KR20190083990A - 종양 미세환경 및 면역요법의 조절을 위한 약제학적 조합물 및 방법 - Google Patents

종양 미세환경 및 면역요법의 조절을 위한 약제학적 조합물 및 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 면역 체크 포인트 억제제와 조합된 HDAC 억제제 및 NSAID의 조합물을 환자에게 투여하는 것을 포함하여, 종양 미세환경에서 면역 억제를 제거하거나 암세포에 대한 면역계를 자극하는 방법에 관한 것이다.

Description

종양 미세환경 및 면역요법을 조절하기 위한 약제학적 조합물 및 방법{A PHARMACEUTICAL COMBINATION AND METHOD FOR REGULATION OF TUMOR MICROENVIRONMENT AND IMMUNOTHERAPY}
본 발명은 면역요법에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 종양 미세환경 및 암 면역요법을 조절하는 약제학적 조합물 및 이의 적용을 제공한다.
암 면역 요법은 인상적이고 유망한 돌파구를 가져온 급속히 발전하는 분야이다. 종양 관련 항원의 존재가 밝혀지면 종양 성장에 개입하기 위해 숙주의 면역 체계를 사용할 가능성이 높아졌다. 면역 체계의 체액성 및 세포성 아암 둘 모두를 활용하는 다양한 메커니즘은 현재 암 면역요법에 대해 조사되고 있다.
면역 이펙터(immune effector)의 입양 전달(adoptive transfer), 면역조절 치료법, 및 백신접종을 포함하는 면역 관용(immune tolerance)을 파괴하기 위한 여러 전략이 제안되었다. 그러나, 이러한 전략들은 여전히 면역 이탈(immune escape)을 예방하지 못한다. 항-아폽토시스 신호전달, 미토겐-활성 단백질 키나아제(MAPK), 및 사이클릭 아데노신 모노포스페이트(cAMP) 관련 메커니즘을 포함하는 주요 이탈 경로(escape pathway)가 암세포에서 일어난다. 종양 미세환경(tumor microenvironment)은 종양 진행을 기초로 하여 동적이기 때문에 중요한 연구 분야이다. 종양은 악성 진행으로 이어질 수 있는 종양 미세환경에서 선택적 압력을 제공하는, 면역 편집으로 불리워지는 과정에 의해 면역 조절을 회피하는 메커니즘을 진화시킨다. '면역 이탈'이라 불리워지는 종양-촉진 시기에서, 면역 체계는 숙주의 면역능력을 더욱 존속시킬 수 있는 암세포를 선택함으로써 또는 종양 성장이 촉진되는 방식으로 종양 미세환경을 변형시킴으로써 추가로 종양 진행시킬 수 있다.
면역 체계 항상성은 면역 체계 반응에서 균형을 조절하기 위한 자극 메커니즘 및 억제 메커니즘 둘 모두의 존재를 포함한다. 억제 메커니즘은 세포독성 T 림프구 관련 항원-4(CTLA-4, CD28 동족체), 및 프로그래밍된 세포 사멸 단백질-1(PD-1) 또는 이의 리간드(PD-L1), TIM-3(T 세포 면역글로불린-3), BTLA(B 및 T 림프구 감쇠자), VISTA(T 세포 활성화의 V-도메인 Ig 억제유전자) 및 LAG-3(림프구-활성화 유전자 3)을 포함한다. 현재, 항-CTLA-4, 항-PD-1, 및 항-PD-L1 항체를 포함하는 다수의 면역 관문 억제제 모노클로날 항체는 여러 종양학 지표에서 치료 용도로 미국 FDA 및 EMA에 의해 승인되었다. 그러나, 이러한 면역 관문 억제제에 대하여, 약 20% 내지 30%의 암 환자는 단일치료법에 대한 종양 반응을 제공하였다. 효능은 여전히 만족스럽지 못하다.
US 20180244783호는 암 및 다른 질병의 치료를 위한 면역치료제와 조합한 Wnt 경로 억제제를 제공한다. US 20180355042호는 암 전이를 감소시키고/거나 예방하는 것을 포함하는, 암을 치료하기 위해 유용한 HDACi 및 PD-1 억제제를 포함한 조합물을 제공한다. 그러나, 더욱 뚜렷한 항암 활성을 달성하기 위한 치료 해법을 개발하는 것이 여전히 요구되고 있다.
본 발명은 놀랍게도, 히스톤 데아세틸라아제(HDAC) 억제제 및 비스테로이드성 항-염증 약물(nonsteroidal anti-inflammatory drug: NSAID)의 조합물이 종양 미세환경에 영향을 미칠 수 있다는 것을 발견하였으며, 이는 면역 관문 억제제와 결합한 이러한 조합물이 항암 활성을 현저하게 개선시킨다는 것을 시사한다. 본 발명은 면역 관문 억제제와 결합한 약제학적 조합물로의 치료가 면역 관문 억제제 단독과 비교하여 항암 활성을 상당히 증가시킨다는 것을 발견하였다. 약제학적 조합물 및 면역 관문 억제제로의 동시-치료는 HDAC 억제제 플러스(plus) 면역 관문 억제제로의 치료보다 종양 성장을 억제하는 데 더 큰 효능을 제공한다. 또한, 약제학적 조합물 및 면역 관문 억제제의 조합물은 종양을 상당히 박멸하고 생존률을 약 70 내지 80%까지 증가시킨다.
일 구현예에서, 본 발명은 종양 미세환경에서 면역 억제를 제거하거나 암세포에 대한 면역 체계를 자극시키는 방법으로서, 대상체에 면역 관문 억제제와 결합한 HDAC 억제제 및 NSAID의 조합물을 투여하는 것을 포함하는 방법을 제공한다. 이러한 방법은 면역요법을 통해 암을 억제하거나 치료할 수 있다. 일 구현예에서, 조합물에서 HDAC 억제제 및 NSAID의 양은 각각 약 5% 내지 약 40%(w/w) 및 약 5% 내지 약 40%(w/w)의 범위이다.
추가 구현예에서, 조합물은 비구아니드 화합물을 추가로 포함한다. 비구아니드 화합물의 양은 약 40% 내지 80%(w/w)의 범위이다.
일부 구현예에서, HDAC 억제제는 클래스 I HDAC의 선택적 억제제이다. 특히, HDAC 억제제는 벤즈아미드 클래스의 HDAC 억제제이다. HDAC 억제제의 특정 구현예는 키다미드, 엔티노스타트, 보리노스타트, 로미뎁신, 파노비노스타트, 벨리노스타트, 파노비노스타트, 발프로산, 모세티노스타트, 아벡시노스타트, 엔티노스타트, 프라시노스타트, 레스미노스타트, 기비노스타트 및 퀴시노스타트를 포함한다.
일부 구현예에서, NSAID는 아스피린, 이부프로펜, 인도메타신, 나프록센 또는 COX-2 억제제이다. COX-2 억제제의 특정 구현예는 셀레콕시브, 로페콕시브 및 에토리콕시브를 포함한다.
일부 구현예에서, 면역 관문 억제제는 항-CTLA-4 항체, 항-PD-1 항체 또는 항-PD-L1 항체이다. 면역 관문 억제제의 특정 구현예는 람브롤리주맙, 피딜리주맙, 니볼루맙, 두르발루맙, 아벨루맙, 아테졸리주맙 및 MIHI를 포함한다.
암의 특정 구현예는 교모세포종, 간암, 대장 암종, 교모세포종, 위암, 대장암, 식도암, 폐암, 췌장암, 신세포 암종, 양성 전립선 비대증, 전립선암, 난소암, 흑색종, 유방암, 만성 림프성 백혈병(CLL), 머켈 세포 암종, 비호지킨 림프종, 급성 골수성 백혈병(AML), 담낭암, 담관암종, 비뇨기 방광암, 및 자궁암을 포함한다.
일 구현예에서, 본 방법은 하나 이상의 추가적인 항암제를 투여하는 것을 추가로 포함한다.
일 구현예에서, 본 발명은 HDAC 억제제, NSAID 및 면역 관문 억제제를 포함하는 약제학적 조합물을 제공한다. HDAC 억제제, NSAID 및 면역 관문 억제제의 구현예는 본원에 기술된 것이다. 일 구현예에서, 약제학적 조합물은 비구아니드 화합물을 추가로 포함한다.
도 1A 내지 도 1D는 CT26 종양-보유 마우스에서 항-PD-1 항체와 결합한 키다미드 또는 엔티노스타트의 치료 반응을 도시한 것이다. CT26 결장 종양을 보유한 BALB/c 마우스는 명시된 바와 같이 다양한 치료 양식으로 치료되었다. IgG, 항-IgG 대조군(비히클, 10 ㎎/㎏); PD-1, 항-PD-1 모노클로날 항체(10 ㎎/㎏); CD, 키다미드(25 ㎎/㎏); E, MS-275(엔티노스타트, 20 ㎎/㎏). 전체 종양 부피(A), 개별 종양 부피(B), CT26 종양 보유-마우스 체중(C), 및 동물 생존(D)이 기록되었다. CT26 종양 보유 마우스는 명시된 바와 같이 치료되고, 종양 부피가 종양 이식 후 3000 ㎣에 도달하였을 때 안락사되었다. 평균 및 SD가 표시된다. 각 실험 아암에서 사용되는 동물의 수 및 P 값이 또한 명시된다. *P < 0.05. P-값은 IgG 그룹을 갖는 명시 그룹에서 종양 크기를 비교한 스튜던트 t-테스트를 이용하여 계산되었다.
도 2A 내지 도 2D는 CT26 종양-보유 마우스에서 항-PD-1 항체와 결합한 키다미드 플러스(plus) 메트포르민의 치료 반응을 도시한 것이다. CT26 결장 종양을 보유한 BALB/c 마우스는 명시된 바와 같이 다양한 치료 양식으로 치료되었다. IgG, 항-IgG 대조군(비히클, 10 ㎎/㎏); PD-1, 항-PD-1 모노클로날 항체(10 ㎎/㎏); CD, 키다미드(12.5, 25, 또는 50 ㎎/㎏); E, MS-275(엔티노스타트, 20 ㎎/㎏); M, 메트포르민(100 ㎎/㎏). 전체 종양 부피(A), 개별 종양 부피(B), CT26 종양 보유-마우스 체중(C), 및 동물 생존(D)이 기록되었다. CT26 종양 보유 마우스는 명시된 바와 같이 치료되고, 종양 이식 후 3,000 ㎣의 종양 부피에서 안락사되었다. 평균 및 SD가 표시된다. 각 실험 아암에서 사용되는 동물의 수 및 P 값이 또한 명시된다. *P < 0.05. P-값은 IgG 그룹을 갖는 명시 그룹에서 종양 크기를 비교한 스튜던트 t-테스트를 이용하여 계산되었다.
도 3A 내지 도 3D는 CT26 종양-보유 마우스에서 항-PD-1 항체와 결합한 키다미드 또는 엔티노스타트 플러스 메트포르민 및 셀레콕시브의 치료 반응을 도시한 것이다. CT26 결장 종양을 보유한 BALB/c 마우스는 명시된 바와 같이 다양한 치료 양식으로 치료되었다. IgG, 항-IgG 대조군(비히클, 10 ㎎/㎏); PD-1, 항-PD-1 모노클로날 항체(10 ㎎/㎏); CD, 키다미드(12.5 ㎎/㎏); E, MS-275(엔티노스타트, 20 ㎎/㎏); C, 셀레콕시브(25 ㎎/㎏); M, 메트포르민(100 ㎎/㎏). 전체 종양 부피(A), 개별 종양 부피(B), 보유-마우스 체중(C), 및 동물 생존(D)이 기록되었다. CT26 종양 보유-마우스는 명시된 바와 같이 치료되고, 종양 이식 후 3,000 ㎣의 종양 부피에서 안락사되었다. 평균 및 SD가 표시된다. 각 실험 아암에서 사용되는 동물의 수 및 P 값이 또한 명시된다. *P < 0.05. P-값은 IgG 그룹을 갖는 명시 그룹에서 종양 크기를 비교한 스튜던트 t-테스트를 이용하여 계산되었다.
도 4A 내지 도 4D는 CT26 종양-보유 마우스에서 항-PD-1 항체와 결합한 다양한 용량의 키다미드 플러스 메트포르민 및 셀레콕시브의 치료 반응을 도시한 것이다. CT26 결장 종양을 보유한 BALB/c 마우스는 명시된 바와 같이 다양한 치료 양식으로 치료되었다. IgG, 항-IgG 대조군(비히클, 10 ㎎/㎏); PD-1, 항-PD-1 모노클로날 항체(10 ㎎/㎏); CD, 키다미드(12.5, 25, 또는 50 ㎎/㎏); C, 셀레콕시브(25 또는 50 ㎎/㎏); M, 메트포르민(100 또는 200 ㎎/㎏). 전체 종양 부피(A), 개별 종양 부피(B), CT26 종양 보유-마우스 체중(C), 및 동물 생존(D)이 기록되었다. CT26 종양 보유 마우스는 명시된 바와 같이 치료되고, 종양 이식 후 3,000 ㎣의 종양 부피에서 안락사되었다. 평균 및 SD가 표시된다. 각 실험 아암에서 사용되는 동물의 수 및 P 값이 또한 명시된다. *P < 0.05. P-값은 IgG 그룹을 갖는 명시 그룹에서 종양 크기를 비교한 스튜던트 t-테스트를 이용하여 계산되었다.
도 5A 내지 도 5D는 CT26 종양-보유 마우스에서 항-PD-L1 항체와 결합한 키다미드 플러스 메트포르민 및 셀레콕시브의 치료 반응을 도시한 것이다. CT26 결장 종양을 보유한 BALB/c 마우스는 명시된 바와 같이 다양한 치료 양식으로 치료되었다. IgG, 항-IgG 대조군(비히클, 10 ㎎/㎏); PD-L1, 항-PD-L1 모노클로날 항체(10 ㎎/㎏); CD, 키다미드(50 ㎎/㎏); C, 셀레콕시브(50 ㎎/㎏); M, 메트포르민(100 ㎎/㎏). 전체 종양 부피(A), 개별 종양 부피(B), CT26 종양-보유-마우스 체중(C), 및 동물 생존(D)이 기록되었다. CT26 종양 보유 마우스는 명시된 바와 같이 치료되고, 종양 이식 후 3,000 ㎣의 종양 부피에서 안락사되었다. 평균 및 SD가 표시된다. 각 실험 아암에서 사용되는 동물의 수 및 P 값이 또한 명시된다. *P < 0.05. P-값은 IgG 그룹을 갖는 명시 그룹에서 종양 크기를 비교한 스튜던트 t-테스트를 이용하여 계산되었다.
도 6A 내지 도 6D는 JC 종양-보유 마우스에서 항-PD-1 항체와 결합한 키다미드 플러스 메트포르민 및 셀레콕시브의 치료 반응을 도시한 것이다. JC 유방 종양을 보유한 BALB/c 마우스는 명시된 바와 같이 다양한 치료 양식으로 치료되었다. IgG, 항-IgG 대조군(비히클, 10 ㎎/㎏); PD-1, 항-PD-1 모노클로날 항체(10 ㎎/㎏); CD, 키다미드(50 ㎎/㎏); C, 셀레콕시브(50 ㎎/㎏); M, 메트포르민(100 ㎎/㎏). 전체 종양 부피(A), 개별 종양 부피(B), JC 종양 보유-마우스 체중(C), 및 동물 생존(D)이 기록되었다. JC 종양 보유 마우스는 명시된 바와 같이 치료되고, 종양 이식 후 3,000 ㎣의 종양 부피에서 안락사되었다. 평균 및 SD가 표시된다. 각 실험 아암에서 사용되는 동물의 수 및 P 값이 또한 명시된다. *P < 0.05. P-값은 IgG 그룹을 갖는 명시 그룹에서 종양 크기를 비교한 스튜던트 t-테스트를 이용하여 계산되었다.
도 7A 내지 도 7E는 CT26 종양-보유 마우스에서 항-PD-L1 항체(상이한 용량에서)와 결합한 키다미드(상이한 용량에서) 플러스 메트포르민 및 셀레콕시브의 치료 반응을 도시한 것이다. CT26 결장 종양을 보유한 BALB/c 마우스는 명시된 바와 같이 다양한 치료 양식으로 치료되었다. IgG, 항-IgG 대조군(비히클, 10 ㎎/㎏); PD-L1, 항-PD-L1 모노클로날 항체(2.5 및 10 ㎎/㎏); CD, 키다미드(6.25, 12.5, 또는 50 ㎎/㎏); C, 셀레콕시브(50 ㎎/㎏); M, 메트포르민(100 ㎎/㎏). 항-PD-L1 항체(2.5 또는 10 ㎎/㎏) 및 키다미드(6.25 또는 50 ㎎/㎏) 플러스 셀레콕시브(50 ㎎/㎏) 및 메트포르민(100 ㎎/㎏)으로의 치료 후 전체 종양 부피(A), 항-PD-L1 항체 부재 하에서 키다미드(6.25, 12.5 또는 50 ㎎/㎏) 플러스 셀레콕시브(50 ㎎/㎏) 및 메트포르민(100 ㎎/㎏)으로의 치료 후 전체 종양 부피(B), 항-PD-L1 항체(2.5 또는 10 ㎎/㎏)의 존재 또는 부재 하에서 키다미드(6.25, 12.5 또는 50 ㎎/㎏) 플러스 셀레콕시브(50 ㎎/㎏) 및 메트포르민(100 ㎎/㎏)으로의 치료 후 개별 전체 종양 부피(C), CT26 종양-보유 마우스 체중(D), 및 동물 생존(E)이 기록되었다. CT26 종양 보유 마우스는 명시된 바와 같이 치료되고, 종양 이식 후 3,000 ㎣의 종양 부피에서 안락사되었다. 평균 및 SD가 표시된다. 각 실험 아암에서 사용되는 동물의 수 및 P 값이 또한 명시된다. *P < 0.05. P-값은 IgG 그룹을 갖는 명시 그룹에서 종양 크기를 비교한 스튜던트 t-테스트를 이용하여 계산되었다.
도 8A 내지 도 8E는 CT26 종양-보유 마우스에서 메트포르민과 함께 또는 이의 없이 키다미드 플러스 셀레콕시브와 결합한 항-PD-1 또는 항-PD-L1 항체의 치료 반응을 도시한 것이다. CT26 결장 종양을 보유한 BALB/c 마우스는 명시된 바와 같이 다양한 치료 양식으로 치료되었다. IgG, 항-IgG 대조군(비히클, 2.5 ㎎/㎏); PD-1, 항-PD-1 모노클로날 항체(2.5 ㎎/㎏); PD-L1, 항-PD-L1 모노클로날 항체(2.5 ㎎/㎏); CD, 키다미드(50 ㎎/㎏); C, 셀레콕시브(50 ㎎/㎏); M, 메트포르민(100 ㎎/㎏). 항-PD-1/항-PD-L1 항체의 존재 또는 부재 하에 메트포르민(100 ㎎/㎏)과 함께 또는 이의 없이 키다미드(50 ㎎/㎏) 플러스 셀레콕시브(50 ㎎/㎏)로의 치료 후 전체 종양 부피(A), 항-PD-1 또는 항-PD-L1 대조군과 비교한 키다미드(50 ㎎/㎏) 플러스 셀레콕시브(50 ㎎/㎏) 및 메트포르민(100 ㎎/㎏)과 결합한 항-PD-1 또는 항-PD-L1 항체로의 치료 후 전체 종양 부피(B), 명시된 바와 같은 다양한 치료 양식으로 치료 후 개별 종양 부피(C). CT26 종양-보유-마우스 체중(D), 및 동물 생존(E)이 기록되었다. CT26 종양 보유 마우스는 명시된 바와 같이 치료되고, 종양 이식 후 3,000 ㎣의 종양 부피에서 안락사되었다. 평균 및 SD가 표시된다. 각 실험 아암에서 사용되는 동물의 수 및 P 값이 또한 명시된다. *P < 0.05. P-값은 IgG 그룹을 갖는 명시 그룹에서 종양 크기를 비교한 스튜던트 t-테스트를 이용하여 계산되었다.
도 9A 내지 도 9H는 CT26 종양-보유 마우스에서 항-PD-1 항체와 결합한 다양한 용량 요법에서의 키다미드 플러스 셀레콕시브의 치료 반응을 도시한 것이다. CT26 결장 종양을 보유한 BALB/c 마우스는 명시된 바와 같이 다양한 치료 양식으로 치료되었다. IgG, 항-IgG 대조군(비히클, 2.5 ㎎/㎏); PD-1, 항-PD-1 모노클로날 항체(2.5 ㎎/㎏); CD, 키다미드(12.5, 25 또는 50 ㎎/㎏); C, 셀레콕시브(12.5, 25 또는 50 ㎎/㎏). 다양한 용량(12.5, 25.0, 또는 50 ㎎/㎏)의 키다미드 12.5 ㎎/㎏ 플러스 셀레콕시브와 결합한 항-PD-1 항체로의 치료 후 전체 종양 부피(A), 키다미드 25 ㎎/㎏ 플러스 다양한 용량(12.5, 25.0, 또는 50 ㎎/㎏)의 셀레콕시브와 결합한 항-PD-1 항체로의 치료 후 전체 종양 부피(B), 키다미드 50 ㎎/㎏ 플러스 다양한 용량(12.5, 25.0, 또는 50 ㎎/㎏)의 셀레콕시브와 결합한 항-PD-1 항체로의 치료 후 전체 종양 부피(C), 명시된 바와 같은 다양한 치료 양식으로의 치료 후 개별 종양 부피(D), CT26 종양-보유-마우스 체중(E), 및 동물 생존(F 내지 H)이 기록되었다. CT26 종양 보유 마우스는 명시된 바와 같이 치료되고, 종양 이식 후 3,000 ㎣의 종양 부피에서 안락사되었다. 평균 및 SD가 표시된다. 각 실험 아암에서 사용되는 동물의 수 및 P 값이 또한 명시된다. *P < 0.05. P-값은 IgG 그룹을 갖는 명시 그룹에서 종양 크기를 비교한 스튜던트 t-테스트를 이용하여 계산되었다.
도 10A 내지 도 10H는 CT26 종양-보유 마우스에서 항-PD-1 또는 항-CTLA-4 항체와 결합한 HDAC 억제제(키다미드 및 모세티노스타트) 플러스 COX-2 억제제(셀레콕시브, 아스피린, 및 이부프로펜)의 치료 반응을 도시한 것이다. CT26 결장 종양을 보유한 BALB/c 마우스는 명시된 바와 같이 다양한 치료 양식으로 치료되었다. IgG, 항-IgG 대조군(비히클, 2.5 ㎎/㎏); PD-1, 항-PD-1 모노클로날 항체(2.5 ㎎/㎏); CTLA4: 항-CTLA4 모노클로날 항체(2.5 ㎎/㎏); CD, 키다미드(50 ㎎/㎏); Moc, 모세티노스타트(30 ㎎/㎏); C, 셀레콕시브(50 ㎎/㎏); Asp, 아스피린(50 ㎎/㎏); Ibu, 이부프로펜(50 ㎎/㎏). 대조군(항-PD-1항체 단독 및 항-PD-1 항체 없는 조합물)과 비교한 키다미드(50 ㎎/㎏) 플러스 COX-2 억제제(셀레콕시브 50 ㎎/㎏, 아스피린 50 ㎎/㎏, 또는 이부프로펜 50 ㎎/㎏)와 결합한 항-PD-1 항체로의 치료 후 전체 종양 부피(A), 셀레콕시브 50 ㎎/㎏ 플러스 HDAC 억제제(키다미드 50 ㎎/㎏ 또는 모세티노스타트 30 ㎎/㎏)와 결합한 항-PD-1 항체로의 치료 후 전체 종양 부피(B), 키다미드 50 ㎎/㎏ 플러스 셀레콕시브 50 ㎎/㎏와 조합된 항-CTLA4 또는 항-PD-1 항체로의 치료 후 전체 종양 부피(C), 명시된 바와 같은 다양한 치료 양식으로의 치료 후 개별 종양 부피(D), CT26 종양-보유-마우스 체중(E), 및 동물 생존(F 내지 H)이 기록되었다. CT26 종양 보유 마우스는 명시된 바와 같이 치료되고, 종양 이식 후 3,000 ㎣의 종양 부피에서 안락사되었다. 평균 및 SD가 표시된다. 각 실험 아암에서 사용되는 동물의 수 및 P 값이 또한 명시된다. *P < 0.05. P-값은 IgG 그룹을 갖는 명시 그룹에서 종양 크기를 비교한 스튜던트 t-테스트를 이용하여 계산되었다.
도 11A 내지 도 11D는 CT26 종양-보유 마우스에서 항-PD-1 항체와 조합된 고정 용량에서의 키다미드 플러스 셀레콕시브의 치료 반응을 확인한 것이다. CT26 결장 종양을 보유한 BALB/c 마우스는 명시된 바와 같이 다양한 치료 양식으로 치료되었다. IgG, 항-IgG 대조군(비히클, 2.5 ㎎/㎏); PD-1, 항-PD-1 모노클로날 항체(2.5 ㎎/㎏); CD, 키다미드(50 ㎎/㎏); C, 셀레콕시브(50 ㎎/㎏). 항-PD-1 항체와 조합한 또는 이의 없이 키다미드 플러스 셀레콕시브로의 치료 후 전체 종양 부피(A), 명시된 바와 같은 다양한 치료 양식으로의 치료 후 개별 종양 부피(B), CT26 종양-보유-마우스 체중(C), 및 동물 생존(D)이 기록되었다. CT26 종양 보유 마우스는 명시된 바와 같이 치료되고, 종양 이식 후 3,000 ㎣의 종양 부피에서 안락사되었다. 평균 및 SD가 표시된다. 동물의 수는 각 실험 아암에서 증가되었으며, P 값이 또한 명시되어 있다. *P < 0.05. P-값은 IgG 그룹을 갖는 명시 그룹에서 종양 크기를 비교한 스튜던트 t-테스트를 이용하여 계산되었다.
도 12A 내지 도 12E는 CT26 종양-보유 누드 마우스에서 항-PD-L1 항체와 조합된 고정 용량에서의 키다미드 플러스 메트포르민 및 셀레콕시브의 치료 반응을 도시한 것이다. CT26 결장 종양을 보유한 BALB/c 누드 마우스는 명시된 바와 같은 다양한 치료 양식으로 치료되었다. IgG, 항-IgG 대조군(비히클, 2.5 ㎎/㎏); PD-L1, 항-PD-L1 모노클로날 항체(2.5 ㎎/㎏); CD, 키다미드(50 ㎎/㎏); C, 셀레콕시브(50 ㎎/㎏); M, 메트포르민(100 ㎎/㎏). 대조군과 비교하여 키다미드 플러스 셀레콕시브 및 메트포르민과 조합된 항-PD-L1 항체로의 치료 후 전체 종양 부피(A), 명시된 바와 같은 다양한 치료 양식으로의 치료 후 개별 종양 부피(B), CT26 종양-보유-마우스 체중(C), 종양 중량(D), 및 정상 마우스와 누드 마우스 간의 항-종양 활성의 비교가 기록되었다.
도 13A 내지 도 13F는 셀레콕시브와 조합된 항-PD-1 항체 및 키다미드로의 치료 후 면역 세포의 반응을 도시한 것이다. 전이성 CT26 종양을 보유한 BALB/c 마우스는 명시된 치료 양식으로 치료되었으며, FACS 분석은 순환 및 종양-침윤 면역 세포를 평가하기 위해 이용되었다. 평균 및 SD가 표시되며, P 값이 명시된다. IgG, 항-IgG 대조군(비히클, 2.5 ㎎/㎏); PD-1, 항-PD-1 모노클로날 항체(2.5 ㎎/㎏); CD, 키다미드(50 ㎎/㎏); C, 셀레콕시브(50 ㎎/㎏). 도 13A는 CD4, CD8, PMN-MDSC, M-MDSC, 및 Treg 세포에 대한 FACS 결과를 도시한 것이다. CD45+CD11b+ 게이트 순환 세포에서 Ly6G+Ly6C 낮은 세포(PMN-MDSC) 및 Ly6C+Ly6G- 세포(M-MDSC)의 백분율을 도시한 예시적인 FACS 데이터. 비-종양-보유 마우스 n=6; 종양-보유 마우스 n=11. 도 13B는 비-종양-보유 마이스와 비교하여, 종양-보유 마우스에서 명시된 상이한 치료적 치료(therapeutic treatment)에 의해 순환 M-MDSC 세포에 대한 FACS 결과를 도시한 것이다. 도 13C는 도 13B에 도시된 바와 같은 마우스에서 명시된 치료 후 23일째에 상응하는 종양 크기와 상관관계가 있는 12일째에 순환 Ly6C+Ly6G- 세포(M-MDSC)에 대한 FACS 결과를 도시한 것이다. 도 13D는 8일째 및 12일째에 명시된 치료에 의한 순환 FoxP3+ Treg 세포에 대한 FACS 결과를 도시한 것이다. 예시적인 FACS 데이터는 순환 백혈구에서 FoxP3 및 CD25 이중 포지티브 세포의 백분율을 도시한 것이다. 도 13E는 8일째에 명시된 치료에 의한 종양-침윤 골수(CD11b+), TAM, 및 M-MDSC 세포에 대한 FACS 결과를 도시한 것이다. 도 13F는 8일째에 명시된 치료에 의한 종양-침윤 CD4+CD25+FoxP3+ Treg, CD4+ T 세포, 및 CD8+ T 세포에 대한 FACS 결과를 도시한 것이다. 도 13g는 유세포 분석에 의해 시험된 바와 같은 다양한 치료 후 CT26 종양-보유 마우스로부터의 종양 조직에서의 CD4+ T 세포 및 Treg 세포의 상대적 비율을 도시한 것이다. 도 13h는 유세포 분석에 의해 시험된 바와 같은 다양한 치료 후 CT26 종양-보유 마우스로부터의 종양 조직에서의 CD8+ T 세포 및 Treg 세포의 상대적 비율을 도시한 것이다. *P < 0.05. 각 그룹 n=6에서 순환하는 면역 세포에 대한 데이터 검정, 각 그룹 n=2에서 종양-침윤 면역 세포에 대한 데이터 검정.
달리 규정하지 않는 한, 본원에서 사용되는 모든 기술 용어 및 과학 용어는 본 발명이 속하는 당업자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 본원에 기술된 것과 유사하거나 동일한 임의의 방법 및 물질이 본 발명의 실무 또는 시험에서 사용될 수 있지만, 바람직한 방법 및 물질은 하기에 기술된다. 본원에 언급된 모든 공개문은 본원에 참고로 포함된다.
단수 용어("a" 및 "an")는 하나 또는 하나 초과(즉, 적어도 하나)의 문법적 목적물을 지칭한다. 일 예로서, "구성요소(an element)"는 하나의 구성요소 또는 하나 초과의 구성요소를 의미한다. "또는"의 사용은 달리 특별히 기술하지 않는 한, "및/또는"을 의미한다.
본원에서 사용되는 "대상체(subject)," "개체(individual)" 및 "환자(patient)"는 척추동물, 바람직하게, 포유동물, 더욱 바람직하게, 인간을 지칭하기 위해 상호교환적으로 사용된다. 포유동물은 쥐, 원숭이, 인간, 농장 동물, 스포츠 동물, 및 애완동물을 포함하지만, 이로 제한되지 않는다. 시험관 내에서 수득되거나 시험관 내에서 배양된 생물학적 독립체의 조직, 세포 및 이의 자손이 또한 포함된다.
본원에서 사용되는 "치료학적 유효량(therapeutically effective amount)"은 질병(예를 들어, 신경퇴행성 질병)에 걸린 대상체를 치료하거나 질병과 관련된 증상 또는 합병증을 완화시키기에 충분한 양을 의미한다.
본원에서 사용되는 용어 "치료하다(treat)," "치료하는(treating)," "치료(treatment)," 등은 장애 및/또는 이와 관련된 증상을 감소시키거나 개선시키는 것을 지칭한다. 배제되는 것은 아니지만, 장애 또는 질환을 치료하는 것이 장애, 질환 또는 이와 관련된 증상이 완전히 제거되는 것을 필요로 하지 않는다는 것을 이해할 것이다.
본원에서 사용되는 용어 "면역요법"은 면역 반응을 유도하거나 향상시키거나 저해하거나 그밖에 개질시키는 것을 포함하는 방법에 의해 질병을 앓고 있거나 질병의 재발을 경감시키거나 악화시킬 위험이 있는 대상체의 치료를 지칭한다.
본원에서 사용되는 용어 "프로그래밍된 세포 사멸 단백질 1(PD-1)"은 CD28 패밀리에 속하는 면역억제 수용체를 지칭한다. PD-1은 생체 내에서 이전에 활성화된 T 세포 상에서 주로 발현되고, 2개의 리간드, 즉, PD-L1 및 PD-L2에 결합한다. 본원에서 사용되는 용어 "PD-1"은 인간 PD-1(hPD-1), hPD-1의 변이체, 아이소폼, 및 종, 및 hPD-1과 함께 적어도 하나의 공통 에피토프를 갖는 유사체를 포함한다. 완전 hPD-1 서열은 유전자은행 수탁 번호(GenBank Accession No.) U64863로 확인될 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 "프로그래밍된 사멸-리간드1(PD-L1)"은 PD-1에 결합 시에 T 세포 활성화 및 시토카인 분비를 하향조절하는 PD-1(다른 하나는 PD-L2임)에 대한 2개의 세포 표면 당단백질 리간드들 중 하나이다. 본원에서 사용되는 용어 "PD-L1"은 인간 PD-L1(hPD-L1), hPD-L1의 변이체, 아이소폼, 및 종 동족체, 및 hPD-L1과 함께 적어도 하나의 공통 에피토프를 갖는 유사체를 포함한다. 완전 hPD-L1 서열은 유전자은행 수탁 번호 Q9NZQ7로 확인될 수 있다.
본원에서 사용되는 "항체" 및 "이의 항원-결합 단편"은 천연 발생 면역글로불린(예를 들어, IgM, IgG, IgD, IgA, IgE, 등)뿐만 아니라, 예를 들어, 단쇄 항체, 키메라 항체(예를 들어, 인간화된 뮤린 항체), 헤테로컨쥬게이트 항체(예를 들어, 이중특이적 항체), Fab', F(ab')2, Fab, Fv, 및 rIgG를 포함하는 비-자연 발생 면역글로불린을 포함한다. 본원에서 사용되는 "항원-결합 단편"은 항원을 특이적으로 인식하는 능력을 보유하는 전장 항체의 부분뿐만 아니라 이러한 부분들의 다양한 조합이다.
본원에서 사용되는 용어 "암"은 신체에서 비정상 세포의 제어되지 않는 성장에 의해 특징되는 다양한 질병의 광범위한 그룹을 지칭한다. 조절되지 않는 세포 분화 및 성장은 이웃하는 조직을 침입하고 또한 림프계 또는 혈류를 통해 신체의 원위 부분으로 전이할 수 있는 악성 종양의 형성을 초래한다. 본원에서 사용되는 "암"은 원발성, 전이성 및 재발성 암을 지칭한다.
본 개시내용은 종양 미세환경 성분들의 조절에 초점을 맞추는 방법으로서, 이에 의해 종양 미세환경에서 면역 억제를 제거하거나 암세포에 대한 면역 체계를 자극시키는 방법을 개발한 것이다. 종양 미세환경은 종양 발생, 종양 진행 및 치료법에 대한 반응에 기여하는 암 생물학의 중요한 양태이다. 종양 미세환경은 대규모의 혼선을 통해 종양 증식, 침습, 및 전이 가능성을 지지하는 악성 세포 및 세포를 포함하는 이종 세포 집단으로 구성된다. 종양 세포는 종종 면역억제성 미세환경을 유도하며, 이는 골수-유래 억제제 세포(MDSC) 및 조절 T 세포(Treg)와 같은 면역 세포의 면역억제 집단의 발달을 선호한다. 이에 따라, 종양 미세환경 내에서의 타겟은 다양한 암 치료법, 특히, 숙주 항종양 면역 반응을 강화시킴으로써 작용하는 면역치료법의 작용을 유도하고 개선시키는 데 도움을 줄 수 있는 것으로 밝혀졌다.
이에 따라, 본 개시내용의 제1 양태는 종양 미세환경에서 면역 억제를 제거하거나 암세포에 대한 면역 체계를 자극시키는 방법으로서, 대상체에 면역 관문 억제제와 결합한 HDAC 억제제 및 NSAID의 약제학적 조합물을 투여하는 것을 포함하는 방법을 제공하는 것이다. 대안적으로, 본 개시내용은 종양 미세환경에서 면역 억제를 제거하거나 암세포에 대한 면역 체계를 자극시키기 위한 약제의 제조에서 HDAC 억제제 및 NSAID의 약제학적 조합물의 용도로서, 약제학적 조합물이 면역 관문 억제제와 함께 투여되는 용도를 제공한다. 대안적으로, 본 개시내용은 종양 미세환경에서 면역 억제를 제거하거나 암세포에 대한 면역 체계를 자극시키기 위한 약제학적 조합물로서, 약제학적 조합물이 HDAC 억제제 및 NSAID를 포함하고, 면역 관문 억제제와 함게 투여되는 약제학적 조합물을 제공한다.
본 개시내용의 제2 양태는 HDAC 억제제, NSAID 및 면역 관문 억제제를 포함하는 약제학적 조합물을 제공하는 것이다.
일 구현예에서, 약제학적 조합물에서 HDAC 억제제, NSAID, 예를 들어, COX-2 억제제 및 면역 관문 억제제의 양은 각각 약 10% 내지 약 70%(w/w), 약 10% 내지 약 70%(w/w) 및 약 0.5% 내지 약 20%이다.
일부 구현예에서, 약제학적 조합물에서 HDAC 억제제의 양은 약 20%(w/w) 내지 약 70%(w/w), 약 30% 내지 약 70%(w/w), 약 40% 내지 약 70%(w/w), 약 20% 내지 약 60%(w/w), 약 30% 내지 약 60%(w/w), 약 40% 내지 약 60%(w/w) 또는 약 35% 내지 약 60%(w/w)의 범위이다.
일부 구현예에서, 약제학적 조합물에서 NSAID의 양은 약 20% 내지 약 70%(w/w), 약 30% 내지 약 70%(w/w), 약 40% 내지 약 70%(w/w), 약 20% 내지 약 60%(w/w), 약 30% 내지 약 60%(w/w), 약 40% 내지 약 60%(w/w) 또는 약 35% 내지 약 60%(w/w)의 범위이다.
HDAC는 세포 순환 진행, 증식 및 아폽토시스에 영향을 미치는 매개된 유전자 발현에 의해 발암성 변형에 관여되는 것으로 나타났다. HDAC는 암, 기생충 및 염증성 질병에 대한 가능한 치료 타겟으로서 조사된다. 효모 히스톤 데아세틸라아제에 보조 도메인의 이의 동족성을 기초로 하여, 18개의 현재 공지된 인간 히스톤 데아세틸라아제는 4개의 그룹(I-IV)으로 분류된다. HDAC1, -2, -3 및 -8을 포함하는 클래스 I은 효모 RPD3 유전자와 관련이 있으며, 클래스 IIA는 HDAC4, -5, -7 및 -9를 포함하며, 클래스 IIB-6, 및 -10은 효모 Hda1 유전자와 관련이 있으며, 시루투인으로서도 알려진 클래스 III은 Sir2 유전자와 관련이 있고, SIRT1-7을 포함하며, 단지 HDAC11을 함유한 클래스 IV는 클래스 I 및 클래스 II 둘 모두의 특징을 갖는다.
본 개시내용의 일 구현예에서, HDAC 억제제는 클래스 I HDAC 억제제이다. 바람직하게, HDAC 억제제는 클래스 I HDAC의 선택적 억제제이다. 일부 구현예에서, HDAC 억제제는 벤즈아미드 클래스의 히스톤 데아세틸라아제(HDAC) 억제제이다. 일부 구현예에서, HDAC 억제제는 키다미드, 보리노스타트, 로미뎁신, 파노비노스타트, 벨리노스타트, 파노비노스타트, 발프로산, 모세티노스타트, 아벡시노스타트, 엔티노스타트, 프라시노스타트, 레스미노스타트, 기비노스타트 및 퀴시노스타트를 포함하지만, 이로 제한되지 않는다. 일부 구현예에서, HDAC 억제제는 키다미드, 엔티노스타트, 또는 모세티노스타트이다.
NSAID는 통증을 줄이고, 열을 감소시키고, 더 높은 용량에서, 염증을 감소시키는 약물의 부류이다. 대부분의 NSAID는 시클로옥시게나아제-1(COX-1) 및 시클로옥시게나아제-2(COX-2)의 활성을 억제하고, 이에 의해 트롬복산 및 프로스타글란딘의 합성을 억제한다. COX-2를 억제하면 항염증, 진통 및 해열 효과를 야기시키는 반면, 또한 COX-1을 억제하는 그러한 NSAID, 특히 아스피린이 대용량에서 위장 출혈 및 궤양을 야기시킬수 있을 것으로 사료된다. COX-2 억제제는 자가면역 및 염증 질병을 치료하게 위해 널리 사용된다. 2가지의 아이소폼, 즉, COX-1 및 COX-2를 갖는 시클로옥시게나아제(COX)는 프로스타그란딘 D2(PGD2), PGE2, PGF2α, 프로스타시클린 PGI2 및 트롬복산 TXA2로 이루어진 프로스타노이드의 생활성 지질의 합성에서 속도-결정 단계의 원인이 되는 효소이다. COX-1은 항상성 프로스타노이드를 유지시키기 위해 신체 조직에서 지속적으로 발현되고, 혈관신생, 혈관확장 및 조직 유지와 같은 여러 생물학적 기능에 관여한다. 그러나, COX-2는 정상 조건에서 낮은 수준으로 발현된다. COX-2는 전-염증성 과정을 개시하기 위해 감염, 손상 및 통증과 같은 자극에 의해 빠르게 유도된다. 선택적 COX-2 억제제는 비스테로이드성 항-염증 약물(NSAID)의 하나의 타입이다.
일부 구현예에서, NSAID는 아스피린, 이부프로펜, 인도메타신, 나프록센 및 COX-2 억제제를 포함하지만, 이로 제한되지 않는다. 본 발명의 일부 구현예에서, NSAID는 COX2 억제제이다. 일부 구현예에서, COX2 억제제는 셀레브렉스(Celebrex)(일반명은 셀레콕시브임), 로페콕시브 및 에토리콕시브를 포함하지만, 이로 제한되지 않는다. 바람직하게, COX2 억제제는 셀레콕시브이다.
일 구현예에서, 면역 관문 억제제는 암세포에 대한 면역 체계를 자극시키고 암을 치료하기 위해 본원에 기술된 약제학적 조합물과 함께 사용될 수 있다. 본 개시내용에서 사용하기에 적합한 면역 관문 억제제는 PD-1을 억제하는 억제 수용체의 길항체, CTLA-4, T 세포 면역글로불린-3, B 및 T 림프구 감쇠자, T 세포 활성화 또는 림프구-활성화 유전자 3 경로의 V-도메인 Ig 억제제, 예를 들어, 항-PD-1 항체, 항-PD-L1 항체, 항-CTLA-4 항체, 항-TIM-3(T 세포 면역글로불린-3) 항체, 항-BTLA(B 및 T 림프구 감쇠자) 항체, 항-VISTA(T 세포 활성화의 V-도메인 Ig 억제제) 항체 및 항-LAG-3(림프구-활성화 유전자 3) 항체를 포함한다. PD-1 또는 PD-L1 억제제의 예는 비제한적으로, 인간 PD-1을 차단하는 인간화된 항체, 예를 들어, 람브롤리주맙(항-PD-1 Ab, 상표명 Keytruda) 또는 피딜리주맙(항-PD-1 Ab), 바벤시오(Bavencio)(항-PD-L1 Ab, 아벨루맙), 임핀지(Imfinzi)(항-PD-L1 Ab, 두르발루맙), 및 테센트리크(Tecentriq)(항-PD-L1 Ab, 아테졸리주맙)뿐만 아니라, 전체 인간 항체, 예를 들어, 니볼루맙(항-PD-1 Ab, 상표명 Opdivo) 및 세미플리맙-rwlc(항-PD-1 Ab, 상표명 Libtayo)를 포함한다. 다른 PD-1 억제제는 비제한적으로, B7-DC-Ig 또는 AMP-244로도 공지된 PD-L2 Fc 융합 단백질 및 현재 치료법에서 사용하기 위한 연구 및/또는 개발 중인 다른 PD-1 억제제를 포함하는 가용성 PD-1 리간드의 설명을 포함할 수 있다. 또한, 면역 관문 억제제는 비제한적으로, PD-L1을 차단하는 인간화된 또는 전체 인간 항체, 예를 들어, 두르발루맙 및 MIH1, 및 현재 연구 중인 다른 PD-L1 억제제를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 면역 관문 억제제의 양은 약 0.5%(w/w) 내지 약 15%(w/w), 0.5%(w/w) 내지 약 10%(w/w), 0.5%(w/w) 내지 약 5%(w/w), 1.0%(w/w) 내지 약 20%(w/w), 1.0%(w/w) 내지 약 15%(w/w), 1.0%(w/w) 내지 약 10%(w/w) 또는 1.0%(w/w) 내지 약 5%(w/w)의 범위이다.
일 구현예에서, 본원에 기술된 조합물은 비구아니드 화합물을 포함한다. 일부 구현예에서, 비구아니드 화합물의 양은 약 30% 내지 약 70%(w/w), 약 30% 내지 약 60%(w/w), 약 30% 내지 약 50%(w/w), 약 50% 내지 약 80%(w/w), 약 60% 내지 약 80%(w/w) 또는 약 60% 내지 약 70%(w/w), 40% 내지 약 70%(w/w), 약 40% 내지 약 60%(w/w) 또는 약 40% 내지 약 50%(w/w)의 범위이다.
비구아니드는 화학식 HN(C(NH)NH2)2를 갖는 유기 화하물이다. 다양한 비구아니드의 유도체는 약제학적 약물로서 사용된다. 용어 "비구아니드"는 종종 특별히 진성 당뇨병 또는 전당뇨병 치료를 위해 사용되는 경구 항고혈당 약물로서 기능하는 부류의 약물을 지칭한다.
본 개시내용의 일부 구현예에서, 비구아니드 화합물은 메트포르민, 펜포르민, 프로구아닐 및 클로르프로구아닐을 포함하지만, 이로 제한되지 않는다. 바람직하게, 비구아니드 화합물은 메트포르민이다.
일 구현예에서, HDAC 억제제 및 NSAID의 약제학적 조합물은 면역 관문 억제제와 동시에 또는 순서대로 또는 교대로 순차적으로 투여된다. 본 개시내용의 일부 구현예에서, HDAC 억제제, NSAID, 면역 관문 억제제 및 비구아니드 화합물은 동시에 투여된다. 일부 구현예에서, HDAC 억제제, NSAID, 면역 관문 억제제 및 비구아니드 화합물은 순서대로 또는 교대로 순차적으로 투여된다.
추가 구현예에서, 본 방법은 하나 이상의 추가적인 항암제를 투여하는 것을 추가로 포함한다. 추가적인 항암제는 본원에 기술되거나 당해 분야에 공지된 임의의 항암제이다. 일 구현예에서, 추가적인 항암제는 화학요법 또는 백금-기반 더블렛 화학요법이다. 특정 구현예에서, 추가적인 항암제는 티로신 키나아제 억제제(TKI)이다. 일 구현예에서, 추가적인 항암제는 항-VEGF 항체이다. 다른 구현예에서, 항암제는 백금 작용제(예를 들어, 시스플라틴, 카보플라틴), 유사분열 억제제(예를 들어, 파클리탁셀, 알부민-결합 파클리탁셀, 도세탁셀, 탁소테레, 도세카드), 불화된 빈카 알칼로이드(예를 들어, 빈플루닌, 자브로), 비노렐빈, 빈블라스틴, 에토포시드, 또는 페메트렉세드 겜시타빈이다. 일 구현예에서, 추가적인 항암제는 5-플루로우라실(5-FU)이다. 특정 구현예에서, 추가적인 항암제는 당해 분야에 공지된 임의의 다른 항암제이다.
본 발명의 약제학적 조합물은 "담체"와 함께 제형화될 수 있다. 본원에서 사용되는 "담체"는 임의의 용매, 분산 매질, 비히클, 코팅, 희석제, 항박테리아제 및/또는 항진균제, 등장제, 흡수 지연제, 완충제, 담체 용액, 현탁액, 콜로이드, 등을 포함한다. 약제학적 활성 물질을 위한 이러한 매질 및/또는 제제의 사용은 당해 분야에 널리 공지되어 있다. 예를 들어, 약제학적 조합물은 하기를 위해 구성된 것을 포함하는 고체 또는 액체 형태로의 투여를 위해 특별히 제형화될 수 있다: (1) 경구 투여, 예를 들어, 드렌치(drench)(수성 또는 비-수성 용액 또는 현탁액), 로젠지, 당과, 캡슐, 환제, 정제(예를 들어, 협측, 설하 및 전신 흡수를 위해 타겟화된 것), 볼루스, 분말, 과립, 혀에 적용하기 위한 페이스트; (2) 비경구 투여, 예를 들어, 피하, 근육내, 정맥 또는 상피 주사에 의한 비경구 투여, 예를 들어, 멸균 용액 또는 현탁액, 또는 지연-방출 제형으로서; (3) 국소 적용, 예를 들어, 피부에 적용된 크림, 로션, 겔, 연고, 또는 제어-방출 패치 또는 스프레이; (4) 질내로 또는 직장내로, 예를 들어, 질 좌약, 크림, 좌제 또는 포움으로서; (5) 설하로; (6) 안구로; (7) 경피로; (8) 점막경우로; 또는 (9) 비강내로.
추가 양태에서, 본 발명은 대상체에서 암을 치료하는 방법으로서, 본 발명의 약제학적 조합물을 대상체에 투여하는 것을 포함하는 방법을 제공한다.
일부 구현예에서, 암은 교모세포종, 간암(예를 들어, 간세포 암종), 대장 암종, 교모세포종, 위암, 대장암, 식도암, 폐암(예를 들어, 비소세포 폐암(NSCLC) 및 소세포 폐암), 췌장암, 신세포 암종, 양성 전립선 비대증, 전립선암, 난소암, 흑색종, 유방암, 만성 림프성 백혈병(CLL), 머켈 세포 암종, 비호지킨 림프종, 급성 골수성 백혈병(AML), 담낭암, 담관암종, 비뇨기 방광암, 및 자궁암을 포함하지만, 이로 제한되지 않는다.
일부 구현예에서, 본 발명의 약제학적 조합물은 단일 제형으로 제공될 수 있다. 다른 구현예에서, 본 발명의 약제학적 조합물은 별개의 제형으로 제공될 수 있다. 약제학적 조합물은 하나 이상의 바람직한 투여 경로에 대해 조정된 다양한 및/또는 복수의 형태로 제형화될 수 있다. 이에 따라, 약제학적 조합물은 예를 들어, 경구, 비경구(예를 들어, 피내, 경피, 피하, 근육내, 정맥내, 복강내, 등), 또는 국소(예를 들어, 비강내, 폐내, 유방내, 질내, 자궁내, 피내, 경피, 직장내, 등)를 포함하는 하나 이상의 공지된 경로를 통해 투여될 수 있다. 약제학적 조합물, 또는 이의 부분은 예를 들어, 비강 또는 호흡 점막에 (예를 들어, 스프레이 또는 에어로졸에 의해) 투여함으로써 점막 표면에 투여될 수 있다. 약제학적 조합물, 또는 이의 부분은 또한, 지속 또는 지연 방출을 통해 투여될 수 있다.
제형은 보편적으로 단위 투약 형태로 제공될 수 있고, 제약 분야에서 널리 공지된 방법에 의해 제조될 수 있다. 약제학적으로 허용되는 담체와 함께 조합물을 제조하는 방법은 본 발명의 약제학적 조합물을 하나 이상의 보조 구성성분을 구성하는 담체와 결합시키는 단계를 포함한다. 일반적으로, 제형은 활성 화합물을 액체 담체, 미분된 고체 담체, 또는 둘 모두와 균일하게 및/또는 친밀하게 결합시키고, 이후에, 필요한 경우에, 생성물을 요망되는 제형으로 형상화시킴으로써 제조될 수 있다.
일부 구현예에서, 본 방법은 대상체에 예를 들어, 약 10 ㎎/㎏ 내지 약 1,000 ㎎/㎏의 용량을 제공하기에 충분한 양의 약제학적 조합물을 투여하는 것을 포함할 수 있다.
본 발명은 하기 실시예에 의해 예시된다. 특정 실시예, 물질, 양, 및 절차가 본원에 기술된 바와 같은 본 발명의 범위 및 사상에 따라 넓게 해석되는 것으로 이해되어야 한다.
실시예
물질 및 방법
시약. Gibco RPMI 1640 및 L-글루타민을 갖는 DMEM은 Invitrogen Life Technologies로부터 구매된 것이다. HyClone FBS는 Thermo Scientific으로부터 구매된 것이다. 키다미드는 GNTbm로부터 제공되었다. 엔티노스타트, 모세티노스타트, 아스피린, 이부프로펜, 셀레콕시브 및 메트포르민은 Cayman Chemical(Ann Arbor, MI)로부터 구매된 것이다. 하기 항체 및 시약은 동물 실험을 위해 사용되었다: 마우스 항-PD-L1(B7-H1) 모노클로날 항체(10F.9G2; Bio X Cell), 마우스 항-PD-1(CD279) 모노클로날 항체(RMP1-14; Bio X Cell), 마우스 항-CTLA4 (CD152) 모노클로날 항체(BE0164; Bio X Cell), 및 랫트 항-IgG2a 아이소타입 대조 모노클로날 항체(2A3; Bio X Cell).
세포주. JC(CRL-2116; 뮤린 유방 종양 세포) 및 CT26(CRL-2638; 뮤린 대장 선암)은 ATCC로부터 구매된 것이다. 두 종양 세포주 모두는 37℃, 5% CO2에서 10%(vol/vol) FBS가 보충된 McCoy' 5A에서 성장되었다.
동물 모델에서 항암 활성. 동물 연구는 대만 의학 대학교 연구소 동물 관리 및 사용 위원회(The Taipei Medical University Institutional Animal Care and Use Committee: TMU IACUC)에 의해 승인되고 감독되었다. 6주령 내지 8주령의 수컷 BALB/C 마우스(BioLASCO Taiwan)는 모든 동물 실험을 위해 사용되었다. JC(1 × 107), 또는 CT26(5 × 106 내지 1 × 107) 암세포는 s.c.에 의해 각 마우스의 우측 옆구리에 접종되었다. 종양은 무작위화 및 치료 전에 11일 동안 성장되었다(종양 크기 약 200 내지 300 ㎣). CT26-보유 및 JC-보유 마우스에는 종양 이식 후 11, 14, 17, 20, 23, 및 26일째에 i.p.로 10 또는 2.5 ㎎/㎏의 항-IgG, 항-PD-1 및/또는 항-PD-L1 및 항-CTLA-4(2.5 ㎎/㎏) 항체가 제공되었으며, 모든 항체는 100 ㎕의 멸균 PBS(pH 7.4)(Invitrogen Life Technologies)에서 적절한 농도로 희석되었다. 셀레콕시브, 키다미드, 메트포르민, 모세티노스타트, 엔티노스타트, 아스피린, 및 이부프로펜 치료는 종양 이식후 11일째에 경구로 투여되었다. 셀레콕시브(12.5, 25.0, 및 50 ㎎/㎏) 또는 메트포르민(100 또는 200 ㎎/㎏)으로의 매일 치료는 11일째에서 26일째까지 수행되었다. 키다미드는 6.25, 12.5, 25, 및 50 ㎎/㎏의 용량으로 또는 단일 용량으로서 종양 보유 마우스를 치료하기 위해 투여되었다. 키다미드는 11일째에서 26일째까지 매일 경구 투여되었다. 엔티노스타트는 11일째에서 25일째까지 격일로 20 ㎎/㎏의 용량으로 경구 투여되었다. 모세티노스타트는 11일째에서 26일째까지 30 ㎎/㎏ 용량의 매일 치료로 경구 투여되었다. 아스피린 및 이부프로펜은 11일째에서 26일째까지 50 ㎎/㎏ 용량의 매일 치료로 경구 투여되었다. 항암 활성은 종양 성장의 치료 개시로부터 종양 부피가 3,000 ㎣에 도달할 때까지 측정되었다. 종양 부피는 길이 × 폭2 × 0.5로서 계산되었다.
동물 모델에서 생존율. 항체 또는 약물의 투여는 11일 내지 25일 또는 26일에 수행되었다. 종양 보유 마우스에서 종양이 계속 성장하였다. 마우스의 종양 부피는 3일에 1번씩 측정되었다. 종양 부피가 3,000 ㎣에 도달하였을 때 종양 보유 마우스는 죽은 것으로 간주되었다. 모든 치료 그룹이 기록되고 분석되었다.
생체내 이종이식 실험. 동물 연구는 대만 의과 대학 연구소 동물 관리 및 사용 위원회(TMU IACUC)에 의해 승인되고 감독되었다. 누드 BALB/c 마우스(6주령, 암컷, 20 g 체중)를 BioLASCO(Taiwan)로부터 구매하였고, 병인원-부재 조건 하에서 유지시켰다. 5×106개 세포의 150 ㎕ CT26 세포를 주사함으로써 마우스 CT26 이종이식 종양 모델을 개발하였다. CT26 암세포를 각 마우스의 우측 옆구리 내에 s.c.로 접종하였다. 종양 세포를, 무작위화 및 치료 전에 종양 크기가 350 내지 400 ㎣에 도달한 직후에 2주 동안 성장하였다. 19마리의 누드 마우스를 5개의 그룹 및 치료로 분류하였다. 시험 동물은 대조군으로서 항-IgG Ab 2.5 ㎎/㎏, 키다미드 50 ㎎/㎏ 플러스 셀레콕시브 50 ㎎/㎏ 및 메트포르민 100 ㎎/㎏과 결합한 항-PD-L1 Ab 2.5 ㎎/㎏, 셀레콕시브 50 ㎎/㎏ 및 메트포르민 100 ㎎/㎏과 결합한 키다미드 50 ㎎/㎏, 키다미드 50 ㎎/㎏, 및 셀레콕시브 50 ㎎/㎏을 수용하였다. 치료 과정은 모든 BALB/C 마우스에 대해 유사하였다. 항암 활성을 종양 성장의 치료의 개시에서부터 희생하기 위해 29일까지 측정하고, 종양을 계량하였다. 종양 부피룰 길이 × 폭2 × 0.5로서 계산하였다.
유세포분석. 하기 항체 및 시약을 유세포분석을 위해 사용하였다: CD3 APC(17A2; Biolegend), CD4 PE(GK1.5; Biolegend), CD8a PerCP(53-6.7; ; Biolegend), CD25 PerCP(PC61; Biolegend), Foxp3 PE(MF-14; Biolegend), CD11b APC(M1/70; Biolegend), Ly-6C PerCP(HK1.4; Biolegend), Ly-6G PE(1A8; BioLegend), CD45 FITC(30-F11; Biolegend), MHCII(M5/114.15.2; eBioscience). 유세포분석을 BD FACSCalibur™(BD Biosciences)로 수행하였고, 데이터를 FACSDiva 소프트웨어(BD Biosciences)로 분석하였다. 순환하는 골수성 유래 억제제 세포(MDSC) 집단 및 림프성 유래 T 세포의 수준을 평가하기 위하여, 혈액 샘플을 키다미드(50 ㎎/㎏) 플러스 셀레콕시브(50 ㎎/㎏)와 함께 또는 이의 없이 항-PD-1 항체(2.5 ㎎/㎏) 치료의 개시 후 8일 및 12일자에 마우스로부터 채혈하였다. 150 마이크로리터의 혈액을 우측 또는 좌측 얼굴 정맥으로부터 엔펜도르프(Eppendorf) 튜브에서 수집하였다. 항응고화된 혈액 샘플로부터의 RBC를 바로, 3분 동안 2 mL의 1× BD FACS Lyse(BD Biosciences)를 사용하여 용해시키고, 샘플을 얼음-냉각된 BD FACS 완충제(BD Biosciences)에서 2회 세척하였다. 샘플을 적절한 항체로 염색하였다. 분석을 위하여, 본 발명자는 PMN-MDSC: CD45+CD11b+Ly6G+Ly6Clow 세포, M-MDSC: CD45+CD11b+Ly6G-Ly6C+ 세포, CD4+ T-세포: CD45+CD3+CD4+ 세포, CD8+ T-세포: CD45+CD3+CD8+ 세포, Treg 세포: CD45+CD3+CD25+ FOXP3+ 세포, TAM 세포: CD45+CD11b+MHCII+ 세포로서 이러한 세포의 이전에 확립된 표현형 기준을 사용하였으며, 전체 CD45+ 세포를 공통 분모로서 사용하였다. 다른 한편으로, 종양내 CD8+ 및 조절 T-세포(Treg) 집단의 수준을 평가하기 위하여, 림프구를 먼저 키다미드(50 ㎎/㎏) 플러스 셀레콕시브(50 ㎎/㎏)와 함께 또는 이의 없이 항-PD-1 항체(2.5 ㎎/㎏) 치료의 개시 후 8일째에 마우스로부터 절제한 종양 샘플로부터 정제하였다. 간단하게, 1차 종양 조직을 수확하고, 계량하고, 미세한 단편으로 절단하였다. 마우스 종양 해리 키트(Cat: 130-096-730)를 이용하였다. 3가지 효소를 200 mg의 종양 조직 당 1 mL의 비율로 각 샘플에 첨가하였다. 샘플을 엔드-오버-엔드 쉐이커(end-over-end shaker) 상에서 37℃에서 120분 동안 인큐베이션하였다. 얻어진 조직 균질물을 0.4 ㎛ 여과하고, 얼음-냉각 PBS에서 3회 세척하고, 샘플 당 1 × 106개의 세포를 항체 라벨링을 위해 사용하였다. CD8+ T-세포 수준을 CD45+CD3+CD8+의 이전에 확립된 표현형 기준을 이용하여 평가하고, 전체 CD45+CD3+ 세포를 공통 분모로서 사용하였다. Treg 세포 수준을 CD45+CD3+CD25+FOXP3+의 이전에 확립된 표현형 기준을 이용하여 평가하고, 전체 CD45+ CD3+ 세포를 공통 분모로서 사용하였다.
통계. 평균 및 표준오차는 적어도 4개의 독립적인 실험으로부터 모든 데이터 포인트에 대해 계산되었다. 각 실험 조건과 IgG 대조군 간의 종양 크기의 쌍별 비교는 스튜던트 2-샘플 t-테스트(Systat Software, San Jose, CA, USA)를 이용하여 수행되었다.
실시예 1: 항-PD-1 항체의 효과
CT-26 결장 암세포-보유 BALB/c 마우스 상에 항-PD-1 항체의 항암 활성을 이해하기 위하여, 항-PD-1 항체를 종양 이식 후 11, 14, 17, 20, 23, 및 26일째에 10 ㎎/㎏의 항-PD-1 및/또는 항-IgG 항체로 CT26-보유 마우스 내에 i.p.로 투여하였다. 종양 크기가 대략 200 내지 300 ㎣까지 성장하였을 때 실험을 개시하였다. 반응 속도를 여러 검정에 의해 평가하였다. 본 연구에서, 본 발명자는 부분 반응(PR, 치료의 종료 시에 종양 보유 마우스에서 ≤ 2배의 종양 성장); 안정한 질병(SD, 치료의 종료 시에 종양 보유 마우스에서 2배 내지 5배의 종양 성장); 진행성 질병(PD, 치료의 종료 시에 종양 보유 마우스에서 5배 이상의 종양 성장)을 규정하였다. 일반적으로, 10배 내지 15배 이상의 종양 성장(약 3,000 ㎣)은 대조군에서 발견되었다. 항-PD-1 항체는 대조군(항-IgG 그룹으로 처리됨)과 비교하여 종양 성장을 유의미하게 억제하였다(도 1A 참조). 대조군의 종양 크기가 대략 3,000 ㎣에 도달하였을 때, 항-PD-1 항체 그룹의 종양 크기는 대략 1,200 ㎣까지 성장하였다(도 1A). 그러나, 항-PD-1 항체는 단지 짧은 시간 동안 종양 성장을 억제하였다. 이후에, 종양은 계속 성장하였다. 항-PD-1 항체 그룹에서, SD는 3마리의 마우스에서 관찰되었으며, PD는 3마리의 마우스에서 관찰되었다(도 1B 참조).
실시예 2: 항-PD-1 항체와 함께 후생적 조절제의 효과
항-PD-1 항체와 함께 키다미드 또는 엔티노스타트의 항암 활성을 CT26 종양 세포 보유 마우스에서 평가하였다. 키다미드 또는 엔티노스타트를 각각 25 ㎎/㎏ 및 20 ㎎/㎏의 용량으로 CT26-보유 마우스에 경구 투여하였다. 키다미드를 매일 투여하였으며, 엔티노스타트를 격일로 투여하였다. 항-PD-1 항체와 함께 키다미드 또는 엔티노스타트는 항-PD-1 항체 단독보다 더욱 강력한 항암 활성을 나타내었다(도 1A). 항-PD-1 항체와 함께 키다미드는 키다미드 단독 보다 종양 성장을 억제하는 데 더욱 효과적이었다. 이의 결과는, 한 마리의 마우스가 PR을 달성하였고, SD가 3마리의 마우스에서 관찰되었으며, PD가 항-PD-1 항체와 함께 키다미드의 그룹에서 한 마리의 마우스에서 관찰됨을 나타낸다(도 1B). 그러나, 항-PD-1 항체 그룹과 함께 엔티노스타트는 항-PD-1 항체 그룹과 함께 키다미드에 비해 종양 성장을 억제하는 데 더욱 효능을 나타낸다(도 1B). 모든 그룹에서, 마우스는 체중이 상실되었다(도 1C). 생존율을 종양 보유 마우스 모델에서 평가하였다. 종양 크기가 대략 3,000 ㎣에 도달하였을 때 생존율을 평가하였다. 모든 약물을 11일 내지 26일째에 투여하였다. 결과는, 항-PD-1 항체 그룹과 함께 키다미드가 42일째에 40% 생존율을 가졌으며, 항-PD-1 항체 그룹 및 항-PD-1 항체 그룹과 함께 엔티노스타트가 각각 약 33% 및 71%의 생존율을 가짐을 나타낸다(도 1D).
실시예 3: 메트포르민 및 항-PD-1 항체와 결합한 키다미드의 효과
100 ㎎/㎏의 메트포르민을 종양 보유 마우스에 경구 투여하였다. 결과는, 종양 성장이 대조군과 비교하여 현저하게 억제함을 나타낸다(도 2A 참조). 메트포르민 그룹에서, SD는 한 마리의 마우스에서 관찰되었으며, PD는 5마리의 마우스에서 관찰되었다(도 2B). 항-PD-1 항체 그룹과 결합한 엔토스타트(양성 대조군)에서, 3마리의 마우스는 PR을 달성하였으며, SD는 한 마리의 마우스에서 관찰되었으며, PD는 3마리의 마우스에서 관찰되었다(도 2B). 도 2A에 도시된 바와 같이, 항-PD-1 항체와 결합한 더 높은 용량(50 ㎎/㎏)의 키다미드는 항-PD-1 항체와 결합한 낮은 용량(12.5 ㎎/㎏)의 키다미드보다 낮은 항암 활성을 갖는다. 항-PD-1 항체와 결합한 12.5 ㎎/㎏의 키다미드로의 치료는 항-PD-1 항체와 결합한 25 또는 50 ㎎/㎏의 키다미드보다 종양 성장을 억제하는 데 더욱 강력하였다(도 2B). 항-PD-1 항체 그룹과 결합한 12.5 ㎎/㎏ 키다미드에서, SD는 두 마리의 마우스에서 관찰되었으며, PD는 4마리의 마우스에서 관찰되었다. 그러나, 키다미드 용량의 증가는 항암 활성을 상승시키지 못하였다(도 2B). 2개의 그룹, 항-PD-1 항체와 결합한 키다미드(50 ㎎/㎏) 및 항-PD-1 항체와 결합한 키다미드(50 ㎎/㎏) 플러스 메트포르민(100 ㎎/㎏)을 시험하였으며, 결과는 도 2B에 도시되어 있다. 결과는, 메트포르민 및 항-PD-1 항체와 결합한 키다미드로의 치료가 항-PD-1 항체와 결합한 키다미드로의 치료보다 종양 성장을 억제하는 데 더욱 강력함을 나타낸다. 도 2B에 도시된 바와 같이, 2마리의 마우스는 PR을 달성하였으며, SD는 한 마리의 마우스에서 관찰되었으며, PD는 2마리의 마우스에서 관찰되었다. 처리 그룹에서의 마우스는 체중이 상실되었다(도 2C 참조). 다음으로, 처리 그룹에서의 마우스의 생존율은 58일에 결정되었다. 도 2D에 도시된 바와 같이, 약물 치료는 30일에 중지하였다. 메트포르민 및 항-PD-1 항체와 결합한 키다미드(50 ㎎/㎏)로의 치료는 종양 성장의 더욱 강력한 억제를 경험하였고, 다른 조합물 치료와 비교하여 생존율을 유의미하게 증가시켰다. 메트포르민 및 항-PD-1 항체 그룹과 결합한 키다미드(50 ㎎/㎏)에서, 생존율은 60%까지 증가하였으며, 양성 대조군(항-PD-1 Ab과 결합한 엔티노스타트)은 단지 대략 20%의 생존율을 가졌다. 항-PD-1 항체(10 ㎎/㎏)와 결합한 키다미드(50 ㎎/㎏)는 종양 성장을 중지시키지 못하였다. 그러나, 조합물에 메트포르민(100 ㎎/㎏)을 첨가한 후에, 억제 활성 및 생존율은 증가하였다. 결과는, 메트포르민이 종양 미세환경에서 탄수화물 대사물에 영향을 미칠 수 있고, 이에 따라, 면역 관문 억제제 항암 활성을 개선한다는 것을 시사한다(도 2D).
실시예 4: 항-PD-1 항체와 결합한 키다미드 또는 엔티노스타트 + 메트포르민 + 셀레콕시브의 효과
키다미드 + 메트포르민 + 셀레콕시브 + 항-PD-1 항체 또는 엔티노스타트 + 메트포르민 + 셀레콕시브 + 항-PD-1 항체로의 치료는 셀레콕시브 없는 치료보다 종양 성장을 억제하는 데 더욱 강력하였다(도 3A). 엔티노스타트 그룹은 키다미드 그룹보다 더욱 강력하다. 그러나, 후생적 조절제 부재 하에, 항-PD-1 항체와 결합한 메트포르민 + 셀레콕시브의 치료 그룹은 감소된 항암 활성을 나타내었다. 치료 그룹에서의 마우스는 체중이 전혀 상실되지 않았다(도 3C). 또한, 도 3B는 치료 그룹에서의 모든 마우스에서 종양 성장을 나타낸다. 이러한 결과는, 항-PD-1 항체와 결합한 엔티노스타트 + 메트포르민, 및 항-PD-1 항체와 결합한 엔티노스타트 + 셀레콕시브가 높은 백분율의 PR을 달성하는 데 매우 강력함을 나타낸다. 셀레콕시브는 메트포르민보다 종양 미세환경에서의 항-종양에서 더욱 중요한 역할을 한다(도 3B). 항-PD-1 항체와 결합한 키다미드 + 메트포르민 또는 항-PD-1 항체와 결합한 키다미드 + 셀레콕시브는 유사한 결과를 나타내며, 이는 높은 백분율의 PR을 달성한다. 그러나, 키다미드 또는 엔티노스타트의 부재 하에서, 면역 관문 억제제-치료 그룹에서의 항암 활성은 감소한다(도 3B). 결과는, 면역 관문 억제제가 항암 활성을 개선시키기 위해 후생적 조절제와 결합할 필요가 있음을 시사한다. 개선은 메트포르민 및 셀레콕시브에 의한 종양 미세환경의 탄수화물 대사산물 및 PGE2 생산의 조절로부터 야기될 수 있으며, 이에 따라, 이는 CT26 종양 보유 마우스의 유의미하게 증가된 반응 속도를 야기시킬 것이다. 또한, 항-PD-1 항체 그룹과 결합한 엔티노스타트 또는 키다미드 + 메트포르민 + 셀레콕시브의 생존율은 약 60 내지 80%까지 증가한다. 그러나, 키다미드/엔티노스타트의 부재 하에서, 생존율은 감소하였다(도 3D에서 항-PD-1 항체 그룹과 결합한 메트포르민 플러스 셀레콕시브 참조). 생존율과 관련하여, 셀레콕시브는 메트포르민과 비교하여 증가된 생존율을 나타낸다(도 3D). 본 발명자는, 셀레콕시브 단독 또는 메트포르민과 결합한 셀레콕시브가 항암 활성을 증가시키는 데 항-PD-1 항체와 결합한 클래스 I HDAC 억제제의 효과를 상승화시키는 데 중요한 인자임을 발견하였다. 면역 관문 억제제와 결합한 클래스 I HDAC 억제제 + 메트포르민 + 셀레콕시브의 조합물은 종양 보유 마우스 모델에서 암을 치료하는 이의 능력의 조짐을 나타낸다.
다음으로, 키다미드의 최적의 반응 용량이 결정되었다. 도 4A에 도시된 바와 같이, 고정 용량의 항-PD-1 항체(10 ㎎/㎏), 다양한 용량의 키다미드(12.5, 25.0, 및 50 ㎎/㎏), 다양한 용량의 셀레콕시브(25 및 50 ㎎/㎏), 및 다양한 용량의 메트포르민(100 및 200 ㎎/㎏)으로의 상이한 치료 요법으로의 치료를 CT26 종양 세포 보유 마우스에서 수행하였다. 이러한 치료 그룹에서의 모든 마우스의 종양 성장은 항-PD-1 그룹 또는 비히클 그룹(항-IgG 그룹)과 비교하여 유의미하게 억제된다. 도 4B에 도시된 바와 같이, 종양 성장은 모든 치료 그룹에서 억제된다. 항-PD-1 항체와 결합한 키다미드의 그룹은 단지 항-PD-1 항체로의 치료보다 종양 성장에 있어서 더욱 강력한 억제를 나타낸다. 또한, 항-PD-1 항체와 결합한 키다미드(12.5 ㎎/㎏) 플러스 셀레콕시브(25 ㎎/㎏) 및 메트포르민(100 ㎎/㎏)의 요법은 약 33%(2마리의 마우스는 PR을 달성함)의 PR 비율을 달성하였고, 항-PD-1 항체와 결합한 키다미드(12.5 ㎎/㎏)보다 종양 성장을 억제하는 데 더욱 활성적이다. 그러나, PR은 항-PD-1 항체와 결합한 키다미드(12.5 ㎎/㎏)의 그룹에서 발견되지 않았다. 결과는 셀레콕시브 및 메트포르민이 면역 관문 억제제로의 치료에서 반응 속도를 상승시키는 데 중요한 역할을 함을 시사한다. CT26 종양 세포 보유 마우스의 반응 속도를 분석하기 위해 다양한 용량의 키다미드를 유사한 요법으로 시험하였다. 결과는, 키다미드의 경우에 50 ㎎/㎏ 용량이 종양 성장을 억제하는 데 최적이고, 항-PD-1 항체 그룹과 결합한 키다미드(50 ㎎/㎏) 플러스 셀레콕시브(25 ㎎/㎏) 및 메트포르민(100 ㎎/㎏)의 치료 요법에서 높은 비율의 PR(약 50%) 및 SD(약 33%)를 가짐을 나타낸다. 결과는, 키다미드가 치료 효과를 달성하는 데 중요한 인자임을 시사한다. 다음으로, 셀레콕시브의 최적의 용량이 결정되었다. 결과는 50 ㎎/㎏ 용량의 셀레콕시브가 치료 그룹에서 각 마우스에서의 종양 성장을 억제하기 위해 25 ㎎/㎏에서보다 더욱 활성적임을 나타낸다(도 4B). 그러나, 면역 관문 억제제는 매우 낮은 반응 속도를 갖는다. 본 발명자는 놀랍게도, 50 ㎎/㎏의 셀레콕시브가 면역요법에서 반응 속도를 상향-조절할 수 있다는 것을 발견하였다. 또한, 메트포르민의 최적 용량이 결정되었다. 100 또는 200 ㎎/㎏ 용량의 요법이 항암 활성에서 차이를 나타내지 않는다는 것이 발견되었다(도 4B). 이러한 데이터는 키다미드 및 셀레콕시브가 면역 관문 억제제와 결합한 메트포르민보다 더욱 중요함을 시사한다. 도 4C에 도시된 바와 같이, 어떠한 치료 그룹에서의 마우스에도 체중이 상실되지 않았다. 도 4D는 치료 그룹에서의 마우스의 생존율을 도시한 것이다. 이러한 데이터는, 항-PD-1 항체(10 ㎎/㎏)와 결합한 키다미드(50 ㎎/㎏) 플러스 셀레콕시브(25 ㎎/㎏) 및 메트포르민(100 ㎎/㎏)의 요법이 최상의 조합물로서, 이러한 것이 종양 성장을 억제하는 강력한 능력을 가지고 생존율을 최대 약 50%까지 상승함을 시사한다. 다른 그룹의 생존율은 또한 항-PD-1 항체 그룹 단독과 비교하여 증가하였다. 항-PD-1 항체(10 ㎎/㎏)와 결합한 50 ㎎/㎏에서의 키다미드 플러스 셀레콕시브 25 ㎎/㎏ 및 메트포르민 100 ㎎/㎏이 생체내 실험에서 이러한 것에서 최적의 요법이지만, 50 ㎎/㎏의 셀레콕시브는 또한 항암 활성에 더 큰 기여를 제공하고, 또한, CT26 종양 세포 보유 마우스에서 생존율을 증가시킨다.
실시예 5: 항-PD-L1 항체와 결합한 키다미드 + 메트포르민 + 셀레콕시브의 효과
본 발명자는 항-PD-1 항체와 결합한 키다미드 플러스 메트포르민 및 셀레콕시브가 CT26-보유 마우스에서 종양 성장에서 유의미한 억제를 지님을 입증하였다(도 4 참조). 도 5A에 도시된 바와 같이, 항-PD-L1 항체(10 ㎎/㎏)와 결합한 키다미드(50 ㎎/㎏) 플러스 메트포르민(100 ㎎/㎏) 및 셀레콕시브(50 ㎎/㎏)를 CT26-보유 마우스에 투여하였다. 키다미드, 메트포르민, 및 셀레콕시브를 매일 투여하였다. 그러나, 항-PD-L1 항체를 3일마다 i.p. 투여하였다. 본 발명자의 데이터는, 키다미드 플러스 메트포르민 및 셀레콕시브가 CT26-보유 마우스에서 종양 성장을 억제하는 것과 관련하여 강력함을 나타낸다(도 5A 참조). 본 발명자는 항-PD-L1 항체의 부재 하에서의 키다미드 플러스 메트포르민 및 셀레콕시브가 CT26-보유 마우스에서 종양 성장을 유의미하게 억제함을 놀랍게도 발견하였다(도 5A). 항-PD-L1 (10 ㎎/㎏) 단독으로의 치료는 종양 성장을 약간 억제한다(도 5A). 이러한 결과로부터, 키다미드 플러스 메트포르민 및 셀레콕시브가 종양 성장을 억제하는 강력한 능력을 지님을 나타낸다. 도 5B는, 키다미드 플러스 메트포르민 및 셀레콕시브 그룹 및 항-PD-L1 항체 그룹과 결합한 키다미드 플러스 메트포르민 및 셀레콕시브가 종양 성장을 유의미하게 억제하고 높은 백분율의 PR을 가짐을 나타낸다. 도 5C에 도시된 바와 같이, 모든 치료 요법은 체중의 어떠한 상실도 야기시키지 않았다. 도 5D에 도시된 바와 같이, 메트포르민 및 셀레콕시브와 결합한 키다미드는 생존율을 약 80%까지 유의미하게 증가시킨다. 이는, 메트포르민 및 셀레콕시브와 결합한 키다미드가 종양 미세환경의 제어에서 및 면역요법을 촉발시키는 데 고도로 효과적임을 나타낸다. 또한, 항-PD-L1 항체와 결합한 키다미드 플러스 메트포르민 및 셀레콕시브는 종양 성장을 억제하는 데 더욱 강력하고, 53일째에 100% 생존율을 달성한다. 53일째에, 생존율은 이러한 2가지 요법들 간에 유사하였다. 결과는, 메트포르민 및 셀레콕시브와 결합한 키다미드가 강력한 종양 성장 억제 활성을 지님을 지시한다. 항-PD-L1 항체와의 조합물은 종양 성장 및 생존율에 대한 억제를 증가시켰다(도 5D).
실시예 6: JC-보유 마우스에서 항-PD-1 항체와 결합한 키다미드 + 메트포르민 + 셀레콕시브의 효과
JC 세포주를 마우스 유선의 악성 신생물로부터 수득하였다. 본 발명자는 임의의 종양 억제가 JC-보유 마우스에서 발견될 수 있는 지의 여부를 평가하는 데 관심이 있었다. 도 6에 도시된 바와 같이, JC 세포는 마우스에서 CT26 세포보다 더 느리게 성장하였다. 이에 따라, JC-보유 마우스에서의 종양 크기는 20일째에 약 300 내지 400 ㎣까지 성장하였다. 키다미드 플러스 메트포르민 및 셀레콕시브는 JC-보유 마우스에서 종양 성장을 유의미하게 억제한다(도 6A). 그러나, 항-PD-1 항체와 결합한 키다미드 플러스 메트포르민 및 셀레콕시브는 JC-보유 마우스에서 종양 성장을 억제하는 데 훨씬 더 효과적이다(도 6A). 이러한 요법은 CT26-보유 마우스 및 JC-보유 마우스 둘 모두에서 종양 성장을 유의미하게 억제한다. 본 발명자는 먼저, 메트포르민 플러스 셀레콕시브와 결합한 키다미드가 정상 면역 종양 보유 마우스에서 종양을 억제하는 데 강력한 면역 요법 활성을 지님을 발견하였다. 또한, 도 6B에 도시된 바와 같이, 단지 항-PD-1 항체는 약간 항암 활성을 가지며, SD는 단지 한 마리의 마우스에서 관찰되었다. 키다미드 플러스 메트포르민 및 셀레콕시브 요법은 종양 성장을 강력하게 억제한다. 그러나, 이는 항-PD-1 항체 요법과 결합한 키다미드 플러스 메트포르민 및 셀레콕시브보다 더 낮은 억제 효과를 갖는다. 키다미드 플러스 메트포르민 및 셀레콕시브 그룹에서, 3마리의 마우스는 PR을 달성하였으며, SD는 4마리의 마우스에서 관찰되었다. 그러나, 항-PD-1 항체 그룹과 결합한 키다미드 플러스 메트포르민 및 셀레콕시브에서, 5마리의 마우스는 PR이었으며, 한 마리의 마우스는 SD이었다. 상기를 고려하면, 키다미드 플러스 메트포르민 및 셀레콕시브 요법은 강력한 항종양 성장을 지닌다. 항-PD-1 또는 항-PD-L1 항체와 결합한 후에, CT26-보유 또는 JC-보유 마우스 모델에서 종양 성장의 억제는 증가된다(도 5B 및 도 6B). 도 6C에 도시된 바와 같이, 치료 그룹에서 어떠한 마우스도 제충이 상실되지 않았다. 도 6D에 도시된 바와 같이, 메트포르민 및 셀레콕시브와 결합한 키다미드는 JC-보유 종양 마우스 종양 마우스 모델에서 항-PD-1 항체 그룹과 비교하여 생존율을 약 28%까지 유의미하게 증가시킨다. 결과는, 키다미드 플러스 메트포르민, 및 셀레콕시브 요법이 암에 대한 양호한 조합물임을 입증한다. 요법은 종양 미세환경을 제어하고 면역요법을 증가시킬 수 있다. 또한, 항-PD-1 항체와 결합한 키다미드 플러스 메트포르민 및 셀레콕시브는 종양 성장을 억제하는 데 더욱 강력하고, 생존율을 대략 83%까지 증가한다. 치료가 35일째에 중지된 후에, CT26-보유 및 JC-보유 종양 마우스에서의 종양은 IgG 대조군에서 더 빠르게 성장하였다. 그러나, 면역 관문 억제제 요법과 결합한 키다미드 플러스 메트포르민 및 셀레콕시브는 종양 성장을 억제하는 데 매우 강력하였고, 이에 따라, 생존율을 유의미하게 증가하였다(도 6D).
실시예 7: CT26-보유 마우스에서 항-PD-L1 항체(낮은 용량 또는 높은 용량)와 결합하거나 없는 키다미드 플러스 메트포르민 및 셀레콕시브의 효과
본 발명은 항-PD-L1 항체 면역 관문 억제제의 투여량의 감소가 여전히 CT26-보유 마우스에서 종양 억제를 수행하였는 지의 여부를 평가하는 데 관심이 있었다. 도 7에 도시된 바와 같이, CT26-보유 마우스에서의 종양 크기는 15일째에 약 250 내지 300 ㎣까지 성장하였다. PD-L1(2.5 또는 10 ㎎/㎏)과 결합한 키다미드 50 ㎎/㎏ 플러스 메트포르민 100 ㎎/㎏ 및 셀레콕시브 50 ㎎/㎏은 CT26-보유 마우스에서 종양 성장을 유의미하게 억제한다(도 7A). 2.5 ㎎/㎏ 내지 10 ㎎/㎏ 항-PD-L1 항체 그룹에서의 CT26-보유 마우스에서의 종양 성장의 억제가 유의미한 차이가 존재하지 않는다. 다른 한편으로, 6.25 ㎎/㎏의 낮은 투여량 또는 항-PD-L1 항체(2.5 또는 10 ㎎/㎏)와 결합한 50 ㎎/㎏ 플러스 메트포르민 100 ㎎/㎏ 및 셀레콕시브 50 ㎎/㎏의 높은 투여량에서의 키다미드는 CT26-보유 마우스에서 종양 성장을 유의미하게 억제한다(도 7A). 6.25 및 50 ㎎/㎏의 2개의 투여량에서의 키다미드 그룹은 낮은 또는 높은 투여량의 항-PD-L1 항체(2.5 또는 10 ㎎/㎏)의 존재와는 무관하게, CT26-보유 마우스에서 종양 성장의 억제의 통계학적으로 유의미한 차이가 존재하지 않음을 나타내었다. 그러나, 항-PD-L1 항체의 부재 하에서의 다양한 용량의 6.25, 12.5, 및 50 ㎎/㎏의 키다미드 플러스 메트포르민 100 ㎎/㎏ 및 셀레콕시브 50 ㎎/㎏는 또한, 도 7B에 도시된 바와 같이 종양 성장의 억제 활성을 현저하게 지닌다. 결과는, 키다미드 50 ㎎/㎏ 플러스 메트포르민 100 ㎎/㎏ 및 셀레콕시브 50 ㎎/㎏ 그룹이 IgG 비히클 그룹과 비교하여 CT26-보유 마우스에서 종양 성장을 유의미하게 억제함을 나타내었다(도 7B). 이러한 결과는 또한, 셀레콕시브 50 ㎎/㎏ 플러스 메트포르민 100 ㎎/㎏과 결합한 다양한 용량의 키다미드가 독특한 면역조절 활성을 지녔으며, 이는 종양 세포를 공격하기 위해 세포독성 T-림프구를 재활성화시키는 데 종양 미세환경에 크게 영향을 미칠 수 있고 마지막으로, 종양 성장의 억제를 야기시킬 수 있음을 나타내었다(도 7B). 또한, 상이한 치료 방식으로 치료된 모든 마우스의 결과는 도 7C에 도시되어 있다. 2.5 ㎎/㎏ 항-PD-L1 항체로의 치료가 종양 세포를 사멸시키기 위해 세포독성 T-림프구를 재활성화시키기에 매우 충분치 않음을 나타내었다. 키다미드 플러스 셀레콕시브 및 메트포르민 그룹에 대하여, 결과는 높은 용량(50 ㎎/㎏)의 키다미드가 종양 세포를 사멸시키기 위해 세포독성 T-림프구를 재활성화시킬 필요가 있음을 나타낸다. 키다미드 플러스 셀레콕시브 및 메트포르민과 결합한 높은 용량(10 ㎎/㎏) 또는 낮은 용량(2.5 ㎎/㎏)의 항-PD-L1 항체로의 치료는 종양 성장을 유의미하게 억제하였다. 키다미드 50 ㎎/㎏ 플러스 셀레콕시브 50 ㎎/㎏ 및 메트포르민 100 ㎎/㎏과 결합한 항-PD-L1 항체(2.5 ㎎/㎏)로의 치료는 도 7C에서 가장 강력한 항암 활성을 갖는 것으로 나타났다. 낮은(2.5 ㎎/㎏) 내지 높은(10 ㎎/㎏) 용량의 항-PD-L1 항체 치료의 항암 활성에서 유의미한 차이가 존재하지 않는다. 이러한 결과는, 키다미드 플러스 셀레콕시브 및 메트포르민 플러스 항-PD-L1 항체와 결합하여, CT26-보유 마우스 모델에서 강력한 항-종양 능력을 위해 요구됨을 시사하였다. 도 7D에 도시된 바와 같이, 치료 그룹에서의 마우스는 체중이 상실되지 않았다. 생존율 결과는 도 7E에 명시되어 있다. 첫째로, 메트포르민 100 ㎎/㎏ 및 셀레콕시브 50 ㎎/㎏과 결합한 키다미드 50 ㎎/㎏로의 치료는 항-PD-L1 항체 단독으로의 치료와 비교하여 생존율을 약 20%까지 유의미하게 증가한다. 결과는, 키다미드 플러스 메트포르민 및 셀레콕시브 요법이 양호한 조합물이고 면역조절 활성을 지님을 입증한다. 이러한 요법은 종양 미세환경을 조절할 수 있고 치료 효능을 상승시킬 수 있다. 둘째로, 항-PD-L1 항체 2.5 ㎎/㎏과 결합한 키다미드 50 ㎎/㎏ 플러스 메트포르민 100 ㎎/㎏ 및 셀레콕시브 50 ㎎/㎏으로의 치료는 종양 성장을 억제하는 데 더욱 강력하고, 생존율을 대략 75%까지 증가시킨다. 유사한 결과는 또한, 항-PD-L1 항체 10 ㎎/㎏과 결합한 키다미드 50 ㎎/㎏ 플러스 메트포르민 100 ㎎/㎏ 및 셀레콕시브 50 ㎎/㎏으로의 치료에서 나타났다(생존율 대략 80%). 셋째로, 항-PD-L1 10 ㎎/㎏ 항체와 결합한 키다미드 6.25 ㎎/㎏ 플러스 메트포르민 100 ㎎/㎏ 및 셀레콕시브 50 ㎎/㎏은 종양 성장을 크게 억제하고, 생존율을 대략 40%까지 증가시킨다. 그러나, 항-PD-L1 2.5 ㎎/㎏ 항체와 결합한 키다미드 6.25 ㎎/㎏ 플러스 메트포르민 100 ㎎/㎏ 및 셀레콕시브 50 ㎎/㎏은 종양 성장을 억제하는 데 더욱 강력하고, 생존율을 대략 100%까지 증가한다. 30일째에 치료가 중지된 후에, CT26-보유 종양 마우스에서의 종양은 IgG 대조군에서 더 빠르게 성장하였다. 그러나, 항-PD-L1 Ab(2.5 또는 10 ㎎/㎏) 요법과 결합한 키다미드 50 ㎎/㎏ 플러스 메트포르민 100 ㎎/㎏ 및 셀레콕시브 50 ㎎/㎏은 종양 성장을 억제하는 데 매우 강력하고, 이에 따라, 도 7E에 도시된 바와 같이 셀레콕시브50 ㎎/㎏ 플러스 메트포르민 100 ㎎/㎏ 요법과 결합한 키다미드 50 ㎎/㎏과 비교하여 생존율을 유의미하게 증가하였다.
실시예 8: CT26-보유 마우스에서 메트포르민과 함께 또는 이의 없이 키다미드 플러스 셀레콕시브와 결합한 항-PD-1 및 항-PD-L1 Ab의 효과의 헤드 투 헤드 비교(head to head comparison)
다음으로, 본 발명자는 CT26-보유 마우스에서 메트포르민과 결합한 또는 이의 없이 키다미드 플러스 셀레콕시브와 결합한 항-PD-1 또는 항-PD-L1 항체의 치료 효과를 평가하는 데 관심이 있었다. 도 8에 도시된 바와 같이, CT26-보유 마우스에서의 종양 크기는 10일째에 약 200 내지 250 ㎣까지 성장하였다. 첫째로, 메트포르민 없는 키다미드 50 ㎎/㎏ 플러스 셀레콕시브 50 ㎎/㎏의 조합물은 IgG 그룹과 비교하여 CT26-보유 마우스에서 종양 성장을 유의미하게 억제하였다(도 8A). 둘째로, 항-PD-1 항체 2.5 ㎎/㎏과 결합한 키다미드 50 ㎎/㎏ 플러스 셀레콕시브 50 ㎎/㎏은 CT26-보유 마우스에서 종양 성장을 억제하는 데 훨씬 더 효과적이다(도 8A). 셋째로, 유사한 결과는 또한 항-PD-L1 항체 2.5 ㎎/㎏ 치료와 결합한 키다미드 50 ㎎/㎏ 플러스 셀레콕시브 50 ㎎/㎏에서 발견되었다. 도 8A 및 도 8B는 셀레콕시브 50 ㎎/㎏과 결합한 키다미드 50 ㎎/㎏이 종양 미세환경에 영향을 미치기에 충분하고 종양을 사멸하기 위해 세포독성 T-림프구를 재활성화하기에 충분함을 도시한다. 다른 한편으로, 키다미드 50 ㎎/㎏ 플러스 셀레콕시브 50 ㎎/㎏과 결합한 낮은 용량(2.5 ㎎/㎏)의 항-PD-1 및 항-PD-L1 항체의 항암 효과의 헤드 투 헤드 비교는 도 8A 및 도 8B에 도시된 바와 같이 CT26-보유 마우스에서 종양 억제의 효능을 나타내었다. 헤드 투 헤드 연구로부터의 이러한 결과는, 면역 관문 억제제 항-PD-1 또는 항-PD-L1 항체가 CT26-보유 마우스 모델에서 강력한 항-종양 능력에 대한 키다미드 플러스 셀레콕시브와의 조합 치료에서 요구됨을 시사하였다. 이러한 발견은 또한, 도 8A 및 도 8B에 도시된 바와 같이 종양 성장을 억제하기 위해 종양 미세환경에서 세포독성 T-림프구의 강력한 재활성화를 위해 키다미드 50 ㎎/㎏ 플러스 셀레콕시브 50 ㎎/㎏와 결합할 때, 항-PD-1 또는 항-PD-L1 항체의 투여량이 제안된 용량 10 ㎎/㎏의 1/4(2.5 ㎎/㎏)까지 감소되었음을 나타내었다. 본 연구는, 키다미드 플러스 셀레콕시브와 결합한 항-PD-1 또는 항-PD-L1 항체의 요법이 강력한 항-종양 활성을 수행하기에 충분함을 입증하였다. 이러한 결과로부터, 메트포르민이 종양 미세환경에서 면역 조절에 작은 역할을 할 수 있다고 결론내릴 수 있다. 적합한 요법은 항-PD-1 또는 항-PD-L1 항체와 같은 면역 관문 억제제와 결합한 키다미드 플러스 셀레콕시브이다. 모든 마우스에서 다양한 치료 방식의 항암 효과는 도 8C에 도시되어 있다. 항-PD-1 항체 단독으로의 치료는 단지 약간 항암 활성을 가지며, 단지 3마리의 마우스는 PR을 달성하였다(반응 속도 37.5%). 키다미드 플러스 셀레콕시브 요법은 보다 양호한 항종양 활성을 나타내었으며, 5마리의 마우스는 PR을 달성하였다(반응 속도 55.5%). 그러나, 이는 항-PD-1 항체 요법과 결합한 메트포르민 100 ㎎/㎏과 함께 또는 이의 없이 키다미드 50 ㎎/㎏ 플러스 셀레콕시브 50 ㎎/㎏보다 더 낮은 억제 효과를 나타내었다. 항-PD-1 항체 그룹과 결합한 키다미드 플러스 셀레콕시브에 대해, 8마리의 마우스는 PR을 달성하였다(반응 속도 88%). 항-PD-L1 항체 그룹에서, 이는 약간 항암 활성을 나타내었으며, 단지 4마리의 마우스는 PR을 달성하였다(반응 속도 50%). 항-PD-L1 항체 2.5 ㎎/㎏ 그룹과 결합한 키다미드 50 ㎎/㎏ 플러스 메트포르민 100 ㎎/㎏ 및 셀레콕시브 50 ㎎/㎏에서, 9마리의 마우스는 PR을 달성하였다(반응 속도 100%). 항-PD-L1 항체 2.5 ㎎/㎏ 그룹과 결합한 키다미드 50 ㎎/㎏ 플러스 셀레콕시브 50 ㎎/㎏에서, 8마리의 마우스는 PR을 달성하였다(반응 속도 88%). 상기를 고려하면, 키다미드 플러스 셀레콕시브 요법은 또한, 강력한 항종양 효과를 지닌다. 키다미드 플러스 셀레콕시브가 항-PD-1 또는 항-PD-L1 항체와 결합될 때, CT26-보유 마우스 모델에서의 종양 성장의 억제는 유의미하게 증가되었다(도 8C). 도 8D에 도시된 바와 같이, 치료 그룹에서의 어떠한 마우스도 체중이 상실되지 않았다. 도 8E에 도시된 바와 같이, 셀레콕시브 그룹과 결합한 키다미드는 CT26-보유 종양 마우스 모델에서 항-IgG 그룹과 비교하여 생존율을 약 55.5%까지 유의미하게 증가하였다. 그리고, 생존율은 항-PD-1(37.5%) 또는 항-PD-L1(50%) 그룹의 생존율보다 더 높았다. 결과는 키다미드 플러스 셀레콕시브 요법이 암에 대한 중간 정도의 조합물임을 입증하였다. 이러한 요법은 종양 미세환경을 제어하고 조절하고, 면역요법을 어느 정도까지 상승시킬 수 있다. 또한, 항-PD-1 항체와 결합한 키다미드 플러스 메트포르민 및 셀레콕시브는 종양 성장을 억제하는 데 더욱 강력하고, 생존율을 대략 80%까지 증가시켰다. 유사한 결과는, 항-PD-1 항체 그룹과 결합한 키다미드 플러스 셀레콕시브가 종양 성장을 억제하는 데 강력하였고, 생존율을 대략 88%까지 증가시켰다. 항-PD-L1 항체 그룹과 결합한 키다미드 플러스 메트포르민 및 셀레콕시브는 종양 성장을 억제하는 데 더욱 강력하고, 생존율을 대략 100%까지 증가시켰다. 유사한 결과는, 항-PD-L1 항체 그룹과 결합한 키다미드 플러스 셀레콕시브가 종양 성장을 억제하는 데 강력하고, 생존율을 대략 88%까지 증가시켰음을 나타내었다. 치료가 26일째에 중지된 후에, CT26-보유 종양 마우스 종양 마우스에서의 종양은 IgG 대조군에서 더 빠르게 성장하였다. 그러나, 면역 관문 억제제 요법의 존재 하에 메트포르민과 결합한 또는 메트포르민이 없는 키다미드 플러스 셀레콕시브는 종양 성장을 억제하는 데 매우 강력하고, 이에 따라, 생존율을 유의미하게 증가시켰다(도 8E). 이러한 연구로부터, 메트포르민이 종양 미세환경에 영향을 미치고 면역요법을 상승시키는 데 사소한 역할을 할 수 있음을 나타내었다. 이러한 연구는, 또한, 면역 관문 억제제와 결합한 키다미드 플러스 셀레콕시브가 항암 면역 반응을 상승시키기에 충분함을 입증하였다. 다른 한편으로, 키다미드 플러스 셀레콕시브와 결합할 때 항-PD-1 내지 항-PD-L1 항체 간의 헤드 투 헤드 비교는 항-PD-L1 항체와의 조합 요법의 항암 활성이 항-PD-1 항체와의 조합 요법의 항암 활성보다 더 양호함을 나타내었다.
실시예 9: CT26-보유 마우스에서 항-PD-1 항체와 결합한 키다미드 플러스 셀레콕시브의 최적의 치료 용량을 확인하기 위함
본 발명자는 항-PD-1 항체와 결합한 키다미드 및 셀레콕시브의 투여량 비율이 CT26-보유 마우스에서 종양 억제를 위해 최적임을 평가하는 데 관심이 있었다. 도 9에 도시된 바와 같이, CT26-보유 마우스에서의 종양 크기는 15일째에 약 400 내지 500 ㎣까지 성장하였다. 항-PD-1 항체(2.5 ㎎/㎏)와 결합한 키다미드(12.5 ㎎/㎏) 플러스 셀레콕시브(12.5, 25, 또는 50 ㎎/㎏)의 조합물은 CT26-보유 마우스에서 종양 성장을 유의미하게 억제하였다(도 9A). 단지 25 ㎎/㎏의 셀레콕시브로의 치료 그룹은 더 약한 항암 활성을 지녔다. 다음으로, 항-PD-1 항체(2.5 ㎎/㎏)와 결합한 키다미드(25 ㎎/㎏) 플러스 셀레콕시브(12.5, 25, 또는 50 ㎎/㎏)로의 치료 그룹은 CT26-보유 마우스에서 종양 성장의 유의미한 억제를 나타내었다(도 9B). 항-PD-1 항체(2.5 ㎎/㎏)와 결합한 키다미드(50 ㎎/㎏) 플러스 셀레콕시브(12.5, 25, 또는 50 ㎎/㎏)의 조합은 CT26-보유 마우스에서 종양 성장의 유의미한 억제를 나타내었다(도 9C). 데이터는 다시, 항-PD-1 항체와 결합한 키다미드 50 ㎎/㎏ 플러스 셀레콕시브50 ㎎/㎏이 CT26-보유 마우스에서 종양 성장을 억제하는 데 휠씬 더 효과적임을 입증하였다(도 9C). 이러한 결과는, 면역 관문 억제제 항-PD-1 항체와 결합한 키다미드 50 ㎎/㎏ 플러스 셀레콕시브 50 ㎎/㎏이 CT26-보유 마우스 모델에서 강력한 항-종양 능력을 달성하였음을 시사하였다. 다른 한편으로, 이러한 결과는 또한, 키다미드/셀레콕시브 투여량 비율이 중요함을 나타내었다. 모든 마우스에서 다양한 치료 방식의 항암 효과는 도 9D에 도시되어 있다. 단지 항-PD-1 항체와 결합한 키다미드 12.5 ㎎/㎏ 플러스 다양한 용량의 셀레콕시브(12.5, 25, 또는 50 ㎎/㎏)로의 치료는 약한 항암 활성을 나타내었으며, 단지 하나 또는 2마리의 마우스는 PR을 달성하였다(반응 속도 25 내지 40%). 단지 항-PD-1 항체와 결합한 키다미드 25 ㎎/㎏ 플러스 다양한 용량의 셀레콕시브(12.5, 25, 또는 50 ㎎/㎏)로의 치료는 약한 항암 활성을 나타내었으며, 단지 하나 또는 2마리의 마우스는 PR을 달성하였다(반응 속도 20 내지 40%). 항-PD-1 항체와 결합한 키다미드 50 ㎎/㎏ 플러스 셀레콕시브 50 ㎎/㎏으로의 치료는 강력한 항종양 활성을 나타내었으며, 3마리의 마우스는 PR을 달성하였다(반응 속도 75%). 도 9E에 도시된 바와 같이, 치료 그룹에서 어떠한 마우스도 체중이 상실되지 않았다. 도 9F에 도시된 바와 같이, 항-PD-1 항체와 결합한 낮은 키다미드 투여량(12.5 ㎎/㎏) 플러스 50 ㎎/㎏의 투여량의 셀레콕시브는 CT26-보유 종양 마우스 종양 마우스 모델에서 항-IgG 항체 대조군과 비교하여 생존율을 약 40%까지 증가하였다. 결과는, 키다미드 12.5 ㎎/㎏ 플러스 높은 투여량의 셀레콕시브(50 ㎎/㎏) 요법이 보다 양호한 항암 효과를 가짐을 나타내었다. 또한, 도 9G에 도시된 바와 같이, 항-PD-1 항체와 결합한 중간 투여량의 키다미드(25 ㎎/㎏) 플러스 12.5 내지 50 ㎎/㎏ 투여량의 셀레콕시브는 생존의 개선을 가지지 않았다. 마지막으로, 도 9H에서 도시된 바와 같이, 항-PD-1 항체와 결합한 높은 투여량의 키다미드(50 ㎎/㎏) 플러스 높은 투여량의 셀레콕시브(50 ㎎/㎏)는 종양 성장의 강력한 억제를 나타내었고, 58일째에 생존율을 대략 50%까지 증가하였다. 치료가 30일째에 중지된 후에, CT26-보유 종양 마우스에서의 종양은 IgG 대조군에서 더 빠르게 성장하였다. 이러한 연구에서, 종양 크기가 약 400 내지 500 ㎣에 도달하였을 때, 치료가 개시되었다. 이는 낮모든 치료 그룹에서 낮은 반응 속도 및 생존율을 야기시킬 것이다. 그러나, 항-PD-1 Ab 요법과 결합한 키다미드 50 ㎎/㎏ 플러스 셀레콕시브 50 ㎎/㎏은 여전히 종양 성장을 억제하는 데 매우 강력하고, 이에 따라, 생존율을 유의미하게 증가하였다(도 9F 내지 도 9H).
실시예 10: CT26-보유 마우스에서 항-PD-1 또는 항-CTLA-4 항체와 결합한 HDAC 억제제 플러스 COX-2 억제제의 항암 메커니즘을 명확하게 하기 위함
다음으로, 본 발명자는 면역 관문 억제제 항체의 존재 하에서 다른 HDAC 억제제 및 COX-2 억제제가 여전히 CT26-보유 마우스에서 종양 억제를 수행하는 데 관심이 있다. 도 10에 도시된 바와 같이, CT26-보유 마우스에서의 종양 크기는 10일째에 약 250 내지 300 ㎣까지 성장하였다. 첫째로, CT26-보유 마우스에서 항-PD-1 Ab와 결합한 상이한 COX-2 억제제 플러스 키다미드를 수행하였다. 항-PD-1 항체 존재 하에서 키다미드 플러스 셀레콕시브(선택적 COX-2 억제제, 50 ㎎/㎏), 아스피린(비-선택적 COX-2 억제제, 50 ㎎/㎏), 또는 이부프로펜(비-선택적 COX-2 억제제, 50 ㎎/㎏)의 조합물은 CT26-보유 마우스에서 종양 성장의 유의미한 억제를 나타내었다(도 10A). 그러나, 항-PD-1 Ab 2.5 ㎎/㎏과 결합한 또는 이의 없이 키다미드 50 ㎎/㎏ 플러스 셀레콕시브 50 ㎎/㎏은 다른 그룹과 비교하여 CT26-보유 마우스에서 종양 성장을 억제하는 데 훨씬 더 효과적이다(도 10A). 놀랍게도, 셀레콕시브 50 ㎎/㎏ 그룹과 결합한 키다미드 50 ㎎/㎏은 도 10A에 도시된 바와 같이 종양 성장을 매우 유의미하게 억제하였다. 동일한 투여량에서 COX-2 억제제에 따르면, 항암 활성(더욱 높은 것에서 더 낮은 것으로)은 하기와 같다: 셀레콕시브 ＞ 아스피린 ＞ 이부프로펜. 다음으로, 본 발명자는 셀레콕시브 및 항-PD-1 항체와 함께, 상이한 HDAC 억제제, 예를 들어, 키다미드, 엔티노스타트, 및 모세티노스타트를 평가하였다. 항-PD-1 항체 요법과 결합한 엔티노스타트 플러스 셀레콕시브는 도 3B에 도시된 바와 같이 강력한 항암 활성을 가짐을 나타내었다. 이러한 연구에서, 본 발명자는 이의 항암 활성의 효능에 대하여 항-PD-1 항체 2.5 ㎎/㎏과 결합한 모세티노스타트(클래스 I HDAC 억제제, 30 ㎎/㎏) 플러스 셀레콕시브 50 ㎎/㎏을 평가하였다. 항-PD-1 항체와 함께, 키다미드 플러스 셀레콕시브와 모세티노스타트 플러스 셀레콕시브 간에 유의미한 차이가 존재하지 않았다(도 10B). 또한, 본 발명자는 또한, CT26-보유 마우스에서 면역 관문 억제제 항-CTLA-4 항체를 갖는 조합물이 종양 억제를 수행하였음을 명확히 하였다. 결과는, CT26-보유 마우스에서 항-PD-1 또는 항-CTLA-4 항체와 결합한 키다미드 플러스 셀레콕시브가 종양 성장을 유의미하게 억제하였음을 나타내었다(도 10C). 키다미드 및 셀레콕시브와 함께 항-PD-1 및 항-CTLA-4 항체로의 치료 간에 유의미한 차이가 존재하지 않았다. 이러한 결과는, 면역 관문 억제제와 결합한 HDAC 억제제 플러스 COX-2 억제제가 CT26-보유 마우스 모델에서 강력한 항-종양 능력을 수행하였음을 시사하였다. 다양한 치료 양식으로 치료된 모든 마우스의 치료 반응은 도 10D에 도시되어 있다. 단지 항-PD-1 항체(2.5 ㎎/㎏)로 치료된 그룹은 약간의 항암 활성을 가졌으며, 단지 2마리의 마우스는 PR을 달성하였다(반응 속도 25%). 키다미드 50 ㎎/㎏ 플러스 셀레콕시브 50 ㎎/㎏ 요법으로의 치료는 강력한 종양 성장 억제를 나타내었으며, 6마리의 마우스는 PR을 달성하였다(반응 속도 75%). 그러나, 이는 항-PD-1 항체 요법과 결합된 키다미드 플러스 셀레콕시브보다 덜 강력하였으며, 여기서, 7마리의 마우스는 PR을 달성하였다(반응 속도 88%). 다른 한편으로, 본 발명자는 항암 활성의 효능에 대해 아스피린 50 ㎎/㎏ 및 이부프로펜 50 ㎎/㎏와의 결합을 평가하였다. 항-PD-1 항체와 결합한 키다미드 플러스 아스피린 또는 이부프로펜으로의 치료는 샐래콕시브-함유 치료의 것과 비교하여 더 낮은 항암 활성을 나타내었으며, 단지 4마리 및 3마리의 마우스는 PR을 달성하였다(반응 속도 각각 50%, 38%). 셀레콕시브가 아시프린 및 이부프로펜보다 종양 성장을 억제하는 데 더욱 강력함을 명확하게 나타낸다. 다음으로, 항암 활성에 있어서 키다미드 및 모세티노스타트의 비교가 결정되었다. 항-PD-1 항체 2.5 ㎎/㎏과 결합한 모세티노스타트 30 ㎎/㎏ 또는 키다미드 50 ㎎/㎏ 플러스 셀레콕시브 50 ㎎/㎏으로 치료된 그룹에서, 7마리의 마우스는 PR을 달성하였다(반응 속도 88%). 이러한 결과는, 키다미드, 엔티노스타트, 및 모세티노스타트가 유사한 항암 활성을 지님을 나타내었다. 이러한 화합물은 클래스 I HDAC 억제제로서 분류되었다. 다음으로, 본 발명자는 항-CTLA-4 항체가 항-PD-1 또는 항-PD-L1 항체와 같은 다른 면역 관문 억제제와 유사한 활성을 지니는 지의 여부에 관심이 있었다. 항-CTLA-4 2.5 ㎎/㎏ 또는 항-PD-1 항체 2.5 ㎎/㎏과 결합한 키다미드 50 ㎎/㎏ 플러스 셀레콕시브 50 ㎎/㎏으로 치료된 그룹에서, 7마리의 마우스는 PR을 달성하였다(반응 속도 88%). 상기를 고려하면, HDAC 억제제(키다미드, 엔티노스타트, 모세티노스타트) 플러스 셀레콕시브 요법은 강력한 항종양 성장 활성을 지닌다. 그리고, 항-PD-1 또는 항-CTLA-4 항체와 추가로 결합하는 경우에, CT26-보유 마우스 모델에서 종양 성장의 억제는 증가되었다(도 10D). 도 10E에 도시된 바와 같이, 치료 그룹에서의 마우스는 체중이 상실되지 않았다. 도 10F에 도시된 바와 같이, 항-PD-1 항체와 결합하거나 이의 없이 키다미드 플러스 셀레콕시브는 CT26-보유 종양 마우스 모델에서 강력한 항암 활성을 지니고, 생존율을 항-PD-1 항체 대조군(약 20%)과 비교하여 약 75%까지 유의미하게 증가하였다. 이러한 결과는 특히, 면역 관문 억제제와 함께, HDAC 억제제 플러스 COX-2 억제제 요법이 암에 대한 양호한 조합물임을 입증하였다. 이러한 요법은 종양 미세환경을 제어하고 면역요법을 상승시킬 수 있다. 이러한 결과는 또한, 아스피린 또는 이부프로펜을 함유한 요법이 항암 활성을 지니고 생존율을 증가시킴을 나타내었지만, 도 10F에 도시된 바와 같이 셀레콕시브를 함유한 요법보다 더 약한 활성을 나타내었다. 또한, 도 10G에 도시된 바와 같이, 항-PD-1 항체와 결합한 키다미드 플러스 셀레콕시브는 종양 성장 억제에 대해 모세티노스타트를 함유한 요법보다 더욱 강력하고, 생존율을 증가시켰다(75% 대 62.5%). 마지막으로, 도 10H에 도시된 바와 같이, 항-CTLA-4 항체와 결합한 키다미드 플러스 셀레콕시브는 종양 성장을 억제하는 데 더욱 강력하였고 생존율을 대략 100%까지 증가되었다. 이러한 결과는, 항-CTLA-4 항체와의 병용 요법이 CT26-보유 종양 마우스 종양 마우스 모델에서 생존율을 증가시키기 위해 항-PD-1 항체와의 병용 요법(생존율 75%)보다 더욱 강력함을 나타내었다. 치료가 26일에 중지된 후에, CT26-보유 종양 마우스에서 종양은 IgG 대조군보다 더 빠르게 성장하였다. 그러나, 종양 성장의 강력한 억제 및 증가된 생존율은 하기와 같이 병용 요법에 의해 달성될 수 있다: 키다미드 플러스 아스피린, 이부프로펜 또는 셀레콕시브, 또는 면역 관문 억제제와 추가로 결합됨; 면역 관문 억제제 요법과 결합된 모세티노스타트 플러스 셀레콕시브; 키다미드 플러스 셀레콕시브와 결합된 항-CTLA-4 항체(도 10F 내지 도 10H). 함께 고려하면, 키다미드 플러스 셀레콕시브 요법과 함께 항-PD-1, 항-PD-L1, 및 항-CTLA-4 항체를 포함하는 면역 관문 억제제는 Treg(조절 T 세포), MDSC(골수-유래 억제 세포), TAM(종양-관련 대식 세포), NK(자연살 T 세포), 및 CTL(세포독성 T-림프구)과 같은 종양 미세환경에서의 주요 ㅅ jd분들의 수 또는 활성에 효율적으로 영향을 미칠 수 있다. 최종적으로, 이러한 요법은 면역요법을 상승시키는 데 효율적이었다. 이러한 결과는 또한, HDAC 억제제(특히, 클래스 I HDAC 억제제) 플러스 COX-2 억제제(특히, 선택적 COX-2 억제제)가 반응 속도 및 생존율에서 면역 관문 억제제의 항암 활성을 효율적으로 상승시킴을 입증하였다.
실시예 11: CT26-보유 마우스에서 항-PD-1 항체와 결합한 셀레콕시브와 함께 키다미드의 최상의 병용 요법을 확인하기 위함
본 발명자는 면역 관문 억제제 항-PD-1 항체 요법과 결합한 키다미드 및 셀레콕시브가 CT26-보유 마우스에서 강력한 종양 억제를 수행하였음을 확인하기 위해 각 치료 그ㅜㅂ에서 더욱 많은 수의 마우스에서의 항암 효과를 평가하였다. 도 11에 도시된 바와 같이, CT26-보유 마우스에서의 종양 크기는 9일째에 약 250 내지 300 ㎣까지 성장하였다. 조합물 키다미드 플러스 셀레콕시브 및 항-PD-1 항체는 CT26-보유 마우스에서 종양 성장을 유의미하게 억제하였다(도 11A). 조합물 키다미드 50 ㎎/㎏ 플러스 항-PD-1 항체 2.5 ㎎/㎏은 또한, CT26-보유 마우스에서 종양 성장을 유의미하게 억제하였다(도 11A). 유사한 결과는 또한, 조합물 키다미드 50 ㎎/㎏ 플러스 셀레콕시브 50 ㎎/㎏에서 명시되었다(도 11A). 그러나, 항-PD-1 항체 2.5 ㎎/㎏과 결합한 키다미드 50 ㎎/㎏ 플러스 셀레콕시브 50 ㎎/㎏은 다른 그룹과 비교하여 CT26-보유 마우스에서 종양 성장을 억제하는 데 훨씬 더 효과적이다(도 11A). 이러한 결과는 면역 관문 억제제와 결합한 키다미드 플러스 셀레콕시브가 CT26-보유 마우스 모델에서 강력한 항종양 능력을 수행하였음을 시사하였다. 모든 마우스에서 다양한 치료 양식의 항암 효과는 도 11B에 도시되어 있다. 항-PD-1 항체 그룹은 단지 약한 항암 활성을 가지며, 단지 3마리의 마우스는 PR을 달성하였다(반응 속도 25%). 조합물 키다미드 플러스 셀레콕시브는 약한 항암 활성을 나타내었으며, 단지 4마리의 마우스는 PR을 달성하였다(반응 속도 33%). 조합물 키다미드 플러스 항-PD-1 항체는 또한, 개선된 항암 활성을 나타내었으며, 5마리의 마우스는 PR을 달성하였다(반응 속도 41%). 조합물 키다미드 플러스 셀레콕시브 및 항-PD-1 항체는 최상의 항암 활성을 나타내었으며, 8마리의 마우스는 PR을 달성하였다(반응 속도 72%). 도 11C에 도시된 바와 같이, 치료 그룹에서의 마우스는 체중을 상실하지 않았다. 도 11D에 도시된 바와 같이, 항-PD-1 항체 2.5 ㎎/㎏와 결합한 키다미드 50 ㎎/㎏ 또는 항-PD-1 Ab 2.5 ㎎/㎏ 단독은 생존율을 각각 약 33% 및 16%까지 증가하였다. 그러나, 항-PD-1 Ab 2.5 ㎎/㎏ 요법과 결합한 키다미드 50 ㎎/㎏ 플러스 셀레콕시브 50 ㎎/㎏은 다시, CT26-보유 종양 마우스 종양 마우스 모델에서 종양 성장을 효율적으로 억제하고 생존율을 약 72%까지 증가시키기 위한 강력한 조합물로서 입증되었다. 항-PD-1 항체 부재 하에서 셀레콕시브와 결합한 키다미드의 요법은 항-IgG 대조 요법과 비교하여 생존율을 개선하지 못하였다. 셀레콕시브의 부재 하에서의 요법은 단지 생존율의 약간 증가를 나타내었다. 함께 고려하면, 이러한 데이터는 면역 관문 억제제와 결합한 키다미드 플러스 셀레콕시브가 종양 성장을 억제하는 데 매우 강력하고 효과적인 조합물이었고, 이에 따라, 면역요법에서 생존율을 유의미하게 증가시킴을 나타내었다(도 11D). 이러한 병용 요법은 종양 미세환경에서 상승적 메커니즘을 통해 T 세포 기억의 개선에서 중요한 역할을 할 수 있다.
실시예 12: CT26-보유 누드 마우스를 사용함으로써 항-PD-L1 항체와 결합한 키다미드 플러스 메트포르민 및 셀레콕시브의 항암 메커니즘을 명확하게 하기 위함
본 발명자는 항-PD-L1 항체와 결합한 키다미드 플러스 메트포르민 및 셀레콕시브가 CT26-보유 마우스(면역력 정상 상태)에서 세포독성 T-림프구를 활성화시킴으로써 종양 억제를 수행하였는 지의 여부를 평가하는 데 관심이 있었다. 이에 따라, 본 발명자는 이론을 시험하기 위해 면역결핍 흉선 누드 마우스(세포독성 T-림프구 결핍)를 사용하였다. 누드 마우스는 흉선의 결함성 발달을 야기시키는 유전적 돌연변이를 갖는 균주로부터의 실험실 마우스이었다. 이는 T-세포의 유의미한 감소 및 세포-매개 면역력의 결여를 야기시킬 것이다. 도 12에 도시된 바와 같이, CT26-보유 누드 마우스에서의 종양 크기는 15일째에 약 350 내지 400 ㎣까지 성장하였다. 여러 치료 그룹은 항암 효과에서 평가되었다. 어떠한 그룹도 도 12A에 도시된 바와 같이 CT26-보유 누드 마우스 모델에서 종양 성장을 효율적으로 억제하지 못하였다. 항-PD-L1 항체 2.5 ㎎/㎏ 요법과 결합하거나 또는 이의 없는 키다미드 50 ㎎/㎏ 플러스 메트포르민 100 ㎎/㎏ 및 셀레콕시브 50 ㎎/㎏은 다른 요법과 비교하여 항암 활성을 약간 지녔다. 그러나, 이전 데이터에 도시된 바와 같이, 동일한 치료 요법은 정상 면역력을 갖는 CT26-보유 마우스(야생형 마우스)에서 항암 활성을 나타내었다. 이러한 결과는, 정상 면역력이 CT26-보유 마우스 모델에서 메트포르민의 존재 또는 부재 하에서 면역 관문 억제제 플러스 키다미드 및 셀레콕시브로의 병용 치료의 강력한 항종양 능력을 위해 요구됨을 시사하였다. 모든 마우스에서 다양한 치료 양식의 항암 효과는 도 12B에 도시되어 있다. 치료 그룹은 PR 반응을 나타내지 않았다. 이러한 결과는, 모든 요법이 면역-결핍 누드 마우스에서 유의미한 항암 활성을 수행하지 못하였음을 나타낸다. 항-PD-L1 항체 요법과 결합한 또는 이의 없는 키다미드 플러스 셀레콕시브 및 메트포르민은 다른 그룹과 비교하여 약한 항암 활성을 나타내었다. 도 12C에 도시된 바와 같이, 치료 그룹에서의 마우스는 체중이 상실되지 않았다. CT26-보유 누드 마우스에서의 종양 중량은 도 12D에 도시된 바와 같이 29일째에 약 2.7 내지 3.3 g까지 성장하였다. 단지 조합물 키다미드 50 ㎎/㎏ 플러스 메트포르민 100 ㎎/㎏ 및 셀레콕시브 50 ㎎/㎏은 종양 중량을 기초로 한 종양 성장의 약한 억제를 나타내었지만, 도 12D에 도시된 바와 같이 종양 크기를 기초로 할 때 유의미하지 않은 억제를 나타내었다. 야생형 BALB/c 마우스 데이터와 비교하여 이러한 연구의 결과에 따르면(도 1 내지 도 11), 조합물 항-PD-L1 또는 항-PD-1 항체와 결합한 키다미드 플러스 메트포르민 및 셀레콕시브의 항종양 활성이 정상 면역력을 필요로 하였음을 시사하였다(도 12E). 이에 따라, 이러한 결과는 항-PD-1/항-PD-L1과 결합한 키다미드 플러스 메트포르민 및 셀레콕시브를 함유한 병용 요법이 암세포를 사멸시키기 위해 세포독성 T-림프구를 재활성화시키는 데 상승적 항종양 효과를 갖는다는 본 발명자의 제안을 지지한다.
함께 고려하면, 이러한 데이터는 키다미드 플러스 셀레콕시브가 매우 중요한 조합물이고, 종양 미세환경을 효율적으로 제어하고, 면역조절 활성을 지님을 나타내었다. 이러한 것이 항-PD-1, 항-PD-L1 또는 항-CTLA-4 항체과 같은 면역 관문 억제제와 결합되었을 때, 이는 항암 활성을 상승시키고 면역력-충분 정상 동물 모델에서 생존을 연장시키는 데 더욱 효율적이었다. 본 발명자는 면역 관문 억제제와 결합한 키다미드 플러스 셀레콕시브가 암 환자에 대한 면역요법에서 효능을 상승시키는 데 유의미할 것임을 예측할 수 있다.
실시예 13: CT26-보유 BALB/c 마우스에서 항-PD-1 항체와 결합한 키다미드 플러스 셀레콕시브로의 치료 후 순환 및 종양-침윤 면역 세포를 분석하기 위함
본 발명자는 혈액 순환 및 종양 미세환경 둘 모두에서 후생적 조절제 키다미드가 COX-2 억제제에 영향을 받은 면역 세포 집단과 결합되었는 지의 여부를 연구하였다. 유세포분석을 이용함으로써, 본 발명자는 먼저, 정상 마우스(종양 없음) 및 종양-보유 마우스의 순환 면역 세포 집단(CD4+ T 세포, CD8+ T 세포, PMN-MDSC 및 M-MDSC, 및 Treg 세포)을 분석하였다. 본 발명자는, CT26 종양-보유 마우스에서, 정상 마우스와 비교하여 순환 과립구 MDSC(PMN-MDSC; CD11b+Ly6G+Ly6Clow로서 규정됨)의 4.7배 증가 및 순환 단핵구 MDSC(M-MDSC; CD11b+Ly6G-Ly6C+로서 규정됨)의 25% 증가가 존재함을 발견하였다(도 13A). 다른 한편으로, 또한, CD4+ T 세포, CD8+ T 세포, 및 Treg 세포가 도 13A에 도시된 바와 같이 정상 마우스와 비교하여 종양-보유 마우스에서 현저하게 증가되었다는 것이 발견되었다. MDSC(골수-유래 억제 세포)는 암, 염증 및 감염 동안 확장하는 세포의 이종 집단이고, T 세포 기능의 억제를 지닌다. 본 발명자는 도 13B에 명시된 바와 같이 M-MDSC에 대한 치료 요법의 효과에 대한 연구에 초점을 맞추었다. 순환 M-MDSC 세포는 어떠한 치료도 없는 종양-보유 마우스에서 유의미하게 증가되었다. 그러나, 이는 항-PD-1 항체 단독 또는 키다미드 플러스 셀레콕시브 또는 항-PD-1 항체와 결합한 키다미드 플러스 셀레콕시브로의 치료에 의해 유의미하게 감소되었다. 치료는 순환 M-MDSC의 수의, 임의의 치료가 없는 정상 마우스에서 관찰된 것과 유사한 수준까지의 눈에 띄는 감소를 야기시켰다(도 13B). 결과는 또한, PMN-MDSC의 세포 수가 임의의 치료에 의해 유의미하게 변경되지 못하였음을 나타내었다(데이터는 미도시됨). 또한, 본 발명자는 도 13C에 명시된 바와 같이 치료후 12일째에 종양-보유 마우스의 순환 M-MDSC 세포 및 23일째에 종양 크기를 분석하였다. 결과는, 12일째에 순환 M-MDSC의 세포 수가 치료 후 23일째에 종양 크기와 유의미하게 상관관계를 가짐을 나타내었다. 다른 면역 세포는 종양 크기와 상관관계를 나타내지 않았다(데이터는 미도시됨). 이러한 결과는, 아마도 순환 M-MDSC 세포가 CT26 보유 마우스에서 종양 발달에 대한 예측제일 수 있음을 시사하였다. 다른 한편으로, 본 발명자는 순환 Treg 세포가 8일째에 항-PD-1 항체와 함께 키다미드 플러스 셀레콕시브로의 치료 및 12일째에 항-PD-1 항체 없이 키다미드 플러스 셀레콕시브로의 치료에 의해 유의미하게 감소되었음을 발견하였다(도 13D). 본 발명자는 다음으로, 종양-침윤 면역 세포를 분석하였다. 항-PD-1 항체 단독으로의 치료는 골수 세포 및 M-MDSC 세포의 수를 현저하게 감소시켰다. 유사한 결과는 또한, 도 13E에 도시된 바와 같이 키다미드 플러스 셀레콕시브와 결합한 항-PD-1 항체 또는 키다미드 플러스 셀레콕시브의 그룹에서 나타났다. TAM의 세포 수는 키다미드 플러스 셀레콕시브로의 치료를 제외한 임의의 치료에 의해 현저하게 변경되지 않았다. Treg의 세포 수는 도 13F에 도시된 바와 같이, 키다미드 플러스 셀레콕시브와 결합한 항-PD-1 항체로의 치료에 의해 현저하게 감소되었고, 항-PD-1 항체 단독 또는 키다미드 플러스 셀레콕시브로의 치료에 의해 중간 정도로 감소되었다. 본 발명자는 Treg에 대한 CD4+ T 세포의 비율이 다른 그룹과 비교하여 키다미드 플러스 셀레콕시브와 함께 항-PD-1 항체의 조합물로 치료된 치료 그룹의 종양 조직에서 약간 증가시켰음을 발견하였다(도 13g). 이러한 치료 그룹은 또한, 다른 그룹과 비교하여 Treg에 대한 CD8+ T 세포의 보다 높은 비율을 나타내었다(도 13h). 함께 고려하면, 키다미드 플러스 셀레콕시브로의 치료는 종양-침윤 골수 세포(CD45+CD11b+), M-MDSC(도 13E) 및 Treg(도 13F)를 감소시켰다. 이러한 결과는, 키다미드 플러스 셀레콕시브가 순환 및 종양-침윤 억제 세포의 억제에서 중요한 역할을 함을 시사하였으며, 이는 후속하여 CT26 종양-보유 마우스에서 관찰된 항-PD-1 항체와 함께 항종양 활성에 기여한다.

Claims (20)

  1. 종양 미세환경에서 면역 억제를 제거하거나 암세포에 대한 면역 체계를 자극시키는 방법으로서, 대상체에 면역 관문 억제제와 함께 HDAC 억제제 및 NSAID의 조합물을 투여하는 것을 포함하는 방법.
  2. 제1항에 있어서, 방법이 면역요법을 통해 암을 억제하거나 치료할 수 있는 방법.
  3. 제1항에 있어서, 암이 교모세포종, 간암, 대장 암종, 교모세포종, 위암, 대장암, 식도암, 폐암, 췌장암, 신세포 암종, 양성 전립선 비대증, 전립선암, 난소암, 흑색종, 유방암, 만성 림프성 백혈병(CLL), 머켈 세포 암종, 비호지킨 림프종, 급성 골수성 백혈병(AML), 담낭암, 담관암종, 비뇨기 방광암, 및 자궁암인 방법.
  4. 제1항에 있어서, 조합물이 비구아니드 화합물을 추가로 포함하는 방법.
  5. 제1항에 있어서, HDAC 억제제가 클래스 I HDAC의 선택적 억제제인 방법.
  6. 제1항에 있어서, HDAC 억제제가 벤즈아미드 클래스의 HDAC 억제제인 방법.
  7. 제1항에 있어서, HDAC 억제제가 키다미드, 엔티노스타트, 보리노스타트, 로미뎁신, 파노비노스타트, 벨리노스타트, 파노비노스타트, 발프로산, 모세티노스타트, 아벡시노스타트, 엔티노스타트, 프라시노스타트, 레스미노스타트, 기비노스타트 또는 퀴시노스타트인 방법.
  8. 제1항에 있어서, HDAC 억제제가 키다미드 또는 엔티노스타트 또는 모세티노스타트인 방법.
  9. 제1항에 있어서, NSAID가 아스피린, 이부프로펜, 인도메타신, 나프록센 또는 COX-2 억제제인 방법.
  10. 제9항에 있어서, COX-2 억제제가 셀레콕시브, 로페콕시브 또는 에토리콕시브인 방법.
  11. 제1항에 있어서, 면역 관문 억제제가 항-CTLA-4 항체, 항-PD-1 항체, 항-PD-L1 항체, 항-TIM-3 항체, 항-BTLA 항체, 항-VISTA 항체 또는 항-LAG-3 항체인 방법.
  12. 제1항에 있어서, 면역 관문 억제제가 람브롤리주맙, 피딜리주맙, 니볼루맙, 두르발루맙, 아벨루맙, 아테졸리주맙 또는 MIHI인 방법.
  13. 제4항에 있어서, 비구아니드 화합물이 메트포르민, 펜포르민, 프로구아닐 및 클로르프로구아닐인 방법.
  14. 제1항에 있어서, 조합물에서 HDAC 억제제, NSAID 및 면역 관문 억제제의 양이 각각 약 10%(w/w) 내지 약 70%(w/w), 약 10%(w/w) 내지 약 70%(w/w) 및 약 0.5%(w/w) 내지 약 20%의 범위인 방법.
  15. 제4항에 있어서, 비구아니드 화합물의 양이 약 30% 내지 70%(w/w)의 범위인 방법.
  16. 제1항에 있어서, 하나 이상의 추가적인 항암제를 투여하는 것을 추가로 포함하는 방법.
  17. HDAC 억제제, NSAID 및 면역 관문 억제제를 포함하는 약제학적 조합물.
  18. 제1항에 있어서, 약제학적 조합물에서 HDAC 억제제, NSAID 및 면역 관문 억제제의 양이 각각 약 10%(w/w) 내지 약 70%(w/w), 약 10% 내지 약 70%(w/w) 및 약 0.5% 내지 약 20%인 약제학적 조합물.
  19. 제1항에 있어서, 본원에 기술된 조합물이 비구아니드 화합물을 추가로 포함하는 약제학적 조합물.
  20. 제19항에 있어서, 비구아니드 화합물의 양이 약 30% 내지 약 70%(w/w)의 범위인 약제학적 조합물.
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