JP2019140988A - モノクローナル抗体および非特異反応抑制剤 - Google Patents
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- G01N33/6854—Immunoglobulins
- G01N33/686—Anti-idiotype
Abstract
Description
1.受託番号NITE BP−02557のハイブリドーマにより産生される、イヌIgMに対するモノクローナル抗体。
2.受託番号NITE BP−02557のハイブリドーマ。
3.前記1に記載のモノクローナル抗体を含有する、免疫測定法用の非特異反応抑制剤。
4.前記モノクローナル抗体の含有量が0.5μg以上20μg以下である、前記3に記載の非特異反応抑制剤。
5.前記免疫測定法が、イムノクロマトグラフ法である前記3または4に記載の非特異反応抑制剤。
6.前記3〜5のいずれか1に記載の非特異反応抑制剤を含有する、イムノクロマトグラフ用テストストリップ。
7.前記3〜5のいずれか1に記載の非特異反応抑制剤を含有する、イムノクロマトグラフ用テストキット。
8.検体中の被検出物質を特異的に検出するための免疫測定法において、前記3〜5のいずれか1に記載の非特異反応抑制剤の存在下に免疫反応を行わせる、免疫測定法。
9.前記免疫測定法が、酵素免疫測定法、凝集法又はイムノクロマトグラフ法である前記8に記載の免疫測定法。
10.前記免疫測定法が、イムノクロマトグラフ法である前記8に記載の免疫測定法。
(1)寄託機関名:独立行政法人製品評価技術基盤機構 特許微生物寄託センター
(2)連絡先:〒292−0818 日本国千葉県木更津市かずさ鎌足2−5−8 122号室 電話番号0438−20−5580
(3)受託番号:NITE BP−02557
(4)識別のための表示:Anti−Dog IgM No.69
(5)原寄託日:2017年10月10日
イヌIgM(Rockland社製、製品名DOG IgM Whole molecule)を免疫原として抗イヌIgM抗体のモノクローナル抗体を、次のように常法に従って作製した。100μgの上記イヌIgMと等量のAduvant Complete Freund(Difco)を混合して、マウス(BALB/c、5週齢、日本SLC)に3回免疫し、その脾臓細胞を細胞融合に用いた。細胞融合には、マウスの骨髄腫細胞であるSp2/0−Ag14細胞(Shulmanら、Nature,276,269−270,1978)を用いた。細胞の培養には、Dulbecco’s Modified Eagle Medium(Gibco)にL−グルタミン 0.3mg/ml、ペニシリンGカリウム 100単位/ml、硫酸ストレプトマイシン 100μg/ml、Gentacin 40μg/mlを添加し(DMEM)、これに牛胎児血清(JRH)を10%となるように加えた培養液を用いた。細胞融合は、免疫マウスの脾臓細胞とSp2/0−Ag14細胞を混合し、そこにPolyethylene glycol solution(Sigma)を添加することにより行った。融合細胞はHAT−DMEM[0.1mM Sodium Hypoxantine、0.4μM Aminopterinおよび0.016mM Thymidine(Gibco)を含む血清加DMEM]で培養し、酵素免疫測定法(ELISA法)により培養上清中の抗体産生を確認した。抗体産生陽性の細胞をHT−DMEM[0.1mM Sodium Hypoxantineおよび0.16mM Thymidineを含む血清加DMEM]で培養し、さらに血清加DMEMで培養を続けた。
検体として、非特異反応を示すヒト血清を用い、上記作製したモノクローナル抗体、及び、従来公知の異好性阻止試薬HBRによる免疫測定法の非特異反応抑制効果を評価した。
具体的には、図1に示すように、バッキングシート6上に、検出部4を有するメンブレンパッド3と、サンプルパッド1と、コンジュゲートパッド2と、吸収パッド5とを形成したテストストリップ、及び展開試料を以下のとおり作製し、イムノクロマトグラフ法により測定を行い、非特異反応抑制効果を評価した。
サンプルパッドとして、グラスファイバーからなる不織布(ミリポア社製:300mm×30mm)を用いた。
(2)コンジュゲートパッドの作製
金コロイド懸濁液(田中貴金属工業社製:LC40nm)0.5mlに、リン酸緩衝液(pH7.4)で0.05mg/mlの濃度になるように希釈した抗ジカウイルスNS1抗体(Aaltobioreagent社製、製品名Anti−Zika virusN
S1 Antibody)を0.1ml加え、室温で10分間静置した。
次いで、1質量%のウシ血清アルブミン(BSA)を含むリン酸緩衝液(pH7.4)を0.1ml加え、更に室温で10分間静置した。その後、十分撹拌した後、8000×gで15分間遠心分離を行い、上清を除去した後、1質量%のBSAを含むリン酸緩衝液(pH7.4)を0.1ml加えた。以上の手順で標識試薬を作製した。
上記作製した標識試薬300μLに300μLの10質量%トレハロース水溶液と1.8mLの蒸留水を加えたものを12mm×300mmのグラスファイバーパッド(ミリポア社製)に均一になるように添加した後、真空乾燥機にて乾燥させ、コンジュゲートパッドを作製した。
メンブレンとしてニトロセルロースからなるシート(ミリポア社製、商品名:HF120、300mm×25mm)を用いた。
次に、5質量%のイソプロピルアルコールを含むリン酸緩衝液(pH7.4)で1.0mg/mlの濃度になるように、抗ジカウイルスNS1抗体(Aaltobioreagent社製、製品名Anti−Zika virusNS1 Antibody)を希釈した溶液150μLを、乾燥されたメンブレン上の検出部に1mmの幅でイムノクロマト用ディスペンサー「XYZ3050」(BIODOT社製)を用いて1μL/mmの量(1シートあたり25μL)でライン状に塗布した。
また、金ナノ粒子標識試薬の展開の有無や展開速度を確認するために検出部の下流に、金ナノ粒子標識物質と広く親和性を有するヤギ由来抗血清をリン酸緩衝液(pH7.4)で希釈した液をコントロール部位(コントロールライン)に塗布した。その後、50℃で30分間乾燥させ、室温で一晩乾燥させた。
(4)テストストリップの作製
検出部を有するメンブレンパッドに、サンプルパッド、コンジュゲートパッド、及びグラスファイバー製の不織布からなる吸収パッドを順次貼り合わせた。そして、裁断機で幅が5mmとなるように裁断し、バッキングシート(倉本産業社製、製品名イムノクロマト用バッキングシート)上に貼り付け、テストストリップとした。なお、コンジュゲートパッドの試料展開方向の長さを12mmとした。
(5)展開試料の調製
非特異反応を示すヒト血清(SCIPAC社製、製品名Normal Female Serum)を検体とし、検体30μL、0.5%Triton X−100を含むPBS溶液60μL、及び上記作製した実施例または比較例のモノクローナル抗体各4μg、あるいはHBR(Scantibody社製)4μgを混合し、展開試料を調製した。また、上記抗体の代わりにPBS10μLを使用したものをコントロールとした。
(6)測定
上記作製したテストストリップ及び展開試料を用いて、以下の方法で非特異反応抑制効果を試験した。
展開試料150μLをテストストリップのサンプルパッドに添加し展開させ、15分後にイムノクロマトリーダーを用いて、検出部の発色強度(450nmの吸光度)を測定した。その結果を表1に示す。
また、判定方法を以下に示す。
○:検出部の発色が目視で認識されない
×:検出部の発色が目視で認識される
2 コンジュゲートパッド
3 メンブレンパッド
4 検出部
5 吸収パッド
6 バッキングシート
Claims (10)
- 受託番号NITE BP−02557のハイブリドーマにより産生される、イヌIgMに対するモノクローナル抗体。
- 受託番号NITE BP−02557のハイブリドーマ。
- 請求項1に記載のモノクローナル抗体を含有する、免疫測定法用の非特異反応抑制剤。
- 前記モノクローナル抗体の含有量が0.5μg以上20μg以下である、請求項3に記載の非特異反応抑制剤。
- 前記免疫測定法が、イムノクロマトグラフ法である請求項3または4に記載の非特異反応抑制剤。
- 請求項3〜5のいずれか1項に記載の非特異反応抑制剤を含有する、イムノクロマトグラフ用テストストリップ。
- 請求項3〜5のいずれか1項に記載の非特異反応抑制剤を含有する、イムノクロマトグラフ用テストキット。
- 検体中の被検出物質を特異的に検出するための免疫測定法において、請求項3〜5のいずれか1項に記載の非特異反応抑制剤の存在下に免疫反応を行わせる、免疫測定法。
- 前記免疫測定法が、酵素免疫測定法、凝集法又はイムノクロマトグラフ法である請求項8に記載の免疫測定法。
- 前記免疫測定法が、イムノクロマトグラフ法である請求項8に記載の免疫測定法。
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