JP2023538568A

JP2023538568A - がん治療における使用のためのｌｆａ－１シグナル伝達メディエーター

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Publication number: JP2023538568A
Application number: JP2023511928A
Authority: JP
Inventors: ヨーナスレーチャー，; クリストフヘス，
Original assignee: ウニベルシテートバーゼル
Priority date: 2020-08-17
Filing date: 2021-08-17
Publication date: 2023-09-08
Also published as: US20240010726A1; CN116507345A; WO2022038157A1; EP4196148A1; KR20230083271A; CA3188953A1; AU2021327129A1; AU2021327129A9

Abstract

本発明は、がん免疫療法における使用のための、中等度のＬＦＡ－１安定化特性を有するＬＦＡ－１シグナル伝達メディエーター、またはがんに対する免疫応答を増強する免疫系モジュレーターと、抗がん免疫応答を選択的かつ有意に増強する中等度のＬＦＡ－１安定化特性を有するＬＦＡ－１シグナル伝達メディエーターとを含む、がん免疫療法における使用のための組成物に関する。本組成物は、組成物の標的送達のための担体を含み得る。

Description

本発明は、がん免疫療法における使用のための中等度のＬＦＡ－１安定化特性を有するＬＦＡ－１シグナル伝達メディエーター、またはがんに対する免疫応答を増強する免疫系モジュレーターと、抗がん免疫応答を選択的かつ有意に増強する中等度のＬＦＡ－１安定化特性を有するＬＦＡ－１シグナル伝達メディエーターとを含む、がん免疫療法における使用のための組成物に関する。組成物は、組成物の標的送達のための担体を含み得る。

手術、放射線治療、および化学療法は、白血病、固形腫瘍、および転移を含むがんの処置のための標準的な容認されたアプローチである。がんを縮小または根絶するために体の免疫系を直接または間接的のいずれかで使用する免疫療法（時に、生物学的治療、バイオセラピー、または生物応答修飾療法とも呼ばれる）は、従来のがん治療に対する補助として何年もの間研究されている。ヒトの免疫系は、がん治療に関して未利用の資源であり、免疫系の構成要素を適切に利用すれば有効な処置を開発することができると考えられている。重要な免疫調節分子および免疫シグナルが同定され、治療試薬として調製されていることから、そのような試薬の臨床での有効性を、周知のがんモデルを使用して試験することができる。免疫療法の戦略としては、ワクチン、活性化細胞、抗体、サイトカイン、ケモカイン、ならびに低分子阻害剤、アンチセンスオリゴヌクレオチドの投与、および遺伝子治療が挙げられる（Mocellin, et al., Cancer Immunol. & Immunother. (2002) 51: 583-595; Dy, et al., J. Clin. Oncol. (2002) 20: 2881-2894, 2002）。

がんおよび腫瘍の成長および転移は、それらが宿主の免疫監視を回避する能力および宿主防御を克服する能力に大いに依存する。大半のがんおよび腫瘍は、宿主免疫系によって多様な程度に認識され得る抗原を発現するが、多くの場合、免疫応答は不適切である。エフェクターＴ細胞の強い活性化を誘発することができないことは、腫瘍抗原の弱い免疫原性またはがんおよび腫瘍細胞による共刺激分子の発現が不適切であるかまたは発現がないことに起因し得る（Epstein, A., & Hu, P. (2012). 米国特許第８，２６８，７８８号、Washington, DC: U.S. Patent and Trademark Office）。

白血球機能関連抗原（ＬＦＡ－１、アルファＬベータ２、ＣＤ１１ａ／ＣＤ１８）は、白血球の輸送および血管外漏出に主に関係するインテグリン型の細胞接着分子である。ＬＦＡ－１は、白血球上に発現され、リガンドＩＣＡＭ－１、ＩＣＡＭ２、およびＩＣＡＭ－３と相互作用して、免疫系の機能にとって必要な多様なホモ型およびヘテロ型細胞接着事象、例えば細胞－細胞、細胞－マトリクス、および細胞－病原体相互作用を促進する（Arnaout MA. Integrin structure: new twists and turns in dynamic cell adhesion. Immunol Rev. 2002;186:125-40; Askari JA, Buckley PA, Mould AP, Humphries MJ. Linking integrin conformation to function. J Cell Sci. 2009;122:165-70; Caswell PT, Norman JC. Integrin trafficking and the control of cell migration. Traffic. 2006;7:14-21; Huttenlocher A, Sandborg RR, Horwitz AF. Adhesion in cell migration. Curr Opin Cell Biol. 1995;7:697-706; Huttenlocher A, Ginsberg MH, Horwitz AF. Modulation of cell migration by integrinmediated cytoskeletal linkages and ligand-binding affinity. J Cell Biol. 1996;134:1551-62）。ＬＦＡ－１は、しばしば不活性な状態で細胞表面上に発現され、低い基礎接着性を媒介する（Zhang K, Chen J. The regulation of integrin function by divalent cations. Cell Adh Migr. 2012;6(1):20-29）。

ＬＦＡ－１媒介接着およびシグナル伝達事象は、免疫応答を含む正常な生理的応答において重要である（Springer TA, Wang J-h. The three-dimensional structure of integrins and their ligands and conformational regulation of cell adhesion. Adv Protein Chem. 2004;68:29-63; Bon G, Folgiero V, Di Carlo S, Sacchi A, Falcioni R. Involvement of α6β4 integrin in the mechanisms that regulate breast cancer progression. Breast Cancer Res. 2007;9:203; Di Sabatino A, Rovedatti L, Rosado MM, Carsetti R, Corazza GR, MacDonald TT. Increased expression of mucosal addressin cell adhesion molecule 1 in the duodenum of patients with active celiac disease is associated with depletion of integrinα4β7-positive T cells in blood. Hum Pathol. 2009;40:699-704; Varner JA, Cheresh DA. Tumor angiogenesis and the role of vascular cell integrin αVβ3. Important Adv Oncol. 1996:69-87）。

ＬＦＡ－１メディエーターの解剖学および結合部位は、以前に記載されている（Groenholm, Mikaela, et al. "LFA-1 integrin antibodies inhibit leukocyte α4β1-mediated adhesion by intracellular signalling." Blood 128.9 (2016): 1270-1281; Zecchinon, Laurent, et al. "Anatomy of the lymphocyte function-associated antigen-1." Clinical and Applied Immunology Reviews 6.3-4 (2006): 149-172）。ＬＦＡ－１の３つのコンフォメーション状態、すなわち閉鎖型頭部を有する折れ曲がりコンフォメーション、閉鎖型頭部を有する伸長したコンフォメーション、および開放型頭部を有する伸長したコンフォメーションが公知であり、これらはそれぞれ、低、中等度、および高親和性状態に対応する（Takagi J, Petre BM, Walz T, Springer TA. Global conformational rearrangements in integrin extracellular domains in outside-in and inside-out signaling. Cell. 2002;110:599-611; Zhang K, Chen J. The regulation of integrin function by divalent cations. Cell Adh Migr. 2012;6(1):20-29）。ＬＦＡ－１の活性化は、頭部と尾部の界面が飛び出しナイフ状に開き、インテグリンヘテロ二量体のリガンド結合頭部が、細胞膜から離れて伸長することを伴うと記載された（Takagi J, Petre BM, Walz T, Springer TA. Global conformational rearrangements in integrin extracellular domains in outside-in and inside-out signaling. Cell. 2002;110:599-611; Zhang K, Chen J. The regulation of integrin function by divalent cations. Cell Adh Migr. 2012;6(1):20-29）。細胞表面上のＬＦＡ－１は、これらのコンフォメーション状態において平衡状態にあり、ＬＦＡ－１安定化特性を有するＬＦＡ－１シグナル伝達メディエーターによって活性な形態で安定化され得る（Takagi J, Petre BM, Walz T, Springer TA. Global conformational rearrangements in integrin extracellular domains in outside-in and inside-out signaling. Cell. 2002;110:599-611; Zhang K, Chen J. The regulation of integrin function by divalent cations. Cell Adh Migr. 2012;6(1):20-29）。

ＬＦＡ－１はまた、抗体、ペプチド、低分子、Ｍｇ^２＋もしくはＭｎ^２＋などの二価カチオン、または他の刺激によっても活性化され得る（Zhang M., March M.E., Lane W.S., Long E.O. A signaling network stimulated by β2 integrin promotes the polarization of lytic granules in cytotoxic cells. Sci. Signal. 2014;7:ra96; Traunecker E., Gardner R., Fonseca J.E., Polido-Pereira J., Seitz M., Villiger P.M., Iezzi G., Padovan E. Blocking of LFA-1 enhances expansion of Th17 cells induced by human CD14(+) CD16(+) nonclassical monocytes. Eur. J. Immunol. 2015;45:1414-1425; Verma N.K., Fazil M.H., Ong S.T., Chalasani M.L.S., Low J.H., Kottaiswamy A., Praseetha P., Kizhakeyil A., Kumar S., Panda A.K., et al. LFA-1/ICAM-1 Ligation in Human T Cells Promotes Th1 Polarization through a GSK3β Signaling- Dependent Notch Pathway. J. Immunol. 2016;197:108-118; Meli A.P., Fontes G., Avery D.T., Leddon S.A., Tam M., Elliot M., Ballesteros-Tato A., Miller J., Stevenson M.M., Fowell D.J., et al. The Integrin LFA-1 Controls T Follicular Helper Cell Generation and Maintenance. Immunity. 2016;45:831-846; Gahmberg C.G., Fagerholm S.C., Nurmi S.M., Chavakis T., Marchesan S., Groenholm M. Regulation of integrin activity and signaling. Biochim. Biophys. Acta. 2009;1790:431-444; Mocsai A., Walzog B., Lowell C.A. Intracellular signalling during neutrophil recruitment. Cardiovasc. Res. 2015;107:373-385）。

ＬＦＡ－１に対する二価カチオンの親和性は、Ｍｎ^２＋＞Ｍｇ^２＋＞Ｃａ^２＋の順に徐々に減少する（Vorup-Jensen T, Waldron TT, Astrof N, Shimaoka M, Springer TA. The connection between metal ion affinity and ligand affinity in integrin I domains. Biochim Biophys Acta. 2007;1774(9):1148-1155）。抗体のＬＦＡ－１安定化特性は、二価カチオンのＬＦＡ－１安定化特性より強いことがある（Schuerpf, Thomas, and Timothy A Springer. "Regulation of integrin affinity on cell surfaces." The EMBO journal vol. 30,23 4712-27. 23 Sep. 2011）。

がん免疫療法におけるＬＦＡ－１などのインテグリンのモジュレーションは、なおも複雑である。以前の研究から、ＬＦＡ－１の遮断による有益な効果が示唆されたが、ヒト腫瘍においてインテグリンに機能的に拮抗する試みは一般的に失敗に終わっている（Goodman, Simon L, and Martin Picard. "Integrins as therapeutic targets." Trends in pharmacological sciences vol. 33,7 (2012): 405-12）。ＲＧＤ結合インテグリンは、がん免疫療法の状況において抗体Ｆｃエフェクター機能の標的として使用された（Kwan, Byron H et al. "Integrin-targeted cancer immunotherapy elicits protective adaptive immune responses." The Journal of experimental medicine vol. 214,6 (2017): 1679-1690）。インテグリンＬＦＡ－１を、例えば抗体によって過度に標的化すると、ＬＦＡ－１を標的化する場合に予期せぬ効果が起こるのは珍しいことではない（Reina, Manuel, and Enric Espel. "Role of LFA-1 and ICAM-1 in Cancer." Cancers vol. 9,11 153. 3 Nov. 2017; Groenholm M, Jahan F, Bryushkova EA, et al. LFA-1 integrin antibodies inhibit leukocyte α4β1-mediated adhesion by intracellular signaling. Blood. 2016;128(9):1270-1281）。

米国特許第８，２６８，７８８号明細書

Mocellin, et al., Cancer Immunol. & Immunother. (2002) 51: 583-595 Dy, et al., J. Clin. Oncol. (2002) 20: 2881-2894, 2002 Arnaout MA. Integrin structure: new twists and turns in dynamic cell adhesion. Immunol Rev. 2002;186:125-40 Askari JA, Buckley PA, Mould AP, Humphries MJ. Linking integrin conformation to function. J Cell Sci. 2009;122:165-70 Caswell PT, Norman JC. Integrin trafficking and the control of cell migration. Traffic. 2006;7:14-21 Huttenlocher A, Sandborg RR, Horwitz AF. Adhesion in cell migration. Curr Opin Cell Biol. 1995;7:697-706 Huttenlocher A, Ginsberg MH, Horwitz AF. Modulation of cell migration by integrinmediated cytoskeletal linkages and ligand-binding affinity. J Cell Biol. 1996;134:1551-62 Zhang K, Chen J. The regulation of integrin function by divalent cations. Cell Adh Migr. 2012;6(1):20-29 Springer TA, Wang J-h. The three-dimensional structure of integrins and their ligands and conformational regulation of cell adhesion. Adv Protein Chem. 2004;68:29-63 Bon G, Folgiero V, Di Carlo S, Sacchi A, Falcioni R. Involvement of α6β4 integrin in the mechanisms that regulate breast cancer progression. Breast Cancer Res. 2007;9:203 Di Sabatino A, Rovedatti L, Rosado MM, Carsetti R, Corazza GR, MacDonald TT. Increased expression of mucosal addressin cell adhesion molecule 1 in the duodenum of patients with active celiac disease is associated with depletion of integrinα4β7-positive T cells in blood. Hum Pathol. 2009;40:699-704 Varner JA, Cheresh DA. Tumor angiogenesis and the role of vascular cell integrin αVβ3. Important Adv Oncol. 1996:69-87 Groenholm, Mikaela, et al. "LFA-1 integrin antibodies inhibit leukocyte α4β1-mediated adhesion by intracellular signalling." Blood 128.9 (2016): 1270-1281 Zecchinon, Laurent, et al. "Anatomy of the lymphocyte function-associated antigen-1." Clinical and Applied Immunology Reviews 6.3-4 (2006): 149-172 Takagi J, Petre BM, Walz T, Springer TA. Global conformational rearrangements in integrin extracellular domains in outside-in and inside-out signaling. Cell. 2002;110:599-611 Zhang M., March M.E., Lane W.S., Long E.O. A signaling network stimulated by β2 integrin promotes the polarization of lytic granules in cytotoxic cells. Sci. Signal. 2014;7:ra96 Traunecker E., Gardner R., Fonseca J.E., Polido-Pereira J., Seitz M., Villiger P.M., Iezzi G., Padovan E. Blocking of LFA-1 enhances expansion of Th17 cells induced by human CD14(+) CD16(+) nonclassical monocytes. Eur. J. Immunol. 2015;45:1414-1425 Verma N.K., Fazil M.H., Ong S.T., Chalasani M.L.S., Low J.H., Kottaiswamy A., Praseetha P., Kizhakeyil A., Kumar S., Panda A.K., et al. LFA-1/ICAM-1 Ligation in Human T Cells Promotes Th1 Polarization through a GSK3β Signaling- Dependent Notch Pathway. J. Immunol. 2016;197:108-118 Meli A.P., Fontes G., Avery D.T., Leddon S.A., Tam M., Elliot M., Ballesteros-Tato A., Miller J., Stevenson M.M., Fowell D.J., et al. The Integrin LFA-1 Controls T Follicular Helper Cell Generation and Maintenance. Immunity. 2016;45:831-846 Gahmberg C.G., Fagerholm S.C., Nurmi S.M., Chavakis T., Marchesan S., Groenholm M. Regulation of integrin activity and signaling. Biochim. Biophys. Acta. 2009;1790:431-444 Mocsai A., Walzog B., Lowell C.A. Intracellular signalling during neutrophil recruitment. Cardiovasc. Res. 2015;107:373-385 Vorup-Jensen T, Waldron TT, Astrof N, Shimaoka M, Springer TA. The connection between metal ion affinity and ligand affinity in integrin I domains. Biochim Biophys Acta. 2007;1774(9):1148-1155 Schuerpf, Thomas, and Timothy A Springer. "Regulation of integrin affinity on cell surfaces." The EMBO journal vol. 30,23 4712-27. 23 Sep. 2011 Goodman, Simon L, and Martin Picard. "Integrins as therapeutic targets." Trends in pharmacological sciences vol. 33,7 (2012): 405-12 Kwan, Byron H et al. "Integrin-targeted cancer immunotherapy elicits protective adaptive immune responses." The Journal of experimental medicine vol. 214,6 (2017): 1679-1690 Reina, Manuel, and Enric Espel. "Role of LFA-1 and ICAM-1 in Cancer." Cancers vol. 9,11 153. 3 Nov. 2017 Groenholm M, Jahan F, Bryushkova EA, et al. LFA-1 integrin antibodies inhibit leukocyte α4β1-mediated adhesion by intracellular signaling. Blood. 2016;128(9):1270-1281

上記を考慮すると、がん免疫療法を選択的に増強することが緊急に必要である。

上記の技術的問題は、本明細書に提供され、特許請求の範囲において特徴付けられる実施形態によって解決される。

したがって、本発明は以下の実施形態に関する。

１．がん免疫療法における使用のための組成物であって
（ａ）がんに対する免疫応答を増強する免疫系モジュレーターと、
（ｂ）抗がん免疫応答を有意に増強する中等度のＬＦＡ－１安定化特性を有するＬＦＡ－１シグナル伝達メディエーターと
を含む組成物。

２．抗がん免疫応答を増強する、がん免疫療法における使用のための中等度のＬＦＡ－１安定化特性を有するＬＦＡ－１シグナル伝達メディエーター。

３．ＬＦＡ－１シグナル伝達メディエーターが、腫瘍関連抗原を提示する細胞の選択的Ｔ細胞媒介死滅を誘導する、実施形態１に記載の使用のための組成物、または実施形態２に記載の使用のためのＬＦＡ－１シグナル伝達メディエーター。

４．中等度のＬＦＡ－１安定化特性を有するＬＦＡ－１シグナル伝達メディエーターが、強いＬＦＡ－１安定化特性を有するシグナル伝達メディエーターよりも、腫瘍関連抗原を提示しない細胞のＴ細胞媒介死滅を少なく誘導する、実施形態１、３に記載の使用のための組成物、または実施形態２、３に記載の使用のためのＬＦＡ－１シグナル伝達メディエーター。

５．強いＬＦＡ－１安定化特性を有するＬＦＡ－１シグナル伝達メディエーターが、ＣＢＲＬＦＡ－１／２である、実施形態４に記載の使用のための組成物、または実施形態４に記載の使用のためのＬＦＡ－１シグナル伝達メディエーター。

６．ＬＦＡ－１シグナル伝達メディエーターが金属イオン依存的接着部位に結合する、実施形態１、３～５に記載の使用のための組成物、または実施形態２～５に記載の使用のためのＬＦＡ－１シグナル伝達メディエーター。

７．ＬＦＡ－１シグナル伝達メディエーターが二価カチオンである、実施形態１、３～６に記載の使用のための組成物、または実施形態２～６に記載の使用のためのＬＦＡ－１シグナル伝達メディエーター。

８．二価カチオンがＭｇ^２＋である、実施形態７に記載の使用のための組成物、または実施形態７に記載の使用のためのＬＦＡ－１シグナル伝達メディエーター。

９．免疫系モジュレーターが、モノクローナル抗体、改変免疫細胞、またはチェックポイント阻害剤（ＣＰＩ）である、実施形態１、３～８のいずれか１つに記載の使用のための組成物。

１０．チェックポイント阻害剤がＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１阻害剤である、実施形態９に記載の使用のための組成物。

１１．ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１阻害剤が、ニボルマブ、ペンブロリズマブ、セミプリマブ、スパルタリズマブ、アテゾリズマブ、デュルバルマブ、およびアベルマブからなる群より選択される阻害剤である、実施形態１０に記載の使用のための組成物。

１２．ＬＦＡ－１シグナル伝達メディエーターの標的化送達のための担体をさらに含む、実施形態１、３～１１のいずれか１つに記載の使用のための組成物、または実施形態２～８、１１に記載の使用のためのＬＦＡ－１シグナル伝達メディエーター。

１３．担体が、膜形成分子である、実施形態１２に記載の使用のための組成物、または実施形態１２に記載の使用のためのＬＦＡ－１シグナル伝達メディエーター。

１４．膜形成分子が、カプセル形成脂質である、実施形態１３に記載の使用のための組成物、または実施形態１３に記載の使用のためのＬＦＡ－１シグナル伝達メディエーター。

１５．免疫系モジュレーターおよびＬＦＡ－１シグナル伝達メディエーターが、同時または逐次的に投与される、実施形態１、３～１４のいずれか１つに記載の使用のための組成物。

１６．免疫系モジュレーターおよびＬＦＡ－１シグナル伝達メディエーターが逐次的に投与される、実施形態１５に記載の使用のための組成物。

１７．免疫系モジュレーターが最初に投与され、その後ＬＦＡ－１シグナル伝達メディエーターが５年間の期間にわたって反復投与される、実施形態１６に記載の使用のための組成物。

１８．最初の投与の後に２～７日毎に反復投与される、実施形態１７に記載の使用のための組成物。

１９．がんが、乳がん、脳がん、血液形成臓器のがん（例えば、急性骨髄性白血病）、免疫系のがん（例えば、ホジキンリンパ腫）、前立腺がん、肺がん、結腸がん、頭頸部がん、皮膚がん、卵巣がん、子宮内膜がん、子宮頸がん（cervix cancer）、腎臓がん、肺がん、胃がん、小腸がん、肝臓がん、膵臓がん、精巣がん、下垂体がん、血液のがん、脾臓がん、胆嚢がん、胆管がん、食道がん、唾液腺がん、および甲状腺がんからなる群より選択される、実施形態１、３～１８のいずれか１つに記載の使用のための組成物、または実施形態２～８、１２～１４に記載の使用のためのＬＦＡ－１シグナル伝達メディエーター。

２０．がんが固形腫瘍であり、ＬＦＡ－１シグナル伝達メディエーターが腫瘍内注射を介して投与される、実施形態１、３～１９のいずれか１つに記載の使用のための組成物、または実施形態２～８、１２～１４、もしくは１９に記載の使用のためのＬＦＡ－１シグナル伝達メディエーター。

第１の実施形態では、本発明は、がんに対する免疫応答を増強する免疫系モジュレーターと、抗がん免疫応答を有意に増強する中等度のＬＦＡ－１安定化特性を有するＬＦＡ－１シグナル伝達メディエーターとを含む、がん免疫療法における使用のための組成物に関する。

別の実施形態では、本発明は、抗がん免疫応答を有意に増強する、中等度のＬＦＡ－１安定化特性を有するＬＦＡ－１シグナル伝達メディエーターに関する。

「がん」という用語は、本明細書で使用される場合、その独自の形質、すなわち正常な制御の喪失が、制御されない成長、分化の欠如、局所組織浸潤、および転移をもたらす、細胞の増殖を伴う疾患を指す。例としては、これらに限定されないが、乳房、脳、血液形成臓器（例えば、急性骨髄性白血病）、免疫系（例えば、ホジキンリンパ腫）、前立腺、肺、結腸、頭頸部、皮膚、卵巣、子宮内膜、子宮頸部、腎臓、肺、胃、小腸、肝臓、膵臓、精巣、下垂体、血液、脾臓、胆嚢、胆管、食道、唾液腺、および甲状腺のがんを含む、腫瘍様疾患を含むがん様疾患およびがん様前駆病変が挙げられる。

「免疫療法」という用語は、本明細書で使用される場合、免疫応答を誘導する、増強する、抑制する、またはそれ以外の方法で改変することを含む方法による、疾患、特にがんの処置または防止を指す。

「免疫系モジュレーター」という用語は、本明細書で使用される場合、特に免疫療法の一部として免疫応答を誘導する、増強する、抑制する、またはそれ以外の方法で改変することができる作用物質、薬物、組成物、および／または細胞を指す。一部の実施形態では、免疫系モジュレーターは、モノクローナル抗体、改変免疫細胞、チェックポイント阻害剤、低分子、サイトカイン、免疫アジュバント、およびＩＭｉＤの群から選択される少なくとも１つである。一部の実施形態では、免疫系モジュレーターは、モノクローナル抗体、改変免疫細胞、およびチェックポイント阻害剤の群から選択される少なくとも１つである。本発明の好ましい実施形態では、免疫系モジュレーターは、モノクローナル抗体、改変免疫細胞、またはチェックポイント阻害剤である。一部の実施形態では、本明細書に記載されるモノクローナル抗体は、ネイキッドモノクローナル抗体（ｎａｋｅｄｍｏｎｏｃｌｏｎａｌａｎｔｉｂｏｄｙ）、結合体化モノクローナル抗体、および二特異性抗体の群から選択される。一部の実施形態では、本明細書に記載される二特異性抗体は、二特異性Ｔ細胞エンゲージャーである。一部の実施形態では、本明細書に記載される改変免疫細胞は、腫瘍浸潤リンパ球、操作されたＴ細胞受容体を有する細胞、ＣＡＲＴ細胞、およびナチュラルキラー細胞の群から選択される少なくとも１つの細胞である。

「免疫応答」という用語は、本明細書で使用される場合、対象の免疫系による応答を指す。例えば免疫応答は、これらに限定されないが、Ｔｏｌｌ受容体活性化の検出可能な変更（例えば、増加）、リンフォカイン（例えば、サイトカインまたはケモカイン）発現および／または分泌、マクロファージ活性化、樹状細胞活性化、Ｔ細胞活性化（例えば、ＣＤ４^＋またはＣＤ８^＋Ｔ細胞）、ＮＫ細胞活性化、および／またはＢ細胞活性化（例えば、抗体の生成および／または分泌）を含む。免疫応答の追加の例は、ＭＨＣ分子に対する免疫原（例えば、抗原（例えば、免疫原性ポリペプチド））の結合、および細胞傷害性Ｔリンパ球（「ＣＴＬ」）応答の誘導、Ｂ細胞応答（例えば、抗体産生）、および／またはヘルパーＴリンパ球応答、および／または免疫原性ポリペプチドが由来する抗原に対する遅延型過敏（ＤＴＨ）応答の誘導、免疫系の細胞（例えば、Ｔ細胞、Ｂ細胞（例えば任意の発達段階の（例えば、形質細胞））の増大（例えば、細胞集団の成長）、ならびに抗原提示細胞による抗原のプロセシングおよび提示の増加を含む。免疫応答は、対象の免疫系が異物（例えば、微生物（例えば、病原体）からの非自己抗原、または異物として認識される自己抗原）として認識する免疫原に対する応答であり得る。このように、本明細書で使用される場合、「免疫応答」は、これらに限定されないが、自然免疫応答（例えば、Ｔｏｌｌ受容体シグナル伝達カスケードの活性化）、細胞媒介性免疫応答（例えば、Ｔ細胞（例えば、抗原特異的Ｔ細胞）および免疫系の非特異的細胞によって媒介される応答）、および液性免疫応答（例えば、Ｂ細胞によって媒介される応答（例えば、抗体の生成ならびに血漿、リンパ、および／または組織体液への分泌を介して））を含む、任意のタイプの免疫応答を指すと理解される。「免疫応答」という用語は、対象の免疫系が抗原（例えば、腫瘍関連抗原）および／または免疫原（例えば、免疫原に対する初回応答ならびに適応免疫応答の結果である獲得（例えば、メモリー）応答の両方）に応答する能力の全ての態様を包含することを意味する。

「ＬＦＡ－１シグナル伝達メディエーター」という用語は、本明細書で使用される場合、ＬＦＡ－１シグナル伝達を誘導する、増強する、容易にする、抑制する、またはそれ以外の方法で改変することができる作用物質を指す。

「ＬＦＡ－１安定化特性」という用語は、本明細書で使用される場合、ＬＦＡ－１がその低親和性状態にある確率を低減させるＬＦＡ１シグナル伝達メディエーターの特性を指す。強いＬＦＡ－１安定化特性を有するＬＦＡ－１シグナル伝達メディエーター、例えばＣＢＲＬＦＡ－１／２は、"Regulation of integrin affinity on cell surfaces" (Schuerpf, Thomas, and Timothy A Springer. The EMBO journal vol. 30,23 4712-27. 23 Sep. 2011)に記載されるアッセイにおいてＫ_ｄ≦１０．２μＭでＩＣＡＭ－１基質に対するＬＦＡ－１媒介リンパ球接着を誘導するＬＦＡ－１シグナル伝達メディエーターである。本発明に従う中等度のＬＦＡ－１安定化特性を有するＬＦＡ－１シグナル伝達メディエーターは、"Regulation of integrin affinity on cell surfaces" (Schuerpf, Thomas, and Timothy A Springer. The EMBO journal vol. 30,23 4712-27. 23 Sep. 2011)に記載されるアッセイにおいてＫ_ｄ＞１０．２μＭでＩＣＡＭ－１基質に対するＬＦＡ－１媒介リンパ球接着を誘導し、抗がん免疫応答を有意に増強するＬＦＡ－１シグナル伝達メディエーターである。一部の実施形態では、本発明に従う中等度のＬＦＡ－１安定化特性を有するＬＦＡ－１シグナル伝達メディエーターは、主に開放型頭部コンフォメーションに対する結合を増強することによってＬＦＡ－１シグナル伝達を媒介するＬＦＡ－１シグナル伝達メディエーターである。したがって、これらの実施形態では、中等度のＬＦＡ－１安定化特性を有するＬＦＡ－１シグナル伝達メディエーターは、アセンブルされたＣＤ１１ａ／ＣＤ１８ヘテロ二量体および折れ曲がりＬＦＡ－１コンフォメーションでのＬＦＡ－１結合よりも、開放型頭部コンフォメーションでのＬＦＡ－１結合を増強する。開放型頭部コンフォメーションでの結合は、ｍ２４（Ｍ２４クローン、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、カテゴリー番号３６３４０２）を使用するフローサイトメトリーによって決定され得る（例えば、図２ｉを参照されたい）。アセンブルされたＣＤ１１ａ／ＣＤ１８ヘテロ二量体での結合は、ＴＳ２／４抗体（ＴＳ２／４クローン、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、カテゴリー番号３５０６０２）を使用するフローサイトメトリーによって決定され得る（例えば、図２ｆを参照されたい）。折れ曲がりコンフォメーションでの結合は、ＨＩ１１１抗体（ＨＩ１１１クローン、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、カテゴリー番号３０１２０２）を使用するフローサイトメトリーによって決定され得る（例えば、図２ｇを参照されたい）。一部の実施形態では、本明細書に記載される中等度のＬＦＡ－１安定化特性を有するＬＦＡ－１シグナル伝達メディエーターは、好ましくは図２ｈまたは２ｉにそれぞれ記載されるアッセイにおいて、ＣＤ３刺激ｍ２４および／またはＫＩＭ１２７結合を、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約１００％増強することができる。一部の実施形態では、本明細書に記載される中等度のＬＦＡ－１安定化特性を有するＬＦＡ－１シグナル伝達メディエーターは、好ましくは図２ｆ、２ｇ、２ｈ、２ｉの対応するアッセイに記載されるように、ＣＤ３刺激ｍ２４および／またはＫＩＭ１２７結合を、ＣＤ３刺激ＨＩ１１１および／またはＴＳ２／４結合より少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約１００％多く増強することができる。一部の実施形態では、本明細書に記載される中等度のＬＦＡ－１安定化特性を有するＬＦＡ－１シグナル伝達メディエーターは、少なくとも１つのＬＦＡ－１シグナル伝達マーカーの少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、または少なくとも約３０％の増加を誘導し、好ましくはＬＦＡ－１シグナル伝達マーカーは、より好ましくは図２Ｊまたは２Ｋのそれぞれに記載されるアッセイにおいて検出される、ＣＤ３／２８媒介ホスホ－ＦＡＫ_３９７陽性％および／またはＴＮＦ陽性％である。一部の実施形態では、中等度のＬＦＡ－１安定化特性を有するＬＦＡ－１シグナル伝達メディエーターは、アセンブルされたＣＤ１１ａ／ＣＤ１８ヘテロ二量体に対する結合を増強しないかまたは実質的に増強せず、折れ曲がりＬＦＡ－１コンフォメーションを増強しないかまたは実質的に増強しない。本発明の文脈において、「ＬＦＡ－１結合を増強しないかまたは実質的に増強しない」とは、ＬＦＡ－１結合を１０％未満、９％未満、８％未満、７％未満、６％未満、５％未満、４％未満、３％未満、２％未満、１％未満増強するかまたは増強しないことを意味する。一部の実施形態では、中等度のＬＦＡ－１安定化特性を有するＬＦＡ－１シグナル伝達メディエーターを説明する閾値および範囲は、アッセイにおいて少なくとも約０．０１２ｍＭ、少なくとも約０．０６ｍＭ、少なくとも約０．１２ｍＭ、少なくとも約０．６ｍＭ、または少なくとも約１．２ｍＭの濃度で達成される。一部の実施形態では、中等度のＬＦＡ－１安定化特性を有するＬＦＡ－１シグナル伝達メディエーターを説明する閾値および範囲は、アッセイにおいて少なくとも約０．０１２ｍＭ～約１．２ｍＭ、約０．０６ｍＭ～約１．２ｍＭ、約０．１２ｍＭ～約１．２ｍＭ、約０．６ｍＭ、または約１．２ｍＭの濃度範囲で達成される。一部の実施形態では、中等度のＬＦＡ－１安定化特性を有するＬＦＡ－１シグナル伝達メディエーターを説明する閾値および範囲は、アッセイにおいて少なくとも最も有効な濃度で達成される。

したがって、本発明の一部の実施形態では、ＣＢＲＬＦＡ－１／２のＬＦＡ－１安定化特性より弱いＬＦＡ－１安定化特性は、中等度のＬＦＡ－１安定化特性とみなされる。

理論に拘束されることなく、本発明の組成物または本発明のＬＦＡ－１シグナル伝達メディエーターは、ＬＦＡ－１安定化を最適化することによってがんに対する免疫応答を増強することができる（図１ｂ～ｆ、ｈ、ｉ）。本発明者らは、中等度のＬＦＡ－１安定化が、がん免疫療法にとって驚くほど有益であることを見出した。これに対し、以前は、強いＬＦＡ－１安定化が、ＩＣＡＭ－１に対するＴリンパ球上のＬＦＡ－１親和性にとって必要であること（Schuerpf, Thomas, and Timothy A Springer. "Regulation of integrin affinity on cell surfaces." The EMBO journal vol. 30,23 4712-27. 23 Sep. 2011）、またはＬＦＡ１の遮断ががん免疫療法にとって有益であること（Cohen S, Haimovich J, Hollander N. Anti-idiotype x anti-LFA-1 bispecific antibodies inhibit metastasis of B cell lymphoma. J Immunol. 2003;170(5):2695-2701）が示唆されていた。そのため、本明細書に提供される本発明は、組成物中のまたは単独での強いＬＦＡ－１安定化特性を有するＬＦＡ－１シグナル伝達メディエーターではなくて、中等度のＬＦＡ－１安定化特性を有するＬＦＡ－１シグナル伝達メディエーターが、がん治療の間に免疫応答を増強することができるという驚くべき知見に基づいている。

本発明のある特定の実施形態では、ＬＦＡ－１シグナル伝達メディエーターは、腫瘍関連抗原を提示する細胞の選択的Ｔ細胞媒介死滅を誘導する。

「選択的Ｔ細胞媒介死滅」という語句は、本明細書で使用される場合、（実施例、図４ｅ）に記載されるアッセイにおいて、腫瘍関連抗原を提示する細胞のＴ細胞媒介死滅（例えば、パルスした細胞の死滅）を、腫瘍関連抗原を提示しない細胞のＴ細胞媒介死滅（例えば、パルスしていない細胞の死滅）によって除算した比が、１．５より大きい、好ましくは１．６より大きい、１．７より大きい、１．８より大きい、１．９より大きい、２．０より大きい、２．１より大きい、２．２より大きい、２．３より大きい、２．４より大きい、２．５より大きい、２．６より大きい、２．７より大きい、２．８より大きい、２．９より大きい、３．０より大きい、３．１より大きい、３．２より大きい、３．３より大きい、３．４より大きい、３．５より大きい、３．６より大きい、３．７より大きい、３．８より大きい、３．９より大きい、４．０より大きいことを指す。

「腫瘍関連抗原」という用語は、本明細書で使用される場合、腫瘍関連細胞によって発現され、正常細胞において発現されるその対応物とは質的に異なるか、または正常細胞より腫瘍細胞において高レベルで発現される分子（例えば、タンパク質またはペプチド）を指す。このように、腫瘍関連抗原は、（例えば、分子がタンパク質である場合には、１つまたは複数のアミノ酸残基）が異なり得るか、または正常細胞において発現されるその対応物と同一であり得る。一部の腫瘍関連抗原は、正常細胞によって発現されないか、または腫瘍細胞の正常な対応物より腫瘍細胞において少なくとも約２倍高い（例えば、約２倍、３倍、５倍、１０倍、２０倍、４０倍、１００倍、５００倍、１，０００倍、５，０００倍、または１５，０００倍高い）レベルで発現される。

任意の好適な腫瘍関連抗原を使用することができる。腫瘍関連抗原は、これらに限定されないが、天然に存在する腫瘍抗原および対象において免疫応答を誘導するその改変型を含み、腫瘍細胞に関連する抗原および腫瘍細胞に対して特異的な抗原、および対象において免疫応答を誘導する前述の改変型をさらに含む。腫瘍関連抗原という用語は、発癌性ウイルス抗原（例えば、ヒトパピローマウイルス抗原）などの腫瘍の誘導と相関するタンパク質に対応する抗原をさらに包含する。例示的な腫瘍関連抗原としては、これらに限定されないが、乳がんのＨＥＲ２／ｎｅｕおよびＢＲＣＡｌ抗原、ＭＡＲＴ－１／ＭｅｌａｎＡ（黒色腫抗原）、Ｆｒａ－１（乳がん）、ＮＹ－ＢＲ６２、ＮＹ－ＢＲ８５、ｈＴＥＲＴ、ｇｐｌＯＯ、チロシナーゼ、ＴＲＰ－Ｉ、ＴＲＰ－２、ＮＹ－ＥＳＯ－Ｉ、ＣＤＫ－４、β－カテニン、ＭＵＭ－Ｉ、カスパーゼ－８、ＫＩＡＡ０２０５、ＳＡＲＴ－Ｉ、ＰＲＡＭＥ、およびｐｉ５抗原、ＭＡＧＥファミリーのメンバー（黒色腫抗原）、ＢＡＧＥファミリーのメンバー（黒色腫抗原）、ＤＡＧＥ／ＰＲＡＭＥファミリーのメンバー（例えば、ＤＡＧＥ－１）、ＧＡＧＥファミリーのメンバー（黒色腫抗原）、ＲＡＧＥファミリーのメンバー（例えば、ＲＡＧＥ－Ｉ）、ＳＭＡＧＥファミリーのメンバー、ＮＡＧ、ＴＡＧ－７２、ＣＡｌ２５、ｐ２１ｒａｓなどの変異したがん原遺伝子、ｐ５３などの変異した腫瘍抑制遺伝子、腫瘍関連ウイルス抗原（例えば、ＨＰＶＥ６およびＥ７）、ＳＳＸファミリー、ＨＯＭ－ＭＥＬ－５５、ＮＹ－ＣＯＬ－２、ＨＯＭ－ＨＤ－３９７、ＨＯＭ－ＲＣＣ－１．１４、ＨＯＭ－ＨＤ－２１、ＨＯＭ－ＮＳＣＬＣ－１１、ＨＯＭ－ＭＥＬ－２．４、ＨＯＭ－ＴＥＳ－１１、ＲＣＣ－３．１．３、ＮＹ－ＥＳＯ－Ｉ、およびＳＣＰファミリーが挙げられる。ＭＡＧＥファミリーのメンバーとしては、これらに限定されないが、ＭＡＧＥ－Ｉ、ＭＡＧＥ－２、ＭＡＧＥ－３、ＭＡＧＥ－４、ＭＡＧＥ－６、ＭＡＧＥ－１１、およびＭＡＧＥ－１２が挙げられる。ＧＡＧＥファミリーのメンバーとしては、これらに限定されないが、ＧＡＧＥ－Ｉ、ＧＡＧＥ－６が挙げられる。例えば、Van den Eynde and van der Bruggen, (1997) Curr. Opin. Immunol. 9: 684-693;およびSahin et al., (1997) Curr. Opin. Immunol. 9: 709-716による概説を参照されたい。

腫瘍関連抗原はまた、これらに限定されないが、ヒト上皮細胞ムチン（Ｍｕｃ－１；乳がん細胞および膵臓がん細胞に存在するＭｕｃ－１糖タンパク質の２０アミノ酸のコアリピート）、ＭＵＣ－２、ＭＵＣ－３、ＭＵＣ－１８、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、ｒａｆ癌遺伝子産物、ＣＡ－１２５、ＧＤ２、ＧＤ３、ＧＭ２、ＴＦ、ｓＴｎ、ｇｐ７５、ＥＢＶ－ＬＭＰ１＆２、前立腺特異抗原（ＰＳＡ）、前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）、ＧｎＴ－ＶイントロンＶ配列（Ｎ－アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＶイントロンＶ配列）、前立腺Ｃａｐｓｍ、ＭＵＭ－Ｉ－Ｂ（黒色腫遍在性変異遺伝子産物）、アルファ－フェトプロテイン（ＡＦＰ）、ＣＯｌ７－１Ａ、ＧＡ７３３、ｇｐ７２、β－ＨＣＧ、ｇｐ４３、ＨＳＰ－７０、ｐｉ７ｍｅｌ、ＨＳＰ－７０、ｇｐ４３、ＨＭＷ、ＨＯＪ－Ｉ、黒色腫ガングリオシド、ＴＡＧ－７２、ｐ２１ｒａｓなどの変異したがん原遺伝子、ｐ５３などの変異した腫瘍抑制遺伝子、エストロゲン受容体、乳脂肪グロブリン、テロメラーゼ、核マトリックスタンパク質、前立腺酸性ホスファターゼ、タンパク質ＭＺ２－Ｅ、多形上皮ムチン（polymorphic epithelial mucin）（ＰＥＭ）、葉酸結合タンパク質ＬＫ２６、切断型上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）、トムセン－フリーデンライヒ（Ｔ）抗原、ＧＭ－２およびＧＤ－２ガングリオシド、多形上皮ムチン、葉酸結合タンパク質ＬＫ２６、ヒト絨毛ゴナドトロピン（ＨＣＧ）、膵癌胎児抗原、がん抗原１５－３、１９－９、５４９、１９５、扁平上皮癌抗原（ＳＣＣＡ）、卵巣がん抗原（ＯＣＡ）、膵臓がん関連抗原（ＰａＡ）、ＥＢＮＡ（エプスタイン－バーウイルス核抗原）１～６、ｇｐ７５、キメラタンパク質Ｐ２１０ＢＣＲ－ＡＢＬ、肺耐性タンパク質（lung resistance protein）（ＬＲＰ）、Ｂｃｌ－２、およびＫｉ－６７であり得る。例えば、米国特許第６，５３７，５５２号を参照されたい；同様に、米国特許第６，８１５，５３１号；第６，７７３，７０７号；第６，６８２，９２８号；および第６，６２３，７３９号も参照されたい。

腫瘍関連抗原はまた、Ｂ細胞腫瘍（例えば、Ｂ細胞リンパ腫；Ｂ細胞白血病；骨髄腫；ヘアリーセル白血病）によって産生された抗体、抗体のイディオタイプのエピトープを含有するそのような抗体の断片、悪性Ｂ細胞抗原受容体、悪性Ｂ細胞免疫グロブリンイディオタイプ、免疫グロブリンの可変領域、免疫グロブリンの可変領域の超可変領域または相補性決定領域（ＣＤＲ）、悪性Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）、ＴＣＲの可変領域および／またはＴＣＲの超可変領域であり得る。一実施形態では、本発明の腫瘍関連抗原は、抗体の天然のイディオタイプのコンフォメーションおよび特異的結合活性を保持する、連結されたＶＨおよびＶＬドメインを含む一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）でもあり得る。

本明細書に提供される中等度のＬＦＡ－１安定化特性を有するＬＦＡ－１シグナル伝達メディエーターは、その免疫応答、例えばＴ細胞機能（図２ｃ）、細胞傷害（図３ｄ、３ｋ、３ｌ、３ｏ、４ｃ、４ｄ）、脱顆粒（図３ｃおよび３ｊ）および／またはサイトカイン放出（図２ｄおよび３ｐ）において免疫細胞を補助することができる。標的細胞のＴ細胞媒介死滅は、中等度のＬＦＡ－１安定化特性を有するＬＦＡ－１シグナル伝達メディエーターの存在下では選択的であるが、強いＬＦＡ－１安定化特性を有するＬＦＡ－１シグナル伝達メディエーターの存在下では非選択的である（図４ｅ）。

したがって、本明細書に提供される本発明は、中等度のＬＦＡ－１安定化特性を有するＬＦＡ－１シグナル伝達メディエーターが、強いＬＦＡ－１安定化特性を有するＬＦＡ－１シグナル伝達メディエーターよりも、非標的細胞の死滅などの望ましくない効果を少なく誘導するという驚くべき知見に基づいている。

したがって、本発明のある特定の実施形態では、中等度のＬＦＡ－１安定化特性を有するＬＦＡ－１シグナル伝達メディエーターは、強いＬＦＡ－１安定化特性を有するシグナル伝達メディエーターよりも、腫瘍関連抗原を提示しない細胞のＴ細胞媒介死滅を少なく誘導する。したがって、強いＬＦＡ－１安定化は、非標的細胞の死滅を誘導することによって望ましくない副作用を誘導する可能性がより高い。

したがって、本明細書に提供される本発明は、ＬＦＡ－１シグナル伝達メディエーターの中等度だが、強くはないＬＦＡ－１安定化特性が、標的細胞の選択的死滅を媒介するという驚くべき知見に基づいている。

本発明のある特定の実施形態では、強いＬＦＡ－１安定化特性を有するＬＦＡ－１シグナル伝達メディエーターは、ＬＦＡ－１のＩ－ＥＧＦ－３結合部位に結合する抗体であり、より好ましくは強いＬＦＡ－１安定化特性を有するＬＦＡ－１シグナル伝達メディエーターはＣＢＲＬＦＡ－１／２である。

「ＣＢＲＬＦＡ－１／２」という用語は、本明細書で使用される場合、Petruzzelli, L et al.（"Activation of lymphocyte function-associated molecule-1 (CD11a/CD18) and Mac-1 (CD11b/CD18) mimicked by an antibody directed against CD18." Journal of immunology (Baltimore, Md.: 1950) vol. 155,2 (1995): 854-66）によって記載されるモノクローナル抗体を指す。

したがって、本明細書に提供される本発明は、中等度のＬＦＡ－１安定化特性を有するＬＦＡ－１シグナル伝達メディエーターが標的細胞の選択的死滅を媒介するが、ＣＢＲＬＦＡ－１／２のＬＦＡ－１安定化特性を有するＬＦＡ－１シグナル伝達メディエーターは媒介しないという驚くべき知見に基づいている。

本発明のある特定の実施形態では、ＬＦＡ－１シグナル伝達メディエーターは、ＬＦＡ－１、好ましくはＬＦＡ－１の細胞外領域、より好ましくはＬＦＡ－１のβ鎖、より好ましくはＬＦＡ－１の頭部、より好ましくはＬＦＡ－１のＩドメイン、より好ましくはＬＦＡ－１の金属イオン依存的接着部位に結合して、中等度のＬＦＡ－１安定化を誘導する。本発明内では、ＬＦＡ－１シグナル伝達メディエーター、特に中等度のＬＦＡ－１安定化特性を有するＬＦＡ－１シグナル伝達メディエーターは、抗体、ペプチド、低分子、またはカチオン、特にＭｇ^２＋などの二価カチオンであり得る。

「金属イオン依存的接着部位」という用語は、本明細書で使用される場合、Ｍｇ^２＋またはＭｎ^２＋などの金属イオンの接着を可能にするＬＦＡ－１分子のＩドメインにおける特徴的な部位を指す。

「二価カチオン」という用語は、本明細書で使用される場合、プラス２の価数を有する、正電荷を持つ元素、原子、または分子を指す。用語は、Ｃａ^２＋、Ｚｎ^２＋、Ｍｎ^２＋、Ｍｇ^２＋、Ｆｅ^２＋、Ｃｏ^２＋、Ｎｉ^２＋、および／またはＣｕ^２＋などの金属イオンを含む。本発明のある特定の実施形態では、二価カチオンは、イオンの塩の形態である。二価の塩の形態の特定の例としては、ＣａＣｌ２、ＺｎＣｌ２、ＭｎＳＯ４、ＭｎＣｌ２、およびＭｇＣｌ２、ならびに上記の塩の形態の例示的な二価カチオンと、例えば塩化物イオン（Ｃｌ）、硫酸イオン（ＳＯ４）、酢酸イオン（Ａｃ）、および／またはリン酸イオン（Ｐ）との他の組合せが挙げられる。上記で例証されたもの以外の二価カチオンおよび塩の形態は、当技術分野で周知であり、本明細書で使用される用語の意味に含まれる。

二価カチオンは、ＬＦＡ－１の金属イオン依存的接着部位に結合して、中等度のＬＦＡ－１安定化特性を生じることが公知である。

したがって、本明細書に提供される本発明は、ＬＦＡ－１シグナル伝達メディエーターが、ＬＦＡ－１、好ましくはＬＦＡ－１の細胞外領域、より好ましくはＬＦＡ－１のβ鎖、より好ましくはＬＦＡ－１の頭部、より好ましくはＬＦＡ－１のＩドメイン、より好ましくは中等度のＬＦＡ－１安定化を誘導するＬＦＡ－１の金属イオン依存的接着部位に結合すると、がん治療の間の免疫系の免疫応答および／または免疫系モジュレーターの免疫応答を選択的に増強することができるという驚くべき知見に基づいている。

中等度のＬＦＡ－１安定化特性を有するＬＦＡ－１シグナル伝達メディエーターは、当技術分野で公知の方法を使用して、例えばフローベースのアッセイ（図２ｆ～ｉ、２ｌ）を使用して、または当業者に公知の他の方法、例えば仮想スクリーニング（Shoda M, Harada T, Yano K, et al. Virtual screening leads to the discovery of an effective antagonist of lymphocyte function-associated antigen-1. ChemMedChem. 2007;2(4):515-521）、Ｖウェル接着アッセイ（Weetall M, Hugo R, Friedman C, et al. A homogeneous fluorometric assay for measuring cell adhesion to immobilized ligand using V-well microtiter plates. Anal Biochem. 2001;293(2):277-287）、インテグリンＬＦＡ－１の無細胞リガンド結合アッセイ（Yuki, Koichi. Methods in molecular biology (Clifton, N.J.) vol. 757 (2012): 73-8）、ＦＲＥＴベースの定量およびスクリーニング技術プラットフォーム（Chakraborty S, Nunez D, Hu SY, et al. FRET based quantification and screening technology platform for the interactions of leukocyte function-associated antigen-1 (LFA-1) with intercellular adhesion molecule-1 (ICAM-1) PLoS One. 2014;9(7):e102572. Published 2014 Jul 17）、共焦点オンビーズスクリーニング（Hintersteiner, Martin, et al. "Identification and X-ray co-crystal structure of a small-molecule activator of LFA-1-ICAM-1 binding." Angewandte Chemie International Edition 53.17 (2014): 4322-4326）、ネガティブ染色電子顕微鏡（Takagi, J., Petre, B.M., Walz, T., and Springer, T.A. (2002). Global conformational rearrangements in integrin extracellular domains in outside-in and inside-out signaling. Cell 110, 599-611）、結晶学（Xiong, J.P., Stehle, T., Zhang, R., Joachimiak, A., Frech, M., Goodman, S.L., and Arnaout, M.A. (2002). Crystal structure of the extracellular segment of integrin αVβ3 in complex with an Arg-Gly-Asp ligand. Science 296, 151-155）、ＮＭＲ（Beglova, N., Blacklow, S.C., Takagi, J., and Springer, T.A. (2002). Cysteine-rich module structure reveals a fulcrum for integrin rearrangement upon activation. Nat. Struct. Biol. 9, 282-287）、エピトープマッピング（Lu, C., Ferzly, M., Takagi, J., and Springer, T.A. (2001). Epitope mapping of antibodies to the C-terminal region of the integrin β2 subunit reveals regions that become exposed upon receptor activation. J. Immunol. 166, 5629-5637and Lu, C., Shimaoka, M., Zang, Q., Takagi, J., and Springer, T.A. (2001).Locking in alternate conformations of the integrin αLβ2 I domain with disulfide bonds reveals functional relationships among integrin domains. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98, 2393-2398）、および／または迅速フローサイトメトリー方法（Crucian, Brian, Mayra Nelman-Gonzalez, and Clarence Sams. "Rapid flow cytometry method for quantitation of LFA-1-adhesive T cells." Clinical and vaccine immunology 13.3 (2006): 403-408）を使用することによって、中等度のＬＦＡ－１安定化特性に関してスクリーニングすることによって同定することができる。

本発明内では、中等度のＬＦＡ－１安定化特性を有するＬＦＡ－１シグナル伝達メディエーターは、１つまたは複数のアッセイ、例えば上記で提供されたアッセイの１つを使用するスクリーニングによって選択され得る。したがって、本明細書で使用される、中等度のＬＦＡ－１安定化特性を有するＬＦＡ－１シグナル伝達メディエーターは、免疫系の機能、例えば代謝リプログラミング（例えば、図２ａおよび３ａ）、増強された選択的免疫細胞媒介死滅（例えば、図３ｄ、３ｋ、および３ｏ）、および／またはSomersalo K, et al.（Cytotoxic T lymphocytes form an antigen-independent ring junction. J Clin Invest. 2004;113(1):49-57）またはFranciszkiewicz K, et al（CD103 or LFA-1 engagement at the immune synapse between cytotoxic T cells and tumor cells promotes maturation and regulates T-cell effector functions. Cancer Res. 2013;73(2):617-628）によって記載される免疫シナプス形成に及ぼす効果を試験するアッセイに基づいて選択され得る。本明細書で使用される中等度のＬＦＡ－１安定化特性を有するＬＦＡ－１シグナル伝達メディエーターは、選択的Ｔ細胞媒介死滅特性を有しながら（例えば、図４ｅ）、好ましくは顕著なＥＣＡＲ増加（例えば、図２ａおよび３ａ）、腫瘍細胞および／または腫瘍関連抗原を提示する細胞の顕著な死滅の増加（例えば、図３ｋ、３ｏ）を誘導する。

中等度のＬＦＡ－１安定化特性を有する好ましいＬＦＡ－１シグナル伝達メディエーターは、本明細書で使用される場合、１つまたは複数のアッセイにおけるＭｇ^２＋の特性であるおよび／またはそれと類似である、好ましくは１つまたは複数のアッセイにおけるＭｇ^２＋の特性と類似である上記のアッセイの１つまたは複数における特性を有し得る。

一例では、当業者は、２ステップスクリーニングを使用して本発明に従う中等度のＬＦＡ－１安定化特性を有するＬＦＡ－１シグナル伝達メディエーターを同定する。第１のステップでは、アッセイ、例えば上記の免疫シナプス形成アッセイを使用して、ＩＣＡＭ－１基質に対するＬＦＡ－１媒介リンパ球の接着をＫ_ｄ＞１０．２μＭで誘導する少なくとも１つのＬＦＡ－１シグナル伝達メディエーター候補を同定する。第２のステップでは、第１のステップからの候補を、候補が抗がん免疫応答を有意に増強すれば、中等度のＬＦＡ－１安定化特性を有するＬＦＡ－１シグナル伝達メディエーターであると同定する。候補は、好ましくは候補が、Ｔ細胞媒介死滅を増強すれば、より好ましくは候補が、スクリーニングの第２のステップにおいて図３ｋに記載されるアッセイにおいて腫瘍関連抗原を提示する細胞の選択的Ｔ細胞媒介死滅を誘導すれば、選択される。図４ｅに記載されるアッセイにおけるＬＦＡ－１シグナル伝達メディエーターの濃度は、当業者によってＬＦＡ－１シグナル伝達を媒介するために適切であると推定される濃度に従う。ＬＦＡ－１シグナル伝達メディエーターがＣＢＲ－ＬＦＡ１／２である本発明の実施形態では、適切なＣＢＲ－ＬＦＡ１／２濃度は、以前の研究においてこれらの濃度で観察されたＬＦＡ－１活性に基づいて、約１０^－１である（Petruzzelli L, Maduzia L, Springer TA. Activation of lymphocyte function-associated molecule-1 (CD11a/CD18) and Mac-1 (CD11b/CD18) mimicked by an antibody directed against CD18. J Immunol. 1995;155(2):854-866; Groenholm M, Jahan F, Bryushkova EA, et al. LFA-1 integrin antibodies inhibit leukocyte α4β1-mediated adhesion by intracellular signaling. Blood. 2016;128(9):1270-1281）。

したがって、本発明のＬＦＡ－１シグナル伝達メディエーターは、がん免疫療法における使用のために驚くほど選択的かつ有用である抗がん免疫応答を有意に増強する。

したがって、本発明の組成物は、がんに対する免疫応答を増強する免疫系モジュレーターと、がん免疫療法における使用のために驚くほど選択的かつ有用である抗がん免疫応答を有意に増強する中等度のＬＦＡ－１安定化特性を有するＬＦＡ－１シグナル伝達メディエーターとを含む。

ＬＦＡ－１は、細胞－細胞接触媒介性死滅ならびに抗体媒介性死滅のプロセスに関係している（Oxford Dictionary of Biochemistry and Molecular Biology. Eds. Cammack, Richard, Teresa Atwood, Peter Campbell, Howard Parish, Anthony Smith, Frank Vella, and John Stirling.: Oxford University Press, 2008）。

本発明のある特定の実施形態では、免疫系モジュレーターは、モノクローナル抗体、改変免疫細胞、またはチェックポイント阻害剤（ＣＰＩ）である。

「抗体」という用語は、本明細書で使用される場合、対応する抗原に特異的に結合することが可能な、免疫グロブリンファミリーのタンパク質または免疫グロブリンの断片を含むポリペプチドを指す。一般的に、「抗体」という用語は、本明細書においてその最も広い意味で使用され、これらに限定されないが、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、多特異性抗体（例えば、二特異性抗体）、キメラ抗体、完全ヒト抗体、およびそれらが所望の抗原結合活性を示す限り抗体断片を含む、様々な抗体構造を包含する。本発明における抗体はまた、キメラ抗体、組換え抗体、組換え抗体の抗原結合性断片、ヒト化抗体、またはファージ表面に提示されたもしくはキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）Ｔ細胞の表面上に提示された抗体であり得る。抗体を産生する方法は、当技術分野で周知である（例えば、Harlow and Lane (1988) Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y.；および米国特許第４，１９６，２６５号を参照されたい）。

「モノクローナル抗体」という用語は、本明細書で使用される場合、実質的に均一な抗体の集団から得られた抗体を指し、すなわち集団を構成する個々の抗体は、微量で存在し得る起こり得る天然に存在する変異を除き同一である。モノクローナル抗体は、非常に特異的であり、単一の抗原部位に指向される。モノクローナル抗体は、それらが、ハイブリドーマ培養によって合成され、本質的に他の免疫グロブリンが混入しないという点で有利である。修飾語「モノクローナル」は、抗体の特徴が、抗体の実質的に均一な集団の中にあることを示し、任意の特定の方法による抗体の産生を必要とするとはみなされない。上記のように、本発明に従って使用されるモノクローナル抗体は、Kohler, Nature 256 (1975), 495によって記載されるハイブリドーマ法によって作製され得る。

「改変」免疫細胞という用語は、本明細書で使用される場合、対象への細胞の投与後にがんに対して増強された免疫応答を付与するようにｉｎｖｉｔｒｏで操作された細胞を指す。本発明の一部の実施形態では、改変免疫細胞は、対象を起源とし、操作後に同じ対象に再度投与される。本発明の一部の実施形態では、改変免疫細胞は、１つの対象に由来し、第２の対象に投与される。改変免疫細胞は、これらに限定されないが、操作された免疫細胞、ならびに／または活性化プロトコールによって活性化されたおよび／もしくは増大プロトコールによって増大させた細胞を含む。「操作された」免疫細胞という用語は、本明細書で使用される場合、外因性の核酸配列、例えばベクターが導入されており、がんに対する免疫応答を増強する免疫細胞を指す。したがって、操作された免疫細胞は、組換えにより導入された核酸を含有しない天然に存在する免疫細胞とは区別される。免疫細胞は、天然で、抗原を標的化するための受容体を有し、サイトカインシグナル等を受け得るが、本開示の免疫細胞は、非天然であり、それらが所望の二成分（ｂｉｐａｒｔｉｔｅ）または三成分（ｔｒｉｐａｒｔｉｔｅ）シグナル伝達分子を発現するように人の手によって直接または間接的に操作されている。操作された免疫細胞は、組換え操作によって１つ、２つ、または３つのシグナル伝達分子を発現するように操作され得る。１つまたは複数のシグナル伝達分子を発現するように細胞を操作することは、単一のステップまたは複数のステップで行われ得、操作は、単一の時点でまたは逐次的な時点で行われ得る。特定の態様では、細胞は、養子移入のためである。細胞は、医薬組成物に含まれ得る。細胞は、本明細書に記載される１つまたは複数のベクターによって形質転換されてもよくまたはトランスフェクトされてもよい。組換え細胞は、本明細書に記載されるベクターの少なくとも１つを導入することによって産生され得る。細胞におけるベクターの存在は、適切な受容体の発現を媒介し、一部の実施形態では、１つまたは複数の構築物が細胞のゲノムに組み込まれる。すなわち、宿主に導入された核酸分子またはベクターは、宿主のゲノムに組み込まれてもよく、または染色体外で維持されてもよい。操作された免疫細胞としては、これらに限定されないが、ＣＡＲＴ細胞、操作された細胞傷害性Ｔ細胞、操作されたＢ細胞、操作された顆粒球、および／または操作された単球、例えば操作されたマクロファージ、操作された樹状細胞が挙げられる。一部の実施形態では、本明細書に記載される操作された免疫細胞は、ＣＡＲＴ細胞、細胞傷害性Ｔ細胞、Ｂ細胞、顆粒球、ＮＫ細胞、および単球の群から選択される少なくとも１つの細胞である。

本明細書で使用される場合、「ＣＰＩ」または「チェックポイント阻害剤」という用語は、１つまたは複数のチェックポイントタンパク質を完全にまたは部分的に低減する、阻害する、干渉する、またはモジュレートする分子を指す。チェックポイントタンパク質は、Ｔ細胞活性化または機能を調節する。

理論に拘束されないが、ＬＦＡ－１メディエーターは、ＬＦＡ－１安定化を介して細胞接着、細胞遊走、および／または細胞分化を増強し得る（Oxford Dictionary of Biochemistry and Molecular Biology. Eds. Cammack, Richard, Teresa Atwood, Peter Campbell, Howard Parish, Anthony Smith, Frank Vella, and John Stirling. : Oxford University Press, 2008; Verma, Navin Kumar, and Dermot Kelleher. "Not just an adhesion molecule: LFA-1 contact tunes the T lymphocyte program." The Journal of Immunology 199.4 (2017): 1213-1221）。ＬＦＡ－１メディエーターは、自然免疫細胞の免疫応答および／または適応免疫細胞の免疫応答を増強し得る可能性がある。例えば、中等度のＬＦＡ－１安定化特性を有するＬＦＡ－１メディエーターは、Ｔ細胞、Ｂ細胞、顆粒球、および／または単球の免疫応答を増強し得る（Oxford Dictionary of Biochemistry and Molecular Biology. Eds. Cammack, Richard, Teresa Atwood, Peter Campbell, Howard Parish, Anthony Smith, Frank Vella, and John Stirling. : Oxford University Press, 2008; Carrasco YR, Fleire SJ, Cameron T, Dustin ML, Batista FD. LFA1/ICAM-1 interaction lowers the threshold of B cell activation by facilitating B cell adhesion and synapse formation. Immunity. 2004;20(5):589-599）。したがって、本発明の組成物は、Ｔ細胞、Ｂ細胞、顆粒球、および単球を含むことによって、がん免疫療法における使用のために特に有用であり得る。改変免疫細胞の免疫応答は、ＬＦＡ－１メディエーターによって特に増強され得る（例えば、図３ｏ、４ｃを参照されたい）。ある特定の改変免疫細胞、例えばメモリーＴ細胞、ＰＨＡ誘導Ｔ細胞芽球、ならびにＲＥＰＴ細胞は、ナイーブＣＤ８^＋細胞より高いＬＦＡ－１発現を有し（図２ｅおよび３ｅ）、したがって本発明において使用するために特に有用である。この所見は、ナイーブＣＤ８^＋細胞では、ＬＦＡ－１メディエーター誘導代謝変化が存在せず（図２ｂ）、およびＬＦＡ－１頭部開放が存在しない（図２ｌ）が、一方ＬＦＡ－１メディエーターの作用時（図２ａおよび２ｍ）に、非ナイーブＣＤ８^＋細胞（例えば、ＥＭＣＤ８^＋細胞、ＰＨＡ芽球およびＲＥＰＴ）では、サイトカイン放出（図２ｄ）、活性化マーカー（図２ｃ）、およびＥＣＡＲが増加することによってさらに裏付けられる。

改変免疫細胞のほかに、モノクローナル抗体および／またはチェックポイント阻害剤はまた、ＬＦＡ－１メディエーターによって増強され得る免疫応答を誘導するためにも有用である（図１ｈ）。チェックポイントタンパク質は、Ｔ細胞活性化または機能を調節する。特に、免疫チェックポイントプロセスの中心は、細胞傷害性Ｔリンパ球関連抗原４（ＣＴＬＡ－４）およびプログラム細胞死（ＰＤ－１）免疫チェックポイント経路である。ＣＴＬＡ－４およびＰＤ－１経路は、免疫応答の異なる段階で作動すると考えられる。ＣＴＬＡ－４は、典型的にリンパ節においてナイーブＴ細胞活性化の初期段階で潜在的に自己反応性のＴ細胞を停止させることから、免疫チェックポイント阻害剤の「リーダー」であると考えられる。ＰＤ－１経路は、主に末梢組織において免疫応答の後期段階で以前に活性化されたＴ細胞を調節する。進行中の患者は、腫瘍細胞または腫瘍浸潤免疫細胞のいずれかによるＰＤ－Ｌ１上方調節を欠如することが示されている（Romano E, Romero P. The therapeutic promise of disrupting the PD-1/PD-L1 immune checkpoint in cancer: unleashing the CD8 T cell-mediated antitumor activity results in significant, unprecedented clinical efficacy in various solid tumors. J Immunother Cancer. 2015;3:15）。このように、ＰＤ－Ｌ１／ＰＤ－１経路を標的とする免疫療法は、この免疫抑制軸が作動性である腫瘍では特に有効であり得、免疫保護環境へのバランスを逆転させることは、既存の抗がん免疫応答を再燃させて強化するであろう。モノクローナル抗体は、Ｔ細胞免疫応答を負に調節する細胞相互作用（例えば、ＣＤ８０／ＣＴＬＡ－４およびＰＤ－１／ＰＤ－１Ｌ）を遮断することができ、既存の免疫を増幅し、それによって抗がん免疫応答を誘発する（Sagiv-Barfi I, Kohrt HE, Czerwinski DK, Ng PP, Chang BY, Levy R. Therapeutic antitumor immunity by checkpoint blockade is enhanced by ibrutinib, an inhibitor of both BTK and ITK. Proc Natl Acad Sci U S A. 2015;112(9): E966-E972）。このように、ＰＤ－１は、感染に対する炎症応答の時点で末梢組織におけるＴ細胞の活性を制限して、自己免疫を制限し、ｉｎｖｉｔｒｏでのＰＤ－１遮断は、特異的抗原標的による、または混合リンパ球反応における同種細胞によるチャレンジに応答して、Ｔ細胞増殖およびサイトカイン産生を増強する。ＰＤ－１遮断は、ＰＤ－１またはそのリガンドであるＰＤ－Ｌ１に結合する抗体を含む多様な機構によって達成され得る。免疫チェックポイント経路の阻害は、いくつかの新規薬物の承認をもたらした：イピリムマブ（抗ＣＴＬＡ－４；Ｙｅｒｖｏｙ（登録商標））、ペンブロリズマブ（抗ＰＤ－１；Ｋｅｙｔｒｕｄａ（登録商標））、セミプリマブ（抗ＰＤ－１；Ｌｉｂｔａｙｏ（登録商標））、スパルタリズマブ（抗ＰＤ－１；Ｎｏｖａｒｔｉｓ（登録商標））、およびニボルマブ（抗ＰＤ－１；Ｏｐｄｉｖｏ（登録商標））。同様にＰＤ－Ｌ１阻害剤、例えばアテゾリズマブ（ＭＰＤＬ３２８０）、アベルマブ（ＭＳＢ００１０７１８Ｃ）、およびデュルバルマブ（ＭＥＤＩ４７３６）、トレメリムマブ（ＰＤ－Ｌ１を標的とするモノクローナル抗体）も利用可能である。これらのアンタゴニスト抗体は、がん患者における客観的臨床応答に関連している。ＣＴＬＡ－４を標的とする抗体は、転移性黒色腫に関して既に販売されている（例えば、イピリムマブ、Ｙｅｒｖｏｙ、Ｂｒｉｓｔｏｌ－ＭｙｅｒｓＳｑｕｉｂｂ、ＢＭＳ）。他の抗体治療は、抗ＰＤ－Ｌ１（例えば、ＭＰＤＬ３２８０Ａ、Ｒｏｃｈｅ）または抗ＰＤ－１（例えば、ニボルマブ、ＢＭＳ）である。

他の免疫チェックポイント阻害剤としては、これらに限定されないが、リンパ球活性化遺伝子３（ＬＡＧ－３）阻害剤、例えばＩＭＰ３２１、可溶性Ｉｇ融合タンパク質が挙げられる。他の免疫チェックポイント阻害剤としては、Ｂ７阻害剤、例えばＢ７－Ｈ３およびＢ７－Ｈ４阻害剤、特に抗Ｂ７－Ｈ３抗体ＭＧＡ２７１が挙げられる。同様に、ＴＩＭ３（Ｔ細胞免疫グロブリンドメインおよびムチンドメイン３）阻害剤も含まれる。ある特定の実施形態では、ＰＤ－１阻害剤は、抗ＰＤ－Ｌ１抗体を含む。ある特定の他の実施形態では、ＰＤ－１阻害剤は、抗ＰＤ－１抗体および類似の結合タンパク質、例えばＰＤ－１に結合して、そのリガンドであるＰＤ－Ｌ１およびＰＤ－Ｌ２によるＰＤ－１の活性化を遮断する全長のヒトＩｇＧ４抗体であるニボルマブ（ＭＤＸ１１０６、ＢＭＳ－９３６５５８、ＯＮＯ－４５３８）；ＰＤ－１に結合するヒト化抗体であるＣＴ－０１１；Ｂ７－ＤＣの融合タンパク質であるＡＭＰ－２２４；抗体Ｆｃ部分；ＰＤ－Ｌ１（Ｂ７－Ｈ１）遮断のためのＢＭＳ－９３６５５９（ＭＤＸ－１１０５－０１）を含む。ある特定の実施形態において使用することができるＰＤ－Ｌ１阻害剤のさらなる例は、アテゾリズマブ（ＭＰＤＬ３２８０）、デュルバルマブ（ＭＥＤＩ４７３６）、およびアベルマブ（ＭＳＢ００１０７１８Ｃ）である。本発明の好ましいチェックポイント阻害剤は、このようにＰＤ－１およびＰＤ－Ｌ１の阻害剤である。本発明のある特定の実施形態では、ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１阻害剤は、ニボルマブ、ペンブロリズマブ、セミプリマブ、スパルタリズマブ、アテゾリズマブ、デュルバルマブ、およびアベルマブからなる群より選択される阻害剤である。ＬＦＡ－１メディエーターは、ＭＣ３８－ＯＶＡに対する抗体の抗がん免疫応答（図１ｂ）および／または抗ＰＤ１抗体の免疫応答（図１ｈおよび１ｉ）を増強することができる。したがって、本発明の組成物は、がんに対する免疫応答を増強するモノクローナル抗体、改変免疫細胞、および／またはチェックポイント阻害剤、ならびにがん免疫療法における使用のために驚くほど選択的かつ有用である抗がん免疫応答を有意に増強する中等度のＬＦＡ－１安定化特性を有するＬＦＡ－１シグナル伝達メディエーターを含む。

本発明のＬＦＡ－１シグナル伝達メディエーター、本発明の組成物、または本発明の組成物の１つもしくは複数の成分が標的部位で高濃度であることは、抗がん免疫応答にとって有益であり得るが、本発明のＬＦＡ－１シグナル伝達メディエーター、本発明の組成物、または本発明の組成物の１つもしくは複数の成分が非標的部位で高濃度であることは、望ましくない効果を誘導し得る。本発明のＬＦＡ－１シグナル伝達メディエーター、本発明の組成物、または本発明の組成物の１つもしくは複数の成分が標的部位で高濃度であることは、投与経路および／または担体の補助によって達成され得る。

本発明のＬＦＡ－１シグナル伝達メディエーター、本発明の組成物、または本発明の組成物の１つもしくは複数の成分（および任意の追加の治療剤）は、非経口、肺内、および鼻腔内、ならびに望ましければ、例えば局所処置の場合では、腫瘍内、病変内、髄腔内、子宮内、または膀胱内投与を含む任意の好適な手段によって投与され得る。非経口注入は、皮下、筋肉内、静脈内、動脈内、腹腔内、または皮下投与を含む。本発明のある特定の実施形態では、本発明のＬＦＡ－１シグナル伝達メディエーター、本発明の組成物、または本発明の組成物の１つもしくは複数の成分は、皮内、膣内、経口、局所、吸入、鼻腔内、経皮、直腸に投与されて（かつ吸収されて）局所および／または全身に作用するために適切な特性を有し得る。本明細書に記載される作用物質および方法と共に使用することができる投与技術は、例えば参照により本明細書に組み込まれる、Goodman and Gilman, The Pharmacological Basis of Therapeutics, current ed.; Pergamon;およびRemington's, Pharmaceutical Sciences (current edition), Mack Publishing Co., Easton, Pa.に見出される。

ある特定の実施形態では、本発明は、固形腫瘍のがん免疫療法における使用のための本発明のＬＦＡ－１シグナル伝達メディエーターまたは本発明の組成物の使用であって、ＬＦＡ－１シグナル伝達メディエーターが腫瘍内注射を介して投与される、使用に関する。

「固形腫瘍」という用語は、本明細書で使用される場合、別個の腫瘍塊を形成する腫瘍を指す。この方法の範囲内の固形腫瘍の例としては、結腸、直腸、腎臓、膀胱、前立腺、脳、乳房、肝臓、肺、皮膚（例えば、黒色腫）、および頭頸部の腫瘍が挙げられる。

「投与する」、「投与すること」、「投与」等の用語は、本明細書で使用される場合、生物学的作用の所望の部位への組成物の送達を可能にするために使用され得る方法を指す。

「腫瘍内注射」という用語は、本明細書で使用される場合、腫瘍への、腫瘍環境への、および／または１つもしくは複数の腫瘍を含有する組織への機械的デバイス媒介投与を指す。

腫瘍内注射によって、全身濃度を劇的に増加させることなく、本発明のＬＦＡ－１シグナル伝達メディエーターまたは本発明の組成物の高い局所濃度を腫瘍環境において達成することができる。ある特定のＬＦＡ－１シグナル伝達メディエーター、例えばＭｇ^２＋は、生物学的作用の所望の部位から急速に除去され得るか、または標的部位での免疫応答を増強するために最も有益である濃度で望ましくない効果（例えば、非標的部位での）を示し得る。ＬＦＡ－１シグナル伝達メディエーターの腫瘍内注射は、標的部位でＬＦＡ－１シグナル伝達メディエーターを治療範囲内に維持するために驚くほど有用であることが証明された（図１ｃ、ｄ、ｈ、およびｉ）。

本発明のある特定の実施形態では、本発明のＬＦＡ－１シグナル伝達メディエーター、本発明の組成物は、ＬＦＡ－１シグナル伝達メディエーターの標的化送達のための担体をさらに含む。

「担体」という用語は、本明細書で使用される場合、標的化送達を可能にする任意の薬学的に許容される溶媒、懸濁化剤、ビヒクル剤、薬物、組成物、デバイス、ツール、またはそれらの組合せを指す。

「標的化送達」という用語は、本明細書で使用される場合、少なくとも１つの非標的部位より少なくとも１つの標的部位においてより高い、活性剤の濃度および／または効果を増加させることを可能にするある特定の送達方法を指す。

担体の使用は、標的部位、例えば腫瘍環境における本発明のＬＦＡ－１シグナル伝達メディエーターまたは本発明の組成物の局所作用を増加させ得る。本発明のある特定の実施形態では、担体は、ＬＦＡ－１シグナル伝達メディエーターまたはその成分が標的部位に達する前に放出するのを遅らせることによって（例えば、リポソームのカプセル化によって）、標的部位での成分の除去および／もしくは代謝を低減することによって、ならびに／または標的部位での干渉剤（例えば、カルシウムキレート剤）の効果を制限することによって、本発明のＬＦＡ－１シグナル伝達メディエーター、または本発明の組成物の少なくとも１つの成分の標的化送達を達成する。

がん免疫療法における使用のための本発明のＬＦＡ－１シグナル伝達メディエーター、または本発明の組成物の成分の標的化送達および／または標的部位に達する前の遅延放出は、当業者に公知の任意の方法によって達成され得る。本発明のある特定の実施形態では、担体は、複数の膜形成分子を介して標的化送達および／または遅延放出を達成する。

「膜形成分子」という用語は、本明細書で使用される場合、生体膜の形成を可能にする、または生体膜に組み込むことができる分子を指す。膜は、単層、二層シート、またはカプセル、例えばリポソームまたはミセルを形成してもよい。ある特定の実施形態では、カプセルは、がんにおける使用のための組成物の少なくとも１つの成分を含有し、薬剤、診断剤、栄養剤、放射線増感剤、造影剤、酵素、核酸、抗体、増殖因子、タンパク質、ペプチド、炭水化物、標的化基、またはそれらの組合せをさらに有し得る。

本発明のある特定の実施形態では、膜形成分子は、カプセル形成脂質である。特に、遅延放出は、ＬＦＡ－１シグナル伝達メディエーター、または本発明の組成物の成分の少なくとも１つに結合するおよび／またはこれらをカプセル化する担体によって達成され得る。本発明のある特定の実施形態では、担体は、重合化可能な両親媒性脂質を含み、より高い安定性を有する架橋されたリポソームを生成する（O'Brien et al., 1998, Acc. Chem. Res. 31:861-868; Moon, J. J., Yuchen, F. A. N., Sahdev, P., & Bazzill, J. (2019)米国特許第１０，３０７，４９１号。Washington, DC: U.S. Patent and Trademark Office）。例としては、これらに限定されないが、ＤＯＴＡＰ、ＤＯＰＥ、ＤＯＢＡＱ、またはＤＯＰＣが挙げられる。本発明の一部の実施形態では、担体は、（例えば、マレイミドまたはジベンゾシクロオクチン（ＤＢＣＯ）で）官能化された脂質を含む。

本発明のある特定の実施形態では、免疫シグナル伝達事象を治療的にモジュレートするために、免疫細胞結合（例えば、Ｔ細胞結合）合成ナノ粒子を、標的部位（例えば、免疫シナプス）への担体として使用する。ある特定の実施形態では、担体は、ＬＦＡ－１シグナル伝達メディエーターまたは本発明の組成物の成分の少なくとも１つをＴ細胞シナプスに送達するために、Ｔ細胞膜タンパク質上の遊離のチオール基とマレイミド官能化ナノ粒子の共有結合カップリングを形成する。担体は、Stephan, Matthias T., et al. （"Synapse-directed delivery of immunomodulators using T-cell-conjugated nanoparticles." Biomaterials 33.23 (2012): 57765787）によって記載されるように、本発明のＬＦＡ－１シグナル伝達メディエーター、または本発明の組成物の成分の少なくとも１つの送達を補助し得る。

本発明の一部の実施形態では、担体は、"Stimuli-responsive liposomes for drug delivery"（Lee, Y., and D. H. Thompson. Wiley Interdisciplinary Reviews: Nanomedicine and Nanobiotechnology 9.5 (2017): e1450）に記載されるように、薬物送達のために刺激応答性リポソームを形成する。

本発明の一部の実施形態では、担体は、本発明のＬＦＡ－１シグナル伝達メディエーター、または本発明の組成物の成分の少なくとも１つに結合体化された担体－抗体である。抗体は、本発明のＬＦＡ－１シグナル伝達メディエーターまたは本発明の組成物の成分の少なくとも１つを標的領域に送達するために、標的部位（例えば、腫瘍環境における）または腫瘍細胞に結合し得る。本発明の一部の実施形態では、担体－抗体は、標的領域に結合すると、本発明のＬＦＡ－１シグナル伝達メディエーターまたは本発明の組成物の成分の少なくとも１つから離れる。本発明の一部の実施形態では、免疫系モジュレーターはまた、ＬＦＡ－１シグナル伝達メディエーターの担体としての機能も果たす。

がん免疫療法における使用のための本発明のＬＦＡ－１シグナル伝達メディエーターまたは組成物の少なくとも１つの成分の除去および／または代謝を低減することは、代謝の薬物誘導性の変更によって達成され得る。一例では、ＬＦＡ１シグナル伝達メディエーター（例えば、マグネシウム）の除去は、副甲状腺抽出物によって低減される（Gill Jr, JOHN R., NORMAN H. Bell, and FREDERIC C. Bartter. "Effect of parathyroid extract on magnesium excretion in man." Journal of applied physiology 22.1 (1967): 136-138）。本発明の一部の実施形態では、担体は、がん免疫療法における使用のための本発明のＬＦＡ－１シグナル伝達メディエーターまたは組成物の成分の少なくとも１つの濃度を増加させるための機械的デバイスである。一例では、担体は、溶血によってＬＦＡ－１シグナル伝達メディエーター（例えば、マグネシウム）の血漿中濃度を増加させるためのデバイスである。

がん免疫療法における使用のための本発明のＬＦＡ－１シグナル伝達メディエーターまたは組成物の少なくとも１つの成分の作用を増強するために標的部位で干渉剤の効果を制限することは、例えばキレートを使用することによって達成され得る。一例では、担体は、ＬＦＡ－１シグナル伝達メディエーターの作用を増強するためにカルシウムキレート剤ＥＧＴＡを含む（Lomakina, Elena B., and Richard E. Waugh. "Micromechanical tests of adhesion dynamics between neutrophils and immobilized ICAM-1." Biophysical journal 86.2 (2004): 12231233）。

したがって、本明細書に提供される本発明は、本発明のＬＦＡ－１シグナル伝達メディエーターまたは本発明の組成物の少なくとも１つの成分の局所的に増加した濃度（例えば、腫瘍内注射または担体による）が、がん治療の間に免疫応答の驚くほどの増強を付与し得るという知見に基づく。

投薬は、投与が短期間であるかまたは長期間であるかに部分的に応じて、任意の好適な経路、例えば注射、例えば静脈内、皮下、または腫瘍内注射による投薬であり得る。これらに限定されないが、単回または様々な時点にわたる複数回投与、ボーラス投与、およびパルス注入を含む様々な投薬スケジュールが、本明細書において企図される。

本発明のＬＦＡ－１シグナル伝達メディエーター、本発明の組成物、または本発明の組成物の成分は、適正な医療行為と一致した様式で製剤化され、投薬され、および投与される。この文脈における検討要因は、処置されるがんの特定のタイプ、処置される特定の対象、対象の臨床状態、がんの進行、作用物質の送達部位、投与方法、投与スケジュール設定、および医療従事者に公知の他の要因を含む。

担体の有効量は、製剤中に存在する本発明のＬＦＡ－１シグナル伝達メディエーターの量、本発明の組成物、または本発明の組成物の少なくとも１つの成分の量、がんのタイプおよび進行、または処置、および他の要因に依存する。

担体が、本発明のＬＦＡ－１シグナル伝達メディエーターまたは本発明の組成物の少なくとも１つの成分に直接結合している本発明の実施形態では、担体は、一般的に本明細書に記載されるものと同じ投薬量範囲および投与経路で、または本明細書に記載される投薬量の約１～９９％で、または経験的／臨床的に適切であると決定された任意の投薬量および任意の経路で使用される。

担体が膜を形成する本発明の実施形態では、担体の量は、本発明のＬＦＡ－１シグナル伝達メディエーターまたは本発明の組成物の少なくとも１つの他の成分の量より高くてもよく、上記の要因に応じて、同時に投与される本発明のＬＦＡ－１シグナル伝達メディエーターまたは本発明の組成物の少なくとも１つの他の成分の量より、例えば２倍、３倍、５倍、１０倍、５０倍、１００倍、または１００倍より高い量であり得る。

本発明のある特定の実施形態では、免疫系モジュレーターは、抗体またはチェックポイント阻害剤であり、用量は、上記の要因に応じて約１μｇ／ｋｇ～１５ｍｇ／ｋｇ（例えば、０．１ｍｇ／ｋｇ～１０ｍｇ／ｋｇ）である。

本発明のある特定の実施形態では、免疫系モジュレーターは改変免疫細胞であり、１つの治療サイクルの免疫系モジュレーターの総用量は、上記の要因に応じて、典型的に約１×１０^４個／ｋｇ～１×１０^１０個／ｋｇの改変免疫細胞またはそれより多い。

本発明のある特定の実施形態では、免疫系モジュレーターは、中等度のＬＦＡ－１安定化特性を有するＬＦＡ－１シグナル伝達メディエーターの担体として作用し、免疫系モジュレーターは、類似の投薬量範囲で、好ましくは中等度のＬＦＡ－１安定化特性を有するＬＦＡ－１シグナル伝達メディエーターのほぼ等モル投薬量範囲で投薬される。

本発明のある特定の実施形態では、中等度のＬＦＡ－１安定化特性を有するＬＦＡ－１シグナル伝達メディエーターは二価カチオンであり、０．５～１５ｍＭ、好ましくは０．９～１０ｍＭ、より好ましくは１．５～５ｍＭの範囲の濃度、特に約３ｍＭの濃度（図１ｂ、ｃ、ｄ、ｈ、およびｉ）の溶液で投与される。

本発明のある特定の実施形態では、中等度のＬＦＡ－１安定化特性を有するＬＦＡ－１シグナル伝達メディエーターは抗体であり、用量は、上記の要因に応じて約１μｇ／ｋｇ～１５ｍｇ／ｋｇ（例えば、０．１ｍｇ／ｋｇ～１０ｍｇ／ｋｇ）である。

本発明のある特定の実施形態では、中等度のＬＦＡ－１安定化特性を有するＬＦＡ－１シグナル伝達メディエーターはペプチドであり、用量は、上記の要因に応じて約１μｇ／ｋｇ～１５ｍｇ／ｋｇ（例えば、０．１ｍｇ／ｋｇ～１０ｍｇ／ｋｇ）である。

本発明のある特定の実施形態では、中等度のＬＦＡ－１安定化特性を有するＬＦＡ－１シグナル伝達メディエーターは低分子であり、用量は、上記の要因に応じて約１μｇ／ｋｇ～１５ｍｇ／ｋｇ（例えば、０．１ｍｇ／ｋｇ～１０ｍｇ／ｋｇ）である。

本発明のＬＦＡ－１シグナル伝達メディエーター、本発明の組成物、または本発明の組成物の少なくとも１つの成分の用量は、例えば１つまたは複数の別個の投与によるか、または連続注入によるかによらず、患者に投与するための初回候補投薬量であり得る。

本発明の一部の実施形態では、免疫系モジュレーターおよびＬＦＡ－１シグナル伝達メディエーターは、同時または逐次的に投与される。

「同時」という用語は、本明細書で使用される場合、１つより多くの薬物の同時の投与を指すが、必ずしも同じ投与経路を介してまたは１つの組み合わせた製剤の形態で投与するわけではない。例えば、本発明の組成物の１つの成分は、経口で提供され得るが、本発明の組成物の別の成分は、病院での患者の診察時に静脈内に提供され得る。

本発明のある特定の実施形態では、本発明の組成物または本発明の組成物の成分は、好適には患者に一度に投与される。

「逐次的に」という用語は、本明細書で使用される場合、本発明の組成物の第１の成分の投与の後に直ちにまたは時間内での、本発明の組成物の第２の成分の投与を指す。

本発明のある特定の実施形態では、免疫系モジュレーターまたはＬＦＡ－１シグナル伝達メディエーターは、免疫系に対して効果を有し得る（例えば、プライミングおよび／または活性化）。投与の関連するスケジュール設定に関する要因、例えば免疫系に及ぼすこの効果の開始および期間に応じて、免疫系モジュレーターおよびＬＦＡ－１シグナル伝達メディエーターを同時または逐次的に投与することは有益である。

免疫系モジュレーターおよびＬＦＡ－１シグナル伝達メディエーターは、薬物動態および薬力学特性などにおける投与のスケジュール設定に関する、ならびに／または互いの薬物動態および薬力学特性に影響を及ぼすより多くの要因が異なり得る。

投与のスケジュール設定に関するさらなる要因は、処置される特定のタイプのがん、処置される特定の対象、対象の臨床状態、がんの進行、作用物質の送達部位、投与方法、および医療従事者に公知の他の要因を含む。

本発明のある特定の実施形態では、免疫系モジュレーター（例えば、改変Ｔ細胞）は、高濃度のＬＦＡ－１シグナル伝達メディエーターの毒性効果を回避するために、対象に同時投与する前に、高濃度のＬＦＡ－１シグナル伝達メディエーター（例えば、Ｍｇ^２＋）を含有する培地中でプレインキュベートされる。

本発明のある特定の実施形態では、免疫系モジュレーターおよび中等度のＬＦＡ－１安定化特性を有するＬＦＡ－１シグナル伝達メディエーターは、免疫系モジュレーターが中等度のＬＦＡ－１安定化特性を有するＬＦＡ－１シグナル伝達メディエーターの担体として作用することを可能にするために同時投与される。

本発明のある特定の実施形態では、免疫系モジュレーターおよび中等度のＬＦＡ－１安定化特性を有するＬＦＡ－１シグナル伝達メディエーターは、担体が本発明の組成物のいくつかの成分の標的化送達を補助することを可能にするために同時投与される。

本発明の一部の実施形態では、免疫系モジュレーターおよびＬＦＡ－１シグナル伝達メディエーターは、逐次的に投与される。

本発明のある特定の実施形態では、免疫系モジュレーターおよびＬＦＡ－１シグナル伝達メディエーターは、上記の投与のスケジュール設定に関する要因に部分的に応じて、１分、５分、１０分、１５分、２０分、３０分、４５分、１時間、２時間、３時間、４時間、６時間、８時間、１２時間、１６時間、１日、１．５日、２日、２．５日、３日、４日、５日、７日、１０日、１２日、１４日、１６日、２４日の時間差で逐次的に投与される（例えば、図１ｂ、ｃ、ｄ、ｅ、ｈ、およびｉ）。

本発明の一部の実施形態では、免疫系モジュレーターは、最初に投与され、その後にＬＦＡ－１シグナル伝達メディエーターが５年未満の期間にわたり反復投与される。

本発明のある特定の実施形態では、本発明のＬＦＡ－１シグナル伝達メディエーター、本発明の組成物、および／または本発明の組成物の少なくとも１つの成分は、好適には一連の処置および／または処置サイクルにわたって患者に投与される。典型的に、ＬＦＡ－１シグナル伝達メディエーターは、数週間から数ヶ月間にわたって投与される。場合によっては、ＬＦＡ－１シグナル伝達メディエーターが、１つまたは複数の所望の効果を示し、許容可能に耐容性を示す場合、ＬＦＡ－１シグナル伝達メディエーターもまた、数年間にわたって投与することができる。

本発明のある特定の実施形態では、ＬＦＡ－１シグナル伝達メディエーター（例えば、Ｍｇ^２＋）は、対象におけるＬＦＡ－１シグナル伝達メディエーター濃度を維持するために反復投与される（図１ａおよび１ｈ）。この反復投与は、ＬＦＡ－１シグナル伝達メディエーターの半減期が免疫系モジュレーターの半減期より短い本発明の実施形態では特に有益であり得る。本発明のそのような実施形態では、ＬＦＡ－１シグナル伝達メディエーターは、上記の投与のスケジュール設定に関する要因に部分的に応じて、例えば１週間、２週間、３週間、または４週間の期間にわたって反復（例えば、０．５日毎、１日毎、１．５日毎、２日毎、２．５日毎、または３日毎に）投与され得る。

他の実施形態では、免疫系モジュレーターの効果（例えば、改変免疫細胞の適用）は、半減期に主に依存せず、本発明のＬＦＡ－１シグナル伝達メディエーターによって増強され得る長期間の効果を示し得る。これらの実施形態では、ＬＦＡ－１シグナル伝達メディエーターの反復投与の期間もまた長くなり、上記の投与のスケジュール設定に関する要因に部分的に応じて、例えば５週間、６週間、２ヶ月、またはそれより長くなり得る。

本発明の一部の実施形態では、第１の投与の後に、２～７日毎に反復投与を行う。

標的部位で本発明の組成物の高濃度を維持するために、本発明の組成物は、少なくとも７日毎、好ましくは６日毎、好ましくは５日毎、好ましくは４日毎、好ましくは３日毎、好ましくは２．５日毎、好ましくは２日毎に反復投与される（図１ａおよび１ｇ）。

数日間またはそれより長い期間にわたる反復投与の場合、がんのタイプおよび標的部位に応じて、処置は一般的に、疾患の症状の所望の抑制が起こるまで持続される。本発明の組成物または本発明の組成物の成分の１つの例示的な投薬量は、約０．０５ｍｇ／ｋｇ～約１０ｍｇ／ｋｇの範囲であろう。このように、約０．５ｍｇ／ｋｇ、２．０ｍｇ／ｋｇ、４．０ｍｇ／ｋｇ、または１０ｍｇ／ｋｇ（またはそのいずれかの組合せ）の１つまたは複数の用量が患者に投与され得る。そのような用量は、間欠的に、例えば毎週または３週間毎（例えば、患者が、抗体の約２～約２０、または例えば、約６用量を投与されるように）に投与され得る。初回のより高い負荷用量の後に１つまたは複数のより低い用量を投与してもよい。しかし、他の投薬レジメンも有用であり得る。この治療の進捗は、従来の技術およびアッセイによって容易にモニターされる。

本発明のある特定の実施形態では、免疫系モジュレーターは改変免疫細胞であり、患者の耐容性を、いくつかの経過、例えば初日に１０％のパターン、２日目に３０％、および３日目に６０％のパターンに従う３つの経過にわたって総細胞数を注射することによって調べる。

したがって、本明細書に提供される本発明は、本発明の組成物の好ましい投与パターンが、がん治療の間に免疫系モジュレーターの免疫応答を驚くほど増強することができるという知見に基づく。

本発明の一部の実施形態では、がんは、乳房、脳、血液形成臓器（例えば、急性骨髄性白血病）、免疫系（例えば、ホジキンリンパ腫）、前立腺、肺、結腸、頭頸部、皮膚、卵巣、子宮内膜、子宮頸部、腎臓、肺、胃、小腸、肝臓、膵臓、精巣、下垂体、血液、脾臓、胆嚢、胆管、食道、唾液腺、および甲状腺のがんからなる群より選択される。

本発明のＬＦＡ－１シグナル伝達メディエーターおよび本発明の組成物は、免疫細胞が近づくことができる臓器または組織のがんにとって特に有用である。

したがって、本明細書に提供される本発明は、本発明の組成物が、乳がん、脳がん、血液形成臓器のがん（例えば、急性骨髄性白血病）、免疫系のがん（例えば、ホジキンリンパ腫）、前立腺がん、肺がん、結腸がん、頭頸部がん、皮膚がん、卵巣がん、子宮内膜がん、子宮頸がん、腎臓がん、肺がん、胃がん、小腸がん、肝臓がん、膵臓がん、精巣がん、下垂体がん、血液のがん、脾臓がん、胆嚢がん、胆管がん、食道がん、唾液腺がん、および／または甲状腺がんからなる群より選択されるがんの免疫療法に使用するために驚くほど有用であるという知見に基づいている。

本発明の一部の実施形態では、がんは、免疫系、胸腺、脾臓、骨髄のがんからなる群より選択される。

本発明のＬＦＡ－１シグナル伝達メディエーターおよび本発明の組成物は、Ｔ細胞が近づくことができるがんの処置に使用するために特に有用である。

したがって、本明細書に提供される本発明は、本発明のＬＦＡ－１シグナル伝達メディエーターおよび本発明の組成物が、がん、黒色腫、肺がん、腎臓がん、膀胱がん、頭頸部がん、ホジキンリンパ腫、膀胱がん、メルケル細胞癌、および／または尿路上皮癌からなる群より選択されるがんの免疫療法に使用するために驚くほど有用であるという知見に基づいている。

特に定義していない限り、本明細書で使用される全ての科学技術用語は、本発明が属する当業者によって一般的に理解される意味と同じ意味を有する。本明細書に記載される方法および材料と類似または同等の方法および材料を、本発明の実践または試験において使用することができるが、好適な方法および材料を以下に記載する。矛盾する場合は、定義を含めた本明細書が優先する。加えて、材料、方法、および例は、単なる例証であり、限定すると意図されない。

本明細書に記載される全般的方法および技術は、当技術分野で周知の従来の方法に従って、ならびに特に示していない限り、本明細書を通して引用および考察されている様々な全般的およびより詳しい参考文献に記載されるように実施され得る。

本発明の態様は、図面および前述の説明において詳細に例証および記載されているが、そのような例証および説明は、例証または例示的であると考えられ、限定的であると考えてはならない。当業者は、以下の特許請求の範囲および精神の範囲内で変化および修正を行うことができると理解される。特に、本発明は、上記および以下に記載される異なる実施形態からの特色の任意の組合せを有するさらなる実施形態を範囲に含む。

さらに、特許請求の範囲において、「含む」という用語は、他の要素またはステップを除外せず、不定冠詞「１つの（ａ）」または「１つの（ａｎ）」は、複数形を除外しない。単一の単位は、特許請求の範囲に引用されるいくつかの特色の機能を満たし得る。属性または特に値に関連する「本質的に」、「約」、「およそ」等の用語はそれぞれ、正確にその属性または正確にその値も規定する。特許請求の範囲におけるいかなる参照符号も、その範囲を限定すると解釈してはならない。

図１：腫瘍内マグネシウム投与は、適応抗腫瘍免疫を改善する。（ａ）実験設計の概略図。ＯＶＡによって免疫化したまたは無処置のままのＢｌ／６マウスに、ＭＣ３８－ＯＶＡ腫瘍細胞を両側の脇腹に皮下接種した。７日目から、３ｍＭＮａＣｌ溶液の注射を左脇腹の腫瘍に適用し、３ｍＭＭｇＣｌ_２溶液を、反対側の腫瘍に注射した。このレジメンを３日毎に全体で８サイクル反復した。（ｂ）免疫化していないマウス（ｎ＝２０）（左のパネル）および免疫化したマウス（ｎ＝１９）（右のパネル）における腫瘍の成長曲線。（ｃ）±ＣＤ８枯渇マウス（ｎ＝６～１７）における腫瘍の成長曲線。結果を、各ｎ＝６～１２匹のマウスの２つの独立した実験からプールした。（ｄ）腫瘍浸潤性ＣＤ８^＋Ｔ細胞の絶対数。（ｅ）Ｋｉ６７（左のパネル）、グランザイムＢ（中央のパネル）、およびＣＤ２５（右のパネル）に関して陽性の腫瘍浸潤性ＣＤ８^＋Ｔ細胞の数。（ｆ）ＰＤ－１およびＴｉｍ３を発現する腫瘍浸潤性ＣＤ８^＋Ｔ細胞の細胞数。（ｇ）実験設計の概略図。ＯＶＡによって免疫化したＢｌ／６マウスに、ＭＣ３８－ＯＶＡ腫瘍細胞を片側の脇腹に皮下接種した。５日目から、３ｍＭＮａＣｌまたは３ｍＭＭｇＣｌ_２のいずれかの腫瘍内注射を開始し、３日毎に８サイクル反復した。マウスに、２００μｇのアイソタイプ対照（ＩｇＧ２ａ）または抗ＰＤ－１Ａｂを、９日目、１２日目、および１５日目にさらに腹腔内注射した。（ｈ）腫瘍の成長曲線（ｎ＝１３～１４）および（ｉ）宿主生存（ｎ＝１３～１４）。結果を２つの独立した実験からプールした（ｂ、ｈ、ｉ）。データを、平均値±ＳＥＭ（Ｂ、Ｃ、Ｈ）、中央値±ＩＱＲとして表記し、各記号は、１匹のマウスを表し（Ｄ、Ｅ、Ｆ）、統計学的有意性を、二元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）と共にボンフェローニ補正（Ｂ、Ｃ、およびＨ）、対応のない両側のスチューデントｔ検定（Ｄ、Ｅ）、二元配置ＡＮＯＶＡと共にシダック補正多重比較検定（Ｆ）およびログランクマンテルコックス検定（Ｉ）によって評価した。^＊ｐ＜０．０５、^＊＊ｐ＜０．０１、^＊＊＊ｐ＜０．００１、^＊＊＊＊ｐ＜０．０００１。ｉ．ｐ．腹腔内；Ａｂ抗体。図１：腫瘍内マグネシウム投与は、適応抗腫瘍免疫を改善する。（ａ）実験設計の概略図。ＯＶＡによって免疫化したまたは無処置のままのＢｌ／６マウスに、ＭＣ３８－ＯＶＡ腫瘍細胞を両側の脇腹に皮下接種した。７日目から、３ｍＭＮａＣｌ溶液の注射を左脇腹の腫瘍に適用し、３ｍＭＭｇＣｌ_２溶液を、反対側の腫瘍に注射した。このレジメンを３日毎に全体で８サイクル反復した。（ｂ）免疫化していないマウス（ｎ＝２０）（左のパネル）および免疫化したマウス（ｎ＝１９）（右のパネル）における腫瘍の成長曲線。（ｃ）±ＣＤ８枯渇マウス（ｎ＝６～１７）における腫瘍の成長曲線。結果を、各ｎ＝６～１２匹のマウスの２つの独立した実験からプールした。（ｄ）腫瘍浸潤性ＣＤ８^＋Ｔ細胞の絶対数。（ｅ）Ｋｉ６７（左のパネル）、グランザイムＢ（中央のパネル）、およびＣＤ２５（右のパネル）に関して陽性の腫瘍浸潤性ＣＤ８^＋Ｔ細胞の数。（ｆ）ＰＤ－１およびＴｉｍ３を発現する腫瘍浸潤性ＣＤ８^＋Ｔ細胞の細胞数。（ｇ）実験設計の概略図。ＯＶＡによって免疫化したＢｌ／６マウスに、ＭＣ３８－ＯＶＡ腫瘍細胞を片側の脇腹に皮下接種した。５日目から、３ｍＭＮａＣｌまたは３ｍＭＭｇＣｌ_２のいずれかの腫瘍内注射を開始し、３日毎に８サイクル反復した。マウスに、２００μｇのアイソタイプ対照（ＩｇＧ２ａ）または抗ＰＤ－１Ａｂを、９日目、１２日目、および１５日目にさらに腹腔内注射した。（ｈ）腫瘍の成長曲線（ｎ＝１３～１４）および（ｉ）宿主生存（ｎ＝１３～１４）。結果を２つの独立した実験からプールした（ｂ、ｈ、ｉ）。データを、平均値±ＳＥＭ（Ｂ、Ｃ、Ｈ）、中央値±ＩＱＲとして表記し、各記号は、１匹のマウスを表し（Ｄ、Ｅ、Ｆ）、統計学的有意性を、二元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）と共にボンフェローニ補正（Ｂ、Ｃ、およびＨ）、対応のない両側のスチューデントｔ検定（Ｄ、Ｅ）、二元配置ＡＮＯＶＡと共にシダック補正多重比較検定（Ｆ）およびログランクマンテルコックス検定（Ｉ）によって評価した。^＊ｐ＜０．０５、^＊＊ｐ＜０．０１、^＊＊＊ｐ＜０．００１、^＊＊＊＊ｐ＜０．０００１。ｉ．ｐ．腹腔内；Ａｂ抗体。

図２：細胞外マグネシウムは、ＬＦＡ－１を介してメモリー特異的活性化を促進する。抗ＣＤ３Ａｂのみ、または抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８Ａｂを注射した場合の、ヒトＥＭＣＤ８Ｔ細胞（ａ）およびナイーブＣＤ８Ｔ細胞（ｂ）サブセットの解糖スイッチを、１．２ｍＭＭｇ^２＋、０ｍＭＭｇ^２＋のいずれかを含有する培地、または活性化の直前に０ｍＭ～１．２ｍＭＭｇ^２＋によって再構成した（０→１．２ｍＭＭｇ^２＋）培地中の代謝フラックス分析によって評価した。（ａ）ヒトエフェクターメモリー（ＥＭ）および（ｂ）ヒトナイーブＣＤ８Ｔ細胞の結果。解糖スイッチを、最大のＥＣＡＲをベースラインＥＣＡＲ測定値から減算することによって定量した。（ｃ）１．２ｍＭおよび０ｍＭＭｇ^２＋培地中でそれぞれ、プレート結合抗ＣＤ３Ａｂおよび可溶性抗ＣＤ２８Ａｂによる活性化の２４時間後でのヒトＥＭＣＤ８Ｔ細胞上の表面活性化マーカーのフローサイトメトリー解析。（ｄ）ＣＢＡによって決定した場合の、対応するＥＭＣＤ８Ｔ細胞培養上清中の炎症性サイトカインの存在量。（ｅ）ヒトナイーブおよびＥＭＣＤ８Ｔ細胞ならびにＰＨＡＴ細胞芽球におけるＣＤ１１ａ（ＬＦＡ－１）表面発現。異なる細胞外Ｍｇ^２＋濃度でのＴＣＲ誘導活性化の存在下または非存在下での、ｍＡｂＴＳ２／４によって評価した総ＬＦＡ－１発現（ｆ）、ｍＡｂＨＩ１１１によるαＬの閉鎖型コンフォメーション（ｇ）、ｍＡｂＫｉｍ１２７によるＬＦＡ－１の伸長したコンフォメーション（ｈ）、ｍＡｂｍ２４によるＬＦＡ－１の開放型頭部コンフォメーション（ｉ）、フォーカルアドヒージョンキナーゼ（ＦＡＫ）のリン酸化（ｈ）、ならびにＴＮＦ発現（ｋ）のフローサイトメトリーに基づく評価。（ｌ）開放型頭部レポーターｍＡｂｍ２４を使用するヒトＥＭおよびナイーブＣＤ８Ｔ細胞における開放型頭部コンフォメーションを有するＬＦＡ－１のフローサイトメトリーに基づく評価。（ｍ）ＥＭＣＤ８Ｔ細胞の解糖スイッチの評価。（ｎ）ナイーブＣＤ８Ｔ細胞の解糖スイッチの評価。ＢＩＲＴ３７７（５０μＭ）による処置の存在下または非存在下でのヒトＰＨＡＴ細胞芽球における、開放型頭部コンフォメーションを有するＬＦＡ－１のＴＣＲ刺激誘導活性化（ｏ）、ならびに解糖スイッチ（ｐ）、および脱顆粒（ｑ）の評価。各記号は、個々の健康なヒトドナーを表し、グラフは、２～４個の独立した実験からのプールした結果を示し、バーは平均値±ＳＤ（ａ～ｃ、ｅ～ｑ）を示し、バーは中央値±四分位範囲（ｄ）を示す。統計学的有意性は、繰り返し測定の一元配置ＡＮＯＶＡと共にシダック多重比較検定（ａ、ｂ、ｅ、ｌ～ｑ）、対応のない両側のスチューデント検定と共にホルム－シダック補正多重比較（ｃ）、マンホイトニー検定（ｄ）によって評価した。^＊ｐ＜０．０５、^＊＊ｐ＜０．０１、^＊＊＊ｐ＜０．００１、^＊＊＊＊ｐ＜０．０００１。ｍＡｂモノクローナル抗体；Ｍｇ^２＋マグネシウム；ＴＮＦ腫瘍壊死因子；ｇＭＦＩ幾何平均蛍光強度。図２：細胞外マグネシウムは、ＬＦＡ－１を介してメモリー特異的活性化を促進する。抗ＣＤ３Ａｂのみ、または抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８Ａｂを注射した場合の、ヒトＥＭＣＤ８Ｔ細胞（ａ）およびナイーブＣＤ８Ｔ細胞（ｂ）サブセットの解糖スイッチを、１．２ｍＭＭｇ^２＋、０ｍＭＭｇ^２＋のいずれかを含有する培地、または活性化の直前に０ｍＭ～１．２ｍＭＭｇ^２＋によって再構成した（０→１．２ｍＭＭｇ^２＋）培地中の代謝フラックス分析によって評価した。（ａ）ヒトエフェクターメモリー（ＥＭ）および（ｂ）ヒトナイーブＣＤ８Ｔ細胞の結果。解糖スイッチを、最大のＥＣＡＲをベースラインＥＣＡＲ測定値から減算することによって定量した。（ｃ）１．２ｍＭおよび０ｍＭＭｇ^２＋培地中でそれぞれ、プレート結合抗ＣＤ３Ａｂおよび可溶性抗ＣＤ２８Ａｂによる活性化の２４時間後でのヒトＥＭＣＤ８Ｔ細胞上の表面活性化マーカーのフローサイトメトリー解析。（ｄ）ＣＢＡによって決定した場合の、対応するＥＭＣＤ８Ｔ細胞培養上清中の炎症性サイトカインの存在量。（ｅ）ヒトナイーブおよびＥＭＣＤ８Ｔ細胞ならびにＰＨＡＴ細胞芽球におけるＣＤ１１ａ（ＬＦＡ－１）表面発現。異なる細胞外Ｍｇ^２＋濃度でのＴＣＲ誘導活性化の存在下または非存在下での、ｍＡｂＴＳ２／４によって評価した総ＬＦＡ－１発現（ｆ）、ｍＡｂＨＩ１１１によるαＬの閉鎖型コンフォメーション（ｇ）、ｍＡｂＫｉｍ１２７によるＬＦＡ－１の伸長したコンフォメーション（ｈ）、ｍＡｂｍ２４によるＬＦＡ－１の開放型頭部コンフォメーション（ｉ）、フォーカルアドヒージョンキナーゼ（ＦＡＫ）のリン酸化（ｈ）、ならびにＴＮＦ発現（ｋ）のフローサイトメトリーに基づく評価。（ｌ）開放型頭部レポーターｍＡｂｍ２４を使用するヒトＥＭおよびナイーブＣＤ８Ｔ細胞における開放型頭部コンフォメーションを有するＬＦＡ－１のフローサイトメトリーに基づく評価。（ｍ）ＥＭＣＤ８Ｔ細胞の解糖スイッチの評価。（ｎ）ナイーブＣＤ８Ｔ細胞の解糖スイッチの評価。ＢＩＲＴ３７７（５０μＭ）による処置の存在下または非存在下でのヒトＰＨＡＴ細胞芽球における、開放型頭部コンフォメーションを有するＬＦＡ－１のＴＣＲ刺激誘導活性化（ｏ）、ならびに解糖スイッチ（ｐ）、および脱顆粒（ｑ）の評価。各記号は、個々の健康なヒトドナーを表し、グラフは、２～４個の独立した実験からのプールした結果を示し、バーは平均値±ＳＤ（ａ～ｃ、ｅ～ｑ）を示し、バーは中央値±四分位範囲（ｄ）を示す。統計学的有意性は、繰り返し測定の一元配置ＡＮＯＶＡと共にシダック多重比較検定（ａ、ｂ、ｅ、ｌ～ｑ）、対応のない両側のスチューデント検定と共にホルム－シダック補正多重比較（ｃ）、マンホイトニー検定（ｄ）によって評価した。^＊ｐ＜０．０５、^＊＊ｐ＜０．０１、^＊＊＊ｐ＜０．００１、^＊＊＊＊ｐ＜０．０００１。ｍＡｂモノクローナル抗体；Ｍｇ^２＋マグネシウム；ＴＮＦ腫瘍壊死因子；ｇＭＦＩ幾何平均蛍光強度。

図３：マグネシウムは、ＬＦＡ－１媒介Ｔ細胞活性化および細胞傷害ならびにＢｉＴＥおよびＣＡＲＴ細胞の機能性を調節する。（ａ）１．２ｍＭＭｇ^２＋および０ｍＭＭｇ^２＋を含有する培地中で抗ＣＤ３／２８Ａｂを注射した場合のマウスＷＴおよびＬＦＡ－１^－／－ＣＴＬの解糖スイッチ、ｎ＝４のマウスの要約したデータの定量として表す。（ｂ）１．２ｍＭおよび０ｍＭＭｇ^２＋培地中でそれぞれ、抗ＣＤ３Ａｂによって刺激したＷＴおよびＬＦＡ－１^－／－ＪｕｒｋａｔＴ細胞におけるカルシウムフラックス。細胞にＦｌｕｏ４を負荷し、プレートリーダーによって記録したシグナル強度を、非刺激ベースライン値に対して正規化した。データを、２連での３回の独立した実験の曲線下面積の定量として表す。（ｃ）ＢＩＲＴ３７７（５０μＭ）の存在下または非存在下で１．２ｍＭＭｇ^２＋、０ｍＭＭｇ^２＋、または１．２ｍＭＭｇ^２＋を含有する培地中、プレート結合抗ＣＤ３Ａｂおよび可溶性抗ＣＤ２８Ａｂと共に８時間インキュベーション後のマウスＷＴおよびＬＦＡ－１^－／－ＣＴＬにおける脱顆粒マーカーＣＤ１０７ａの発現。各３回の技術的反復のｎ＝３のマウスの定量結果。（ｄ）１０μｇ／ｍｌＰＨＡの存在下で（ｃ）と同様の条件下でマウスＷＴおよびＬＦＡ－１^－／－ＣＴＬと共に４時間同時培養後のＥＬ４標的細胞におけるカスパーゼ－３活性。エフェクター対標的細胞比は、３：１であった。結果を、各３回の技術的反復のｎ＝３のマウスについて定量した。（ｅ）フローサイトメトリーによって評価したヒトナイーブおよびＥＭＣＤ８Ｔ細胞、ＰＨＡＴ細胞芽球、およびＲＥＰＴ細胞における代表的なＣＤ１１ａ（ＬＦＡ－１）表面発現。（ｃ）と同じ条件下でＴ２標的細胞（１０^－８Ｍ９ｃペプチドをパルスした）と同時インキュベーション後のＲＥＰＴ細胞における、折れ曲がりコンフォメーションを有する不活性なＬＦＡ－１（ｆ）、β２レグの伸長を伴う伸長したコンフォメーション（ｇ）、開放頭部を有するＬＦＡ－１（ｈ）、ＦＡＫのリン酸化、脱顆粒マーカーＣＤ１０７ａの発現（ｊ）のフローサイトメトリーに基づく評価。エフェクター対標的細胞比は１：１であった。データは、ｎ＝５の健康なドナー（ｆ、ｇ、ｈ）、各２回の技術的反復を行うｎ＝３の健康なドナー、または４回の技術的反復を行うｎ＝１の健康なドナーの定量した結果として表す（ｊ）。（ｋ）（ｃ）と同じ条件を使用してＲＥＰＴ細胞と同時培養した４５分後の、９ｃペプチド（１０^－８Ｍ）をパルスしたＴ２標的細胞におけるカスパーゼ－３活性。エフェクター対標的細胞比は、１：１であった。データは、４回の技術的反復によるｎ＝１の健康なドナーの定量した結果を表す。（ｌ）表記のＭｇ^２＋およびブリナツモマブ濃度でのｎ＝５の健康なドナーのＰＨＡ芽球との３．５時間の同時培養後のＲａｍｏｓ標的細胞におけるカスパーゼ－３活性のフローサイトメトリー評価を表す箱ひげ図。（ｍ）ｎ＝５の健康なドナー、３００ｐｇｍｌ^－１のブリナツモマブ濃度でのＲａｍｏｓ細胞との３０分の同時培養後の、ＰＨＡ芽球における活性化誘導ＬＦＡ－１頭部開放のフローサイトメトリーに基づく評価。（ｎ）ＰＨＡ芽球、非形質導入Ｔ細胞、ならびに抗ＣＤ１９発現ＣＡＲＴ細胞におけるＣＤ１１ａ発現の代表的なヒストグラム。（ｏ）０．６ｍＭまたは０ｍＭＭｇ^２＋を含有する培地中でＰＳＭＡ＋ＰＣ３－ＰＩＰ細胞系と同時培養した抗ＰＳＭＡＣＡＲＴ細胞およびＵＴＤＴ細胞による細胞傷害アッセイ。細胞傷害は、死滅した標的細胞における細胞傷害の緑色試薬の取り込み（緑色の面積／μｍ^２）によって駆動される蛍光の曲線下総面積として報告される。エフェクター対標的細胞比は、２：１であった。２回の独立した実験からのｎ＝６のプールした結果を示す。（ｐ）（ｏ）で表した条件に対応する細胞培養上清中の２４時間でのＩＦＮγの存在量を、ＥＬＩＳＡによって決定した（ｎ＝８、３回の独立した実験）。（ｑ）Ｍｇ^２＋枯渇食餌またはそれぞれの対照食餌のいずれかを与え、抗ＰＳＭＡＣＡＲＴ細胞、非形質導入Ｔ細胞、または食塩溶液によって処置したマウスの腫瘍成長曲線。各群当たりｎ＝６のマウスによるｎ＝２の独立した実験を表す。データを、平均値±ＳＤ（ａ～ｄ、ｆ～ｋ、ｍ、ｐ）、±ＩＱＲ（ｌ）、±ＳＥＭ（ｏ、ｑ）として表す。統計学的有意性を、通常の一元配置ＡＮＯＶＡと共にシダック多重比較検定（ａ～ｄ、ｉ～ｋ、ｌ）、ＲＭ一元配置ＡＮＯＶＡと共にシダック多重比較（ｆ、ｇ、ｈ）、二元配置ＡＮＯＶＡと共にチューキーの事後検定（ｏ、ｑ）、および対応のない両側のスチューデントｔ検定（ｍ、ｐ）によって評価した。Ａｂ抗体；ＥＭエフェクターメモリー；Ｍｇ^２＋マグネシウム；ＣＴＬ細胞傷害性Ｔリンパ球；ＰＳＭＡ前立腺特異的膜抗原；ＣＡＲキメラ抗原受容体；ＵＴＤ非形質導入；ＰＨＡフィトヘマグルチニン、ＲＥＰＴ細胞急速増大プロトコールＴ細胞。図３：マグネシウムは、ＬＦＡ－１媒介Ｔ細胞活性化および細胞傷害ならびにＢｉＴＥおよびＣＡＲＴ細胞の機能性を調節する。（ａ）１．２ｍＭＭｇ^２＋および０ｍＭＭｇ^２＋を含有する培地中で抗ＣＤ３／２８Ａｂを注射した場合のマウスＷＴおよびＬＦＡ－１^－／－ＣＴＬの解糖スイッチ、ｎ＝４のマウスの要約したデータの定量として表す。（ｂ）１．２ｍＭおよび０ｍＭＭｇ^２＋培地中でそれぞれ、抗ＣＤ３Ａｂによって刺激したＷＴおよびＬＦＡ－１^－／－ＪｕｒｋａｔＴ細胞におけるカルシウムフラックス。細胞にＦｌｕｏ４を負荷し、プレートリーダーによって記録したシグナル強度を、非刺激ベースライン値に対して正規化した。データを、２連での３回の独立した実験の曲線下面積の定量として表す。（ｃ）ＢＩＲＴ３７７（５０μＭ）の存在下または非存在下で１．２ｍＭＭｇ^２＋、０ｍＭＭｇ^２＋、または１．２ｍＭＭｇ^２＋を含有する培地中、プレート結合抗ＣＤ３Ａｂおよび可溶性抗ＣＤ２８Ａｂと共に８時間インキュベーション後のマウスＷＴおよびＬＦＡ－１^－／－ＣＴＬにおける脱顆粒マーカーＣＤ１０７ａの発現。各３回の技術的反復のｎ＝３のマウスの定量結果。（ｄ）１０μｇ／ｍｌＰＨＡの存在下で（ｃ）と同様の条件下でマウスＷＴおよびＬＦＡ－１^－／－ＣＴＬと共に４時間同時培養後のＥＬ４標的細胞におけるカスパーゼ－３活性。エフェクター対標的細胞比は、３：１であった。結果を、各３回の技術的反復のｎ＝３のマウスについて定量した。（ｅ）フローサイトメトリーによって評価したヒトナイーブおよびＥＭＣＤ８Ｔ細胞、ＰＨＡＴ細胞芽球、およびＲＥＰＴ細胞における代表的なＣＤ１１ａ（ＬＦＡ－１）表面発現。（ｃ）と同じ条件下でＴ２標的細胞（１０^－８Ｍ９ｃペプチドをパルスした）と同時インキュベーション後のＲＥＰＴ細胞における、折れ曲がりコンフォメーションを有する不活性なＬＦＡ－１（ｆ）、β２レグの伸長を伴う伸長したコンフォメーション（ｇ）、開放頭部を有するＬＦＡ－１（ｈ）、ＦＡＫのリン酸化、脱顆粒マーカーＣＤ１０７ａの発現（ｊ）のフローサイトメトリーに基づく評価。エフェクター対標的細胞比は１：１であった。データは、ｎ＝５の健康なドナー（ｆ、ｇ、ｈ）、各２回の技術的反復を行うｎ＝３の健康なドナー、または４回の技術的反復を行うｎ＝１の健康なドナーの定量した結果として表す（ｊ）。（ｋ）（ｃ）と同じ条件を使用してＲＥＰＴ細胞と同時培養した４５分後の、９ｃペプチド（１０^－８Ｍ）をパルスしたＴ２標的細胞におけるカスパーゼ－３活性。エフェクター対標的細胞比は、１：１であった。データは、４回の技術的反復によるｎ＝１の健康なドナーの定量した結果を表す。（ｌ）表記のＭｇ^２＋およびブリナツモマブ濃度でのｎ＝５の健康なドナーのＰＨＡ芽球との３．５時間の同時培養後のＲａｍｏｓ標的細胞におけるカスパーゼ－３活性のフローサイトメトリー評価を表す箱ひげ図。（ｍ）ｎ＝５の健康なドナー、３００ｐｇｍｌ^－１のブリナツモマブ濃度でのＲａｍｏｓ細胞との３０分の同時培養後の、ＰＨＡ芽球における活性化誘導ＬＦＡ－１頭部開放のフローサイトメトリーに基づく評価。（ｎ）ＰＨＡ芽球、非形質導入Ｔ細胞、ならびに抗ＣＤ１９発現ＣＡＲＴ細胞におけるＣＤ１１ａ発現の代表的なヒストグラム。（ｏ）０．６ｍＭまたは０ｍＭＭｇ^２＋を含有する培地中でＰＳＭＡ＋ＰＣ３－ＰＩＰ細胞系と同時培養した抗ＰＳＭＡＣＡＲＴ細胞およびＵＴＤＴ細胞による細胞傷害アッセイ。細胞傷害は、死滅した標的細胞における細胞傷害の緑色試薬の取り込み（緑色の面積／μｍ^２）によって駆動される蛍光の曲線下総面積として報告される。エフェクター対標的細胞比は、２：１であった。２回の独立した実験からのｎ＝６のプールした結果を示す。（ｐ）（ｏ）で表した条件に対応する細胞培養上清中の２４時間でのＩＦＮγの存在量を、ＥＬＩＳＡによって決定した（ｎ＝８、３回の独立した実験）。（ｑ）Ｍｇ^２＋枯渇食餌またはそれぞれの対照食餌のいずれかを与え、抗ＰＳＭＡＣＡＲＴ細胞、非形質導入Ｔ細胞、または食塩溶液によって処置したマウスの腫瘍成長曲線。各群当たりｎ＝６のマウスによるｎ＝２の独立した実験を表す。データを、平均値±ＳＤ（ａ～ｄ、ｆ～ｋ、ｍ、ｐ）、±ＩＱＲ（ｌ）、±ＳＥＭ（ｏ、ｑ）として表す。統計学的有意性を、通常の一元配置ＡＮＯＶＡと共にシダック多重比較検定（ａ～ｄ、ｉ～ｋ、ｌ）、ＲＭ一元配置ＡＮＯＶＡと共にシダック多重比較（ｆ、ｇ、ｈ）、二元配置ＡＮＯＶＡと共にチューキーの事後検定（ｏ、ｑ）、および対応のない両側のスチューデントｔ検定（ｍ、ｐ）によって評価した。Ａｂ抗体；ＥＭエフェクターメモリー；Ｍｇ^２＋マグネシウム；ＣＴＬ細胞傷害性Ｔリンパ球；ＰＳＭＡ前立腺特異的膜抗原；ＣＡＲキメラ抗原受容体；ＵＴＤ非形質導入；ＰＨＡフィトヘマグルチニン、ＲＥＰＴ細胞急速増大プロトコールＴ細胞。図３：マグネシウムは、ＬＦＡ－１媒介Ｔ細胞活性化および細胞傷害ならびにＢｉＴＥおよびＣＡＲＴ細胞の機能性を調節する。（ａ）１．２ｍＭＭｇ^２＋および０ｍＭＭｇ^２＋を含有する培地中で抗ＣＤ３／２８Ａｂを注射した場合のマウスＷＴおよびＬＦＡ－１^－／－ＣＴＬの解糖スイッチ、ｎ＝４のマウスの要約したデータの定量として表す。（ｂ）１．２ｍＭおよび０ｍＭＭｇ^２＋培地中でそれぞれ、抗ＣＤ３Ａｂによって刺激したＷＴおよびＬＦＡ－１^－／－ＪｕｒｋａｔＴ細胞におけるカルシウムフラックス。細胞にＦｌｕｏ４を負荷し、プレートリーダーによって記録したシグナル強度を、非刺激ベースライン値に対して正規化した。データを、２連での３回の独立した実験の曲線下面積の定量として表す。（ｃ）ＢＩＲＴ３７７（５０μＭ）の存在下または非存在下で１．２ｍＭＭｇ^２＋、０ｍＭＭｇ^２＋、または１．２ｍＭＭｇ^２＋を含有する培地中、プレート結合抗ＣＤ３Ａｂおよび可溶性抗ＣＤ２８Ａｂと共に８時間インキュベーション後のマウスＷＴおよびＬＦＡ－１^－／－ＣＴＬにおける脱顆粒マーカーＣＤ１０７ａの発現。各３回の技術的反復のｎ＝３のマウスの定量結果。（ｄ）１０μｇ／ｍｌＰＨＡの存在下で（ｃ）と同様の条件下でマウスＷＴおよびＬＦＡ－１^－／－ＣＴＬと共に４時間同時培養後のＥＬ４標的細胞におけるカスパーゼ－３活性。エフェクター対標的細胞比は、３：１であった。結果を、各３回の技術的反復のｎ＝３のマウスについて定量した。（ｅ）フローサイトメトリーによって評価したヒトナイーブおよびＥＭＣＤ８Ｔ細胞、ＰＨＡＴ細胞芽球、およびＲＥＰＴ細胞における代表的なＣＤ１１ａ（ＬＦＡ－１）表面発現。（ｃ）と同じ条件下でＴ２標的細胞（１０^－８Ｍ９ｃペプチドをパルスした）と同時インキュベーション後のＲＥＰＴ細胞における、折れ曲がりコンフォメーションを有する不活性なＬＦＡ－１（ｆ）、β２レグの伸長を伴う伸長したコンフォメーション（ｇ）、開放頭部を有するＬＦＡ－１（ｈ）、ＦＡＫのリン酸化、脱顆粒マーカーＣＤ１０７ａの発現（ｊ）のフローサイトメトリーに基づく評価。エフェクター対標的細胞比は１：１であった。データは、ｎ＝５の健康なドナー（ｆ、ｇ、ｈ）、各２回の技術的反復を行うｎ＝３の健康なドナー、または４回の技術的反復を行うｎ＝１の健康なドナーの定量した結果として表す（ｊ）。（ｋ）（ｃ）と同じ条件を使用してＲＥＰＴ細胞と同時培養した４５分後の、９ｃペプチド（１０^－８Ｍ）をパルスしたＴ２標的細胞におけるカスパーゼ－３活性。エフェクター対標的細胞比は、１：１であった。データは、４回の技術的反復によるｎ＝１の健康なドナーの定量した結果を表す。（ｌ）表記のＭｇ^２＋およびブリナツモマブ濃度でのｎ＝５の健康なドナーのＰＨＡ芽球との３．５時間の同時培養後のＲａｍｏｓ標的細胞におけるカスパーゼ－３活性のフローサイトメトリー評価を表す箱ひげ図。（ｍ）ｎ＝５の健康なドナー、３００ｐｇｍｌ^－１のブリナツモマブ濃度でのＲａｍｏｓ細胞との３０分の同時培養後の、ＰＨＡ芽球における活性化誘導ＬＦＡ－１頭部開放のフローサイトメトリーに基づく評価。（ｎ）ＰＨＡ芽球、非形質導入Ｔ細胞、ならびに抗ＣＤ１９発現ＣＡＲＴ細胞におけるＣＤ１１ａ発現の代表的なヒストグラム。（ｏ）０．６ｍＭまたは０ｍＭＭｇ^２＋を含有する培地中でＰＳＭＡ＋ＰＣ３－ＰＩＰ細胞系と同時培養した抗ＰＳＭＡＣＡＲＴ細胞およびＵＴＤＴ細胞による細胞傷害アッセイ。細胞傷害は、死滅した標的細胞における細胞傷害の緑色試薬の取り込み（緑色の面積／μｍ^２）によって駆動される蛍光の曲線下総面積として報告される。エフェクター対標的細胞比は、２：１であった。２回の独立した実験からのｎ＝６のプールした結果を示す。（ｐ）（ｏ）で表した条件に対応する細胞培養上清中の２４時間でのＩＦＮγの存在量を、ＥＬＩＳＡによって決定した（ｎ＝８、３回の独立した実験）。（ｑ）Ｍｇ^２＋枯渇食餌またはそれぞれの対照食餌のいずれかを与え、抗ＰＳＭＡＣＡＲＴ細胞、非形質導入Ｔ細胞、または食塩溶液によって処置したマウスの腫瘍成長曲線。各群当たりｎ＝６のマウスによるｎ＝２の独立した実験を表す。データを、平均値±ＳＤ（ａ～ｄ、ｆ～ｋ、ｍ、ｐ）、±ＩＱＲ（ｌ）、±ＳＥＭ（ｏ、ｑ）として表す。統計学的有意性を、通常の一元配置ＡＮＯＶＡと共にシダック多重比較検定（ａ～ｄ、ｉ～ｋ、ｌ）、ＲＭ一元配置ＡＮＯＶＡと共にシダック多重比較（ｆ、ｇ、ｈ）、二元配置ＡＮＯＶＡと共にチューキーの事後検定（ｏ、ｑ）、および対応のない両側のスチューデントｔ検定（ｍ、ｐ）によって評価した。Ａｂ抗体；ＥＭエフェクターメモリー；Ｍｇ^２＋マグネシウム；ＣＴＬ細胞傷害性Ｔリンパ球；ＰＳＭＡ前立腺特異的膜抗原；ＣＡＲキメラ抗原受容体；ＵＴＤ非形質導入；ＰＨＡフィトヘマグルチニン、ＲＥＰＴ細胞急速増大プロトコールＴ細胞。

図４：マグネシウムは、生理的範囲内のＬＦＡ－１媒介Ｔ細胞活性化および細胞傷害を調節する。（ａ）１．２ｍＭＭｇ^２＋、０ｍＭＭｇ^２＋を含有する培地、または活性化の直前に１．２ｍＭＭｇ^２＋へと再構成した培地（０→１．２ｍＭＭｇ^２＋）中で、抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８Ａｂおよび二次架橋抗ＣＤ３／２８Ａｂの追加の注射による超生理的活性化時のヒトＥＭＣＤ８Ｔ細胞の代謝フラックス解析。３回の独立した実験からのｎ＝６の健康なドナーからのプールした結果。（ｂ）Ｍｇ^２＋含有培地の存在下または非存在下で、プレート結合抗ＣＤ３ｍＡｂの表記の濃度による活性化時のＰＨＡＴ細胞芽球のＣＤ６９発現。（ｃ）表記の濃度のＰＨＡの存在下、１．２ｍＭＭｇ^２＋または０ｍＭＭｇ^２＋を含有する培地中で、マウスＷＴおよびＬＦＡ－１^－／－ＣＴＬと４時間同時培養後のＥＬ４標的細胞におけるカスパーゼ－３活性。エフェクター対標的細胞比は、３：１であった。２回の独立した実験からのｎ＝３～４のプールした結果。（ｄ）１．２ｍＭＭｇ^２＋または０ｍＭＭｇ^２＋を含有する培地中、ルシフェラーゼ発現ＥＬ４標的細胞（１０^－６Ｍの変更されたＯＶＡペプチドをパルスした）と４時間同時培養したＷＴおよびＬＦＡ－１^－／－ＯＴ１ＣＴＬを使用する細胞傷害アッセイ。細胞傷害を、ルシフェリンを培地に添加した後、発光シグナル強度を測定することによって定量した。エフェクター対標的細胞比は、３：１であった（ｎ＝４のマウス）。（ｅ）活性化抗ＬＦＡ－１ＡｂＣＢＲ－ＬＦＡ１／２（１０μｇ／ｍｌ）またはアイソタイプ対照Ａｂ（１０μｇ／ｍｌ）、および１．２ｍＭまたは０ｍＭＭｇ^２＋を含有する培地中で、ルシフェラーゼ発現Ｔ２標的細胞（１０^－８Ｍの９ｃペプチドによるパルスの存在下または非存在下）と４時間同時培養したヒトＲＥＰＴ細胞の細胞傷害。細胞傷害を、ルシフェリンを培地に添加した後、発光シグナル強度を測定することによって定量した。エフェクター対標的細胞比は、２：１であった。ｎ＝１の健康なドナーおよび３～６回の技術的反復による代表的な実験。データは、平均値±ＳＤとして表す。統計学的有意性は、通常の一元配置ＡＮＯＶＡと共にシダック多重比較検定（ａ、ｄ、ｅ）によって評価した。

発明の詳細な説明
本明細書で使用される場合、冠詞「１つ」および「１つ（ａｎ）」は、冠詞の文法上の目的語の１つまたは１つより多く、すなわち少なくとも１つを指す。例として、「１つの要素」は、１つの要素または１つより多くの要素を意味する。「約」という用語は、本明細書で使用される場合、およそ、そのあたり、ほぼ、または付近を意味する。「約」という用語が、数値範囲と共に使用される場合、これは、記載される数値の上および下の境界を延長させることによってその範囲を修飾する。一般的に、「約」という用語は、本明細書において、数値を、記載の値の上および下に、指定された値から±２０％または±１０％、一部の例では±５％、一部の例では±１％、および一部の例では±０．１％の変動によって修飾するために使用され、そのような変動は本開示の方法を実施するために適切である。「処置」という用語（およびその文法的変化形、例えば「処置する」または「処置している」）は、本明細書で使用される場合、処置される個体の自然の経過を変更する試みの少なくとも１つの介入を指し、予防のために、または少なくとも１つの病態の経過の間に実施することができる。処置の望ましい効果としては、これらに限定されないが、疾患の発生または再発を防止すること、症状の軽減、疾患の任意の直接または間接的な病的結果の縮小、転移の防止、疾患進行速度の減少、疾患状態の改善または緩和、および寛解または予後の改善が挙げられる。処置は、疾患または病的状態の症状または病態に及ぼす任意の有益なまたは望ましい効果を含み、処置される疾患または状態、例えばがんの１つまたは複数の測定可能なマーカーの最小の低減さえも含み得る。「処置」は、疾患または状態、またはその関連する症状の完全な根絶または治癒を必ずしも示さない。「患者」、「対象」、「個体」等の用語は、本明細書において互換的に使用され、ｉｎｖｉｔｒｏまたはｉｎｓｉｔｕで本明細書に記載される方法に従うか否かによらず、任意の動物またはその細胞を指す。ある特定の非限定的な実施形態では、患者、対象、または個体はヒトである。「キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）」という用語は、本明細書で使用される場合、既定の抗原に結合することが可能な細胞外ドメイン、細胞外ドメインが由来するポリペプチドとは異なるシグナル伝達タンパク質に由来する１つまたは複数の細胞質ドメインを含む細胞内セグメント、および膜貫通ドメインを含む融合タンパク質を指す。「有効量」という用語は、本明細書で使用される場合、所望の生物学的結果を誘導するために十分な、活性剤（例えば、単独で、組み合わせた、または潜在的に他の治療剤と組み合わせた本明細書に提供される１つまたは複数の化合物）の量を指す。その結果は、がん関連疾患の徴候、症状、もしくは原因の改善もしくは軽減、または生物システムの任意の他の所望の変更であり得る。

細胞培養培地
初代ヒトＣＤ８Ｔ細胞、ＰＨＡ誘導Ｔ細胞芽球、ＪｕｒｋａｔＴ細胞、ＰＣ３－ＰＩＰおよびＴ２細胞を培養するために、ＲＰＭＩ－１６４０培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に、熱不活化１０％ウシ胎仔血清（ＨＩＦＣＳ、Ｇｉｂｃｏ）、５０Ｕｍｌ^－１ペニシリン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）および５０μｇｍｌ^－１ストレプトマイシン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を追加補充した。ヒトＲＥＰＴ細胞は、１０％ヒトＨＩＡＢ血清、５０Ｕｍｌ^－１ペニシリン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）および５０μｇｍｌ^－１ストレプトマイシン、１ｍＭピルビン酸塩（Ｇｉｂｃｏ）、１％ＭＥＭ非必須アミノ酸（Ｇｉｂｃｏ）、１％ＧｌｕｔａＭＡＸ（Ｇｉｂｃｏ）、および３，０００Ｕｍｌ^－１ヒト組換えＩＬ－２（Ｐｒｏｌｅｕｋｉｎ、Ｎｏｖａｒｔｉｓ）を追加補充したＲＰＭＩ－１６４０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）と１：１で混合したＡＩＭＶ培地（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）中で増大させた。マウスＴ細胞およびＥＬ４細胞は、１０％ＨＩＦＣＳ、１００Ｕｍｌ^－１ペニシリン、１００μｇストレプトマイシン、０．２９ｍｇｍｌ^－１Ｌ－グルタミン、５０μＭ２－メルカプトエタノール（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を含有するＲＰＭＩ－１６４０培地中で維持した。２９３Ｔヒト胎児腎（ＨＥＫ－２９３Ｔ）は、１０％ＨＩＦＣＳ、２ｍｍｏｌｌグルタミン、１００μｇｍｌ^－１ペニシリン、および１００Ｕｍｌ^－１ストレプトマイシン（全て、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎから購入した）を追加補充したＲＰＭＩ－１６４０中で培養した。ＭＣ３８－ＯＶＡ細胞は、１０％ＦＣＳ、５０ＵｍＬ^－１ペニシリンおよび５０μｇｍＬ^－１ストレプトマイシン、１ｍＭピルビン酸ナトリウム、５０μＭ２－メルカプトエタノールを追加補充したＲＰＭＩ－１６４０－Ｇｌｕｔａｍａｘ培地中、ジェネティシン選択下（０．４ｍｇｍＬ^－１Ｇ４１８）で維持した。全ての試薬をＧｉｂｃｏから購入した。マグネシウム不含培地は、二回蒸留水（ｄｄＨ_２Ｏ）に、ＲＰＭＩ－１６４０アミノ酸溶液（ＳｉｇｍａＡｌｄｒｉｃｈ）、ＲＰＭＩ－１６４０ビタミン溶液（ＳｉｇｍａＡｌｄｒｉｃｈ）、１％ＧｌｕｔａＭＡＸ（Ｇｉｂｃｏ）、２５ｍＭＨＥＰＥＳ（Ｇｉｂｃｏ）、２ｇＬ^－１重炭酸ナトリウム（ＳｉｇｍａＡｌｄｒｉｃｈ）、２ｇＬ^－１グルコース（ＳｉｇｍａＡｌｄｒｉｃｈ）、１００ｍｇＬ^－１硝酸カルシウム（ＳｉｇｍａＡｌｄｒｉｃｈ）、４００ｍｇＬ^－１塩化カリウム（ＳｉｇｍａＡｌｄｒｉｃｈ）、６ｇＬ^－１塩化ナトリウム（ＳｉｇｍａＡｌｄｒｉｃｈ）、８００ｍｇＬ^－１リン酸水素ナトリウム（ＳｉｇｍａＡｌｄｒｉｃｈ）、１ｍｇＬ^－１グルタチオン（ＳｉｇｍａＡｌｄｒｉｃｈ）、５０Ｕｍｌ^－１１ペニシリン、および５０μｇｍｌ^－１ストレプトマイシン、および１０％ＨＩ透析ＦＣＳ（ｄＦＣＳ、Ｇｉｂｃｏ）を製造元の指示に従って追加補充することによって自作した。機能的読み出しに関して、表記のように、培地に１．２ｍＭＭｇＣｌ_２もしくは１．２ｍＭＭｇＳＯ_４を追加補充したか、または無処理のままとした（＝０ｍＭＭｇ^２＋）。あらゆる条件の細胞を、何らかの機能的読み出しの前に、マグネシウム不含培地で最初に２回洗浄した。自作培地中の低いバックグラウンドＭｇ^２＋値を、ＩＣＰ－ＭＳによって確認した（データは示していない）。

細胞系
ＪｕｒｋａｔＴ細胞（クローンＥ６１、ＴＩＢ－１５２）およびＨＥＫ－２９３Ｔを、ＡＴＣＣから購入した。Ｔ２細胞およびＥＬ４は、Ｐｒｏｆ．Ｚｉｐｐｅｌｉｕｓ（ＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆＢａｓｅｌ）から寄贈された。ＭＣ３８－ＯＶＡは、当初ＰｅｄｒｏＲｏｍｅｒｏ（ＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆＬａｕｓａｎｎｅ）から寄贈された。ＰＣ３－ＰＩＰ細胞系は、当初Ａ．Ｒｏｓａｔｏ（ＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆＰａｄｕａ、Ｐａｄｏｖａ）から寄贈された。細胞を上記のように培養した。

マウス
Ｃ５７ＢＬ／６、ＭＨＣクラスＩ拘束ＯＶＡ特異的Ｔ細胞受容体（ＯＴ－Ｉ）トランスジェニックおよびＢ６．１２９Ｓ７－Ｉｔｇａｌｔｍ１Ｂｌｌ／Ｊ（ＬＦＡ－１ＫＯ）マウスを、当初ＪａｃｋｓｏｎＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（ＵＳＡ）から購入し、その後、バーゼル大学の特定病原体フリー（ＳＰＦ）条件で飼育および収容した。齢および性別を一致させたＣ５７ＢＬ／６マウスを、腫瘍内Ｍｇ^２＋適用実験のためにＣｈａｒｌｅｓＲｉｖｅｒ（Ｉｔａｌｙ）から購入した。マウスを、ＳＰＦ条件で維持し、１週間馴化させた後、ジュネーブ大学の動物施設で実験を行った。実験は全て、ＳｗｉｓｓＦｅｄｅｒａｌＶｅｔｅｒｉｎａｒｙＯｆｆｉｃｅのガイドラインを遵守し、ＣａｎｔｏｎａｌＶｅｔｅｒｉｎａｒｙＯｆｆｉｃｅ（ＣａｎｔｏｎｏｆＢａｓｅｌ－ＳｔａｄｔａｎｄＧｅｎｅｖａ）によって承認された。全てのケージは、食物および水を自由に摂ることができた。実験の間、全ての動物を、窮迫の徴候に関して少なくとも２日毎にモニターし、必要であれば体重を週に３回測定した。マウスは、エンドポイントにおいて二酸化炭素の過量によって屠殺した。

ヒトナイーブおよびメモリーＴ細胞の単離
血液試料を、健康な男性および女性ドナー（年齢１８～６５歳）から、書面でのインフォームドコンセントを得た後（Ｂｌｏｏｄｄｏｎｏｒｃｅｎｔｅｒ、ＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙＨｏｓｐｉｔａｌＢａｓｅｌ）、バフィーコートとして得た。

末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を、標準的な密度勾配遠心分離プロトコール（Ｌｙｍｐｈｏｐｒｅｐ；ＦｒｅｓｅｎｉｓＫａｂｉ）によって単離した。ＭＡＣＳビーズおよびＬＳカラム（いずれもＭｉｌｔｅｎｙＢｉｏｔｅｃ）を使用してＣＤ８陽性Ｔ細胞を選別した。陽性選択したＣＤ８Ｔ細胞を、ＡＰＣ抗ＣＤ６２ＬｍＡｂ（ＩｍｍｕｎｏＴｏｏｌｓ）およびＰａｃｉｆｉｃＢｌｕｅ抗ＣＤ４５ＲＡ（ＢｅｃｋｍａｎＣｏｕｌｔｅｒ）と共にインキュベートした。ナイーブおよびＥＭＣＤ８^＋Ｔ細胞をそれぞれ、ＣＤ６２Ｌ^＋ＣＤ４５ＲＡ^＋およびＣＤ６２Ｌ^－ＣＤ４５ＲＡ^－集団として同定した。細胞選別を、ＢＤＦＡＣＳＡｒｉａＩＩＩまたはＢＤｉｎｆｌｕｘ細胞選別装置（ＢＤＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）によって実施した。細胞を、３７℃で２４時間休ませた後、さらなる実験を行った。

ヒトＴ細胞芽球（ＰＨＡ芽球）の生成
ＰＢＭＣを、１０μｇｍｌ^－１フィトヘマグルチニン（ＰＨＡ、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）および３００Ｕｍｌ^－１ヒト組換えＩＬ－２（Ｐｒｏｌｅｕｋｉｎ、Ｎｏｖａｒｔｉｓ）によって活性化した。ＰＨＡ芽球を、新鮮なＩＬ－２を３～４日毎に添加することによって増大させた。

ヒトＴ細胞のｉｎｖｉｔｒｏ活性化
特に述べていない限り、ヒトＥＭＣＤ８Ｔ細胞およびＰＨＡ芽球を、１μｇｍｌ^－１のプレート結合抗ＣＤ３Ａｂ（ＨＩＴ３ａ、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）および５μｇｍｌ^－１の可溶性抗ＣＤ２８Ａｂの存在下で活性化させた。ナイーブＣＤ８Ｔ細胞を、施設内で作製した抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８コーティングマイクロビーズによって活性化した。ポリビーズミクロスフェア（４．５ｍｍ、ＰｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅＥｐｐｅｎｈｅｉｍ）を、１μｇ抗ＣＤ３Ａｂおよび１０μｇ抗ＣＤ２８Ａｂと共にインキュベートした。Ｔ細胞を２×１０^５細胞／ウェルで９６ウェル平底プレート（ＧｒｅｉｎｅｒＢＩＯＯｎｅ）において、１０％ｄＦＣＳを追加補充し、表記のＭｇ^２＋またはＬＦＡ－１阻害剤を追加補充した自作の培地中に蒔いた。初代ヒトＴ細胞を、２４時間活性化させ、ＰＨＡ芽球を４時間活性化させた。

ＮＹ－ＥＳＯペプチド
ＮＹ－ＥＳＯ－９ｃペプチド（ＳＬＬＭＷＩＴＱＣ）を、＞９５％純度でＥＺＢｉｏｌａｂｓから購入した。凍結乾燥ペプチドを、１０ｍＭで滅菌ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）中に再懸濁し、－２０℃でさらに使用するまで保存した。

ＲＥＰＴ細胞のためのＴ細胞受容体構築物
コドン最適化ＷＴＬＡＵ１５５ＮＹ－ＥＳＯ－１Ｔ細胞受容体アルファおよびベータ鎖を、ＩＲＥＳドメインによって隔てられたｈＰＧＫプロモーターの下でコードするレンチウイルス構築物は、ローザンヌ大学のＤｒ．ＭｉｃｈａｅｌＨｅｂｅｉｓｅｎおよびＤｒ．ＮａｔａｌｉｅＲｕｆｅｒから寄贈された（Hebeisen et al., 2013; Schmid et al., 2010）。このＴＣＲは、その内因性ＮＹ－ＥＳＯ－１ＳＬＬＭＷＩＴＱＣペプチドに関してＫ_Ｄ＝２１．４μＭを有した。

ＲＥＰＴ細胞のためのレンチウイルスの生成
レンチウイルスを生成するために２．５×１０^６個の低継代ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、ＤＭＥＭ培地（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）中で培養し、１５ｃｍ組織培養処理培養皿に播種した。３日後、第二世代のＬＴＲ含有ドナープラスミド、パッケージングプラスミドｐＣＭＶ－ｄｅｌｔａ８．９、およびエンベローププラスミドＶＳＶ－Ｇを、追加補充していないＯｐｔｉ－ＭＥＭ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）中、４：２：１の比で混合し、濾過滅菌した。次に、この溶液を、同様にＯｐｔｉ－ＭＥＭ中で希釈したポリエチレンイミン２５ｋＤａ（ＰｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓＩｎｃ．）とＤＮＡ：ＰＥＩ比１：３で混合した。１５ｃｍ培養皿当たり２８μｇのＤＮＡをトランスフェクトした。２日後、上清を細胞から収集し（培地交換）、０．４５μｍＰＥＳフィルターを通して濾過した。第２のバッチの上清を２４時間後に収集するまで、上清を４℃で１日間保存した。レンチウイルス粒子を含有する上清を、４０，０００×ｇ、４℃で２時間の超遠心分離によって濃縮し、ＰＢＳ中０．１％ＢＳＡに再懸濁させ、－８０℃で凍結した。

ＲＥＰＴ細胞産生のためのヒトＴ細胞の形質導入
ＮＹ－ＥＳＯ－１ＴＣＲ特異的Ｔ細胞を生成するために、健康なヒトドナーＰＢＭＣを解凍し、ＰＢＳ中で洗浄した。次に、ＣＤ８Ｔ細胞を、ＣＤ８マイクロビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）を使用して製造元の指示に従って、ＡｕｔｏＭＡＣＳ（Ｍｙｌｔｅｎｙｉ）上で単離した。単離された細胞を洗浄し、１５０Ｕｍｌ^－１ＩＬ－２を追加補充した培地中に再懸濁させ、１．５ｍｉｏｍｌ^－１で蒔いた。次に、ＣＤ８Ｔ細胞を、Ｔ細胞活性化および増大キット（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）からの活性化ビーズと、製造元の指示に従って１：１の比で活性化した。２４時間後、上記のように産生されたＮＹ－ＥＳＯ－１ＴＣＲレンチウイルス粒子を、感染多重度（ＭＯＩ）２で添加した。次に細胞を、２日毎に新鮮な培地を与え、５０Ｕｍｌ^－１ＩＬ－２を補充して５日間増大させた。ＮＹ－ＥＳＯ－１ＴＣＲ陽性Ｔ細胞を、ＦＡＣＳＡｒｉａＩＩＩまたはＦＡＣＳＳｏｒｐＡｒｉａ（ＢＤ）によって選別し、ＮＹ－ＥＳＯ－９ｃペプチドによって再度刺激した。０．５～２×１０^６細胞ｍｌ^－１の細胞密度を増大のために維持し、３，０００Ｕｍｌ^－１ＩＬ－２を３日毎に交換した。１週間増大させた後、細胞を液体窒素中で保存するか、またはさらに増大させて、その後下記の機能的読み出しのために使用した。

ＲＥＰＴ細胞の活性化および細胞傷害
ＲＥＰＴ細胞を、９６ウェル平底プレートにおいてＴ２標的細胞と共に、特に示していない限り、１：１の比（各４～６×１０^４個）でインキュベートした。最適な比は、各ドナーに関して事前に滴定されている。異なる細胞集団を識別するために、ＲＥＰＴ細胞を、ＣｅｌｌＴｒａｃｅＶｉｏｌｅｔ（ＣＴＶ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）によって標識し、Ｔ２標的細胞を、カルボキシフルオレセイン二酢酸スクシンイミジルエステル（ＣＦＳＥ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）によって標識した。同時インキュベーションの前に、ＣＦＳＥ標識Ｔ２標的細胞を、１０^－８ＭのＮＹＥＳＯペプチドによってマグネシウム不含培地中で３０分間パルスし、３回洗浄した後、１０％ｄＦＣＳを追加補充したマグネシウム不含培地中、表記のカチオンまたはＬＦＡ－１阻害剤濃度でＲＥＰＴ細胞と共に再懸濁させた。全ての同時インキュベーション実験に関して、細胞を、遠心分離することなく沈降させた。脱顆粒アッセイに関して、抗ＣＤ１０７ａ－ＡＦ６４７Ａｂを、同時インキュベーションの全期間にわたって培養培地に直接添加した。４時間後、細胞を採取し、冷ＦＡＣＳ緩衝液中で洗浄し、２％ＰＦＡによって室温で１５分間穏やかに固定した。細胞傷害を、ＮｕｃＶｉｅｗ４８８蛍光発生カスパーゼ－３基質（Ｂｉｏｔｉｕｍ）によって調べた。蛍光発生カスパーゼ基質を、同時インキュベーションの開始時、ウェルに最終濃度１μＭで添加した。４５分後、細胞をＦＡＣＳ緩衝液中で洗浄し、２％ＰＦＡによって室温で１５分間穏やかに固定した。タンパク質リン酸化の解析に関して、同時インキュベーションを、以下のフローサイトメトリーの節に記載されるように２５分後に終了した。あるいは、ルシフェラーゼ発現Ｔ２標的細胞を使用した（図４ｅ）。この特定の実験に関して、ＲＥＰＴ細胞Ｔ２標的比は２：１であった。ＣＢＲ－ＬＦＡ１／２（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）またはアイソタイプ対照（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）を、同時培養の開始時に最終濃度１０μｇｍｌ^－１で添加した。細胞傷害は、ルシフェリンを０．１５ｍｇｍｌ^－１（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）で培地に添加した後、プレートリーダー（ＳｙｎｅｒｇｙＨ１、ＢｉｏＴｅｋ）によって発光シグナル強度を測定することによって定量した。

ＣＡＲＴ細胞の組換えレンチウイルス産生
高力価複製欠損レンチウイルスを産生し、初代Ｔ細胞の形質導入のために超遠心分離によって濃縮した。簡単に説明すると、トランスフェクションの２４時間前に、ＨＥＫ２９３細胞をＴ－１５０組織培養フラスコにおいて３０ｍｌの培地中、１０×１０６個で播種した。全てのプラスミドＤＮＡを、Ｅｎｄｏ－ｆｒｅｅＭａｘｉｐｒｅｐキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して精製した。ＨＥＫ－２９３Ｔ細胞に、７μｇｐＶＳＶ－Ｇ（ＶＳＶ糖タンパク質発現プラスミド）、１８μｇＲ８７４（ＲｅｖおよびＧａｇ／Ｐｏｌ発現プラスミド）、および１５μｇｐＥＬＮＳトランスジーンプラスミドを、Ｔｕｒｂｏｆｅｃｔ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）およびＯｐｔｉｍｅｍ培地の混合物（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、３ｍｌのＯｐｔｉｍｅｍに関して１８０μｌのＴｕｒｂｏｆｅｃｔ）を使用してトランスフェクトした。ウイルス上清をトランスフェクションの４８時間後に収集した。ウイルス粒子を２４，０００ｇで２時間の超遠心分離によって濃縮し、４００μｌの培地中に再懸濁させた直後、ドライアイス上で瞬間凍結した。

ＣＡＲＴ細胞生成のための初代ヒトＴ細胞形質導入
初代ヒトＴ細胞を、健康なドナーの末梢血単核細胞（ＨＤ；バフィーコートまたはアフェレーシスフィルターとして調製）から単離した。全ての血液試料を、インフォームドコンセントを得たＨＤから収集し、ＣａｎｔｏｎｏｆＶａｕｄからの倫理的承認を受けて遺伝子操作した。総末梢血単核細胞を、Ｌｙｍｐｈｏｐｒｅｐ（Ａｘｏｎｌａｂ）分離溶液を介して、標準的な遠心分離プロトコールを使用して得た。ＣＤ４およびＣＤ８Ｔ細胞を、磁気ビーズに基づく陰性選択キットを使用して製造元の推奨（ｅａｓｙＳＥＰ、ＳｔｅｍＣｅｌｌｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）に従って単離した。精製ＣＤ４およびＣＤ８Ｔ細胞を、１：１の比で培養し、抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８Ａｂコーティングビーズ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）によってＴ細胞対ビーズの１：２の比で刺激した。Ｔ細胞に、活性化後１８～２２時間で、レンチウイルス粒子を形質導入した。ヒト組換えＩＬ－２（ｈＩＬ－２；Ｇｌａｘｏ）を、刺激後５日まで（＋５日目）１日おきに５０ＩＵｍｌ^－１の濃度で補充した。＋５日目に、磁気ビーズを除去し、ｈ－ＩＬ－７およびｈ－ＩＬ－１５（ＭｉｌｔｅｎｙｉＢｉｏｔｅｃ）を１０ｎｇｍｌ^－１で培養物に添加し、ｈ－ＩＬ－２を置き換えた。０．５～１×１０^６細胞ｍｌ^－１の細胞密度を増大のために維持した。休ませた操作されたＴ細胞を、全ての機能的アッセイの前にトランスジーン発現が等価となるように調整した。

ＣＡＲＴ細胞による細胞傷害アッセイ
細胞傷害アッセイを、ＩｎｃｕＣｙｔｅ機器（ＥｓｓｅｎＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を使用して実施した。簡単に説明すると、１．２５×１０^４個のＰＣ３－ＰＩＰ標的細胞を、９６ウェル平底プレート（Ｃｏｓｔａｒ、Ｖｉｔａｒｉｓ）に播種した。４時間後、休ませたＴ細胞（４８時間サイトカインを添加していない）を洗浄し、２．５×１０^４個／ウェルで、１０％ｄＦＣＳを追加補充し、および０．６ｍＭＭｇＣｌ_２を追加補充したまたはＭｇ^２＋を追加補充していない自作の培地中に２：１のエフェクター対標的比で播種した。外因性のサイトカインは、アッセイの同時培養期間の間に添加しなかった。ＩｎｃｕＣｙｔｅカスパーゼ－３／７（ＥｓｓｅｎＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を、全体積２００μｌ中、最終濃度５μＭで添加した。時間をわたっての自発的な細胞死をモニターするために、ＩｎｃｕＣｙｔｅカスパーゼ－３／７試薬の存在下での非形質導入（ＵＴＤ）－Ｔ細胞および腫瘍細胞の同時インキュベーションを含む実験の内部陰性対照を、全てのアッセイに含めた。陽性対照として、腫瘍細胞単独を、１％トライトン溶液によって処理し、アッセイにおける最大死滅を評価した。ウェル当たりの総緑色領域の画像を同時培養の２時間毎に収集した。ウェル当たりの総緑色領域を、ＥｓｓｅｎＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅによって提供されるＩｎｃｕＣｙｔｅＺＯＯＭソフトウェアの同じ解析プロトコールを使用して得た。データは全て、０時間で観察されたバックグラウンド蛍光（ＣＡＲ－Ｔ細胞による任意の細胞死滅の前）を全てのさらなる時点から減算することによって正規化した。

ＣＡＲＴ細胞のサイトカイン放出アッセイ
サイトカイン放出アッセイを、９６ウェル丸底プレートにおいて、１０％ｄＦＣＳを追加補充し、および０．６ｍＭＭｇＣｌ_２を追加補充したまたはＭｇ^２＋を追加補充していない最終体積２００μｌの自作の培地中、２連で、ウェル当たり５×１０^４個のＴ細胞を５×１０^４個の標的細胞と同時培養することによって実施した。２４時間後、同時培養上清を収集し、市販の酵素結合免疫吸着検定キットによって、製造元のプロトコール（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）に従ってＩＦＮγの存在に関して試験した。

マウスＭＣ３８－ＯＶＡ腫瘍モデル－設定
特に述べていない限り、６～１２週齢の雌性マウスを実験に使用した。事前に免疫化したマウスによるアッセイにおいて、マウスを腫瘍移植の１９日前に、１００μＬのＰＢＳに再懸濁した１００μｇのＯＶＡタンパク質（Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ）および５０μｇのＣｐＧ－ＢＯＤＮ１８２６（Ｅｕｒｏｇｅｎｔｅｃ）の皮下注射によって免疫化した。腫瘍の移植に関して、マウスに、１００μｌのＰＢＳに再懸濁させた０．５×１０^６個のＭＣ３８－ＯＶＡ細胞を脇腹に皮下接種した。両側の腫瘍実験の場合、マウスに、３ｍＭＮａＣｌ、または３ｍＭＭｇＣｌ２（いずれもｄｄＨ２Ｏに希釈した）のいずれかの５０μＬの腫瘍内注射を行った。ＮａＣｌ溶液の注射を左脇腹の腫瘍に適用し、ＭｇＣｌ２溶液を反対側の腫瘍に注射した。腫瘍が触診可能となる、通常腫瘍注射後５日目から１０日目の間に腫瘍内注射を開始した。注射を、３日毎に繰り返した。腫瘍サイズを、キャリパーを使用して定量し、腫瘍体積を、合理的な楕円の方程式（α２×β×π／６、αは短軸であり、βは長軸である）を使用して計算した。全ての生存実験において、いずれかの腫瘍寸法が１５ｍｍより長い長さに達した後、マウスの試験を中止した。

マウスＭＣ３８－ＯＶＡ腫瘍モデル－ｉｎｖｉｖｏＣＤ８^＋Ｔ細胞枯渇
ＣＤ８枯渇実験に関して、マウスを上記のようにＯＶＡによって免疫化し、０．５×１０^６個のＭＣ３８－ＯＶＡ細胞を片側の脇腹に接種した。腫瘍が触診可能となった後、３ｍＭＮａＣｌまたは３ｍＭＭｇＣｌ２のいずれかの腫瘍内注射を開始し、３日毎に繰り返した。ＣＤ８Ｔ細胞を、１０ｍｇｋｇ^－１の抗ＣＤ８ａＡｂ（５３－６．７２、ＢｉｏＸＣｅｌｌ）を１週間に１回腹腔内投与することによって枯渇させた。

マウスＭＣ３８－ＯＶＡ腫瘍モデル－ｉｎｖｉｖｏＰＤ－１遮断
ＰＤ－１遮断実験に関して、マウスを上記のようにＯＶＡによって免疫化し、片側の脇腹に０．５×１０^６個のＭＣ３８－ＯＶＡ細胞を接種した。腫瘍が触診可能となった５日目に、３ｍＭＮａＣｌまたは３ｍＭＭｇＣｌ２のいずれかの腫瘍内注射を開始し、３日毎に８サイクルを繰り返した。マウスにさらに、アイソタイプ対照（ＩｇＧ２ａ）または抗ＰＤ－１Ａｂを、腫瘍の移植後９日目、１２日目、および１５日目に、ｐＨを一致させた１００μｌのＰＢＳ（製造元の推奨に従う）中で希釈した２００μｇ／マウスの用量で腹腔内注射した。使用した抗体は：抗ＰＤ－１ＩｇＧ２ａＡｂ（クローンＲＭＰ１－１４）またはＩｇＧ２ａアイソタイプ対照Ａｂ（クローン２Ａ３、いずれもＢｉｏＸＣｅｌｌから購入）であった。

マウスＭＣ３８－ＯＶＡ腫瘍モデル－腫瘍浸潤免疫細胞のフローサイトメトリー解析
腫瘍組織をマウスから単離し、秤量し、カミソリの刃で細切した。組織をアキュターゼ（ＰＡＡ）、コラゲナーゼＩＶ（Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ）、ヒアルロニダーゼ（Ｓｉｇｍａ）、およびＤＮアーゼＩＶ型（Ｓｉｇｍａ）を使用して３７℃で６０分間絶えず振とうさせながら消化した。細胞懸濁物を、セルストレーナー（７０μｍ）を使用して濾過した。ＰｒｅｃｉｓｉｏｎＣｏｕｎｔｉｎｇビーズ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）を染色前に添加し、腫瘍１グラム当たりの細胞数を定量した。単細胞懸濁物を、ラット抗マウスＦｃγＩＩＩ／ＩＩ受容体（ＣＤ１６／ＣＤ３２）遮断抗体（‘Ｆｃ－ｂｌｏｃｋ’）によってブロックし、生存／死細胞排除色素によって染色した。次に、細胞を、細胞表面抗原に対するフルオロフォア結合体化抗体と共にインキュベートし、ＦＡＣＳ緩衝液（ＰＢＳ＋２％ＦＢＳ）中で洗浄し、再懸濁させた。細胞内／核内抗原の場合、細胞表面抗体によって染色した細胞を固定し、Ｆｏｘｐ３／転写因子染色緩衝液（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を使用して透過性にした後、細胞内抗原に対する抗体と共にインキュベートした。

マグネシウム制限食餌
精製成分齧歯類食餌ＡＩＮ－７６Ａに基づくマグネシウム制限食餌および一致する対照食餌を、ＲｅｓｅａｒｃｈＤｉｅｔｓＩｎｃ．（ＵＳＡ）から購入した。

マウスＣＴＬ分化および培養
単細胞懸濁物を、Ｃ５７Ｂｌ／６およびＬＦＡ－１ＫＯマウス（雄性および雌性、６～１０週齢、性別および週齢の等しい分布）から採取したリンパ節および脾臓から作製した。ナイーブＣＤ８Ｔ細胞を、磁気ビーズに基づく陰性選択キットを使用して、製造元の推奨（ｅａｓｙＳＥＰ、ＳｔｅｍＣｅｌｌｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）に従って単離した。ナイーブＴ細胞（２×１０^５個／ウェル）を、１００Ｕｍｌ^－１のＩＬ－２（Ｐｒｏｌｅｕｋｉｎ）の存在下、５μｇの抗ＣＤ３Ａｂ（プレート結合）および１μｇの抗ＣＤ２８Ａｂ（可溶性；いずれもＢｉｏｌｅｇｅｎｄから）の存在下で２日間平板培養した。細胞を洗浄し、５００Ｕｍｌ^－１ＩＬ－２を含む９６ウェル丸底プレートにおいて新鮮な培地中１０^６個ｍｌ^－１で播種した。０．５～２×１０^６個ｍｌ^－１の細胞密度を増大のために維持し、ＩＬ－２を毎日交換した。機能的読み出しを、最初の活性化後７～１９日目に、ＩＬ－２の非存在下で行った。

マウスＯＴ－１細胞およびヒトＪｕｒｋａｔＴ細胞のＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９編集
ｃｒＲＮＡを、ＩＤＴからの事前に設計されたＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９ガイドＲＮＡツールから選択した。産物ＩＤおよび配列を補足表Ｉに記載する。ｃｒＲＮＡ（ＩＤＴ）または陰性対照ｃｒＲＮＡ＃１（ＩＤＴ）およびｔｒＲＮＡ（ＩＤＴ）を、１：１の比でヌクレアーゼ不含二重鎖緩衝液（ＩＤＴ）中、最終濃度５０μＭとなるように混合し、９５℃で５分間アニールし、４０μＭＣａｓ９（ＱＢ３ＭａｃｒｏＬａｂ、ＵＣＢｅｒｋｅｌｅｙ）に加えた後、室温で少なくとも１０分間インキュベートした。マウスＯＴ－１細胞に、マウスＴ細胞ＮｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒＫｉｔ（Ｌｏｎｚａ）によって、２ｂＮｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒを使用して製造元の指示に従ってトランスフェクトした。簡単に説明すると、単細胞懸濁物を、ＯＴ－Ｉマウス（雄性および雌性、６～１０週齢、性別および週齢の等しい分布）から採取したリンパ節および脾臓から作製した。２×１０^６個のＯＴ－Ｉリンパ球を、１００μｌのＮｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ溶液中に再懸濁させ、２０μＭのＲＮＰと合わせた。適切なｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒプログラムを適用した。細胞を、マウスＴ細胞Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ培地（Ｌｏｎｚａ）中で２４時間休ませた後、ＯＶＡ_{２５７－２６４}ペプチドをパルスした（１０^－９Ｍ）Ｃ５７／Ｂｌ６脾細胞によって１００Ｕｍｌ^－１のＩＬ－２（Ｐｒｏｌｅｕｋｉｎ）の存在下で３日間活性化した。細胞を洗浄し、５００Ｕｍｌ^１ＩＬ－２を含む９６ウェル丸底プレートにおいて新鮮な培地中、１０^６個ｍｌ^－１で播種した。ノックアウト効率を、フローサイトメトリーによって検証し、細胞選別によって精製した。

ＪｕｒｋａｔＴ細胞を、ＡＭＡＸＡ細胞系Ｖヌクレオフェクションキット（Ｌｏｎｚａ）を使用して上記のようにトランスフェクトした。ノックアウト効率を、フローサイトメトリーによって検証し、細胞選別によって精製した。ＪｕｒｋａｔＴ細胞を最初に１週間増大させた後、液体窒素中で保存した。

マウスＣＴＬのｉｎｖｉｔｒｏ活性化
ＷＴまたはＬＦＡ－１ＫＯＣ５７／Ｂｌ６のＣＴＬを、特に述べていない限り、０．０５μｇｍｌ^－１のプレート結合抗ＣＤ３Ａｂ（１４５－２Ｃ１１、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）および１μｇｍｌ^－１の可溶性抗ＣＤ２８Ａｂ（３７．５１、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）の存在下、２×１０^５細胞／ウェルで９６ウェル平底プレートにおいて特に述べていない限り８時間活性化した。表面活性化マーカーの染色を以下に記載する。細胞傷害を、ＮｕｃＶｉｅｗ４８８蛍光発生カスパーゼ－３基質によって評価した。ＣＴＶ標識ＣＴＬおよびＣＦＳＥ標識ＥＬ４標的細胞を、表記の濃度のＰＨＡの存在下、９６ウェル平底プレートにおいて４時間インキュベートした。カスパーゼ－３基質を、インキュベーションの最後の４５分間添加した。細胞を採取し、ＦＡＣＳ緩衝液中で洗浄し、２％ＰＦＡによって室温で１５分間穏やかに固定した。

ＯＴ－Ｉ由来ＣＴＬを、１０μＭのＯＶＡ_{２５７－２６４}ペプチド（ＳＩＩＮＦＥＫＬ、Ｅｕｒｏｇｅｎｔｅｃ）または変更されたペプチドリガンドＲ７（ＳＩＩＱＦＥＲＬ、Ｅｕｒｏｇｅｎｔｅｃ）、Ｈ７（ＳＩＩＱＦＥＨＬ、Ｅｕｒｏｇｅｎｔｅｃ）、またはＧ４（ＳＩＩＧＦＥＫＬ、Ｅｕｒｏｇｅｎｔｅｃ）によって４時間刺激した。細胞を採取し、表面活性化マーカーに関して染色した。細胞傷害アッセイに関して、ＥＬ４標的細胞に、１μＭの異なるＯＶＡペプチドを同時インキュベーションの前に３０分間パルスした。細胞傷害を、蛍光発生カスパーゼ－３基質（上記の通り）またはルシフェラーゼ発現ＥＬ４標的細胞のいずれかによって評価した。細胞傷害を、０．１５ｍｇｍｌ^－１のルシフェリン（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）を培地に添加した後、プレートリーダー（ＳｙｎｅｒｇｙＨ１、ＢｉｏＴｅｋ）によって発光シグナル強度を測定することによって定量した。

サイトメトリックビーズアレイ（ｃｙｔｏｍｅｔｒｉｃｂｅａｄａｒｒａｙ）（ＣＢＡ）
細胞培養上清中のサイトカイン濃度を、ＬｅｇｅｎｄＰｌｅｘサイトメトリックビーズアレイヒトＴｈ１パネル（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）を使用して製造元の指示に従って決定した。

代謝アッセイ
ＳｅａｈｏｒｓｅＸＦ－９６ｅ細胞外フラックスアナライザー（ＳｅａｈｏｒｓｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、Ａｇｉｌｅｎｔ）を使用して、細胞の代謝プロファイルを決定した。Ｔ細胞を、Ｃｅｌｌｔａｋ（Ｃｏｒｎｉｎｇ、ＵＳＡ）コーティング細胞プレートに蒔いた（２×１０^５細胞／ウェル）。実験を、緩衝化されていない血清およびＭｇ^２＋不含自作培地中で行った。培地を１．２ｍＭＭｇＣｌ_２の存在下または非存在下で再構成した。Ｍｇ^２＋の再構成は、実験の開始時から存在したか、または機器のマルチインジェクションポートを介して蒔いた細胞に適用した。全ての以下の濃度は、表記の物質の最終のウェル濃度を表す。ヒトＴ細胞を、抗ＣＤ３Ａｂ（１μｇｍＬ^－１）、または抗ＣＤ３Ａｂ（１μｇｍＬ^－１）、および抗ＣＤ２８Ａｂ（１０μｇｍＬ^－１）の注射によって活性化した。ある特定の実験では（表記のように）、抗ＣＤ３／ＣＤ２８抗体を、二次ヤギ抗マウスＡｂ（５μｇｍＬ^－１、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）の追加の注射によって架橋させた。マウスＴ細胞を、抗ＣＤ３Ａｂ（５μｇｍＬ^－１）および抗ＣＤ２８Ａｂ（２．５μｇｍＬ^－１）の注射によって活性化した。

カルシウムフラックスアッセイ
ＪｕｒｋａｔＴ細胞に、Ｍｇ^２＋不含自作培地中で最終濃度２μＭのＦｌｕｏ４（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を、３７℃で３０分間負荷した。細胞を、２回洗浄し、細胞接着を増強するためにコラーゲン（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を事前にコーティングした黒色９６ウェル平底プレート（ＧｒｅｉｎｅｒＢＩＯｏｎｅ）において２×１０^５個／ウェルで蒔いた。３７℃で１５分間さらにインキュベートすることによって、細胞を接着させ、Ｆｌｕｏ４プローブを完全に脱エステル化させた。ＪｕｒｋａｔＴ細胞を、１０μｇｍＬ^－１抗ＣＤ３によって刺激した。時間をわたっての蛍光強度をＴｅｃａｎＳｐａｒｋＭ１０プレートリーダーによって測定した。試料を、２回の技術的反復で行い、蛍光シグナル強度の平均値を、非刺激ベースライン値に対して正規化した。

ブリナツモマブを用いる同時培養アッセイ
ブリナツモマブ（Ａｍｇｅｎ）は、注入の残りに由来した。ヒトＰＨＡ芽球を、９６ウェル平底プレートにおいてＲａｍｏｓ標的細胞と共に０．５：１の比（６．５×１０^４個のＰＨＡ芽球および１．３×１０^５個のＲａｍｏｓ細胞）で、表記のブリナツモマブ濃度でインキュベートした。異なる細胞集団を識別するために、ＰＨＡ芽球をＣＴＶによって標識（４９ａｂｅｌｌｅｄ）し、Ｔ２標的細胞をＣＦＴＲＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎによって標識した。全ての同時インキュベーション実験に関して、細胞を、遠心分離することなく沈降させた。ＬＦＡ－１コンフォメーションの定量のために、ｍ２４を、細胞培養培地に直接添加し、１０分間インキュベートした後、氷上で３０分間インキュベートした後、洗浄し、その後２％ＰＦＡによって固定した。細胞傷害を、ＣｅｌｌＥｖｅｎｔカスパーゼ－３／７Ｇｒｅｅｎ検出試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）によって上記のように３．５時間後に定量した。カスパーゼ基質を、インキュベーションの最後４５分間に最終濃度２μＭで添加した。細胞を採取し、ＦＡＣＳ緩衝液中で洗浄し、２％ＰＦＡによって室温で１５分間固定後、ＦＡＣＳによって解析した。

抗ＣＤ１９ＣＡＲＴ細胞のための組換えレンチウイルス産生
トランスフェクションの２４時間前、ＨＥＫ－２９３Ｔ細胞を播種した（１０ｍｌ培地当たり３．８×１０６個）。全てのプラスミドＤＮＡを、エンドトキシンフリーのプラスミドＭａｘｉｐｒｅｐＫｉｔ（Ｓｉｇｍａ）を使用して精製した。ＨＥＫ－２９３Ｔ細胞に、１．３ｐｍｏｌｐｓＰＡＸ２（レンチウイルスパッケージングプラスミド）および０．７２ｐｍｏｌｐＭＤ２Ｇ（ＶＳＶ－Ｇエンベロープ発現プラスミド）および１．６４ｐｍｏｌｐＣＡＲ－ＣＤ１９ＣＡＲ－ｐ２ａ－ＥＧＦＰ（ＣｒｅａｔｉｖｅＢｉｏｇｅｎｅ）を、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）およびＯｐｔｉｍｅｍ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用してトランスフェクトした。ウイルス上清を形質導入の４８時間後に収集した。ウイルス粒子を、ＰＥＧ沈殿を使用して濃縮し、－８０℃で保存した。

抗ＣＤ１９ＣＡＲＴ細胞生成のための初代ヒトＴ細胞の形質導入
血液試料（Ｂｌｏｏｄｄｏｎｏｒｃｅｎｔｅｒ、ＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙＨｏｓｐｉｔａｌＢａｓｅｌ）を、書面でのインフォームドコンセント後に健康なドナーから得た。ＰＢＭＣを、標準的な密度勾配遠心分離プロトコール（Ｌｙｍｐｈｏｐｒｅｐ；ＦｒｅｓｅｎｉｕｓＫａｂｉ）によって単離した。ＣＤ４^＋およびＣＤ８^＋Ｔ細胞を、磁気ＣＤ４^＋およびＣＤ８^＋ビーズ（ＭｉｌｔｅｎｙｉＢｉｏｔｅｃ）を使用して陽性選択した。精製ＣＤ４^＋およびＣＤ８^＋Ｔ細胞をＲ１０ＡＢ中で培養した。ＣＤ４^＋およびＣＤ８^＋Ｔ細胞を、２４ウェル細胞培養プレートに蒔き、抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８モノクローナル抗体コーティングビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｊ、Ｔ細胞活性化＆増大キット）によって、ＩＬ－２（１５０Ｕｍｌ－１）を含有する培地中、１：１の比で刺激した。Ｔ細胞を、ポリブレン（６μｇｍｌ－１、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を含有する培地中での活性化から１８～２２時間後に、レンチウイルス粒子によって形質導入した。２日毎に、培地を新鮮なＩＬ－２（１５０Ｕｍｌ－１）と交換した。形質導入の５日後、ＧＦＰ^＋細胞を、選別してＣＤ１９－ＣＡＲ^＋細胞を濃縮し、磁気ビーズを非形質導入細胞から除去した。細胞を、ＩＬ－２（１５０Ｕｍｌ－１）を含有する培地中でさらに３日間増大させた後、標的細胞死滅アッセイを行った。

抗ＣＤ１９ＣＡＲＴ細胞による細胞傷害アッセイ
ＣＤ８^＋抗ＣＤ１９ＣＡＲＴ細胞を、Ｒａｍｏｓ標的細胞と共に０．１～０．３３：１の比（０．５～１．５×１０^４個のＣＡＲＴ細胞および５×１０^４個のＲａｍｏｓ標的細胞）でインキュベートした。Ｒａｍｏｓ細胞は、同時インキュベーションの前にＣＦＴＲによって標識されていた。細胞を、９６ウェル平底プレートにおいて遠心分離することなく沈降させ、３時間インキュベートした。細胞傷害を、ＢｉｏＴｒａｃｋｅｒＮｕｃＶｉｅｗ４０５Ｂｌｕｅカスパーゼ－３色素（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）を使用してフローサイトメトリーによって定量した。

抗ＰＳＭＡＣＡＲＴ細胞のための組換えレンチウイルス産生
高力価複製欠損レンチウイルスを産生し、初代Ｔ細胞の形質導入のために超遠心分離によって濃縮した。簡単に説明すると、トランスフェクションの２４時間前に、ＨＥＫ－２９３細胞をＴ－１５０組織培養フラスコ中、３０ｍｌの培地中で１０×１０^６個で播種した。全てのプラスミドＤＮＡを、Ｅｎｄｏ－ｆｒｅｅＭａｘｉｐｒｅｐキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して精製した。ＨＥＫ－２９３Ｔ細胞に、７μｇｐＶＳＶ－Ｇ（ＶＳＶ糖タンパク質発現プラスミド）、１８μｇのＲ８７４（ＲｅｖおよびＧａｇ／Ｐｏｌ発現プラスミド）、および１５μｇのｐＥＬＮＳトランスジーンプラスミドを、Ｔｕｒｂｏｆｅｃｔ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）およびＯｐｔｉｍｅｍ培地の混合物（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、３ｍｌのＯｐｔｉｍｅｍに関して１８０μｌのＴｕｒｂｏｆｅｃｔ）を使用してトランスフェクトした。ウイルス上清をトランスフェクションの４８時間後に収集した。ウイルス粒子を２４，０００ｇで２時間の超遠心分離によって濃縮し、４００μｌの培地中に再懸濁させた直後、ドライアイス上で瞬間凍結した。

抗ＰＳＭＡＣＡＲＴ細胞生成のための初代ヒトＴ細胞形質導入
初代ヒトＴ細胞を、健康なドナーの末梢血単核細胞（ＨＤ；バフィーコートまたはアフェレーシスフィルターとして調製）から単離した。全ての血液試料を、インフォームドコンセントを得た健康なドナーから収集し、ＣａｎｔｏｎｏｆＶａｕｄ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄからの倫理的承認を受けて遺伝子操作した。ＰＢＭＣを、Ｌｙｍｐｈｏｐｒｅｐ（Ａｘｏｎｌａｂ）分離溶液を介して、標準的な遠心分離プロトコールを使用して得た。ＣＤ４およびＣＤ８^＋Ｔ細胞を、磁気ビーズに基づく陰性選択キットを使用して製造元の推奨（ｅａｓｙＳＥＰ、ＳｔｅｍＣｅｌｌｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）に従って単離した。精製ＣＤ４およびＣＤ８^＋Ｔ細胞を、１：１の比で培養し、抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８Ａｂコーティングビーズ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）によってＴ細胞対ビーズの１：２の比で刺激した。Ｔ細胞に、活性化から１８～２２時間後に、レンチウイルス粒子を形質導入した。ヒト組換えＩＬ－２（ｈＩＬ－２；Ｇｌａｘｏ）を、刺激後５日まで（＋５日目）１日おきに５０ＩＵｍｌ－１の濃度で補充した。＋５日目、磁気ビーズを除去し、ｈ－ＩＬ－７およびｈ－ＩＬ－１５（ＭｉｌｔｅｎｙｉＢｉｏｔｅｃ）を培養物に１０ｎｇｍｌ^－１で添加し、ｈ－ＩＬ－２を置き換えた。０．５～１×１０^６個ｍｌ－１の細胞密度を増大のために維持した。休ませた操作されたＴ細胞を、全ての機能的アッセイの前にトランスジーン発現が等価となるように調整した。

抗ＰＳＭＡＣＡＲＴ細胞による細胞傷害アッセイ
細胞傷害アッセイを、ＩｎｃｕＣｙｔｅ機器（ＥｓｓｅｎＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を使用して実施した。簡単に説明すると、１．２５×１０^４個のＰＣ３－ＰＩＰ標的細胞を、９６ウェル平底プレート（Ｃｏｓｔａｒ、Ｖｉｔａｒｉｓ）に播種した。４時間後、休ませたＴ細胞（４８時間サイトカインを添加していない）を洗浄し、２．５×１０^４個／ウェルで、２：１のエフェクター対標的比で、１０％ｄＦＣＳを追加補充し、および０．６ｍＭＭｇＣｌ_２を追加補充した、またはＭｇ^２＋を追加補充していない自作の培地中に播種した。外因性のサイトカインは、同時培養期間の間に添加しなかった。ＩｎｃｕＣｙｔｅカスパーゼ－３／７（ＥｓｓｅｎＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を、全体積２００μｌ中、最終濃度５μＭで添加した。時間をわたっての自発的な細胞死をモニターするために、ＩｎｃｕＣｙｔｅカスパーゼ－３／７試薬の存在下での非形質導入（ＵＴＤ）－Ｔ細胞および腫瘍細胞の同時インキュベーションを含む実験の内部陰性対照を全てのアッセイに含めた。陽性対照として、腫瘍細胞単独を、１％トライトン溶液によって処理し、アッセイにおける最大死滅を評価した。ウェル当たりの総緑色領域の画像を同時培養の２時間毎に収集した。ウェル当たりの総緑色領域を、ＥｓｓｅｎＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅによって提供されるＩｎｃｕＣｙｔｅＺＯＯＭソフトウェアの同じ解析プロトコールを使用して得た。細胞傷害は、死滅した標的細胞における細胞傷害の緑色試薬の取り込み（緑色の面積／μｍ２）によって駆動される蛍光の曲線下総面積として報告する。データは全て、０時間で観察されたバックグラウンド蛍光（ＣＡＲ－Ｔ細胞による任意の細胞死滅の前）を全てのさらなる時点から減算することによって正規化した。

抗ＰＳＭＡＣＡＲＴ細胞のサイトカイン放出アッセイ
サイトカイン放出アッセイを、９６ウェル丸底プレートにおいて、１０％ｄＦＣＳを追加補充し、および０．６ｍＭＭｇＣｌ２を追加補充したまたはＭｇ^２＋を追加補充していない最終体積２００μｌの自作の培地中、２連で、ウェル当たり５×１０^４個のＴ細胞を５×１０^４個の標的細胞と同時培養することによって実施した。２４時間後、同時培養上清を収集し、市販の酵素結合免疫吸着検定キットによって、製造元のプロトコール（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）に従ってＩＦＮγの存在に関して試験した。

抗ＰＳＭＡＣＡＲＴ細胞のｉｎｖｉｖｏ実験
１０～１２週齢の雄性ＮＳＧマウスに、Ｍｇ^２＋制限食餌、または一致させた対照食餌を５日間与えた後、腫瘍を注射し、実験の間、それぞれの食餌で維持した。５×１０^６個のＰＣ３－ＰＩＰ腫瘍細胞を皮下注射した。５日後、食塩溶液または２×１０^６個のＴ細胞（ＵＴＤまたはＣＡＲＴ細胞）の静脈内注射を、静脈内に養子移入した。腫瘍体積を週に２回モニターした。動物を毎日モニターし、腫瘍をキャリパーで１日おきに測定した。腫瘍体積は式Ｖ＝１／２（長さ×幅２）を使用して計算し、式中、長さは、キャリパーの測定を介して決定した最大の長手方向の直径であり、幅は、最大の横方向の直径である。

フローサイトメトリー
表面マーカーの解析に関して、Ｔ細胞を表記の時点で採取し、冷ＰＢＳ中で１回洗浄し、必要であれば、ＦｉｘａｂｌｅＶｉａｂｉｌｉｔｙＤｙｅｓによって４℃で１５分間染色した。表面マーカーを、適切な抗体によって４℃で２０分間染色した。

活性化誘導ＬＦＡ－１頭部開放の評価に関して、Ｔ細胞を、４５分間活性化し、抗ヒトＣＤ１１ａ／ＣＤ１８（クローンｍ２４）を培地に直接添加し、氷上で２０分間インキュベートした。次に細胞を、ＦＡＣＳ緩衝液中で２回洗浄し、２％ＰＦＡ中で固定し、室温で２０分間インキュベートし、ＦＡＣＳ緩衝液によって洗浄後、獲得した。

ＬＦＡ－１コンフォメーションのさらなる定量のために、ｍ２４、ＫＩＭ１２７、またはＴＳ２／４ｍＡｂをまた、細胞培養培地に３７℃で１０分間、および氷上で３０分間、直接添加した後、洗浄し、次いで２％ＰＦＡによって固定した。ＨＩ１１１による染色のために、細胞を４５分間活性化し、２％ＰＦＡによって固定し、次いでＨＩ１１１によって染色し、ＦＡＣＳ緩衝液によって洗浄した後、獲得した。

細胞内ＴＮＦ染色のために、細胞を、表記のように４時間活性化した。活性化の最後の２時間に、細胞を、サイトカイン分泌を遮断するためにブレフェルジンＡ溶液（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）によって処理した。次に、細胞を洗浄し、室温で２０分間固定（固定／透過処理溶液、ＢＤＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）し、透過処理緩衝液（ＢＤＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）によって洗浄した後、４５分間染色し、さらに洗浄後、獲得した。タンパク質リン酸化を解析するために、Ｔ細胞を、表記のように刺激し、８％パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を直接培養培地に添加し、４％ＰＦＡの最終濃度を得ることにより固定した。細胞を、室温で１５分間インキュベートし、ＦＡＣＳ緩衝液によって洗浄した後、氷冷メタノールによって４℃で５分間透過処理を行った後、ＦＡＣＳ緩衝液によって洗浄し、細胞を室温で３０分間染色し、洗浄し、および獲得した。

ＢＤＦｏｒｔｅｓｓａＬＳＲＩＩ（ＢＤＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）またはＣｙｔｏｆｌｅｘＳ（Ｂｅｃｋｍａｎｎ）フローサイトメーターを、フローサイトメトリーのために使用した。

以下の抗体を染色のために使用した：

ＭＣ３８－ＯＶＡ腫瘍モデル：
ＣＤ３（ＢＵＶ８０５、ＢＤＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、ＣＤ４（ＢＵＶ４９６、ＢＤＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、ＣＤ８（ｅＦｌｕｏｒ４５０、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）、ＣＤ１１ｂ（ＡＰＣ－Ｃｙ７、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）、ＣＤ１１ｃ（ＦＩＴＣ、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）、ＣＤ１９（ＢＢ５１５、ＢＤＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、ＣＤ２５（ＰＥ－Ｃｙ５．５、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）、ＣＤ４５（ＢＵＶ３８５、ＢＤＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、ＣＤ８０（ＢＶ６０５、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）、ＣＤ１０３（ＢＶ６５０、ＢＤＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、ＣＤ２０６（ＢＶ７１１、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）、ＣＸＣＲ３（ＢＵＶ７３７、ＢＤＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、Ｆ４／８０（ＡＦ６４７、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）、ＦｏｘＰ３（ＡＰＣ、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）、ＧｚｍＢ（ＰＥ－ｅＦｌｕｏｒ６１０、Ｉｎｉｖｔｒｏｇｅｎ）、Ｋｉ６７（ＡＦ５３２、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）、ＬＦＡ－１（ＳＢ４３６、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）、Ｌｙ－６Ｇ（ＢＵＶ５６３、ＢＤＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、Ｌｙ－６ｃ（ＰｅｒＣＰ、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）、ＭＨＣＩＩ（ＢＶ５１０、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）、ＮＫｐ４６（ＢＵＶ５６３、ＢＤＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、ＰＤ－１（ＢＶ７８５、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）、ＰＤ－Ｌ１（ＢＶ４２１、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）、ＴＣＦ－７（ＡＦ７００、Ｒ＆ＤＳｙｓｔｅｍｓ）、Ｔｉｍ－３（ＢＢ７００、ＢＤＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、ＺｏｍｂｉｅＵＶＦｉｘａｂｌｅＶｉａｂｉｌｉｔｙＫｉｔ（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）マウス腹膜炎モデル：ＣＤ８（ＦＩＴＣ、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）、ＣＤ１１ｂ（ＰＥ－Ｃｙ５、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）、ＣＤ１１ｃ（ＰＥ－Ｃｙ５、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）、ＣＤ６９（ＡＰＣ、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）、ＣＤ１０７ａ（ＰＥ／Ｃｙ７、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）、Ｂ２２０（ＰＥ－Ｃｙ５、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）、Ｆ４／８０（ＰＥ－Ｃｙ５、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）、四量体Ｈ－２ＫｂＯＶＡ（ＰＥ、Ｔｅｔｒａｍｅｒｓｃｏｒｅｆａｃｉｌｉｔｙ、ＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆＬａｕｓａｎｎｅ）、ＶｉａｂｉｌｉｔｙＤｙｅ（ＺｏｍｂｉｅＲｅｄ、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ，）。

マウスｉｎｖｉｔｒｏ活性化：
ＣＤ１１ａ（ＦＩＴＣおよびＢＶ４２１、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）、ＬＦＡ－１（ＢＶ４２１、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）、ＣＤ８（ＦＩＴＣ、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）、ＣＤ６９、（ＡＰＣ、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）、ＣＤ１０７ａ（ＰＥ－Ｃｙ７、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）、ＶｉａｂｉｌｉｔｙＤｙｅ（ＡｑｕａＺｏｍｂｉｅ、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）。

ヒトＴ細胞ｉｎｖｉｔｒｏ活性化
ＣＤ１１ａ（ＦＩＴＣまたは非標識、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）、ＣＤ１８（ＰＥまたは非標識、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）、ＣＤ１８（非標識、ＩｎＶｉｖｏＢｉｏＴｅｃｈＳｅｒｖｉｃｅｓＧｍｂＨ）、ＣＤ２５（ＡＰＣ、ＢＤ）、ＣＤ４５ＲＡ（ＰａｃｉｆｉｃＢｌｕｅ、Ｂｅｃｋｍａｎｎ）、ＣＤ６２Ｌ（ＡＰＣ、ＩｍｍｕｎｏＴｏｏｌｓ）、ＣＤ６９（ＰｅｒＣＰ、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）、ＣＤ７１（ＰＥ、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）、ＣＤ１０７ａ（ＡＦ６４７ＢＤおよびＰＥ－Ｃｙ７Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）、ＣＤ９８（ＦＩＴＣ、ＢＤＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）、ｍ２４エピトープＬＦＡ－１（ＰＥＢｉｏｌｅｇｅｎｄ）、ＴＣＲＶベータ１３．１（ＦＩＴＣおよびＰＥ－Ｃｙ７、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）、ＴＮＦ（ＰＥ、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）、ホスホ－ＦＡＫ（Ｔｙｒ３９７、非標識、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）、ＶｉａｂｉｌｉｔｙＤｙｅ（ＡｑｕａＺｏｍｂｉｅ、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ；ＺｏｍｂｉｅＧｒｅｅｎ、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）、二次ヤギ抗マウスＡＦ４８８（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）。

化学物質
ＬＦＡ－１阻害剤試験を、５０μＭのＢＩＲＴ３７７（Ｔｏｃｒｉｓ）を使用して実施した。化学物質は全て、ＤＭＳＯ中でアリコートにし、－２０℃で保存した。

統計分析
統計学的有意性を、Ｐｒｉｓｍ８．０（ＧｒａｐｈＰａｄＳｏｆｔｗａｒｅ、ＵＳＡ）を使用して解析した。０．０５未満のＰ値は、統計学的に有意であると考えられた。

（実施例１：腫瘍内マグネシウム注射は、メモリーＣＤ８Ｔ細胞媒介抗腫瘍免疫を改善する）
ＣＤ８Ｔ細胞は、抗腫瘍免疫にとって必須である。腫瘍の微小環境におけるＭｇ^２＋の役割、そして特にＴ細胞免疫に及ぼすその機能的影響を調べるために、本発明者らは、ＭＣ３８－ＯＶＡ腫瘍モデルにおける腫瘍内（ｉ．ｔ．）Ｍｇ^２＋投与の影響を調べた。具体的には、マウスを、オボアルブミン（ＯＶＡ）に対して免疫化するか、または無処置のままとし、その後ＯＶＡ発現ＭＣ３８結腸直腸癌細胞を両側の脇腹皮下に移植した。７日目以降、右側の腫瘍に、３ｍＭＭｇＣｌ２を繰り返し注射し、左側の対照腫瘍に３ｍＭＮａＣｌ溶液を受容させた（図１ａ、実験スキーム）。腫瘍の成長は、免疫化していないマウスでは、ＭｇＣｌ_２とＮａＣｌ処置の間で同等であったが、事前に免疫化したマウスでは腫瘍内ＭｇＣｌ_２投与は、腫瘍の成長を有意に低減させ、腫瘍内Ｍｇ^２＋濃度の増加により、メモリーＴ細胞媒介抗腫瘍免疫が特異的に強化されたことを示した（図１ｂ）。ＯＶＡ免疫化は、腫瘍の拒絶において重要な役割を果たすメモリーＣＤ８^＋Ｔ細胞を含むＯＶＡ特異的メモリーＴ細胞を誘導し、およびＣＤ８枯渇実験は、Ｍｇ^２＋が、ＣＤ８^＋Ｔ細胞を介してその効果を発揮することを確立した（図１Ｃ）。それゆえ、本発明者らは、腫瘍内Ｍｇ^２＋が、メモリーＣＤ８^＋Ｔ細胞区画にどのように影響を及ぼしたかをさらに規定することを求めた。フローサイトメトリーを使用して、本発明者らは、腫瘍浸潤免疫細胞を計数し、表現型を決定した。特に、腫瘍浸潤性ＣＤ８^＋Ｔ細胞の数は、Ｍｇ^２＋処置群で増加した（図１Ｄ）。その数が増加したことと一致して、より多くのＭｇ^２＋処置ＣＤ８^＋Ｔ細胞がＫｉ６７を発現した（図１Ｅ、左のパネル）。加えて、より多くのＭｇ^２＋曝露ＣＤ８^＋Ｔ細胞が、グランザイムＢを含有し、活性化マーカーＣＤ２５を発現した（図１Ｅ、中央および右のパネル）。増加した活性化をさらに反映して、ＰＤ－１およびＴＩＭ３もまた、Ｍｇ^２＋処置ＣＤ８^＋Ｔ細胞において有意により頻繁に（同時）発現された（図１Ｆ）。

次に、本発明者らは、ＭｇＣｌ_２処置をＰＤ１遮断と組み合わせると、メモリーＣＤ８^＋Ｔ細胞の腫瘍抑制能を相乗的に改善し得るか否かを調べた（図１Ｇ、実験スキーム）。腫瘍内ＭｇＣｌ２をＰＤ－１遮断と組み合わせて受容したマウスは、他の処置レジメンと比較して腫瘍成長の制御に関して顕著に優れており、ＭｇＣｌ_２は単独で免疫制御を有意に改善した（図１Ｈ）。腫瘍内ＭｇＣｌ_２適用は、単独でＮａＣｌ処置対照群と比較して有意に改善された動物の生存をもたらしたが、ＭｇＣｌ２をＰＤ１遮断と組み合わせると、さらなる生存利益をもたらした（図１Ｉ）。

併せて考慮すると、本発明者らのデータは、腫瘍内Ｍｇ^２＋適用が、メモリーＣＤ８Ｔ細胞の抗腫瘍活性を強化すること、および腫瘍内Ｍｇ^２＋濃度の増加が、ＰＤ－１遮断と相乗的に作用して、改善された腫瘍抑制をもたらしたことを実証した。これらの実験は全て、Ｍｇ^２＋が、メモリーＣＤ８^＋Ｔ細胞依存的腫瘍制御の重要なモジュレーターであると同定した。

（実施例２：細胞外マグネシウムは、ＬＦＡ－１安定化を介したＬＦＡ－１^ｈｉｇｈＴ細胞のＴ細胞活性化を可能にした）
Ｍｇ^２＋制限条件下で観察されたメモリー細胞特異的活性化欠損を、ｉｎｖｉｔｒｏで再現できるか否かを決定するために、本発明者らは、初代ヒトエフェクターメモリー（ＥＭ）およびナイーブＣＤ８Ｔ細胞を用いて代謝フラックス解析を実施した。この方法は、Ｔ細胞が、活性化時に「解糖スイッチ」と呼ばれる好気性の解糖の即時上方調節を示し、Ｔ細胞がＩＦＮγの急速な産生などのエフェクター能を獲得することを可能にすることから、Ｔ細胞活性化をリアルタイムでモニタリングすることを可能にする（Gubser PM, Bantug GR, Razik L, et al. Rapid effector function of memory CD8⁺ T cell requires an immediate-early glycolytic switch. Nat Immunol. 2013;14(10):1064-1072. doi:10.1038/ni.2687）。解糖フラックスプロファイルの解析から、ＥＭＣＤ８Ｔ細胞の解糖スイッチング（ｇｌｙｃｏｌｙｔｉｃｓｗｉｔｃｈｉｎｇ）が、Ｍｇ^２＋の非存在下では鈍化することが明らかとなった。特に、活性化欠損は、ＣＤ２８を通しての共刺激とは無関係であり、活性化直前にＭｇ^２＋を添加し戻す（add-back）と完全に逆転可能であった（図２ａ）。これに対し、ナイーブＣＤ８Ｔ細胞は、Ｍｇ^２＋の非存在下で解糖の活性化誘導上方調節が損なわれなかったことを示した（図２ｂ）。これらのデータは、（ｉ）以前のｉｎｖｉｖｏ実験で見出された、Ｍｇ^２＋制限条件下でのメモリーＴ細胞特異的機能障害を、ｉｎｖｉｔｒｏで再現できること、（ｉｉ）細胞外Ｍｇ^２＋の非存在が、ＥＭＣＤ８Ｔ細胞において近位ＴＣＲシグナル伝達に影響を及ぼし、次にこれが解糖スイッチングを妨害すること、および（ｉｉｉ）ＥＭＣＤ８Ｔ細胞の鈍化した解糖スイッチングを、活性化直前にＭｇ^２＋を添加し戻すことによって完全に逆転できることを示し、このことは、Ｍｇ^２＋枯渇条件に起因する非可逆的な細胞損傷に反論するものである。次に、本発明者らは、２４時間にわたる中等度のＴＣＲ刺激（プレート結合抗ＣＤ３および可溶性抗ＣＤ２８Ａｂ）時のＥＭＣＤ８Ｔ細胞における表面活性化の発現を評価した。細胞外Ｍｇ^２＋の非存在下では、ＥＭＣＤ８Ｔ細胞は、Ｔ細胞活性化マーカー、例えば初期および後期活性化（それぞれ、ＣＤ６９およびＣＤ２５）；代謝リプログラミング（ＣＤ７１、ＣＤ９８）、および脱顆粒（ＣＤ１０７ａ）の指標を上方調節することができなかった（図２ｃ）。これらの同じアッセイウェルからのサイトカイン分泌の測定により、Ｍｇ^２＋制限条件でＩＦＮγ、ＴＮＦ、およびＩＬ－２の産生が減少することが明らかとなった（図２ｄ）。ヒトナイーブおよびＥＭＣＤ８Ｔ細胞ならびにＰＨＡ芽球におけるＣＤ１１ａ表面発現の解析は、ナイーブＣＤ８Ｔ細胞が、ＥＭＣＤ８Ｔ細胞またはＰＨＡ芽球と比較して有意により低いＣＤ１１ａの表面発現を有したことを明らかにした。一方、ＰＨＡ芽球はＣＤ１１ａの最高の発現レベルを示した（図２ｅ）。ＬＦＡ－１は、３つのコンフォメーション状態、すなわち閉鎖型頭部を有する折れ曲がりコンフォメーション、閉鎖型頭部を有する伸長したコンフォメーション、および開放型頭部を有する伸長したコンフォメーションを有することが公知であり、これらはそれぞれ低、中等度、および高親和性状態に対応する（Zhang K, Chen J. The regulation of integrin function by divalent cations. Cell Adh Migr. 2012;6(1):20-29）。休止Ｔ細胞では、ＬＦＡ－１は、主にその不活性な／折れ曲がりコンフォメーションで存在し、ＴＣＲ刺激に応答して、ＬＦＡ－１は、低親和性状態から高親和性状態へと変換する。この変換は、Ｍｇ^２＋に高い親和性で結合する金属イオン依存的接着部位（ＭＩＤＡＳ）によって調整される。したがって、メモリーＣＤ８Ｔ細胞がＭｇ^２＋依存的であるが、ナイーブＣＤ８Ｔ細胞の活性化がＭｇ^２＋非依存的であるように思われるという所見は、ＬＦＡ－１^ｈｉｇｈをよりＭｇ^２＋依存的にするＴ細胞亜集団における示差的ＬＦＡ－１発現パターンを考慮すると矛盾しない。ｍＡｂＴＳ２／４は、アセンブルされたＣＤ１１ａ／ＣＤ１８ヘテロ二量体のみに存在するＣＤ１１ａ上のエピトープにマッピングされる。ＴＳ２／４エピトープの存在量は、細胞外Ｍｇ^２＋濃度ならびにＴ細胞活性化状態とは無関係であった（図２ｆ）。ｍＡｂＨＩ１１１は、不活性な／折れ曲がりＬＦＡ－１コンフォメーションを報告する（図２ｇ）。ＰＨＡＴ細胞芽球は、減少する細胞外Ｍｇ^２＋濃度でＴＣＲ刺激時により高レベルの不活性なＬＦＡ－１を示した。Ｋｉｍ１２７は、折れ曲がった不活性なインテグリンでは隠れているが、インテグリンが伸長した際に露出するＣＤ１８のエピトープに結合する。本発明者らは、増加する細胞外Ｍｇ^２＋濃度によるＴ細胞活性化時に、用量依存的なＫＩＭ１２７シグナルの増加を観察した（図２ｈ）。ＬＦＡ－１の伸長／開放型高親和性コンフォメーションは、例えばフローサイトメトリーによってｍ２４抗体を使用して定量することができる。ＫＩＭ１２７によって報告されたＬＦＡ－１の伸長と一致して、頭部の開放もまた、細胞外Ｍｇ^２＋濃度に強く依存した（図２ｉ）。ＬＦＡ－１活性化およびその後の外側から内側へのシグナル伝達（ｏｕｔｓｉｄｅ－ｉｎｓｉｇｎａｌｌｉｎｇ）は、フォーカルアドヒージョンキナーゼ（ＦＡＫ）のリン酸化をもたらした。Ｍｇ^２＋利用能に関連するこの初期のＬＦＡ－１下流のシグナルを調べるために、本発明者らは、活性化Ｔ細胞芽球におけるＦＡＫリン酸化を評価した。Ｍｇ^２＋制限条件での低減されたＬＦＡ－１の伸長ならびに頭部開放と一致して、ＦＡＫリン酸化も同様に減少した（図２ｊ）。さらに、活性化誘導サイトカイン産生の評価は、細胞外Ｍｇ^２＋濃度に対する用量依存性の類似のパターンを示した（図２ｋ）。ＥＭＣＤ８Ｔ細胞は、Ｍｇ^２＋制限条件で低減された活性化誘導ＬＦＡ－１頭部開放を示したが、中等度のＴＣＲ刺激は、いずれの条件下でもナイーブＣＤ８Ｔ細胞においてＬＦＡ－１頭部開放を誘導しなかった（図２ｌ）。その上、アロステリックＬＦＡ－１阻害剤であるＢＩＲＴ３７７を使用して、ＬＦＡ－１をその不活性な閉鎖型コンフォメーションで安定化させると、Ｍｇ^２＋の存在下で活性化によって誘導されるＬＦＡ－１頭部開放が妨げられた（図２ｏ）。特に、ＬＦＡ－１活性化は、非刺激Ｔ細胞におけるＭｇ^２＋の存在および非存在の間で差がなかった（データは示していない）。Ｔ細胞活性化の過程でのＬＦＡ－１の伸長および頭部開放の阻害は、解糖スイッチングの障害（図２ｐ）ならびに脱顆粒の減少（図２ｑ）をもたらした。

全体として、これらのデータは、低減した存在量の折れ曲がりＬＦＡ－１、ならびにＭｇ^２＋がＭＩＤＡＳに結合することによって媒介されるその後の伸長および頭部開放が、ＬＦＡ－１^ｈｉｇｈ細胞の活性化にとって極めて重要であることを示した。細胞外環境にＭｇ^２＋が存在しないこと、または折れ曲がり／低親和性コンフォメーションでＬＦＡ－１を薬理学的に強制的に安定化させることは、Ｔ細胞活性化の鈍化をもたらした。したがって、本発明者らは、ＬＦＡ－１^ｈｉｇｈＴ細胞の活性化が中等度のＬＦＡ－１安定化特性を有するメディエーターを必要とすると結論付ける。

（実施例３：マグネシウムは、ＬＦＡ－１安定化の中等度のモジュレーションを介して細胞傷害性Ｔ細胞活性を調節する－強いＬＦＡ－１安定化はマグネシウム－ＬＦＡ－１軸を無効にする）
細胞外Ｍｇ^２＋が、ＬＦＡ－１を介してそのＴ細胞調節活性を媒介するか否かを解明するために、本発明者らは、ＬＦＡ－１－欠損（ＬＦＡ－１^－／－）Ｔ細胞による実験を行うことによって本発明者らの仮説の遺伝的検証を試みた。本発明者らの以前の知見に従って、ＬＦＡ－１^－／－Ｔ細胞の活性化は、細胞外Ｍｇ^２＋濃度によって変更されないことが予想された。第１の試みでは、本発明者らは、代謝フラックス解析によって活性化誘導解糖スイッチングをモニターした。野生型（ＷＴ）細胞傷害性リンパ球（ＣＴＬ）は、Ｍｇ^２＋枯渇条件では、解糖スイッチングの低減を示したが、ＬＦＡ－１^－／－ＣＴＬの活性化は、好気性解糖の上方調節の低減をもたらし、これは実際に細胞外Ｍｇ^２＋濃度とは無関係であった（図３ａ）。好気性解糖の上方調節のほかに、ＴＣＲ刺激はまた、細胞外カルシウム（Ｃａ^２＋）の急速な流入ももたらした。細胞質Ｃａ^２＋は、極めて重要な二次メッセンジャーであり、完全なＴ細胞活性化にとって必要である。代謝フラックス解析と一致して、細胞外Ｍｇ^２＋濃度の枯渇は、ＷＴＪｕｒｋａｔＴ細胞においてＣａ^２＋流入の減少をもたらしたが、ＬＦＡ－１^－／－ＪｕｒｋａｔＴのＣａ^２＋流入は低減された。この場合も、この低減は、細胞外Ｍｇ^２＋濃度とは無関係であった（図３ｂ）。細胞外Ｍｇ^２＋枯渇または遺伝的欠失のいずれかに起因するＬＦＡ－１機能性の欠如は、即時のＣａ^２＋流入を低減させたが、さらにより明らかに長期間の持続的なＣａ^２＋流入の非存在をもたらした。持続的なＣａ^２＋流入は、完全なＴ細胞活性化にとって必要であり、免疫シナプスへのミトコンドリアのトランスロケーションによって媒介され、そこでそれらが局所的に高いＣａ^２＋濃度を緩衝化し、それによって膜Ｃａ^２＋チャネルの開口を延長させることが報告されている（Quintana, A., Schwindling, C., Wenning, A. S., Becherer, U., Rettig, J., Schwarz, E. C., & Hoth, M. (2007). T cell activation requires mitochondrial translocation to the immunological synapse. Proceedings of the National Academy of Sciences, 104(36), 14418-14423）。したがって、本発明者らは、中等度のＬＦＡ－１安定化特性を有するＬＦＡ－１メディエーターとして作用する細胞外Ｍｇ^２＋が、免疫シナプスにおいて多分子シグナル伝達複合体のアセンブリを統合し、それによってＴ細胞活性化を形成すると結論付ける。次に、本発明者らは、細胞傷害性Ｔ細胞活性に関する中等度のＬＦＡ－１安定化の重要性を評価した。したがって、本発明者らは、ＷＴおよびＬＦＡ－１^－／－ＣＴＬを活性化し、フローサイトメトリーによって脱顆粒を評価した。Ｍｇ^２＋制限またはＢＩＲＴ３７７による薬理学的阻害のいずれかによるＷＴＣＴＬにおけるＬＦＡ－１機能性の阻害は、低減されたＣＴＬ脱顆粒をもたらした。一方、ＬＦＡ－１^－／－ＣＴＬにおける細胞傷害の顆粒放出は、そのようなＬＦＡ－１モジュレーションによって影響を受けなかった（図３ｃ）。同様に、アポトーシス性標的細胞の頻度によって評価したＷＴＣＴＬの細胞傷害は、ＬＦＡ－１機能性が遮断される場合に低減された（図３ｄ）。ＬＦＡ－１^－／－ＣＴＬは、ＷＴＣＴＬと比較して顕著に減少した細胞傷害能を示したのみならず、ＬＦＡ－１モジュレーションに対して非応答性でもあった。

患者に投与するために十分な数の腫瘍特異的Ｔ細胞を生成するために、急速増大プロトコール（ＲＥＰ）を使用することができる。ＲＥＰＴ細胞は、高いＬＦＡ－１表面発現を示す（図３ｅ）。本発明者らは、ＲＥＰＴ細胞を、同族ペプチドでパルスした腫瘍標的細胞と同時培養し、ＬＦＡ－１コンフォメーションを評価した。本発明者らは、細胞外Ｍｇ^２＋の存在下で不活性な、折れ曲がりコンフォメーションの存在量の低減を観察し（図３ｆ）、活性化の際のより活性なＬＦＡ－１を支持した。この知見と一致して、開放頭部を有する（図３ｈ）伸長ＬＦＡ－１（図３ｇ）が有意に増加した。同様に、ＦＡＫリン酸化は、細胞外Ｍｇ^２＋の存在下で有意に増加し、その後の脱顆粒（図３ｆ）および細胞傷害（図３ｇ）も有意に増加した。Ｍｇ^２＋制限またはＢＩＲＴ３７７適用のいずれかによってＬＦＡ－１を阻害すると、脱顆粒または標的細胞死滅の低減をもたらした（図３ｆ～ｋ）。ＣＤ１９陽性細胞に結合してこれを除去するためにＴ細胞に係合するＣＤ３／ＣＤ１９二特異性抗体であるブリナツモマブ（Ｂｌｉｎｃｙｔｏ（登録商標））の使用は、Ｂ細胞悪性疾患の臨床転帰を改善した。その作用様式を考慮して、本発明者らは、ブリナツモマブの有効性に及ぼすＭｇ^２＋の影響を試験することを目標とした。ブリナツモマブ媒介細胞傷害は、その報告された治療範囲（２３０～６２０ｐｇｍｌ^－１）で、Ｍｇ^２＋の利用能に強く依存したが（図３ｌ）、ＬＦＡ－１頭部開放も同様にＭｇ^２＋依存的であった。

著者らは、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）Ｔ細胞の細胞傷害活性、別の養子細胞に基づく免疫療法もＬＦＡ－１の高い表面発現を示し（図３ｎ）、同様に細胞外Ｍｇ^２＋に依存することを見出した。時間経過死滅アッセイは、Ｍｇ^２＋制限により、ｉｎｖｉｔｒｏで腫瘍標的細胞に対するＣＡＲＴ細胞の細胞溶解活性が損なわれたことを明らかにした（図３ｏおよび同時に低減された炎症性ＩＦＮγ放出（図３ｐ））。食事制限を通して全身のＭｇ^２＋を低減させることが、ｉｎｖｉｖｏでのＣＡＲＴ細胞媒介細胞傷害に影響を及ぼし得るか否かを調べるために、腫瘍拒絶実験を実施した。実際に、食事性Ｍｇ^２＋制限は、ｉｎｖｉｖｏでＣＡＲＴ細胞媒介腫瘍拒絶に負の影響を及ぼすために十分であった（図３ｑ）。これらの実験は、養子細胞に基づく新規免疫療法の有効性が、細胞外Ｍｇ^２＋によって媒介される中等度のＬＦＡ－１安定化に依存し、そのような治療を受けている患者におけるＭｇ^２＋状態の評価の重要性を強調することを際立たせた。

特に、Ｍｇ^２＋に関するＥＭＣＤ８^＋Ｔ細胞の感受性は、ＣＤ３／２８標的化ｍＡｂと架橋する二次抗抗体の注射によって達成される超生理的活性化の状況では失われる（図４ａ）。これに一致して、抗ＣＤ３抗体の濃度を高めることによってＴＣＲ刺激の強度を増加させると、細胞外Ｍｇ^２＋に対するＰＨＡＴ細胞芽球の依存性があまり顕著でなくなり（図４ｂ）、このことは、Ｍｇ^２＋が、中等度の／生理的刺激の状況でＬＦＡ－１^ｈｉｇｈＴ細胞の活性化を微細に調節することを示唆した。ＯＶＡバリアントペプチド（ＯＴ－Ｉに対する親和性：Ｇ４＜Ｈ７＜Ｒ７）を使用して、特異的標的細胞溶解の調節におけるＭｇ^２＋－ＬＦＡ－１システムの重要性を、ＴＣＲ親和性のスペクトルにわたり確認した（図４ｃ）。これらのデータは、細胞溶解が、Ｍｇ^２＋－ＬＦＡ－１調節機能を必要としたことをさらに確認した。これは、ポリクローナルＷＴおよびＬＦＡ－１^－／－ＣＴＬによるｉｎｖｉｔｒｏ細胞傷害アッセイによってさらに確認された：低いＰＨＡ濃度（１μｇｍｌ^－１）は、いずれの条件でも細胞傷害活性をもたらさず、中間のＰＨＡ濃度（１０μｇｍｌ^－１）は、ＷＴＣＴＬにおいてＭｇ^２＋依存的効果を示したが、ＬＦＡ－１^－／－ＣＴＬは、ＷＴＣＴＬと比較して損なわれた細胞傷害能を示した。興味深いことに、高いＰＨＡ濃度（１００μｇｍｌ^－１）は、細胞外Ｍｇ^２＋の存在下または非存在下およびＬＦＡ－１遺伝子型の間の差を等しくし、全体的に高い細胞溶解性エフェクター機能をもたらした（図４ｄ）。その上、ＬＦＡ－１活性化モノクローナル抗体を使用すると、ＲＥＰＴ細胞は細胞外Ｍｇ^２＋濃度に非依存性となったが、非特異的細胞傷害も増加した（図４ｅ）。

これらの結果は、（ｉ）細胞外Ｍｇ^２＋がその中等度のＬＦＡ－１安定化特性を介してＬＦＡ－１^ｈｉｇｈＴ細胞において低から中等度のＴＣＲ刺激を増幅し、ＬＦＡ－１^－／－Ｔ細胞と比較して優れたＴ細胞活性化およびその後の細胞傷害性エフェクター機能をもたらしたこと、（ｉｉ）強いＬＦＡ－１安定化剤、例えば抗体を使用すると、非特異的標的細胞死滅をもたらしたことを示唆した。したがって、例えば、Ｍｇ^２＋によって媒介されるＬＦＡ－１の中等度の安定化は、生理的Ｔ細胞活性化にとって不可欠であり、新規治療戦略を直接知らせることができた。

Claims

がん免疫療法における使用のための組成物であって
（ａ）がんに対する免疫応答を増強する免疫系モジュレーターと、
（ｂ）抗がん免疫応答を有意に増強する、中等度のＬＦＡ－１安定化特性を有するＬＦＡ－１シグナル伝達メディエーターと
を含む、組成物。
前記ＬＦＡ－１シグナル伝達メディエーターが、腫瘍関連抗原を提示する細胞の選択的Ｔ細胞媒介死滅を誘導する、請求項１に記載の使用のための組成物。
前記中等度のＬＦＡ－１安定化特性を有するＬＦＡ－１シグナル伝達メディエーターが、強いＬＦＡ－１安定化特性を有するシグナル伝達メディエーターよりも、腫瘍関連抗原を提示しない細胞のＴ細胞媒介死滅を少なく誘導する、請求項１または２に記載の使用のための組成物。
前記強いＬＦＡ－１安定化特性を有するＬＦＡ－１シグナル伝達メディエーターがＣＢＲＬＦＡ－１／２である、請求項３に記載の使用のための組成物。
前記ＬＦＡ－１シグナル伝達メディエーターが金属イオン依存的接着部位に結合する、請求項１～４に記載の使用のための組成物。
前記ＬＦＡ－１シグナル伝達メディエーターが二価カチオンである、請求項１～５に記載の使用のための組成物。
前記二価カチオンがＭｇ^２＋である、請求項６に記載の使用のための組成物。
前記免疫系モジュレーターが、モノクローナル抗体、改変免疫細胞、またはチェックポイント阻害剤（ＣＰＩ）である、請求項１～７のいずれか一項に記載の使用のための組成物。
前記チェックポイント阻害剤がＰＤ－１／ＰＤＬ１阻害剤である、請求項８に記載の使用のための組成物。
前記ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１阻害剤が、ニボルマブ、ペンブロリズマブ、セミプリマブ、スパルタリズマブ、アテゾリズマブ、デュルバルマブ、およびアベルマブからなる群より選択される阻害剤である、請求項９に記載の使用のための組成物。
前記ＬＦＡ－１シグナル伝達メディエーターの標的化送達のための担体をさらに含む、請求項１～１０のいずれか一項に記載の使用のための組成物。
前記担体が、膜形成分子である、請求項１１に記載の使用のための組成物。
前記膜形成分子が、カプセル形成脂質である、請求項１２に記載の使用のための組成物。
前記がんが、乳がん、脳がん、血液形成臓器のがん、免疫系のがん、前立腺がん、肺がん、結腸がん、頭頸部がん、皮膚がん、卵巣がん、子宮内膜がん、子宮頸がん、腎臓がん、肺がん、胃がん、小腸がん、肝臓がん、膵臓がん、精巣がん、下垂体がん、血液のがん、脾臓がん、胆嚢がん、胆管がん、食道がん、唾液腺がん、および甲状腺がんからなる群より選択される、請求項１～１３のいずれか一項に記載の使用のための組成物。
前記がんが、固形腫瘍であり、前記ＬＦＡ－１シグナル伝達メディエーターが腫瘍内注射を介して投与される、請求項１～１４のいずれか一項に記載の使用のための組成物。