JP2018534246A - スフィンゴ糖脂質の糖鎖エピトープに対する抗体に結合する炭水化物リガンド - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、神経系のスフィンゴ糖脂質の糖鎖エピトープに対する抗体に結合する、炭水化物リガンドおよび部分のそれぞれ、これらの炭水化物リガンドを含むポリマー、ならびに神経疾患の診断および治療におけるそれらの使用に関する。
様々な神経疾患が、抗グリカン抗体の存在、またはレベル上昇に関連している。抗糖脂質抗体、詳細には抗ガングリオシド抗体は、種々の神経病理状態、例えば多発性硬化症、パーキンソン病、アルツハイマー病、認知症、筋萎縮性側索硬化症(ALS)、慢性炎症性脱髄性多発ニューロパチー(CIDP)、ギラン・バレー症候群(GBS)(亜型の急性運動性軸索型ニューロパチー(AMAN)、急性運動感覚性軸索型ニューロパチー(AMSAN)、および急性炎症性脱髄性多発ニューロパチー(AIDP)を含む)、ミラー・フィッシャー症候群(MFS)および多巣性運動ニューロパチー(MMN)を含む自己免疫介在性ニューロパチーにおいて検出されている(K. Kollewe et al., Plos One 2015, 10)。
本発明は、神経系のスフィンゴ糖脂質の糖鎖エピトープに対する抗体に結合する、炭水化物リガンドおよび部分のそれぞれ、これらの炭水化物リガンドを含むポリマー、ならびに神経疾患の診断および治療におけるそれらの使用に関する。特に本発明は、神経系のスフィンゴ糖脂質で構成される糖鎖エピトープ、詳細には神経疾患に関連する抗グリカン抗体が結合するセレブロシド、(ネオ)ラクト型、ガングリオ型およびスルホグルクロニルパラグロボシド型のスフィンゴ糖脂質で構成される糖鎖エピトープを模倣する、炭水化物リガンドおよび部分のそれぞれに関する。本発明は、抗グリカン抗体に関連する神経疾患の診断における、ならびに処置のための、これらの炭水化物リガンドおよび部分のそれぞれの使用に関する。
RI2は、H、SO3H、または
RI3は、Hまたは
RI4は、Hまたは
RI5およびRI6は、独立して、Hまたは
RI7は、Hまたは
式(II)が、
RII2は、Zまたは
前記リンカーZが、−N(Ra)−A−B−CH2−(CH2)q−SHであり、ここでRaが、H、C1〜C4−アルキル、C1〜C4−アルコキシ、CH2C6H5、CH2CH2C6H5、OCH2C6H5、またはOCH2CH2C6H5であり;Aが、C1〜C7−アルキレン、C1〜C7−アルコキシ、C1〜C4−アルキル−(OCH2CH2)pO−C1〜C4−アルキル、またはC1〜C7−アルコキシ−Rbであり、Rbが、任意選択で置換されたアリールまたは任意選択で置換されたヘテロアリールであり、pが、0〜6であり、好ましくはpが、1、2または3であり、さらに好ましくはpが、1であり;Bが、NHC(O)、SまたはCH2であり;qが、0〜6であり、好ましくはqが、1、2、3または4であり、さらに好ましくはqが、1または2であり;前記リンカーZが、前記炭水化物部分の還元末端に−N(Ra)−基を介して共有結合している、化合物を提供する。
本発明の化合物、特に式(I)または(II)の本発明の化合物は、神経系のスフィンゴ糖脂質の糖鎖エピトープ、詳細にはセレブロシド型、(ネオ)ラクト型、およびガングリオ型などのスフィンゴ糖脂質で構成される糖鎖エピトープに対する抗グリカン抗体を認識する。炭水化物リガンドは、多価で提示するためにポリマー骨格へのカップリングを可能にするリンカーを含有する。カップリングから得られた糖鎖ポリマーは、各グリカンモノマーと比較して、抗炭水化物抗体の分離という点において優れている。該糖鎖ポリマーは、特に神経疾患に関連する抗グリカン抗体を検出する、およびそれに結合する適切な診断または治療薬である。
RI3は、Hまたは
RI4は、Hまたは
RI5およびRI6は、独立して、Hまたは
RI7は、Hまたは
そして式(II)が、
RII2は、Zまたは
前記リンカーZが、−N(Ra)−A−B−CH2−(CH2)q−SHであり、ここでRaが、H、C1〜C4−アルキル、C1〜C4−アルコキシ、CH2C6H5、CH2CH2C6H5、OCH2C6H5、またはOCH2CH2C6H5であり;Aが、C1〜C7−アルキレン、C1〜C7−アルコキシ、C1〜C4−アルキル−(OCH2CH2)pO−C1〜C4−アルキル、またはC1〜C7−アルコキシ−Rbであり、Rbが、任意選択で置換されたアリールまたは任意選択で置換されたヘテロアリールであり、pが、0〜6であり、好ましくはpが、1、2または3であり、さらに好ましくはpが、1であり;Bが、NHC(O)、SまたはCH2であり;qが、0〜6であり、好ましくはqが、1、2、3または4であり、さらに好ましくはqが、1または2であり;前記リンカーZが、前記炭水化物部分の還元末端に−N(Ra)−基を介して共有結合している、化合物を提供する。
前記リンカーZは、−N(Ra)−A−B−CH2−(CH2)q−SHであり、ここでRaは、H、C1〜C4−アルキル、C1〜C4−アルコキシ、CH2C6H5、CH2CH2C6H5、OCH2C6H5、またはOCH2CH2C6H5であり;Aは、C1〜C7−アルキレン、C1〜C7−アルコキシ、C1〜C4−アルキル−(OCH2CH2)pO−C1〜C4−アルキル、またはC1〜C7−アルコキシ−Rbであり、Rbは、任意選択で置換されたアリールまたは任意選択で置換されたヘテロアリールであり、pは、0〜6であり、好ましくはpは、1、2または3であり、さらに好ましくはpは、1であり;Bは、NHC(O)、SまたはCH2であり;qは、0〜6であり、好ましくはqは、1、2、3または4であり、さらに好ましくはqは、1または2であり;前記リンカーZは、前記炭水化物部分の還元末端に−N(Ra)−基を介して共有結合している。
(A)アミノ酸が、ポリリジン、特にポリ−L−リジンまたはポリ−D−リジンなどのように側鎖アミノアルキル官能基を含み、アミノ基が、スペーサ部分を介して前記リンカーZのSH−基に連結している、ポリ−α−アミノ酸。典型的なそして好ましいスペーサ部分は、末端CH2基を含み、前記スペーサ部分の前記末端CH2基は、前記リンカーZのS−に連結している。好ましいスペーサ部分は、アセチル基である;
(B)アミノ酸が、ポリアスパラギン酸、ポリグルタミン酸、ポリアスパラギン、またはポリグルタミンなどのように側鎖カルボニルアルキル官能基を含み、カルボニル基(それぞれアスパラギン酸およびグルタミン酸中の本来のカルボキシ基に対応する)が、スペーサ部分を介して前記リンカーZのSH−基に連結している、ポリ−α−アミノ酸(D−およびL−型)。典型的なそして好ましいスペーサ部分は、末端CH2基を含み、前記スペーサ部分の前記末端CH2基は、前記リンカーZのS−に連結している;
(C)アミノ酸が、ポリセリン、ポリトレオニン、ポリチロシン、またはポリヒドロキシプロリンなどのように側鎖ヒドロキシアルキルまたはヒドロキシアリール官能基を含み、ヒドロキシ基が、スペーサ部分を介して前記リンカーZのSH−基に連結している、ポリ−α−アミノ酸(D−およびL−型)。典型的なそして好ましいスペーサ部分は、末端CH2基を含み、前記スペーサ部分の前記末端CH2基は、前記リンカーZのS−に連結している;
(D)アミノ酸が、ポリシステインなどのように側鎖チオアルキル官能基を含み、アミノ酸側鎖の末端CH2基(チオールの次)が、典型的にそして好ましくはチオエーテルとして、リンカーZの末端SH基に連結している、ポリ−α−アミノ酸;
(E)(A)〜(D)に記載される通り、スペーサ部分を介して前記リンカーZのSH−基に連結された2種以上の異なるα−アミノ酸のコポリマー;
(F)カルボキシ基が、スペーサ部分を介して前記リンカーZのSH−基に連結している、ポリアクリル酸、ポリメタクリル酸、またはアクリル酸とメタクリル酸のコポリマー。典型的なそして好ましいスペーサ部分は、末端CH2基を含み、前記スペーサ部分の前記末端CH2基は、前記リンカーZのS−に連結している;
(G)コポリマーのビニルアルコール部分のヒドロキシ基が、スペーサ部分を介して前記リンカーZのSH−基に連結している、N−ビニル−2−ピロリドンとビニルアルコールのコポリマー。典型的なそして好ましいスペーサ部分は、末端CH2基を含み、前記スペーサ部分の前記末端CH2基は、前記リンカーZのS−に連結している;
(H)アミノ基が、スペーサ部分を介して前記リンカーZのSH−基に連結している、キトサン。典型的なそして好ましいスペーサ部分は、末端CH2基を含み、前記スペーサ部分の前記末端CH2基は、前記リンカーZのS−に連結している;
(I)末端エステル基が、スペーサ部分を介して前記リンカーZのSH−基に連結している、ポリホスファゼンポリマー。典型的なそして好ましいスペーサ部分は、末端CH2基を含み、前記スペーサ部分の前記末端CH2基は、前記リンカーZのS−に連結している。好ましいスペーサ部分は、アセチル基である。
R1は、前記リンカーZのSH−基が、スペーサ部分を介してR1の末端アミノ基に連結しており、典型的にそして好ましくは、前記スペーサ部分が、アセチル基である、前記リンカーZに連結されたアミノアルキル置換基であり;
R2は、可溶性置換基を有するキャップされたアミノ官能基である、2,3−ジヒドロキシプロピルチオアセチルアミノアルキルであり;
ポリマー内の、それぞれR1およびR2を有する2つの括弧内の式の間の関係は、キャップされたアミノ官能基に対する炭水化物担持の関係を示す)
を含む。
R1は、前記リンカーZに連結されたカルボニルアルキル置換基であり、前記リンカーZのSH−基は、R1の−CH2−基に連結されており、
R2は、2,3−ジヒドロキシプロピルチオカルボニルアルキルであり、
ポリマー内の、それぞれR1およびR2を有する2つの括弧内の式の間の関係は、キャップされたカルボニルまたはカルボキシ官能基に対する炭水化物担持の関係を示す)
を含む。
R2は、2,3−ジヒドロプロピルチオカルボニルアルキル、即ち、可溶性置換基を有するキャップされたカルボキシまたはアミド官能基である。
R1は、前記リンカーZに連結されたヒドロキシアルキルまたはヒドロキシアリール置換基であり、前記リンカーZのSH−基は、R1の−CH2−基に連結されており、
R2は、2,3−ジヒドロキシプロピルチオアセチル−ヒドロキシアルキル(または−ヒドロキシアリール)であり、
ポリマー内の、それぞれR1およびR2を有する2つの括弧内の式の間の関係は、キャップされたヒドロキシ官能基に対する炭水化物担持の関係を示す)
を含む。
R1は、前記リンカーZに連結されたチオアルキル置換基であり、前記リンカーZのSH−基は、R1の−CH2−基に連結されており、
R2は、2,3−ジヒドロキシプロピルチオアルキルであり、
ポリマー内の、それぞれR1およびR2を有する2つの括弧内の式の間の関係は、キャップされたチオール官能基に対する炭水化物担持の関係を示す)
を含む。
R1は、前記リンカーZに連結されたアミノアルキル置換基であり、前記リンカーZのSH−基は、R1の−CH2−基に連結されており、
R2は、2,3−ジヒドロキシプロピルチオアセチルアミノアルキルアミノまたは関連のアミノ置換基であり、
R3は、水素またはメチルであり、
ポリマー内の、それぞれR1およびR2を有する2つの括弧内の式の間の関係は、キャップされたアミド官能基に対する炭水化物担持の関係を示す)
を含む。
R1は、前記リンカーZに連結されたアミノアルキル置換基であり、前記リンカーZのSH−基は、R1(Va)の−CH2−基に連結されており、
R2は、2,3−ジヒドロキシプロピルチオアセチルアミノアルキルアミノカルボニルまたは関連のアミノカルボニル置換基であり、 ポリマー内の、それぞれR1およびR2を有する2つの括弧内の式の間の関係は、キャップされたヒドロキシ官能基に対する炭水化物担持の関係を示す)
を含む。
のR1であり、R2は、式(Vd)
R1は、前記リンカーZに連結されたアミノアルキル置換基であり、前記リンカーZのSH−基は、R1の−CH2−基に連結されており、
R2は、2,3−ジヒドロキシプロピルチオアセチルアミンであり、
ポリマー内の、それぞれR1およびR2を有する2つの括弧内の式の間の関係は、キャップされたアミノ官能基に対する炭水化物担持の関係を示す)
を含む。
R1は、前記リンカーZに連結されたカルボニルアルキルまたはカルボニルアリール置換基であり、前記リンカーZのSH−基は、R1の−CH2−基に連結されており、
R2は、2,3−ジヒドロキシプロピルチオカルボニルアルキルまたはカルボニルアリールであり、
ポリマー内の、それぞれR1およびR2を有する2つの括弧内の式の間の関係は、キャップされたカルボキシ官能基に対する炭水化物担持の関係を示す)
を含む。
一般的方法
NMRスペクトルは、Bruker Avance DMX−500(500MHz)分光計で得た。1Hおよび13C NMRスペクトルの割り付けは、2D法(COSY、HSQCおよびHMBC)を用いて実現した。化学シフトは、残留するCHCl3、CHD2OD、DMSO−d6またはHDOを参照として用いてppmで表している。IRスペクトルは、Perkin−Elmer Spectrum One FT−IR分光計を用いて記録した。エレクトロスプレーイオン化−質量分析法(ESI−MS)は、Waters micromass ZQで得た。HRMS分析は、フォトダイオードアレイ検出器を具備したAgilent 1100LCおよび4GHz時間・デジタルコンバータを具備したMicromass QTOF Iを用いて実施した。反応を、シリカゲル60 F254(Merck)でコーティングしたガラスプレートを用いてESI−MSおよびTLCによりモニタリングし、UV光を用いること、および/またはモスタイン(mostain)(10%H2SO4水溶液中の硫酸セリウムアンモニウムとモリブデン酸アンモニウム四水和物の0.02M溶液)で炭化させることにより可視化した。カラムクロマトグラフィーを、シリカゲル(Redisep順相シリカゲルカラム35/70)またはRP−18(Merck LiChroprep(登録商標)RP−18 40/63)で実施した。ジクロロメタン(DCM)およびMeOHを、Al2O3(Fluka、5016A basic型)でのろ過により乾燥させた。ジメチルホルムアミド(DMF)は、Acros(99.8%、エクストラドライ、分子ふるい上)から購入した。分子ふるい(MS、4Å)を、使用の直前に、真空にて400℃で30分間活性化させた。サイズ排除クロマトグラフィーは、ポリアクリルアミドゲル(Biogel P−2 Fine)で実施した。透析は、Biotechセルロースエステル(CE)膜(SpectrumLabs、分子量カットオフ:100〜500Da)で実施した。遠心分離は、Eppendorf Centrifuge 5804Rで実施した。rt=室温。
NaOAc/AcOH緩衝液(0.1M、pH4.5、50μL)中のヘミアセタール1(5.0mg、4.90μmol)の溶液に、オキシアミン2(4.4mg、49μmol、10当量)を添加した。反応混合物を、25〜40℃で24〜48時間撹拌した。透析による精製により、化合物3(4.97mg、4.55μmol、91%)を綿毛状の白色固体として得た。
1H−NMR(500MHz,D2O):δ4.80(d,1H),4.57(d,1H),4.57(d,1H),4.24(d,1H),4.22−4.11(m,2H),4.06(dd,1H),4.04−3.96(m,3H),3.94(d,1H),3.89(dd,1H),3.86−3.74(m,12H),3.73−3.57(m,10H),3.54(dd,1H),3.52(dd,1H),3.39(dd,1H),3.28−3.26(m,2H),2.81(s,3H),2.68(dd,1H),2.05,2.03(2s,6H),1.94(t,1H)。
HRMS(ESI+):m/z1071.4132(C40H71N4O29 +[M+H]+の計算値:m/z1071.4198)。
無水DMF(90μL)中のアミン3(4.97mg、4.55μmol)の懸濁液に、DL−ジチオトレイトール(1.2mg、8.2μmol、1.8当量)、γ−チオブチロラクトン(3.9μL、46μmol、10当量)およびEt3N(6.3μL、46μmol、10当量)を逐次添加した。反応混合物を、25〜40℃で12〜24時間撹拌した。この時間の後、反応混合物を濃縮して、溶媒をキシレンと共蒸発させた。P2サイズ排除クロマトグラフィーによる精製により、化合物4(2.8mg、2.33μmol、54%)を綿毛状の白色固体として得た。
1H−NMR(500MHz,D2O):δ4.79(d,1H),4.56(m,2H),4.22−3.31(m,32H),2.75(s,3H),2.68(m,1H),2.57(t,2H),2.41(t,2H),2.05,2.03(2s,6H),1.91(m,3H)。
MS(ESI−):m/z1171.59(C44H75N4O30S−[M−Na]−の計算値:m/z1171.42)。
DMF(60μL)中の5(1.2mg、5.83μmol)の溶液に、化合物4(2.8mg、2.33μmol、0.4当量)、水(3μL)およびDMF(10μL)中のDBU(1.3μL、8.74μmol、1.5当量)の溶液を逐次添加した。rtで1〜24時間撹拌した後、チオグリセロール(1.5μL、17.5μmol、3.0当量)およびEt3N(2.4μL、17.5μmol、3.0当量)を添加した。反応混合物をrtでさらに12〜24時間撹拌した。生成物を、EtOH/Et2O(1:1、1mL)の撹拌溶液への緩徐な添加により沈殿させた。沈殿物をろ別して、EtOHで洗浄し、乾燥させた。限外濾過(Sartorius Stedim Vivaspinチューブ、6mL、分子量カットオフ10kDa、5500rpm)により、さらなる精製を行った。凍結乾燥により、GM1aポリマー6(2.88mg、84%)を白色固体として得た。1H NMRによれば、生成物は、炭水化物エピトープ4に置換されたリジン側鎖のおよそ28%を含有した。
NaOAc/AcOH緩衝液(0.1M、pH4.5、98μL)中のヘミアセタール7(10mg、9.80μmol)の溶液に、オキシアミン2(8.8mg、98μmol、10当量)を添加した。反応混合物を、25〜40℃で24〜48時間撹拌した。透析による精製により、化合物8(7.6mg、6.95μmol、71%)を綿毛状の白色固体として得た。
1H−NMR(500MHz,D2O):δ4.72(d,1H),4.54(d,1H),4.46(d,1H),4.24(d,1H),4.17(d,1H),4.13(d,1H),4.09(dd,1H),4.06−3.97(m,4H),3.95(d,1H),3.91(dd,1H),3.89−3.81(m,7H),3.81−3.60(m,12H),3.78(dd,1H),3.62−3.57(m,1H),3.59(dd,1H),3.57(dd,1H),3.44(dd,1H),3.29−3.27(m,2H),2.81(s,3H),2.77(dd,1H),2.06,2.05(2s,6H),1.81(dd,1H)。
MS(ESI−):m/z1069.62(C40H69N4O29 −[M−Na]−の計算値:m/z1069.41).
無水DMF(140μL)中のアミン8(7.6mg、6.95μmol)の懸濁液に、DL−ジチオトレイトール(スパチュラの先端量)、γ−チオブチロラクトン(6.0μL、69.5μmol、10当量)およびEt3N(9.7μL、69.5μmol、10当量)を逐次添加した。反応混合物を、25〜40℃で12〜24時間撹拌した。この時間の後、反応混合物を濃縮して、溶媒をキシレンと共蒸発させた。P2サイズ排除クロマトグラフィーによる精製により、化合物9(5.4mg、4.52μmol、65%)を綿毛状の白色固体として得た。
1H−NMR(500MHz,D2O):δ4.72(d,1H),4.54(d,1H),4.47(d,1H),4.19(d,1H),4.17(d,1H),4.13(d,1H),4.09(dd,1H),4.04(dd,1H),4.00(dd,1H),3.96(d,1H),3.93−3.80(m,10H),3.80−3.58(m,13H),3.58−3.52(m,1H),3.56(dd,1H),3.55(dd,1H),3.47−3.40(m,1H),3.44(dd,1H),2.81−2.74(m,5H),2.57(t,2H),2.40(t,2H),2.06,2.05(2s,6H),1.94−1.89(m,2H),1.81(dd,1H)。
HRMS(ESI−):m/z1171.01(C44H75N4O30S−[M−Na]−の計算値:m/z1171.42)。
DMF(60μL)中の5(1.86mg、9.04μmol)の溶液に、化合物9(5.4mg、4.52μmol、0.5当量)、水(40μL)およびDMF(15μL)中のDBU(2.0μL,13.6μmol、1.5当量)の溶液を逐次添加した。rtで1〜24時間撹拌した後、チオグリセロール(2.3μL、27.1μmol、3.0当量)およびEt3N(3.8μL、27.1μmol、3.0当量)を添加した。反応混合物をrtでさらに12〜24時間撹拌した。生成物を、EtOH/Et2O(1:1、1mL)の撹拌溶液への緩徐な添加により沈殿させた。沈殿物をろ別して、EtOHで洗浄し、乾燥させた。限外濾過(Sartorius Stedim Vivaspinチューブ、6mL、分子量カットオフ10kDa、5500rpm)により、さらなる精製を行った。凍結乾燥により、GM1bポリマー10(4.2mg、61%)を白色固体として得た。1H NMRによれば、生成物は、炭水化物エピトープ9に置換されたリジン側鎖のおよそ45%を含有した。
NaOAc/AcOH緩衝液(0.1M、pH4.5、141μL)中のヘミアセタール11(10.0mg、14.1μmol)の溶液に、オキシアミン2(12.7mg、141μmol、10当量)を添加した。反応混合物を、25〜40℃で24〜48時間撹拌した。P2サイズ排除クロマトグラフィーによる精製により、化合物12(10.9mg、14.0μmol、定量的量)を綿毛状の白色固体として得た。
1H−NMR(500MHz,D2O):δ4.71(d,1H),4.47(d,1H),4.46(d,1H),4.24(d,1H),4.18(d,1H),4.13(d,1H),4.06−4.00(m,3H),4.04(dd,1H),3.93(d,1H),3.90(dd,1H),3.87−3.75(m,8H),3.76−3.65(m,4H),3.64(dd,1H),3.61−3.58(m,2H),3.60(dd,1H),3.55(dd,1H),3.43(dd,1H),3.28(t,2H),2.81(s,3H),2.06(s,3H)。
MS(ESI+):m/z780.46(C29H54N3O21 +[M+H]+の計算値:m/z780.32)。
無水DMF(282μL)中のアミン12(11mg、14.1μmol)の懸濁液に、DL−ジチオトレイトール(スパチュラの先端量)、γ−チオブチロラクトン(12.2μL、46μmol、10当量)およびEt3N(19.7μL、141μmol、10当量)を逐次添加した。反応混合物を、25〜40℃で12〜24時間撹拌した。この時間の後、反応混合物を濃縮して、溶媒をキシレンと共蒸発させた。P2サイズ排除クロマトグラフィーによる精製により、化合物13(10.0mg、11.3μmol、80%)を綿毛状の白色固体として得た。
1H−NMR(500MHz,D2O):δ4.72(d,1H),4.47(d, 2H),4.19(d,1H),4.19−4.16(m,1H),4.14−4.11(m,1H),4.04(dd,1H),4.01−3.97(m,1H),3.94−3.91(m,1H),3.92−3.85(m,3H),3.85−3.71(m,8H),3.76−3.63(m,4H),3.64(dd,1H),3.60(dd,1H),3.57−3.52(m,3H),3.46−3.38(m,3H),2.78−2.75(m,2H),2.76(s,3H),2.40(t,2H),2.06(s,3H),2.03−2.00(m,2H)。
MS(ESI+):m/z904.05(C33H59N3O22SNa+[M+Na]+の計算値:m/z904.32)。
DMF(60μL)中の5(1.3mg、6.25μmol)の溶液に、化合物13(3.7mg、4.19μmol、0.4当量)、水(5μL)およびDMF(105μL)中のDBU(2.3μL、15.7μmol、1.5当量)の溶液を逐次添加した。rtで1〜24時間撹拌した後、チオグリセロール(2.7μL、31.4μmol、3.0当量)およびEt3N(4.4μL、31.4μmol、3.0当量)を添加した。反応混合物をrtでさらに12〜24時間撹拌した。生成物を、EtOH/Et2O(1:1、1mL)の撹拌溶液への緩徐な添加により沈殿させた。沈殿物をろ別して、EtOHで洗浄し、乾燥させた。限外濾過(Sartorius Stedim Vivaspinチューブ、6mL、分子量カットオフ10kDa、5500rpm)により、さらなる精製を行った。凍結乾燥により、アシアロGM1ポリマー14(4.6mg、71%)を白色固体として得た。1H NMRによれば、生成物は、炭水化物エピトープ13に置換されたリジン側鎖のおよそ44%を含有した。
NaOAc/AcOH緩衝液(0.1M、pH4.5,140μL)中のヘミアセタール15(12.0mg、14.0μmol)の溶液に、オキシアミン2(12.6mg、114μmol、10当量)を添加した。反応混合物を、25〜40℃で24〜48時間撹拌した。透析による精製により、化合物16(9.9mg、10.6μmol、76%)を綿毛状の白色固体として得た。
1H NMR(500MHz,D2O)δ4.79(d,1H),4.55(d,1H),4.24(d,1H),4.20−4.09(m,2H),4.04−4.00(dd 2H),3.97−3.87(m,3H),3.91−3.68(m,14H),3.66−3.56(m,5H),3.50(dd,1H),3.41−3.34(t,1H),3.31−3.26(t,2H),2.81(s,3H),2.72−2.63(m,1H),2.05(s,3H),2.04(s,3H),2.00−1.88(m,1H)。
MS(ESI−):m/z907.56(C34H59N4O24 −[M−Na]−の計算値:m/z907.35)。
無水DMF(250μL)中のアミン16(9.9mg、10.6μmol)の懸濁液に、DL−ジチオトレイトール(スパチュラの先端量)、γ−チオブチロラクトン(9.2μL、106μmol、10当量)およびEt3N(14.8μL、106μmol、10当量)を逐次添加した。反応混合物を、25〜40℃で12〜24時間撹拌した。この時間の後、反応混合物を濃縮して、溶媒をキシレンと共蒸発させた。P2サイズ排除クロマトグラフィーによる精製により、化合物17(5.7mg、5.52μmol、52%)を綿毛状の白色固体として得た。
1H−NMR(500MHz,D2O):δ4.76(d,1H),4.56(d,1H),4.19(d,1H),4.17(dd,1H),4.15(d,1H),4.01(dd,1H),3.94(d,1H),3.94(dd,1H),3.90−3.75(m,11H),3.75−3.60(m,5H),3.62(dd,1H),3.58−3.53(m,1H),3.56(dd,1H),3.50(dd,1H),3.45−3.40(m,2H),3.38(dd,1H, H−2Gal),2.77(s,3H),2.68(dd,1H),2.57(t,2H),2.40(t,2H),2.05,2.04(2s,6H),1.97−1.89(m,3H)。
MS(ESI−):m/z1009.54(C38H65N4O25S−[M−Na]−の計算値:m/z1009.37)。
DMF(110μL)中の5(2.27mg、11.04μmol)の溶液に、化合物17(5.7mg、5.52μmol、0.5当量)、水(25μL)およびDMF(22μL)中のDBU(2.5μL、16.55μmol、1.5当量)の溶液を逐次添加した。rtで1〜24時間撹拌した後、チオグリセロール(2.9μL、33.11μmol、3.0当量)およびEt3N(4.6μL、33.11μmol、3.0当量)を添加した。反応混合物をrtでさらに12〜24時間撹拌した。生成物を、EtOH/Et2O(1:1、1mL)の撹拌溶液への緩徐な添加により沈殿させた。沈殿物をろ別して、EtOHで洗浄し、乾燥させた。限外濾過(Sartorius Stedim Vivaspinチューブ、6mL、分子量カットオフ10kDa、5500rpm)により、さらなる精製を行った。凍結乾燥により、GM2ポリマー18(4.5mg、56%)を白色固体として得た。1H NMRによれば、生成物は、炭水化物エピトープ17に置換されたリジン側鎖のおよそ49%を含有した。
NaOAc/AcOH緩衝液(0.1M、pH4.5、35μL)中のヘミアセタール19(5.0mg、3.75μmol)の溶液に、オキシアミン2(3.4mg、38μmol、10当量)を添加した。反応混合物を、25〜40℃で24〜48時間撹拌した。透析による精製により、化合物20(5.0mg、1.2当量のオキシム2と混和、3.27μmol、回収された収率87%)を綿毛状の白色固体として得た。
1H−NMR(500MHz,D2O):δ4.79(m,1H),4.63(d,1H),4.55(d,1H),4.24(d,1H),4.18(d,1H),4.18−4.14(m,1H),4.15−4.10(m,1H),4.11(dd,1H),4.09−4.05(m,2H),4.06−4.02(m,1H),4.04−3.96(m,1H),3.99−3.95(m,1H),3.93−3.87(m,1H),3.92−3.85(m,2H),3.89−3.80(m,2H),3.87−3.80(m,1H),3.86−3.70(m,7H),3.82−3.52(m,12H),3.67−3.60(m,3H),3.58(dd,1H),3.54(dd,1H),3.41(dd,1H),3.30−3.26(m,2H),2.81(s,3H),2.77(dd,1H),2.70(dd,1H),2.05(s,6H),2.03(s,3H),1.93(t,1H),1.82(t,1H)。
MS(ESI−):m/z679.83(C51H85N5O37 2−[M−2Na]2−の計算値:m/z679.75)。
無水DMF(65μL)中のアミン20(5.0mg、3.27μmol)の懸濁液に、DL−ジチオトレイトール(スパチュラの先端量)、γ−チオブチロラクトン(2.8μL、32.7μmol、10当量)およびEt3N(4.6μL、32.7μmol、10当量)を逐次添加した。反応混合物を、25〜40℃で12〜24時間撹拌した。この時間の後、反応混合物を濃縮して、溶媒をキシレンと共蒸発させた。P2サイズ排除クロマトグラフィーによる精製により、化合物21(3.8mg、2.52μmol、78%)を綿毛状の白色固体として得た。
1H−NMR(500MHz,D2O):δ4.79(m,1H),4.63(d,1H),4.56(d,1H),4.19(d,1H),4.18−4.13(m,3H),4.11(dd,1H),4.06(m,1H),4.02−3.96(m,1H),3.97(d,1H),3.94−3.85(m,3H),3.94−3.51(m,12H),3.93−3.84(m,2H),3.88−3.80(m,2H),3.87−3.68(m,7H),3.86−3.81(m,1H),3.68−3.61(m,2H),3.66−3.60(m,1H),3.58−3.54(m,1H),3.56−3.50(m,1H),3.45−3.38(m,3H),2.80−2.75(m,1H),2.77(s,3H),2.70(dd,1H),2.57(t,2H),2.40(t,2H),2.05(s,6H),2.03(s,3H),1.96−1.89(m,3H),1.82(t,1H)。
MS(ESI−):m/z730.97(C55H91N5O38S2−[M−2Na]2−の計算値:m/z730.75)。
DMF(67μL)中の5(1.4mg、6.63μmol)の溶液に、化合物21(2.4mg、1.59μmol、0.4当量)、水(15μL)およびDMF(13μL)中のDBU(1.5μL、9.9μmol、1.5当量)の溶液を逐次添加した。rtで1〜24時間撹拌した後、チオグリセロール(1.7μL、19.9μmol、3.0当量)およびEt3N(2.8μL、19.9μmol、3.0当量)を添加した。反応混合物をrtでさらに12〜24時間撹拌した。生成物を、EtOH/Et2O(1:1、1mL)の撹拌溶液への緩徐な添加により沈殿させた。沈殿物をろ別して、EtOHで洗浄し、乾燥させた。限外濾過(Sartorius Stedim Vivaspinチューブ、6mL、分子量カットオフ10kDa、5500rpm)により、さらなる精製を行った。凍結乾燥により、GD1aポリマー22(3.6mg、59%)を白色固体として得た。1H NMRによれば、生成物は、炭水化物エピトープ21に置換されたリジン側鎖のおよそ46%を含有した。
NaOAc/AcOH緩衝液(0.1M、pH4.5、150μL)中のヘミアセタール23(19.3mg、15.0μmol)の溶液に、オキシアミン2(313.5mg、150μmol、10当量)を添加した。反応混合物を、25〜40℃で24〜48時間撹拌した。透析による精製により、化合物24(14.2mg、10.1μmol、70%)を綿毛状の白色固体として得た。
1H−NMR(500MHz,D2O):δ4.80(d,1H),4.55−4.53(t,2H),4.23(d,1H),4.21−3.40(m,38H),3.29−3.27(m,2H),2.81(s,3H),2.78−2.69(m,2H),2.09,2.06,2.05 (3s,9H),1.82−1.73(m,2H)。
MS(ESI−):m/z1382.67(C51H85N5O37 −[M−Na]−の計算値:m/z1382.48)。
無水DMF(70μL)中のアミン24(4.9mg、3.51μmol)の懸濁液に、DL−ジチオトレイトール(1.0mg、6.31μmol、1.8当量)、γ−チオブチロラクトン(3.0μL、35.0μmol、10当量)およびEt3N(4.9μL、32.0μmol、10当量)を逐次添加した。反応混合物を、25〜40℃で12〜24時間撹拌した。この時間の後、反応混合物を濃縮して、溶媒をキシレンと共蒸発させた。P2サイズ排除クロマトグラフィーによる精製により、化合物25(4.1mg、2.72μmol、77%)を綿毛状の白色固体として得た。
1H−NMR(500MHz,D2O):δ4.79(d,1H),4.55−4.53(m,2H),4.21−3.40(m,41H),2.77(s,3H),2.80−2.67(m,4H),2.41(t,2H),2.09,2.05(2s,11H),1.84−1.73(m,2H)。
MS(ESI−):m/z1484.86(C55H91N5O38NaS−[M−Na]−の計算値:m/z1484.50)。
DMF(30μL)中の5(0.59mg、2.89μmol)の溶液に、化合物25(2.1mg、1.45μmol、0.5当量)、水(3μL)およびDMF(6μL)中のDBU(0.6μL、4.34μmol、1.5当量)の溶液を逐次添加した。rtで1〜24時間撹拌した後、チオグリセロール(0.75μL、8.7μmol、3.0当量)およびEt3N(1.21μL、8.7μmol、3.0当量)を添加した。反応混合物をrtでさらに12〜24時間撹拌した。生成物を、EtOH/Et2O(1:1、1mL)の撹拌溶液への緩徐な添加により沈殿させた。沈殿物をろ別して、EtOHで洗浄し、乾燥させた。限外濾過(Sartorius Stedim Vivaspinチューブ、6mL、分子量カットオフ10kDa、5500rpm)により、さらなる精製を行った。凍結乾燥により、GD1bポリマー26(0.68mg、40%)を白色固体として得た。1H NMRによれば、生成物は、炭水化物エピトープ25に置換されたリジン側鎖のおよそ20%を含有した。
NaOAc/AcOH緩衝液(0.1M、pH4.5、103μL)中のヘミアセタール27(10mg、10.3μmol)の溶液に、オキシアミン2(9.3mg、103μmol、10当量)を添加した。反応混合物を、25〜40℃で24〜48時間撹拌した。透析による精製により、化合物28(5.4mg、5.18μmol、50%)を綿毛状の白色固体として得た。
1H−NMR(500MHz,D2O):δ4.55(d,1H),4.24−3.57(m,28 H),4.23(d,1H),3.27(m,2H),2.84−2.77(m,1H),2.81(s,3H),2.70(dd,1H),2.09,2.05(2s,6H),1.76(t,2H)。
MS(ESI−):m/z497.36(C37H62N4O27 2−[M−2Na]2−の計算値:m/z497.18)。
無水DMF(61μL)中のアミン28(3.2mg、3.07μmol)の懸濁液に、DL−ジチオトレイトール(スパチュラの先端量)、γ−チオブチロラクトン(2.7μL、30.7μmol、10当量)およびEt3N(4.3μL、30.7μmol、10当量)を逐次添加した。反応混合物を、25〜40℃で12〜24時間撹拌した。この時間の後、反応混合物を濃縮して、溶媒をキシレンと共蒸発させた。P2サイズ排除クロマトグラフィーによる精製により、化合物29(2.3mg、2.01μmol、66%)を綿毛状の白色固体として得た。
1H−NMR(500MHz,D2O):δ4.55(d,1H),4.21−3.55(m,28H),4.20(d,1H),3.43(m,2H),2.80−2.75(m,1H),2.77(s,3H),2.71−2.68(m,1H),2.57(t,2H),2.40(t,2H),2.09,2.05(2s,6H),1.92−1.89(m,2H),1.76(t,2H)。
MS(ESI−):m/z548.26(C41H68N4O28S2−[M−2Na]2−の計算値:m/z548.19)。
DMF(37μL)中の5(0.75mg、3.67μmol)の溶液に、化合物29(2.1mg、1.83μmol、0.5当量)、水(10μL)およびDMF(7μL)中のDBU(0.8μL、5.5μmol、1.5当量)の溶液を逐次添加した。rtで1〜24時間撹拌した後、チオグリセロール(1.0μL、11.0μmol、3.0当量)およびEt3N(1.5μL、11.0μmol、3.0当量)を添加した。反応混合物をrtでさらに12〜24時間撹拌した。生成物を、EtOH/Et2O(1:1、1mL)の撹拌溶液への緩徐な添加により沈殿させた。沈殿物をろ別して、EtOHで洗浄し、乾燥させた。限外濾過(Sartorius Stedim Vivaspinチューブ、6mL、分子量カットオフ10kDa、5500rpm)により、さらなる精製を行った。凍結乾燥により、GD3ポリマー30(0.3mg、18%)を白色固体として得た。1H NMRによれば、生成物は、炭水化物エピトープ29に置換されたリジン側鎖のおよそ17%を含有した。
NaOAc/AcOH緩衝液(0.1M、pH4.5、30μL)中のヘミアセタール31(5.0mg、3.04μmol)の溶液に、オキシアミン2(2.7mg、30μmol、10当量)を添加した。反応混合物を、25〜40℃で24〜48時間撹拌した。透析による精製により、化合物32(4.38mg、2.55μmol、84%)を綿毛状の白色固体として得た。
1H−NMR(500MHz,D2O):δ4.80(d,1H),4.64,4.55 (2d,2H),4.24(d,1H),4.20−3.40(m,45H),3.29−3.27(m,2H),2.81(s,3H),2.78−2.69(m,3H),2.08,2.05(2s,12H),1.85−1.65(m,3H)。
MS(ESI−):m/z836.33(C62H101N6O45Na2−[M−2Na]2−の計算値:m/z836.29)。
無水DMF(37μL)中のアミン32(3.2mg、1.86μmol)の懸濁液に、DL−ジチオトレイトール(0.5mg、3.35μmol、1.8当量)、γ−チオブチロラクトン(1.6μL、18.6μmol、10当量)およびEt3N(2.6μL、18.6μmol、10当量)を逐次添加した。反応混合物を、25〜40℃で12〜24時間撹拌した。この時間の後、反応混合物を濃縮して、溶媒をキシレンと共蒸発させた。P2サイズ排除クロマトグラフィーによる精製により、化合物33(0.82mg、0.45μmol、24%)を綿毛状の白色固体として得た。
1H−NMR(500MHz,D2O):δ4.79(d,1H),4.64,4.55 (2d,2H),4.20−3.40(m,39H),2.77(s,3H),2.79−2.66(m,3H),2.57(t,2H),2.40(t,2H),2.08,2.05(2s,14H),1.94−1.74(m,2H)。
MS(ESI−):m/z583.80(C66H107N6O46SNa3−[M−3Na]3−の計算値:m/z583.87)。
DMF(9μL)中の5(0.19mg、0.90μmol)の溶液に、化合物33(0.82mg、0.45μmol、0.5当量)、水(1μL)およびDMF(2μL)中のDBU(0.2μL、1.36μmol、1.5当量)の溶液を逐次添加した。rtで1〜3時間撹拌した後、チオグリセロール(0.2μL、2.7μmol、3.0当量)およびEt3N(0.4μL、2.7μmol、3.0当量)を添加した。反応混合物をrtでさらに12〜24時間撹拌した。生成物を、EtOH/Et2O(1:1、1mL)の撹拌溶液への緩徐な添加により沈殿させた。沈殿物をろ別して、EtOHで洗浄し、乾燥させた。限外濾過(Sartorius Stedim Vivaspinチューブ、6mL、分子量カットオフ10kDa、5500rpm)により、さらなる精製を行った。凍結乾燥により、GT1aポリマー34(0.28mg、25%)を白色固体として得た。1H NMRによれば、生成物は、炭水化物エピトープ33に置換されたリジン側鎖のおよそ57%を含有した。
NaOAc/AcOH緩衝液(0.1M、pH4.5、98μL)中のヘミアセタール1(10.0mg、9.80μmol)の溶液に、オキシアミン35(8.8mg、98μmol、10当量)を添加した。反応混合物を、25〜40℃で24〜48時間撹拌した。透析による精製により、化合物36(6.2mg、5.63μmol、58%)を綿毛状の白色固体として得た。
1H−NMR(500MHz,D2O):δ4.78(d,1H),4.57−4.54(m,2H),4.31(d,1H),4.18−3.51(m,33H),3.38(t,1H),3.32(m,2H),3.27(m,2H),2.68(dd,1H),2.05,2.03(2s,6H),1.95(t,1H)。
HRMS(ESI+):m/z1071.4177(C40H71N4O29 +[M+H]+の計算値:1071.4198)。
無水DMF(112μL)中のアミン36(6.1mg、5.6μmol)の懸濁液に、DL−ジチオトレイトール(スパチュラの先端量)、γ−チオブチロラクトン(4.9μL、56μmol、10当量)およびEt3N(7.8μL、56μmol、10当量)を逐次添加した。反応混合物を、25〜40℃で12〜24時間撹拌した。この時間の後、反応混合物を濃縮して、溶媒をキシレンと共蒸発させた。P2サイズ排除クロマトグラフィーによる精製により、化合物37(5.0mg、4.2μmol、74%)を綿毛状の白色固体として得た。
1H−NMR(500MHz,D2O):δ4.78(d,1H),4.56(m,2H),4.25(d,1H),4.18−3.37(m,34H),3.46(m,2H,Hb), 3.23(m,1H),3.07(m,1H),2.77(m,1H),2.68(dd,1H),2.41(t,2H),2.05,2.03(2s,6H),1.97−1.93(m,3H)。
MS(ESI−):m/z1171.65(C44H75N4O30S−[M−Na]−の計算値:1171.42)。
DMF(84μL)中の5(1.7mg、8.4μmol)の溶液に、化合物37(5.0mg、4.2μmol、0.5当量)、水(8.4μL)およびDMF(17μL)中のDBU(1.9μL、12.5μmol、1.5当量)の溶液を逐次添加した。rtで1〜24時間撹拌した後、チオグリセロール(2.2μL、25μmol、3.0当量)およびEt3N(3.5μL、25μmol、3.0当量)を添加した。反応混合物をrtでさらに12〜24時間撹拌した。生成物を、EtOH/Et2O(1:1、1mL)の撹拌溶液への緩徐な添加により沈殿させた。沈殿物をろ別して、EtOHで洗浄し、乾燥させた。限外濾過(Sartorius Stedim Vivaspinチューブ、6mL、分子量カットオフ10kDa、5500rpm)により、さらなる精製を行った。凍結乾燥により、GM1a−リンカー2−ポリマー38(2.5mg、41%)を白色固体として得た。1H NMRによれば、生成物は、炭水化物エピトープ37に置換されたリジン側鎖のおよそ41%を含有した。
NaOAc/AcOH緩衝液(0.1M、pH4.5、98μL)中のヘミアセタール1(10.0mg、9.80μmol)の溶液に、オキシアミン39(13.1mg、98μmol、10当量)を添加した。反応混合物を、25〜40℃で24〜48時間撹拌した。透析による精製により、化合物40(7.48mg、6.50μmol、51%)を綿毛状の白色固体として得た。
1H−NMR(500MHz,D2O):δ4.78(d,1H),4.56(d,2H),4.19(d,1H),4.18−4.14(m,3H),4.13−3.48(m,32H),3.38(dd,1H),3.23(m,2H),2.79(s,3H),2.67(m,1H),2.05,2.02(2s,6H),1.94(m,1H)。
HRMS(ESI+):m/z1115.4447(C42H75N4O30 +[M+H]+の計算値:1115.4461)。
無水DMF(130μL)中のアミン40(7.48mg、6.50μmol)の懸濁液に、DL−ジチオトレイトール(スパチュラの先端量)、γ−チオブチロラクトン(5.6μL、65μmol、10当量)およびEt3N(9.1μL、65μmol、10当量)を逐次添加した。反応混合物を、25〜40℃で12〜24時間撹拌した。この時間の後、反応混合物を濃縮して、溶媒をキシレンと共蒸発させた。P2サイズ排除クロマトグラフィーによる精製により、化合物41(5.21mg、4.16μmol、64%)を綿毛状の白色固体として得た。
1H−NMR(500MHz,D2O):δ4.78(d,1H),4.56(d,2H),4.19(d,1H),4.18−3.52(m,36H),3.41(t,2H),3.37(dd,1H),2.79(s,3H),2.67(m,1H),2.57(t,2H),2.39(t,2H),2.05,2.02(2s,6H),1.98−1.88(m,3H)。
HRMS(ESI+):m/z1239.4412(C46H80N4O31NaS+[M+H]+1239.4419の計算値)。
DMF(84μL)中の5(1.72mg、8.41μmol)の溶液に、化合物41(5.21mg、4.21μmol、0.5当量)、水(8.4μL)およびDMF(17μL)中のDBU(1.9μL、13μmol、1.5当量)の溶液を逐次添加した。rtで1〜24時間撹拌した後、チオグリセロール(2.2μL、25μmol、3.0当量)およびEt3N(3.5μL、25μmol、3.0当量)を添加した。反応混合物をrtでさらに12〜24時間撹拌した。生成物を、EtOH/Et2O(1:1、1mL)の撹拌溶液への緩徐な添加により沈殿させた。沈殿物をろ別して、EtOHで洗浄し、乾燥させた。限外濾過(Sartorius Stedim Vivaspinチューブ、6mL、分子量カットオフ10kDa、5500rpm)により、さらなる精製を行った。凍結乾燥により、GM1a−リンカー3−ポリマー42(2.64mg、32%)を白色固体として得た。1H NMRによれば、生成物は、炭水化物エピトープ41に置換されたリジン側鎖のおよそ61%を含有した。
NaOAc/AcOH緩衝液(0.1M、pH4.5、98μL)中のヘミアセタール1(10.0mg、9.8μmol)の溶液に、オキシアミン43(16mg、98μmol、10当量)を添加した。反応混合物を、25〜40℃で24〜48時間撹拌した。逆相クロマトグラフィー(0→100%、H2O中のMeOH)による精製により、化合物44(5.5mg、4.7μmol、48%)を綿毛状の白色固体として得た。
1H−NMR(500MHz,D2O):δ4.78(d,1H),4.56,4.55(2d, 2H),4.26(d,1H),4.21−3.48(m,36H),3.38(t,1H),3.35−3.30(m,1H),3.16(m,1H),3.04−3.01(m,2H),3.01−2.99(m,2H),2.89(t,2H),2.68(dd,1H),2.05 2.02(2s,6H),1.95(t,1H)。
MS(ESI−):m/z1146.59(C42H72N3O29S2−[M−Na]−1146.37の計算値)。
DMF(57μL)中の5(1.17mg、5.13μmol)の溶液に、化合物44(3.35mg、2.86μmol、0.5当量)、水(5.8μL)およびDMF(12μL)中のDBU(1.3μL、8.6μmol、1.5当量)の溶液を逐次添加した。rtで1〜3時間撹拌した後、チオグリセロール(1.5μL、17μmol、3.0当量)およびEt3N(2.4μL、17μmol、3.0当量)を添加した。反応混合物をrtでさらに12〜24時間撹拌した。生成物を、EtOH/Et2O(1:1、1mL)の撹拌溶液への緩徐な添加により沈殿させた。沈殿物をろ別して、EtOHで洗浄し、乾燥させた。限外濾過(Sartorius Stedim Vivaspinチューブ、6mL、分子量カットオフ10kDa、5500rpm)により、さらなる精製を行った。凍結乾燥により、GM1a−リンカー4−ポリマー45(3.08mg、90%)を白色固体として得た。1H NMRによれば、生成物は、炭水化物エピトープ44に置換されたリジン側鎖のおよそ30%を含有した。
EtOH(3.5mL)中のアルデヒド61(340mg、2.14mmol)の溶液に、メトキシアミン塩酸塩(214mg、3.77mmol、1.2当量)およびAcONa(350mg、4.27mmol、2.0当量)を添加した。反応混合物をrtで一晩撹拌した。この時間の後、NaBH3CN(201mg、3.20mmol、1.5当量)を添加して、新たに調製した1Mエタノール性HCl溶液(7.0mL、AcClおよびEtOHから新たに調製した)を滴加した。rtで1時間撹拌した後、飽和NaHCO3水溶液の添加により反応物を中和した。反応混合物をH2Oで希釈して、DCMで抽出した(3回)。有機相をプールしてブラインで洗浄し、無水Na2SO4で乾燥させた。懸濁液をろ過して、減圧濃縮した。PE/アセトン(85:15)で溶出するフラッシュクロマトグラフィーによる精製により、アミノアルコール62(158mg、0.832mmol、39%) を無色油状物として生成した。
1H−NMR(500MHz,CDCl3)δ5.69(s,1H),4.91(s,1H),3.54(s,3H),3.30(m,2H),3.00(t,2H),1.46(s,9H)。
アミノアルコール62(160mg、0.84mmol) を、DCM(1.1mL)に溶解した。この溶液を0℃に冷却して、トリフルオロ酢酸(TFA、320μL、4.2mmol、5.0当量)を反応混合物に滴加した。0℃で1時間撹拌した後、rtで3時間撹拌し、反応混合物をMeOHで希釈して、遊離塩基Amberlite樹脂で中和した。懸濁液を綿でろ過し、ろ液を真空濃縮した。DCM/MeOH(9:1→7:3)で溶出するフラッシュクロマトグラフィーによる精製により、アミン62 (100mg) を部分的にTFA塩として得た。
1H−NMR(500MHz,D2O)δ3.47(s,3H),3.13(m,2H),3.10(m,2H)。
アミン63(1.0mL、10mmol)を、DCM(50mL)に溶解した。この溶液を0℃に冷却し、ジ−tert−ブチルジカルボナート(Boc2O、1.74g、8.9mmol、0.8当量)を溶液に添加し、その後、Et3N(1.4mL、10mmol、1.0当量)を添加した。0℃で1時間撹拌した後、rtで2時間撹拌し、反応混合物をDCMで希釈して、H2Oおよびブラインで洗浄した。有機相を無水Na2SO4で乾燥させた。懸濁液を綿でろ過し、ろ液を真空濃縮した。DCM/MeOH(1:0→9:1)で溶出するフラッシュクロマトグラフィーによる精製により、アルコール64 (1.37g、6.67mmol、84%)を無色油状物として得た。
1H−NMR(500MHz,CDCl3)δ4.88(s,1H),3.74(m,2H),3.58(t,2H),3.56(t,2H),3.34(m,2H),2.05(s,1H),1.45(s,9H)。
アルコール64(1.25g、6.09mmol)を、DCM(34mL)に溶解した。この溶液を0℃に冷却して、メタンスルホニルクロリド(MsCl、0.80mL、10.3mmol、1.7当量)をこの溶液に添加した後、Et3N(1.9mL、13.4mmol、2.2当量)を添加した。rtで3時間撹拌した後、反応混合物をアセトン(33mL)およびLiBr(8.9g、103mmol、17当量)で希釈した。反応混合物をrtで一晩撹拌した。この時間の後、溶媒を減圧濃縮した。粗製の残渣を、EtOAcで希釈し、H2Oおよびブラインで洗浄した。有機相を無水Na2SO4で乾燥させた。懸濁液を綿でろ過し、ろ液を真空濃縮した。PE/アセトン(85:15→8:2)で溶出するフラッシュクロマトグラフィーによる精製により、臭化物65(1.60g、5.95mmol、98%)を無色油状物として得た。
1H−NMR(500MHz,CDCl3):δ4.91(s,1H),3.78(t,2H),3.56(t,2H),3.47(t,2H),3.33(d,2H),1.45(s,9H)。
NaH(鉱物油中の60%、82mg、2.04mmol、0.96当量)を、無水DMF(1.4mL)中のアミノアルコール66(313mg、2.12mmol、1.0当量)の溶液に0℃で添加した。その温度で30分間撹拌した後、臭化物65(456mg、1.70mmol、0.8当量)の溶液を、反応混合物に添加した。反応混合物を0℃で1時間、その後、rtで2時間撹拌した。この時間の後、反応混合物をMeOHの添加によりクエンチし、真空濃縮して、溶媒をキシレンと共蒸発させた。PE/アセトン(8:2→75:25)で溶出するフラッシュクロマトグラフィーによる精製により、アミノアルコール67(510mg、1.53mmol、90%)を無色油状物として得た。
1H−NMR(500MHz,CDCl3):δ5.04(s,1H),4.04−3.93(m,2H),3.69−3.62(m,2H),3.55(t,2H),3.33(m,2H),3.11(s,3H),1.49(s,9H),1.44(s,9H)。
アミノアルコール67(421mg、1.26mmol)を、DCM(1.6mL)に溶解した。この溶液を0℃に冷却して、TFA(480μL、6.29mmol、5.0当量)を反応混合物に滴加した。0℃で1時間、その後rtで5時間撹拌した後、反応混合物をMeOHで希釈して、遊離塩基Amberlite樹脂で中和した。懸濁液を綿でろ過し、ろ液を真空濃縮した。DCM/MeOH(95:5→7:3)で溶出するフラッシュクロマトグラフィーによる精製により、アミン39(162mg、1.21mmol、96%)を無色油状物として得た。
1H−NMR(500MHz,D2O):δ3.94(m,2H),3.78(t,2H),3.74(m,2H),3.24(t,2H),2.69(s,3H)。
エステル68(100mg、0.60mmol)を、無水DCM(1.2mL)に溶解した。この溶液を−78℃に冷却して、DIBAL−H(トルエン中に1M、0.60mL、0.60mmol、1当量)を反応混合物に滴加した。−78℃で2時間撹拌した後、DIBAL−H(0.3mL、0.3mmol、0.5当量) を反応混合物に滴加した。−78℃でさらに30分間撹拌した後、酒石酸カリウムナトリウム四水和物(1.7g)およびH2O(2.0mL)を、反応混合物に添加した。rtで1時間激しく撹拌した後、水相をDCMで抽出した(3回)。有機相をプールしてブラインで洗浄し、Na2SO4で乾燥させた。懸濁液を綿でろ過して、ろ液を真空濃縮した。PE/アセトン(85:15→8:2)で溶出するフラッシュクロマトグラフィーにより、誘導体69(50mg、0.37mmol、61%)白色固体として生成した。
1H−NMR(500MHz,CDCl3):δ4.93(dd,1H),3.65(d,1H),3.46(dd,1H),3.34(m,1H),3.11−2.99(m,1H),2.87(dd 1H),2.71(m,1H),2.61(m,1H)。
EtOH(2.8mL)中の化合物69(232mg、1.7mmol)の溶液に、メトキシアミン塩酸塩(171mg、2.0mmol、1.2当量)およびAcONa(279mg、3.4mmol、2.0当量)を添加した。反応混合物をrtで一晩撹拌した。この時間の後、NaBH3CN(160mg、2.6mmol、1.5当量)を添加して、新たに調製した1Mエタノール性HCl溶液(5.6mL、AcClおよびEtOHから新たに調製した)を滴加した。rtで1時間撹拌した後、飽和NaHCO3水溶液の添加により反応物を中和した。反応混合物をH2Oで希釈して、DCMで抽出した(3回)。有機相をプールしてブラインで洗浄し、無水Na2SO4で乾燥させた。懸濁液をろ過して、減圧濃縮した。Tol/アセトン(85:15)で溶出するフラッシュクロマトグラフィーによる精製により、アミノアルコール43(49mg、0.29mmol、17%)を無色油状物として生成した。
1H−NMR(500MHz,CDCl3):δ5.90(s,1H),3.54(s,3H),3.08(t,2H),2.78−2.68(m,6H),1.72(t,1H)。
アクロレイン70(0.20mL、3.0mmol)を、1,2−エタンジチオール71(1.3mL、15.0mmol、5.0当量)に滴加して、反応混合物をrtで3時間撹拌した。この時間の後、反応混合物をEtOH(5.0mL)およびメトキシアミン塩酸塩(300mg、3.6mmol)およびNaOAc(492mg、6.0mmol)を添加し、反応混合物をrtで一晩撹拌した。この時間の後、NaBH3CN(282mg、4.5mmol、1.5当量)を反応混合物に添加して、1Mエタノール性HCl(10mL、AcClおよびEtOHから新たに調製した)を滴加した。rtで1時間撹拌した後、飽和NaHCO3水溶液の添加により反応物を中和した。反応混合物をH2Oで希釈して、DCMで抽出した(3回)。有機相をプールしてブラインで洗浄し、無水Na2SO4で乾燥させた。懸濁液をろ過して、減圧濃縮した。Tol/アセトン(8:2)で溶出するフラッシュクロマトグラフィーによる精製により、アミノアルコール72(159mg、0.88mmol、29%) を無色油状物として生成した。
1H−NMR(500MHz CDCl3):δ5.60(s,1H),3.53(s,3H),3.01(t,2H),2.76(m,2H),2.73(m,2H),2.62(t,2H),1.82(m,2H),1.72(dd,1H)。
ジオール73(100mg、0.22mmol)を、無水MeOH(5mL)に溶解した。Bu2SnO(58mg、0.23mmol、1.05当量)を添加して、反応混合物を80℃で4時間還流した。この時間の後、溶媒を減圧蒸発させて、粗製の残渣を高真空下で5時間乾燥させた。該粗製の残渣を、Arの下で無水1,2−ジメトキシエタン(DME、2.5mL)に溶解した。無水CsF(67mg、0.44mmol、2.0当量)およびトリフラート74(175mg、0.44mmol、2.0当量)を添加した。Arの下、rtで一晩撹拌した後、溶媒を減圧蒸発させた。フラッシュクロマトグラフィー(Tol/EtOAc 8:2)により、アルコール75(35mg、50μmol、23%)を生成した。
1H NMR(500MHz,CDCl3)δ7.36−7.23(m,20H),5.19(d,1H),5.10(d,1H),4.95(d,1H),4.94(d,1H),4.67(d,1H),4.64(d,1H),4.63(d,1H),4.58(1d,1H),4.44(d,1H),4.16(dd,1H),3.79(m,1H),3.77(d,2H),3.73(dd,1H),3.53(m,1H),3.39(t,1H),3.30(dd,1H),1.70−1.45(m,8H),1.06−0.97(m,3H),0.86−0.76(m,2H)。
MS(ESI+):m/z717.60(C43H50O8Na+[M+Na]+の計算値:m/z717.34)。
THF/H2O(4:1、1.0mL)中のベンジル75(25mg、40μmol)の脱気した(degazed)溶液に、Ar下でPd(OH)2/C(10mg)を添加した。反応混合物をH2雰囲気下で一晩撹拌した。この時間の後、反応混合物をPTFE Acrodisc 0.45μm膜でろ過して、減圧濃縮した。H2O中のMeOH(0→100%)で溶出する逆相クロマトグラフィーにより、対応するウロナート76(8.5mg、25μmol、63%)を綿状の白色固体として得た。
MS(ESI+):m/z357.32(C15H26O8Na+[M+Na]+の計算値:m/z357.16)。
NaOAc/AcOH緩衝液(2M、pH4.5、260μL)中のヘミアセタール76(8.8mg、26μmol)の溶液に、オキシアミン72(25mg、138μmol、5.2当量)およびEtOH(520μL)を添加した。反応混合物を、25〜40℃で48〜72時間撹拌した。P2サイズ排除クロマトグラフィーと、その後の、逆相クロマトグラフィー(0%→100% H2O中のMeOH)による精製により、化合物77(8.3mg、16.7μmol、64%)を綿毛状の白色固体として得た。
1H−NMR(500MHz,D2O)δ4.17(d,1H),4.00(dd,1H),3.94(dd,1H),3.88(t,1H),3.80(dd,1H),3.74(dd,1H),3.66−3.63(m,4H),3.46(dd,1H),3.15(m,1H),3.05−2.96(m,2H),2.82−2.69(m,5H),1.95−1.88(m,2H),1.81(m,1H),1.73−1.54(m,7H),1.21(m,3H),1.02−0.90(m,2H)。
MS(ESI−):m/z496.37(C21H38O8NS2 −[M−H]−の計算値:m/z496.20)。
DMF(116μL)中の5(2.38mg、11.6μmol)の溶液に、化合物77(1.60mg、3.22μmol、0.28当量)、水(10μL)およびDMF(24μL)中のDBU(2.6μL、17.4μmol、1.5当量)の溶液を逐次添加した。rtで1〜3時間撹拌した後、チオグリセロール(3.0μL、34.8μmol、3.0当量)およびEt3N(4.9μL、34.8μmol、3.0当量)を添加した。反応混合物をrtでさらに12〜24時間撹拌した。生成物を、EtOH/Et2O(1:1、1mL)の撹拌溶液への緩徐な添加により沈殿させた。沈殿物をろ別して、EtOHで洗浄し、乾燥させた。限外濾過(Sartorius Stedim Vivaspinチューブ、6mL、分子量カットオフ10kDa、5500rpm)により、さらなる精製を行った。凍結乾燥により、GM4模倣体ポリマー78(3.84mg、67%)を白色固体として得た。1H NMRによれば、生成物は、炭水化物エピトープ77に置換されたリジン側鎖のおよそ56%を含有した。
無水DCM(26mL)中のジオール73(285mg、0.634mmol)の溶液を、Ar雰囲気下、新たに活性化した4Å MS上でrtで30分間撹拌した。混合物を−78℃に冷却し、BzCN(87mg、0.665mmol、1.05当量)およびDMAP(7.7mg、63μmol、0.1当量)を添加した。反応混合物をAr雰囲気下、−78℃で4時間撹拌した。反応物をMeOHでクエンチして、得られた懸濁液をろ過した。ろ液を10%NaHCO3水溶液およびブラインで洗浄して、無水Na2SO4で乾燥させた。溶液をろ過して、減圧濃縮した。トルエン/EtOAc(95:5→9:1)で溶出するフラッシュクロマトグラフィーによる精製により、アルコール79(260mg、0.469mmol、74%)を白色泡状物として生成した。
1H−NMR(500MHz,CDCl3)δ8.12−7.10(m,20H),5.65(d,1H),5.02(d,1H),5.00(d,1H),4.71(d,1H),4.69(d,1H),4.57(d,1H),4.53(d,1H),4.46(d,1H),3.90−3.86(m,1H),3.87−3.84(m,1H),3.69−3.65(dd,1H),3.66−3.61(m,2H),2.42(d,1H)。
MS(ESI+):m/z577.23(C34H34O7Na+[M+Na]+の計算値:m/z577.22)。
無水DCM(1.0mL)中のアクセプター79(100mg、0.180mmol)およびドナー80(127mg、0.360mmol、2.0当量)の溶液に、NIS(164mg、0.728mmol、2.4当量)を添加した。反応混合物を−20℃に冷却して、TfOH(1.6μL、0.018mmol、0.1当量)を添加した。反応混合物を−20℃で1時間撹拌した。反応混合物をEt3Nで中和して、DCMで希釈し、10%Na2S2O3水溶液およびブラインで洗浄して、無水Na2SO4で乾燥させた。懸濁液をろ過して、減圧濃縮した。トルエン/EtOAc(85:15→8:2)で溶出するフラッシュクロマトグラフィーによる精製により、二糖81(82mg、0.103mmol、57%)を白色泡状物として生成した。
1H−NMR(500MHz,CDCl3)δ8.09−8.06,7.56,7.46,7.37−7.22(m,20H),5.54(d,1H),5.37(s,1H),5.07(d,1H),5.03(d,1H),4.99(d,1H),4.92(t,1H),4.77(t,1H),4.70(d,1H),4.68(d,1H),4.51(d,1H),4.54(d,1H),4.56(d,1H),4.19(d,1H),4.03(dd,1H),3.92(dd,1H),3.84(dd,1H),3.75(dd,1H),3.58(dd,1H),2.11,1.82(2s,6H)
MS(ESI+):m/z819.39(C44H44O14Na+[M+Na]+の計算値:m/z819.26)。
ラクトン81(109mg、138μmol)を、無水DCM/MeOH(1:4、2.5mL)に0℃で溶解した。無水NaOAc(10mg、124μmol、0.9当量)を添加して、反応混合物を4℃で一晩撹拌した。この時間の後、混合物をAmberlyst H+樹脂の添加により中和した。この懸濁液をろ過して、ろ液を減圧濃縮した。PE/Acet(75:25→7:3)を用いたフラッシュクロマトグラフィーにより、所望のアルコール82(73g、88.2μmol、64%)を白色泡状物として得た。
1H−NMR(500MHz,CDCl3)δ8.07−8.03,7.60−7.55, 7.45,7.40−7.22(m,20H),5.67(d,1H),5.13(dd,1H),5.00(d,1H),4.98(d,1H),4.97(d,1H),4.74(dd,1H),4.71(d,1H),4.64(d,1H),4.56(d,1H),4.52(d,1H),4.48(d,1H),4.05(dd,1H),3.85(m,1H),3.84(d,1H),3.82(dd,1H),3.69(s,3H),3.65−3.62(m,2H),3.59(m,1H),2.70(d,1H),2.06(s,3H),1.79(s,3H)。
MS(ESI+):m/z851.47(C45H48O15Na+[M+Na]+の計算値:m/z851.29).
無水DMF(0.4mL)中のアルコール82(72mg、87μmol)の溶液に、Arの下、0℃でSO3・Py(41mg、26mmol、3.0当量)を添加した。rtで2時間撹拌した後、反応混合物をNaHCO3(146mg)の添加によりクエンチして、反応混合物をrtで30分間撹拌した。懸濁液をろ過し、ろ液を濃縮して、溶媒をキシレンと共蒸発させた。DCM/MeOH(95:5→9:1)を用いたフラッシュクロマトグラフィーにより、スルファート83(67mg、72μmol、82%)を得た。
1H−NMR(500MHz,CDCl3)δ7.98,7.52−7.45,7.40−7.20(m,20H),5.61(d,1H),5.19(t,1H),4.99(d,1H),4.98(d,1H),4.92(d,1H),4.83(t,1H),4.69(d,1H),4.63(d,1H),4.55(d,1H),4.50(d,1H),4.46(m,1H),4.45(d,1H),3.98(dd,1H),3.88(d,1H),3.83(t,1H),3.79(dd,1H),3.65(s,3H),3.63−3.52(m,2H),1.95(s,3H),1.75(s,3H)。
MS(ESI−):m/z907.45(C45H47O18S−[M−Na]−の計算値:m/z907.25)。
アセタート83(70mg、75μmol)を、THF/H2O(10:1、1.8mL)の溶液に溶解した。反応混合物を0℃に冷却して、2.0MLiOH水溶液(0.4mL、115mmol、9.5当量)を緩徐に添加した。反応混合物を一晩撹拌して、緩徐にrtに到達させた。翌朝、反応物を、Amberlyst H+樹脂の添加により中和した。反応混合物をろ過して、減圧濃縮した。H2O中のMeOHで溶出する逆相クロマトグラフィー(0%→50%)により、対応するウロナート84(47mg、62μmol、83%)を白色泡状物として得た。
1H−NMR(500MHz,MeOD)δ7.43−7.20(m,15H),4.92(d,1H),4.78(d,1H),4.77(d,1H),4.67(d,1H),4.62(d,1H),4.51(d,1H),4.59(d,1H),4.32(t,1H),4.12(d,1H),3.83(dd,1H),3.79−3.71(m,4H),3.68−3.64(m,2H),3.58(dd,1H)。
MS(ESI−):m/z705.43(C33H37O15S−[M−2Na+H]−の計算値:m/z705.19)。
H2O/MeOH(10:1、5.2mL)中のベンジル84(46mg、61μmol)の溶液に、Pd(OH)2/C(20mg)を添加した。反応混合物をH2雰囲気下で6時間撹拌した。この時間の後、反応混合物をPTFE Acrodisc 0.45μm膜でろ過して、減圧濃縮した。H2Oで溶出する逆相クロマトグラフィーにより、ウロナート85(29mg、60μmol、定量的量)を綿毛状の白色固体として得た。
MS(ESI−):m/z434.96(C12H19O15S−[M−2Na+H]−の計算値:m/z435.05)。
NaOAc/AcOH緩衝液(2M、pH4.5、235μL)中のヘミアセタール85(11.3mg、23.5μmol)の溶液に、オキシアミン72(21mg、117μmol、10当量)およびEtOH(450μL)を添加した。反応混合物を、25〜40℃で24〜48時間撹拌した。P2サイズ排除クロマトグラフィーと、その後の逆相クロマトグラフィー(100%H2O)による精製により、化合物58(5.07mg、7.88μmol、33%)を綿毛状の白色固体として得た。
1H−NMR(500MHz,D2O)δ4.80(d,1H),4.36(t,1H),4.24−4.17(m,2H),3.93(dd,1H),3.84(dd,1H),3.82(d,1H),3.80−3.74(m,2H),3.73(dd,1H),3.67(m,1H),3.65(s,3H),3.64(dd,1H),3.18(m,1H),3.03−2.96(m,5H),2.74(t,2H),1.94(t,2H)。
MS(ESI−):m/z598.19(C18H32O15S3 −[M−2Na+H]−の計算値:m/z598.04)。
DMF(175μL)中の5(3.59mg、17.5μmol)の溶液に、化合物58(5.07mg、7.88μmol、0.45当量)、水(28μL)およびDMF(36μL)中のDBU(3.9μL、26μmol、1.5当量)の溶液を逐次添加した。rtで1〜3時間撹拌した後、チオグリセロール(4.5μL、53μmol、3.0当量)およびEt3N(7.3μL、53μmol、3.0当量)を添加した。反応混合物をrtでさらに12〜24時間撹拌した。生成物を、EtOH/Et2O(1:1、1mL)の撹拌溶液への緩徐な添加により沈殿させた。沈殿物をろ別して、EtOHで洗浄し、乾燥させた。限外濾過(Sartorius Stedim Vivaspinチューブ、6mL、分子量カットオフ10kDa、5500rpm)により、さらなる精製を行った。凍結乾燥により、HNK−1ポリマー86(7.4mg、87%)を白色固体として得た。1H NMRによれば、生成物は、炭水化物エピトープ58に置換されたリジン側鎖のおよそ40%を含有した。
ポリ−L−リジンデンドリマー(生成6、64の外部アミン基、TFA塩、10mg、41.8μmol)を、Ar下で無水DMF/2.6−ルチジン(4:1、130μL)に溶解した。この溶液を0℃に冷却して、無水DMF(17μL)中の(ClAc)2O(7.0mg、52μmol、1.25当量)の溶液を滴加した。反応混合物を4℃で一晩撹拌した。この時間の後、反応混合物をEt2O/EtOH(1:1、2mL)の撹拌溶液に緩徐に添加することにより、デンドリマーを沈殿させた。沈殿物をろ別して、Et2O/EtOH(1:1)で洗浄して乾燥させ、クロロアセチル化デンドリマー88(7.2mg、89%)を灰白色の固体として得た。
1H NMR(500MHz,DMSO)δ8.27(s,1H),8.17(s,1H),7.99(s,1H),7.81(s,1H),4.26(s,1H),4.19(s,1H),4.10(s,2H),4.02(s,2H),3.08−2.96(s,4H),1.66−1.17(m,12H)。
DMF(109μL)中の88(2.12mg、10.9μmol)の溶液に、化合物58(3.5mg、5.44μmol、0.5当量)、水(20μL)およびDMF(22μL)中のDBU(2.4μL、16μmol、1.5当量)の溶液を逐次添加した。rtで1〜3時間撹拌した後、チオグリセロール(2.8μL、33μmol、3.0当量)およびEt3N(4.6μL、33μmol、3.0当量)を添加した。反応混合物をrtでさらに12〜24時間撹拌した。生成物を、EtOH/Et2O(1:1、2mL)の撹拌溶液への緩徐な添加により沈殿させた。沈殿物をろ別して、EtOHで洗浄し、乾燥させた。限外濾過(Sartorius Stedim Vivaspinチューブ、6mL、分子量カットオフ10kDa、5500rpm)により、さらなる精製を行った。凍結乾燥により、HNK−1/デンドリマー性ポリリジンコンジュゲート89(3.54mg、58%)を白色固体として得た。1H NMRによれば、生成物は、炭水化物エピトープ58に置換されたリジン側鎖のおよそ48%を含有した。
ポリ−L−オルニチン臭化水素酸塩(水0.25mlに溶解した25mg)を、陰イオン交換カラム(Ambersep 900水酸化物型、5×0.5cm)に通した。溶離液を10%p−トルエンスルホン酸(PTSA)水溶液で中和した。凍結乾燥により、ポリ−L−オルニチンのトシル酸塩(33.5mg、91%)を綿毛状の白色固体として得た。
1H NMR(500MHz,D2O)δ7.86(s,1H),7.48(t,2H),7.11(t,2H),4.15(s,1H),2.76(s,2H),1.75−1.46(m,4H)。
ポリ−L−オルニチン(33mg、116μmol)のトシル酸塩を、Arの下、無水DMF/2,6−ルチジン(4:1、360μL)に溶解した。この溶液を0℃に冷却して、DMF(48μL)中の(ClAc)2O(25mg、145μmol、1.25当量)の溶液を滴加した。反応混合物を4℃で一晩撹拌した。この時間の後、反応混合物をEt2O/EtOH(1:1、4mL)の撹拌溶液に緩徐に添加することにより、ポリマーを沈殿させた。沈殿物をろ別して、Et2O/EtOH(1:1)で洗浄して乾燥させ、クロロアセチル化ポリ−L−オルニチン92(14mg、73μmol、63%)を灰白色固体として得た。
1H NMR(500MHz,DMSO)δ8.24(s,1H),4.04(s,2H),3.88(m,1H),3.13(s,2H),2−04−1.38(m,6H)。
DMF(137μL)中の92(2.6mg、13.7μmol)の溶液に、化合物58(4.0mg、6.17μmol、0.45当量)、水(24μL)およびDMF(28μL)中のDBU(3.1μL、21μmol、1.5当量)の溶液を逐次添加した。rtで1〜3時間撹拌した後、チオグリセロール(3.6μL、41μmol、3.0当量)およびEt3N(5.7μL、41μmol、3.0当量)を添加した。反応混合物をrtでさらに12〜24時間撹拌した。生成物を、EtOH/Et2O(1:1、2mL)の撹拌溶液への緩徐な添加により沈殿させた。沈殿物をろ別して、EtOHで洗浄し、乾燥させた。限外濾過(Sartorius Stedim Vivaspinチューブ、6mL、分子量カットオフ10kDa、5500rpm)により、さらなる精製を行った。凍結乾燥により、HNK−1ポリオルニチンコンジュゲート93(4.9mg、61%)を白色固体として得た。1H NMRによれば、生成物は、炭水化物エピトープ58に置換されたオルニチン側鎖のおよそ60%を含有した。
NaOAc/AcOH緩衝液(2M、pH4.5、1.5mL)中のヘミアセタール94(107mg、0.297mmol)の溶液に、オキシアミン72(270mg、1.50μmol、5.0当量)およびEtOH(3.0mL)を添加した。反応混合物を、25〜40℃で24〜48時間撹拌した。この時間の後、溶媒を減圧蒸発させた。粗製の残渣を、Ar下でH2O(5.0mL)に懸濁させた。DL−ジチオトレイトール(460mg、2.98mmol、10当量)を反応混合物に添加し、その後、1MNaOH水溶液を添加した(pHが一定して9になるまで)。rtで2時間撹拌した後、反応混合物をC18カラムへ直接ロードした。逆相クロマトグラフィー(0→100%、H2O中MeOH)による精製により、化合物56(117mg、0.231mmol、78%)を綿毛状の白色固体として得た。
1H−NMR(500MHz,D2O)δ4.47(d,1H),4.23(d,1H),3.98(dd,1H),3.95(d,1H),3.86−3.77(m,3H),3.75(m,1H),3.71−3.60(m,4H),3.65(s,3H),3.56(dd,1H),3.55(m,1H),3.19(m,1H),3.01(m,1H),2.83(m,2H),2.79(m,2H),2.72(m,2H),1.92(m,2H)。
MS(ESI+):m/z528.29(C18H35O11NS2Na+[M+Na]+の計算値:m/z528.15)。
チオール56(28mg、49μmol)を、無水DMF(1.0mL)に溶解した。その後、溶液を脱気した後、Arを流した。臭化物95(56mg、0.163mmol、3.3当量)およびCs2CO3(32mg、99μmol、2.0当量)を、反応混合物に添加した。Ar下、rtで2時間撹拌した後、反応混合物をC18カラムへ直接ロードした。H2O中のMeOH(0%→95%)で溶出する逆相クロマトグラフィーにより、対応するFmoc保護アミン96(28mg、37μmol、75%)を白色泡状物として得た。
1H NMR(500MHz,MeOD)δ7.81−7.77(m,2H),7.73−7.65(m,2H),7.41−7.36(m,2H),7.33−7.29(m,2H),4.36(d,1H),4.05(d,1H),3.86−3.83(m,2H),3.81(d,1H),3.78(dd,1H),3.70(dd,1H),3.63(d,1H),3.61(s,3H),3.58(m,1H),3.57−3.50(m,5H),3.48(dd,1H),3.33(m,1H),3.12(m,1H),3.00−2.99(m,2H),2.94(dt,1H),2.75−2.62(m,6H),1.89−1.80(m,1H),1.72−1.63(m,1H)。
MS(ESI+):m/z793.41(C35H50O13N2S2Na+[M+Na]+の計算値:m/z793.26)。
誘導体96(28mg、37μmol)を、Arの下で無水DMF(1.0mL)に溶解した。ピペリジン(0.2mL)を、Arの下でこの溶液に添加した。Arの下、rtで4時間撹拌した後、溶媒をトルエンと共蒸発させた(3回)。0.1%TFA水溶液中のMeOH(0%→60%)で溶出する逆相クロマトグラフィーにより、対応するアミン97(13mg、23.7μmol、64%)を白色泡状物として得た。
1H NMR(500MHz,D2O)δ4.47(d,1H),4.23(d,1H),3.99(dd,1H),3.95(d,1H),3.85−3.76(m,3H),3.75(m,1H),3.71−3.59(m,4H),3.64(s,3H),3.56(dd,1H),3.55(m,1H),3.26(t,2H),3.18(m,1H),3.01(m,1H),2.92(t,2H),2.88−2.86(m,5H),2.73(t,1H),1.95−1.89(m,2H)。
MS(ESI+):m/z549.31(C20H41O11N2S2 +[M+H]+の計算値:m/z549.21)。
DMF(0.4mL)中のクロロアセチル化キトサン98(5.0mg、12.2μmol)の溶液に、化合物56(24.0 mg、39.1μmol、3.2当量)およびDBU(7.0μL、48.8μmol、4.0当量)を逐次添加した。rtで2時間撹拌した後、反応混合物を50℃で1時間加熱した。この時間の後、H2O(2μL)を添加して、反応混合物を50℃でさらに1時間撹拌した。生成物を、EtOH/Et2O(1:1、4mL)の撹拌溶液への緩徐な添加により沈殿させた。沈殿物をろ別して、EtOHで洗浄して、乾燥させ、キトサンコンジュゲート99(12.8mg、58%)を白色固体として得た。
IR(KBr)ν3400(vs,b,OH),2926,2067,1734(COester),1651(COamide),1419,1382,1274,1207,1119,1076,1034,894,784,702,622,600
キトサン誘導体99(16mg、8.9μmol)を、0.1MNaOH水溶液(0.32mL)に懸濁させた。懸濁液を40℃で90分間撹拌した。固体をろ別して、H2O、EtOHおよびEt2Oで洗浄して乾燥させ、 ラクトース−キトサンコンジュゲート100(3.7mg、59%)を白色固体として得た。
IR(KBr)ν3436(vs,b,OH),2921,1648(COamide),1553,1377,1075,1034,894
リン酸緩衝液(100mM、pH5.0、81μL)中のポリ−L−グルタミン酸ナトリウム塩(Alamanda Polymers社製、n=250、2.50mg、16.5μmol)の溶液に、リン酸緩衝液(100mM、pH5.0、417μL)中のN−ヒドロキシスルホスクシンイミドナトリウム塩(スルホ−NHS、60mg、0.26mmol、15.6当量)およびN−(3−ジメチルアミノプロピル)−N’−エチルカルボジイミド塩酸塩(EDC・HCl、37mg、0.19mmol、11.5当量)の溶液を添加した。rtで15分間撹拌した後、アミン97(13mg、23.7μmol、1.4当量)を添加し、その後、飽和NaHCO3水溶液を、pHが一定して7になるまで添加した。rtで2時間撹拌した後、エタノールアミンを、最終濃度10mMに達するように反応混合物に添加した。rtで10分間撹拌した後、反応混合物を限外濾過チューブ(Sartorius Stedim Vivaspinチューブ、6mL、分子量カットオフ10kDa)に移した。限外濾過(5500rpm)による精製および凍結乾燥により、ラクトース−ポリグルタミン酸コンジュゲート102(4.9mg、45%)を綿毛状の白色固体として得た。1H NMRによれば、生成物は、炭水化物エピトープ56に置換されたグルタミン酸側鎖のおよそ100%を含有した。
ニューロパチー患者7名の血清を調べた。血清は全て、病院で抗ガングリオシド抗体に関して試験陽性であった。血清の抗ガングリオシド抗体力価を、Buhlmann Laboratories(Schonenbuch、スイス所在)のELISAアッセイにより決定した。血清は、Buhlmann Laboratories(Schonenbuch、スイス所在)またはUniversity Hospital Baselの臨床検査室(Basel、スイス所在)のいずれかから得た。神経免疫学的評価を行って抗ガングリオシド反応性陰性の個体の血清を、対照とした。本発明者らの研究での血清使用は、北西部および中部スイス倫理委員会により認可されている(EKNZ UBE−15/46)。
合成された炭水化物ポリマー6(GM1aエピトープ)、26(GD1bエピトープ)、および34(GT1aエピトープ)を、GanglioCombi(−Light) ELISAおよび/または化合物6の場合には抗GM1 ELISA(全てBuhlmann Laboratories(Schonenbuch、スイス所在)のキット)で試験した。ウシ馬尾由来の精製ガングリオシドでコーティングした96ウェルマイクロタイタープレートを、洗浄緩衝液(300μl/ウェル)で2回洗浄した後、8種の異なる濃度の炭水化物ポリマーを添加した(25μl/ウェル)。抗ガングリオシドIgGまたはIgM抗体を含有する患者血清を、適当な希釈率で添加して(25μl/ウェル)(2倍濃縮)、総容量50μl/ウェルを得た。プレートをプレートシーラーで覆い、4〜8℃で2時間インキュベートした。ウェルを洗浄緩衝液(300μl/ウェル)で3回洗浄した後、抗ヒトIgM抗体−西洋ワサビペルオキシダーゼコンジュゲートまたは抗ヒトIgG抗体−西洋ワサビペルオキシダーゼコンジュゲートのいずれかを添加した(100μl/ウェル)。プレートを4〜8℃で2時間インキュベートした。ウェルを洗浄した後(300μl/ウェルで3回)、テトラメチルベンジジンの基質溶液(過酸化水素を含むクエン酸緩衝液中のTMB)を添加して(100μl/ウェル)、プレートを遮光して、600rpmおよび室温でさらに30分間インキュベートした。最後に、停止溶液(0.25M硫酸)を添加して(100μl/ウェル)、発色反応の度合いを、マイクロプレートリーダー(Spectramax 190、Molecular Devices、米国カリフォルニア州所在)を用いた450nmでの吸収測定により決定した。
6週齢の性別を一致させた野生型BALB/cマウスの背下部の複数の部位に、ウシ馬尾由来から精製したスフィンゴ糖脂質SGPGおよびSGLPG(いずれの糖脂質もHNK−1炭水化物エピトープを含有する)の全量100μgを皮下注射した。糖脂質の単離を、Burgerら(Journal of Immunological Methods 1991, 140, 31−36)によって記載されたプロトコルに従って実施した。これらの糖脂質をPBSに溶解し、KLH (最終濃度1.4mg/ml) と混合して、同容量のTiterMax(登録商標)Goldで乳化した。2回の追加免疫注射を、KLHおよびTiterMax(登録商標)Goldと混合した精製SGPG/SGLPG 20μgにより、2および4週間後に実施した。血液試料を尾静脈穿刺により採取して、0.5M EDTA 1μlを含有する試験管に移して、1,800rpmで15分間遠心分離した。上清(血漿)を新しい試験管に移して、−55℃で貯蔵した。PBSに溶解した糖鎖ポリマー86を、尾静脈のi.v.注射により投与した。マウス血漿試料を、上記の抗MAG ELISAにより分析した。
Claims (15)
- 炭水化物部分およびリンカーZを含む化合物であって、前記炭水化物部分が、神経系のスフィンゴ糖脂質で構成される糖鎖エピトープを模倣しており、
前記リンカーZが、−N(Ra)−A−B−CH2−(CH2)q−SHであり、ここで
Raが、H、C1〜C4−アルキル、C1〜C4−アルコキシ、CH2C6H5、CH2CH2C6H5、OCH2C6H5、またはOCH2CH2C6H5であり;
Aが、C1〜C7−アルキレン、C1〜C7−アルコキシ、C1〜C4−アルキル−(OCH2CH2)pO−C1〜C4−アルキル、またはC1〜C7−アルコキシ−Rbであり、Rbが、任意選択で置換されたアリールまたは任意選択で置換されたヘテロアリールであり、pが、0〜6であり、好ましくはpが、1、2または3であり、さらに好ましくはpが、1であり;
Bが、NHC(O)、SまたはCH2であり;
qが、0〜6であり、好ましくはqが、1、2、3または4であり、さらに好ましくはqが、1または2であり;
前記リンカーZが、前記炭水化物部分の還元末端に−N(Ra)−基を介して共有結合している、化合物。 - 式(I)または式(II)の化合物であって、
式(I)が、
RI2は、H、SO3H、または
RI3は、Hまたは
RI4は、Hまたは
RI5およびRI6は、独立して、Hまたは
RI7は、Hまたは
式(II)が、
RII2は、Zまたは
Zが、−N(Ra)−A−B−CH2−(CH2)q−SHであり、ここで
Raが、H、C1〜C4−アルキル、C1〜C4−アルコキシ、CH2C6H5、CH2CH2C6H5、OCH2C6H5、またはOCH2CH2C6H5であり;
Aが、C1〜C7−アルキレン、C1〜C7−アルコキシ、C1〜C4−アルキル−(OCH2CH2)pO−C1〜C4−アルキル、またはC1〜C7−アルコキシ−Rbであり、Rbが、任意選択で置換されたアリールまたは任意選択で置換されたヘテロアリールであり、pが、0〜6であり、好ましくはpが、1、2または3であり、さらに好ましくはpが、1であり;
Bが、NHC(O)、SまたはCH2であり;
qが、0〜6であり、好ましくはqが、1、2、3または4であり、さらに好ましくはqが、1または2である、請求項1に記載の化合物。 - 式(I)の化合物である、請求項1または2に記載の化合物。
- 式(II)の化合物である、請求項1または2に記載の化合物。
- 式4*、9*、13*、17*、21*、25*、29*、33*、または46*〜60* のいずれか1つ:
Raは、H、C1〜C4−アルキル、C1〜C4−アルコキシ、CH2C6H5、CH2CH2C6H5、OCH2C6H5、またはOCH2CH2C6H5であり;
Aは、C1〜C7−アルキレン、C1〜C7−アルコキシ、C1〜C4−アルキル−(OCH2CH2)pO−C1〜C4−アルキル、またはC1〜C7−アルコキシ−Rbであり、Rbは、任意選択で置換されたアリールまたは任意選択で置換されたヘテロアリールであり、pは、0〜6であり、好ましくはpは、1、2または3であり、さらに好ましくはpは、1であり;
Bは、NHC(O)、SまたはCH2であり;
qは、0〜6であり、好ましくはqは、1、2、3または4であり、さらに好ましくはqは、1または2である)の化合物である、請求項1〜4のいずれか1項に記載の化合物。 - Raが、H、CH3、CH2CH3、CH2CH2CH3、CH(CH3)2、OCH3、OCH2CH3、OCH2CH2CH3、CH2C6H5、OCH2C6H5であり;
Aが、O(CH2)pCH2、(CH2)pCH2、CH2(OCH2CH2)pOCH2、(OCH2CH2)pOCH2CH2またはO(CH2)pC6H5であり;
Bが、NHC(O)、SまたはCH2である、請求項1〜5のいずれか1項に記載の化合物。 - 前記リンカーZが、式(a)〜(g):
- 式4、9、13、17、21、25、29、33、37、41、44、56、58または77
- 請求項1〜8のいずれか1項に記載の化合物の複数を含むポリマーであって、前記化合物が、前記リンカーZによってポリマー骨格に連結されており、前記連結が、前記リンカーZのSH−基を介してもたらされ、前記化合物の複数が、(i)複数の式(I)の化合物、(ii)複数の式(II)の化合物、または(iii)複数の式(I)および式(II)の化合物であり、前記化合物(I)および(II)が、請求項2〜8のいずれか1項に定義される、ポリマー。
- 前記ポリマー骨格が、α−アミノ酸ポリマー、アクリル酸もしくはメタクリル酸ポリマーもしくはコポリマー、N−ビニル−2−ピロリドン−ビニルアルコールコポリマー、キトサンポリマー、またはポリホスファゼンポリマーであり、好ましくは前記ポリマー骨格が、α−アミノ酸ポリマーであり、さらに好ましくは前記ポリマー骨格が、α−アミノ酸ポリマーであり、前記α−アミノ酸ポリマーの前記α−アミノ酸が、リジン、オルニチン、グルタミン酸、またはアスパラギン酸である、請求項9に記載のポリマー。
- 前記ポリマー骨格が、ポリリジンであり、好ましくは前記ポリマー骨格の分子量が、1,000Da〜300,000Daである、請求項9または10に記載のポリマー。
- ポリマー骨格上への前記化合物の炭水化物部分の担持(loading)の割合%が、10〜90%の間、好ましくは20〜70%の間、特に30〜60%の間である、請求項9〜11のいずれか1項に記載のポリマー。
- 請求項1〜8のいずれか1項に記載の化合物、好ましくは請求項2〜8のいずれか1項に記載の式(I)もしくは(II)の化合物、または請求項9〜12のいずれか1項に記載のポリマー、を含む医薬組成物。
- 神経疾患を処置する方法において使用するための、請求項1〜8のいずれか1項に記載の化合物、好ましくは請求項2〜8のいずれか1項に記載の式(I)もしくは(II)の化合物、または請求項9〜12のいずれか1項に記載のポリマー、または請求項13に記載の医薬組成物であって、好ましくは前記神経疾患が、多発性硬化症、パーキンソン病、アルツハイマー病、認知症および免疫介在性ニューロパチーから選択され、好ましくは前記免疫介在性ニューロパチーが、ギラン・バレー症候群(GBS)、慢性炎症性脱髄性多発ニューロパチー(CIDP)、ミラー・フィッシャー症候群、ビッカースタッフ脳幹脳炎、多巣性運動ニューロパチーまたは抗MAGニューロパチーから選択される、請求項1〜8のいずれか1項に記載の化合物、好ましくは請求項2〜8のいずれか1項に記載の式(I)もしくは(II)の化合物、または請求項9〜12のいずれか1項に記載のポリマー、または請求項13に記載の医薬組成物。
- 好ましくは免疫介在性ニューロパチーである、神経疾患の診断の方法において使用するための、請求項1〜8のいずれか1項に記載の化合物、好ましくは請求項2〜8のいずれか1項に記載の式(I)もしくは(II)の化合物、または請求項9〜12のいずれか1項に記載のポリマー、または請求項13に記載の医薬組成物。
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