BR102019000155A2 - Uso de uma combinação e combinação farmacêutica - Google Patents

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Jia-Shiong Chen
Ye-Su CHAO
Chia-Nan Chen
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Abstract

“uso de uma combinação e combinação farmacêutica” a invenção refere-se a um método de remoção de supressão imunológica em um microambiente tumoral ou de estímulo a um sistema imune contra células de câncer, compreendendo a administração a um sujeito de uma combinação de um inibidor de hdac e uma nsaid em combinação com um inibidor de ponto de verificação imunológico.

Description

“USO DE UMA COMBINAÇÃO E COMBINAÇÃO FARMACÊUTICA” Campo da Invenção [001] A presente invenção refere-se à imunoterapia. Particularmente, a presente invenção fornece uma combinação farmacêutica e as suas aplicações na regulação do microambiente tumoral e imunoterapia do câncer.
Antecedentes da Invenção [002] A imunoterapia contra o câncer é um campo em rápido desenvolvimento que produziu avanços impressionantes e promissores. A descoberta da existência de antígenos associados a tumores levantou agora a possibilidade de usar o sistema imunológico do hospedeiro para intervir no crescimento tumoral. Vários mecanismos de aproveitamento dos braços humoral e celular do sistema imunológico estão atualmente sendo explorados para a imunoterapia do câncer.
[003] Várias estratégias têm sido propostas para quebrar a tolerância imunológica incluindo transferência adotiva de efetores imunes, terapia imunomoduladora e vacinação. Mas, essas estratégias ainda não impedem o escape imunológico. A principal via de fuga ocorre em células cancerosas, incluindo sinalização anti-apoptótica, proteina-quinase ativada por mitógeno (MAPK), e mecanismos relacionados a monofosfato cíclico de adenosina (cAMP). O microambiente tumoral é um importante campo de pesquisa, pois é dinâmico, com base na progressão tumoral. Os tumores desenvolvem mecanismos para escapar do controle imunológico por meio de um processo chamado imuno edição, que fornece uma pressão seletiva no microambiente tumoral que pode levar à progressão maligna. Na fase promotora de tumor referida como ‘fuga imune’, o sistema imune pode favorecer a progressão do tumor, quer por seleção das células cancerosas que são mais capazes de sobreviver à imunocompetência do hospedeiro ou por modificação
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2/56 do microambiente do tumor, de tal maneira que o crescimento tumoral é facilitado.
[004] A homeostase do sistema imunológico inclui a presença de mecanismos estimulatórios e inibitórios para controlar o equilíbrio na resposta do sistema imunológico. Os mecanismos de inibição incluem o antígeno-4 associado ao linfócito T citotóxico (CTLA-4, um homólogo de CD28), e proteína1 de morte celular programada (PD-1) ou o seu ligante (PD-L1), TIM-3 (imunoglobulina-3 de células T), BTLA (atenuador de linfócitos B e T), VISTA (supressor de Ig de domínio V de ativação de células T) e LAG-3 (gene de ativação de linfócitos 3). Atualmente, muitos pontos de anticorpos monoclonais inibidores de verificação imunológica, incluindo anticorpos anti-CTLA-4, anti-PDL1, anti-PD-1, foram aprovados pela FDA e EMA para utilização terapêutica em várias indicações oncológicas. No entanto, para estes inibidores de verificação imunológica, cerca de 20% a 30% dos doentes com câncer tiveram resposta ao tumor para monoterapia. A eficácia ainda é insatisfatória.
[005] O documento US 2018/0244783 fornece inibidores da via Wnt em combinação com agentes imunoterapêuticos para o tratamento de câncer e outras doenças. O documento US 2018/0355042 fornece combinações que incluem um inibidor de HDACi e um PD-1 que são úteis para o tratamento do câncer, incluindo a redução e/ ou prevenção de metástase do câncer. No entanto, existe ainda a necessidade de desenvolver uma solução terapêutica para alcançar uma atividade antitumoral mais pronunciada.
Descrição Resumida da Invenção [006] A presente invenção surpreendentemente descobriu que a combinação de um inibidor de histona-desacetilase (HDAC) e drogas antiinflamatórias não esteroidal (NSAIDs) pode influenciar o microambiente tumoral, sugerindo que tal combinação, em combinação com inibidores de ponto de verificação imunológico marcadamente melhora a atividade anticancerígena. A
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3/56 presente invenção descobriu que o tratamento com a combinação farmacêutica combinado com um inibidor de ponto de verificação imunológico aumenta significativamente a atividade anticâncer em comparação com o inibidor de ponto de verificação imunológico sozinho. O co-tratamento com a combinação farmacêutica e um inibidor de ponto de verificação imunológico fornece maior potência na inibição do crescimento tumoral do que com o inibidor de HDAC mais o inibidor de ponto de verificação imunológico. Além disso, a combinação da combinação farmacêutica e um inibidor de ponto de verificação imunológico significativamente erradica o tumor e aumentar a taxa de sobrevivência para cerca de 70 a 80%.
[007] Em uma forma de realização, a presente invenção fornece um método de remoção de supressão imunológica em um microambiente tumoral ou de estímulo de um sistema imune contra as células de câncer, compreendendo a administração a um sujeito de uma combinação de um inibidor de HDAC e um NSAID em combinação com um inibidor de ponto de verificação imunológico. O método pode inibir ou tratar um câncer através de imunoterapia. Em uma forma de realização, as quantidades do inibidor de HDAC e NSAID na combinação variam entre cerca de 5% e cerca de 40% (p/p) e cerca de 5% a cerca de 40% (p/p), respectivamente.
[008] Em uma outra forma de realização, a combinação compreende ainda um composto de biguanida. A quantidade de composto de biguanida varia de cerca de 40% a 80% (p/p).
[009] Em algumas formas de realização, o inibidor de HDAC é um inibidor seletivo de classe I de HDAC. Particularmente, o inibidor de HDAC é uma classe de benzamida de inibidor de HDAC. Certas formas de realização do inibidor de HDAC incluem chidamida, entinostat, vorinostat, romidepsina, panobinostat, belinostat, panobinostat, ácido valproico, mocetinostat, abexinostat, entinostat, pracinostat, resminostat, givinostat e quisinostat.
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4/56 [0010] Em algumas formas de realização, a NSAID é aspirina, ibuprofeno, indometacina, naproxona ou um inibidor de COX-2. Certas formas de realização o inibidor de COX-2 inclui celecoxibe, rofecoxibe e etoricoxibe.
[0011] Em algumas formas de realização, o inibidor de ponto de verificação imunológico é um anticorpo anti-CTI_A-4, anticorpo anti-PD-1 ou um anticorpo anti-PD-L1. Certas formas de realização do inibidor de ponto de verificação imunológico incluem lambrolizumab, pidilizumab, nivolumab, durvalumab, avelumab, atezolizumabe e MIHI.
[0012] Certas formas de realização do câncer incluem glioblastoma, câncer de fígado, carcinoma, câncer gástrico, câncer coloretal, câncer de esôfago, câncer de pulmão, câncer pancreático, carcinoma da célula renal, hiperplasia benigna da próstata, câncer da próstata, câncer do ovário, melanoma, câncer da mama, leucemia linfocítica crônica, carcinoma da célula de Merkel (CLL), linfoma não-Hodgkin, leucemia mieloide aguda (AML), câncer da vesícula biliar, colangiocarcinoma, câncer da bexiga urinária, e câncer uterino.
[0013] Em uma forma de realização, o método compreende ainda a administração de um ou mais agentes anticâncer adicionais.
[0014] Em uma forma de realização, a invenção fornece uma combinação farmacêutica compreendendo um inibidor de HDAC, um NSAID e um inibidor de ponto de verificação imunológico. As formas de realização do inibidor HDAC, da NSAID e do inibidor de ponto de verificação imunológico são aquelas aqui descritas. Em uma forma de realização, a combinação farmacêutica compreende ainda um composto de biguanida.
Breve Descrição dos Desenhos [0015] As Figuras 1 A a D mostram a resposta terapêutica de chidamida ou entinostat combinado com anticorpo anti-PD-1 em camundongos portadores de tumor CT26. Os camundongos BALB/c portadores de um tumor
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5/56 do cólon CT26 foram tratados com várias modalidades terapêuticas como indicado. IgG, controle anti-lgG (veículo, 10 mg/kg); PD-1, anticorpo monoclonal de Anti-PD-1 (10 mg/kg); CD, chidamida (25 mg/kg); E, MS-275 (entinostat, 20 mg/kg). Os volumes tumorais totais (A), volumes tumorais individuais (B), peso corporal de camundongos portadores de tumor CT26 (C), e a sobrevivência dos animais (D) foram registrados. Camundongos portadores de tumor CT26 foram tratados como indicado, e sacrificados quando o volume do tumor atingiu 3000 mm3 após o implante do tumor. Médias e Desvios Padrões (DPs) são mostrados. O número de animais utilizados em cada braço experimental e os valores de P também são indicados. * P <0,05. Os valores de P foram calculados usando teste T de Student que comparou o tamanho do tumor no grupo de indicação com o grupo de IgG.
[0016] Figuras 2 A a D mostram a resposta terapêutica de chidamida mais metformina combinados com anticorpo anti-PD-1 em camundongos portadores de tumor CT26. Os camundongos BALB/c portadores de um tumor do cólon CT26 foram tratados com várias modalidades terapêuticas como indicado. IgG, controle anti-lgG (veículo, 10 mg/kg); PD-1, anticorpo monoclonal de Anti-PD-1 (10 mg/kg); CD, chidamida (12,5, 25 ou 50 mg/kg); E, MS-275 (entinostat, 20 mg/kg); M, metformina (100 mg/kg). Os volumes tumorais totais (A), volumes tumorais individuais (B), peso corporal de camundongos portadores de tumor CT26 (C), e a sobrevivência dos animais (D) foram registrados. Os camundongos portadores de tumor CT26 foram tratados como indicado, e sacrificados quando o volume do tumor alcançou 3,000 mm3 após a implantação do tumor. Médias e DPs são mostrados. O número de animais utilizados em cada braço experimental e os valores de P também são indicados. * P < 0,05. Os valores de P foram calculados usando teste T de Student que comparou o tamanho do tumor no grupo de indicação com o grupo de IgG.
[0017] As Figuras 3 A a D mostram a resposta terapêutica de
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6/56 chidamida ou entinostat mais metformina e celecoxibe combinados com anticorpo anti-PD-1 em camundongos portadores de tumor CT26. Camundongos BALB/c portadores de tumor de cólon CT26 foram tratados com várias modalidades terapêuticas como indicado. IgG, controle anti-lgG (veículo, 10 mg/kg); PD-1, anticorpo monoclonal de Anti-PD-1 (10 mg/kg); CD, chidamida (12,5 mg/kg); E, MS-275 (entinostat, 20 mg/kg); C, celecoxibe (25 mg/kg); M, metformina (100 mg/kg). O volume tumoral total (A), os volumes dos tumores individuais (B), o peso corporal camundongos portadores (C), e a sobrevivência dos animais (D) foram registrados. Os camundongos portadores de tumor CT26 foram tratados como indicado, e sacrificados quando o volume do tumor atingiu 3000 mm3 após a implantação do tumor. Médias e DPs são mostrados. O número de animais utilizados em cada braço experimental e os valores de P também são indicados. * P < 0,05. Os valores de P foram calculados usando teste T de Student que comparou o tamanho do tumor no grupo de indicação com o grupo de IgG.
[0018] As Figuras 4A a D mostram a resposta terapêutica do chidamida mais metformina e celecoxibe em várias doses combinadas com o anticorpo anti-PD-1 em camundongos portadores de tumor CT26. Os camundongos BALB/ c portadores de um tumor do cólon CT26 foram tratados com várias modalidades terapêuticas como indicado. IgG, controle anti-lgG (veículo, 10 mg/kg); PD-1, anticorpo monoclonal de Anti-PD-1 (10 mg/kg); CD, chidamida (12,5,25 ou 50 mg/kg); C, celecoxibe (25ou 50 mg/kg); M, metformina (100 ou 200 mg/kg). Os volumes tumorais totais (A), volumes tumorais individuais (B), peso corporal de camundongos portadores de tumor CT26 (C), e a sobrevivência dos animais (D) foram registrados. Os camundongos portadores de tumor CT26 foram tratados como indicado, e sacrificados quando o volume do tumor atingiu 3000 mm3 após a implantação do tumor. Médias e DPs são mostrados. O número de animais utilizados em cada braço experimental e os
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7/56 valores de P também são indicados. * P < 0,05. Os valores de P foram calculados usando teste T de Student que comparou o tamanho do tumor no grupo de indicação com o grupo de IgG.
[0019] As Figuras 5 A a D mostram a resposta terapêutica do chidamida mais metformina e celecoxibe combinados com o anticorpo anti-PDL1 em camundongos portadores de tumor CT26. Os camundongos BALB/ c portadores de um tumor do cólon CT26 foram tratados com várias modalidades terapêuticas como indicado. IgG, controle anti-lgG (veículo, 10 mg/kg); PD-L1, anticorpo monoclonal anti-PD-L1 (10 mg/kg); CD, chidamida (50 mg/kg); C, celecoxibe (50 mg/kg); M, metformina (100 mg/kg). O volume tumoral total (A), os volumes dos tumores individuais (B), o peso corporal camundongos portadores de tumor CT26 (C), e a sobrevivência dos animais (D) foram registrados. Os camundongos portadores de tumor CT26 foram tratados como indicado, e sacrificados quando o volume do tumor atingiu 3000 mm3 após a implantação do tumor. Médias e DPs são mostrados. O número de animais utilizados em cada braço experimental e os valores de P também são indicados. * P < 0,05. Os valores de P foram calculados usando teste T de Student que comparou o tamanho do tumor no grupo de indicação com o grupo de IgG.
[0020] As Figuras 6A a D mostram a resposta terapêutica de chidamida mais metformina e celecoxibe combinados com anticorpo anti-PD-1 em camundongos portadores de tumor JC. Camundongos BALB/ c portadores de tumor de mama JC foram tratados com várias modalidades terapêuticas, conforme indicado. IgG, controle anti-lgG (veículo, 10 mg/kg); PD-1, anticorpo monoclonal de Anti-PD-1 (10 mg/kg); CD, chidamida (50 mg/kg); C, celecoxibe (50 mg/kg); M, metformina (100 mg/kg). Os volumes tumorais totais (A), volumes tumorais individuais (B), camundongos portadores de tumor JC (C), e a sobrevivência dos animais (D) foram registrados. Camundongos portadores de tumor JC foram tratados como indicado, e sacrificados quando o volume do
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8/56 tumor atingiu 3000 mm3 após a implantação do tumor. Médias e DPs são mostrados. O número de animais utilizados em cada braço experimental e os valores de P também são indicados. * P < 0,05. Os valores de P foram calculados usando teste T de Student que comparou o tamanho do tumor no grupo de indicação com o grupo de IgG.
[0021] As Figuras 7 A a E mostram a resposta terapêutica do chidamida (em diferentes doses) mais metformina e celecoxibe combinados com ou sem o anticorpo anti-PD-L1 (em doses diferentes) em camundongos portadores de tumor CT26. Os camundongos BALB/ c portadores de um tumor do cólon CT26 foram tratados com várias modalidades terapêuticas como indicado. IgG, controle anti-lgG (veículo, 10 mg/kg); PD-L1, anticorpo monoclonal anti-PD-L1 (2,5 e 10 mg/kg); CD, chidamida (6.25, 12.5 ou 50 mg/kg); C, celecoxibe (50 mg/kg); M, metformina (100 mg/kg). Os volumes tumorais totais após o tratamento com anticorpo anti-PD-L1 (2,5 ou 10 mg/kg) e chidamida (6,25 ou 50 mg/kg) mais celecoxibe (50 mg/kg) e metformina (100 mg/kg) (A), os volumes tumorais totais após o tratamento com chidamida (6,25,
12,5 ou 50 mg/kg) mais celecoxibe (50 mg/kg) e metformina (100 mg/kg) na ausência de anticorpo anti-PD-L1 (B), os volumes tumorais individuais após o tratamento com chidamida (6,25, 12,5 ou 50 mg/kg) mais celecoxibe (50 mg/kg) e metformina (100 mg/kg) na presença (2,5 ou 10 mg/kg) ou ausência de anticorpo anti-PD-L1 (C), o peso corporal de camundongos portadores de tumor CT26 (D) e a sobrevivência animal (E) foram registrados. Os camundongos portadores de tumor CT26 foram tratados como indicado, e sacrificados quando o volume do tumor atingiu 3000 mm3 após a implantação do tumor. Médias e DPs são mostrados. O número de animais utilizados em cada braço experimental e os valores de P também são indicados. * P < 0,05. Os valores de P foram calculados usando teste T de Student que comparou o tamanho do tumor no grupo de indicação com o grupo de IgG.
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9/56 [0022] As Figuras 8 A a E mostram a resposta terapêutica dos anticorpos anti-PD-1 ou anti-PD-L1 combinado com chidamida mais celecoxibe, com ou sem metformina em camundongos portadores de tumor CT26. Os camundongos BALB/ c portadores de um tumor do cólon CT26 foram tratados com várias modalidades terapêuticas como indicado. IgG, controle anti-lgG (veículo, 2,5 mg/kg); PD-1, anticorpo monoclonal anti-PD-1 (2,5 mg/kg); PD-L1, anticorpo monoclonal anti-PD-L1 (2,5 mg/kg); CD, chidamida (50 mg/kg); C, celecoxibe (50 mg/kg); M, metformina (100 mg/kg). Os volumes tumorais totais após o tratamento com chidamida (50 mg/kg) mais celecoxibe (50 mg/kg) com ou sem metformina (100 mg/kg), na presença ou ausência de anticorpos antiPD-1/ anti-PD-L1 (A), os volumes tumorais totais após o tratamento com anticorpo anti-PD-1 ou anti-PD-L1 combinado com chidamida (50 mg/kg) mais celecoxibe (50 mg/kg) e metformina (100 mg/kg) em comparação com os grupos de controle de anti-PD-1 ou anti-PD-L1 (B), volumes tumorais individuais após o tratamento com várias modalidades terapêuticas, como indicado (C), o peso corporal de camundongos com tumor CT26 (D) e a sobrevivência dos animais (E) foram registrados. Os camundongos portadores de tumor CT26 foram tratados como indicado, e sacrificados quando o volume do tumor atingiu 3000 mm3 após a implantação do tumor. Médias e DPs são mostrados. O número de animais utilizados em cada braço experimental e os valores de P também são indicados. * P < 0,05. Os valores de P foram calculados usando teste T de Student que comparou o tamanho do tumor no grupo de indicação com o grupo de IgG.
[0023] As Figuras 9 A a H mostram a resposta terapêutica de chidamida mais celecoxibe em vários regimes de dose combinado com anticorpo anti-PD-1 em camundongos portadores de tumor CT26. Os camundongos BALB/ c portadores de um tumor do cólon CT26 foram tratados com várias modalidades terapêuticas como indicado. IgG, controle anti-lgG (veículo, 2.5 mg/kg); PD-1,
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10/56 anticorpo monoclonal anti-PD-1 (2,5 mg/kg); CD, chidamida (12,5, 25 ou 50 mg/kg); C, celecoxibe (12,5, 25 ou 50 mg/kg). Os volumes tumorais totais após o tratamento com anticorpo anti-PD-1 combinado com chidamida 12,5 mg/kg mais celecoxibe em várias doses (12,5, 25,0 ou 50 mg/kg) (A), os volumes tumorais totais após o tratamento com anticorpo anti-PD-1 combinado com chidamida 25 mg/kg mais celecoxibe em várias doses (12,5, 25,0 ou 50 mg/kg) (B) os volumes tumorais totais após o tratamento com anticorpo anti-PD-1 combinados com chidamida a 50 mg/kg mais celecoxibe em várias doses (12,5, 25,0 ou 50 mg/kg) (C) os volumes tumorais individuais após o tratamento com várias modalidades terapêuticas como indicado (D), o peso corporal de camundongos portadores de tumor CT26 (E) e sobrevivência dos animais (F a H) foram registrados. Os camundongos portadores de tumor CT26 foram tratados como indicado, e sacrificados quando o volume do tumor atingiu 3000 mm3 após a implantação do tumor. Médias e DPs são mostrados. O número de animais utilizados em cada braço experimental e os valores de P também são indicados. * P < 0,05. Os valores de P foram calculados usando teste T de Student que comparou o tamanho do tumor no grupo de indicação com o grupo de IgG.
[0024] As Figuras 10 A a H mostram a resposta terapêutica do inibidor de HDAC (chidamida e mocetinostat) mais inibidores de COX-2 (celecoxibe, aspirina, ibuprofeno) combinados com anticorpo anti-PD-1 ou antiCTLA-4 em camundongos portadores de tumor CT26. Os camundongos BALB/ c portadores de um tumor do cólon CT26 foram tratados com várias modalidades terapêuticas como indicado. IgG, controle anti-lgG (veículo, 2.5 mg/kg); PD-1, anticorpo monoclonal anti-PD-1 (2,5 mg/kg); CTLA4: anticorpo monoclonal antiCTLA4 (2,5 mg/kg); CD, chidamida (50 mg/kg); Moc, mocetinostat (30 mg/kg); C, celecoxibe (50 mg/kg); Asp, aspirina (50 mg/kg); Ibu, ibuprofeno (50 mg/kg). Os volumes tumorais totais após tratamento com anticorpo anti-PD-1 combinado
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11/56 com chidamida (50 mg/kg) mais inibidor de COX-2 (celecoxibe 50 mg/kg, aspirina 50 mg/kg ou ibuprofeno 50 mg/kg) comparados aos dos grupos de controle (anticorpo anti-PD-1 sozinho e combinação sem anticorpo anti-PD-1) (A), os volumes tumorais totais após o tratamento com anticorpo anti-PD-1 combinado com celecoxibe 50 mg/kg mais inibidor de HDAC (chidamida a 50 mg/kg ou mocetinostat 30 mg/kg) (B) os volumes tumorais totais após o tratamento com anticorpo anti-CTI_A4 ou anti-PD-1 combinado com chidamida a 50 mg/kg mais celecoxibe de 50 mg/kg (C), volumes tumorais individuais após o tratamento com várias modalidades terapêuticas, como indicado (D), o peso corporal dos camundongos portadores de tumor CT26 (E) e a sobrevivência dos animais (F a H) foram registrados. Os camundongos portadores de tumor CT26 foram tratados como indicado, e sacrificados quando o volume do tumor atingiu 3000 mm3após a implantação do tumor. Médias e DPs são mostrados. O número de animais utilizados em cada braço experimental e os valores de P também são indicados. *P < 0,05. Os valores de P foram calculados usando teste T de Student que comparou o tamanho do tumor no grupo de indicação com o grupo de IgG.
[0025] As Figuras 11 A a D confirmam a resposta terapêutica do chidamida mais celecoxibe em dose fixa combinada com anticorpo anti-PD-1 em camundongos portadores de tumor CT26. Os camundongos BALB/ c portadores de um tumor do cólon CT26 foram tratados com várias modalidades terapêuticas como indicado. IgG, controle anti-lgG (veículo, 2,5 mg/kg); PD-1, anticorpo monoclonal anti-PD-1 (2,5 mg/kg); CD, chidamida (50 mg/kg); C, celecoxibe (50 mg/kg). Os volumes tumorais totais após o tratamento com chidamida mais celecoxibe combinados com ou sem anticorpo anti-PD-1 (A), volumes tumorais individuais após o tratamento com várias modalidades terapêuticas, conforme indicado (B), peso corporal dos camundongos portadores de tumor CT26 (C) e sobrevivência dos animais (D) foram registrados. Os camundongos portadores
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12/56 de tumor CT26 foram tratados como indicado, e sacrificados quando o volume do tumor atingiu 3000 mm3 após a implantação do tumor. Médias e DPs são mostrados. O número de animais foi aumentado em cada braço experimental e os valores de P também são indicados. * P < 0,05. Os valores de P foram calculados usando teste T de Student que comparou o tamanho do tumor no grupo de indicação com o grupo de IgG.
[0026] As Figuras 12 A a E mostram a resposta terapêutica do chidamida mais metformina e celecoxibe em dose fixa combinada com anticorpo anti-PD-L1 em camundongos portadores de tumor CT26. Camundongos BALB/ c nus portadores de um tumor de cólon CT26 foram tratados com várias modalidades terapêuticas como indicado. IgG, controle anti-lgG (veículo, 2,5 mg/kg); PD-L1, anticorpo monoclonal anti-PD-L1 (2,5 mg/kg); CD, chidamida (50 mg/kg); C, celecoxibe (50 mg/kg); M, metformina (10 mg/kg). Os volumes tumorais individuais após o tratamento com o anticorpo anti-PD- L1 combinado com o chidamida mais celecoxibe e metformina comparados com os dos grupos de controle (A), os volumes tumorais individuais após o tratamento com várias modalidades terapêuticas como indicado (B), peso corporal dos camundongos portadores de tumor (C), o peso do tumor (D), e a comparação das atividades antitumorais entre camundongos normais e nus (E) foram registrados.
[0027] Figuras 13 A a F mostram a resposta de células imunes após tratamento com anticorpo anti-PD-1 e chidamida combinado com o celecoxibe. Camundongos BALB/ c portadores de tumores metastáticos CT26 foram tratados com as modalidades terapêuticas indicadas, e análises FACS foram utilizadas para avaliar células imunológicas circulantes e infiltrantes de tumores. Médias e DPs são mostrados, com valores de P indicados. IgG, controle antilgG (veículo, 2,5 mg/kg); PD-1, anticorpo monoclonal anti-PD-1 (2,5 mg/kg); CD, chidamida (50 mg/kg); C, celecoxibe (50 mg/kg). A Figura 13A mostra resultados de FACS para CD4, CD8, PMN-MDSC, M-MDSC, e células Treg. Dados FACS
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13/56 representativos mostrando as percentagens de células Ly6G+Ly6Cbaixas (PMNMDSCs) e células Ly6C+Ly6G' (M-MDSCs) em células em circulação dependentes de CD45+CD11b+. Camundongos não portadores de tumor n = 6; Camundongos portadores de tumor n = 11. A Figura 13B mostra resultados de FACS para células em circulação M-MDSC por tratamentos terapêuticos diferentes indicados em camundongos portadores de tumor, em comparação com os camundongos que não portam tumores. A Figura 13C mostra resultados de FACS para fazer células circulantes Ly6C+Ly6G' (M-MDSCs) no dia 12 correlacionado com o tamanho do tumor correspondente no dia 23 após o tratamento indicado nos camundongos como mostrado na Figura 13B. A Figura 13D mostra resultados de FACS para células circulantes FoxP3+ Tregs por tratamento indicado no dia 8 e dia 12. Dados representativos de FACS mostram percentagens de células duplamente positivas para FoxP3 e CD25 em leucócitos circulantes. A Figura 13E mostra os resultados de FACS para células mieloide infiltrantes de tumor (CD11b+), TAM, e M-MDSC por tratamento indicado no dia
8. A Figura 13F mostra os resultados de FACS para células infiltrantes do tumor CD4+CD25+FoxP3+ Tregs, células T CD4+, e células T CD8+ por tratamento indicado no dia 8. A Figura 13G mostra a proporção relativa de células T CD4+ e células Treg em tecidos tumorais de camundongos portadores de tumor CT26 após vários tratamentos, conforme examinado por análise citométrica de fluxo. Figura 13H mostra a relação relativa de células T CD8+ e células Treg em tecidos tumorais de camundongos portadores de tumor CT26 após vários tratamentos, como examinado por análise de citometria de fluxo. * P < 0,05. Ensaio de dados para células imunológicas circulantes em cada grupo n = 6, ensaio de dados por células imunológicas que infiltram no tumor em cada grupo n = 2.
Descrição Detalhada da Invenção [0028] A menos que definido de outro modo, todos os termos técnicos e científicos aqui utilizados têm o mesmo significado que o normalmente
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14/56 entendido por um técnico no assunto à qual esta invenção pertence. Embora quaisquer métodos e materiais semelhantes ou equivalentes aos aqui descritos possam ser utilizados na prática ou teste da invenção, os métodos e materiais preferidos são agora descritos. Todas as publicações aqui mencionadas são aqui incorporadas por referência.
[0029] O termo “um” e “uma” refere-se a um ou mais do que um (ou seja, pelo menos um) do objeto gramatical do artigo. Por exemplo, “um elemento” significa um elemento ou mais de um elemento. O uso de “ou” significa “e/ ou “, a menos que especificamente indicado de outra forma.
[0030] Como aqui utilizado, “sujeito”, “indivíduo” e “paciente” são utilizados indistintamente para se referir um vertebrado, de preferência um mamífero, mais preferivelmente um humano. Mamíferos incluem, mas não estão limitados a, murinos, símios, humanos, animais de fazenda, animais de esporte e animais de estimação. Tecidos, células e sua progênie de uma entidade biológica obtida in vitro ou cultivadas in vitro também são englobados.
[0031] Como aqui utilizado, “quantidade terapeuticamente eficaz” significa uma quantidade suficiente para tratar um sujeito que sofre de uma doença (por exemplo, uma doença neurodegenerativa) ou para aliviar um sintoma ou uma complicação associada com a doença.
[0032] Tal como aqui utilizado, os termos “tratar, “tratando”, “tratamento” e semelhantes referem-se à redução ou melhoria de um distúrbio e/ ou sintomas a ele associado. Será apreciado que, embora não seja excluída, o tratamento de uma desordem ou condição não requer que o distúrbio, condição ou sintomas associados com estes sejam completamente eliminados.
[0033] Como aqui utilizado, o termo “imunoterapia” refere-se ao tratamento de um sujeito afetado ou em risco de contrair ou sofrer uma recorrência de uma doença por um método compreendendo induzir, melhorar, suprir ou de outro modo modificar uma resposta imune.
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15/56 [0034] Como aqui utilizado, o termo “proteína 1 de morte celular programada (PD-1)” refere-se a um receptor imuno-inibidor pertencente à família CD28. A PD-1 é expressa predominantemente em células T previamente ativadas in vivo e se liga a dois ligantes, PD-L1 e PD-L2. O termo “PD-1” tal como aqui utilizado inclui PD-1 humano (hPD-1), variantes, isoformas e homólogos de espécies de hPD-1 e análogos com pelo menos um epítopo comum com hPD-1. A sequência completa de hPD-1 pode ser encontrada no número de acesso do GenBank U64863.
[0035] Tal como aqui utilizado, o termo “ligante 1 de morte programada (PD-L1)” é um dos dois ligantes de glicoproteína de superfície celular para PD-1 (o outro sendo PD-L2) que regulam negativamente a ativação de células T e secreção de citoquina após a ligação com PD-1. O termo “PD-L1” tal como aqui utilizado inclui PD-L1 humano (hPD-L1), variantes, isoformas e espécies homólogas de hPD-L1 e análogos possuindo pelo menos um epítopo comum com hPD-L1. A sequência completa hPD-L1 pode ser encontrada no número de acesso do GenBank Q9NZQ7.
[0036] Como aqui utilizado, um “anticorpo” e “fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos” englobam imunoglobulinas de ocorrência natural (por exemplo, IgM, IgG, IgD, IgA, IgE, etc.) bem como imunoglobulinas de ocorrência não natural, incluindo, por exemplo, anticorpos de cadeia simples, anticorpos quiméricos (por exemplo, anticorpos de murinos humanizados), anticorpos heteroconjugados (por exemplo, anticorpos biespecíficos), Fab’, F(ab’).sub.2, Fab, Fv e rlgG. Como aqui utilizado, um “fragmento de ligação ao antígeno” é uma porção do anticorpo completo que retém a capacidade de reconhecer especificamente o antígeno, bem como várias combinações de tais porções.
[0037] Como aqui utilizado, o termo “câncer” refere-se a um amplo grupo de várias doenças caracterizadas pelo crescimento descontrolado de células anormais no corpo. A divisão celular desregulada e o crescimento
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16/56 resultam na formação de tumores malignos que invadem os tecidos vizinhos e podem também metastatizar para partes distantes do corpo através do sistema linfático ou da corrente sanguínea. “Câncer”, tal como é aqui utilizado, refere-se a cânceres primários, metastáticos e recorrentes.
[0038] A presente invenção desenvolve métodos que focam sobre a regulação dos componentes do microambiente do tumor, em que removendo a supressão imunológica em um microambiente tumoral ou estimulando um sistema imune contra células cancerosas. O microambiente tumoral é um aspecto importante da biologia do câncer que contribui para o início do tumor, a progressão do tumor e as respostas à terapia. O microambiente tumoral é composto por uma população celular heterogênea que inclui células malignas e células que suportam a proliferação tumoral, a invasão e o potencial metastático através de conversa cruzada (crosstalk) extensa. As células tumorais geralmente induzem um microambiente imunossupressor, que favorece o desenvolvimento de populações imunossupressoras de células imunológicas, como células supressoras derivadas de mieloides (MDSCs) e células T regulatórias (Tregs). Portanto, foram descobertos alvos dentro do microambiente tumoral que podem ajudar a dirigir e melhorar as ações de várias terapias contra o câncer, notadamente imunoterapias que atuam potencializando as respostas imunológicas antitumorais do hospedeiro.
[0039] Assim, o primeiro aspecto da presente invenção é fornecer um método de remoção de supressão imunológica em um microambiente tumoral ou estimulando um sistema imune contra as células de câncer, compreendendo a administração a um sujeito de uma combinação farmacêutica de um inibidor de HDAC e um NSAID em combinação com um inibidor de ponto de verificação imunológico. Alternativamente, a presente divulgação fornece uma utilização de uma combinação farmacêutica de um inibidor de HDAC e um NSAID na fabricação de um medicamento para a remoção de supressão
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17/56 imunológica em um microambiente tumoral ou estimulando um sistema imune contra células de câncer, em que a combinação farmacêutica é administrada em combinação com um inibidor de ponto de verificação imunológico. Alternativamente, a presente divulgação fornece uma combinação farmacêutica para a remoção de supressão imunológica em um microambiente tumoral ou estimula um sistema imune contra células de câncer, em que a combinação farmacêutica compreende um inibidor de HDAC e um NSAID e é administrada em combinação com um inibidor de ponto de verificação imunológico.
[0040] O segundo aspecto da presente invenção é fornecer uma combinação farmacêutica que compreende um inibidor de HDAC, um NSAID e um inibidor de ponto de verificação imunológico.
[0041] Em uma forma de realização, as quantidades do inibidor de HDAC, a NSAID tal como inibidor de COX-2 e o inibidor de ponto de verificação imunológico na combinação farmacêutica são cerca de 10% a cerca de 70% (p/p), cerca de 10% a cerca de 70% (p/p) e cerca de 0,5% a cerca de 20%, respectivamente.
[0042] Em algumas formas de realização, a quantidade de inibidor de HDAC na combinação farmacêutica varia de cerca de 20% (p/p) a cerca de 70% (p/p), cerca de 30% a cerca de 70% (p/p), cerca de 40% a cerca de 70% (p/p), cerca de 20% a cerca de 60% (p/p), cerca de 30% a cerca de 60% (p/p), cerca de 40% a cerca de 60% (p/p) ou cerca de 35% a cerca de 60% (p/p).
[0043] Em algumas formas de realização, a quantidade da NSAID na combinação farmacêutica varia entre cerca de 20% e cerca de 70% (p/p), cerca de 30% a cerca de 70% (p/p), cerca de 40% a cerca de 70% (p/p), cerca de 20% a cerca de 60% (p/p), cerca de 30% a cerca de 60% (p/p), cerca de 40% a cerca de 60% (p/p) ou cerca de 35% a cerca de 60% (p/p).
[0044] Os HDACs mostraram estar envolvidos na transformação oncogênica por expressão gênica mediada que influencia a progressão do ciclo
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18/56 celular, proliferação e apoptose. Os HDACs são investigados como possíveis alvos de tratamento para cânceres, doenças parasitárias e inflamatórias. Com base na sua homologia de domínios acessórios para as deacetilases de levedura, as 18 desacetilases de histona humana atualmente conhecidas são classificadas em quatro grupos (l-IV). A classe I, que inclui HDAC1, -2, -3 e -8, está relacionada ao gene RPD3 de levedura; A classe IIA inclui HDAC4, -5, -7 e -9; A classe IIB -6 e -10 está relacionada ao gene Hda1 da levedura; A classe III, também conhecida como sirtuínas, está relacionada ao gene Sir2 e inclui SIRT17; e a classe IV, que contém apenas HDAC11 possui características das Classes I e II.
[0045] Em uma forma de realização da presente divulgação, o inibidor de HDAC é um inibidor de HDAC de classe I. De preferência, o inibidor de HDAC é um inibidor seletivo de classe I de HDACs. Em algumas formas de realização, o inibidor de HDAC é uma classe de benzamida de inibidor da histona desacetilase (HDAC). Em algumas formas de realização, o inibidor de HDAC inclui, mas não está limitado o chidamida, vorinostat, romidepsin, panobinostat, belinostat, panobinostat, ácido valproico, mocetinostat, abexinostat, entinostat, pracinostat, resminostat, givinostat e quisinostat. Em algumas formas de realização, o inibidor de HDAC é chidamida, entinostat, ou mocetinostat.
[0046] O NSAID é uma classe de drogas que reduz a dor, diminui a febre e, em doses mais altas, diminui a inflamação. A maioria dos NSAIDs inibe a atividade da ciclooxigenase-1 (COX-1) e da ciclooxigenase-2 (COX-2) e, assim, a síntese de tromboxanos e prostaglandinas. Pensa-se que a inibição da COX-2 conduza a efeitos anti-inflamatórios, analgésicos e antipiréticos, enquanto que os NSAIDs que também inibem a COX-1, particularmente a aspirina, podem causar hemorragias gastrointestinais e úlceras em grandes doses. Os inibidores de COX-2 são amplamente utilizados no tratamento de doenças autoimunes e inflamatórias. A ciclooxigenase (COX), que tem duas
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19/56 isoformas, COX-1 e COX-2, é a enzima responsável pela etapa determinante da taxa na síntese dos lipídeos bioativos de prostanoides consistindo em prostaglandina D2 (PGD2), PGE2, PGF2a, prostaciclina PGI2 e tromboxano TXA2. A COX-1 é constitutivamente expressa em tecidos do corpo para manter prostanoides homeostáticos e está envolvida em várias funções biológicas, como angiogênese, vasodilatação e manutenção de tecidos. No entanto, a COX2 é expressa em níveis baixos em condição normal. A COX-2 é rapidamente induzida por estímulos como infecção, lesão e dor para iniciar os processos próinflamatórios. Inibidores seletivos da COX-2 são um tipo de drogas antiinflamatórias não esteroidais (NSAIDs).
[0047] Em algumas formas de realização, a NSAID inclui, mas não está limitada a, aspirina, ibuprofeno, indometacina, naproxeno e um inibidor de COX-2. Em algumas formas de realização da presente invenção, a NSAID é um inibidor de COX-2. Em algumas formas de realização, o inibidor de COX-2 inclui, mas não está limitado a, Celebrex (nome genérico é o celecoxibe), rofecoxibe e etoricoxibe. De preferência, o inibidor de COX-2 é celecoxibe.
[0048] Em uma forma de realização, o inibidor de ponto de verificação imunológica pode ser utilizado em combinação com a combinação farmacêutica aqui descrita para estimular um sistema imune contra células cancerosas e tratar um câncer. Os inibidores de ponto de verificação imunológica adequados para utilização na presente descrição compreendem um antagonista de um receptor inibidor que inibe a PD-1, CTLA-4, imunoglobulina-3 de células T, atenuadores de linfócitos B e T, supressor Ig de domínio V da ativação das células T ou via de ativação do gene 3 por linfócitos, tais como anticorpos antiPD-1, anticorpos anti-PD-L1, anticorpos anti-CTLA-4, anticorpos anti-TIM-3 (imunoglobulina-3 de células T), anticorpos anti-BTLA (atenuador de linfócitos B e T), anticorpos anti-VISTA (supressor Ig de domínio V de ativação de células T) e anticorpos anti-LAG-3 (gene 3 de ativação de linfócitos). Exemplos de
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20/56 inibidores de PD-1 ou PD-L1 incluem, sem limitação anticorpos humanizados que bloqueiam PD-1 humana, tais como lambrolizumab (anti-PD-1 Ab, nome comercial Keytruda) ou pidilizumab (anti-PD-1 Ab), Bavencio (anti -PD-L1 Ab, avelumab), Imfinzi (anti-PD-L1 Ab, durvalumab) e Tecentriq (anti-PD-L1 Ab, atezolizumab) bem como anticorpos totalmente humanos como nivolumab (antiPD-1 Ab, nome comercial Opdivo) e cemiplimab-rwlc (anti-PD-1 Ab, nome comercial Libtayo). Outros inibidores de PD-1 podem incluir apresentações de ligante de PD-1 solúvel incluindo, sem limitação, a proteína de fusão PD-L2 Fc também conhecida como B7-DC-lg ou AMP-244 e outros inibidores de PD-1 presentemente sob investigação e/ ou desenvolvimento para uso em terapia. Adicionalmente, os inibidores do ponto de verificação imunológico podem incluir, sem limitação, anticorpos humanizados ou totalmente humanos que bloqueiam PD-L1, tais como durvalumab e MIH1 e outros inibidores de PD-L1 presentemente sob investigação. Em algumas formas de realização, a quantidade do inibidor de ponto de verificação imunológico varia de cerca de 0,5% (p/p) a cerca de 15% (p/p), 0,5% (p/p) a cerca de 10% (p/p), 0,5% (p/p) para cerca de 5% (p/p), 1,0% (p/p) a cerca de 20% (p/p), 1,0% (p/p) a cerca de 15% (p/p), 1,0% (p/p) a cerca de 10% (p/p) ou 1,0% (p/p) a cerca de 5% (p/p).
[0049] Em uma forma de realização, a combinação aqui descrita compreende ainda um composto de biguanida. Em algumas formas de realização, a quantidade do composto de biguanida varia de cerca de 30% a cerca de 70% (p/p), cerca de 30% a cerca de 60% (p/p), cerca de 30% a cerca de 50% (p/p), cerca de 50% a cerca de 80% (p/p), cerca de 60% a cerca de 80% (p/p) ou cerca de 60% a cerca de 70% (p/p), 40% a cerca de 70% (p/p), cerca de 40% a cerca de 60% (p/p) ou cerca de 40% a cerca de 50% (p/p).
[0050] A biguanida é um composto orgânico com a fórmula HN(C(NH)NH2)2. Uma variedade de derivados de biguanida são usadas como drogas farmacêuticas. O termo “biguanidina” frequentemente refere-se
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21/56 especificamente a uma classe de drogas que funcionam como drogas antihiperglicêmicas orais utilizadas para a diabetes mellitus ou tratamento prédiabetes.
[0051] Em algumas formas de realização da presente invenção, o composto de biguanida, inclui, mas não está limitado a, metformina, fenformina, proguanil e clorproguanil. De preferência, o composto de biguanida é a metformina.
[0052] Em uma forma de realização, a combinação farmacêutica de um inibidor de HDAC e um NSAID é administrada com o inibidor de ponto de verificação imunológico simultaneamente ou sequencialmente em qualquer ordem ou de forma alternada. Em algumas formas de realização da presente divulgação, o inibidor de HDAC, a NSAID, o inibidor de ponto de verificação imunológico e um composto de biguanida são administrados simultaneamente. Em algumas formas de realização, o inibidor de HDAC, a NSAID, o inibidor de ponto de verificação imunológico e o composto de biguanida são administrados sequencialmente em qualquer ordem ou de forma alternada.
[0053] Em uma outra forma de realização, o método compreende ainda a administração de um ou mais agentes anticânceres adicionais. O agente anticâncer adicional é qualquer agente anticâncer aqui descrito ou conhecido na arte. Em uma forma de realização, o agente anticâncer adicional é uma quimioterapia ou uma quimioterapia de baseada em doublet de platina. Em certas formas de realização, o agente anticâncer adicional é um inibidor da tirosina quinase (TKI). Em uma forma de realização, o agente anticâncer adicional é um anticorpo anti-VEGF. Em outras formas de realização, o agente anticâncer é um agente de platina (por exemplo, cisplatina, carboplatina), um inibidor mitótico (por exemplo, paclitaxel, paclitaxel ligado a albumina, docetaxel, taxotere, docecad), um alcalóide de Vinca fluorado (por exemplo, vinflunina, javlor), vinorelbina, vinblastina, etoposida ou gemcitabina pemetrexada. Em uma
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22/56 forma de realização, o agente anticâncer adicional é o 5-flurouracil (5-FU). Em certas formas de realização, o agente anticâncer adicional é qualquer outro agente anticâncer conhecido na técnica.
[0054] A combinação farmacêutica da presente invenção pode ser formulada com um “veículo”. Como aqui utilizado, “veículo” inclui qualquer solvente, meio de dispersão, veículo, revestimento, diluente, agente antibacteriano e/ ou antifúngico, agente isotônico, agente de retardamento de absorção, tampão, solução transportadora, suspensão, coloide e semelhantes. A utilização de tais meios e/ ou agentes para substâncias ativas farmacêuticas é bem conhecida na técnica. Por exemplo, as combinações farmacêuticas podem ser especialmente formuladas para administração na forma sólida ou líquida, incluindo aquelas adaptadas para o seguinte: (1) administração oral, por exemplo, empapas (soluções ou suspensões aquosas ou não aquosas), pastilhas, drágeas, cápsulas, pílulas, comprimidos (por exemplo, aqueles direcionados para absorção bucal, sublingual e sistêmica), bolos, pós, grânulos, pastas para aplicação na língua; (2) administração parentérica, por exemplo, por injeção subcutânea, intramuscular, intravenosa ou epidural como, por exemplo, uma solução ou suspensão estéril, ou formulação de libertação prolongada; (3) aplicação tópica, por exemplo, como um creme, loção, gel, unguento ou um penso de liberação controlada ou spray aplicado na pele; (4) intravaginalmente ou intraretalmente, por exemplo, como um pessário, creme, supositório ou espuma; (5) sublingualmente; (6) ocularmente; (7) transdermicamente; (8) transmucosamente; ou (9) nasalmente.
[0055] Em um aspecto adicional, a presente invenção fornece um método de tratamento de um câncer em um sujeito, o método compreendendo a administração de uma combinação farmacêutica da presente invenção para o sujeito.
[0056] Em algumas formas de realização, o câncer inclui, mas não
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23/56 está limitado a, glioblastoma, câncer de fígado (tais como o carcinoma hepatocelular), o carcinoma colorretal, o câncer gástrico, câncer coloretal, câncer de esôfago, câncer de pulmão (tal como câncer de pulmão de célula não pequena (NSCLC) e câncer de pulmão de célula pequena), câncer de pâncreas, carcinoma de célula renal, hiperplasia benigna da próstata, câncer de próstata, câncer de ovário, melanoma, câncer da mama, leucemia linfocítica crônica (CLL), carcinoma celular de Merkel, linfoma não-Hodgkin, leucemia mieloide aguda(AML), câncer de vesícula biliar, colangiocarcinoma, câncer da bexiga urinária, e câncer uterino.
[0057] Em algumas formas de realização, a combinação farmacêutica da invenção pode ser fornecida em uma formulação única. Em outras formas de realização, a combinação farmacêutica da invenção pode ser fornecida em formulações separadas. Uma combinação farmacêutica pode ser formulada em uma variedade e/ ou em várias formas adaptadas a uma ou mais vias preferidas de administração. Assim, uma combinação farmacêutica pode ser administrada através de uma ou mais vias conhecidas, incluindo, por exemplo, oral, parenteral (por exemplo, intradérmica, transcutânea, subcutânea, intramuscular, intravenosa, intraperitoneal, etc.) ou tópica (por exemplo, intranasal, intrapulmonar, intramamária, intravaginal, intrauterina, intradérmica, transcutânea, retal, etc.). Uma combinação farmacêutica, ou uma porção da mesma, pode ser administrada a uma superfície da mucosa, tal como por administração a, por exemplo, a mucosa nasal ou respiratória (por exemplo, por pulverização ou aerossol). Uma combinação farmacêutica, ou uma porção da mesma, também pode ser administrada através de uma liberação prolongada ou retardada.
[0058] Uma formulação pode ser convenientemente apresentada na forma de dosagem unitária e pode ser preparada por métodos bem conhecidos na técnica farmacêutica. Métodos de preparação de uma
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24/56 combinação com um veículo farmaceuticamente aceitável incluem a etapa de associar a combinação farmacêutica da invenção a um veículo que constitui um ou mais ingredientes acessórios. Em geral, uma formulação pode ser preparada associando uniformemente e/ ou intimamente o composto ativo com um veículo líquido, um veículo sólido finamente dividido, ou ambos, e depois, se necessário, moldando o produto nas formulações desejadas.
[0059] Em algumas formas de realização, o método pode incluir a administração de uma quantidade suficiente da combinação farmacêutica para fornecer uma dose de, por exemplo, desde cerca de 10 mg/ kg a cerca de 1000 mg/kg para o sujeito.
[0060] A presente invenção é ilustrada pelos exemplos seguintes. Entender-se-á que os exemplos, materiais, quantidades e procedimentos particulares devem ser interpretados amplamente de acordo com o escopo e o espírito da invenção, como aqui estabelecido.
Exemplos Materiais e Métodos [0061] Reagente. Gibco RPMI 1640 e o DMEM com L-glutamina foram adquiridos da Invitrogen Life Technologies. O HyClone FBS foi adquirido da Thermo Scientific. Chidamida foi fornecida por GNTbm. Entinostat, mocetinostat, aspirina, ibuprofeno, celecoxibe e metformina foram adquiridos da Cayman Chemical (Ann Arbor, Ml). Os seguintes anticorpos e reagentes foram utilizados em experimentos com animais: anticorpo monoclonal anti-PD-L1 de rato (B7-H1) (10F.9G2; Bio X Cell), anticorpo monoclonal anti-PD-1 de rato (CD279) (RMP1 -14; Bio X Cell), anticorpo monoclonal anti-CTLA4 de rato (CD 152) (BE0164; Bio X Cell) e anticorpo monoclonal de controle do isotipo antilgG2a de rato (2A3; Bio X Cell).
[0062] Linhagens celulares. JC (CRL-2116; células de tumor de mama murino) e CT26 (CRL-2638; adenocarcinoma colorretal murino) foram
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25/56 adquiridos na ATCC. Ambas as linhagens celulares de tumor foram cultivadas em McCoy 5A suplementado com 10% (vol/ vol) de FBS a 37 °C, 5% de CO2.
[0063] Atividade anticâncer em modelos animais. A pesquisa em animais foi aprovada e supervisionada pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso Animal da Universidade de Taipei (TMU IACUC). Foram utilizados camundongos BALB/ C machos com seis a oito meses de idade (BioLASCO Taiwan) para todos os experimentos em animais. Células cancerosas JC (1 x 107), ou CT26 (5 x 106 — 1 x 107) foram inoculadas por s.c. no flanco direito de cada camundongo. Os tumores foram deixados crescer durante 11 dias (tamanho do tumor de cerca de 200 a 300 mm3) antes da randomização e tratamento. Os camundongos portadores de CT26 e JC receberam 10 ou 2,5 mg/kg de anticorpos anti-lgG, anti-PD-1 e/ ou anti-PD-L1 e anti-CTLA-4 (2,5 mg/kg) i.p. nos dias 11, 14, 17, 20, 23, e 26 após o implante do tumor, e todos os anticorpos foram diluídos até concentrações apropriadas em 100 pi de PBS estéril (pH 7,4) (Invitrogen Life Technologies). Os tratamentos com celecoxibe, chidamida, metformina, mocetinostat, entinostat, aspirina, ibuprofeno foram administrados oralmente no dia 11 pós implantação do tumor. Tratamento diário com celecoxibe (12,5, 25,0 e 50 mg/kg) ou metformina (100 ou 200 mg/kg) foi realizado dos dias 11 a 26. Chidamida foi administrado para o tratamento de camundongos portadores de tumor em doses de 6,25, 12,5, 25 e 50 mg/kg ou como dose única. Chidamida foi administrado por via oral diariamente dos dias 11 a 26. Entinostat foi oralmente administrado a uma dose de 20 mg/kg a cada dois dias a partir dos dias 11 a 25. Mocetinostat foi administrado oralmente a uma dose de 30 mg/kg de tratamento diário dos dias 11 a 26. Aspirina e ibuprofeno foram administrados oralmente a uma dose de 50 mg/kg de tratamento diário dos dias 11 a 26. A atividade anticâncer foi medida a partir do início do tratamento do crescimento tumoral até que o volume do tumor atingisse 3000 mm3. O volume do tumor foi calculado como comprimento * largura2 * 0,5.
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26/56 [0064] Taxa de Sobrevivência em Modelos Animais. A administração de anticorpo ou drogas foi realizada a partir dos dias 11 a 25 ou 26. O tumor continuou a crescer nos camundongos portadores de tumor. O volume do tumor dos camundongos foi medido uma vez a cada três dias. Os camundongos portadores de tumores eram considerados como mortos quando o volume de tumor alcançava 3000 mm3. Todos os grupos de tratamento foram registrados e analisados.
[0065] Experimento de Xenoenxerto in Vivo. A pesquisa em animais foi aprovada e supervisionada pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso Animal da Universidade de Taipei (TMU IACUC). Camundongos BALB/ c nus (6 semanas de idade, sexo feminino, 20 g de peso corporal) foram adquiridos da BioLASCO, Taiwan, e mantidos em condições isentas de patógenos. O modelo de tumor de xenoenxerto CT26 de camundongo era desenvolvido por injeção de 5 x 106células em 150 pl_ de células CT26. As células de câncer CT26 foram inoculadas s.c. no flanco direito de cada camundongo. As células tumorais foram deixadas crescer durante 2 semanas quando o tamanho do tumor alcançava 350 a 400 mm3 antes da randomização e do tratamento. Dezenove camundongos nus foram classificados em cinco grupos e tratamento. O animal teste recebeu 2,5 mg/kg de anti-lgG Ab como controle, 2,5 mg/kg de anti-PD-L1 Ab combinado com 50 mg/kg de chidamida mais 50 mg/kg de celecoxibe e 100 mg/kg de metformina, 50 mg/kg de chidamida combinada com 50 mg/kg de celecoxibe e 100 mg/kg de metformina, 50 mg/kg de chidamida e 50 mg/kg de celecoxibe. O processo de tratamento foi semelhante para todos os camundongos BALB/ C. A atividade anticâncer foi medida desde o início do tratamento do crescimento tumoral até ao dia 29 para sacrificar e pesar o tumor. O volume do tumor foi calculado como comprimento x largura2 x 0,5.
[0066] Citometria de Fluxo. Os seguintes anticorpos e reagentes foram utilizados para citometria de fluxo: CD3 APC (17A2; Biolegend), CD4 PE
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27/56 (GK1.5; Biolegend), CD8a PerCP (53-6.7; Biolegend), CD25 PerCP (PC61; Biolegend), Foxp3 PE (MF-14; Biolegend), CD11b APC (M1/70; Biolegend), Ly6C PerCP (HK1.4; Biolegend), Ly-6G PE (1A8; BioLegend), CD45 FITC (30-F11; Biolegend), MHC II (M5/ 114.15.2; eBioscience). A citometria de fluxo foi realizada com um BD FACSCalibur™ (BD Biosciences) e os dados foram analisados com o software FACSDiva (BD Biosciences). Para avaliar o nível de mieloides de circulação derivados da população de células supressoras (MDSC) e células T derivadas de linfoides, amostras de sangue foram coletadas dos camundongos no dia 8 e dia 12 após início dos tratamentos com anticorpo antiPD-1 (2,5 mg/kg) tratamentos com ou sem chidamida (50 mg/kg) mais celecoxibe (50 mg/kg). Cento e cinquenta microlitros de sangue foram coletados em um tubo Eppendorf da veia facial direita ou esquerda. RBCs de amostras de sangue anticoagulado foram imediatamente Usadas usando 2 mL de 1 x BD FACS Lyse (BD Biosciences) por 3 min, e as amostras foram lavadas duas vezes em BD FACS Buffer (BD Biosciences). As amostras foram coradas com os anticorpos apropriados. Para a análise, usou-se critérios fenotípicos anteriormente estabelecidos destas células como PMN-MDSC: células CD45+CD11b+Ly6G+Ly6Cbaixa, M-MDSC: células CD45+CD11 b+Ly6GLy6C+, células T CD4+: células CD45+CD3+CD4+, células T CD8+: células CD45+CD3+CD8+, células Treg: células CD45+CD3+CD25+FOXP3+, células TAM: células CD45+CD11b+MHCH+e células CD45+totais foram utilizadas como um denominador comum. Por outro lado, para avaliar o nível de populações de CD8+ intratumorais e de células T reguladoras (Treg), os linfócitos foram primeiro purificados de amostras de tumor excisadas do camundongo no dia 8 após o início dos tratamentos com anticorpo anti-PD-1 (2,5 mg/kg) com ou sem chidamida (50 mg/kg) mais celecoxibe (50 mg/kg). Resumidamente, tecidos tumorais primários foram colhidos, pesados e picados até fragmentos finos. O Kit de dissociação de tumor de camundongo (Cat: 130 -096-730) foi empregado.
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As três enzimas foram adicionadas a cada amostra na proporção de 1 mL por 200 mg de tecido tumoral. As amostras foram incubadas em um agitador endover-end durante 120 min a 37 °C. Os homogenizados de tecido resultantes foram filtrados em 0,4 pm e lavados três vezes em PBS gelado e utilizaram-se 1 x 106células por amostra para marcação do anticorpo. O nível de células T CD8+ foi avaliado usando critérios fenotípicos previamente estabelecidos de CD45+CD3+CD8+, e células CD45+CD3+ totais foram usadas como um denominador comum. O nível de células Treg foi avaliado usando critérios fenotípicos previamente estabelecidos de CD45+CD3+CD25+FOXP3+, e células CD45+CD3+totais foram usadas como um denominador comum.
[0067] Estatísticas. As médias e erros padrão foram calculados para todos os pontos de dados de pelo menos quatro experimentos independentes. Comparações entre pares do tamanho do tumor entre cada uma das condições experimentais e o grupo controle de IgG foram realizadas usando o teste t de duas amostras de Student (Systat Software, San Jose, CA, EUA).
Exemplo 1 - Efeitos de anticorpo anti-PD-1 [0068] Para compreender a atividade anticâncer de anticorpo antiPD-1 em camundongos BALB/ c portando célula de câncer de cólon CT26, o anticorpo anti-PD-1 foi administrado em que camundongos portando CT26 em 10 mg/kg de anticorpos anti-PD-1 e/ ou anti-lgG i.p. nos dias 11, 14, 17, 20, 23 e 26 da implantação pós-tumor. O experimento foi iniciado e quando o tamanho do tumor crescia a, aproximadamente, de 200-300 mm3. A taxa de resposta foi avaliada por vários ensaios. Neste estudo, definimos Resposta Parcial (PR, ü 2 vezes de crescimento tumoral em camundongos portando o tumor no fim do tratamento); Doença Estável (SD, entre dois e cinco vezes o crescimento tumoral em camundongos portando o tumor no final do tratamento); Doença Progressiva (PD, igual a ou maior do que cinco vezes o crescimento tumoral em camundongos portando o tumor no final do tratamento). Normalmente, mais de
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29/56 dez a quinze vezes o crescimento tumoral (cerca de 3000 mm 3) foi encontrado no grupo controle. O anticorpo anti-PD-1 inibiu significativamente o crescimento tumoral em comparação com o grupo de controle (tratados com grupo anti-lgG) (ver Figura 1A). Quando o tamanho do tumor do grupo de controle atingiu aproximadamente 3000 mm3, a do grupo de anticorpo anti-PD-1 cresceu cerca de 1200 mm3 (Figura 1A). No entanto, o anticorpo anti-PD-1 apenas inibiu o crescimento tumoral por um curto período de tempo; em seguida, o tumor continuou a crescer. No grupo de anticorpo anti-PD-1, SD foi observado em 3 camundongos e PD foi observado em 3 camundongos (ver Figura 1B).
Exemplo 2 - Efeitos do modulador epigenético combinado com o anticorpo anti-PD-1 [0069]A atividade anticâncer de chidamida ou entinostat em combinação com anticorpo anti-PD-1 foi avaliada em camundongos portando células tumorais CT26. O chidamida ou entinostat foram administrados oralmente a camundongos portando CT26, a uma dose de 25 mg/kg e 20 mg/kg, respectivamente. A chidamida foi administrada diariamente e o entinostat foi administrado a cada dois dias. A chidamida ou entinostat combinado com o anticorpo anti-PD-1 exibiram uma atividade anticâncer mais potente do que o anticorpo anti-PD-1 sozinho (Figura 1A). A chidamida combinada com o anticorpo anti-PD-1 foi mais eficaz na inibição do crescimento tumoral do que o chidamida sozinha. Os nossos resultados mostram que um camundongo alcançou PR, SD foi observado em três camundongos, e PD foi observado em um camundongo no grupo de chidamida em combinação com anticorpo anti-PD1 (Figura 1B). No entanto, o entinostat combinado com grupo de anticorpo antiPD-1 mostra mais potência em inibir o crescimento tumoral do que o chidamida combinado com grupo de anticorpo anti-PD-1 (Figura 1B). Em todos os grupos, os camundongos não perderam peso (Figura 1C). A taxa de sobrevivência foi avaliada com o modelo de camundongos portando o tumor. A taxa de
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30/56 sobrevivência foi avaliada quando o tamanho do tumor atingiu aproximadamente 3000 mm3. Todas as drogas foram administradas a partir de 11 a 26 dias. Os resultados mostram que chidamida combinado com grupo de anticorpo anti-PD1 tinha uma taxa de sobrevivência de 40% no dia 42, enquanto que a um grupo de anticorpo anti-PD-1 e entinostat combinado com um grupo de anticorpo antiPD-1 tem taxas de sobrevivência de cerca de 33% e 71%, respectivamente (Figura 1D).
Exemplo 3 - Efeitos do chidamida combinado com metformina e anticorpo anti-PD-1 [0070] Administrou-se oralmente 100 mg/kg de metformina a camundongos portadores de tumor. Os resultados mostram que o crescimento tumoral foi marcadamente inibido em comparação com o grupo controle (ver Figura 2A). No grupo tratado com metformina, SD foi observado em um camundongo e PD foi observado em cinco camundongos (Figura 2B). No entinostat combinado com o grupo de anticorpo anti-PD-1 (controle positivo), três camundongos alcançaram PR, SD foi observado em um camundongo e PD foi observado em três camundongos (Figura 2B). Como mostrado na Figura 2A, uma dose mais alta (50 mg/kg) de chidamida combinada com anticorpo anti-PD1 tem atividade anticâncer mais baixa do que uma dose baixa (12,5 mg/kg) de chidamida combinado com anticorpo anti-PD-1. O tratamento com chidamida a
12,5 mg/kg combinado com anticorpo anti-PD-1 era mais potente na inibição de crescimento tumoral do que chidamida em 25 ou 50 mg/kg combinado com anticorpo anti-PD-1 (Figura 2B). No chidamida a 12,5 mg/kg combinado com grupo de anticorpo anti-PD-1, SD foi observado em dois camundongos e PD foi observado em quatro camundongos. No entanto, o aumento da dose de chidamida não aumentou a atividade anticâncer (Figura 2B). Dois grupos, chidamida (50 mg/kg) combinado com anticorpo anti-PD-1 e chidamida (50 mg/kg) mais metformina (100 mg/kg) combinados com anticorpo anti-PD-1,
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31/56 foram testados e os resultados são mostrados na Figura 2B. Os resultados mostram que o tratamento com chidamida combinado com metformina e anticorpo anti-PD-1 é mais potente na inibição do crescimento tumoral de que com chidamida combinado com anticorpo anti-PD-1. Como mostrado na Figura 2B, dois camundongos alcançaram PR, SD foi observado em um camundongo, e PD foi observado em dois camundongos. Os camundongos em grupos de tratamento não perderam peso corporal (ver Figura 2C). Em seguida, a taxa de sobrevivência dos camundongos nos grupos de tratamento foi determinada no dia 58. Como mostrado na Figura 2D, o tratamento com a droga parou no dia 30. O tratamento com chidamida (50 mg/kg) combinado com metformina e anticorpo anti-PD-1 experimentou inibição mais potente do crescimento tumoral, e significativamente aumentou a taxa de sobrevivência em comparação com outros tratamentos de combinação. No chidamida (50 mg/kg) combinado com metformina e grupo de anticorpo anti-PD-1, a taxa de sobrevivência aumentou para 60%, enquanto o grupo de controle positivo (entinostat combinado com antiPD-1 Ab) teve apenas cerca de 20% de taxa de sobrevivência. Chidamida (50 mg/kg) combinado com anticorpo anti-PD-1 (10 mg/kg) não pode parar o crescimento tumoral; entretanto, após a adição de metformina (100 mg/kg) à combinação, a atividade inibitória e a taxa de sobrevivência aumentaram. O resultado sugere que a metformina pode influenciar o metabólito de carboidrato do tumor em um microambiente de tumor e assim melhorar a atividade anticâncer do inibidor de ponto de verificação imunológico (Figura 2D).
Exemplo 4 - Efeitos de chidamida ou entinostat + metformina + celecoxibe COMBINADOS COM ANTICORPO ANTI-PP-1 [0071] O tratamento com chidamida + metformina + celecoxibe + anticorpo anti-PD-1 ou entinostat + metformina + celecoxibe + anticorpo anti-PD1 era mais potente na inibição do crescimento tumoral do que aquele sem celecoxibe (Figura 3A). O grupo entinostat é mais potente que o grupo de
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32/56 chidamida. No entanto, na ausência de um modulador de epigenética, o grupo de tratamento de metformina + celecoxibe combinado com anticorpo anti-PD-1 mostraram diminuição na atividade anticâncer. Nenhum dos camundongos nos grupos de tratamento perdeu qualquer peso corporal (Figura 3C). Além disso, a Figura 3B mostra o crescimento tumoral de todos os camundongos nos grupos de tratamento. Os nossos resultados mostram que o entinostat + metformina combinado com o anticorpo anti-PD-1 e o entinostat + celecoxibe combinado com anticorpo anti-PD-1 são muito potentes em alcançar uma alta percentagem de PR. Celecoxibe desempenha um papel mais importante a atividade antitumoral em um microambiente de tumor do que a metformina (Figura 3B). O chidamida + metformina combinados com anticorpo anti-PD-1 ou chidamida + celecoxibe combinados com o anticorpo anti-PD-1 mostram resultados semelhantes, que alcançam uma elevada percentagem de PR. No entanto, na ausência de chidamida ou entinostat, a atividade anticâncer nos grupos de tratamento com inibidor de ponto de verificação imunológico diminui (Figura 3B). Os resultados sugerem que os inibidores de ponto de verificação imunológico necessitam de ser combinados com o modulador de epigenética para melhorar a atividade anticâncer. A melhoria pode resultar do controle do metabólito de carboidrato e produção de PGE2 em um microambiente de tumor por metformina e celecoxibe, e, portanto, irá resultar em taxa de resposta significativamente aumentada dos camundongos portadores de tumor CT26. Além disso, a taxa de sobrevivência do entinostato ou do chidamida + metformina + celecoxibe combinados com o grupo de anticorpo anti-PD-1 aumenta para cerca de 60 a 80%. No entanto, na ausência de chidamida/ entinostat, a taxa de sobrevivência diminui (ver o metformina mais celecoxibe combinado com o grupo de anticorpo anti-PD-1 na Figura 3D). Em relação à taxa de sobrevivência, o celecoxibe apresenta taxas de sobrevivência aumentadas em comparação com a metformina (Figura 3D). Nós descobrimos que o celecoxibe isoladamente ou o
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33/56 celecoxibe combinado com metformina são importantes fatores em sinergizar o efeito de inibidor de HDAC de classe I combinado com o anticorpo anti-PD-1 em aumentar a atividade anticâncer. A combinação do inibidor de HDAC de classe I + metformina + celecoxibe combinado com inibidores de ponto de verificação imunológico mostra o potencial na sua capacidade de curar o câncer nos modelos de camundongos portadores de tumor.
[0072] Em seguida, a dose de resposta ótima de chidamida foi determinada. Como mostrado na Figura 4A, tratamentos com diferentes regimes terapêuticos com uma dose fixa do anticorpo anti-PD-1 (10 mg/kg), várias doses de chidamida (12.5, 25,0, e 50 mg/kg), várias doses de celecoxibe (25 e 50 mg/kg) e várias doses de metformina (100 e 200 mg/kg) foram realizadas em camundongos que portam células tumorais CT26. O crescimento tumoral em todos os camundongos nestes grupos de tratamento é significativamente inibido em comparação com o grupo de anti-PD-1 ou o grupo veículo (grupo anti-lgG). Como mostrado na Figura 4B, o crescimento tumoral é inibido em todos os grupos de tratamento. O grupo de chidamida combinado com o anticorpo antiPD-1 mostra inibição mais potente no crescimento tumoral do que o tratamento com o anticorpo anti-PD-1 apenas. Além disso, o regime de chidamida (12,5 mg/kg) mais celecoxibe (25 mg/kg) e metformina (100 mg/kg) combinado com o anticorpo anti-PD-1 alcançou uma proporção de PR de cerca de 33% (dois camundongos alcançaram PR) e é mais ativo na supressão do crescimento tumoral do que o chidamida (12,5 mg/kg) combinado com o anticorpo anti-PD-1. No entanto, nenhum PR foi encontrado no grupo de chidamida (12,5 mg/kg) combinado com o anticorpo anti-PD-1. O resultado sugere que o celecoxibe e metformina desempenham um papel importante para aumentar a taxa de resposta no tratamento com inibidores de ponto de verificação imunológico. Várias doses de chidamida foram testadas em regimes semelhantes para analisar a taxa de resposta dos camundongos portadores de células tumorais
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CT26. Os resultados mostram que uma dose de dose de 50 mg/kg é ótima para chidamida na inibição do crescimento tumoral, e tem uma alta proporção de PR (cerca de 50%) e SD (cerca de 33%) no regime de tratamento de chidamida (50 mg/kg) mais celecoxibe (25 mg/kg) e metformina (100 mg/kg) combinados com o grupo de anticorpo anti-PD-1. O resultado sugere que chidamida é um fator chave na obtenção de efeito terapêutico. Em seguida, a dose ótima de celecoxibe foi determinada. Os resultados mostram que o celecoxibe em uma dose de 50 mg/kg, é mais ativa do que a 25 mg/kg para suprimir o crescimento tumoral em cada camundongo no grupo de tratamento (Figura 4B). No entanto, o inibidor de ponto de verificação imunológico tem uma taxa de resposta muito baixa. Nós surpreendentemente descobrimos que o celecoxibe, a 50 mg/kg, pode regular positivamente a taxa de resposta em imunoterapia. Além disso, a dose ótima de metformina foi determinada. Verificou-se que a metformina a uma dose de 100 ou 200 mg/kg de regime não faz diferença na atividade anticâncer (Figura 4B). Estes dados sugerem que chidamida e celecoxibe são mais importantes do que metformina em combinação com um inibidor de ponto de verificação imunológico. Como mostrado na Figura 4C, nenhum dos camundongos em quaisquer dos grupos de tratamento perdeu qualquer peso corporal. A Figura 4D mostra as taxas de sobrevivência dos camundongos nos grupos de tratamento. Estes dados sugerem que o regime de chidamida (50 mg/kg) mais celecoxibe (25 mg/kg) e metformina (100 mg/kg) combinados com o anticorpo anti-PD-1 (10 mg/kg) é a melhor combinação, que tem uma capacidade poderosa para suprimir o crescimento tumoral e aumentar a taxa de sobrevivência em até cerca de 50%. A taxa de sobrevivência de outros grupos também aumentou em comparação com o grupo de anticorpos anti-PD-1 sozinho. Embora chidamida a 50 mg/kg mais celecoxibe a 25 mg/kg e metformina a 100 mg/kg combinados com o anticorpo anti-PD-1 (10 mg/kg) seja o regime ótimo neste experimento in vivo, o celecoxibe a 50 mg/kg também pode
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35/56 fornecer maior contribuição à atividade anticâncer e também aumentar a taxa de sobrevivência nos camundongos portadores de células de tumor CT26.
Exemplo 5 - Efeitos de chidamida + metformina + celecoxibe combinados COM ANTICORPO ANTI-PD-L1 [0073]Demostramos que chidamida mais metformina e celecoxibe combinados com o anticorpo anti-PD-1 possui uma inibição significativa em crescimento tumoral nos camundongos portando CT26 (ver Figura 4). Como mostrado na Figura 5A, chidamida (50 mg/kg) mais metformina (100 mg/kg) e celecoxibe (50 mg/kg) combinados com o anticorpo anti-PD-L1 (10 mg/kg) foi administrado aos camundongos portadores de CT26. Chidamida, metformina e celecoxibe foram administrados diariamente. No entanto, o anticorpo anti-PD-L1 foi administrado i.p. a cada 3 dias. Nossos dados mostram que chidamida mais metformina e celecoxibe é potente no que diz respeito a inibir o crescimento tumoral nos camundongos portando CT26 (ver Figura 5A). Nós surpreendentemente descobrimos que chidamida mais metformina e celecoxibe na ausência de anticorpo anti-PD-L1 significativamente inibe o crescimento tumoral nos camundongos portando CT26 (Figura 5A). O tratamento com anti-PD-L1 (10 mg/kg) sozinho inibe ligeiramente o crescimento tumoral (Figura 5A). A partir destes resultados, é mostrado que chidamida mais metformina e celecoxibe possui uma potente capacidade para inibir o crescimento tumoral. A Figura 5B mostra que o grupo chidamida mais metformina e celecoxibe e o grupo chidamida mais metformina e celecoxibe combinado com o anticorpo anti-PD-L1 significativamente inibe o crescimento tumoral e tem alta percentagem de PR. Como mostrado na Figura 5C, todos os regimes de tratamento não causaram qualquer perda de peso corporal. Como mostrado na Figura 5D, chidamida combinado com metformina e celecoxibe aumenta significativamente a taxa de sobrevivência
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36/56 para cerca de 80%. Este resultado mostra que chidamida combinado com metformina e celecoxibe era altamente eficaz no controle de um microambiente de tumor e desencadeia imunoterapia. Além disso, chidamida mais metformina e celecoxibe combinados com o anticorpo anti-PD-L1 são mais poderosos para inibir o crescimento tumoral e alcançam uma taxa de sobrevivência de 100% no dia 53. No dia 53, as taxas de sobrevivência foram semelhantes entre estes dois regimes. Os resultados indicam que chidamida combinado com metformina e celecoxibe possui uma potente atividade inibitória do crescimento tumoral. A combinação com o anticorpo anti-PD-L1 aumentou a inibição sobre o crescimento tumoral e a taxa de sobrevivência (Figura 5D).
Exemplo 6 - Efeitos de chidamida + metformina + celecoxibe combinados COM O ANTICORPO ANTI-PP-1 EM CAMUNDONGOS PORTANDO JC [0074] A linhagem celular de JC foi obtida a partir de neoplasias malignas da glândula mamária de camundongo. Ficamos interessados em avaliar se qualquer inibição de tumor podería ser encontrada em camundongos portando JC. Como mostrado na Figura 6, as células JC cresceram mais lentamente que as células CT26 em camundongos; por conseguinte, o tamanho do tumor nos camundongos portadores de JC cresceu para cerca de 300 a 400 mm3 no dia 20. Chidamida mais metformina e celecoxibe significativamente inibe crescimento tumoral nos camundongos portadores de JC (Figura 6A). No entanto, chidamida mais metformina e celecoxibe combinados com o anticorpo anti-PD-1 é ainda mais eficaz na inibição do crescimento tumoral nos camundongos portadores de JC (Figura 6A). Este regime significativamente inibe o crescimento tumoral em ambos os camundongos portadores de CT26 e os camundongos portadores de JC. Em primeiro lugar, verificamos que chidamida combinado com metformina mais celecoxibe possui uma atividade terapêutica imune potente na inibição tumoral em camundongos portadores de tumor com
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37/56 imunidade normais. Além disso, como mostrado na Figura 6B, o anticorpo antiPD-1 tem apenas atividade anticâncer leve e o SD foi observado em apenas um camundongo. O regime com chidamida mais metformina e celecoxibe inibe de forma potente o crescimento tumoral; no entanto, tem menor efeito inibitório do que a chidamida mais metformina e o celecoxibe combinados com o regime de anticorpo anti-PD-1. No grupo da chidamida mais metformina e celecoxibe, três camundongos alcançaram PR e SD foi observado em quatro camundongos. No entanto, no chidamida mais metformina e celecoxibe combinados com o grupo de anticorpo anti-PD-1, cinco camundongos foram PR e um camundongo foi SD. Diante do exposto, o regime de chidamida mais metformin e celecoxibe possui uma potente atividade de crescimento antitumoral. Após combinar com anticorpo anti-PD-1 ou anti-PD-L1, a inibição do crescimento tumoral em modelos de camundongos portadores de CT26 ou camundongos portadores de JC é aumentada (Figura 5B e a Figura 6B). Como mostrados na Figura 6C, nenhum dos camundongos nos grupos de tratamento perdeu qualquer peso corporal. Como mostrado na Figura 6D, chidamida combinado com metformina e celecoxibe significativamente aumenta a taxa de sobrevivência a cerca de 28% em comparação com o grupo de anticorpo anti-PD-1 no modelo camundongos portadores de tumor JC. O resultado comprova que o regime com chidamida mais metformina, e celecoxibe é uma boa combinação contra o câncer. O regime pode controlar um microambiente tumoral e impulsionar a imunoterapia. Além disso, chidamida mais metformina e celecoxibe combinados com o anticorpo anti-PD-1 é mais potente para inibir o crescimento tumoral e aumenta a taxa de sobrevivência para cerca de 83%. Após o tratamento ser interrompido no dia 35, o tumor no camundongo portador de tumor CT26 e camundongo portador de tumor JC cresceu mais rapidamente no grupo controle IgG. No entanto, chidamida mais metformina e celecoxibe, combinados com um regime inibidor de ponto de verificação imunológico, foi muito potente na inibição do crescimento
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38/56 tumoral e, assim, significativamente aumentou as taxas de sobrevivência (Figura 6D).
Exemplo 7 - Efeitos de chidamida mais metformina e celecoxibe combinados COM OU SEM ANTICORPO ANTI-PD-L1 (DOSE BAIXA OU DOSE ELEVADA) EM CAMUNDONGOS PORTADORES DE CT26 [0075] Estávamos interessados em avaliar se a redução na dosagem de um inibidor de ponto de verificação imunológico de anticorpo antiPD-L1 ainda realizaria inibição tumoral em camundongos portadores de CT26. Como mostrado na Figura 7, o tamanho do tumor nos camundongos portadores de CT26 cresceu para cerca de 250 a 300 mm3 no dia 15. Chidamida a 50 mg/kg + metformina a 100 mg/kg e celecoxibe a 50 mg/kg combinados com PD- L1 (2,5 ou 10 mg/kg) significativamente inibe o crescimento tumoral em camundongos portadores de CT26 (Figura 7A). Não há diferença significativa na inibição de crescimento tumoral nos camundongos portadores de CT26 entre 2,5 mg/kg e 10 mg/kg de grupos de anticorpo anti-PD-L1. Por outro lado, chidamida em uma dose baixa de 6,25 mg/kg ou a uma dose elevada de 50 mg/kg mais metformina a 100 mg/kg e de celecoxibe a 50 mg/kg combinados com anticorpo anti-PD-L1 (2,5 ou 10 mg/kg) significativamente inibe o crescimento tumoral nos camundongos portadores de CT26 (Figura 7A). Grupos de chidamida em duas doses de 6,25 e 50 mg/kg mostrou nenhuma diferença significativa estatisticamente na inibição de crescimento tumoral nos camundongos portadores de CT26, independentemente da presença de dosagem baixa ou elevada de anticorpo anti-PD-L1 (2,5 ou 10 mg/kg). No entanto, chidamida em várias doses de 6,25, 12,5 e 50 mg/kg, mais metformina a 100 mg/kg e celecoxibe a 50 mg/kg, na ausência de anticorpo anti-PD-L1, também possui atividade marcadamente inibitória do crescimento tumoral, como mostrado na Figura 7B. O resultado demonstrou que o grupo de chidamida a 50 mg/kg mais metformina 100 mg/kg e celecoxibe a 50 mg/kg significativamente inibe o
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39/56 crescimento tumoral em camundongos portadores de CT26, em comparação com a grupo veículo de IgG (Figura 7B). Este resultado também demonstrou que chidamida em várias doses combinadas com celecoxibe a 50 mg/kg mais metformina a 100 mg/kg possuíam atividades imunomodulatórias únicas, que poderia marcadamente influenciar o microambiente do tumor para reativar linfócitos T citotóxicos para atacar as células tumorais e, finalmente causar a inibição do crescimento tumoral (Figura 7B). Além disso, os resultados de todos os camundongos tratados com diferentes modalidades terapêuticas são mostrados na Figura 7C. Foi demonstrado que o tratamento com 2,5 mg/kg de anticorpo anti-PD-L1 não foi potente o suficiente para reativar linfócitos T citotóxicos para matar células tumorais. Para os grupos chidamida mais celecoxibe e de metformina, os resultados demonstraram que a dose elevada (50 mg/kg) de chidamida foi necessária para reativar linfócitos T citotóxicos para matar células tumorais. O tratamento com elevada dose (10 mg/kg) ou uma dose baixa (2,5 mg/kg) de anticorpo anti-PD-L1 combinado com chidamida mais celecoxibe e metformina significativa mente inibiu o crescimento tumoral. O tratamento com anticorpo anti-PD-L1 (2,5 mg/kg) combinado com chidamida a 50 mg/kg mais celecoxibe a 50 mg/kg e metformina a 100 mg/kg foi mostrado ter atividade anticâncer mais potente na Figura 7C. Não há diferença significativa na atividade anticâncer entre dose baixa (2,5 mg/kg) e elevada (10 mg/kg) de tratamento com anticorpo anti-PD-L1. Estes resultados sugeriram que, em combinação com chidamida mais celecoxibe e metformina, o anticorpo anti-PDL1 é necessário para a potente capacidade antitumoral em modelo de camundongos portadores de CT26. Como mostrado na Figura 7D, nenhum dos camundongos nos grupos tratamento perdeu qualquer peso corporal. Os resultados da taxa de sobrevivência foram indicados na Figura 7E. Primeiro, tratamento com chidamida a 50 mg/kg combinado com metformina a 100 mg/kg e celecoxibe a 50 mg/kg aumenta significativamente a taxa de sobrevivência a
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40/56 cerca de 20% em comparação com o tratamento com anticorpo anti-PD- L1 sozinho. O resultado comprova que o regime com chidamida mais metformina e celecoxibe é uma boa combinação e possui atividade imunomodulatória. O regime pode controlar o microambiente tumoral e aumentar a eficácia terapêutica. Segundo, tratamento com chidamida a 50 mg/kg mais metformina a 100 mg/kg e celecoxibe a 50 mg/kg combinados com anticorpo anti-PD- L1 a 2,5 mg/kg, é mais potente para inibir o crescimento tumoral e aumentar a taxa de sobrevivência para cerca de 75%. Um resultado semelhante foi também mostrado em tratamento com chidamida a 50 mg/kg + metformina a 100 mg/kg e celecoxibe a 50 mg/kg combinados com anticorpo anti-PD- L1 a 10 mg/kg (a taxa de sobrevivência de cerca de 80%). Terceiro, chidamida a 6,25 mg/kg, mais metformina a 100 mg/kg e celecoxibe a 50 mg/kg combinados com o anticorpo anti-PD-L1 a 10 mg/kg marcadamente inibe o crescimento tumoral e aumenta a taxa de sobrevivência para cerca de 40%. Mas, Chidamida a 6,25 mg/kg, mais metformina a 100 mg/kg e celecoxibe a 50 mg/kg combinados com o anticorpo anti-PD- L1 a 2,5 mg/kg é mais potente para inibir o crescimento tumoral e aumentar a taxa de sobrevivência para cerca de 100%. Após o tratamento ser interrompido no dia 30, o tumor nos camundongos portadores de tumor CT26 cresceu mais rapidamente no grupo controle de IgG. No entanto, chidamida a 50 mg/kg mais metformina a 100 mg/kg e celecoxibe a 50 mg/kg, combinados com regimes de anti-PD-L1 Ab (2,5 ou 10 mg/kg), foram muito potentes na inibição do crescimento tumoral e, assim, aumentou significativamente a taxa de sobrevivência em comparação com chidamida a 50 a mg/kg combinado com celecoxibe a 50 mg/kg mais metformina a 100 mg/kg, como mostrado na Figura 7E.
Exemplo 8 - Comparação cabeça com cabeça dos efeitos de anti-PD-1 e ANTI-PD-L1 Ab EM COMBINAÇÃO COM CHIDAMIDA MAIS CELECOXIBE, COM OU SEM METFORMINA EM CAMUNDONGOS PORTADORES DE CT26 [0076] Em seguida, estávamos interessados em avaliar os efeitos terapêuticos de anticorpo anti-PD-1 ou anti-PD-L1 em combinação com
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41/56 chidamida mais celecoxibe combinados com ou sem metformina em camundongos portadores de CT26. Como mostrado na Figura 8, o tamanho do tumor em camundongos portadores de CT26 cresceu para cerca de 200 a 250 mm3 no dia 10. Primeiro, a combinação de chidamida a 50 mg/kg, mais celecoxibe a 50 mg/kg sem metformina significativamente inibiu o crescimento tumoral nos camundongos portadores de CT26 em comparação com o grupo de IgG (Figura 8A). Em segundo lugar, chidamida a 50 mg/kg, mais celecoxibe a 50 mg/kg combinados com o anticorpo anti-PD-1 a 2,5 mg/kg é ainda mais eficaz na inibição do crescimento tumoral em camundongos portadores de CT26 (Figura 8A). Em terceiro lugar, um resultado similar foi também encontrado no tratamento com chidamida a 50 mg/kg, mais celecoxibe a 50 mg/kg combinado com o anticorpo anti-PD- L1 a 2,5 mg/kg. As Figuras 8A e 8B mostram que chidamida a 50 mg/kg combinado com celecoxibe a 50 mg/kg foi suficiente para influenciar o microambiente do tumor e reativar linfócitos T citotóxicos para matar o tumor. Por outro lado, comparação cabeça a cabeça dos efeitos anticâncer de dose baixa (2,5 mg/kg) de anticorpos anti-PD-1 e anti-PD-L1 em combinação com chidamida a 50 mg/kg mais celecoxibe a 50 mg/kg mostrou potência de inibição de tumor em camundongos portadores de CT26 como mostrado nas Figuras 8A e 8B. Estes resultados do estudo cabeça a cabeça sugeriu que imune o anticorpo anti-PD-1 ou anti-L1-PD inibidor de ponto de verificação imunológico é necessário no tratamento de combinação com chidamida mais celecoxibe para potente capacidade antitumoral em modelo de camundongos portadores de CT26. Esta descoberta também demonstrou que a dosagem de anticorpo antiPD-1 ou anti-PD-L1 pode ser reduzida a 1/4 (2,5 mg/kg) da dose recomendada de 10 mg/kg, quando combinado com chidamida a 50 mg/kg mais celecoxibe a 50 mg/kg para reativação potente de linfócitos T citotóxicos no microambiente do tumor para inibir crescimento tumoral como mostrado nas Figuras 8A e 8B. O estudo comprovou que o regime com anticorpo anti-PD-1 ou anti-PD-L1
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42/56 combinado com chidamida mais celecoxibe foi suficiente para a execução de atividades antitumorais potentes. A partir desses resultados, pode-se concluir que a metformina pode ter um papel menor na regulação da imunidade no microambiente tumoral. O regime adequado é chidamida mais celecoxibe, combinados com um inibidor de ponto de verificação imunológico tais como anticorpo anti-PD-1 ou anti-PD-L1. Os efeitos anticâncer de várias modalidades terapêuticas em todos os camundongos são mostrados na Figura 8C. O tratamento com anticorpo anti-PD-1 sozinho teve apenas uma ligeira atividade anticâncer e apenas três camundongos alcançaram PR (taxa de resposta 37,5%). O regime com chidamida mais celecoxibe mostrou melhor atividade antitumoral, e cinco camundongos alcançaram PR (taxa de resposta 55,5%); no entanto, apresentou menor efeito inibitório do que chidamida a 50 mg/kg mais celecoxibe a 50 mg/kg com ou sem metformina a 100 mg/kg combinados com o regime de anticorpo anti-PD-1. No grupo com chidamida mais celecoxibe combinados com grupo de anticorpo anti-PD-1, oito camundongos alcançaram PR (taxa de resposta 88%). No grupo com anticorpo anti-PD-L1 mostrou ligeira atividade anticâncer e apenas quatro camundongos alcançaram PR (taxa de resposta 50%). No grupo chidamida a 50 mg/kg + metformina a 100 mg/kg e celecoxibe a 50 mg/kg combinados com anticorpo anti-PD- L1 a 2,5 mg/kg, nove camundongos alcançaram PR (taxa de resposta 100%). No grupo chidamida a 50 mg/kg, mais celecoxibe a 50 mg/kg combinados com anticorpo anti-PD- L1 s
2,5 mg/kg, oito camundongos alcançaram PR (taxa de resposta 88%). Diante do exposto, o regime de chidamida mais celecoxibe também possui um potente efeito antitumoral. Quando chidamida mais celecoxibe foram combinados com anticorpo anti-PD-1 ou anti-PD-L1, a inibição do crescimento tumoral em modelos de camundongos portadores de CT26 foi significativamente aumentada (Figura 8C). Como mostrado na Figura 8D, nenhum dos camundongos nos grupos de tratamento perdeu qualquer peso corporal. Como mostrado na Figura
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8Ε, o grupo chidamida combinado com celecoxibe aumentou significativamente a taxa de sobrevivência para cerca de 55,5% em comparação com o grupo antiIgG no modelo de camundongos portadores de tumor CT26. E a taxa de sobrevivência foi melhor que a do grupo anti-PD-1 (37,5%) ou anti-PD-L1 (50%). O resultado provou que o regime de chidamida mais celecoxibe é uma combinação moderada contra o câncer. Este regime pode controlar e regular o microambiente do tumor e aumentar a imunoterapia a algum grau. Além disso, chidamida mais metformina e celecoxibe combinados com o anticorpo anti-PD1 foi mais potente para inibir o crescimento tumoral e aumentar a taxa de sobrevivência para cerca de 80%. Um resultado semelhante foi mostrado que o grupo de chidamida mais celecoxibe combinados com anticorpo anti-PD-1 era potente para inibir o crescimento tumoral e aumentar a taxa de sobrevivência para cerca de 88%. O grupo de chidamida mais metformina e celecoxibe combinados com o anticorpo anti-PD- L1 era mais potente para inibir o crescimento tumoral e aumentar a taxa de sobrevivência para cerca de 100%. Um resultado semelhante foi mostrado que o grupo de chidamida mais celecoxibe combinados com o anticorpo anti-PD- L1 era potente para inibir o crescimento tumoral e aumentar a taxa de sobrevivência para cerca de 88%. Após o tratamento ser interrompido no dia 26, o tumor nos camundongos portadores de tumor CT26 cresceu mais rapidamente no grupo controle de IgG. No entanto, chidamida e celecoxibe combinados com ou sem metformina na presença de um regime inibidor de ponto de verificação imunológico foram muito potentes na inibição do crescimento tumoral e, portanto, aumentaram significativamente a taxa de sobrevivência (Figura 8E). A partir deste estudo, demonstrou-se que a administração de metformina pode desempenhar um papel menor na influência do microambiente tumoral e na impulsão da imunoterapia. Este estudo também provou que chidamida mais celecoxibe combinados com inibidor de ponto de verificação imunológico foi suficiente para impulsionar a
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44/56 resposta imune anticâncer. Por outro lado, a comparação cabeça a cabeça entre anticorpo anti-PD-1 e anti-L1-PD, quando combinado com chidamida mais celecoxibe tem demonstrado que a atividade anticâncer do regime de combinação com anticorpo anti-PD-L1 é melhor do que aquele de regime de combinação com anticorpo anti-PD-1.
Exemplo 9 - Para confirmar a dose de tratamento ótima de chidamida mais CELECOXIBE COMBINADOS COM ANTICORPO ANTI-PP-1 EM CAMUNDONGOS PORTADORES DE CT26 [0077] Estávamos interessados em avaliar qual proporção de dosagem de chidamida e celecoxibe combinados com anticorpo anti-PD-1 é a ótima para inibição do tumor em camundongos portadores de CT26. Como mostrado na Figura 9, o tamanho do tumor nos camundongos portadores de CT26 cresceu para cerca de 400 a 500 mm3 no dia 15. A combinação de chidamida (12,5 mg/kg) mais celecoxibe (12,5, 25, ou 50 mg/kg) com anticorpo anti-PD-1 (2,5 mg/kg) significativamente inibiu o crescimento tumoral nos camundongos portadores de CT26 (Figura 9A). Apenas os grupos de tratamento com celecoxibe a 25 mg/kg possuíam atividade anticâncer mais fraca. Em seguida, os grupos de tratamento com chidamida (25 mg/kg) mais celecoxibe (12,5, 25, ou 50 mg/kg) com anticorpo anti-PD-1 (2,5 mg/kg) mostrou inibição significativa de crescimento tumoral em camundongos portadores de CT26 (Figura 9B). A combinação de chidamida (50 mg/kg) mais celecoxibe (12,5, 25, ou 50 mg/kg) com anticorpo anti-PD-1 (2,5 mg/kg) mostrou inibição significativa de crescimento tumoral em camundongos portadores de CT26 (Figura 9C). Os dados provaram novamente que chidamida a 50 mg/kg, mais celecoxibe a 50 mg/kg combinados com o anticorpo anti-PD-1 é ainda mais eficaz na inibição do crescimento tumoral em camundongos portadores de CT26 (Figura 9C). Estes resultados sugerem que chidamida a 50 mg/kg, mais celecoxibe a 50 mg/kg combinado com anticorpo anti-PD-1 inibidor de ponto de verificação imunológico
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45/56 apresentou capacidade antitumoral forte em modelo de camundongos portadores de CT26. Por outro lado, estes resultados também demonstraram que a proporção de dosagem de chidamida/ celecoxibe era importante. Os efeitos anticâncer de várias modalidades terapêuticas em todos os camundongos são mostrados na Figura 9D. O tratamento com chidamida a 12,5 mg/kg, mais diversas doses de celecoxibe (12,5, 25, ou 50 mg/kg) combinados com um anticorpo anti-PD-1 mostraram apenas ligeira atividade anticâncer e apenas um ou dois camundongos alcançaram PR (taxa de resposta 25-40%). O tratamento com chidamida a 25 mg/kg, mais diversas doses de celecoxibe (12,5, 25, ou 50 mg/kg) combinados com um anticorpo anti-PD-1 mostraram apenas ligeira atividade anticâncer e apenas um ou dois camundongos alcançaram PR (taxa de resposta 20-40%). O tratamento com chidamida a 50 mg/kg, mais celecoxibe a 50 mg/kg combinados com um anticorpo anti-PD-1 apresentaram atividades antitumorais potentes e três camundongos alcançaram PR (taxa de resposta 75%). Como mostrado na Figura 9E, nenhum dos camundongos nos grupos de tratamento perdeu qualquer peso corporal. Como mostrado na Figura 9F, dosagem baixa de chidamida (12,5 mg/kg), mais celecoxibe na dosagem de 50 mg/kg combinados com anticorpo anti-PD-1 aumentou a taxa de sobrevivência para cerca de 40% em comparação com o grupo controle de anticorpos anti-lgG no modelo de camundongos portadores de CT26. O resultado demonstrou que o regime de chidamida a 12,5 mg/kg mais dosagem alta de celecoxibe (50 mg/kg) tinha melhor efeito anticâncer. Além disso, um mostrado na Figura 9L, a dosagem intermediária de chidamida (25 mg/kg), mais celecoxibe em dosagem de 12,5 a 50 mg/kg combinados com anticorpo anti-PD1 não apresentou nenhuma melhoria na taxa de sobrevivência. Finalmente, um mostrado na Figura 9H, alta dosagem de chidamida (50 mg/kg) mais alta dosagem de celecoxibe (50 mg/kg) combinados com anticorpo anti-PD-1 mostrou potente inibição de crescimento tumoral e aumentou a taxa de
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46/56 sobrevivência para cerca de 50% no dia 58. Após o tratamento ser interrompido no dia 30, o tumor nos camundongos portadores de tumor CT26 cresceu mais rapidamente no grupo controle de IgG. Neste estudo, o tratamento foi iniciado quando o tamanho do tumor atingiu cerca de 400 a 500 mm3. Isso iria resultar em taxa de resposta mais baixa e taxa de sobrevivência em todos os grupos de tratamento. No entanto, o regime de chidamida a 50 mg/kg, mais celecoxibe a 50 mg/kg combinados com anti-PD-1 Ab ainda foi muito potente na inibição do crescimento tumoral e, assim, aumentou significativamente a taxa de sobrevivência (Figura 9F-H).
Exemplo 10 - Para esclarecer os mecanismos anticâncer de inibidores de HDAC MAIS INIBIDORES DE COX-2 COMBINADOS COM ANTICORPO ANTI-PP-1 OU anti-CTLA-4 em camundongos portadores de CT26 [0078] Em seguida, estávamos interessados em avaliar se outros inibidores de HDAC e de COX-2, na presença de um anticorpo inibidor de ponto de verificação imunológico, ainda realizaria a inibição tumoral em camundongos portadores de CT26. Como mostrado na Figura 10, o tamanho do tumor em camundongos portadores de CT26 cresceu para cerca de 250 a 300 mm3 no dia 10. Primeiro, os diferentes inibidores de COX-2 mais chidamida combinados com anti-PD-1 Ab nos camundongos portadores de CT26 foram realizadas. A combinação de chidamida mais celecoxibe (inibidor seletivo de COX-2, a 50 mg/kg), aspirina (inibidor não seletivo de COX-2, a 50 mg/kg), ou ibuprofeno (inibidor não seletivo de COX-2, a 50 mg/kg), na presença de um anticorpo antiPD-1 , mostrou inibição significativa de crescimento tumoral em camundongos portadores de CT26 (Figura 10A). No entanto, chidamida a 50 mg/kg, mais celecoxibe a 50 mg/kg combinados com ou sem o anti-PD-1 Ab a 2,5 mg/kg é ainda mais eficaz na inibição do crescimento tumoral em camundongos portadores de CT26, em comparação com outros grupos (Figura 10A). De forma surpreendente, o grupo com chidamida a 50 mg/kg combinado com celecoxibe
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47/56 a 50 mg/kg inibiu muito significativamente o crescimento tumoral como se mostra na Figura 10A. De acordo com os inibidores de COX-2 na mesma dosagem, a atividade anticâncer (a partir de mais para menos) foi como se segue: celecoxibe > aspirina > ibuprofeno. Em seguida, nós avaliamos diferentes inibidores de HDAC, tais como chidamida, entinostat, e mocetinostat, em combinação com celecoxibe e anticorpo anti-PD-1. O regime com entinostat mais celecoxibe combinados com anticorpo anti-PD-1 mostrou-se como tendo atividade anticâncer potente, como mostrado na Figura 3B. Neste estudo, nós avaliamos mocetinostat (inibidor de HDAC de classe I, a 30 mg/kg), mais celecoxibe a 50 mg/kg combinados com anticorpo anti-PD-1 a 2,5 mg/kg para a sua potência de atividade anticâncer. Não houve diferença significativa entre chidamida mais celecoxibe e mocetinostat mais celecoxibe, em combinação com anticorpo antiPD-1 (Figura 10B). Além disso, nós também esclarecemos que a combinação com anticorpo anti-CTI_A-4 inibidor de ponto de verificação imunológico realizou inibição do tumor em camundongos portadores de CT26. Os resultados mostraram que chidamida mais celecoxibe combinados com anticorpo anti-PD1 ou anti-CTI_A-4 significativamente inibiu o crescimento tumoral em camundongos portadores de CT26 (Figura 10C). Não houve diferença significativa entre o tratamento com anticorpo anti-PD-1 e anti-CTI_A-4, em combinação com chidamida e celecoxibe. Estes resultados sugeriram que os inibidores de HDAC mais inibidores de COX-2 combinados com inibidores de ponto de verificação imunológicos executaram forte capacidade antitumoral em modelo de camundongos portadores de CT26. As respostas terapêuticas de todos os camundongos tratados com várias modalidades terapêuticas foram mostradas na Figura 10D. O grupo tratado com um anticorpo anti-PD-1 (2,5 mg/kg) apresentou apenas ligeira atividade anticâncer e apenas dois camundongos alcançaram PR (taxa de resposta 25%). O tratamento com o regime de chidamida a 50 mg/kg, mais celecoxibe a 50 mg/kg mostrou potente
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48/56 inibição de crescimento tumoral e seis camundongos alcançaram PR (taxa de resposta de 75%); no entanto, foi menos potente que o regime de chidamida mais celecoxibe combinados com anticorpo anti-PD-1, em que sete camundongos atingiram a PR (taxa de resposta de 88%). Por outro lado, avaliamos a combinação com aspirina a 50 mg/kg e ibuprofeno a 50 mg/kg pela sua potência de atividade anticancerígena. O tratamento com chidamida mais aspirina ou ibuprofeno combinados com anticorpo anti-PD-1 mostrou menor atividade anticâncer em comparação com que aquele de tratamento contendo celecoxibe e apenas quatro e três camundongos alcançaram PR (taxa de resposta de 50%, 38%, respectivamente). Parece estar claro que o celecoxibe foi mais potente para inibir o crescimento tumoral do que a aspirina e ibuprofeno. Em seguida, a comparação de chidamida e mocetinostat na atividade anticâncer foi determinada. No grupo tratado com mocetinostat a 30 mg/kg ou chidamida a 50 mg/kg mais celecoxibe a 50 mg/kg combinados com o anticorpo anti-PD-1 a
2,5 mg/kg, Sete camundongos alcançaram PR (taxa de resposta 88%). Este resultado demonstrou que chidamida, entinostat e mocetinostat possuíam atividade anticâncer similar. Estes compostos foram classificados como inibidor de HDAC de classe I. Em seguida, estávamos interessados se o anticorpo antiCTLA-4 possuía uma atividade semelhante como outros inibidores de ponto de verificação imunológico, tais como anticorpo anti-PD-1 ou anti-PD-L1. No grupo tratado com chidamida a 50 mg/kg, mais celecoxibe a 50 mg/kg combinados com anti-CTLA-4 a 2,5 mg/kg ou anticorpo anti-PD-1 a 2,5 mg/kg, sete camundongos alcançaram PR (taxa de resposta de 88%). Dado o acima, o regime com os inibidores de HDAC (chidamida, entinostat, mocetinostat) mais celecoxibe possui potente atividade de crescimento antitumoral. E ainda combinados com anticorpo anti-PD-1 ou anti-CTLA-4, a inibição do crescimento tumoral em modelo de camundongos portadores de CT26 foi aumentada (Figura 10D). Como mostrado na Figura 10E, nenhum dos camundongos nos grupos de
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49/56 tratamento algum perdeu peso. Como mostrado na Figura 10F, chidamida mais celecoxibe combinados com ou sem anticorpo anti-PD-1 possuía potente atividade anticâncer e significativamente aumentou a taxa de sobrevivência para cerca de 75% em comparação com o grupo controle de anticorpo anti-PD-1 (cerca de 20%) no modelo de camundongos portadores de tumor CT26. O resultado provou que o regime com os inibidores de HDAC, mais inibidores de COX-2, especialmente em combinação com inibidores de ponto de verificação imunológico, é uma boa combinação contra o câncer. O regime pode controlar o microambiente do tumor e impulsionar a imunoterapia. Este resultado também demonstrou que os regimes contendo aspirina ou ibuprofeno possuíam atividade anticancerígena e aumentavam a taxa de sobrevivência, mas mostraram atividade mais fraca do que o regime contendo celecoxibe, como mostrado na Figura 10F. Além disso, como mostrado na Figura 10G, chidamida mais celecoxibe combinados com o anticorpo anti-PD-1 foi mais potente do que o regime contendo mocetinostat na inibição do crescimento tumoral e no aumento da taxa de sobrevivência (75% vs 62,5%). Finalmente, como mostrados na Figura 10H, chidamida mais celecoxibe combinados com o anticorpo anti-CTLA4 era mais potente para inibir o crescimento tumoral e aumentar a taxa de sobrevivência para cerca de 100%. Este resultado demonstrou que o regime de combinação com anticorpo anti-CTLA-4 foi mais potente do que aquele com anticorpo anti-PD-1 (taxa de sobrevivência de 75%) para aumentar a taxa de sobrevivência no modelo de camundongos portadores de tumor CT26. Após o tratamento ser interrompido no dia 26, o tumor nos camundongos portadores de tumor CT26 cresceu mais rapidamente no grupo controle de IgG. No entanto, a inibição potente do crescimento tumoral e o aumento da taxa de sobrevivência podem ser alcançados através de regimes de combinação como se segue: chidamida mais aspirina, ibuprofeno ou celecoxibe, ou ainda combinado com um inibidor de ponto de verificação imunológico; regime com mocetinostat mais
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50/56 celecoxibe combinados com inibidor de ponto de verificação imunológico; anticorpo anti-CTLA-4 combinado com chidamida mais celecoxibe (Figura 10FH). Tomados em conjunto, os regimes com inibidores de ponto de verificação imunológico, incluindo anticorpo anti-PD-1, anti-PD-L1, e o anti-CTLA-4, em combinação com chidamida mais celecoxibe, pode influenciar eficazmente o número ou a atividade de componentes principais no microambiente do tumor, tais como Treg (células T reguladoras), MDSCs (células supressoras derivadas de mieloides), TAM (macrófagos associados a tumores), NK (células T assassinas naturais), e de CTL (linfócitos T citotóxicos). Finalmente, estes regimes foram eficientes para aumentar a imunoterapia. Esses resultados ainda provam nossa proposta de que um inibidor de HDAC (especialmente inibidor de HDAC de classe I) mais inibidores de COX-2 (especialmente inibidores seletivos de COX-2) impulsionam de forma eficaz a atividade anticâncer de inibidores de ponto de verificação imunológico em taxa de resposta e taxa de sobrevivência.
Exemplo 11 - Para confirmar o melhor regime de combinação -chidamida COM CELECOXIBE COMBINADOS COM ANTICORPO ANTI-PP-1 EM CAMUNDONGOS PORTADORES DE CT26 [0079] Nós avaliamos o efeito anticâncer com maior número de camundongos em cada grupo de tratamento para confirmar que o regime com chidamida e celecoxibe combinados com anticorpo anti-PD-1 inibidor de ponto de verificação imunológico executou potente inibição do tumor em camundongos portadores de CT26. Como mostrado na Figura 11, o tamanho do tumor em camundongos portadores de CT26 cresceu para cerca de 250 a 300 mm3 no dia
9. A combinação de chidamida mais celecoxibe e anticorpo anti-PD-1 inibiu significativamente o crescimento tumoral nos camundongos portadores de CT26 (Figura 11 A). A combinação de chidamida a 50 mg/kg, mais anticorpo anti-PD-1 a 2,5 mg/kg também significativamente inibiu o crescimento tumoral em camundongos portadores de CT26 (Figura 11 A). Um resultado semelhante foi
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51/56 também indicado em combinação com chidamida a 50 mg/kg e celecoxibe a 50 mg/kg (Figura 11 A). No entanto, chidamida a 50 mg/kg, mais celecoxibe a 50 mg/kg combinados com o anticorpo anti-PD-1 a 2,5 mg/kg é ainda mais eficaz na inibição do crescimento tumoral em camundongos portadores de CT26, em comparação com os outros grupos (Figura 11 A). Estes resultados sugeriram que chidamida mais celecoxibe combinados com inibidor de ponto de verificação imunológico executou capacidade antitumoral forte em modelo de camundongos portadores de CT26. O efeito anticâncer de diversas modalidades terapêuticas em todos os camundongos foi mostrado na Figura 11B. O grupo de anticorpo anti-PD-1 apresentou apenas ligeira atividade anticâncer e apenas três camundongos alcançaram PR (taxa de resposta 25%). A combinação de chidamida mais celecoxibe mostrou ligeira atividade anticâncer e apenas quatro camundongos alcançaram PR (taxa de resposta 33%). A combinação de chidamida mais anticorpo anti-PD-1 também mostrou atividade anticâncer melhorada e cinco camundongos alcançaram PR (taxa de resposta 41%). A combinação de chidamida mais celecoxibe e um anticorpo anti-PD-1 mostrou a melhor atividade anticâncer e oito camundongos alcançaram PR (taxa de resposta 72%). Como mostrado na Figura 11C, nenhum dos camundongos nos grupos de tratamento perdeu peso algum. Como mostrado na Figura 11 D, chidamida a 50 mg/kg combinado com anticorpo anti-PD-1 a 2,5 mg/kg ou antiPD-1 Ab a 2,5 mg/kg sozinho aumentou a taxa de sobrevivência para cerca de 33% e 16%, respectivamente. No entanto, o regime com chidamida a 50 mg/kg, mais celecoxibe a 50 mg/kg combinados com anti-PD-1 Ab a 2,5 mg/kg foi novamente comprovado como combinações poderosas para inibir eficientemente o crescimento tumoral e aumentar a taxa de sobrevivência para cerca de 72% no modelo de camundongo portador de tumor CT26. O regime de chidamida combinado com celecoxibe na ausência do anticorpo anti-PD-1 não melhorou a taxa de sobrevivência em comparação com o regime controle de antiPetição 870190020412, de 28/02/2019, pág. 59/135
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IgG. Os regimes na ausência de celecoxibe só mostraram ligeiro aumento da taxa de sobrevivência. Em conjunto, estes dados demonstraram que chidamida mais celecoxibe, combinados com um inibidor de ponto de verificação imunológico, é uma combinação muito potente e eficaz na inibição do crescimento tumoral e, assim, aumentou significativamente a taxa de sobrevivência em imunoterapia (Figura 11 D). Este regime de combinação pode desempenhar um papel importante na melhoria da memória das células T através de mecanismos sinérgicos no microambiente do tumor.
Exemplo 12 - Para esclarecer os mecanismos anticâncer de chidamida mais METFORMINA E CELECOXIBE COMBINADOS COM ANTICORPO ANTI-PD-L1 USANDO CAMUNDONGOS NUS PORTADORES DE CT26 [0080] Nós estávamos interessados em avaliar se chidamida mais metformina e celecoxibe combinados com anticorpo anti-PD-L1 executava inibição de tumor, ativando os linfócitos T citotóxicos em camundongos portadores de CT26 (estado de imunidade normal)executava utilizou-se um modelo animal de camundongo imunodeficiente atímico nu (deficiência em linfócitos T citotóxicos) para testar a teoria. Os camundongos nus eram camundongos de laboratório de uma estirpe com mutação genética que causa o desenvolvimento defeituoso do timo. Isso causa diminuição significativa de células T e falta de imunidade mediada por células. Como mostrado na Figura 12, o tamanho do tumor no camundongo nu portador de CT26 aumentou para cerca de 350 a 400 mm3 no dia 15. Vários grupos de tratamento foram avaliados no efeito anticâncer. Nenhum dos grupos inibiu eficientemente o crescimento tumoral em modelo de camundongos nus portadores de CT26 tal como mostrado na Figura 12A. Os regimes de chidamida a 50 mg/kg mais metformina a 100 mg/kg e celecoxibe a 50 mg/kg combinados com ou sem anticorpo anti-PD-L1 a
2,5 mg/kg possuíram ligeira atividade anticâncer, em comparação com os outros regimes. No entanto, como mostrado em dados anteriores, os mesmos regimes
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53/56 de tratamento mostraram atividade anticâncer em camundongos portadores de CT26 com imunidade normal (camundongos do tipo selvagem). Estes resultados sugeriram que a imunidade normal é necessária para a capacidade antitumoral forte de tratamento de combinação com inibidor de ponto de verificação imunológico mais chidamida e celecoxibe na presença ou ausência de metformina em modelo de camundongos portadores de CT26. Os efeitos anticâncer de várias modalidades terapêuticas em todos os camundongos foram mostrados na Figura 12B. Nenhum dos grupos de tratamento mostrou resposta PR. Estes resultados demonstraram que todos os regimes não poderiam realizar atividade anticâncer significativa em camundongos nus com deficiência imunológica. Os regimes de chidamida mais celecoxibe e metformina combinados com ou sem anticorpos anti-PD-L1 mostrou ligeira atividade anticâncer, em comparação com os outros grupos. Como mostrado na Figura 12C, nenhum dos camundongos nos grupos de tratamento perdeu qualquer peso corporal. O peso tumoral nos camundongos nus portadores de CT26 cresceram para cerca de 2,7 a 3,3 g no dia 29, como mostrado na Figura 12D. Apenas a combinação de chidamida a 50 mg/kg, mais de metformina a 100 mg/kg e celecoxibe a 50 mg/kg mostrou ligeira inibição do crescimento tumoral com base no peso do tumor, mas nenhuma inibição significativa quando baseado no tamanho do tumor, como mostrado na Figura 12D. De acordo com os resultados deste estudo, em comparação com os dados de camundongos do tipo selvagem BALB/ c (Figuras 1-11), foi sugerido que a atividade antitumoral de combinação de chidamida mais metformina e celecoxibe combinados com anticorpo anti-PD-L1 ou anti-PD-1 necessitava de imunidade normal (Figura 12E). Portanto, estes resultados suportam a proposta de que a terapia de combinação contendo chidamida mais metformina e celecoxibe combinados com anticorpo anti-PD-L1/ anti-PD-1 tem um efeito sinérgico antitumoral para reativar os linfócitos T citotóxicos para matar cancerosas células.
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54/56 [0081] Tomados em conjunto, estes dados demonstraram que chidamida mais celecoxibe é uma combinação muito importante, eficientemente controla o microambiente do tumor e possui atividade imunomoduladora. Quando este foi combinado com o inibidor de ponto de verificação imunológico, tais como anticorpo anti-PD-1, anti-PD-L1 ou anti-CTLA-4, ele foi mais eficiente em impulsionar a atividade anticâncer e estender a sobrevivência no modelo animal imunidade suficiente normal. Pode ser previsto que chidamida mais celecoxibe combinados com inibidor de ponto de verificação imunológico será significativo na potencialização da eficácia na imunoterapia para pacientes com câncer.
Exemplo 13 - Para analisar as células circulantes e células imunológicas INFILTRANTES DE TUMORES APÓS TRATAMENTO COM CHIDAMIDA MAIS CELECOXIBE COMBINADOS COM ANTICORPO ANTI-PP-1 EM CAMUNDONGOS BALB/ C PORTADORES DE CT26 [0082] Foi estudado se o modulador epigenético chidamida combinado a um inibidor de COX-2 afetaria a população de células imunológicas em ambos o sangue de circulação e o microambiente do tumor. Utilizando a citometria de fluxo, foram analisados em primeiro lugar a população de células imunológicas circulante (células T CD4+, células T CD e+, PMN-MDSC e MMDSC, e células Treg) de camundongos normais (sem tumor) e camundongos portadores de tumor. Nós descobrimos que em camundongos portadores de tumor CT26 havia um aumento de 4,7 vezes na circulação de MDSCs granulocíticas (PMN-MDSCs; definidos como CD11 b+Ly6G+Ly6CbaiX0) e 25% de aumento na circulação de monócitos MDSC (M-MDSC; definidos como CD11 b+Ly6G'Ly6C+) em comparação com camundongos normais (Figura 13A). Pelo outro lado, foi também encontrado que células T CD4+, células T CDe+, e células Treg foram marcadamente diminuídas em camundongos portadores de tumor em comparação com camundongos normais como mostrado na Figura
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13Α. As MDSCs (células supressoras derivadas de mieloides) são uma população heterogênea de células que se expande durante o câncer, inflamação e infecção e possuem a supressão das funções das células T. Nós focamos o estudo sobre o efeito de regimes de tratamento de M-MDSCs como indicado na Figura 13B. Células circulantes de M-MDSC foram significativamente aumentadas em camundongos portadores de tumor sem qualquer tratamento. No entanto, foram significativamente reduzidas por tratamento com anticorpo anti-PD-1 sozinho ou chidamida mais celecoxibe ou chidamida mais celecoxibe combinados com anti-PD-1 do anticorpo. O tratamento resultou em uma redução notável no número de M-MDSCs de circulação para um nível semelhante ao observado em camundongos normais sem qualquer tratamento (Figura 13B). O resultado também demonstrou que o número de células de PMN-MDSCs não foi significativamente mudado por qualquer tratamento (dados não mostrados). Além disso, analisou-se células M-MDSC circulantes de camundongos portadores de tumor no dia 12 e o tamanho do tumor no dia 23 após o tratamento como indicado na Figura 13C. Os resultados mostraram que o número de células de circulação M-MDSCs no dia 12 foi significativamente correlacionado com o tamanho do tumor no dia 23 após tratamento. Outras células imunológicas não foram correlacionadas com o tamanho do tumor (dados não apresentados). Estes resultados sugeriram que talvez células M-MDSC circulantes podem ser um preditor de desenvolvimento de camundongos portadores de CT26. Por outro lado, verificou-se que células Treg circulantes foram significativamente reduzidas pelo tratamento com chidamida mais celecoxibe com anticorpo anti-PD-1 no dia 8 e chidamida mais celecoxibe sem anticorpo anti-PD-1 no dia 12 (Figura 13D). Em seguida, analisamos células imunológicas infiltrantes de tumores. O tratamento com anticorpo anti-PD-1 sozinho reduziu marcadamente o número de células mieloides e células M-MDSC. Resultados semelhantes foram também mostrados nos grupos de anticorpo anti-PD-1 combinado com chidamida mais
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56/56 celecoxibe ou chidamida mais celecoxibe, tal como mostrado na Figura 13E. O número de célula TAMs não foi marcadamente alterado por qualquer tratamento, exceto o tratamento com chidamida mais celecoxibe. O número de células de Treg foi marcadamente reduzido pelo tratamento com anticorpo anti-PD-1 combinado com chidamida mais celecoxibe, e moderadamente reduzido pelo tratamento com anticorpo anti-PD-1 sozinho ou chidamida mais celecoxibe, tal como mostrado na Figura 13F. Descobrimos a proporção de células T CD4+ para Tregs ligeiramente aumentada em tecidos de tumor do grupo de tratamento tratados com a combinação de anticorpo anti-PD-1 com chidamida mais celecoxibe em comparação com os outros grupos (Figura 13G). Este grupo de tratamento também mostrou maior proporção de células T CD8+ para Tregs do que os outros grupos (Figura 13H). Tomados em conjunto, o tratamento com chidamida mais celecoxibe reduziu as células mieloides que se infiltram no tumor (CD45+CD11b+), M-MDSCs (Figura 13E) e Tregs (Figura 13F). Estes resultados sugeriram que chidamida mais celecoxibe desempenha um papel importante em suprimir células supressoras circulantes e infiltrantes de tumor, que subsequentemente contribui para atividade antitumoral em combinação com anticorpo anti-PD-1 observado em camundongos portadores de tumor CT26.

Claims (20)

1. USO DE UMA COMBINAÇÃO de um inibidor de HDAC e um NSAID em combinação com um inibidor de ponto de verificação imunológico, caracterizado por ser para preparar um medicamento para a remoção de supressão imunológica em um microambiente tumoral ou estimular um sistema imune contra células de câncer em um sujeito.
2. USO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por poder inibir ou tratar um câncer por meio da imunoterapia.
3. USO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo câncer ser glioblastoma, câncer de fígado, carcinoma colorretal, , câncer gástrico, câncer coloretal, câncer de esôfago, câncer de pulmão, câncer pancreático, carcinoma e célula renal, hiperplasia benigna da próstata, câncer de próstata, câncer de ovário, melanoma, câncer e mama, leucemia linfocítica crônica (CLL), carcinoma de células de Merkel, linfoma não-Hodgkin, leucemia mieloide aguda (AML), câncer da vesícula biliar, colangiocarcinoma, câncer de bexiga, e câncer uterino.
4. USO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pela combinação compreender ainda um composto de biguanida.
5. USO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo inibidor de HDAC ser um inibidor seletivo da classe I de HDAC.
6. USO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo inibidor de HDAC ser uma classe de benzamida de inibidor de HDAC.
7. USO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo inibidor de HDAC ser chidamida, entinostat, vorinostat, romidepsin, panobinostat, belinostat, panobinostat, ácido valproico, mocetinostat, abexinostat, entinostat, pracinostat, resminostat, givinostat ou quisinostat.
8. USO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo inibidor de HDAC ser chidamida ou entinostat ou mocetinostat.
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2/3
9. USO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pela NSAID ser aspirina, ibuprofeno, indometacina, naproxeno ou um inibidor de COX-2.
10. USO, de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo inibidor de COX-2 ser o celecoxibe, rofecoxibe ou etoricoxibe.
11. USO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo inibidor de ponto de verificação imunológico ser um anticorpo anti-CTI_A-4, um anticorpo anti-PD-1, um anticorpo anti-PD-L1, um anticorpo anti-TIM-3, um anticorpo anti-BTI_A, um anticorpo anti-VISTA ou um anticorpo anti-l_AG-3.
12. USO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo inibidor de ponto de verificação imunológico ser lambrolizumab, pidilizumab, nivolumab, durvalumab, avelumab, atezolizumab ou MIHI.
13. USO, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo composto de biguanida ser a metformina, fenformina, proguanil e clorproguanil.
14. USO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelas quantidades do inibidor de HDAC, a NSAID e o inibidor de ponto de verificação imunológico na faixa de combinação variarem de cerca de 10% (p/p) a cerca de 70% (p/p), cerca de 10% (p/p) a cerca de 70% (p/p) e cerca de 0,5% (p/p) a cerca de 20%, respectivamente.
15. USO, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pela quantidade de composto de biguanida variar de cerca de 30% a 70% (p/p).
16. USO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por compreender ainda a administração de um ou mais agentes anticâncer adicionais.
17. COMBINAÇÃO FARMACÊUTICA, caracterizada por compreender um inibidor de HDAC, uma NSAID e um inibidor de ponto de verificação imunológico.
18. COMBINAÇÃO FARMACÊUTICA, de acordo com a
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3/3 reivindicação 1, caracterizada pelas quantidades do inibidor de HDAC, a NSAID e o inibidor de ponto de verificação imunológico na combinação farmacêutica serem de cerca de 10% (p/p) a cerca de 70% (p/p), cerca de 10% a cerca de 70% (p/p) e cerca de 0,5% a cerca de 20%, respectivamente.
19. COMBINAÇÃO FARMACÊUTICA, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada por compreender ainda um composto de biguanida.
20. COMBINAÇÃO FARMACÊUTICA, de acordo com a reivindicação 19, caracterizada pela quantidade do composto de biguanida variar de cerca de 30% a cerca de 70% (p/p).
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B07A Application suspended after technical examination (opinion) [chapter 7.1 patent gazette]
B09B Patent application refused [chapter 9.2 patent gazette]