JP2019193655A - カチオンキレーターホットスタート - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、核酸化学の分野に関連する。より詳細には、本発明は、核酸改変反応の分野における酵素活性の制御に関連する。
核酸改変反応は、学究的背景と産業的背景との両方における現代の生物学的研究および薬学的研究において中心的な役割を担う。そのような反応は、核酸増幅反応から、制御されかつ特異的な核酸の切断にまで及ぶ、広い範囲の応用をカバーする。これらは、過去数十年の間に広範に研究された酵素によって媒介される。
本発明は、反応組成物において二価カチオンの濃度を調整することによって、酵素的活性を制御する方法に関連する。
本発明は、例えば、以下の項目を提供する。
(項目1)
(i)a.少なくとも1種の酵素であって、該酵素の活性が、反応組成物における二価カチオンの存在に依存する、酵素、
b.二価カチオン、
c.キレート剤であって、該カチオンの該キレート剤への結合が、該反応組成物のpHおよび/または温度に依存している、キレート剤、
d.酸解離定数が温度依存性であり、それにより温度における変化が該反応組成物のpHの変化をもたらす、緩衝系、
e.該酵素のための基質
を含む反応組成物を提供する工程、および
(ii)該反応組成物において温度を変化させる工程であって、それによりキレート剤に結合する二価カチオンが、これらの錯体から放出され、ここで、該酵素は、これにより活性化されるか、またはその活性が上昇される、工程、
の工程を含む、反応組成物における酵素活性の制御のための方法。
(項目2)
前記酵素が、核酸改変酵素である、項目1に記載の方法。
(項目3)
前記核酸改変酵素が、ポリメラーゼ、逆転写酵素およびヌクレアーゼを含む群から選択される、項目1〜3に記載の方法。
(項目4)
前記核酸改変酵素の活性が、基質結合および基質プロセシングを含む、項目2に記載の方法。
(項目5)
前記核酸改変酵素からの前記二価カチオンの除去が、低下した活性または活性の消失をもたらす、項目1〜4に記載の方法。
(項目6)
前記キレート剤が、エチレンジアミン四酢酸(EDTA)、エチレングリコールビス(アミノエチル)N,N’−四酢酸(EGTA)およびニトリロ三酢酸(NTA)を含む群から選択される、前記項目のいずれか1項に記載の方法。
(項目7)
前記二価カチオンが、Mg2+、Ca2+、Mn2+、Cu2+、Fe2+、Ni2+、Zn2+およびCo2+を含む群から選択される、前記項目のいずれか1項に記載の方法。
(項目8)
前記キレート剤が、EDTAであり、前記カチオンが、Mg2+、Ca2+、Mn2+、Cu2+、Ni2+、Zn2+およびCo2+から選択される、前記項目のいずれかに記載の方法。
(項目9)
前記キレート剤がEGTAであり、前記カチオンがCa2+および/またはMg2+である、前記項目のいずれかに記載の方法。
(項目10)
前記キレート剤がNTAであり、前記カチオンがCa2+および/またはCu2+および/またはCo2+である、前記項目のいずれかに記載の方法。
(項目11)
前記反応組成物が、緩衝系、好ましくはTris緩衝系を含み、前記二価カチオンが、好ましくは0.01と20mMとの間の濃度の、Mg2+であり、前記キレート剤が、0.05と50mMとの間の濃度のEGTAであり、前記核酸改変酵素が、DNAポリメラーゼ、好ましくはホットスタートポリメラーゼである、前記項目のいずれか1項に記載の方法。
(項目12)
前記反応組成物が、緩衝系、好ましくはTris緩衝系を含み、前記二価カチオンが、Mg2+、Ca2+、Mn2+、Cu2+、Fe2+、Ni2+、Zn2+およびCo2+の群から選択され、前記キレート剤が、EGTA、EDTAおよびNTAの群から選択され、前記核酸酵素が、ヌクレアーゼである、前記項目のいずれか1項に記載の方法。
(項目13)
i.緩衝系
ii.キレート剤
iii.核酸改変酵素
iv.前記酵素のための二価カチオン
を含む、核酸改変反応を行うためのキット。
本発明は、反応組成物における酵素活性の制御のための方法に関連する。反応組成物は、少なくとも1種の酵素(前記酵素の活性は、二価カチオンに依存している)、キレート剤、二価カチオン(前記カチオンの前記キレート剤への結合は、反応組成物のpHおよび/または温度に依存している)、緩衝系(酸解離定数は温度依存性であり、それにより、温度における変化が水性溶液のpHの変化をもたらす)および前記酵素の基質を含む。加えて、反応組成物において温度を変化させることは、キレート剤に結合する二価イオンが、これらの錯体から放出されることをもたらし、それによって当該酵素は活性化されるか、または活性を上昇させる。前記カチオンをキレートすることは、構造についての影響を有しない(前記カチオンを選択的に錯体化することは、活性を調節する)。活性における変化は、可逆性である(キレートすることによる不活性化は、温度上昇で前記カチオンを放出することによって逆転され得る)。
Tris緩衝剤は、PCR緩衝剤において慣用的に使用される。室温で、Trisに基づくPCR緩衝剤のpHは、8.7である。Trisは、1℃あたり0.03pH単位のpH値における温度依存性のシフトを示す。これは、95℃でpH値が6.6であることを意味する。PCR実験のためのキレート剤を選択するために、3種の異なるキレート剤、NTA、EDTAおよびEGTAの結合定数のpH依存性を調べた。それぞれのキレート剤についての文献から公知であるpK値を使用し、錯体形成のpH依存性を決定した(図1)。EGTAについての相関曲線は、pH値と結合定数との間の強力な相関を示す。それゆえ、EGTAをこの後の実験のために選択した。
増幅実験を、非特異的な副産物をもたらす傾向のあることが公知である試験系を使用して行った。1.2kbのゲノムDNA配列が、標的配列であった。プライマーHugAおよびプライマーHugBを使用した。
プライマー配列は、次の通りである:
アガロースゲルでのPCR反応の解析(図2)は、キレート剤としてEGTAを含有する反応が、EGTAを含まない反応と比較して少ない副産物を有することから、より特異的であることを示す。酵素的反応において慣用的に使用される他の緩衝剤は、表4に列挙される。
以下の実験は、残存活性を有するTaqポリメラーゼ分子を使用して、PCR反応混合物におけるプライマーダイマーの形成を検出するための系を使用した。ここでは、重亜硫酸処理したDNAが、鋳型として使用される。重亜硫酸処理(非メチル化シトシンのウラシルへの化学的修飾を伴う)の結果として、前記鋳型は、3種の塩基のみからなる。重亜硫酸処理は一本鎖DNAを使用する場合でのみはたらくため、前記重亜硫酸処理の完了後の大部分のDNAは、一本鎖である。そのようなDNA配列の増幅のために使用されるプライマーは、3種の塩基のみからなるため、低減した複雑性により特徴付けられる。それゆえ、これらのプライマーは、ダイマー形成の傾向があり、前記重亜硫酸処理したDNAに100.000倍超結合できる可能性が非常に高い。
このセットの実験において、DNase(ウシ膵臓から単離されたヌクレアーゼ)の活性を調節する手段を調べた。
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