｅｋ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ Ｉｎｃ., Ｗｉｎｏｏｓｋｉ, ＶＴ）を使用して、薬物調製３８４ウェルプレートに細胞を播種した。プレートを７２時間インキュベートし、次に、自動ＦＣＭＡのために、ＣＯ_２インキュベーター（Ｃｙｔｏｍａｔ ２Ｃ, Ｋｅｎｄｒｏ, Ｓｏｌｌｅｎｔｕｎａ, Ｓｗｅｄｅｎ）、ディスペンサーモジュール（Ｍｕｌｔｉｄｒｏｐ ３８４, Ｔｉｔｅｒｔｅｋ, Ｈｕｎｔｓｖｉｌｌｅ, ＡＬ）、ウォッシャーモジュール（ＥＬｘ ４０５, Ｂｉｏ−Ｔｅｋ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ Ｉｎｃ）、デリッデイングステーション、プレートホテル、バーコードリーダー（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）、液体ハンドラー（Ｂｉｏｍｅｋ ２０００, Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）及び多目的リーダー（ＦＬＵＯｓｔａｒ Ｏｐｔｉｍａ, ＢＭＧ Ｌａｂｔｅｃｈ ＧｍｂＨ, Ｏｆｆｅｎｂｕｒｇ, Ｇｅｒｍａｎｙ）を有するＯＲＣＡロボット（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）からなる統合されたＨＴＳ ＳＡＧＩＡＮ Ｃｏｒｅ Ｓｙｓｔｅｍに移した。

異なる細胞株（例えば、ＣＣＲＦ−ＣＥＭ Ｔ細胞白血病、ＲＰＭＩ−８２２６多発性骨髄腫、Ａ２７８０卵巣癌、ＦａＤｕ頭頸部癌（扁平上皮癌種）、ＨＴ２９大腸癌、ＭＣＦ７ 乳癌及びＨＬ−６０白血病細胞）並びに初代ヒト腫瘍細胞培養のパネル（表５）を（結腸、胃、腎臓、虫垂、小腸及び膵臓癌、並びに偽胚様体腹膜）を分析した。結果は、効果−濃度グラフに例示されるように（図３）、化合物Ａの広範な抗癌活性を示す。

例１０
本発明者らはまた、異なる起源の癌を表す細胞系における化合物Ａ、Ｂ及びＣの活性を特徴付けることを始めた。使用された特異的アッセイ及び機構的評価からの結論は、以前に詳細に記載されている（Ｚｈａｎｇら、２０１４年）。化合物Ａ、Ｂ及びＣ（図４参照）を、細胞ベースの蛍光ミクロカルチャー細胞毒性アッセイ（ＦＭＣＡ）を使用して、以前に詳細に記載されているように（Ｌｉｎｄｈａｇｅｎら、２００８年）、６つのヒト腫瘍細胞株における生存指数（ＳＩ）として表される細胞傷害性につい評価した。この方法は、原形質膜を有する生存細胞によるＦＤＡの加水分解から生成された蛍光フルオレセインの測定に基づく。蛍光は、無傷の生存細胞の数に比例する。

材料及び方法
細胞培養
細胞株は、プロバイダーによって推奨されたそれぞれの細胞培地で培養した。培地に１０％熱不活性ウシ胎児血清、２ｍｍｏｌ／ＬのＬ−グルタミン、１００μｇ／ｍＬのストレプトマイシン及び１００Ｕ／ｍＬのペニシリン（全てＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ製）を補充した。この細胞株を、５％ＣＯ_２を含む加湿雰囲気中、３７℃で培養した。

細胞傷害活性の測定
簡潔にＦＭＣＡ分析、ウェル当たり２５００細胞を３８４ウェルマイクロプレートに播種し、化合物で処理する前に一晩インキュベートした。化合物を音響液体移送（Ｅｃｈｏ ５５０、ＬａｂＣｙｔｅ）を使用して添加した。プレートを３７℃で７２時間インキュベートし、次に洗浄し、ＦＤＡを３７℃で５０分のインキュベーションによってウェルに添加した。各ウェルの生存細胞の数に比例する蛍光を、Ｆｌｕｏｒｏｓｋａｎ装置（Ｌａｂｓｙｓｔｅｍｓ，ＧＭＩ，Ｒａｍｓｅｙ、ＭＩＮ）で４８５／５２０ｎｍで測定した。細胞生存率は、対照ウェルの値のパーセンテージとして分析された化合物処理ウェルで蛍光値として定義され、ブランク値を引いたものとして定義される生存指数（ＳＩ）として示される。品質基準は、対象及びブランクウェル＜３０％におけるシグナル／ブランク比＞１０及び変動係数（ＣＶ）を含んだ。Ｇｒａｐｈ Ｐａｄ Ｐｒｉｓｍ (Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ, Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ, ＵＳＡ)。全ての実験を２回行い、各濃度を、各実験において４回繰り返して評価した。化合物（Ａ、Ｂ及びＣ）を、ＤＭＳＯ、５ｍＭに希釈した。

結果と考察
試験化合物（Ａ、Ｂ及びＣ）は、癌細胞株の広範な範囲に強い活性を示した（表６及び図４参照）。細胞株は、血液学的及び固体腫瘍の両方を表す、広範囲の癌タイプをカバーするように選択された（表６）。これらの結果から、化合物Ａ、Ｂ及びＣは、結腸癌、子宮頚部腺癌、急性リンパ芽球性白血病及び急性単球性白血病を含むいくつかの異なる腫瘍細胞に対して有効であることが、明らかに示される。
本明細書に提示される結果から、化合物Ａ、Ｂ及びＣは、結腸癌、子宮頚部腺癌、肝細胞癌、急性リンパ芽球性白血病及び急性単球性白血病を含むいくつかの異なる腫瘍細胞株に対して有効であることが明らかに示される。

特定の態様を、本明細書中で詳細に説明したが、これは、例示のみを目的として実施されたものであり、添付の特許請求の範囲を限定するものではない。特に、特許請求の範囲によって規定される本発明の精神及び範囲から逸脱することなく、本発明に対して様々な置換、変更及び改変を行いうることは、発明者によって意図される。

参考文献
Eshba et al. Synthesis of some substituted-1,2,4-triazino[5,6-b]indole derivatives as potential antiviral and anticancer agents. PharmazieVol. 42, No. 10, 1987; 664-666.
Lindhagen E, Nygren P, Larsson R (2008) The fluorometric microculture cytotoxicity assay. Nature Protocls 3: 1364-1369.
Kgokong JL, Smith PP, Matsabisa GM(2005) Bioorg Med Chem. 13(8):2935-42).
Zhang X et al. (2014) Induction of mitochondrial dysfunction as a strategy for targeting tumor cells in metabolically compromised microenvironments. Nature communications 5:3295.

Claims (19)

1. 一般式１の薬学的に活性な化合物、又はその薬学的に許容可能な塩を含む癌の治療の使用のための医薬組成物：
   
   式中、ＲはＨ又はメチル又はＣ_１−Ｃ_４直鎖又は分枝アルキルによって置換されたメチレンであり、
   Ｒ^１は、Ｈ、Ｃ_１−Ｃ_４直鎖又は分枝アルキル、メトキシ、１〜３個のフッ素、臭素、ハロゲンで置換されたメトキシからなる群から選択され；
   Ｒ^２は、Ｈ又はＣ_１−Ｃ_４直鎖又は分枝アルキルであり；
   Ｘは、ＣＨ又はＮであり；
   Ｙは、ＣＨ又はＮであり、ここで薬理学的に活性な化合物、又はその薬学的に許容可能な塩の少なくとも９５重量％（ｗ／ｗ）は、Ｅ異性体の形態である。
2. 薬理学的に活性な化合物が、結晶形態の塩である、請求項１に記載の医薬組成物。
3. 塩が二塩酸塩である、請求項２に記載の医薬組成物。
4. ０．１〜１０％（ｗ／ｖ）の濃度の薬学的に許容可能な添加剤をさらに含む、請求項１〜３のいずれかに記載の医薬組成物。
5. 少なくとも１２ヶ月の安定性を有する、請求項１〜４のいずれかに記載の医薬組成物。
6. 以下のステップを含む、請求項１〜５のいずれかに記載の医薬組成物を調製する方法：
   ｉ．遊離塩として一般式１の化合物の溶液を提供するステップ、
   ｉｉ．溶液を一般式１の化合物を二塩酸塩に形成するのに十分な量のエタノール中の塩酸塩と反応させるステップであって、ここで、二塩酸塩は、自発的に沈殿するステップ、
   ｉｉｉ．溶媒のステップ（ｉｉ）で得られる二塩酸塩を含む沈殿物をストリッピングするステップ、
   ｉｖ．任意に、薬学的に許容可能な添加物を含む、水性溶媒中にステップ（ｉｉｉ）の二塩酸塩を溶解させるステップ、及び
   ｖ．混合物を凍結乾燥し、それによって凍結乾燥粉末又はケーキを得るステップ。
7. 一般式１ｂの化合物を含む沈殿物：
   
   式中、Ｒは、Ｈ又はメチル又はＣ_１−Ｃ_４直鎖又は分枝によって置換されたメチレンであり、
   Ｒ^１は、Ｈ、Ｃ_１−Ｃ_４直鎖又は分枝アルキル、メトキシ、１〜３個のフッ素、臭素、ハロゲンで置換されたメトキシからなる群から選択され；
   Ｒ^２は、Ｈ又はＣ_１−Ｃ_４直鎖又は分枝アルキルであり；
   Ｘは、ＣＨ又はＮであり；
   Ｙは、ＣＨ又はＮであり、ここで、化合物１ｂの少なくとも９５重量％（ｗ／ｗ）は、Ｅ異性体の形態である。
8. 請求項１のステップｉ）〜ｉｉｉ）を含む、請求項７に記載の二塩酸塩沈殿物を調製する方法。
9. 残留エタノールが二塩酸塩沈殿物の２〜２０重量％の範囲である、請求項７に記載の二塩酸塩沈殿物。
10. 一般式１ａの化合物を含む凍結乾燥物：
    
    式中、Ｒは、Ｈ又はメチル又はＣ_１−Ｃ_４直鎖又は分枝アルキルによって置換されたメチレンであり、
    Ｒ^１は、Ｈ、Ｃ_１−Ｃ_４直鎖又は分枝アルキル、メトキシ、１〜３個のフッ素、臭素、ハロゲンで置換されるメトキシから選択され；
    Ｒ^２は、Ｈ又はＣ_１−Ｃ_４直鎖又は分枝アルキルであり；
    Ｘは、ＣＨ又はＮであり；
    Ｙは、ＣＨ又はＮであり、ここで、化合物１ａの少なくとも９５重量％（ｗ／ｗ）は、Ｅ異性体の形態である。
11. 以下のステップを含む、請求項１０に記載の凍結乾燥物を調製する方法：
    ｉ．任意には、薬学的に許容可能な添加物を含む、水性溶媒中のステップの二塩酸塩沈殿物を溶解するステップ、及び
    ｉｉ．混合物を凍結乾燥させ、それによって凍結乾燥粉末又はケーキを得るステップ。
12. 医薬組成物における使用のための請求項７又は９に記載の二塩酸塩沈殿物又は請求項１０に記載の凍結乾燥物。
13. ０．５〜３０ｍｇ／ｍｌの範囲の最終濃度の水性溶媒中の医薬組成物、請求項１〜５、７、９及び１０のいずれに記載の薬学的に許容可能な塩を再構成することによって調製される点滴液に適した医薬製剤。
14. ｐＨが０．５〜４の範囲である、請求項１３に記載の医薬製剤。
15. 癌の治療に用いるための請求項１〜５、７、９、１０、１３及び１４のいずれかに記載の医薬組成物、薬学的に許容可能な塩又は製剤。
16. 癌が、固体腫瘍、液体腫瘍又は血液腫瘍である、請求項１５に記載の医薬組成物、薬学的に許容可能な塩又は製剤。
17. 請求項１〜５、７、９、１０、１３及び１４のいずれかに記載の化合物、又はそれらの薬学的に許容可能な塩を含む医薬製剤の有効量をそのような治療を必要とする対象に投与する、対象において癌を治療する方法。
18. 別の抗癌治療と組み合わされる、請求項１７に記載の癌を治療するための方法。
19. 有効量が、０．０１〜１０ｍｇ／ｋｇ体重、好ましくは０．１〜５ｍｇ／ｋｇ体重、及びより好ましくは１〜４ｍｇ／ｋｇ体重の範囲である、請求項１７又は１８のいずれかに記載の癌を治療するための方法。