JP2019501657A - 生体外培養工程中の体細胞の複製能拡張法 - Google Patents
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Abstract
Description
(A)CDKN2B遺伝子座の遺伝子改変による複製老化の遅延
要約すると、この第一の例示的な実施形態は、ガイドRNA(gRNA)(配列番号1〜5)を用いてCDKN2Bのエクソン#1(NCBI受入番号:NM_204433.1)に標的化されたインデルを作製するためのCRISPR Cas9を用いて、ニワトリ(Gallus gallus)骨格筋から単離された初代筋芽細胞集団内のp15タンパク質をコードするCDKN2B遺伝子座を破壊する。CDKN2B遺伝子座の破壊は単独でも利益をもたらすが、TERT遺伝子からのテロメラーゼタンパク質ホモログの発現を指示する遺伝子コンストラクト(配列番号6)(NCBI受入番号:NM_001031007.1;NCBI Gene ID:420972)から得られる補助的なテロメラーゼ活性と組み合わされた場合、改変細胞集団の複製能を無制限に増大させる。標的化されたCDKN2B不活性化は新規なあプローチである。
実施形態I−Aに記載されるように改変された細胞は、TERT遺伝子からのテロメラーゼタンパク質ホモログの発現を指示する遺伝子コンストラクト(NCBI受入番号:NM001031007.1;NCBI Gene ID:420972)で改変されてもよい。この後、TERT遺伝子からのテロメラーゼタンパク質ホモログの発現を指示する遺伝子コンストラクト(配列番号6)を導入されたこの集団からの、テロメラーゼタンパク質ホモログの発現を指示する前記遺伝子コンストラクトによる遺伝子改変を特徴とする細胞についての、細胞のセレクションが続く。
一実施形態では、食用バイオマスの製造は4つの工程を含む:(1)CDKN2B遺伝子座への遺伝子改変および/またはTERTの異所性発現を有する、選択を受けた細胞集団を増殖させる工程;(2)増殖させた細胞集団をマスターセルバンクストックインベントリ内で凍結保存および貯蔵する工程;(3)生体外環境でマスターセルバンクストックインベントリから細胞を播種および培養する工程;並びに、(4)培養された食用の細胞バイオマスを回収する工程。
要約すると、この第二の例示的な実施形態は、ガイドRNA(gRNA)(配列番号8〜10)を用いてCDKN2Aの第1エクソンに標的化されたインデル変異を作製するためのCRISPR/Cas9を用いて、ウシ(Bos taurus)骨格筋から単離された初代筋芽細胞集団である後生動物体細胞集団内のp16タンパク質をコードするCDKN2A遺伝子座を破壊する。ウシ(Bos taurus)のCDKN2A遺伝子は、p16をコードする最初のエクソンがCDKN2Aの第2エクソンである、2つの予想スプライスバリアント(NCBI受入番号:XM_010807759.2、XM_010807758.1)を有している。CDKN2A遺伝子座の破壊は単独でも複製的恩恵をもたらすが、同一細胞集団でTERT遺伝子からのテロメラーゼタンパク質ホモログの発現を指示する合成遺伝子コンストラクト(配列番号11)(NCBI受入番号:NM_001046242.1;NCBI Gene ID518884)から得られる補助的なテロメラーゼ活性と組み合せて使用された場合、両改変の相乗作用により、いずれか単独の改変よりもさらに改変細胞集団の複製能は増加し得る。ウシ(Bos taurus)種のゲノムは、CDKN2A遺伝子がp16をコードする予想転写物(NCBI受入番号:XM_010807759.2)を有することを特徴とする。言い換えれば、前記遺伝子改変は、CDKN2A遺伝子のエクソン2(すなわち、p16をコードする遺伝子配列のエクソン1)内の保存ヌクレオチド配列の変異、および、CDKN2A遺伝子のエクソン2(すなわち、p16をコードする遺伝子配列のエクソン1)を標的とするガイドRNAであり、CRISPR/Cas9を用いて作製される。予想p16コード配列内のCDKN2A遺伝子座の破壊は、本願における新規の方法である。これらの例に使用された方法のより詳細な説明については、材料と方法のセクションA、B、C、D、E、F、G、HおよびIを参照されたい。
大まかに言えば、第三の例示的な実施形態は、サイクリン依存性キナーゼホモログの異所性発現によって、具体的にはCDK4遺伝子からのCDK4タンパク質ホモログの異所性発現を指示する遺伝子コンストラクト(NCBI Gene ID:510618)を用いた細胞の改変によって、複製老化時の網膜芽細胞腫タンパク質による細胞分裂周期阻害の、サイクリン依存性キナーゼ阻害因子による安定化を、抑制する。TERT遺伝子からのテロメラーゼタンパク質ホモログの過剰発現を指示する遺伝子コンストラクト(NCBI Gene ID:518884)から得られる補助的なテロメラーゼ活性を追加することにより、さらなる恩恵を得ることができる。テロメラーゼタンパク質ホモログの過剰発現は、未改変親集団と比べて、改変細胞集団の複製能を増加させる。
(A)標的遺伝子座の配列決定
それぞれの種について、E.Z.N.A. Tissue DNA Extractionキット(オメガバイオテック社)を用いて初代細胞の単離物からゲノムDNAを注出する。ニワトリ(Gallus gallus)由来の内在性CDKN2Bおよびウシ(Bos taurus)由来の内在性CDKN2Aを増幅するように設計されたプライマーを用いて、ゲノムDNAをPCR増幅する。
CRISPR/Cas9を用いて、ウシ(Bos taurus)ゲノム内のCDKN2Aのp16およびニワトリ(Gallus gallus)ゲノム内のCDKN2Bのp15を破壊する。CRISPR/Cas9に好適なgRNAは、Geneious R10(http://www.geneious.com、Kearse et al., 2012)の「Find CRISPR Sites」機能を用いて設計される。各々の種について、NCBI上の最新の参照ゲノムを用いて、非特異的な作用をふるいにかける:Gallus gallus−5.0(NCBI RefSeq Assembly受入番号:GCF_000002315.4.)およびBos taurus v3.1.1(NCBI RefSeq Assembly受入番号:GCF_000003055.6)。オフターゲットスコアが90%を超えるgRNAのみ合成を検討する。合成のために選択されるガイドRNA配列には、ニワトリ(Gallus gallus)については配列番号1〜5が、ウシ(Bos taurus)については配列番号8〜10が含まれるが、これらに限定はされない。各々の選択されたgRNA用に、別々のpGS−gRNAベクターが、サードパーティベンダーにより構築、増幅および精製されている。各々のgRNAプラスミドと同時導入されるpSpCas9 PX165ベクターも、サードパーティベンダーから供給される。
CAG(Cytomegalovirus, Chicken Beta-Actin, Rabbit Beta-Globulin)調節エレメント(Alexopoulou、Couchman、およびWhiteford、2008)を用いて、全ての導入された合成コンストラクトのロバストな発現が促進される。ニワトリ(Gallus gallus)TERT参照配列(NCBI受入番号:NM_001031007.1)はNCBIから検索された。各々の転写物バリアント(NM_001031007.1およびXM_015282334.1)については、コードDNA配列(CDS)領域を注出して連結し、連結配列にする。次いで、Geneious R10(http://www.geneious.com、Kearse et al., 2012)で、前記CAG調節エレメントを、各転写物バリアントの前記CDSの5’末端に連結する。完全合成コンストラクトの配列番号6および配列番号7は、商業ベンダーにより構築され哺乳類発現ベクターにクローニングされたものである。ここに記載された戦略は、合成TERTコンストラクトのウシバージョンを作製するのにも使用される。ウシ(Bos taurus)TERTコンストラクト(配列番号11)は参照配列(NCBI受入番号:NM_001046242.1)を用いて設計する。
標的化されたインデル変異誘発を行うため、プラスミドがコードするCRISPR/Cas9タンパク質によって認識されるgRNA配列を、トランスフェクション用に合成、増幅、および精製する。プラスミドDNAは、原核細胞系での増幅に必要な調節エレメントを含有する標準的なベクター骨格を有する。各々のプラスミドは、各々の標的細胞集団内で一過性にgRNAまたはCas9タンパク質を発現させて、5’調節領域、コード領域、またはそれら両方の内部でインデル変異形成を引き起こすために必要な、調節領域およびコード領域も含有する。
まず、1回のトランスフェクションサイクルを受けた親細胞プールから個々のクローン細胞集団を単離することによって、CRISPR/Cas9 gRNAを用いて先にトランスフェクトされた細胞集団を選択する。細胞は限界希釈法を用いて選択する。トランスフェクト細胞を酵素的に解離させて単個細胞浮遊液にする。2×104細胞/mL増殖培地の希釈用ストック(working stock)を、全量500μLとなるように作製する。組織培養用処理96ウェルプレートの各ウェルを0.1%ゼラチンでコートする。ウェルA1を除いて、各ウェルに100μlの増殖培地を加える。4×103個の細胞(200uL)を、組織培養用処理96ウェルプレートの0.1%ゼラチン被覆A1ウェルに無菌的に入れる。ウェルA1の半分量(100μL)を直ちにウェルB1に移し、十分に混合する。この希釈系列(1:2)をウェルC1からH1まで繰り返す。細胞が移された後、ウェルH1から100μLを取り出し廃棄する。100μLの無細胞増殖培地をA1からH1の各ウェルに添加し、十分に混合する。次いで、ウェルA1内の半分量をウェルA2に移し、十分に混合する。この工程をウェルA2からA12まで繰り返す。再度、ウェルB1から始めてB12まで続けて、この希釈系列を繰り返す。この工程全体を行Cから行Hまで繰り返し、プレート全体(96ウェル全て)に希釈量の細胞を入れる。希釈系列を完了させるために、列12の各ウェルから半分量(100μL)を取り出し廃棄する。列2〜12の各ウェルに100μLの無細胞増殖培地を各々加えて、プレート上の各ウェルの最終体積を200μLにする。個々の細胞コロニーが現われるまで(細胞倍加10回以上、すなわち1,024細胞以上)、プレート全体を37℃の低酸素下でインキュベートする。1個の単一単離細胞に由来する細胞を含んでいるように見えるウェルを、単一細胞に解離し、0.1%ゼラチン被覆24ウェルプレートの1つのウェルに1:1継代し、37℃、5%CO2、5%O2雰囲気の条件下でインキュベートする。90%コンフルエントになったら、12ウェルプレート、次に6ウェルプレートへと、細胞を増殖させる。
次に、p15機能を標的としたニワトリ(Gallus gallus)CDKN2B遺伝子の、または、p16機能を標的としたウシ(Bos taurus)CDKN2A遺伝子の、5’領域にインデル変異形成を示す細胞集団を、標準的なEdUアッセイにより、機能的特徴および表現型的特徴について評価する。正確にインデルにより破壊された遺伝子を有することが確認され、クローン的に純粋な細胞集団を、先のCRISPR/Cas9標的化を受けておらず、且つ、前記インデル改変細胞と細胞集団倍加数が同じである野生型細胞と同時に、等密度に播種する。各々の細胞型を、37℃、5%CO2、5%O2雰囲気の条件下で24時間インキュベートする。この後、標準的なチミジン類似体試薬(EdU)を培地に添加し(Click−iT Alexa 488 EdUキット、サーモ・フィッシャー社)、細胞を37℃、5%CO2、5%O2雰囲気の条件下で4時間インキュベートする。インキュベーション後、細胞を洗浄、固定、および透過処理し、抗EdU Alexa 488結合型アジドを用いてプロービングする。標準的なDAPI核染色を用いて核の対比染色を行う。次に、細胞を標準的な488nm波長の光の下で励起して可視化する。野生型細胞集団およびCDKN2B/A遺伝子改変型細胞集団のAlexa Flour 488/DAPIの比を数量化し比較することで、各細胞群内の増殖集団割合を評価する。集団処理毎の総細胞数および細胞継代数全体で測定された総細胞数の両方における、陽性のAlexa Fluor 488シグナルは、DNA複製が生じていたことを示すものであり、細胞が活発に増殖していることの直接的な尺度となる。連続継代中の増殖能の相対的な維持を定量化および追跡するために、続く集団倍加の間、少なくとも1つの細胞集団が増殖をやめ老化となるまで、この手順を繰り返す。
異所的に発現させるために、研究対象の後生動物に種特異的なTERTまたはCDK4の調節配列およびコード配列(すなわち、「目的遺伝子」)を含むプラスミドDNAコンストラクトを、商業的プラスミド作製サービス、および特有の真核生物抗生物質耐性遺伝子(すなわち、他の常在性の薬剤選択マーカーに特有)を用いて、作製する。本明細書に記載される用途のために、プラスミドDNAは、原核細胞系での増幅に必要な調節エレメントを含有する標準的なベクター骨格を有する。
細胞集団を抗生物質による選択および生存により選択する。Fugene HD:直線化されたTERTまたはCDK4プラスミドDNA配列中でインキュベートされた細胞から培地を除去し、1×PBSで洗浄し、新鮮な増殖培地を加える。その後、致死量の抗生物質を培地に加えて細胞クローン選択を開始する。細胞を致死的な抗生物質への暴露の下、37℃、5%O2、5%CO2の条件で、14日間、インキュベートする。細胞培地を監視し、一定間隔で交換することで、薬剤誘導死による細胞性のデトリタスおよびデブリスを除去する。トランスフェクトされたプラスミドに含まれていた抗生物質耐性遺伝子を有する単一細胞から生じた病的でない(non-morbid)増殖性細胞コロニーを、無菌p200ピペットチップを用いてピックし、96ウェルプレートの0.1%ゼラチン被覆ウェルに移す。次に、致死的な抗生物質濃度を有する200μLの増殖培地を以前の通りに再添加し、一定の選択圧を維持する。細胞を、37℃、5%O2、5%CO2雰囲気の条件下でコロニーが現われるまでインキュベートする。株化された増殖性のコロニーを次に、単一細胞に解離させ、より大きな表面積のゼラチン被覆ウェル内に、6ウェルプレートの6個のウェル内でコンフルエントとなるまで増殖させる。次に、目的遺伝子含有プラスミドによって標的とされた、生存中の増殖後細胞集団それぞれの、各6ウェルプレートの1つのコンフルエントなウェルを、全ゲノムDNA単離にかける。全細胞ゲノムDNAを単離し定量化する。次に、全ゲノムDNAを目的遺伝子のコード配列のPCR増幅にかけ、0.8%アガロースゲル上で10W/cmで泳動して分離させる。次に、これらのPCR産物をアガロースゲルから抽出し、Sanger法による配列決定にかける。配列トレースを、野生型の未処理親細胞集団、および種特異的な目的遺伝子配列のコンピュータシミュレーションによる設計と比較する。次に、コンピュータシミュレーションによる予測と一致する目的遺伝子のゲノム配列を示す細胞集団を、機能的特徴および表現型的特徴について評価する。
標準的なTRAPアッセイを用いて、TERT発現産物の機能評価を行う。TRAP(Telomerase Repeated Amplification Protocol)は以下の方法で行う。TERTコンストラクトを含むことが確認された単離クローン細胞集団を、TERTコンストラクトを含まない細胞(未処理細胞対照)と同時に、等濃度で播種し、37℃、5%CO2、5%O2雰囲気の条件下で80%コンフルエントまでインキュベートする。次に、細胞を洗浄、収集、ペレット化、および溶解して、細胞内タンパク質画分およびゲノムDNAを集める。このゲノムDNAに対し、必要な試薬および緩衝液を含む市販のTRAPアッセイキット(TRAPeze Telomerase Detection Kit、EMDミリポア社)を用いてPCR増幅を行う。増幅産物を非変性アクリルアミドゲル上で泳動して、活性テロメラーゼの存在を示すバンドパターン(すなわち、活性テロメラーゼの増加またはその不在と正に相関するラダー状のバンドパターン)を分離する。
本発明は、複製老化時の網膜芽細胞腫タンパク質による細胞分裂周期進行の抑制を非干渉化するために使用された特定の手法に限定されない。本明細書で名を挙げられたこれらの特定の手法に加えて、他の手法によってもこの抑制は達成可能である。そのような手法の例として以下が挙げられるが、これらに限定はされない:(1)低分子ヘアピン型RNAによるRNA翻訳のサイレンシング(図8);(2)ガイドRNAによって標的化されたヌクレアーゼ活性欠失型Cas9による内在性遺伝子発現の改変(図5および図6);(3)レンチウイルスベクター、レトロウイルスベクター、トランスフェクトDNAまたは相同組換えによる遺伝子操作;(4)RB1遺伝子座からの遺伝子発現を途絶させる図4、図6、図7、および図8にモデル化された方法によるRBタンパク質の機能または遺伝子発現の直接標的阻害;(5)CDK6およびCDK2等の野生型サイクリン依存性キナーゼホモログ、並びにCKI阻害に対して抵抗性であるCDK4R24C等の変異型CDKホモログ(Wolfel et. al., 1995; Science Vol. 269 pp 1281 - 1284)の異所性過剰発現;(6)p15およびp16の両転写物を種の特徴とする細胞におけるp15およびp16の両機能の同時破壊;並びに、(7)ロイシン−X−システイン−X−グルタミン酸を含むペンタペプチドモチーフに相同なモチーフを含む、網膜芽細胞腫ファミリータンパク質を標的とするウイルスタンパク質を用いる、網膜芽細胞腫ファミリータンパク質の機能破壊。
Claims (34)
- 後生動物の体細胞集団の複製能を拡張するための方法であって、
遺伝子改変によりサイクリン依存性キナーゼ阻害因子(「CKI」)を介した網膜芽細胞腫タンパク質の安定化を抑止することによって、網膜芽細胞腫タンパク質による複製老化中の細胞分裂周期の進行阻害を非干渉化すること;
機能的なテロメア逆転写酵素(「TERT」)タンパク質の異所性発現を指示する遺伝子コンストラクト(配列番号11)を後生動物体細胞集団に形質導入することで、テロメラーゼ活性を維持すること;
前記遺伝子改変および前記TERTタンパク質の異所性発現を有するマスターセルバンクとなるセルバンクを維持すること;
生体外環境で前記マスターセルバンクから細胞を培養し、培養された細胞バイオマスとすること;並びに、
食用に前記培養された細胞バイオマスを回収すること、
を含む方法。 - 前記遺伝子改変が、前記後生動物体細胞集団におけるCDKN2B遺伝子(NCBI Gene ID:395076)を遺伝子改変することにより、p15タンパク質を不活性化することで、網膜芽細胞腫タンパク質による複製老化時の細胞周期の阻害を無効にすることを含む、請求項1に記載の方法。
- 前記遺伝子改変が前記CDKN2B遺伝子のエクソン1内の保存ヌクレオチド配列の変異である、請求項2に記載の方法。
- 前記遺伝子改変が、前記CDKN2B遺伝子のエクソン1を標的とするガイドRNA(配列番号1、2、3、4および5)からなる群から選択されるガイドRNAを用いてなされる挿入変異であり、且つ、CRISPR/Cas9(Clustered Regularly−Interspaced Short Palindromic Repeats−Cas9)を用いて作製される、請求項3に記載の方法。
- 前記遺伝子改変が、前記CDKN2B遺伝子のエクソン1を標的とするガイドRNA(配列番号1、2、3、4および5)からなる群から選択されるガイドRNAを用いてなされる欠失変異であり、且つ、CRISPR/Cas9を用いて作製される、請求項3に記載の方法。
- 前記マスターセルバンクからの細胞の培養が、
マスターセルバンクから選択された細胞集団を増殖させること;
増殖した細胞集団をマスターセルバンクストックインベントリ内で凍結保存し貯蔵すること;
前記マスターセルバンクストックインベントリからの細胞を生体外環境で播種および培養すること;並びに、
食用に培養された細胞バイオマスを回収すること、
をさらに含む、請求項2に記載の方法。 - 前記後生動物体細胞集団の種名がニワトリ(Gallus gallus)であり、前記後生動物体細胞集団の系譜が骨格筋である、請求項2に記載の方法。
- 前記遺伝子改変が、前記後生動物体細胞集団におけるCDKN2A遺伝子(NCBI Gene ID:616369)を遺伝子改変することにより、p16タンパク質を不活性化することで、網膜芽細胞腫タンパク質による複製老化時の細胞周期の阻害を無効にすることを含む、請求項1に記載の方法。
- 前記遺伝子改変が前記CDKN2A遺伝子のエクソン2内の保存ヌクレオチド配列の変異である、請求項8に記載の方法。
- 前記遺伝子改変が、前記CDKN2A遺伝子のエクソン2を標的とするガイドRNAを用いてなされる挿入変異であり、且つ、CRISPR/Cas9を用いて作製される、請求項9に記載の方法。
- 前記遺伝子改変が、前記CDKN2A遺伝子のエクソン2を標的とするガイドRNA(配列番号8、9、および10)からなる群から選択されるガイドRNAを用いてなされる欠失変異であり、且つ、CRISPR/Cas9を用いて作製される、請求項9に記載の方法。
- 前記マスターセルバンクからの細胞の培養が、
マスターセルバンクから選択された細胞集団を増殖させること;
増殖した細胞集団をマスターセルバンクストックインベントリ内で凍結保存し貯蔵すること;
前記マスターセルバンクストックインベントリからの細胞を生体外環境で播種および培養すること;並びに、
食用に培養された細胞バイオマスを回収すること、
をさらに含む、請求項8に記載の方法。 - 前記後生動物体細胞集団の種名がウシ(Bos taurus)であり、前記後生動物体細胞集団の系譜が骨格筋である、請求項8に記載の方法。
- 前記遺伝子改変が、CDK4遺伝子(NCBI Gene ID:510618)からのサイクリン依存性キナーゼ4(「CDK4」)タンパク質のホモログの異所性発現を指示する遺伝子コンストラクト(配列番号12)で、前記細胞集団を改変することをさらに含む、請求項1に記載の方法。
- 前記マスターセルバンクからの細胞の培養が、
マスターセルバンクから選択された細胞集団を増殖させること;
増殖した細胞集団をマスターセルバンクストックインベントリ内で凍結保存し貯蔵すること;
前記マスターセルバンクストックインベントリからの細胞を生体外環境で播種および培養すること;並びに、
食用に培養された細胞バイオマスを回収すること、
をさらに含む、請求項14に記載の方法。 - 前記後生動物体細胞集団の種名がニワトリ(Gallus gallus)であり、前記後生動物体細胞集団の系譜が骨格筋である、請求項14に記載の方法。
- 前記後生動物細胞集団の改変が、ウシ(Bos taurus)CDK4遺伝子からのCDK4タンパク質のホモログの発現を指示する遺伝子コンストラクト(配列番号12)によるものである、請求項14に記載の方法。
- 以下を含む工程:
遺伝子改変によりCKIを介した網膜芽細胞腫タンパク質の安定化を抑止することによって、網膜芽細胞腫タンパク質による複製老化中の細胞分裂周期の進行阻害を非干渉化すること;
機能的TERTタンパク質の異所性発現を指示する遺伝子コンストラクト(配列番号11)を後生動物体細胞集団に形質導入することで、テロメラーゼ活性を維持すること;
前記遺伝子改変および前記TERTタンパク質の異所性発現を有するマスターセルバンクとなるセルバンクを維持すること;
生体外環境で前記マスターセルバンクから細胞を培養し、培養された細胞バイオマスとすること;並びに、
食用に前記培養された細胞バイオマスを回収すること、
により得られ、
工業生産における適用を拡張性のあるものとするための無限の複製能を有する、
後生動物体細胞集団のクローン細胞株。 - 前記遺伝子改変が、前記後生動物体細胞集団におけるCDKN2B遺伝子(NCBI Gene ID:395076)を遺伝子改変することにより、p15タンパク質を不活性化することで、網膜芽細胞腫タンパク質による複製老化時の細胞周期の阻害を無効にすることを含む、請求項18に記載のクローン細胞株。
- 前記遺伝子改変が前記CDKN2B遺伝子のエクソン1内の保存ヌクレオチド配列の変異である、請求項19に記載のクローン細胞株。
- 前記遺伝子改変が、前記CDKN2B遺伝子のエクソン1を標的とする(配列番号1、2、3、4および5)からなる群から選択されるガイドRNAを用いてなされる挿入変異であり、且つ、CRISPR/Cas9を用いて作製される、請求項20に記載のクローン細胞株。
- 前記遺伝子改変が、前記CDKN2B遺伝子のエクソン1を標的とする(配列番号1、2、3、4および5)からなる群から選択されるガイドRNAを用いてなされる欠失変異であり、且つ、CRISPR/Cas9を用いて作製される、請求項20に記載のクローン細胞株。
- 前記マスターセルバンクからの細胞の培養が、
マスターセルバンクから選択された細胞集団を増殖させること;
増殖した細胞集団をマスターセルバンクストックインベントリ内で凍結保存し貯蔵すること;
前記マスターセルバンクストックインベントリからの細胞を生体外環境で播種および培養すること;並びに、
食用に培養された細胞バイオマスを回収すること、
をさらに含む、請求項18に記載のクローン細胞株。 - 前記後生動物体細胞集団の種名がニワトリ(Gallus gallus)であり、前記後生動物体細胞集団の系譜が骨格筋である、請求項19に記載のクローン細胞株。
- 前記遺伝子改変が、前記後生動物体細胞集団におけるCDKN2A遺伝子(NCBI Gene ID:616369)を遺伝子改変することにより、p16タンパク質を不活性化することで、網膜芽細胞腫タンパク質による複製老化時の細胞周期の阻害を無効にすることを含む、請求項18に記載の方法。
- 前記遺伝子改変が前記CDKN2Aのエクソン2内の保存ヌクレオチド配列の変異である、請求項25に記載のクローン細胞株。
- 前記遺伝子改変が、前記CDKN2Aのエクソン2を標的とする(配列番号8〜10)からなる群から選択されるガイドRNAを用いてなされる挿入変異であり、且つ、CRISPR/Cas9を用いて作製される、請求項26に記載のクローン細胞株。
- 前記遺伝子改変が、前記CDKN2Aのエクソン2を標的とする(配列番号8〜10)からなる群から選択されるガイドRNAを用いてなされる欠失変異であり、且つ、CRISPR/Cas9を用いて作製される、請求項26に記載のクローン細胞株。
- 前記マスターセルバンクからの細胞の培養が、
マスターセルバンクから選択された細胞集団を増殖させること;
増殖した細胞集団をマスターセルバンクストックインベントリ内で凍結保存し貯蔵すること;
前記マスターセルバンクストックインベントリからの細胞を生体外環境で播種および培養すること;並びに、
食用に培養された細胞バイオマスを回収すること、
をさらに含む、請求項25に記載のクローン細胞株。 - 前記後生動物体細胞集団の種名がウシ(Bos taurus)であり、前記後生動物体細胞集団の系譜が骨格筋である、請求項25に記載のクローン細胞株。
- 前記遺伝子改変が、CDK4遺伝子(NCBI Gene ID:510618)からのCDK4タンパク質のホモログの異所性発現を指示する遺伝子コンストラクトで、前記細胞集団を改変することをさらに含む、請求項18に記載のクローン細胞株。
- 前記マスターセルバンクからの細胞の培養が、
マスターセルバンクから選択された細胞集団を増殖させること;
増殖した細胞集団をマスターセルバンクストックインベントリ内で凍結保存し貯蔵すること;
前記マスターセルバンクストックインベントリからの細胞を生体外環境で播種および培養すること;並びに、
食用に培養された細胞バイオマスを回収すること、
をさらに含む、請求項31に記載のクローン細胞株。 - 前記後生動物体細胞集団の種名がニワトリ(Gallus gallus)であり、前記後生動物体細胞集団の系譜が骨格筋である、請求項31に記載のクローン細胞株。
- 前記後生動物細胞集団の改変が、ウシ(Bos taurus)CDK4遺伝子からのCDK4タンパク質のホモログの発現を指示する遺伝子コンストラクト(配列番号12)によるものである、請求項31に記載のクローン細胞株。
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