JP2019142841A - 腫瘍微小環境の制御および免疫治療のための薬学的組み合わせおよび方法 - Google Patents

Abstract

【課題】薬学的組み合わせならびに腫瘍微小環境の制御および癌免疫治療におけるその応用の提供。【解決手段】対象において腫瘍微小環境における免疫抑制を取り除きまたは癌細胞に対する免疫系を刺激する方法において使用するための組み合わせであって、免疫チェックポイント阻害剤との組み合わせでＨＤＡＣ阻害剤とＮＳＡＩＤとを含む組み合わせであって、該組み合わせはさらにビグアニド化合物を含む。【選択図】なし

Description

本発明は免疫治療に関する。特に本発明は、薬学的組み合わせならびに腫瘍微小環境の制御および癌免疫治療におけるその応用を提供する。

癌免疫治療は、急速に発展している分野であり、前途有望なめざましいブレークスルーをもたらしてきた。腫瘍関連抗原の存在が発見されたことにより、今や、宿主の免疫系を使った腫瘍成長への介入の可能性が高まっている。免疫系の液性アームと細胞性アームの両方を利用するさまざまな機序が、現在、癌免疫治療のために探索されている。

免疫寛容を破るために、免疫エフェクターの養子移入、免疫調節治療およびワクチン接種を含むいくつかの戦略が提案されている。しかしこれらの戦略では免疫回避は依然として防止されない。癌細胞では、抗アポトーシスシグナリング、マイトジェン活性化プロテインキナーゼ（ＭＡＰＫ）および環状アデノシン一リン酸（ｃＡＭＰ）が関係する機序を含む主要回避経路が生じる。腫瘍微小環境は、腫瘍進行に応じて動的に変化するので、重要な研究分野である。腫瘍は免疫編集と呼ばれる過程によって免疫コントロールを回避するための機序を発達させ、それが、悪性進行につながりうる腫瘍微小環境中の選択圧を与える。「免疫回避」と呼ばれる腫瘍促進相において、免疫系は、宿主の免疫能に耐えて生き残る能力が高い癌細胞を選択するか、あるいは腫瘍のアウトグロースが容易になるように腫瘍微小環境を変更することによって、腫瘍進行を助長することができる。

免疫系ホメオスタシスには、免疫系応答のバランスをコントロールするために、刺激機序と阻害機序の両方が存在する。阻害機序には、細胞傷害性Ｔリンパ球関連抗原４（ＣＴＬＡ−４、ＣＤ２８ホモログ）、およびプログラム細胞死タンパク質１（ＰＤ−１）またはそのリガンド（ＰＤ−Ｌ１）、ＴＩＭ−３（Ｔ細胞免疫グロブリン３）、ＢＴＬＡ（ＢおよびＴリンパ球アテニュエーター（Ｂ ａｎｄ Ｔ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ ａｔｔｅｎｕａｔｏｒ））、ＶＩＳＴＡ（Ｔ細胞活性化のＶドメインＩｇサプレッサー（Ｖ−ｄｏｍａｉｎ Ｉｇ ｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒ ｏｆ Ｔ ｃｅｌｌ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ））およびＬＡＧ−３（リンパ球活性化遺伝子３）が含まれる。現在、抗ＣＴＬＡ−４、抗ＰＤ−１および抗ＰＤ−Ｌ１抗体を含む多くの免疫チェックポイント阻害剤モノクローナル抗体が、いくつかの腫瘍学的適応における治療的使用について、米国ＦＤＡおよびＥＭＡによって承認されている。しかし、これらの免疫チェックポイント阻害剤の場合、単独治療に対して腫瘍応答があったのは、癌患者の約２０％〜３０％である。有効性はまだ十分ではない。

米国特許出願公開第２０１８０２４４７８３号明細書は、癌および他の疾患を処置するために、免疫療法剤と組み合わされたＷｎｔ経路阻害剤を提供している。米国特許出願公開第２０１８０３５５０４２号明細書は、癌転移の低減および／または防止を含む癌の処置に有用なＨＤＡＣｉおよびＰＤ−１阻害剤を含む組み合わせを提供している。しかし、さらに顕著な抗腫瘍活性を達成するために、治療的解決策を開発することが今なお必要とされている。

本発明は、驚いたことに、ヒストンデアセチラーゼ（ＨＤＡＣ）阻害剤と非ステロイド性抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）との組み合わせが腫瘍微小環境に影響を及ぼしうることを見いだした。これは、そのような組み合わせを免疫チェックポイント阻害剤と組み合わせれば、抗癌活性が著しく改良されることを示唆している。本発明は、免疫チェックポイント阻害剤と組み合わされた本薬学的組み合わせによる処置が、免疫チェックポイント阻害剤単独と比較して、抗癌活性を有意に増強することを見いだした。本薬学的組み合わせと免疫チェックポイント阻害剤とによる同時処置は、腫瘍成長の阻害において、ＨＤＡＣ阻害剤＋免疫チェックポイント阻害剤の場合よりも高い効力を与える。さらにまた、本薬学的組み合わせと免疫チェックポイント阻害剤との組み合わせは、腫瘍を有意に根絶し、生存率を約７０〜８０％まで増強する。

一実施形態において、本発明は、ＨＤＡＣ阻害剤とＮＳＡＩＤとの組み合わせを免疫チェックポイント阻害剤と組み合わせて対象に投与する工程を含む、腫瘍微小環境における免疫抑制を取り除きまたは癌細胞に対する免疫系を刺激する方法を提供する。本方法は免疫治療によって癌を阻害または処置することができる。ある実施形態において、本組み合わせ中のＨＤＡＣ阻害剤とＮＳＡＩＤの量は、それぞれ、約５％〜約４０％（ｗ／ｗ）および約５％〜約４０％（ｗ／ｗ）の範囲にある。

さらなる一実施形態において、本組み合わせは、ビグアニド化合物をさらに含む。ビグアニド化合物の量は約４０％〜８０％（ｗ／ｗ）の範囲にある。

いくつかの実施形態において、ＨＤＡＣ阻害剤はクラスＩ ＨＤＡＣの選択的阻害剤である。特に、ＨＤＡＣ阻害剤はベンズアミドクラスのＨＤＡＣ阻害剤である。ＨＤＡＣ阻害剤の実施形態をいくつかあげると、チダミド、エンチノスタット、ボリノスタット、ロミデプシン、パノビノスタット、ベリノスタット、パノビノスタット、バルプロ酸、モセチノスタット、アベキシノスタット、エンチノスタット、プラシノスタット（ｐｒａｃｉｎｏｓｔａｔ）、レスミノスタット、ギビノスタット（ｇｉｖｉｎｏｓｔａｔ）およびキシノスタットなどがある。

いくつかの実施形態において、ＮＳＡＩＤはアスピリン、イブプロフェン、インドメタシン、ナプロキセンまたはＣＯＸ−２阻害剤である。ＣＯＸ−２阻害剤の実施形態をいくつかあげると、セレコキシブ、ロフェコキシブおよびエトリコキシブなどがある。

いくつかの実施形態において、免疫チェックポイント阻害剤は抗ＣＴＬＡ−４抗体、抗ＰＤ−１抗体または抗ＰＤ−Ｌ１抗体である。免疫チェックポイント阻害剤の実施形態をいくつかあげると、ランブロリズマブ、ピディリズマブ、ニボルマブ、デュルバルマブ、アベルマブ、アテゾリズマブおよびＭＩＨＩなどがある。

癌の実施形態をいくつかあげると、膠芽腫、肝癌、結腸直腸癌、膠芽腫、胃癌、結腸直腸癌、食道癌、肺癌、膵癌、腎細胞癌、良性前立腺過形成、前立腺癌、卵巣癌、黒色腫、乳癌、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）、メルケル細胞癌、非ホジキンリンパ腫、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、胆嚢癌、胆管癌、膀胱癌、および子宮癌などがある。

一実施形態において、本方法は、１つまたは複数の追加抗癌剤を投与する工程をさらに含む。

一実施形態において、本発明は、ＨＤＡＣ阻害剤、ＮＳＡＩＤおよび免疫チェックポイント阻害剤を含む薬学的組み合わせを提供する。ＨＤＡＣ阻害剤、ＮＳＡＩＤおよび免疫チェックポイント阻害剤の実施形態は、本明細書に記載するものである。一実施形態において、本薬学的組み合わせは、ビグアニド化合物をさらに含む。

ＣＴ２６腫瘍担持マウスにおける、抗ＰＤ−１抗体と組み合わされたチダミドまたはエンチノスタットの治療応答を示す図である。ＣＴ２６結腸腫瘍を担持するＢＡＬＢ／ｃマウスを、表示のとおり、さまざまな治療モダリティで処置した。ＩｇＧ、抗ＩｇＧ対照（媒体、１０ｍｇ／ｋｇ）；ＰＤ−１、抗ＰＤ−１モノクローナル抗体（１０ｍｇ／ｋｇ）；ＣＤ、チダミド（２５ｍｇ／ｋｇ）；Ｅ、ＭＳ−２７５（エンチノスタット、２０ｍｇ／ｋｇ）。総腫瘍体積（Ａ）、個別腫瘍体積（Ｂ）、ＣＴ２６腫瘍担持マウス体重（Ｃ）および動物生存率（Ｄ）を記録した。ＣＴ２６腫瘍担持マウスを表示のとおり処置し、腫瘍移植後に腫瘍体積が３０００ｍｍ^３に達したら安楽死させた。平均およびＳＤを示す。各実験アームに使用した動物の数およびＰ値も示されている。^＊Ｐ＜０．０５。Ｐ値は、適応群での腫瘍サイズをＩｇＧ群と比較するスチューデントのｔ検定を使って計算した。

ＣＴ２６腫瘍担持マウスにおける、抗ＰＤ−１抗体と組み合わされたチダミド＋メトホルミンの治療応答を示す図である。ＣＴ２６結腸腫瘍を担持するＢＡＬＢ／ｃマウスを、表示のとおり、さまざまな治療モダリティで処置した。ＩｇＧ、抗ＩｇＧ対照（媒体、１０ｍｇ／ｋｇ）；ＰＤ−１、抗ＰＤ−１モノクローナル抗体（１０ｍｇ／ｋｇ）；ＣＤ、チダミド（１２．５、２５または５０ｍｇ／ｋｇ）；Ｅ、ＭＳ−２７５（エンチノスタット、２０ｍｇ／ｋｇ）；Ｍ、メトホルミン（１００ｍｇ／ｋｇ）。総腫瘍体積（Ａ）、個別腫瘍体積（Ｂ）、ＣＴ２６腫瘍担持マウス体重（Ｃ）および動物生存率（Ｄ）を記録した。ＣＴ２６腫瘍担持マウスを表示のとおり処置し、腫瘍移植後、３，０００ｍｍ^３の腫瘍体積において安楽死させた。平均およびＳＤを示す。各実験アームに使用した動物の数およびＰ値も示されている。^＊Ｐ＜０．０５。Ｐ値は、適応群での腫瘍サイズをＩｇＧ群と比較するスチューデントのｔ検定を使って計算した。

ＣＴ２６腫瘍担持マウスにおける、抗ＰＤ−１抗体と組み合わされたチダミドまたはエンチノスタット＋メトホルミンおよびセレコキシブの治療応答を示す図である。ＣＴ２６結腸腫瘍を担持するＢＡＬＢ／ｃマウスを、表示のとおり、さまざまな治療モダリティで処置した。ＩｇＧ、抗ＩｇＧ対照（媒体、１０ｍｇ／ｋｇ）；ＰＤ−１、抗ＰＤ−１モノクローナル抗体（１０ｍｇ／ｋｇ）；ＣＤ、チダミド（１２．５ｍｇ／ｋｇ）；Ｅ、ＭＳ−２７５（エンチノスタット、２０ｍｇ／ｋｇ）；Ｃ、セレコキシブ（２５ｍｇ／ｋｇ）；Ｍ、メトホルミン（１００ｍｇ／ｋｇ）。総腫瘍体積（Ａ）、個別腫瘍体積（Ｂ）、担持マウス体重（Ｃ）および動物生存率（Ｄ）を記録した。ＣＴ２６腫瘍担持マウスを表示のとおり処置し、腫瘍移植後、３，０００ｍｍ^３の腫瘍体積において安楽死させた。平均およびＳＤを示す。各実験アームに使用した動物の数およびＰ値も示されている。^＊Ｐ＜０．０５。Ｐ値は、適応群での腫瘍サイズをＩｇＧ群と比較するスチューデントのｔ検定を使って計算した。

ＣＴ２６腫瘍担持マウスにおける、抗ＰＤ−１抗体と組み合わされたさまざまな用量のチダミド＋メトホルミンおよびセレコキシブの治療応答を示す図である。ＣＴ２６結腸腫瘍を担持するＢＡＬＢ／ｃマウスを、表示のとおり、さまざまな治療モダリティで処置した。ＩｇＧ、抗ＩｇＧ対照（媒体、１０ｍｇ／ｋｇ）；ＰＤ−１、抗ＰＤ−１モノクローナル抗体（１０ｍｇ／ｋｇ）；ＣＤ、チダミド（１２．５、２５または５０ｍｇ／ｋｇ）；Ｃ，セレコキシブ（２５または５０ｍｇ／ｋｇ）；Ｍ、メトホルミン（１００または２００ｍｇ／ｋｇ）。総腫瘍体積（Ａ）、個別腫瘍体積（Ｂ）、ＣＴ２６腫瘍担持マウス体重（Ｃ）および動物生存率（Ｄ）を記録した。ＣＴ２６腫瘍担持マウスを表示のとおり処置し、腫瘍移植後、３，０００ｍｍ^３の腫瘍体積において安楽死させた。平均およびＳＤを示す。各実験アームに使用した動物の数およびＰ値も示されている。^＊Ｐ＜０．０５。Ｐ値は、適応群での腫瘍サイズをＩｇＧ群と比較するスチューデントのｔ検定を使って計算した。

ＣＴ２６腫瘍担持マウスにおける、抗ＰＤ−Ｌ１抗体と組み合わされたチダミド＋メトホルミンおよびセレコキシブの治療応答を示す図である。ＣＴ２６結腸腫瘍を担持するＢＡＬＢ／ｃマウスを、表示のとおり、さまざまな治療モダリティで処置した。ＩｇＧ、抗ＩｇＧ対照（媒体、１０ｍｇ／ｋｇ）；ＰＤ−Ｌ１、抗ＰＤ−Ｌ１モノクローナル抗体（１０ｍｇ／ｋｇ）；ＣＤ、チダミド（５０ｍｇ／ｋｇ）；Ｃ、セレコキシブ（５０ｍｇ／ｋｇ）；Ｍ、メトホルミン（１００ｍｇ／ｋｇ）。総腫瘍体積（Ａ）、個別腫瘍体積（Ｂ）、ＣＴ２６腫瘍担持マウス体重（Ｃ）および動物生存率（Ｄ）を記録した。ＣＴ２６腫瘍担持マウスを表示のとおり処置し、腫瘍移植後、３，０００ｍｍ^３の腫瘍体積において安楽死させた。平均およびＳＤを示す。各実験アームに使用した動物の数およびＰ値も示されている。^＊Ｐ＜０．０５。Ｐ値は、適応群での腫瘍サイズをＩｇＧ群と比較するスチューデントのｔ検定を使って計算した。

ＪＣ腫瘍担持マウスにおける抗ＰＤ−１抗体と組み合わされたチダミド＋メトホルミンおよびセレコキシブの治療応答を示す図である。ＪＣ乳腫瘍を担持するＢＡＬＢ／ｃマウスを、表示のとおり、さまざまな治療モダリティで処置した。ＩｇＧ、抗ＩｇＧ対照（媒体、１０ｍｇ／ｋｇ）；ＰＤ−１、抗ＰＤ−１モノクローナル抗体（１０ｍｇ／ｋｇ）；ＣＤ、チダミド（５０ｍｇ／ｋｇ）；Ｃ，セレコキシブ（５０ｍｇ／ｋｇ）；Ｍ、メトホルミン（１００ｍｇ／ｋｇ）。総腫瘍体積（Ａ）、個別腫瘍体積（Ｂ）、ＪＣ腫瘍担持マウス体重（Ｃ）および動物生存率（Ｄ）を記録した。ＪＣ腫瘍担持マウスを表示のとおり処置し、腫瘍移植後、３，０００ｍｍ^３の腫瘍体積において安楽死させた。平均およびＳＤを示す。各実験アームに使用した動物の数およびＰ値も示されている。^＊Ｐ＜０．０５。Ｐ値は、適応群での腫瘍サイズをＩｇＧ群と比較するスチューデントのｔ検定を使って計算した。

ＣＴ２６腫瘍担持マウスにおける、（異なる用量の）抗ＰＤ−Ｌ１抗体と組み合わされたまたは抗体ＰＤ−Ｌ１抗体なしでの（異なる用量の）チダミド＋メトホルミンおよびセレコキシブの治療応答を示す図である。ＣＴ２６結腸腫瘍を担持するＢＡＬＢ／ｃマウスを、表示のとおり、さまざまな治療モダリティで処置した。ＩｇＧ、抗ＩｇＧ対照（媒体、１０ｍｇ／ｋｇ）；ＰＤ−Ｌ１、抗ＰＤ−Ｌ１モノクローナル抗体（２．５および１０ｍｇ／ｋｇ）；ＣＤ、チダミド（６．２５、１２．５または５０ｍｇ／ｋｇ）；Ｃ、セレコキシブ（５０ｍｇ／ｋｇ）；Ｍ、メトホルミン（１００ｍｇ／ｋｇ）。抗ＰＤ−Ｌ１抗体（２．５または１０ｍｇ／ｋｇ）およびチダミド（６．２５または５０ｍｇ／ｋｇ）＋セレコキシブ（５０ｍｇ／ｋｇ）およびメトホルミン（１００ｍｇ／ｋｇ）による処置後の総腫瘍体積（Ａ）、抗ＰＤ−Ｌ１抗体非存在下でのチダミド（６．２５、１２．５または５０ｍｇ／ｋｇ）＋セレコキシブ（５０ｍｇ／ｋｇ）およびメトホルミン（１００ｍｇ／ｋｇ）による処置後の総腫瘍体積（Ｂ）、抗ＰＤ−Ｌ１抗体の存在下（２．５または１０ｍｇ／ｋｇ）または非存在下でのチダミド（６．２５、１２．５または５０ｍｇ／ｋｇ）＋セレコキシブ（５０ｍｇ／ｋｇ）およびメトホルミン（１００ｍｇ／ｋｇ）による処置後の個別総腫瘍体積（Ｃ）、ＣＴ２６腫瘍担持マウス体重（Ｄ）および動物生存率（Ｅ）を記録した。ＣＴ２６腫瘍担持マウスを表示のとおり処置し、腫瘍移植後、３，０００ｍｍ^３の腫瘍体積において安楽死させた。平均およびＳＤを示す。各実験アームに使用した動物の数およびＰ値も示されている。^＊Ｐ＜０．０５。Ｐ値は、適応群での腫瘍サイズをＩｇＧ群と比較するスチューデントのｔ検定を使って計算した。

ＣＴ２６腫瘍担持マウスにおける、メトホルミンありまたはメトホルミンなしでのチダミド＋セレコキシブと組み合わされた抗ＰＤ−１抗体または抗ＰＤ−Ｌ１抗体の治療応答を示す図である。ＣＴ２６結腸腫瘍を担持するＢＡＬＢ／ｃマウスを、表示のとおり、さまざまな治療モダリティで処置した。ＩｇＧ、抗ＩｇＧ対照（媒体、２．５ｍｇ／ｋｇ）；ＰＤ−１、抗ＰＤ−１モノクローナル抗体（２．５ｍｇ／ｋｇ）；ＰＤ−Ｌ１、抗ＰＤ−Ｌ１モノクローナル抗体（２．５ｍｇ／ｋｇ）；ＣＤ、チダミド（５０ｍｇ／ｋｇ）；Ｃ、セレコキシブ（５０ｍｇ／ｋｇ）；Ｍ、メトホルミン（１００ｍｇ／ｋｇ）。抗ＰＤ−１／抗ＰＤ−Ｌ１抗体の存在下または非存在下、メトホルミン（１００ｍｇ／ｋｇ）ありまたはメトホルミンなしでの、チダミド（５０ｍｇ／ｋｇ）＋セレコキシブ（５０ｍｇ／ｋｇ）による処置後の総腫瘍体積（Ａ）、抗ＰＤ−１対照群または抗ＰＤ−Ｌ１対照群と比較した、チダミド（５０ｍｇ／ｋｇ）＋セレコキシブ（５０ｍｇ／ｋｇ）およびメトホルミン（１００ｍｇ／ｋｇ）と組み合わされた抗ＰＤ−１抗体または抗ＰＤ−Ｌ１抗体による処置後の総腫瘍体積（Ｂ）、表示のとおりさまざまな治療モダリティで処置した後の個別腫瘍体積（Ｃ）、ＣＴ２６腫瘍担持マウス体重（Ｄ）および動物生存率（Ｅ）を記録した。ＣＴ２６腫瘍担持マウスを表示のとおり処置し、腫瘍移植後、３，０００ｍｍ^３の腫瘍体積において安楽死させた。平均およびＳＤを示す。各実験アームに使用した動物の数およびＰ値も示されている。^＊Ｐ＜０．０５。Ｐ値は、適応群での腫瘍サイズをＩｇＧ群と比較するスチューデントのｔ検定を使って計算した。

ＣＴ２６腫瘍担持マウスにおける、抗ＰＤ−１抗体と組み合わされたさまざまな投与レジメンでのチダミド＋セレコキシブの治療応答を示す図である。ＣＴ２６結腸腫瘍を担持するＢＡＬＢ／ｃマウスを、表示のとおり、さまざまな治療モダリティで処置した。ＩｇＧ、抗ＩｇＧ対照（媒体、２．５ｍｇ／ｋｇ）；ＰＤ−１、抗ＰＤ−１モノクローナル抗体（２．５ｍｇ／ｋｇ）；ＣＤ、チダミド（１２．５、２５または５０ｍｇ／ｋｇ）；Ｃ，セレコキシブ（１２．５、２５または５０ｍｇ／ｋｇ）。チダミド１２．５ｍｇ／ｋｇ＋さまざまな用量のセレコキシブ（１２．５、２５．０または５０ｍｇ／ｋｇ）と組み合わされた抗ＰＤ−１抗体による処置後の総腫瘍体積（Ａ）、チダミド２５ｍｇ／ｋｇ＋さまざまな用量のセレコキシブ（１２．５、２５．０または５０ｍｇ／ｋｇ）と組み合わされた抗ＰＤ−１抗体による処置後の総腫瘍体積（Ｂ）、チダミド５０ｍｇ／ｋｇ＋さまざまな用量のセレコキシブ（１２．５、２５．０または５０ｍｇ／ｋｇ）と組み合わされた抗ＰＤ−１抗体による処置後の総腫瘍体積（Ｃ）、表示のとおりさまざまな治療モダリティで処置した後の個別腫瘍体積（Ｄ）、ＣＴ２６腫瘍担持マウス体重（Ｅ）および動物生存率（Ｆ〜Ｈ）を記録した。ＣＴ２６腫瘍担持マウスを表示のとおり処置し、腫瘍移植後、３，０００ｍｍ^３の腫瘍体積において安楽死させた。平均およびＳＤを示す。各実験アームに使用した動物の数およびＰ値も示されている。^＊Ｐ＜０．０５。Ｐ値は、適応群での腫瘍サイズをＩｇＧ群と比較するスチューデントのｔ検定を使って計算した。

ＣＴ２６腫瘍担持マウスにおける、抗ＰＤ−１または抗ＣＴＬＡ−４抗体と組み合わされたＨＤＡＣ阻害剤（チダミドおよびモセチノスタット）＋ＣＯＸ−２阻害剤（セレコキシブ、アスピリンおよびイブプロフェン）の治療応答を示す図である。ＣＴ２６結腸腫瘍を担持するＢＡＬＢ／ｃマウスを、表示のとおり、さまざまな治療モダリティで処置した。ＩｇＧ、抗ＩｇＧ対照（媒体、２．５ｍｇ／ｋｇ）；ＰＤ−１、抗ＰＤ−１モノクローナル抗体（２．５ｍｇ／ｋｇ）；ＣＴＬＡ４：抗ＣＴＬＡ４モノクローナル抗体（２．５ｍｇ／ｋｇ）；ＣＤ、チダミド（５０ｍｇ／ｋｇ）；Ｍｏｃ、モセチノスタット（３０ｍｇ／ｋｇ）；Ｃ、セレコキシブ（５０ｍｇ／ｋｇ）；Ａｓｐ、アスピリン（５０ｍｇ／ｋｇ）；Ｉｂｕ、イブプロフェン（５０ｍｇ／ｋｇ）。対照群（抗ＰＤ−１抗体単独および抗ＰＤ−１抗体なしの組み合わせ）と比較した、チダミド（５０ｍｇ／ｋｇ）＋ＣＯＸ−２阻害剤（セレコキシブ５０ｍｇ／ｋｇ、アスピリン５０ｍｇ／ｋｇまたはイブプロフェン５０ｍｇ／ｋｇ）と組み合わされた抗ＰＤ−１抗体による処置後の総腫瘍体積（Ａ）、セレコキシブ５０ｍｇ／ｋｇ＋ＨＤＡＣ阻害剤（チダミド５０ｍｇ／ｋｇまたはモセチノスタット３０ｍｇ／ｋｇ）と組み合わされた抗ＰＤ−１抗体による処置後の総腫瘍体積（Ｂ）、チダミド５０ｍｇ／ｋｇ＋セレコキシブ５０ｍｇ／ｋｇと組み合わされた抗ＣＴＬＡ４抗体または抗ＰＤ−１抗体による処置後の総腫瘍体積（Ｃ）、表示のとおりさまざまな治療モダリティで処置した後の個別腫瘍体積（Ｄ）、ＣＴ２６腫瘍担持マウス体重（Ｅ）および動物生存率（Ｆ〜Ｈ）を記録した。ＣＴ２６腫瘍担持マウスを表示のとおり処置し、腫瘍移植後、３，０００ｍｍ^３の腫瘍体積において安楽死させた。平均およびＳＤを示す。各実験アームに使用した動物の数およびＰ値も示されている。^＊Ｐ＜０．０５。Ｐ値は、適応群での腫瘍サイズをＩｇＧ群と比較するスチューデントのｔ検定を使って計算した。

ＣＴ２６腫瘍担持マウスにおける、抗ＰＤ−１抗体と組み合わされた固定用量のチダミド＋セレコキシブの治療応答を確認する図である。ＣＴ２６結腸腫瘍を担持するＢＡＬＢ／ｃマウスを、表示のとおり、さまざまな治療モダリティで処置した。ＩｇＧ、抗ＩｇＧ対照（媒体、２．５ｍｇ／ｋｇ）；ＰＤ−１、抗ＰＤ−１モノクローナル抗体（２．５ｍｇ／ｋｇ）；ＣＤ、チダミド（５０ｍｇ／ｋｇ）；Ｃ，セレコキシブ（５０ｍｇ／ｋｇ）。抗ＰＤ−１抗体と組み合わされたまたは抗ＰＤ−１抗体なしでのチダミド＋セレコキシブによる処置後の総腫瘍体積（Ａ）、表示のとおりさまざまな治療モダリティで処置した後の個別腫瘍体積（Ｂ）、ＣＴ２６腫瘍担持マウス体重（Ｃ）および動物生存率（Ｄ）を記録した。ＣＴ２６腫瘍担持マウスを表示のとおり処置し、腫瘍移植後、３，０００ｍｍ^３の腫瘍体積において安楽死させた。平均およびＳＤを示す。各実験アームにおける動物の数を増やした。Ｐ値も示されている。^＊Ｐ＜０．０５。Ｐ値は、適応群での腫瘍サイズをＩｇＧ群と比較するスチューデントのｔ検定を使って計算した。

ＣＴ２６腫瘍担持ヌードマウスにおける、抗ＰＤ−Ｌ１抗体と組み合わされた固定用量のチダミド＋メトホルミンおよびセレコキシブの治療応答を示す図である。ＣＴ２６結腸腫瘍を担持するＢＡＬＢ／ｃヌードマウスを、表示のとおり、さまざまな治療モダリティで処置した。ＩｇＧ、抗ＩｇＧ対照（媒体、２．５ｍｇ／ｋｇ）；ＰＤ−Ｌ１、抗ＰＤ−Ｌ１モノクローナル抗体（２．５ｍｇ／ｋｇ）；ＣＤ、チダミド（５０ｍｇ／ｋｇ）；Ｃ、セレコキシブ（５０ｍｇ／ｋｇ）；Ｍ、メトホルミン（１００ｍｇ／ｋｇ）。対照群と比較した、チダミド＋セレコキシブおよびメトホルミンと組み合わされた抗ＰＤ−Ｌ１抗体による処置後の総腫瘍体積（Ａ）、表示のとおりさまざまな治療モダリティで処置した後の個別腫瘍体積（Ｂ）、ＣＴ２６腫瘍担持マウス体重（Ｃ）、腫瘍重量（Ｄ）、および正常マウスとヌードマウスとの間での抗腫瘍活性の比較（Ｅ）を記録した。

セレコキシブと組み合わされた抗ＰＤ−１抗体およびチダミドによる処置に続く免疫細胞の応答を示す図である。転移性ＣＴ２６腫瘍を担持するＢＡＬＢ／ｃマウスを表示の治療モダリティで処置し、ＦＡＣＳ分析を利用して、循環免疫細胞および腫瘍浸潤性免疫細胞を評価した。平均およびＳＤを示すと共に、Ｐ値を表示する。ＩｇＧ、抗ＩｇＧ対照（媒体、２．５ｍｇ／ｋｇ）；ＰＤ−１、抗ＰＤ−１モノクローナル抗体（２．５ｍｇ／ｋｇ）；ＣＤ、チダミド（５０ｍｇ／ｋｇ）；Ｃ，セレコキシブ（５０ｍｇ／ｋｇ）。図１３Ａは、ＣＤ４、ＣＤ８、ＰＭＮ−ＭＤＳＣ、Ｍ−ＭＤＳＣおよびＴｒｅｇ細胞に関するＦＡＣＳ結果を示す。ＣＤ４５^＋ＣＤ１１ｂ^＋でゲートをかけた循環細胞におけるＬｙ６Ｇ^＋Ｌｙ６Ｃ^ｌｏｗ細胞（ＰＭＮ−ＭＤＳＣ）およびＬｙ６Ｃ^＋Ｌｙ６Ｇ⁻細胞（Ｍ−ＭＤＳＣ）のパーセンテージを示す代表的ＦＡＣＳデータ。非腫瘍担持マウスｎ＝６；腫瘍担持マウスｎ＝１１。図１３Ｂは、非腫瘍担持マウスとの比較で腫瘍担持マウスにおける、表示した異なる治療的処置による循環Ｍ−ＭＤＳＣ細胞に関するＦＡＣＳ結果を示す。図１３Ｃは、図１３Ｂに示すマウスにおける表示の処置後の、１２日目における循環Ｌｙ６Ｃ^＋Ｌｙ６Ｇ⁻細胞（Ｍ−ＭＤＳＣ）に関するＦＡＣＳ結果が、２３日目における対応する腫瘍サイズと相関したことを示している。図１３Ｄは、８日目および１２日目における表示の処置による循環ＦｏｘＰ３^＋Ｔｒｅｇ細胞に関するＦＡＣＳ結果を示す。代表的ＦＡＣＳデータが、循環白血球中のＦｏｘＰ３およびＣＤ２５二重陽性細胞のパーセンテージを示している。図１３Ｅは、８日目における表示の処置による腫瘍浸潤性骨髄系（ＣＤ１１ｂ^＋）細胞、ＴＡＭ細胞およびＭ−ＭＤＳＣ細胞に関するＦＡＣＳ結果を示す。図１３Ｆは、８日目における表示の処置による腫瘍浸潤性ＣＤ４^＋ＣＤ２５^＋ＦｏｘＰ３^＋Ｔｒｅｇ細胞、ＣＤ４^＋Ｔ細胞およびＣＤ８^＋Ｔ細胞に関するＦＡＣＳ結果を示す。図１３Ｇは、フローサイトメトリー分析によって調べた、さまざまな処置後のＣＴ２６腫瘍担持マウスからの腫瘍組織におけるＣＤ４^＋Ｔ細胞とＴｒｅｇ細胞との相対比を示す。図１３Ｈは、フローサイトメトリー分析によって調べた、さまざまな処置後のＣＴ２６腫瘍担持マウスからの腫瘍組織におけるＣＤ８^＋Ｔ細胞とＴｒｅｇ細胞との相対比を示す。^＊Ｐ＜０．０５。各群ｎ＝６での循環免疫細胞に関するデータアッセイ、各群ｎ＝２での腫瘍浸潤性免疫細胞に関するデータアッセイ。

発明の詳細な説明

別段の定義がある場合を除き、本明細書において使用する技術用語および科学用語は、本発明が属する技術分野における通常の技能を有する者が一般に理解しているものと同じ意味を有する。本明細書に記載するものと類似するまたは等価な方法および材料はいずれも本発明の実施または試験において使用できるが、好ましい方法および材料を以下に述べる。本明細書において言及する刊行物はすべて、参照により本明細書に組み入れられる。

「ａ」および「ａｎ」という用語は、１つまたは１つより多い（すなわち少なくとも１つ）の当該冠詞の文法上の対象を指す。例えば「要素（ａｎ ｅｌｅｍｅｎｔ）」は、１つの要素または１つより多い要素を意味する。「または」の使用は、別段の言明がある場合を除き、「および／または」を意味する。

本明細書にいう「対象」、「個体」および「患者」は、脊椎動物、好ましくは哺乳動物、より好ましくはヒトを指すために、相互可換的に使用される。哺乳動物として、マウス、サル、ヒト、農用動物、スポーツ動物およびペットがあげられるが、これらに限定されない。インビトロで得られたまたはインビトロで培養された生物学的実体の組織、細胞およびそれらの子孫も包含される。

本明細書にいう「治療有効量」は、疾患（例えば神経変性疾患）に苦しむ対象を処置するのに十分な量、または疾患に関連する症状または合併症を緩和するのに十分な量を意味する。

本明細書において使用する「処置する」、「処置すること」、「処置」などの用語は、障害および／またはそれに関連する症状を低減しまたは改善することを指す。障害または容態の処置は、その障害、容態またはそれに関連する症状が完全に除去されることを排除するわけではないものの、それを必要とするわけでもないことは、理解されるであろう。

本明細書において使用する「免疫治療」という用語は、ある疾患に苦しむ対象、またはある疾患にかかるリスクもしくはある疾患の再発を起こすリスクがある対象を、免疫応答を誘導し、亢進し、抑制し、または他の形で修飾することを含む方法によって処置することを指す。

本明細書において使用する「プログラム細胞死タンパク質１（ＰＤ−１）」という用語は、ＣＤ２８ファミリーに属する免疫阻害受容体を指す。ＰＤ−１は、インビボでは主に、以前に活性化されたＴ細胞上で発現し、２つのリガンドＰＤ−Ｌ１およびＰＤ−Ｌ２に結合する。本明細書において使用する「ＰＤ−１」という用語には、ヒトＰＤ−１（ｈＰＤ−１）、ｈＰＤ−１の変異体、アイソフォームおよび種ホモログ、ならびにｈＰＤ−１と共通するエピトープを少なくとも１つは有する類似体が含まれる。完全なｈＰＤ−１配列はＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｕ６４８６３に見いだすことができる。

本明細書において使用する「プログラム死リガンド（ｐｒｏｇｒａｍｍｅｄ ｄｅａｔｈ−ｌｉｇａｎｄ）１（ＰＤ−Ｌ１）」という用語は、ＰＤ−１に結合したときにＴ細胞の活性化およびサイトカイン分泌をダウンレギュレートする、ＰＤ−１の２つの細胞表面糖タンパク質リガンドのうちの１つである（もう一つはＰＤ−Ｌ２である）。本明細書において使用する「ＰＤ−Ｌ１」という用語には、ヒトＰＤ−Ｌ１（ｈＰＤ−Ｌ１）、ｈＰＤ−Ｌ１の変異体、アイソフォームおよび種ホモログ、ならびにｈＰＤ−Ｌ１と共通するエピトープを少なくとも１つは有する類似体が含まれる。完全なｈＰＤ−Ｌ１配列はＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｑ９ＮＺＱ７に見いだすことができる。

本明細書にいう「抗体」および「その抗原結合性フラグメント」は、天然免疫グロブリン（例えばＩｇＭ、ＩｇＧ、ＩｇＤ、ＩｇＡ、ＩｇＥなど）および非天然免疫グロブリン、例えば単鎖抗体、キメラ抗体（例えばヒト化マウス抗体）、ヘテロコンジュゲート抗体（例えば二重特異性抗体）、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）_２、Ｆａｂ、ＦｖおよびｒＩｇＧなどを包含する。本明細書にいう「抗原結合性フラグメント」は、抗原を特異的に認識する能力を保っている完全長抗体の一部分、ならびにそのような部分のさまざまな組み合わせである。

本明細書において使用する「癌」という用語は、身体における異常細胞のコントロールされない成長を特徴とする、多種多様な疾患群を指す。無制御な細胞の分裂と成長は、隣接組織に侵入してリンパ系または血流を介して身体の遠隔部分に転移することができる悪性腫瘍の形成をもたらす。本明細書にいう「癌」は、原発癌、転移癌および再発癌を指す。

本開示は、腫瘍微小環境構成要素の制御に焦点を合わせ、よって腫瘍微小環境における免疫抑制を取り除きまたは癌細胞に対する免疫系を刺激する方法を開発する。腫瘍微小環境は、腫瘍イニシエーション、腫瘍進行および治療に対する応答に寄与する癌生物学の重要な一態様である。腫瘍微小環境は、悪性細胞ならびに大規模なクロストークによる腫瘍の増殖、侵入および転移能を支える細胞を含む不均質な細胞集団で構成される。腫瘍細胞は、しばしば、骨髄由来抑制細胞（ＭＤＳＣ）および制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）などの免疫抑制的免疫細胞集団の発生に有利な免疫抑制微小環境を誘導する。それゆえに、さまざまな癌治療、特に宿主抗腫瘍免疫応答を増進することによって働く免疫治療の作用を指示し改良するのに役立ちうる腫瘍微小環境内のターゲットが発見されている。

したがって、本開示の第１の態様は、ＨＤＡＣ阻害剤とＮＳＡＩＤとの薬学的組み合わせを免疫チェックポイント阻害剤と組み合わせて対象に投与する工程を含む、腫瘍微小環境における免疫抑制を取り除きまたは癌細胞に対する免疫系を刺激する方法を提供することである。あるいは本開示は、腫瘍微小環境における免疫抑制を取り除きまたは癌細胞に対する免疫系を刺激するための医薬品の製造における、免疫チェックポイント阻害剤と組み合わせて投与されるＨＤＡＣ阻害剤とＮＳＡＩＤとの薬学的組み合わせの使用を提供する。あるいは本開示は、腫瘍微小環境における免疫抑制を取り除きまたは癌細胞に対する免疫系を刺激するための薬学的組み合わせであって、ＨＤＡＣ阻害剤とＮＳＡＩＤとを含み、かつ免疫チェックポイント阻害剤と組み合わせて投与される薬学的組み合わせを提供する。

本開示の第２の態様は、ＨＤＡＣ阻害剤、ＮＳＡＩＤおよび免疫チェックポイント阻害剤を含む薬学的組み合わせを提供することである。

一実施形態において、ＨＤＡＣ阻害剤とＣＯＸ−２阻害剤などのＮＳＡＩＤの量は、それぞれ約１０％〜約７０％（ｗ／ｗ）および約１０％〜約７０％（ｗ／ｗ）の範囲にある。一実施形態において、本薬学的組み合わせ中のＨＤＡＣ阻害剤、ＣＯＸ−２阻害剤などのＮＳＡＩＤ、および免疫チェックポイント阻害剤の量は、それぞれ約１０％〜約７０％（ｗ／ｗ）、約１０％〜約７０％（ｗ／ｗ）および約０．５％〜約２０％である。

いくつかの実施形態において、本薬学的組み合わせ中のＨＤＡＣ阻害剤の量は、約２０％（ｗ／ｗ）〜約７０％（ｗ／ｗ）、約３０％〜約７０％（ｗ／ｗ）、約４０％〜約７０％（ｗ／ｗ）、約２０％〜約６０％（ｗ／ｗ）、約３０％〜約６０％（ｗ／ｗ）、約４０％〜約６０％（ｗ／ｗ）または約３５％〜約６０％（ｗ／ｗ）の範囲にある。

いくつかの実施形態において、本薬学的組み合わせ中のＮＳＡＩＤの量は、約２０％〜約７０％（ｗ／ｗ）、約３０％〜約７０％（ｗ／ｗ）、約４０％〜約７０％（ｗ／ｗ）、約２０％〜約６０％（ｗ／ｗ）、約３０％〜約６０％（ｗ／ｗ）、約４０％〜約６０％（ｗ／ｗ）または約３５％〜約６０％（ｗ／ｗ）の範囲にある。

ＨＤＡＣは、細胞周期進行、増殖およびアポトーシスに影響を及ぼす媒介遺伝子発現（ｍｅｄｉａｔｅｄ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）によって、発癌性形質転換に関与することが示されている。ＨＤＡＣは、癌、寄生虫病および炎症性疾患の処置ターゲット候補として研究されている。現在知られている１８のヒトヒストンデアセチラーゼは、酵母ヒストンデアセチラーゼとのアクセサリードメインのホモロジーに基づいて、４つのグループ（Ｉ〜ＩＶ）に分類される。ＨＤＡＣ−１、−２、−３および−８を含むクラスＩは酵母ＲＰＤ３遺伝子と類縁であり、クラスＩＩＡはＨＤＡＣ−４、−５、−７および−９を、またクラスＩＩＢはＨＤＡＣ−６および−１０を含み、酵母ＨＤａ１遺伝子と類縁であり、クラスＩＩＩはサーチュインとしても知られ、Ｓｉｒ２遺伝子に類縁であって、ＳＩＲＴ１〜７を含み、ＨＤＡＣ１１だけを含むクラスＩＶは、クラスＩとクラスＩＩの両方の特徴を有する。

本発明の一実施形態において、ＨＤＡＣ阻害剤はクラスＩ ＨＤＡＣ阻害剤である。好ましくは、ＨＤＡＣ阻害剤はクラスＩ ＨＤＡＣの選択的阻害剤である。いくつかの実施形態において、ＨＤＡＣ阻害剤はベンズアミドクラスのヒストンデアセチラーゼ（ＨＤＡＣ）阻害剤である。いくつかの実施形態において、ＨＤＡＣ阻害剤としては、チダミド、ボリノスタット、ロミデプシン、パノビノスタット、ベリノスタット、パノビノスタット、バルプロ酸、モセチノスタット、アベキシノスタット、エンチノスタット、プラシノスタット、レスミノスタット、ギビノスタットおよびキシノスタットがあげられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、ＨＤＡＣ阻害剤はチダミド、エンチノスタットまたはモセチノスタットである。

ＮＳＡＩＤは、痛みを低減し、熱を下げ、高用量では炎症を減少させる薬物クラスである。大半のＮＳＡＩＤは、シクロオキシゲナーゼ−１（ＣＯＸ−１）およびシクロオキシゲナーゼ−２（ＣＯＸ−２）の活性を阻害し、それによってトロンボキサンおよびプロスタグランジンの合成を阻害する。ＣＯＸ−２の阻害は抗炎症効果、鎮痛効果および解熱効果につながると考えられているが、その一方で、ＣＯＸ−１も阻害するＮＳＡＩＤ、特にアスピリンは、高用量では、消化管出血および潰瘍を引き起こしうる。ＣＯＸ−２阻害剤は、自己免疫疾患および炎症性疾患を処置するために広く使用されている。２つのアイソフォームＣＯＸ−１およびＣＯＸ−２があるシクロオキシゲナーゼ（ＣＯＸ）は、プロスタグランジンＤ２（ＰＧＤ２）、ＰＧＥ２、ＰＧＦ２α、プロスタサイクリンＰＧＩ２およびトロンボキサンＴＸＡ２からなるプロスタノイドの生物活性脂質の合成における律速段階を担う酵素である。ＣＯＸ−１はホメオスタシスプロスタノイドを維持するために体組織において構成的に発現し、例えば血管新生、血管拡張および組織維持などのいくつかの生物学的機能に関与する。しかしＣＯＸ−２は正常条件では低レベルで発現する。ＣＯＸ−２は、感染、傷害および痛みなどの刺激によって迅速に誘導されて、炎症誘発性過程を開始する。選択的ＣＯＸ−２阻害剤は非ステロイド性抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）の一タイプである。

いくつかの実施形態では、ＮＳＡＩＤとして、アスピリン、イブプロフェン、インドメタシン、ナプロキセンおよびＣＯＸ−２阻害剤があげられるが、これらに限定されない。本発明のいくつかの実施形態において、ＮＳＡＩＤはＣＯＸ２阻害剤である。いくつかの実施形態において、ＣＯＸ２阻害剤として、セレブレックス（Ｃｅｌｅｂｒｅｘ）（一般名はセレコキシブである）、ロフェコキシブおよびエトリコキシブがあげられるが、これらに限定されない。好ましくはＣＯＸ２阻害剤はセレコキシブである。

一実施形態において、免疫チェックポイント阻害剤は、癌細胞に対する免疫系を刺激し癌を処置するために、本明細書に記載する薬学的組み合わせと組み合わせて使用することができる。本開示における使用に適した免疫チェックポイント阻害剤は、ＰＤ−１、ＣＴＬＡ−４、Ｔ細胞免疫グロブリン３、ＢおよびＴリンパ球アテニュエーター、Ｔ細胞活性化のＶドメインＩｇサプレッサーまたはリンパ球活性化遺伝子３経路を阻害する阻害受容体のアンタゴニスト、例えば抗ＰＤ−１抗体、抗ＰＤ−Ｌ１抗体、抗ＣＴＬＡ−４抗体、抗ＴＩＭ−３（Ｔ細胞免疫グロブリン３）抗体、抗ＢＴＬＡ（ＢおよびＴリンパ球アテニュエーター）抗体、抗ＶＩＳＴＡ（Ｔ細胞活性化のＶドメインＩｇサプレッサー）抗体および抗ＬＡＧ−３（リンパ球活性化遺伝子３）抗体を含む。ＰＤ−１またはＰＤ−Ｌ１阻害剤の例には、ヒトＰＤ−１を遮断するヒト化抗体、例えばランブロリズマブ（抗ＰＤ−１ Ａｂ、商品名キイトルーダ）またはピディリズマブ（抗ＰＤ−１ Ａｂ）、バベンチオ（抗ＰＤ−Ｌ１ Ａｂ、アベルマブ）、イミフィンジ（抗ＰＤ−Ｌ１ Ａｂ、デュルバルマブ）、およびテセントリク（抗ＰＤ−Ｌ１ Ａｂ、アテゾリズマブ）、ならびに完全ヒト抗体、例えばニボルマブ（抗ＰＤ−１ Ａｂ、商品名オプジーボ）およびセミプリマブ（ｃｅｍｉｐｌｉｍａｂ−ｒｗｌｃ）（抗ＰＤ−１ Ａｂ、商品名リブタヨ（Ｌｉｂｔａｙｏ））が含まれるが、これらに限定されない。他のＰＤ−１阻害剤としては、可溶性ＰＤ−１リガンド、例えば限定するわけではないが、Ｂ７−ＤＣ−ＩｇまたはＡＭＰ−２４４としても知られるＰＤ−Ｌ２ Ｆｃ融合タンパク質ならびに現在治療用に研究および／または開発されている他のＰＤ−１阻害剤の提示をあげることができる。加えて、免疫チェックポイント阻害剤としては、ＰＤ−Ｌ１を遮断するヒト化または完全ヒト抗体、例えばデュルバルマブおよびＭＩＨ１ならびに現在研究されている他のＰＤ−Ｌ１阻害剤もあげることができるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、免疫チェックポイント阻害剤の量は、約０．５％（ｗ／ｗ）〜約１５％（ｗ／ｗ）、０．５％（ｗ／ｗ）〜約１０％（ｗ／ｗ）、０．５％（ｗ／ｗ）〜約５％（ｗ／ｗ）、１．０％（ｗ／ｗ）〜約２０％（ｗ／ｗ）、１．０％（ｗ／ｗ）〜約１５％（ｗ／ｗ）、１．０％（ｗ／ｗ）〜約１０％（ｗ／ｗ）または１．０％（ｗ／ｗ）〜約５％（ｗ／ｗ）の範囲にある。

一実施形態において、本明細書に記載する組み合わせはビグアニド化合物をさらに含む。いくつかの実施形態において、ビグアニド化合物の量は、約３０％〜約７０％（ｗ／ｗ）、約３０％〜約６０％（ｗ／ｗ）、約３０％〜約５０％（ｗ／ｗ）、約５０％〜約８０％（ｗ／ｗ）、約６０％〜約８０％（ｗ／ｗ）または約６０％〜約７０％（ｗ／ｗ）、４０％〜約７０％（ｗ／ｗ）、約４０％〜約６０％（ｗ／ｗ）または約４０％〜約５０％（ｗ／ｗ）の範囲にある。

ビグアニドは式ＨＮ（Ｃ（ＮＨ）ＮＨ_２）_２の有機化合物である。さまざまなビグアニド誘導体が医薬として使用される。「ビグアニジン」という用語は、特に、真性糖尿病処置または前糖尿病処置に使用される経口血糖降下薬として機能する薬物クラスを指すことが多い。

本開示のいくつかの実施形態において、ビグアニド化合物としては、メトホルミン、フェンホルミン、プログアニルおよびクロルプログアニルがあげられるが、これらに限定されない。好ましくはビグアニド化合物はメトホルミンである。

一実施形態において、ＨＤＡＣ阻害剤とＮＳＡＩＤとの本薬学的組み合わせは、免疫チェックポイント阻害剤と共に、同時に、または逐次的にいずれかの順序でもしくは交互に、投与される。本開示のいくつかの実施形態では、ＨＤＡＣ阻害剤、ＮＳＡＩＤ、免疫チェックポイント阻害剤およびビグアニド化合物が、同時に投与される。いくつかの実施形態において、ＨＤＡＣ阻害剤、ＮＳＡＩＤ、免疫チェックポイント阻害剤およびビグアニド化合物は、逐次的にいずれかの順序で、または交互に投与される。

さらなる一実施形態において、本方法は、１つまたは複数の追加抗癌剤を投与する工程を、さらに含む。追加抗癌剤は、本明細書に記載するまたは当技術分野で知られる、任意の抗癌剤である。一実施形態において、追加抗癌剤は、化学治療剤またはプラチナダブレット化学治療剤である。一定の実施形態において、追加抗癌剤はチロシンキナーゼ阻害剤（ＴＫＩ）である。一実施形態において、追加抗癌剤は抗ＶＥＧＦ抗体である。他の実施形態において、抗癌剤は、プラチナ剤（例えばシスプラチン、カルボプラチン）、有糸分裂阻害剤（例えばパクリタキセル、アルブミン結合型パクリタキセル、ドセタキセル、タキソテール、ドセキャド（ｄｏｃｅｃａｄ））、フッ化ビンカアルカロイド（例えばビンフルニン、ジャブラ−（ｊａｖｌｏｒ））、ビノレルビン、ビンブラスチン、エトポシド、またはペメトレキセドゲムシタビンである。一実施形態において、追加抗癌剤は５−フルロウラシル（５−ＦＵ）である。一定の実施形態において、追加抗癌剤は当技術分野において知られる他の任意の抗癌剤である。

本発明の薬学的組み合わせは「担体」を使って製剤化しうる。本明細書にいう「担体」には、任意の溶媒、分散媒、媒体、コーティング、希釈剤、抗細菌および／または抗真菌剤、等張化剤、吸収遅延剤、緩衝剤、担体溶液、懸濁液、コロイドなどが含まれる。薬学的活性物質のためのそのような媒質および／または薬剤の使用は、当技術分野において周知である。例えば本薬学的組み合わせは、以下の投与に適合したものを含む固形または液状での投与のために、特別に製剤化することができる：（１）経口投与、例えばドレンチ剤（水性または非水性の溶液剤または懸濁剤）、口中錠、糖衣剤、カプセル剤、丸剤、錠剤（例えば口腔粘膜吸収、舌下吸収および全身性吸収を目的とするもの）、ボーラス剤、散剤、顆粒剤、舌に塗布するためのペースト剤；（２）例えば滅菌溶液剤もしくは滅菌懸濁剤または持続放出製剤としての、例えば皮下、筋肉内、静脈内または硬膜外注射による、非経口投与；（３）例えば皮膚に塗布されるクリーム剤、ローション剤、ゲル剤、軟膏または制御放出貼付剤または噴霧剤としての、局所塗布；（４）例えばペッサリー、クリーム剤、坐剤またはフォーム剤としての、腟内または直腸内投与；（５）舌下投与；（６）眼投与；（７）経皮投与；（８）経粘膜投与；または（９）経鼻投与。

さらなる一態様において、本発明は、本発明の薬学的組み合わせを対象に投与する工程を含む、対象における癌を処置する方法を提供する。

いくつかの実施形態において、癌としては、膠芽腫、肝癌（肝細胞癌など）、結腸直腸癌、膠芽腫、胃癌、結腸直腸癌、食道癌、肺癌（非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）および小細胞肺癌など）、膵癌、腎細胞癌、良性前立腺過形成、前立腺癌、卵巣癌、黒色腫、乳癌、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）、メルケル細胞癌、非ホジキンリンパ腫、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、胆嚢癌、胆管癌、膀胱癌、および子宮癌があげられるが、これらに限定されない。

いくつかの実施形態において、本発明の薬学的組み合わせは、単一の製剤として提供されうる。別の実施形態において、本発明の薬学的組み合わせは別々の製剤として提供されうる。薬学的組み合わせは、１つまたは複数の好ましい投与経路に適合した多様なおよび／または複数の形態で製剤化されうる。したがって薬学的組み合わせは、例えば経口、非経口（例えば皮内、経皮、皮下、筋肉内、静脈内、腹腔内など）または局所（例えば鼻腔内、肺内、乳房内、腟内、子宮内、皮内、経皮、経直腸など）を含む、１つまたは複数の既知の経路によって投与することができる。薬学的組み合わせまたはその一部分は、粘膜表面に、例えば鼻粘膜または呼吸粘膜への（例えばスプレーまたはエアロゾルによる）投与によって、投与することができる。薬学的組み合わせまたはその一部分は、持続放出または遅延放出によって投与することもできる。

製剤は、単位剤形として好都合に提示することができ、薬学分野において周知の方法によって調製することができる。薬学的に許容される担体との組み合わせを調製する方法は、本発明の薬学的組み合わせを、１つまたは複数の補助成分を構成する担体と混和する工程を含む。一般に、製剤は、活性化合物を液状担体、微細固形担体またはその両方と均一および／または十分に混和した後、必要であれば、その生成物を所望の製剤に成形することによって調製しうる。

いくつかの実施形態において、本方法は、約１０ｍｇ／ｋｇ〜約１，０００ｍｇ／ｋｇの用量が対象に与えられるように、十分な量の本薬学的組み合わせを投与する工程を含むことができる。

以下の実施例によって本発明を例証する。特定の例、材料、量および手順は、本明細書に記載する本発明の範囲および要旨に従って幅広く解釈されるべきであることを理解すべきである。

材料および方法
試薬．Ｇｉｂｃｏ ＲＰＭＩ１６４０およびＤＭＥＭ（Ｌ−グルタミン含有）はＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓから購入した。ＨｙＣｌｏｎｅ ＦＢＳはＴｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃから購入した。チダミドはＧＮＴｂｍから提供された。エンチノスタット、モセチノスタット、アスピリン、イブプロフェン、セレコキシブおよびメトホルミンはＣａｙｍａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ（Ａｎｎ Ａｒｂｏｒ，ＭＩ）から購入した。動物実験には以下の抗体および試薬を使用した：マウス抗ＰＤ−Ｌ１（Ｂ７−Ｈ１）モノクローナル抗体（１０Ｆ．９Ｇ２；Ｂｉｏ Ｘ Ｃｅｌｌ）、マウス抗ＰＤ−１（ＣＤ２７９）モノクローナル抗体（ＲＭＰ１−１４；Ｂｉｏ Ｘ Ｃｅｌｌ）、マウス抗ＣＴＬＡ４（ＣＤ１５２）モノクローナル抗体（ＢＥ０１６４；Ｂｉｏ Ｘ Ｃｅｌｌ）およびラット抗ＩｇＧ２ａアイソタイプ対照モノクローナル抗体（２Ａ３；Ｂｉｏ Ｘ Ｃｅｌｌ）。

細胞株．ＪＣ（ＣＲＬ−２１１６；マウス乳腺腫瘍細胞）およびＣＴ２６（ＣＲＬ−２６３８；マウス結腸直腸腺癌）はＡＴＣＣから購入した。どちらの腫瘍細胞株も、１０％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）ＦＢＳを補足したマッコイ５Ａ中、３７℃、５％ＣＯ_２で成長させた。

動物モデルにおける抗癌活性．動物研究は台北医学大学施設内動物実験委員会（ＴＭＵ ＩＡＣＵＣ）による承認および監督を受けた。すべての動物実験に６〜８週齢の雄ＢＡＬＢ／ｃマウス（ＢｉｏＬＡＳＣＯＴ Ｔａｉｗａｎ）を使用した。ＪＣ癌細胞（１×１０^７個）またはＣＴ２６癌細胞（５×１０^６〜１×１０^７個）を、各マウスの右脇腹にｓ．ｃ．によって接種した。無作為化および処置に先だって、腫瘍を１１日間成長させた（腫瘍サイズ約２００〜３００ｍｍ^３）。ＣＴ２６担持マウスおよびＪＣ担持マウスに、１０または２．５ｍｇ／ｋｇの抗ＩｇＧ、抗ＰＤ−１および／または抗ＰＤ−Ｌ１ならびに抗ＣＴＬＡ−４（２．５ｍｇ／ｋｇ）抗体を、腫瘍移植後１１、１４、１７、２０、２３および２６日目に、ｉ．ｐ．投与した。すべての抗体を１００μＬの無菌ＰＢＳ（ｐＨ７．４）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）に適当な濃度まで希釈した。セレコキシブ、チダミド、メトホルミン、モセチノスタット、エンチノスタット、アスピリンおよびイブプロフェン処置は、腫瘍移植後１１日目に、経口的に施行した。セレコキシブ（１２．５、２５．０および５０ｍｇ／ｋｇ）またはメトホルミン（１００または２００ｍｇ／ｋｇ）による連日処置は、１１日目から２６日目まで行った。チダミドは、腫瘍担持マウスを処置するために、６．２５、１２．５、２５および５０ｍｇ／ｋｇの用量で、または単回投与として、投与された。チダミドは１１日目から２６日目まで毎日、経口投与した。エンチノスタットは、１１日目から２５日目まで、２日ごとに２０ｍｇ／ｋｇの用量で経口投与した。モセチノスタットは、１１日目から２６日目まで、用量３０ｍｇ／ｋｇの連日処置で、経口投与した。アスピリンおよびイブプロフェンは、１１日目から２６日目まで、用量５０ｍｇ／ｋｇの連日処置で、経口投与した。抗癌活性を、腫瘍成長の処置の開始時から、腫瘍体積が３，０００ｍｍ^３に達するまで測定した。腫瘍体積は長さ×幅^２×０．５として算出した。

動物モデルにおける生存率．抗体または薬物の投与は１１日目から２５日目または２６日目まで行った。腫瘍は腫瘍担持マウス中で成長し続けた。マウスの腫瘍体積は３日ごとに１回測定した。腫瘍担持マウスは、腫瘍体積が３，０００ｍｍ^３に達したときに死亡とみなした。すべての処置群を記録し、分析した。

インビボ異種移植片実験．動物研究は台北医学大学施設内動物実験委員会（ＴＭＵ ＩＡＣＵＣ）による承認および監督を受けた。ヌードＢＡＬＢ／ｃマウス（６週齢、雌、体重２０ｇ）をＢｉｏＬＡＳＣＯ，Ｔａｉｗａｎから購入し、病原体フリー条件下で維持した。５×１０^６細胞の１５０μＬ ＣＴ２６細胞を注射することによって、マウスＣＴ２６異種移植片腫瘍モデルを開発した。ＣＴ２６癌細胞を各マウスの右脇腹にｓ．ｃ．接種した。ランダム化および処置に先だって、腫瘍サイズが３５０〜４００ｍｍ^３に達したら、腫瘍細胞を２週間成長させた。１９匹のヌードマウスを５つの群および処置に分類した。試験動物には、対照としての抗ＩｇＧ Ａｂ２．５ｍｇ／ｋｇ、チダミド５０ｍｇ／ｋｇ＋セレコキシブ５０ｍｇ／ｋｇおよびメトホルミン１００ｍｇ／ｋｇと組み合わされた抗ＰＤ−Ｌ１ Ａｂ２．５ｍｇ／ｋｇ、セレコキシブ５０ｍｇ／ｋｇおよびメトホルミン１００ｍｇ／ｋｇと組み合わされたチダミド５０ｍｇ／ｋｇ、チダミド５０ｍｇ／ｋｇ、およびセレコキシブ５０ｍｇ／ｋｇを投与した。処置プロセスはすべてのＢＡＬＢ／Ｃマウスで同様であった。抗癌活性は、腫瘍成長の処置の開始時から２９日目まで測定して、屠殺し、腫瘍を重量測定した。腫瘍体積は長さ×幅^２×０．５として算出した。

フローサイトメトリー．フローサイトメトリーには以下の抗体および試薬を使用した：ＣＤ３ ＡＰＣ（１７Ａ２；Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）、ＣＤ４ ＰＥ（ＧＫ１．５；Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）、ＣＤ８ａ ＰｅｒＣＰ（５３−６．７；；Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）、ＣＤ２５ ＰｅｒＣＰ（ＰＣ６１；Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）、Ｆｏｘｐ３ ＰＥ（ＭＦ−１４；Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）、ＣＤ１１ｂ ＡＰＣ（Ｍ１／７０；Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）、Ｌｙ−６Ｃ ＰｅｒＣＰ（ＨＫ１．４；Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）、Ｌｙ−６Ｇ ＰＥ（１Ａ８；Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）、ＣＤ４５ ＦＩＴＣ（３０−Ｆ１１；Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）、ＭＨＣＩＩ（Ｍ５／１１４．１５．２；ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）。フローサイトメトリーはＢＤ ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ（商標）（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で行い、データはＦＡＣＳＤｉｖａソフトウェア（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で分析した。循環骨髄由来抑制細胞（ＭＤＳＣ）集団およびリンパ由来Ｔ細胞のレベルを評価するために、チダミド（５０ｍｇ／ｋｇ）＋セレコキシブ（５０ｍｇ／ｋｇ）ありまたはなしの抗ＰＤ−１抗体（２．５ｍｇ／ｋｇ）処置の開始後８日目および１２日目に、マウスから血液試料を収集した。左右顔面静脈のどちらかから、１５０マイクロリットルの血液を、エッペンドルフチューブに収集した。抗凝固処理した血液試料からのＲＢＣを、直ちに、２ｍＬの１×ＢＤ ＦＡＣＳ Ｌｙｓｅ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使って３分間溶解し、試料を氷冷ＢＤ ＦＡＣＳ緩衝液（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）中で２回洗浄した。試料を適当な抗体で染色した。分析のために、本発明者らは、以前に確立されたこれらの細胞の表現型基準を、ＰＭＮ−ＭＤＳＣ：ＣＤ４５^＋ＣＤ１１ｂ^＋Ｌｙ６Ｇ^＋Ｌｙ６Ｃ^ｌｏｗ細胞、Ｍ−ＭＤＳＣ：ＣＤ４５^＋ＣＤ１１ｂ^＋Ｌｙ６Ｇ⁻Ｌｙ６Ｃ^＋細胞、ＣＤ４^＋Ｔ細胞：ＣＤ４５^＋ＣＤ３^＋ＣＤ４^＋細胞、ＣＤ８^＋Ｔ細胞：ＣＤ４５^＋ＣＤ３^＋ＣＤ８^＋細胞、Ｔｒｅｇ細胞：ＣＤ４５^＋ＣＤ３^＋ＣＤ２５^＋ＦＯＸＰ３^＋細胞、ＴＡＭ細胞：ＣＤ４５^＋ＣＤ１１ｂ^＋ＭＨＣＩＩ^＋細胞として使用し、全ＣＤ４５^＋細胞を共通項として使用した。他方、腫瘍内のＣＤ８^＋集団および制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）集団のレベルを評価するために、チダミド（５０ｍｇ／ｋｇ）＋セレコキシブ（５０ｍｇ／ｋｇ）ありまたはなしの抗ＰＤ−１抗体（２．５ｍｇ／ｋｇ）処置の開始後、８日目に、まず、マウスから切り出した腫瘍試料からリンパ球を精製した。簡単に述べると、原発腫瘍組織を収穫し、重量測定し、細片に切り刻んだ。マウス腫瘍解離キット（Ｃａｔ：１３０−０９６−７３０）を使用した。３つの酵素を腫瘍組織２００ｍｇあたり１ｍＬの比で各試料に加えた。試料を、回転振とう機上、３７℃で１２０分間インキュベートした。結果として得られた組織ホモジネートを０．４μｍフィルターで濾過し、氷冷ＰＢＳで３回洗浄し、１試料あたり１×１０^６細胞を抗体標識に使用した。ＣＤ８^＋Ｔ細胞レベルは、以前に確立されたＣＤ４５^＋ＣＤ３^＋ＣＤ８^＋という表現型基準を使って評価し、全ＣＤ４５^＋ＣＤ３^＋細胞を共通項として使用した。Ｔｒｅｇ細胞レベルは、以前に確立されたＣＤ４５^＋ＣＤ３^＋ＣＤ２５^＋ＦＯＸＰ３^＋という表現型基準を使って評価し、全ＣＤ４５^＋ＣＤ３^＋細胞を共通項として使用した。

統計．すべてのデータポイントについて少なくとも４つの独立した実験から平均および標準誤差を算出した。各実験条件とＩｇＧ対照群との間の腫瘍サイズのペアワイズ比較を、スチューデントの二標本検定を使って行った（Ｓｙｓｔａｔ Ｓｏｆｔｗａｒｅ，Ｓａｎ Ｊｏｓｅ，ＣＡ，ＵＳＡ）。

実施例１ 抗ＰＤ−１抗体の効果
ＣＴ−２６結腸癌細胞担持ＢＡＬＢ／ｃマウスに対する抗ＰＤ−１抗体の抗癌活性を理解するために、ＣＴ２６担持マウスに、抗ＰＤ−１抗体を、１０ｍｇ／ｋｇの抗ＰＤ−１および／または抗ＩｇＧ抗体で、腫瘍移植後１１日目、１４日目、１７日目、２０日目、２３日目および２６日目にｉ．ｐ．投与した。腫瘍サイズが２００〜３００ｍｍ^３に成長したら、実験を開始した。奏効率をいくつかのアッセイで評価した。この研究では、本発明者らは、部分奏効（ＰＲ、処置の終了時に腫瘍担持マウスにおいて≦２倍の腫瘍成長）；安定（Ｓｔａｂｌｅ Ｄｉｓｅａｓｅ）（ＳＤ、処置の終了時に腫瘍担持マウスにおいて２〜５倍の腫瘍成長）；進行（Ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｖｅ Ｄｉｓｅａｓｅ）（ＰＤ、処置の終了時に腫瘍担持マウスにおいて５倍以上の腫瘍成長）を画定した。通常は、１０〜１５倍以上の腫瘍成長（約３，０００ｍｍ^３）が対照群に見られた。抗ＰＤ−１抗体は、対照群（抗ＩｇＧ群で処置した群）と比較して腫瘍成長を有意に阻害した（図１Ａ参照）。対照群の腫瘍サイズがおよそ３，０００ｍｍ^３に達したときに、抗ＰＤ−１抗体群のそれはおよそ１，２００ｍｍ^３まで成長していた（図１Ａ）。しかし、抗ＰＤ−１抗体単独では、腫瘍成長は短時間しか阻害されず、その後、腫瘍は成長を続けた。抗ＰＤ−１抗体群では、３匹のマウスにＳＤが観察され、３匹のマウスにＰＤが観察された（図１Ｂ参照）。

実施例２ 抗ＰＤ−１抗体と組み合わされたエピジェネティック調節因子の効果
抗ＰＤ−１抗体と組み合わせたチダミドまたはエンチノスタットの抗癌活性を、ＣＴ２６腫瘍細胞担持マウスにおいて評価した。チダミドまたはエンチノスタットを、それぞれ２５ｍｇ／ｋｇおよび２０ｍｇ／ｋｇの用量で、ＣＴ２６担持マウスに経口投与した。チダミドは毎日投与し、エンチノスタットは２日ごとに投与した。抗ＰＤ−１抗体と組み合わされたチダミドまたはエンチノスタットは、抗ＰＤ−１抗体単独よりも強力な抗癌活性を呈した（図１Ａ）。抗ＰＤ−１抗体と組み合わされたチダミドは、チダミド単独よりも、腫瘍成長の阻害において有効であった。本発明者らの結果は、抗ＰＤ−１抗体と組み合わせたチダミドの群では、１匹のマウスがＰＲを達成し、３匹のマウスにＳＤが観察され、１匹のマウスにＰＤが観察されたことを示している（図１Ｂ）。しかし、抗ＰＤ−１抗体と組み合わされたエンチノスタットの群は、腫瘍成長の阻害において、抗ＰＤ−１抗体と組み合わされたチダミドの群よりも高い効力を示す（図１Ｂ）。どの群でもマウスに体重減少はなかった（図１Ｃ）。腫瘍担持マウスモデルで生存率を評価した。生存率は、腫瘍サイズがおよそ３，０００ｍｍ^３に達したときに評価した。すべての薬物を１１日から２６日まで投与した。結果は、抗ＰＤ−１抗体と組み合わされたチダミドの群が、４２日目に４０％の生存率を有し、一方、抗ＰＤ−１抗体群および抗ＰＤ−１抗体と組み合わされたエンチノスタットの群は、それぞれ約３３％および７１％の生存率を有することを示している（図１Ｄ）。

実施例３ メトホルミンおよび抗ＰＤ−１抗体と組み合わされたチダミドの効果
１００ｍｇ／ｋｇのメトホルミンを腫瘍担持マウスに経口投与した。結果は、対照群と比較して腫瘍成長が著しく阻害されたことを示している（図２Ａ参照）。メトホルミン群では、１匹のマウスにＳＤが観察され、５匹のマウスにＰＤが観察された（図２Ｂ）。抗ＰＤ−１抗体と組み合わされたエンチノスタットの群（陽性対照）では、３匹のマウスがＰＲを達成し、１匹のマウスにＳＤが観察され、３匹のマウスにＰＤが観察された（図２Ｂ）。図２Ａに示すとおり、抗ＰＤ−１抗体と組み合わされた高用量（５０ｍｇ／ｋｇ）のチダミドは、抗ＰＤ−１抗体と組み合わされた低用量（１２．５ｍｇ／ｋｇ）のチダミドよりも低い抗癌活性を有する。抗ＰＤ−１抗体と組み合わされた１２．５ｍｇ／ｋｇのチダミドによる処置は、抗ＰＤ−１抗体と組み合わされた２５または５０ｍｇ／ｋｇのチダミドよりも、腫瘍成長の阻害において強力であった（図２Ｂ）。抗ＰＤ−１抗体と組み合わされた１２．５ｍｇ／ｋｇチダミドの群では、２匹のマウスにＳＤが観察され、４匹のマウスにＰＤが観察された。しかしチダミドの増加は抗癌活性を強化しなかった（図２Ｂ）。２つの群、抗ＰＤ−１抗体と組み合わされたチダミド（５０ｍｇ／ｋｇ）および抗ＰＤ−１抗体と組み合わされたチダミド（５０ｍｇ／ｋｇ）＋メトホルミン（１００ｍｇ／ｋｇ）を試験した。結果を図２Ｂに示す。結果は、メトホルミンおよび抗ＰＤ−１抗体と組み合わされたチダミドによる処置が、抗ＰＤ−１抗体と組み合わされたチダミドよりも、腫瘍成長の阻害において強力であることを示している。図２Ｂに示すとおり、２匹のマウスがＰＲを達成し、１匹のマウスにＳＤが観察され、２匹のマウスにＰＤが観察された。処置群のマウスに体重減少はなかった（図２Ｃ参照）。次に、処置群におけるマウスの生存率を５８日目に決定した。図２Ｄに示すとおり、薬物処置は３０日目に停止した。メトホルミンおよび抗ＰＤ−１抗体と組み合わされたチダミド（５０ｍｇ／ｋｇ）による処置は、他の併用処置と比較して、腫瘍成長のより強力な阻害を起こし、生存率を有意に増加させた。メトホルミンおよび抗ＰＤ−１抗体と組み合わされたチダミド（５０ｍｇ／ｋｇ）の群では生存率が６０％に増加し、一方、陽性対照群（抗ＰＤ−１ Ａｂと組み合わされたエンチノスタット）は２０％前後の生存率しかなかった。抗ＰＤ−１抗体（１０ｍｇ／ｋｇ）と組み合わされたチダミド（５０ｍｇ／ｋｇ）は腫瘍成長を停止することができないが、この組み合わせにメトホルミン（１００ｍｇ／ｋｇ）を付加した後は、阻害活性および生存率が増加した。結果は、メトホルミンは腫瘍微小環境における腫瘍糖質代謝産物に影響を及ぼすことができ、よって免疫チェックポイント阻害剤の抗癌活性を改良することを示唆している（図２Ｄ）。

実施例４ 抗ＰＤ−１抗体と組み合わされたチダミドまたはエンチノスタット＋メトホルミン＋セレコキシブの効果
チダミド＋メトホルミン＋セレコキシブ＋抗ＰＤ−１抗体またはエンチノスタット＋メトホルミン＋セレコキシブ＋抗ＰＤ−１抗体による処置は、腫瘍成長の阻害において、セレコキシブがないものより強力であった（図３Ａ）。エンチノスタット群はチダミド群より強力である。しかし、エピジェネティック調節因子が存在しない場合、抗ＰＤ−１抗体と組み合わされたメトホルミン＋セレコキシブの処置群は、減少した抗癌活性を示した。処置群のマウスに体重減少はなかった（図３Ｃ）。さらにまた、図３Ｂは、処置群の全マウスの腫瘍成長を示している。本発明者らの結果は、抗ＰＤ−１抗体と組み合わされたエンチノスタット＋メトホルミンおよび抗ＰＤ−１抗体と組み合わされたエンチノスタット＋セレコキシブが、高率のＰＲを達成するのに、非常に強力であることを示している。セレコキシブは、腫瘍微小環境における抗腫瘍に、メトホルミンよりも重要な役割を果たす（図３Ｂ）。抗ＰＤ−１抗体と組み合わされたチダミド＋メトホルミンまたは抗ＰＤ−１抗体と組み合わされたチダミド＋セレコキシブは、類似する結果を示し、高率のＰＲを達成する。しかし、チダミドまたはエンチノスタットが存在しない場合は、免疫チェックポイント阻害剤処置群における抗癌活性が減少する（図３Ｂ）。結果は、抗癌活性を改良するには免疫チェックポイント阻害剤をエピジェネティクス調節因子と組み合わせる必要があることを示唆している。この改良は、メトホルミンおよびセレコキシブによる腫瘍微小環境における糖質代謝産物およびＰＧＥ２生産のコントロールに起因しうるので、ＣＴ２６腫瘍担持マウスの奏効率の著しい増加をもたらすであろう。そのうえ、抗ＰＤ−１抗体と組み合わされたエンチノスタットまたはチダミド＋メトホルミン＋セレコキシブの群の生存率は、約６０〜８０％まで増加する。しかし、チダミド／エンチノスタットが存在しない場合、生存率は減少する（図３Ｄの、抗ＰＤ−１抗体と組み合わされたメトホルミン＋セレコキシブの群を参照されたい）。生存率に関して、セレコキシブはメトホルミンと比較して増加した生存率を呈する（図３Ｄ）。本発明者らは、抗癌活性の増強に関して、抗ＰＤ−１抗体と組み合わされたクラスＩ ＨＤＡＣ阻害剤の効果を補強する上で、セレコキシブ単独またはメトホルミンと組み合わされたセレコキシブが重要な因子であることを見いだした。免疫チェックポイント阻害剤と組み合わされたクラスＩ ＨＤＡＣ阻害剤＋メトホルミン＋セレコキシブの組み合わせは、腫瘍担持マウスモデルにおいて癌を治癒させるその能力において有望である。

次に、チダミドの至適応答用量を決定した。図４Ａに示すとおり、固定用量の抗ＰＤ−１抗体（１０ｍｇ／ｋｇ）、さまざまな用量のチダミド（１２．５、２５．０および５０ｍｇ／ｋｇ）、さまざまな用量のセレコキシブ（２５および５０ｍｇ／ｋｇ）およびさまざまな用量のメトホルミン（１００および２００ｍｇ／ｋｇ）による異なる治療レジメンでの処置を、ＣＴ２６腫瘍細胞担持マウスにおいて行った。これらの処置群のすべてのマウスにおいて、腫瘍成長は、抗ＰＤ−１群または媒体群（抗ＩｇＧ群）との比較で、有意に阻害される。図４Ｂに示すとおり、腫瘍成長はすべての処置群において阻害される。抗ＰＤ−１抗体と組み合わされたチダミドの群は、抗ＰＤ−１抗体単独による処置よりも強力な阻害を示す。さらにまた、抗ＰＤ−１抗体と組み合わされたチダミド（１２．５ｍｇ／ｋｇ）＋セレコキシブ（２５ｍｇ／ｋｇ）およびメトホルミン（１００ｍｇ／ｋｇ）のレジメンは、約３３％のＰＲ比率を達成し（２匹のマウスがＰＲを達成した）、腫瘍成長の抑制において、抗ＰＤ−１抗体と組み合わされたチダミド（１２．５ｍｇ／ｋｇ）よりも活性である。しかし、抗ＰＤ−１抗体と組み合わされたチダミド（１２．５ｍｇ／ｋｇ）の群では、ＰＲは見られなかった。これらの結果は、免疫チェックポイント阻害剤による処置における奏効率を強化するために、セレコキシブおよびメトホルミンが重要な役割を果たすことを示唆している。ＣＴ２６腫瘍担持マウスの奏効率を分析するために、さまざまな用量のチダミドを、類似するレジメンで試験した。結果は、腫瘍成長の阻害において、チダミドにとっては５０ｍｇ／ｋｇ用量という用量が最適であり、抗ＰＤ−１抗体と組み合わされたチダミド（５０ｍｇ／ｋｇ）＋セレコキシブ（２５ｍｇ／ｋｇ）およびメトホルミン（１００ｍｇ／ｋｇ）という処置レジメンの群では、ＰＲ（約５０％）およびＳＤ（約３３％）の比率が高いことを示している。この結果は、チダミドが治療効果をあげるのに重要な因子であることを示唆している。次に、セレコキシブの至適用量を決定した。結果は、処置群の各マウスにおける腫瘍成長を抑制するには、用量５０ｍｇ／ｋｇのセレコキシブの方が２５ｍｇ／ｋｇより活性であることを示している（図４Ｂ）。しかし免疫チェックポイント阻害剤は奏効率が非常に低い。本発明者らは、驚いたことに、５０ｍｇ／ｋｇのセレコキシブは免疫治療における奏効率を増加させうることを見いだした。さらにまた、メトホルミンの至適用量を決定した。メトホルミンは、用量１００または２００ｍｇ／ｋｇのレジメンでは、抗癌活性に相違がないことがわかった（図４Ｂ）。これらのデータは、チダミドおよびセレコキシブが、免疫チェックポイント阻害剤と組み合わせたメトホルミンより重要であることを示唆している。図４Ｃに示すとおり、どの処置群のどのマウスにも体重減少はなかった。図４Ｄは、処置群におけるマウスの生存率を示している。これらのデータは、抗ＰＤ−１抗体（１０ｍｇ／ｋｇ）と組み合わされたチダミド（５０ｍｇ／ｋｇ）＋セレコキシブ（２５ｍｇ／ｋｇ）およびメトホルミン（１００ｍｇ／ｋｇ）のレジメンが最善の組み合わせであって、これが、強力な腫瘍成長抑制能力を有し、生存率を約５０％まで上昇させることを示唆している。他の群の生存率も、抗ＰＤ−１抗体群単独と比較すると増加した。抗ＰＤ−１抗体（１０ｍｇ／ｋｇ）と組み合わされた５０ｍｇ／ｋｇのチダミド＋セレコキシブ２５ｍｇ／ｋｇおよびメトホルミン１００ｍｇ／ｋｇがこのインビボ実験では最適なレジメンであるが、５０ｍｇ／ｋｇのセレコキシブも抗癌活性に、より多くの寄与をすることができ、ＣＴ２６腫瘍細胞担持マウスにおける生存率も増加させうる。

実施例５ 抗ＰＤ−Ｌ１抗体と組み合わされたチダミド＋メトホルミン＋セレコキシブの効果
本発明者らは、抗ＰＤ−１抗体と組み合わされたチダミド＋メトホルミンおよびセレコキシブが、ＣＴ２６担持マウスにおける腫瘍成長に有意な阻害を持つことを実証した（図４参照）。図５Ａに示すとおり、抗ＰＤ−Ｌ１抗体（１０ｍｇ／ｋｇ）と組み合わされたチダミド（５０ｍｇ／ｋｇ）＋メトホルミン（１００ｍｇ／ｋｇ）およびセレコキシブ（５０ｍｇ／ｋｇ）をＣＴ２６担持マウスに投与した。チダミド、メトホルミンおよびセレコキシブは毎日投与した。しかし抗ＰＤ−Ｌ１抗体は３日ごとにｉ．ｐ．投与した。本発明者らのデータは、チダミド＋メトホルミンおよびセレコキシブが、ＣＴ２６担持マウスにおいて、腫瘍成長の阻害に関して強力であることを示している（図５Ａ参照）。本発明者らは、驚いたことに、チダミド＋メトホルミンおよびセレコキシブは、抗ＰＤ−Ｌ１抗体が存在しなくても、ＣＴ２６担持マウスにおける腫瘍成長を有意に阻害することを見いだした（図５Ａ）。抗ＰＤ−Ｌ１（１０ｍｇ／ｋｇ）単独による処置は、腫瘍成長をわずかに阻害する（図５Ａ）。これらの結果から、チダミド＋メトホルミンおよびセレコキシブは強力な腫瘍成長阻害能を持つことが示される。図５Ｂは、チダミド＋メトホルミンおよびセレコキシブ群ならびに抗ＰＤ−Ｌ１抗体と組み合わされたチダミド＋メトホルミンおよびセレコキシブの群が腫瘍成長を有意に阻害し、高率のＰＲを有することを示している。図５Ｃに示すとおり、どの処置レジメンも体重減少を引き起こさなかった。図５Ｄに示すとおり、メトホルミンおよびセレコキシブと組み合わされたチダミドは、生存率を約８０％まで有意に増加させる。この結果は、メトホルミンおよびセレコキシブと組み合わされたチダミドが、腫瘍微小環境のコントロールおよび免疫治療のトリガリングにおいて、非常に有効であることを示している。そのうえ、抗ＰＤ−Ｌ１抗体と組み合わされたチダミド＋メトホルミンおよびセレコキシブは、さらに強力に腫瘍成長を阻害して、５３日目に１００％の生存率を達成する。５３日目に、これら２つのレジメンの間で、生存率は類似していた。結果は、メトホルミンおよびセレコキシブと組み合わされたチダミドが強力な腫瘍成長阻害活性を持つことを示している。抗ＰＤ−Ｌ１抗体との組み合わせは、腫瘍成長の阻害および生存率を増加させた（図５Ｄ）。

実施例６ ＪＣ担持マウスにおける、抗ＰＤ−１抗体と組み合わされたチダミド＋メトホルミン＋セレコキシブの効果
ＪＣ細胞株をマウス乳腺の悪性新生物から得た。本発明者らは、ＪＣ担持マウスにおいて何らかの腫瘍阻害を見いだしうるかどうかを評価することに関心を持った。図６に示すとおり、ＪＣ細胞はマウスではＣＴ２６細胞より成長が遅かった。したがって、ＪＣ担持マウスにおける腫瘍サイズは、２０日目に約３００〜４００ｍｍ^３まで成長した。チダミド＋メトホルミンおよびセレコキシブは、ＪＣ担持マウスにおける腫瘍成長を有意に阻害する（図６Ａ）。しかし、抗ＰＤ−１抗体と組み合わされたチダミド＋メトホルミンおよびセレコキシブは、ＪＣ担持マウスにおける腫瘍成長の阻害において、より一層有効であった（図６Ａ）。このレジメンは、ＣＴ２６担持マウスでもＪＣ担持マウスでも、腫瘍成長を有意に阻害する。本発明者らは、メトホルミン＋セレコキシブと組み合わされたチダミドが、正常免疫腫瘍担持マウス中の腫瘍の阻害において強力な免疫治療活性を持つことを初めて見いだした。そのうえ、図６Ｂに示すとおり、抗ＰＤ−１抗体はわずかな抗癌活性を有するに過ぎず、ＳＤは１匹のマウスにしか観察されなかった。チダミド＋メトホルミンおよびセレコキシブレジメンは腫瘍成長を強力に阻害するが、その阻害効果は抗ＰＤ−１抗体と組み合わされたチダミド＋メトホルミンおよびセレコキシブのレジメンより低かった。チダミド＋メトホルミンおよびセレコキシブ群では、３匹のマウスがＰＲを達成し、４匹のマウスにＳＤが観察された。しかし、抗ＰＤ−１抗体と組み合わされたチダミド＋メトホルミンおよびセレコキシブの群では、５匹のマウスがＰＲであり、１匹のマウスがＳＤであった。上記のことから、チダミド＋メトホルミンおよびセレコキシブレジメンは強力な抗腫瘍成長を持つ。抗ＰＤ−１抗体または抗ＰＤ−Ｌ１抗体と組み合わせると、ＣＴ２６担持マウスモデルまたはＪＣ担持マウスモデルにおける腫瘍成長の阻害は増加する（図５Ｂおよび図６Ｂ）。図６Ｃに示すとおり、処置群のどのマウスにも体重減少はなかった。図６Ｄに示すとおり、ＪＣ担持腫瘍マウスモデルにおいて、メトホルミンおよびセレコキシブと組み合わされたチダミドは、抗ＰＤ−１抗体群と比較して、生存率を約２８％まで有意に増加させる。結果は、チダミド＋メトホルミンおよびセレコキシブレジメンが癌に対して良い組み合わせであることを証明している。このレジメンは腫瘍微小環境をコントロールし、免疫治療を強化することができる。さらにまた、抗ＰＤ−１抗体と組み合わされたチダミド＋メトホルミンおよびセレコキシブは、より強力に腫瘍成長を阻害し、生存率を８３％前後まで増加させる。３５日目に処置を停止した後は、ＣＴ２６担持腫瘍マウスおよびＪＣ担持腫瘍マウスにおける腫瘍が、ＩｇＧ対照群では、より早く成長した。しかし、免疫チェックポイント阻害剤と組み合わされたチダミド＋メトホルミンおよびセレコキシブのレジメンは、腫瘍成長の阻害において非常に強力であり、したがって生存率を有意に増加させた（図６Ｄ）。

実施例７ ＣＴ２６担持マウスにおける、抗ＰＤ−Ｌ１抗体（低用量または高用量）と組み合わされた、または抗ＰＤ−Ｌ１抗体なしの、チダミド＋メトホルミンおよびセレコキシブの効果
本発明者らは、抗ＰＤ−Ｌ１抗体免疫チェックポイント阻害剤の投薬量を低減してもなお、ＣＴ２６担持マウスにおける腫瘍阻害を行えるかどうかを評価することに関心を持った。図７に示すとおり、ＣＴ２６担持マウス中の腫瘍サイズは、１５日目に約２５０〜３００ｍｍ^３まで成長した。ＰＤ−Ｌ１（２．５または１０ｍｇ／ｋｇ）と組み合わされたチダミド５０ｍｇ／ｋｇ＋メトホルミン１００ｍｇ／ｋｇおよびセレコキシブ５０ｍｇ／ｋｇは、ＣＴ２６担持マウスにおける腫瘍成長を有意に阻害する（図７Ａ）。２．５ｍｇ／ｋｇ抗ＰＤ−Ｌ１抗体群と１０ｍｇ／ｋｇ抗ＰＤ−Ｌ１抗体群との間でＣＴ２６担持マウスにおける抗腫瘍成長の阻害に有意差はない。一方、抗ＰＤ−Ｌ１抗体（２．５または１０ｍｇ／ｋｇ）と組み合わされた６．２５ｍｇ／ｋｇの低投薬量または５０ｍｇ／ｋｇの高投薬量のチダミド＋メトホルミン１００ｍｇ／ｋｇおよびセレコキシブ５０ｍｇ／ｋｇは、ＣＴ２６担持マウスにおける腫瘍成長を有意に阻害する（図７Ａ）。チダミド群は、６．２５および５０ｍｇ／ｋｇという２つの投薬量で、低投薬量または高投薬量の抗ＰＤ−Ｌ１抗体（２．５または１０ｍｇ／ｋｇ）の存在とは無関係に、ＣＴ２６担持マウスにおける腫瘍成長の阻害に統計的有意差を示さなかった。しかし、図７Ｂに示すとおり、６．２５、１２．５および５０ｍｇ／ｋｇというさまざまな用量のチダミド＋メトホルミン１００ｍｇ／ｋｇならびにセレコキシブ５０ｍｇ／ｋｇは、抗ＰＤ−Ｌ１抗体の非存在下でも、顕著に、腫瘍成長の阻害活性を持っている。結果は、チダミド５０ｍｇ／ｋｇ＋メトホルミン１００ｍｇ／ｋｇおよびセレコキシブ５０ｍｇ／ｋｇ群が、ＩｇＧ媒体群と比較して、ＣＴ２６担持マウスにおける腫瘍成長を有意に阻害することを実証した（図７Ｂ）。この結果は、セレコキシブ５０ｍｇ／ｋｇ＋メトホルミン１００ｍｇ／ｋｇと組み合わされたさまざまな用量のチダミドが、ユニークな免疫調節活性を持ち、それが腫瘍微小環境に顕著な影響を及ぼして、腫瘍細胞を攻撃し最終的には腫瘍成長の阻害を引き起こすように、細胞傷害性Ｔリンパ球を再活性化しうることも実証した（図７Ｂ）。さらにまた、異なる治療モダリティで処置された全マウスの結果を図７Ｃに示す。２．５ｍｇ／ｋｇの抗ＰＤ−Ｌ１抗体による処置は、腫瘍細胞を殺すように細胞傷害性Ｔリンパ球を再活性化できるほどには強力でないことが実証された。チダミド＋セレコキシブおよびメトホルミン群の場合、結果は、腫瘍細胞を殺すように細胞傷害性Ｔリンパ球を再活性化するには、高用量（５０ｍｇ／ｋｇ）のチダミドが必要であることを実証した。チダミド＋セレコキシブおよびメトホルミンと組み合わされた高用量（１０ｍｇ／ｋｇ）または低用量（２．５ｍｇ／ｋｇ）の抗ＰＤ−Ｌ１抗体は、腫瘍成長を有意に阻害した。チダミド５０ｍｇ／ｋｇ＋セレコキシブ５０ｍｇ／ｋｇおよびメトホルミン１００ｍｇ／ｋｇと組み合わされた抗ＰＤ−Ｌ１抗体（２．５ｍｇ／ｋｇ）による処置は、図７Ｃにおいて最も強力な抗癌活性を有することが示された。低用量（２．５ｍｇ／ｋｇ）と高用量（１０ｍｇ／ｋｇ）の抗ＰＤ−Ｌ１抗体処置の間で、抗癌活性に有意差はない。これらの結果は、ＣＴ２６担持マウスモデルにおける強力な抗腫瘍能力には、チダミド＋セレコキシブおよびメトホルミンとの組み合わせで、抗ＰＤ−Ｌ１抗体が必要であることを示唆した。図７Ｄに示すとおり、処置群のどのマウスにも体重減少はなかった。生存率の結果を図７Ｅに示す。第１に、メトホルミン１００ｍｇ／ｋｇおよびセレコキシブ５０ｍｇ／ｋｇと組み合わされたチダミド５０ｍｇ／ｋｇによる処置は、抗ＰＤ−Ｌ１抗体単独による処置と比較して、生存率を約２０％まで有意に増加させる。結果は、チダミド＋メトホルミンおよびセレコキシブレジメンが良い組み合わせであって免疫調節活性を持つことを証明している。このレジメンは腫瘍微小環境をコントロールし、治療有効性を強化することができる。第２に、抗ＰＤ−Ｌ１抗体２．５ｍｇ／ｋｇと組み合わされたチダミド５０ｍｇ／ｋｇ＋メトホルミン１００ｍｇ／ｋｇおよびセレコキシブ５０ｍｇ／ｋｇによる処置は、より強力に腫瘍成長を阻害し、生存率を７５％前後まで増加させる。類似する結果が、抗ＰＤ−Ｌ１抗体１０ｍｇ／ｋｇと組み合わされたチダミド５０ｍｇ／ｋｇ＋メトホルミン１００ｍｇ／ｋｇおよびセレコキシブ５０ｍｇ／ｋｇによる処置でも示された（生存率８０％前後）。第３に、抗ＰＤ−Ｌ１ １０ｍｇ／ｋｇ抗体と組み合わされたチダミド６．２５ｍｇ／ｋｇ＋メトホルミン１００ｍｇ／ｋｇおよびセレコキシブ５０ｍｇ／ｋｇは、腫瘍成長を著しく阻害し、生存率を４０％前後まで増加させる。しかし、抗ＰＤ−Ｌ１ ２．５ｍｇ／ｋｇ抗体と組み合わされたチダミド６．２５ｍｇ／ｋｇ＋メトホルミン１００ｍｇ／ｋｇおよびセレコキシブ５０ｍｇ／ｋｇは、より強力に腫瘍成長を阻害し、生存率をほぼ１００％まで増加させる。３０日目に処置を停止した後、ＩｇＧ対照群では、ＣＴ２６担持腫瘍マウスにおける腫瘍の成長が速くなった。しかし、抗ＰＤ−Ｌ１ Ａｂ（２．５または１０ｍｇ／ｋｇ）と組み合わされたチダミド５０ｍｇ／ｋｇ＋メトホルミン１００ｍｇ／ｋｇおよびセレコキシブ５０ｍｇ／ｋｇのレジメンは、腫瘍成長の阻害において非常に強力であり、したがって、図７Ｅに示すとおり、セレコキシブ５０ｍｇ／ｋｇ＋メトホルミン１００ｍｇ／ｋｇと組み合わされたチダミド５０ｍｇ／ｋｇのレジメンと比較して、生存率を有意に増加させた。

実施例８ ＣＴ２６担持マウスにおける、メトホルミンありまたはメトホルミンなしでチダミド＋セレコキシブと組み合わせた抗ＰＤ−１ Ａｂおよび抗ＰＤ−Ｌ１ Ａｂの効果の直接比較
次に本発明者らは、ＣＴ２６担持マウスにおける、メトホルミンと組み合わされた、またはメトホルミンなしの、チダミド＋セレコキシブと組み合わせた抗ＰＤ−１抗体または抗ＰＤ−Ｌ１抗体の治療効果を評価することに関心を持った。図８に示すとおり、ＣＴ２６担持マウス中の腫瘍サイズは、１０日目に約２００〜２５０ｍｍ^３まで成長した。第１に、メトホルミンなしのチダミド５０ｍｇ／ｋｇ＋セレコキシブ５０ｍｇ／ｋｇの組み合わせは、ＩｇＧ群と比較してＣＴ２６担持マウスにおける腫瘍成長を有意に阻害した（図８Ａ）。第２に、抗ＰＤ−１抗体２．５ｍｇ／ｋｇと組み合わされたチダミド５０ｍｇ／ｋｇ＋セレコキシブ５０ｍｇ／ｋｇは、ＣＴ２６担持マウスにおける腫瘍成長の阻害において、より一層有効である（図８Ａ）。第３に、抗ＰＤ−Ｌ１抗体２．５ｍｇ／ｋｇ処置と組み合わされたチダミド５０ｍｇ／ｋｇ＋セレコキシブ５０ｍｇ／ｋｇでも、類似する結果が見いだされた。図８Ａおよび８Ｂは、セレコキシブ５０ｍｇ／ｋｇと組み合わされたチダミド５０ｍｇ／ｋｇが、腫瘍微小環境に影響を及ぼし、腫瘍を殺すように細胞傷害性Ｔリンパ球を再活性化するのに十分であったことを示している。一方、チダミド５０ｍｇ／ｋｇ＋セレコキシブ５０ｍｇ／ｋｇと組み合わせた低用量（２．５ｍｇ／ｋｇ）の抗ＰＤ−１抗体および抗ＰＤ−Ｌ１抗体の抗癌効果の直接比較は、図８Ａおよび図８Ｂに示すとおり、ＣＴ２６担持マウスにおける腫瘍阻害の効力を示した。直接研究からのこれらの結果は、チダミド＋セレコキシブとの併用処置において、ＣＴ２６担持マウスモデルにおける強力な抗腫瘍能力には、免疫チェックポイント阻害剤抗ＰＤ−１抗体または抗ＰＤ−Ｌ１抗体が必要であることを示唆した。この知見は、図８Ａおよび図８Ｂに示すとおり、腫瘍微小環境における細胞傷害性Ｔリンパ球を強力に再活性化して腫瘍成長を阻害するためにチダミド５０ｍｇ／ｋｇ＋セレコキシブ５０ｍｇ／ｋｇと組み合わせた場合、抗ＰＤ−１抗体または抗ＰＤ−Ｌ１抗体の投薬量は、推奨量である１０ｍｇ／ｋｇの１／４（２．５ｍｇ／ｋｇ）低減できることも実証された。この研究はチダミド＋セレコキシブと組み合わされた抗ＰＤ−１抗体または抗ＰＤ−Ｌ１抗体のレジメンが、強力な抗腫瘍活性の遂行に十分であったことを証明した。これらの結果から、腫瘍微小環境における免疫の制御にメトホルミンが果たしうる役割は大きくはないと結論することができる。最適なレジメンは、抗ＰＤ−１抗体または抗ＰＤ−Ｌ１抗体などの免疫チェックポイント阻害剤と組み合わされたチダミド＋セレコキシブである。すべてのマウスにおけるさまざまな治療モダリティの抗癌効果を図８Ｃに示す。抗ＰＤ−１抗体単独による処置には、わずか抗癌活性しかなく、ＰＲを達成したマウスは３匹だけだった（奏効率３７．５％）。チダミド＋セレコキシブレジメンは、より良い抗腫瘍活性を示し、５匹のマウスがＰＲを達成したが（奏効率５５．５％）、これは、抗ＰＤ−１抗体と組み合わされたメトホルミン１００ｍｇ／ｋｇありまたはなしのチダミド５０ｍｇ／ｋｇ＋セレコキシブ５０ｍｇ／ｋｇのレジメンよりも、低い阻害効果を示した。抗ＰＤ−１抗体と組み合わされたチダミド＋セレコキシブの群では、８匹のマウスがＰＲを達成した（奏効率８８％）。抗ＰＤ−Ｌ１抗体群において、これはわずかな抗癌活性を示し、ＰＲを達成したマウスは４匹だけだった（奏効率５０％）。抗ＰＤ−Ｌ１抗体２．５ｍｇ／ｋｇと組み合わされたチダミド５０ｍｇ／ｋｇ＋メトホルミン１００ｍｇ／ｋｇおよびセレコキシブ５０ｍｇ／ｋｇの群では、９匹のマウスがＰＲを達成した（奏効率１００％）。抗ＰＤ−Ｌ１抗体２．５ｍｇ／ｋｇと組み合わされたチダミド５０ｍｇ／ｋｇ＋セレコキシブ５０ｍｇ／ｋｇの群では、８匹のマウスがＰＲを達成した（奏効率８８％）。上記のことから、チダミド＋セレコキシブレジメンも強力な抗腫瘍効果を持つ。チダミド＋セレコキシブを抗ＰＤ−１抗体または抗ＰＤ−Ｌ１抗体と組み合わせたところ、ＣＴ２６担持マウスモデルにおける腫瘍成長の阻害が有意に増加した（図８Ｃ）。図８Ｄに示すとおり、処置群のどのマウスにも体重減少はなかった。図８Ｅに示すとおり、セレコキシブと組み合わされたチダミドの群は、ＣＴ２６担持腫瘍マウスモデルにおいて、抗ＩｇＧ群と比較して、生存率を約５５．５％まで有意に増加させた。また、この生存率は、抗ＰＤ−１群の生存率（３７．５％）または抗ＰＤ−Ｌ１群の生存率（５０％）よりも良かった。結果は、チダミド＋セレコキシブレジメンが、癌に対して中等度の組み合わせであることを証明した。このレジメンは、ある程度は、腫瘍微小環境をコントロールし制御することができ、免疫治療を強化することができる。さらにまた、抗ＰＤ−１抗体と組み合わされたチダミド＋メトホルミンおよびセレコキシブは、腫瘍成長を強力に阻害し、生存率を８０％前後まで増加させた。抗ＰＤ−１抗体と組み合わされたチダミド＋セレコキシブの群は強力に腫瘍成長を阻害し、生存率を８８％前後まで増加させるという、類似する結果が示された。抗ＰＤ−Ｌ１抗体と組み合わされたチダミド＋メトホルミンおよびセレコキシブの群は、腫瘍成長を強力に阻害し、生存率をほぼ１００％まで増加させた。抗ＰＤ−Ｌ１抗体と組み合わされたチダミド＋セレコキシブの群は強力に腫瘍成長を阻害し、生存率を８８％前後まで増加させるという、類似する結果が示された。２６日目に処置を停止した後、ＩｇＧ対照群では、ＣＴ２６担持腫瘍マウスにおける腫瘍の成長が速くなった。しかし、免疫チェックポイント阻害剤レジメンの存在下でメトホルミンと組み合わされたまたはメトホルミンなしのチダミド＋セレコキシブは、腫瘍成長の阻害において非常に強力であり、したがって生存率を有意に増加させた（図８Ｅ）。この研究から、腫瘍微小環境に影響を及ぼし免疫治療を強化するためにメトホルミンが果たしうる役割は大きくはないことが実証された。この研究は、抗癌免疫応答を強化するには、免疫チェックポイント阻害剤と組み合わされたチダミド＋セレコキシブで十分であることも証明した。一方、チダミド＋セレコキシブと組み合わされた場合の抗ＰＤ−１抗体と抗ＰＤ−Ｌ１抗体との直接比較は、抗ＰＤ−Ｌ１抗体との併用レジメンの抗癌活性が、抗ＰＤ−１抗体との併用レジメンの抗癌活性より良いことを実証した。

実施例９ ＣＴ２６担持マウスにおける、抗ＰＤ−１抗体と組み合わされたチダミド＋セレコキシブの至適処置用量の確認
本発明者らは、ＣＴ２６担持マウスにおける腫瘍阻害にとって、抗ＰＤ−１抗体と組み合わされたチダミドおよびセレコキシブのどの投薬量比が最適であるかを評価することに関心を持った。図９に示すとおり、ＣＴ２６担持マウス中の腫瘍サイズは、１５日目に約４００〜５００ｍｍ^３まで成長した。チダミド（１２．５ｍｇ／ｋｇ）＋セレコキシブ（１２．５、２５または５０ｍｇ／ｋｇ）と抗ＰＤ−１抗体（２．５ｍｇ／ｋｇ）との組み合わせは、ＣＴ２６担持マウスにおける腫瘍成長を有意に阻害した（図９Ａ）。セレコキシブが２５ｍｇ／ｋｇである処置群だけは抗癌活性が弱かった。次に、チダミド（２５ｍｇ／ｋｇ）＋セレコキシブ（１２．５、２５または５０ｍｇ／ｋｇ）および抗ＰＤ−１抗体（２．５ｍｇ／ｋｇ）の処置群は、ＣＴ２６担持マウスにおける腫瘍成長の有意な阻害を示した（図９Ｂ）。チダミド（５０ｍｇ／ｋｇ）＋セレコキシブ（１２．５、２５または５０ｍｇ／ｋｇ）と抗ＰＤ−１抗体（２．５ｍｇ／ｋｇ）との組み合わせは、ＣＴ２６担持マウスにおける腫瘍成長の有意な阻害を示した（図９Ｃ）。このデータも、抗ＰＤ−１抗体と組み合わされたチダミド５０ｍｇ／ｋｇ＋セレコキシブ５０ｍｇ／ｋｇが、ＣＴ２６担持マウスにおける腫瘍成長の阻害において、より一層有効であることを証明した（図９Ｃ）。これらの結果は、免疫チェックポイント阻害剤である抗ＰＤ−１抗体と組み合わされたチダミド５０ｍｇ／ｋｇ＋セレコキシブ５０ｍｇ／ｋｇが、ＣＴ２６担持マウスモデルにおいて、強い抗腫瘍能力を発揮することを示唆した。一方、これらの結果は、チダミド／セレコキシブ投薬量比が重要であることも実証した。すべてのマウスにおけるさまざまな治療モダリティの抗癌効果を図９Ｄに示す。抗ＰＤ−１抗体と組み合わされたチダミド１２．５ｍｇ／ｋｇ＋さまざまな用量のセレコキシブ（１２．５、２５または５０ｍｇ／ｋｇ）による処置は、わずかな抗癌活性しか示さず、ＰＲを達成したマウスは１匹または２匹に過ぎなかった（奏効率２５〜４０％）。抗ＰＤ−１抗体と組み合わされたチダミド２５ｍｇ／ｋｇ＋さまざまな用量のセレコキシブ（１２．５、２５または５０ｍｇ／ｋｇ）による処置は、わずかな抗癌活性しか示さず、ＰＲを達成したマウスは１匹または２匹に過ぎなかった（奏効率２０〜４０％）。抗ＰＤ−１抗体と組み合わされたチダミド５０ｍｇ／ｋｇ＋セレコキシブ５０ｍｇ／ｋｇによる処置は、強力な抗腫瘍活性を示し、３匹のマウスがＰＲを達成した（奏効率７５％）。図９Ｅに示すとおり、処置群のどのマウスにも体重減少はなかった。図９Ｆに示すとおり、ＣＴ２６担持腫瘍マウスモデルにおいて、抗ＰＤ−１抗体と組み合わされた低投薬量のチダミド（１２．５ｍｇ／ｋｇ）＋投薬量５０ｍｇ／ｋｇのセレコキシブは、抗ＩｇＧ抗体対照群と比較して、生存率を約４０％まで増加させた。結果は、チダミド１２．５ｍｇ／ｋｇ＋高投薬量のセレコキシブ（５０ｍｇ／ｋｇ）レジメンが、より良い抗癌効果を有することを実証した。さらにまた、図９Ｇに示すとおり、抗ＰＤ−１抗体と組み合わされた中間投薬量のチダミド（２５ｍｇ／ｋｇ）＋１２．５〜５０ｍｇ／ｋｇの投薬量のセレコキシブでは、生存率に改善がなかった。最後に、図９Ｈに示すとおり、抗ＰＤ−１抗体と組み合わされた高投薬量のチダミド（５０ｍｇ／ｋｇ）＋高投薬量のセレコキシブ（５０ｍｇ／ｋｇ）は、腫瘍成長の強力な阻害を示し、生存率を５８日目で５０％前後まで増加させた。３０日目に処置を停止した後、ＩｇＧ対照群では、ＣＴ２６担持腫瘍マウスにおける腫瘍の成長が速くなった。この研究では、腫瘍サイズが約４００〜５００ｍｍ^３に達したときに処置を開始した。これは、すべての処置群において、奏効率および生存率の低下をもたらすだろう。しかし、抗ＰＤ−１Ａｂと組み合わされたチダミド５０ｍｇ／ｋｇ＋セレコキシブ５０ｍｇ／ｋｇのレジメンは、腫瘍成長の阻害において依然として極めて強力であり、よって生存率を有意に増加させた（図９Ｆ〜Ｈ）。

実施例１０ ＣＴ２６担持マウスにおける抗ＰＤ−１抗体または抗ＣＴＬＡ−４抗体と組み合わされたＨＤＡＣ阻害剤＋ＣＯＸ−２阻害剤の抗癌機序の解明
次に、本発明者らは、免疫チェックポイント阻害抗体の存在下で、他のＨＤＡＣ阻害剤およびＣＯＸ−２阻害剤でも、ＣＴ２６担持マウスにおける腫瘍阻害を行えるかどうかを評価することに関心を持った。図１０に示すとおり、ＣＴ２６担持マウス中の腫瘍サイズは１０日目に約２５０〜３００ｍｍ^３まで成長した。まず、ＣＴ２６担持マウスにおいて、抗ＰＤ−１ Ａｂと組み合わされた異なるＣＯＸ−２阻害剤＋チダミドを行った。チダミド＋セレコキシブ（選択的ＣＯＸ−２阻害剤、５０ｍｇ／ｋｇ）、アスピリン（非選択的ＣＯＸ−２阻害剤、５０ｍｇ／ｋｇ）またはイブプロフェン（非選択的ＣＯＸ−２阻害剤、５０ｍｇ／ｋｇ）の組み合わせは、抗ＰＤ−１抗体の存在下で、ＣＴ２６担持マウスにおける腫瘍成長の有意な阻害を示した（図１０Ａ）。しかし、抗ＰＤ−１ Ａｂ２．５ｍｇ／ｋｇと組み合わされた、または抗ＰＤ−１ Ａｂなしの、チダミド５０ｍｇ／ｋｇ＋セレコキシブ５０ｍｇ／ｋｇは、ＣＴ２６担持マウスにおける腫瘍成長の阻害において、他の群と比較して、より一層有効であった（図１０Ａ）。驚いたことに、セレコキシブ５０ｍｇ／ｋｇと組み合わされたチダミド５０ｍｇ／ｋｇの群は、図１０Ａに示すとおり、腫瘍成長を著しく有意に阻害した。同じ投薬量のＣＯＸ−２阻害剤では、抗癌活性は（強いものから弱いものへ順に）次のとおりである：セレコキシブ＞アスピリン＞イブプロフェン。次に本発明者らは、チダミド、エンチノスタットおよびモセチノスタットなどの異なるＨＤＡＣ阻害剤を、セレコキシブおよび抗ＰＤ−１抗体と組み合わせて評価した。抗ＰＤ−１抗体と組み合わされたエンチノスタット＋セレコキシブのレジメンは、図３Ｂに示すとおり、強力な抗癌活性を有することが示されている。この研究において、本発明者らは、抗ＰＤ−１抗体２．５ｍｇ／ｋｇと組み合わされたモセチノスタット（クラスＩ ＨＤＡＣ阻害剤、３０ｍｇ／ｋｇ）＋セレコキシブ５０ｍｇ／ｋｇを、その抗癌活性の効力について評価した。抗ＰＤ−１抗体と組み合わせたチダミド＋セレコキシブとモセチノスタット＋セレコキシブとの間に有意差はなかった（図１０Ｂ）。さらにまた本発明者らは、免疫チェックポイント阻害剤である抗ＣＴＬＡ−４抗体との組み合わせが、ＣＴ２６担持マウスにおいて腫瘍阻害を行うことも明らかにした。結果は、抗ＰＤ−１抗体または抗ＣＴＬＡ−４抗体と組み合わされたチダミド＋セレコキシブが、ＣＴ２６担持マウスにおける腫瘍成長を有意に阻害することを示した（図１０Ｃ）。チダミドおよびセレコキシブとの組み合わせで、抗ＰＤ−１抗体による処置と抗ＣＴＬＡ−４抗体による処置との間に有意差はなかった。これらの結果は、免疫チェックポイント阻害剤と組み合わされたＨＤＡＣ阻害剤＋ＣＯＸ−２阻害剤が、ＣＴ２６担持マウスモデルにおいて強い抗腫瘍能力を発揮することを示唆した。さまざまな治療モダリティで処置された全マウスの治療応答を図１０Ｄに示した。抗ＰＤ−１抗体（２．５ｍｇ／ｋｇ）単独で処置された群はわずかな抗癌活性しか有さず、ＰＲを達成したマウスは２匹だけだった（奏効率２５％）。チダミド５０ｍｇ／ｋｇ＋セレコキシブ５０ｍｇ／ｋｇレジメンによる処置は、強力な腫瘍成長阻害を示し、６匹のマウスがＰＲを達成した（奏効率７５％）。しかしこれは、７匹のマウスがＰＲ（奏効率８８％）を達成した抗ＰＤ−１抗体と組み合わされたチダミド＋セレコキシブのレジメンほど、強力ではなかった。一方、本発明者らは、アスピリン５０ｍｇ／ｋｇおよびイブプロフェン５０ｍｇ／ｋｇとの組み合わせを、それらの抗癌活性の効力について評価した。抗ＰＤ−１抗体と組み合わされたチダミド＋アスピリンまたはイブプロフェンによる処置は、セレコキシブ含有処置の抗癌活性と比較して低い抗癌活性を示し、ＰＲを達成したマウスは４匹および３匹だけだった（奏効率はそれぞれ５０％、３８％）。セレコキシブがアスピリンおよびイブプロフェンよりも強力に腫瘍成長を阻害することは明らかなようである。次に、チダミドとモセチノスタットの抗癌活性の比較を決定した。ＰＤ−１抗体２．５ｍｇ／ｋｇと組み合わされたモセチノスタット３０ｍｇ／ｋｇまたはチダミド５０ｍｇ／ｋｇ＋セレコキシブ５０ｍｇ／ｋｇで処置された群では、７匹のマウスがＰＲを達成した（奏効率８８％）。この結果は、チダミド、エンチノスタットおよびモセチノスタットが、類似する抗癌活性を持つことを実証した。これらの化合物はクラスＩ ＨＤＡＣ阻害剤と分類された。次に、本発明者らは、抗ＣＴＬＡ−４抗体が、抗ＰＤ−１抗体または抗ＰＤ−Ｌ１抗体などの他の免疫チェックポイント阻害剤のように類似する活性を持つかどうかに関心を持った。抗ＣＴＬＡ４抗体２．５ｍｇ／ｋｇまたは抗ＰＤ−１抗体２．５ｍｇ／ｋｇと組み合わされたチダミド５０ｍｇ／ｋｇ＋セレコキシブ５０ｍｇ／ｋｇで処置した群では、７匹のマウスがＰＲを達成した（奏効率８８％）。上記のことから、ＨＤＡＣ阻害剤（チダミド、エンチノスタット、モセチノスタット）＋セレコキシブレジメンは、強力な抗腫瘍成長活性を持つ。また、抗ＰＤ−１抗体または抗ＣＴＬＡ−４抗体とさらに組み合わせると、ＣＴ２６担持マウスモデルにおける腫瘍成長の阻害は増加した（図１０Ｄ）。図１０Ｅに示すとおり、処置群のどのマウスにも体重減少はなかった。図１０Ｆに示すとおり、ＣＴ２６担持腫瘍マウスモデルにおいて、抗ＰＤ−１抗体と組み合わされたまたは抗ＰＤ−１抗体なしのチダミド＋セレコキシブは、強力な抗癌活性を持ち、抗ＰＤ−１抗体対照群（約２０％）と比較して生存率を約７５％まで有意に増加させた。結果は、ＨＤＡＣ阻害剤＋ＣＯＸ−２阻害剤レジメンが、特に免疫チェックポイント阻害剤との組み合わせにおいて、癌に対して良い組み合わせであることを証明した。このレジメンは、腫瘍微小環境をコントロールし、免疫治療を強化することができる。この結果は、図１０Ｆに示すとおり、アスピリンまたはイブプロフェンを含むレジメンは抗癌活性を持ち、生存率を増加させるが、セレコキシブを含むレジメンより弱い活性を示すことも実証した。さらにまた、図１０Ｇに示すとおり、抗ＰＤ−１抗体と組み合わされたチダミド＋セレコキシブは、腫瘍成長阻害に関して、モセチノスタットを含むレジメンより強力であり、生存率を増加させた（７５％対６２．５％）。最後に、図１０Ｈに示すとおり、抗ＣＴＬＡ−４抗体と組み合わされたチダミド＋セレコキシブは、腫瘍成長を強力に阻害し、生存率をほぼ１００％まで増加させた。この結果は、抗ＣＴＬＡ−４抗体との併用レジメンが、抗ＰＤ−１抗体（生存率７５％）との併用レジメンよりも強力であって、ＣＴ２６担持腫瘍マウスモデルにおける生存率を増加させることを実証した。２６日目に処置を停止した後、ＩｇＧ対照群では、ＣＴ２６担持腫瘍マウスにおける腫瘍の成長が速くなった。しかし、腫瘍成長の強力な阻害および生存率の増加を、以下の併用レジメンによって達成することができる：チダミド＋アスピリン、イブプロフェンもしくはセレコキシブ、またはさらに免疫チェックポイント阻害剤と組み合わされたもの；免疫チェックポイント阻害剤と組み合わされたモセチノスタット＋セレコキシブのレジメン；チダミド＋セレコキシブと組み合わされた抗ＣＴＬＡ−４抗体（図１０Ｆ〜Ｈ）。総合すると、抗ＰＤ−１抗体、抗ＰＤ−Ｌ１抗体および抗ＣＴＬＡ−４抗体を含む免疫チェックポイント阻害剤は、チダミド＋セレコキシブレジメンとの組み合わせにおいて、腫瘍微小環境における主要構成要素、例えばＴｒｅｇ（制御性Ｔ細胞）、ＭＤＳＣ（骨髄由来抑制細胞）、ＴＡＭ（腫瘍関連マクロファージ）、ＮＫ（ナチュラルキラーＴ細胞）およびＣＴＬ（細胞傷害性Ｔリンパ球）の数または活性に効率よく影響を及ぼすことができる。最後に、これらのレジメンは効率よく免疫治療を強化した。これらの結果は、ＨＤＡＣ阻害剤（とりわけクラスＩ ＨＤＡＣ阻害剤）＋ＣＯＸ−２阻害剤（とりわけ選択的ＣＯＸ−２阻害剤）が、奏効率および生存率において、免疫チェックポイント阻害剤の抗癌活性を効率よく強化するという本発明者らの提案を、さらに証明した。

実施例１１ ＣＴ２６担持マウスにおける、最も良い併用レジメン−抗ＰＤ−１抗体と組み合わされたチダミドとセレコキシブの確認
本発明者らは、免疫チェックポイント阻害剤である抗ＰＤ−１抗体と組み合わされたチダミドおよびセレコキシブのレジメンが、ＣＴ２６担持マウスにおいて強力な腫瘍阻害を行うことを確認するために、各処置群のマウスの数を増やして抗癌効果を評価した。図１１に示すとおり、ＣＴ２６担持マウス中の腫瘍サイズは、９日目に約２５０〜３００ｍｍ^３まで成長した。チダミド＋セレコキシブおよび抗ＰＤ−１抗体の組み合わせは、ＣＴ２６担持マウスにおける腫瘍成長を有意に阻害した（図１１Ａ）。チダミド５０ｍｇ／ｋｇ＋抗ＰＤ−１抗体２．５ｍｇ／ｋｇの組み合わせも、ＣＴ２６担持マウスにおける腫瘍成長を有意に阻害した（図１１Ａ）。チダミド５０ｍｇ／ｋｇ＋セレコキシブ５０ｍｇ／ｋｇの組み合わせでも、類似する結果が示された（図１１Ａ）。しかし、抗ＰＤ−１抗体２．５ｍｇ／ｋｇと組み合わされたチダミド５０ｍｇ／ｋｇ＋セレコキシブ５０ｍｇ／ｋｇは、ＣＴ２６担持マウスにおける腫瘍成長の阻害において、他の群と比較して、より一層有効であった（図１１Ａ）。これらの結果は、免疫チェックポイント阻害剤と組み合わされたチダミド＋セレコキシブが、ＣＴ２６担持マウスモデルにおいて強い抗腫瘍能力を発揮することを示唆した。すべてのマウスにおけるさまざまな治療モダリティの抗癌効果を図１１Ｂに示した。抗ＰＤ−１抗体群にはわずか抗癌活性しかなく、ＰＲを達成したマウスは３匹だけだった（奏効率２５％）。チダミド＋セレコキシブの組み合わせはわずかな抗癌活性を示し、ＰＲを達成したマウスは４匹だけだった（奏効率３３％）。チダミド＋抗ＰＤ−１抗体の組み合わせも抗癌活性の改善を示し、５匹のマウスがＰＲを達成した（奏効率４１％）。チダミド＋セレコキシブおよび抗ＰＤ−１抗体の組み合わせは、最も良い抗癌活性を示し、８匹のマウスがＰＲを達成した（奏効率７２％）。図１１Ｃに示すとおり、処置群のどのマウスにも体重減少はなかった。図１１Ｄに示すとおり、抗ＰＤ−１抗体２．５ｍｇ／ｋｇと組み合わされたチダミド５０ｍｇ／ｋｇまたは抗ＰＤ−１ Ａｂ２．５ｍｇ／ｋｇ単独は、生存率をそれぞれ約３３％および１６％まで増加させた。しかし、抗ＰＤ−１ Ａｂ２．５ｍｇ／ｋｇと組み合わされたチダミド５０ｍｇ／ｋｇ＋セレコキシブ５０ｍｇ／ｋｇのレジメンは、ここでも、ＣＴ２６担持腫瘍マウスモデルにおいて腫瘍成長を効率よく阻害し生存率を約７２％まで増加させる、強力な組み合わせであると証明された。抗ＰＤ−１抗体の非存在下でセレコキシブと組み合わされたチダミドのレジメンは、抗ＩｇＧ対照レジメンと比較して生存率を改善しなかった。セレコキシブが存在しないレジメンは、わずかな生存率の増加しか示さなかった。総合すると、これらのデータは、免疫チェックポイント阻害剤と組み合わされたチダミド＋セレコキシブが、腫瘍成長の阻害において極めて強力で有効な組み合わせであり、よって免疫治療における生存率を有意に増加させることを実証した（図１１Ｄ）。この併用レジメンは腫瘍微小環境における相乗作用機序によるＴ細胞メモリーの改善に重要な役割を果たしうる。

実施例１２ ＣＴ２６担持ヌードマウスを使用することによる、抗ＰＤ−Ｌ１抗体と組み合わされたチダミド＋メトホルミンおよびセレコキシブの抗癌機序の解明
本発明者らは、抗ＰＤ−Ｌ１抗体と組み合わされたチダミド＋メトホルミンおよびセレコキシブが、ＣＴ２６担持マウス（免疫正常状態）において、細胞傷害性Ｔリンパ球を活性化することによって腫瘍阻害を行うのかどうかを評価することに関心を持った。そこで本発明者らは、免疫不全無胸腺ヌードマウス（細胞傷害性Ｔリンパ球欠損性）動物モデルを使って、この理論を検証した。ヌードマウスは、胸腺の発育不良を引き起こす遺伝的変異を持つ系統からの実験用マウスであった。これは、Ｔ細胞の著しい減少と細胞性免疫の欠如を引き起こすことになる。図１２に示すとおり、ＣＴ２６担持ヌードマウス中の腫瘍サイズは１５日目に約３５０〜４００ｍｍ^３まで成長した。いくつかの処置群を抗癌効果について評価した。図１２Ａに示すとおり、どの群も、ＣＴ２６担持ヌードマウスモデルにおける腫瘍成長を効率よくは阻害しなかった。抗ＰＤ−Ｌ１抗体２．５ｍｇ／ｋｇと組み合わされた、または抗ＰＤ−Ｌ１抗体なしの、チダミド５０ｍｇ／ｋｇ＋メトホルミン１００ｍｇ／ｋｇおよびセレコキシブ５０ｍｇ／ｋｇのレジメンは、他のレジメンと比較して、抗癌活性をわずかに持っていた。しかし、先のデータに示したとおり、免疫が正常なＣＴ２６担持マウス（野生型マウス）では、同じ処置レジメンが抗癌活性を示した。これらの結果は、ＣＴ２６担持マウスモデルにおける、メトホルミンの存在下または非存在下での、免疫チェックポイント阻害剤＋チダミドおよびセレコキシブによる併用処置の強い抗腫瘍能力には、正常な免疫が必要であることを示唆した。すべてのマウスにおけるさまざまな治療モダリティの抗癌効果を図１２Ｂに示した。どの処置群もＰＲ応答を示さなかった。これらの結果は、どのレジメンも、免疫欠損性ヌードマウスでは有意な抗癌活性を発揮できないことを実証した。抗ＰＤ−Ｌ１抗体と組み合わされた、または抗ＰＤ−Ｌ１抗体なしの、チダミド＋セレコキシブおよびメトホルミンは、他の群と比較して、わずかな抗癌活性を示した。図１２Ｃに示すとおり、処置群のどのマウスにも体重減少はなかった。ＣＴ２６担持ヌードマウス中の腫瘍サイズは、図１２Ｄに示すとおり、２９日目に約２．７〜３．３ｇまで成長した。図１２Ｄに示すとおり、チダミド５０ｍｇ／ｋｇ＋メトホルミン１００ｍｇ／ｋｇおよびセレコキシブ５０ｍｇ／ｋｇの組み合わせだけが、腫瘍重量に基づけば腫瘍成長のわずかな阻害を示したが、腫瘍サイズに基づくと有意な阻害は示さなかった。野生型ＢＡＬＢ／ｃマウスデータ（図１〜１１）と比較したこの研究の結果によれば、抗ＰＤ−Ｌ１抗体または抗ＰＤ−１抗体と組み合わせたチダミド＋メトホルミンおよびセレコキシブの組み合わせの抗腫瘍活性は、正常な免疫を必要とすることが示唆された（図１２Ｅ）。したがってこれらの結果は、抗ＰＤ−１／抗ＰＤ−Ｌ１と組み合わされたチダミド＋メトホルミンおよびセレコキシブを含む併用治療が、癌細胞を殺すように細胞傷害性Ｔリンパ球を再活性化する相乗的抗腫瘍効果を有するという、本発明者らの提案を裏付けている。

総合すると、これらのデータは、チダミド＋セレコキシブが極めて重要な組み合わせであり、腫瘍微小環境を効率よくコントロールし、免疫調節活性を持つことを実証した。これは、抗ＰＤ−１抗体、抗ＰＤ−Ｌ１抗体または抗ＣＴＬＡ−４抗体などの免疫チェックポイント阻害剤と組み合わせると、免疫的に十分な正常動物モデルでの抗癌活性の強化および余命延長において、より効率的であった。免疫チェックポイント阻害剤と組み合わされたチダミド＋セレコキシブは、癌患者のための免疫治療における効力を強化するのに有意義であるだろうと、本発明者らは予測することができる。
実施例１３ ＣＴ２６担持ＢＡＬＢ／ｃマウスにおける抗ＰＤ−１抗体と組み合わされたチダミド＋セレコキシブによる処置後の循環免疫細胞および腫瘍浸潤性免疫細胞の分析
本発明者らは、ＣＯＸ−２阻害剤と組み合わされたエピジェネティック調節因子チダミドが免疫細胞集団に影響を及ぼすかどうかを、血液循環および腫瘍微小環境の両方で調べた。フローサイトメトリーを使用することにより、本発明者らはまず、正常マウス（腫瘍なし）および腫瘍担持マウスにおける循環免疫細胞集団（ＣＤ_４ ^＋Ｔ細胞、ＣＤ_８ ^＋Ｔ細胞、ＰＭＮ−ＭＤＳＣおよびＭ−ＭＤＳＣ、ならびにＴｒｅｇ細胞）を分析した。本発明者らは、ＣＴ２６腫瘍担持マウスでは、正常マウスと比較して、循環顆粒球性ＭＤＳＣ（ＰＭＮ−ＭＤＳＣ；ＣＤ１１ｂ^＋Ｌｙ６Ｇ^＋Ｌｙ６Ｃ^ｌｏｗと定義される）には４．７倍の増加が、また循環単球ＭＤＳＣ（Ｍ−ＭＤＳＣ；ＣＤ１１ｂ^＋Ｌｙ６Ｇ⁻Ｌｙ６Ｃ^＋と定義される）には２５％の増加があることを見いだした（図１３Ａ）。一方、図１３Ａに示すとおり、腫瘍担持マウスでは正常マウスと比較して、ＣＤ_４ ^＋Ｔ細胞、ＣＤ_８ ^＋Ｔ細胞およびＴｒｅｇ細胞が著しく減少していることもわかった。ＭＤＳＣ（骨髄由来抑制細胞）は、癌、炎症および感染中に拡大する不均質な細胞集団であり、Ｔ細胞機能の抑制を持つ。本発明者らは、図１３Ｂに示すとおり、処置レジメンの効果に関する研究をＭ−ＭＤＳＣに集中させた。無処置の腫瘍担持マウスでは、循環Ｍ−ＭＤＳＣ細胞が有意に増加した。しかしこれは、抗ＰＤ−１抗体単独での処置、またはチダミド＋セレコキシブもしくは抗ＰＤ−１抗体と組み合わされたチダミド＋セレコキシブでの処置により、有意に減少した。この処置は、無処置の正常マウスに観察されるものと類似するレベルへの循環Ｍ−ＭＤＳＣ数のめざましい低減をもたらした（図１３Ｂ）。結果は、ＰＭＮ−ＭＤＳＣの細胞数はどの処置でも有意に変化しないことも実証した（データ省略）。加えて本発明者らは、図１３Ｃに示すとおり、処置後１２日目に腫瘍担持マウスの循環Ｍ−ＭＤＳＣ細胞を、また処置後２３日目に腫瘍サイズを分析した。結果は、処置後１２日目における循環Ｍ−ＭＤＳＣの細胞数が、処置後２３日目における腫瘍サイズと有意に相関することを示した。他の免疫細胞は腫瘍サイズと相関しなかった（データ省略）。これらの結果は、循環Ｍ−ＭＤＳＣ細胞がＣＴ２６担持マウスにおける腫瘍発達の予測因子におそらくなりうることを示唆した。一方、本発明者らは、８日目におけるチダミド＋セレコキシブと抗ＰＤ−１抗体での処置および１２日目における抗ＰＤ−１抗体なしのチダミド＋セレコキシブでの処置によって、循環Ｔｒｅｇ細胞が有意に低減することを見いだした（図１３Ｄ）。本発明者らは、次に、腫瘍浸潤性免疫細胞を分析した。抗ＰＤ−１抗体単独での処置は骨髄系細胞およびＭ−ＭＤＳＣ細胞の数を著しく低減した。類似する結果が、図１３Ｅに示すとおり、チダミド＋セレコキシブと組み合わされた抗ＰＤ−１抗体の群またはチダミド＋セレコキシブの群でも示された。チダミド＋セレコキシブによる処置を除けば、どの処置によっても、ＴＡＭの細胞数が著しく変化することはなかった。Ｔｒｅｇの細胞数は、図１３Ｆに示すとおり、チダミド＋セレコキシブと組み合わされた抗ＰＤ−１抗体での処置によって著しく低減し、抗ＰＤ−１抗体単独またはチダミド＋セレコキシブでの処理によって中等度に低減した。本発明者らは、抗ＰＤ−１抗体とチダミド＋セレコキシブとの組み合わせで処置された処置群の腫瘍組織では、他の群と比較して、Ｔｒｅｇに対するＣＤ４^＋Ｔ細胞の比がわずかに増加することを見いだした（図１３Ｇ）。この処置群では、Ｔｒｅｇに対するＣＤ８^＋Ｔ細胞の比も、他の群より高かった（図１３Ｈ）。総合すると、チダミド＋セレコキシブによる処置は、腫瘍浸潤性骨髄系細胞（ＣＤ４５^＋ＣＤ１１ｂ^＋）、Ｍ−ＭＤＳＣ（図１３Ｅ）およびＴｒｅｇ（図１３Ｆ）を減少させた。これらの結果は、チダミド＋セレコキシブが循環抑制細胞および腫瘍浸潤性抑制細胞の抑制に重要な役割を果たし、それが次に、抗ＰＤ−１抗体との組み合わせで、ＣＴ２６腫瘍担持マウスに観察された抗腫瘍活性に寄与することを示唆した。

Claims (20)

1. 対象において腫瘍微小環境における免疫抑制を取り除きまたは癌細胞に対する免疫系を刺激する方法において使用するための組み合わせであって、免疫チェックポイント阻害剤との組み合わせでＨＤＡＣ阻害剤とＮＳＡＩＤとを含む組み合わせ。
2. 免疫治療によって癌を阻害または処置することができる、請求項１に記載の組み合わせ。
3. 前記癌が、膠芽腫、肝癌、結腸直腸癌、膠芽腫、胃癌、結腸直腸癌、食道癌、肺癌、膵癌、腎細胞癌、良性前立腺過形成、前立腺癌、卵巣癌、黒色腫、乳癌、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）、メルケル細胞癌、非ホジキンリンパ腫、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、胆嚢癌、胆管癌、膀胱癌および子宮癌である、請求項１に記載の組み合わせ。
4. ビグアニド化合物をさらに含む、請求項１に記載の組み合わせ。
5. 前記ＨＤＡＣ阻害剤がクラスＩ ＨＤＡＣの選択的阻害剤である、請求項１に記載の組み合わせ。
6. 前記ＨＤＡＣ阻害剤がベンズアミドクラスのＨＤＡＣ阻害剤である、請求項１に記載の組み合わせ。
7. 前記ＨＤＡＣ阻害剤が、チダミド、エンチノスタット、ボリノスタット、ロミデプシン、パノビノスタット、ベリノスタット、パノビノスタット、バルプロ酸、モセチノスタット、アベキシノスタット、エンチノスタット、プラシノスタット、レスミノスタット、ギビノスタットまたはキシノスタットである、請求項１に記載の組み合わせ。
8. 前記ＨＤＡＣ阻害剤がチダミドまたはエンチノスタットまたはモセチノスタットである、請求項１に記載の組み合わせ。
9. 前記ＮＳＡＩＤが、アスピリン、イブプロフェン、インドメタシン、ナプロキセンまたはＣＯＸ−２阻害剤である、請求項１に記載の組み合わせ。
10. 前記ＣＯＸ−２阻害剤が、セレコキシブ、ロフェコキシブまたはエトリコキシブである、請求項９に記載の組み合わせ。
11. 前記免疫チェックポイント阻害剤が、抗ＣＴＬＡ−４抗体、抗ＰＤ−１抗体、抗ＰＤ−Ｌ１抗体、抗ＴＩＭ−３抗体、抗ＢＴＬＡ抗体、抗ＶＩＳＴＡ抗体または抗ＬＡＧ−３抗体である、請求項１に記載の組み合わせ。
12. 前記免疫チェックポイント阻害剤が、ランブロリズマブ、ピディリズマブ、ニボルマブ、デュルバルマブ、アベルマブ、アテゾリズマブまたはＭＩＨＩである、請求項１に記載の組み合わせ。
13. 前記ビグアニド化合物が、メトホルミン、フェンホルミン、プログアニルおよびクロルプログアニルである、請求項４に記載の組み合わせ。
14. 前記組み合わせ中の前記ＨＤＡＣ阻害剤、前記ＮＳＡＩＤおよび前記免疫チェックポイント阻害剤の量が、それぞれ約１０％（ｗ／ｗ）〜約７０％（ｗ／ｗ）、約１０％（ｗ／ｗ）〜約７０％（ｗ／ｗ）および約０．５％（ｗ／ｗ）〜約２０％の範囲にある、請求項１に記載の組み合わせ。
15. ビグアニド化合物の量が約３０％〜７０％（ｗ／ｗ）の範囲にある、請求項４に記載の組み合わせ。
16. １つまたは複数の追加抗癌剤をさらに含む、請求項１に記載の組み合わせ。
17. ＨＤＡＣ阻害剤、ＮＳＡＩＤおよび免疫チェックポイント阻害剤を含む薬学的組み合わせ。
18. 前記薬学的組み合わせ中の前記ＨＤＡＣ阻害剤、前記ＮＳＡＩＤおよび前記免疫チェックポイント阻害剤の量が、それぞれ約１０％（ｗ／ｗ）〜約７０％（ｗ／ｗ）、約１０％〜約７０％（ｗ／ｗ）および約０．５％〜約２０％である、請求項１に記載の薬学的組み合わせ。
19. ビグアニド化合物をさらに含む、請求項１に記載の薬学的組み合わせ。
20. 前記ビグアニド化合物の量が約３０％〜約７０％（ｗ／ｗ）の範囲にある、請求項１９に記載の薬学的組み合わせ。