JP2018533920A - ネイティブに対合するt細胞受容体配列のt細胞受容体標的識別のための高スループットプロセス - Google Patents
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Abstract
Description
本出願は、2015年9月25日に出願された米国仮出願番号第62/232,511号に基づく優先権を主張しており、この仮出願は、その全体が参考として本明細書中に援用される。
Tリンパ球またはT細胞は、ヒトおよび他の動物における適応免疫系の不可欠な成分である。これらは、生物内の細胞媒介性免疫の重要な部分を構成する。細胞傷害性T細胞およびヘルパーT細胞を含む、多くのT細胞サブセットが存在する。細胞傷害性T細胞(CD8+T細胞としても既知)は、異常な細胞、例えば、ウイルス感染細胞または腫瘍細胞を死滅させる。ヘルパーT細胞(CD4+T細胞としても既知)は、他の免疫細胞の活性化および成熟を助ける。
ハイスループット単一細胞分析に由来する多数のTCRの抗原特異性をスクリーニングおよび決定するための方法および組成物が、本明細書で開示されている。一態様では、ハイスループット並行単一細胞配列決定を使用して、対象由来の生物学的試料から、複数のネイティブに対合したTCR鎖を識別するステップ;1つまたは複数の操作された細胞においてTCRポリペプチドを発現させるステップであって、このTCRポリペプチドが、ネイティブに対合したTCR鎖の少なくとも1つのペアを含む、ステップ;1つまたは複数の操作された細胞を、複数の操作された抗原提示細胞(APC)のうちの1つまたは複数に接触させるステップであって、複数の操作されたAPCの各操作されたAPCが、異なる抗原ポリペプチドを含む、ステップ;複数の操作されたAPCのうちの反応性の操作されたAPCを識別するステップであって、この反応性の操作されたAPCが、TCRポリペプチドを発現する操作された細胞に対する反応性を有し、そして/またはTCRポリペプチドを発現する操作された細胞に対する応答を示す、ステップ;および選択されたAPCの抗原ポリペプチドを決定するステップであって、それによって、ネイティブに対合したTCR鎖の標的抗原を決定するステップを含む方法が、本明細書で提供される。
一部の実施形態では、第1の複数の操作された細胞は、第1の複数の操作されたAPCによって発現される第1のMHC型に特異的な第1のTCRポリペプチドを発現し、第2の複数の操作された細胞は、第2の複数の操作されたAPCによって発現される第2のMHC型に特異的な第2のTCRポリペプチドを発現する。一部の態様では、第1のTCRポリペプチドおよび第2のTCRポリペプチドを含むTCRポリペプチドのライブラリーが提供される。一部の実施形態では、第1のTCRポリペプチドは、抗原ポリペプチドと第1のMHC型のMHCとを含む複合体に特異的であり、第2のTCRポリペプチドは、抗原ポリペプチドと第2のMHC型のMHCとを含む複合体に特異的である。
本明細書で言及される全ての刊行物、特許および特許出願は、各個々の刊行物、特許または特許出願が参照により組み込まれると具体的かつ個々に示されるのと同じ程度まで、全ての目的のためにそれらの全体が参照により本明細書に組み込まれる。
いくつかの態様が、例示のために、例となる適用に関連して、以下に記載される。多くの具体的な詳細、関連性および方法が、本明細書に記載される特色の完全な理解を提供するために示されていることを理解すべきである。しかし、当業者は、本明細書に記載される特色が、具体的な詳細のうち1つもしくは複数を伴わずに、または他の方法を伴って実施され得ることを容易に認識する。一部の行為は、他の行為もしくは事象とは異なる順序でおよび/またはそれらと同時に生じ得るので、本明細書に記載される特色は、行為または事象の例示された順序付けによっては限定されない。さらに、全ての例示された行為または事象が、本明細書に記載される特色に従って方法論を実行するために必要とされるわけではない。
T細胞受容体鎖対および抗体免疫グロブリン鎖対は、免疫受容体の両方の型であり、進化的に関連している。ハイスループット配列決定および診断学のためのポリヌクレオチドライブラリーを生成することが、本発明の目的である。特定の共通の性状を有する患者またはコホートからの抗体および/またはTCR発見のためのヒト由来のライブラリーパネルを開発することもまた、本発明の目的である。出発材料は、免疫細胞が包括的に単離される、または所望の場合にはナイーブ、メモリーおよびASCについてサブソーティングされる、末梢血であり得る、または組織生検由来であり得る。開示された発明は、複数の異なる型の対合した可変配列、例えば、T細胞受容体鎖対および抗体免疫グロブリン鎖対に適用され得る。
ポリヌクレオチドを含有する任意の生物学的試料が、本明細書に記載されている方法において使用され得る。例えば、試料は、RNAまたはDNAを含有する対象由来の生物学的試料であり得る。これらのポリヌクレオチドは、生物学的試料から抽出され得、またはこの試料は、ポリヌクレオチドの抽出も精製もなしに、この方法に直接供され得る。この試料は、抽出または単離されたDNAまたはRNAであり得る。試料はまた、生物学的検体から抽出された総RNAもしくはDNA、cDNAライブラリー、ウイルスまたはゲノムDNAであり得る。一実施形態では、ポリヌクレオチドは、種々の他の成分、例えば、タンパク質、脂質および非鋳型核酸を含有する生物学的試料から単離される。核酸鋳型分子は、動物、植物、細菌、真菌または任意の他の細胞性生物から取得される任意の細胞性材料から取得され得る。ある特定の実施形態では、これらのポリヌクレオチドは、単一の細胞から取得される。ポリヌクレオチドは、生物から直接、または生物から取得された生物学的試料から取得され得る。任意の組織または体液検体は、本発明における使用のための核酸の供給源として使用され得る。ポリヌクレオチドが、培養細胞、例えば、初代細胞培養物または細胞株からも単離され得る。鋳型核酸が取得される細胞または組織は、ウイルスまたは他の細胞内病原体に感染し得る。
一部の場合には、本明細書で提供されている方法は、標的ポリヌクレオチド分子、例えば、細胞由来のポリヌクレオチド分子の増幅および配列決定に向けられる。一部の場合には、本明細書で提供されている方法は、標的ポリヌクレオチド分子の2またはそれよりも多くの領域の増幅および配列決定に向けられる。一部の場合には、本明細書で提供されている方法は、2またはそれよりも多くの標的ポリヌクレオチド分子の増幅および配列決定に向けられる。一態様では、標的ポリヌクレオチドはRNAである。一態様では、標的ポリヌクレオチドはゲノム核酸である。特定の生物の染色体中の遺伝子材料に由来するDNAは、ゲノムDNAであり得る。好ましい実施形態では、標的ポリヌクレオチドは、免疫細胞によって産生される抗体またはTCRの可変領域を含む配列を含む。一部の実施形態では、標的ポリヌクレオチドは、免疫細胞によって産生される抗体の重鎖の可変領域を含む配列を含む。一部の実施形態では、標的ポリヌクレオチドは、免疫細胞によって産生される抗体の軽鎖の可変領域を含む配列を含む。一部の実施形態では、標的ポリヌクレオチドは、免疫細胞によって産生されるTCRのアルファ鎖の可変領域を含む配列を含む。一部の実施形態では、標的ポリヌクレオチドは、免疫細胞によって産生されるTCRのベータ鎖の可変領域を含む配列を含む。一部の実施形態では、標的ポリヌクレオチドは、免疫細胞によって産生されるTCRのガンマ鎖の可変領域を含む配列を含む。一部の実施形態では、標的ポリヌクレオチドは、免疫細胞によって産生されるTCRのデルタ鎖の可変領域を含む配列を含む。
一部の態様では、「抗体発現ライブラリー」または「TCR発現ライブラリー」または「発現ライブラリー」は、本明細書で使用される場合、核酸またはタンパク質レベルのいずれかでの分子のコレクション(つまり2つまたはそれよりも多くの分子)を指す場合がある。したがって、一部の実施形態では、この用語は、複数の抗体またはTCR分子をコードする発現ベクターのコレクション(つまり、核酸レベル)を指していてもよく、かつ/またはそれらが適切な発現系で発現された後の抗体またはTCR分子のコレクション(つまり、タンパク質レベル)を指していてもよい。あるいは、発現ベクター/発現ライブラリーは、それらが発現され得る好適な宿主細胞に含有されていてもよい。本発明の発現ライブラリー中のコードまたは発現されている抗体分子は、任意の適切な形式であってもよく、例えば、抗体またはTCR分子全体であってもよく、抗体またはTCR断片、例えば単鎖抗体(例えばscFv抗体)、Fv抗体、Fab’抗体、(Fab’)2断片、ダイアボディ等であってもよい。用語「コードする(encoding)」および「コードする(coding for)」、例えば、特定の酵素を「コードする」/「コードする」核酸配列、または特定の酵素のDNAコード配列、または特定の酵素を「コードする」/「コードする」ヌクレオチド配列など、ならびに他の同義的な用語は、適切な調節配列の制御下に置かれると酵素に転写および翻訳されるDNA配列を指す。「プロモーター配列」は、細胞内でRNAポリメラーゼに結合可能であり、下流(3’方向)コード配列の転写を開始可能であるDNA調節領域である。プロモーターは、DNA配列の一部である。この配列領域は、その3’末端に開始コドンを有する。プロモーター配列は、バックグラウンドを超える検出可能なレベルで転写を開始させるために必要なエレメントを有する最小数の塩基を含む。しかしながら、RNAポリメラーゼがこの配列に結合し、転写が開始コドン(プロモーターを有する3’末端)から開始されると、転写は、3’方向の下流に進行する。プロモーター配列内には、転写開始部位(ヌクレアーゼS1でマッピングすることにより便利に規定される)ならびにRNAポリメラーゼの結合をもたらすタンパク結合ドメイン(コンセンサス配列)が見出されることになる。
バーコードは、分子バーコードまたはベッセルバーコードであり得る。一部の実施形態では、バーコード、例えば、分子バーコードまたはベッセルバーコードは、2〜36ヌクレオチド、4〜36ヌクレオチド、または6〜30ヌクレオチド、または8〜20ヌクレオチド、2〜20ヌクレオチド、4〜20ヌクレオチド、または6〜20ヌクレオチドの範囲内の長さを各々有し得る。ある特定の態様では、セット内のバーコードの融解温度は、互いに10℃以内、互いに5℃以内、または互いに2℃以内である。ある特定の態様では、セット内のバーコードの融解温度は、互いに10℃以内、互いに5℃以内、または互いに2℃以内ではない。他の態様では、バーコードは、最小限に交差ハイブリダイズするセットのメンバーである。例えば、かかるセットの各メンバーのヌクレオチド配列は、セットの全ての他のメンバーのヌクレオチド配列とは十分に異なり得、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で任意の他のメンバーの相補体と安定な二重鎖を形成できるメンバーは存在しない。一部の実施形態では、最小限に交差ハイブリダイズするセットの各メンバーのヌクレオチド配列は、全ての他のメンバーのヌクレオチド配列とは、少なくとも2つのヌクレオチドが異なる。バーコード技術は、Winzelerら(1999年)Science 285巻:901頁;Brenner(2000年)Genome Biol.1巻:1頁;Kumarら(2001年)Nature Rev. 2巻:302頁;Giaeverら(2004年)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101巻:793頁;Easonら(2004年)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101巻:11046頁;およびBrenner(2004年)Genome Biol. 5巻:240頁に記載されている。
複数の細胞の試料を小さな反応容積に分割し、複数の細胞の個々の細胞からの、または個々の細胞に由来するポリヌクレオチドの分子およびベッセルバーコード付与と併用することにより、バイオマーカー配列等の配列のレパートリーのハイスループット配列決定が可能になり得る。
一般的に、液滴ライブラリーは、単一コレクション内に共にプールされているいくつかのライブラリー要素で構成される。ライブラリーは、複雑さが、単一のライブラリー要素から1×1015個またはそれよりも多くのライブラリー要素まで、様々であってもよい。各ライブラリー要素は、一定濃度の1つまたは複数の所与の成分である。要素は、これらに限定されないが、細胞、ビーズ、アミノ酸、タンパク質、ポリペプチド、核酸、ポリヌクレオチド、または小分子化合物であってもよい。要素は、分子バーコード、ベッセルバーコード、または両方等の識別子を含有していてもよい。
一般的に、1対または複数対のプライマーを増幅反応に使用することができる。プライマー対の1つのプライマーは、フォワードプライマーであってもよく、プライマー対の1つのプライマーは、リバースプライマーであってもよい。
一部の場合では、標的ポリヌクレオチドは、逆転写によりRNAから調製される。一部の場合では、標的ポリヌクレオチドは、ポリメラーゼ等を使用して、プライマー伸長によりDNAから調製される。
標的ポリヌクレオチドを含有する試料は、増幅され得るmRNAまたはその断片を含み得る。一部の場合には、mRNAまたはその断片の平均長さは、約100、200、300、400、500もしくは800塩基対未満、または約5、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190もしくは200ヌクレオチド未満、または約1、2、5、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100キロ塩基未満であり得る。一部の場合には、比較的短い鋳型、例えば、約40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95または100塩基である鋳型を含有する試料由来の標的配列が、増幅される。
本明細書に記載されている方法または方法ステップの1つまたは複数を実施した後、生成されたポリヌクレオチドのライブラリーを配列決定してもよい。
本明細書で開示されている方法およびキットは、1つまたは複数の酵素を含んでいてもよい。酵素の例としては、これらに限定されないが、リガーゼ、逆転写酵素、ポリメラーゼ、および制限ヌクレアーゼが挙げられる。
本明細書で操作されたAPC(eAPC)とも呼ばれる人工抗原提示細胞(aAPC)は、内因性MHCタンパク質を発現しないAPC細胞(一部の実施形態では、K562細胞株に基づく細胞)を指し得る。一部の実施形態では、これらのaAPC細胞は、調査中のTCRの供給源生物のものとマッチしたMHC遺伝子(複数可)でトランスフェクトされる。aAPCは、目的のペプチド抗原をコードする発現ベクターでさらにトランスフェクトされ得る、または標的抗原のライブラリーでパルスされ得る。
目的のネイティブに対合したTCR鎖は、発現ベクターを使用してT細胞中にトランスフェクトされ得る。一部の実施形態では、T細胞株は、内因性TCR発現を欠如するように操作される。一部の態様では、例示のT細胞株として、Jurkat細胞株が挙げられる。一部の態様では、目的のTCRを発現するT細胞は、目的のTCRが由来した宿主生物とマッチするMHC分子上の抗原のライブラリーを提示するaAPC(上記)と共に培養される。一部の実施形態では、T細胞は、TCRを介したMHC−ペプチド複合体の係合を介してaAPCを結合し、上記のように、APCによるレポーター遺伝子の発現を生じる。活性化されたAPCは、蛍光活性化セルソーティング(FACS)または磁気活性化セルソーティング(MACS)を使用して単離され得る。一部の実施形態では、抗原性ペプチドは、酸および/または逆相HPLC(RP−HPLC)による処理によって、MHC分子から溶出され得る。さらなる実施形態では、この抗原性ペプチドは、配列決定され得るまたは質量分析によって分析され得る。この方法は、目的のTCRに対する標的抗原の大きいパネルの迅速かつ同時のスクリーニングを可能にし、それによって、TCRの標的抗原の正確な識別を可能にする。
本開示は、目的の抗原に対して反応性であるヒト由来TCRを識別し、それによって、治療的に適切なTCRの発見を可能にする方法を提供する。一部の実施形態では、目的の抗原は、がんなどの疾患状態を代表し得る。一部の実施形態では、腫瘍浸潤リンパ球の種々のTCRが、CD4およびCD8共受容体を発現するT細胞株中にトランスフェクトされ得る。一部の実施形態では、このT細胞株は、内因性TCR発現を欠如するように操作される。一部の態様では、例示のT細胞株として、Jurkat細胞株が挙げられる。一部の実施形態では、TCRは、T細胞の複数の集団を与える、複数の患者のT細胞から単離され得る。目的の種々のTCRを発現するT細胞は、目的の標的抗原を提示するaAPCと共に培養され得る。一部の実施形態では、これらのaAPCは、aAPCの複数の集団で構成され、ここで、各集団は、同じ標的抗原を全てが提示する、共培養物中に存在する各T細胞集団とマッチするMHC分子でトランスフェクトされ得る。一部の態様では、aAPCにおいてこのレポーター遺伝子の発現を誘導するTCR発現T細胞が単離され、目的の抗原に対して反応性のTCRを決定するために分析される。
処置の方法
本明細書で開示されている方法およびキットは、1つまたは複数の試薬を使用することを含んでいてもよい。試薬の例としては、これらに限定されないが、PCR試薬、ライゲーション試薬、逆転写試薬、酵素試薬、ハイブリダイゼーション試薬、試料調製試薬、親和性捕捉試薬、ビーズ等の固体支持体、ならびに核酸精製および/または単離用の試薬が挙げられる。
BCRおよびTCRのハイスループット識別
腫瘍浸潤リンパ球(TIL)は、抗がん免疫応答に重要であるが、それらの存在量、表現型、および機能は予測不能であるため、研究は困難である。本発明者らは、細胞ソーティング、刺激、または培養を行う必要なく、TILを高深度で特徴付けるための方法を開発した。エマルジョンに基づく単一細胞バーコード付与法により、数百万個のインプット細胞中のリンパ球の中から、ネイティブに対合したB細胞およびT細胞受容体(BCRおよびTCR)配列が捕捉される。以前の手法とは対照的に、回収される可変領域は全長であり、さらなるmRNAおよびタンパク質標的が付随し得る。卵巣腺癌に由来する400,000個のソーティングされていない細胞を処理し、11,000個を超えるTILから対合したBCRおよびTCRを回収する前に、健常ヒト血液に由来する300万個のB細胞およびHIV患者に由来する350,000個のB細胞で本方法を検証した。本発明者らの結果は、任意の対合したBCRまたはTCRレパートリーの最も高深度のサンプリングであると共に、エマルジョン中での単一細胞の同時RNA配列決定およびタンパク質測定を最初に実証するものである。
単一細胞のバーコード付与
免疫レパートリーの配列決定は、基礎免疫学、自己免疫、感染症、および腫瘍学において幅広い応用を有する。多くの研究では、循環血液中のBCRおよびTCR多様性が調査されているが、TILの免疫受容体に対する関心が高まっている。その機能は、がん成長または退縮に高度に関連しているが、その程度は様々であり、特徴付けされていないことが多い。TILのより良好な理解に向かって重要なことは、新しい腫瘍関連抗原の識別を可能にし得るため、TILのBCRおよびTCRの回収および機能的な特徴付けである。腫瘍抗原は、がんワクチンを開発するために、チェックポイント阻害剤の役割を理解するために、および固形腫瘍のキメラ抗原受容体T細胞(CAR−T)療法を進歩させるために、非常に必要とされている。しかしながら、免疫配列決定における数十年に及ぶ技術的進歩にも関わらず、全長のネイティブに対合したBCR(重鎖および軽鎖)およびTCR(アルファおよびベータ鎖)を、観察されるレパートリーを制限および偏向するin vitro培養または細胞ソーティングを行わずに、腫瘍等の不均質試料から回収した研究はない。初代未培養免疫細胞は、in vitro刺激細胞の100分の1未満の受容体RNAを含み得るため、技術的な困難性が非常に高い。複雑な不均質試料に由来するネイティブに対合したBCRおよびTCRの包括的な分析を可能にするため、多数の単一細胞を並列単離およびDNAバーコード付与するためのマイクロ流体エマルジョンに基づく方法を開発した(図4)。毎時最大100万個の細胞が、個々の約65ピコリットルエマルジョン液滴中で単離される。液滴内で細胞を溶解し、標的特異的プライマーを用いて標的mRNAを逆転写し、二段階DNAバーコード付与プロセスにより、分子特異的および液滴特異的バーコードをcDNAに付着する。その後の回収および次世代シークエンシングの後、この二重バーコード付与戦略は、配列読み取りを、それらの当初の分子および細胞の両方にクラスター化することを可能にする。これより、エラーおよび増幅バイアスの広範な矯正、mRNAおよび細胞の両レベルでのクローン計数、重鎖アイソタイプの決定、ならびに、重要なことには、BCRおよびTCRの全長のネイティブに対合したV(D)J配列を超ハイスループットで同時に回収することが可能になる。
健常血液試料からのB細胞VHVLペア対の大規模回収
最初に、本技術を開発し、対合能力およびスループットを、陰性ビーズ濃縮により健常ボランティアの末梢血から単離された300万個のB細胞でアセスメントした。エマルジョンを6つの別々の画分に分割し、それらを並列で処理し、配列決定前に再混合しなかった。エマルジョンを、1液滴当たり0.2細胞になるように装填した。これは、占有液滴の約90%が単一細胞を含有するというポアソン期待値をもたらし、エマルジョン液滴観察と一致していた(図5A)。エマルジョン破壊および追加のライブラリー処理ステップを行った後、Illumina MiSeqを用いて、ペアエンド325+300bp配列決定を実施した。配列決定データを処理するため、液滴および分子バーコードを共に使用して、元々の各mRNA分子からPCR複製読み取りを収集し、各mRNAについてコンセンサスを決定して、少なくとも2つの読み取りから組み立てられたmRNA配列のみを維持した。フォワードおよびリバース読み取りを繋ぎ合わせて、5’UTR、完全V(D)J配列、およびアイソタイプ決定に十分な定常領域を含む全長産物を生成した。IMGT High−VQuestおよび/またはIgBLASTを用いて、再配置された免疫グロブリン重鎖および軽鎖配列に注釈を付けた。
HIV長期非進行者からの公既知の低頻度VHVL対ペアの回収。
アッセイの対合感度および正確性のさらなる検証として、いくつかの希少な(10,000個の細胞中、<1個の細胞)ネイティブVHVL対合が既に既知である試料を処理した。HIV長期非進行患者から末梢B細胞を得た。この患者のメモリB細胞は、HIV中和活性を示す抗体が近年詳細に探索されている。350,000個のB細胞を処理して、合計38,620個のフィルタリングされたVHVLペアを生成した。興味深いことには、この個体は、以前の健常試料(図3A)または典型的な健常末梢B細胞レパートリーよりも高い割合のIgGを示した。このデータセットに由来するVH配列を、PGT121を含む、この個体に由来する全ての報告されている広域中和抗体(bNAb)と比較し、8つの類似または同一のVH配列を見出した。これは、bNAbのこのファミリーが循環B細胞の0.03%未満であることを示す。重要なことには、これら重鎖と対合した全ての軽鎖は、予想される同様に希少のbNAb系列のものであり、以前に報告されているように、同じIgλ−V3−21/J3再配置および特徴的な3コドン挿入を示し、本発明者らの方法の正確性および感度が高いことが支持された。さらに、この個体に由来する、全ての既知の新らたに生成されたPGT121様VHVLペアの系統樹(図3B)では、VHおよびVLツリーは、鏡像様位置を占める対合したVHおよびVL配列と非常に類似したトポロジーを示しており、これは、系統発生史が共通していることを反映している可能性が高い。ここで発見されたバリアントペアは、このルールに良好に当てはまる。興味深いことには、2つの発表されている抗体PGT122およびPGT123は、例外であると考えられ、これら2つの対合を支持するものは見出されなかったが、その代わりに、PGT122VH:PGT123VL様のおよびPGT123VH:PGT122VL様のペアが見出された。これは、元々の報告書では確認されていない対合を示している。8つの新規なPGT様VHVLペアの完全なV(D)J領域をコードするDNAを合成し、抗体を完全IgGとして発現させ、複数のHIV擬似系統を中和する能力を試験した(図6C)。抗体は良好に発現され、全てがウイルスに対する強力な中和活性を示し、関連する生物学的試料からネイティブに対合した機能性抗体バリアントを迅速に生成する本発明者らの手法の有用性が実証された。
腫瘍浸潤リンパ球に由来するB細胞およびT細胞受容体対ペア
対合した受容体をハイスループットで回収するためにエマルジョンバーコード付与が検証されたことを受けて、免疫受容体を、腫瘍から直接回収した。プロテアーゼで分離された切除卵巣腺癌試料を得、400,000個のソーティングされていない細胞をエマルジョンに入れた。別々の等量の試料をCD3/CD19染色することにより、かなりの数の浸潤性B(約5%)およびT細胞(約20%)が物質中に存在することが示唆された。エマルジョン中の単一細胞分散系は、いくつかの限定的な塊が視認されたとはいえ、精製細胞と類似しており、試料の細胞タイプが不均質であったことを考慮すると予想通りに液滴内の細胞サイズおよび形状に広範なばらつきがあった(図7A)。
追加の目的の表現型マーカーの捕捉
液滴バーコード付与による受容体鎖の対合は、潜在的に、免疫受容体の他に追加の標的の捕捉を可能にする。この可能性を調査するため、CD4+およびCD8+集団に入る健常T細胞を、磁気ビーズ濃縮により分離し、各タイプの20,000個の細胞を別々のエマルジョンに入れ、TCRアルファおよびベータ鎖を標的とするプライマーならびにCD4およびCD8のmRNAを用いて実験を行った。配列決定後、CD4+単離細胞に由来するTCR VαおよびVβ(「TCRペア」)を含有する3,861個の液滴バーコードの47.0%は、CD4 mRNAに関連していたが、CD8 mRNAに関連したものは0.3%に過ぎなかった。反対に、CD8+単離細胞に由来する2,235個のTCRペアの50.6%が、CD8 mRNAにリンクしていたが、CD4 mRNAにリンクしていたものは0.6%に過ぎなかった。これは、以前の報告と同様に、細胞表現型を決定するためのmRNAに基づく手法は、高特異性だが、感度に制限があることを示す。対照的に、細胞表面受容体等のタンパク質は、通常、それらのコードmRNAよりも非常に大きな数(1細胞当たり1,000〜100,000個)で存在し、検出がより容易である可能性が高いだけでなく、より直接的に細胞表現型と関連する可能性が高い。各細胞での標的タンパク質レベルを測定するため、特注オリゴヌクレオチドDNA標識を、抗ヒトCD4およびCD8抗体にコンジュゲートし、標識抗体を、30,000個の細胞をエマルジョンに入力する前に、CD4+およびCD8+ T細胞の未分離混合物と共にインキュベートした(図8A)。DNA標識は、抗体特異的配列タグだけでなく、分子バーコード、および増幅された液滴バーコードに相補的な配列を担持し、mRNAでの実施と同様に、エマルジョン液滴バーコード付与、および分子計数を可能にする。DNA標識、ならびにTCR、CD4、およびCD8 mRNAを、同時に標的とした。配列決定およびフィルタリング後、3,682個の液滴バーコードを、高い信頼性でTCR VαVβペアであると識別した。以前の実験と一致して、TCRペアのおよそ半分(52%)を、mRNAに基づいてCD4またはCD8ステータスに帰属させることができた(図8B)。しかしながら、液滴バーコードの95%超は、タンパク質ステータスに基づいてCD4またはCD8に帰属させることができ、1液滴当たりの平均分子計数は、CD4/8タンパク質(平均20.5)が、CD4/8 mRNA(平均1.0)よりもかなり高かった。mRNAおよびタンパク質決定が両方とも合致していたことを考慮すると、mRNAとタンパク質シグナルとの間の合致率は高く(図8C)、液滴の96.0%だった。一部の希少な例では、CD4およびCD8タンパク質の両方が検出された。これは、液滴が、2つまたはそれよりも多くの細胞を含有していた結果であると考えられた。エマルジョンバーコード付与により、単一細胞免疫受容体を、目的のmRNAおよびタンパク質マーカーと、全てハイスループットで直接的に関連付けることが初めて可能になった。抗PD−1および抗CTLA−4等の拡大された免疫腫瘍学的関連マーカーセットを用いて、この手法をTILに応用することは、保証されている。
ヒト試料
健常レパートリー検証用の血液試料を、Personal Genome Projectの承認に基づいて収集した。HIV bNAb実験用のPBMCを、IAVIプロトコールGコホートのHIV−1感染ドナーであるドナー17から得た。ヒトHIV試料は全て、ルワンダ共和国国立倫理委員会、エモリー大学内治験審査委員会、ザンビア大学研究倫理委員会、チャリングクロス研究倫理委員会、UVRI科学および倫理委員会、ニューサウスウェールズ大学研究倫理委員会、聖ビンセント病院および東シドニー地区ヘルスサービス、ケニヤッタ国立病院倫理調査委員会、ケープタウン大学倫理委員会、国際施設内治験審査委員会、マヒドン大学倫理委員会、ウォルターリード陸軍研究所(WRAIR)施設内治験審査委員会、およびコートジボアール委員会「National d’Ethique des Sciences de la Vie et de la Sante」(CNESVS)により承認された臨床試験プロトコールに基づいて書面によるインフォームドコンセントを得たうえで収集した。凍結保存され、解離され、切除された、単一ドナーに由来する卵巣腺癌を、IRB承認プロトコールに基づいて、書面によるインフォームドコンセントを得たうえで、Conversant Biologicsから得た。
細胞調製
300万個の健常B細胞に関する研究では、ヘパリンナトリウム(BD)を有するVacutainer CPT細胞調製チューブに50mLの血液を採取し、1800×gで20分間遠心分離し、細胞調製緩衝液(2%ウシ胎仔血清および2mM EDTAで補填された1×PBS)で2回洗浄し、200×gのスピンを使用して血小板を除去し、得られたPBMCを、RPMI−1640培地(Life Technologies)+20%ウシ胎仔血清+10%DMSOに、必要になるまで−80℃で凍結保存した。エマルジョン生成の前に、PBMCを解凍し、細胞調製緩衝液で2回洗浄し、計数した。ネガティブ選択に基づくヒトB細胞濃縮キット(Stem Cell Technologies)を製造業者の説明書に従って使用して、B細胞を単離した。20μm細胞ストレーナーに細胞を通し、細胞調製緩衝液で6.2×106細胞/mL(300万個のB細胞での実験)または3.1×106細胞/mL(PGTドナーおよび卵巣腫瘍での実験)に希釈した。
エマルジョン内での免疫受容体バーコード付与
エマルジョン生成プラットフォームは、親フッ素性にコーティングされた石英Dolomite小型2試薬チップ内への、2つの水相および1つの親フッ素性油連続相のコンピュータ制御流動が可能になるように、単一の空気圧縮機により駆動され、各々がMitos流速センサを有する3つのMitos Pポンプ(Dolomite Microfluidics)を備えていた。1つの水性インプットチャネルは、所望の1液滴当たりの細胞占有レベルをもたらすように、必要とされる密度の細胞を含有し、第2の水性のチャネルは、AbPair(商標)反応緩衝液およびオリゴヌクレオチド(www.abvitro.com/catalog AV2070−1SおよびAV2080−1S)、5単位/μLのMuMLVに基づく逆転写酵素(Thermo Scientific)、および0.1単位/μLのHerculase II PCRポリメラーゼを含む溶解および反応混合物を含有していた。100μLのHamilton Microliterシリンジを使用して、100μL内部径PEEKチューブ試料ループに、各々約100μLのLRミックスを2回のインジェクションで負荷した。100μLのHamilton Gastightシリンジを使用して、約100μLの0.2mm内部径FEPチューブループに、約110μLの細胞懸濁液を負荷した。エマルジョンは、チップの2つの油チャネルから油を同時に流動させた2試薬チップに、水相を同一の流速で集中流噴射することにより形成した。チップ出口チャネルを出るエマルジョンを、冷却ブロックに配置した0.2mLのPCRストリップチューブ(Eppendorf)内に滴下させ、その後、過剰な油を、ピペットでチューブの底部から取り除き、40μLのオーバーレイ溶液(25mM Na−EDTA、pH8.0)を添加し、チューブを、転写タグ化反応のために標準的サーモサイクラーに移した。45分間の逆転写(RT)ステップ中、標的特異的RTプライマーを用いて、ランダム化分子バーコードを含有するユニバーサルアダプター配列の鋳型スイッチに基づく付加により、RNAを42℃で逆転写した。RT後、エマルジョンを、40サイクルの熱サイクル(各サイクル:82℃で10秒間、65℃で25秒間)にかけて、液滴バーコード鋳型のPCR増幅を実施し、それを、初期溶解および反応混合物中で30,000cp/μLに希釈し、15,000cp/μLまたは約65pl液滴当たり約1個の最終混合物中での濃度を生成した。液滴バーコードの一方の末端は、Illumina読み取り2(「P7」)プライマー部位を含み、他方の末端は、ユニバーサルアダプターオリゴヌクレオチドの共通配列とマッチングする。したがって、PCR中、鋳型スイッチしたcDNAは、増幅された液滴バーコード鎖にアニーリングし、オーバーラップ伸長によりスプライスされて、標的、分子バーコード、および液滴バーコード配列を含有する全長産物を産生することができる。
エマルジョン破壊、クリーンアップ、下流PCR、プール化、および配列決定
熱サイクル後、オーバーレイ溶液を、ピペットで取り除き、40μLエマルジョン破壊溶液(1:1 FC−40:パーフルオロオクタノール)を、15μL溶解物クリアリング溶液(12.5μL Qiagenプロテアーゼ、2.5μLの0.5M Na−EDTA、pH8.0)と共に添加した。10回反転させてエマルジョンを破壊した後、混合物を50℃で15分間、および95℃で3分間インキュベートして、プロテアーゼを不活化した。15,000×gで1分間遠心分離して水相を単離した後、回収した物質を徹底的に精製して、オリゴヌクレオチド、試薬、および過剰な液滴バーコードPCR産物を除去した。全長産物は、RTプライマーの5’ビオチン化によりビオチンを含有するため、ストレプトアビジンビーズをクリーンアップすることにより、それらは、過剰な液滴バーコードPCR産物から効率的に分離することができ、したがって、オーバーラップ伸長法に共通の問題である下流PCR組換えアーティファクトが最小限に抑えられる。まず、製造業者の説明書を使用して1:1比のAMPure XPビーズ(Agencourt)を使用し、その後、この場合も製造業者の説明書を使用してストレプトアビジンビーズ(New England Biolabs)を使用してクリーンアップし、その後、95℃の脱イオン水で溶出させ、その後1:1比のAMPure XPビーズで第2のクリーンアップを行うことにより、産物を精製した。その後、産物を、標的濃縮PCRに入れ、BまたはT細胞受容体標的の定常領域に特異的なプライマーを、液滴バーコード配列のユニバーサル末端に特異的なプライマーと共に使用した。このリバースプライマーは、製造業者の説明書に従ってMiSeq機器でマルチプレックス配列決定するための6塩基インデックスバーコードも含んでいた。したがって、このステップでは、全長液滴バーコード化標的配列のみが増幅される。まず、反応開始時に2分間の98℃ポリメラーゼ活性化ステップを含む製造業者の推奨条件下で、Q5ホットスタートポリメラーゼ(New England Biolabs)を使用して、全ての標的を、98℃で10秒間;64℃で20秒間;72℃で15秒間の7サイクルで一緒に増幅した。この後、1.5:1のビーズ:PCR比でAMPure XPクリーンアップを行った。その後、同じ熱サイクル条件を以前と同様に使用して、各鎖(VH、VL、Vα、Vβ)を別々に標的とする第2の7サイクルを実施し、その後、AMPure XPクリーンアップを行った。その後、同じ熱サイクル条件および5〜15サイクル(qPCRにより判断される収量に応じて)で、全長Illumina配列決定アダプターを付加し、TapeStation D1000(Agilent)定量化に十分な物質を生成する最終PCRを実施した。その後、ライブラリーをプールし、V3 2×300bp MiSeqプラットフォーム(Illumina)で配列決定した。
MiSeqプラットフォームの改変
BCRまたはTCRの完全な可変V(D)J領域の再構成には、2つのペアエンドIllumina読み取りを繋ぎ合わせることが必要である。このプロセスを向上させるため、2×300bpキットのフォワード読み取りを325bpに延長した。免疫受容体ライブラリーは、定常領域プライマー部位の多様性を制限するため、10%phiXスパイクインを使用して、ライブラリー多様性の制限という問題を軽減した。
読み取りのバイオインフォマティクス処理の概要
pRESTOパッケージ(バージョン0.4)の周辺に組み立てた特注パイプラインを使用して、Illumina MiSeq読み取りを処理して、各液滴からmRNA分子の全長コンセンサス配列を生成し、IgBLASTおよび/またはIMGT/HighV−QUESTで注釈を付け、特注スクリプトおよびChange−Oパッケージを用いて、さらにアラインし、フィルタリングし、および処理して、統計情報を生成した。
読み取り処理および注釈、アイソタイプ帰属。
生読み取り処理、V(D)J注釈、およびクローンの帰属は、pRESTOおよびChange−Oパッケージを利用して特注パイプラインで実施した。手短に言えば、生Illuminaペアエンド325+300bp読み取りを品質管理し、プライマートリミングし、液滴特異的(DB)および分子特異的バーコード(MB)を、プライマー部位のファジーマッチングにより識別した。まとめると、DBおよびMBにより由来分子が固有に識別され、この固有な分子識別子(UMI)を使用して、同じ分子から生じる一致PCR複製読み取り(最小で2つ)をグループ化し、各mRNA配列のコンセンサスを生成する。アイソタイプ特異的プライミングは、プライマートリミングされた配列内の既知のアイソタイプ特異的定常領域のファジーマッチングにより確認した。V(D)J生殖系列セグメントおよび再配置構造を、IgBLASTを使用して決定し、IMGT/HighV−QUESTで確認し、適切な場合は、Change−Oおよび特注スクリプトで解析した。マッチングするIGHV遺伝子、IGHJ遺伝子、および接合部長を有する機能性V(D)J配列を、Change−Oに実装されているように、グループ内で単一連鎖クラスター化することにより、クローンを帰属させた。300万個の循環細胞データセットでは、対称化トランジション/トランスバージョンモデルを使用して、4.0の重みが加えられたクローン内距離を、クローン内の最近傍距離カットオフとして使用した。
液滴免疫受容体含有フィルタリングおよび対合フィデリティー算出
液滴からB細胞配列を回収する精度は、本バーコード付与法により2つのやり方:液滴内mRNA配列一致および交差画分対合一致を使用してアセスメントすることができる。各液滴内では、1遺伝子座当たり複数のmRNAが捕捉され、1つの細胞に由来する発現V(D)J配列は、一致するはずである。配列一致を規定する、複数のアラインされたV(D)Jセグメントの2%配列多様性(平均のペアを成すヌクレオチド差pi55<0.02)のカットオフを使用して、1液滴当たり1つよりも多くの生産的VDJおよび1つの生産的VJ配列の存在を、推定免疫受容体含有または複数細胞占有として、バイオインフォマティクス的に目印を付ける。対立遺伝子排除的な液滴毎に重鎖および軽鎖コンセンサス配列を組み立て、クローン規定および交差画分対合分析に使用した。300万個の循環B細胞データセットでは、各VH系列は、データセット中の>20,000個の軽鎖クローンの1つ(理想的な場合)と関連している。VHVLペアを有する259,368個の免疫遺伝子座排除的な液滴中、10,870個のVDJ重鎖遺伝子座再配置クラスターが、少なくとも6つの物理的に分離されたエマルジョン画分の2つに存在していた。これらクラスターは、増殖系列であるか、または同じVJエクソンの、独立しているが類似の再配置であるかのいずれかを表わす。VDJ再配置が、2つの複製で一貫したVJ再配置と対合している場合、両実験は、独立して真の陽性をもたらした(より希少な再配置を有する2,604個のクローンの35,922個の考え得るペアを成す比較のうち33,157個)。したがって、各複製の精度は、96.1%(0.923^0.5)である。
HIV bNAb候補配列の発見
本発明者らの38,620個のVHVLペアを、tblastx、MUSCLE、およびPhyMLを使用して文献から選別した既知のbNAb HCDR3、VDJ配列、およびドナー17系列との類似性について探索することにより、HIVの新しいネイティブに対合した広域中和抗体(BNAb)を発見し、その後、完全なV(D)Jアミノ酸配列の系統樹を手作業で検査して、既知のbNAb配列で分散されている抗体候補を選択した。
HIV bNAbタンパク質発現および精製
抗体配列を合成し、以前に記載されている重鎖および軽鎖ベクターにクローニングした。重鎖および軽鎖プラスミドを、製造業者のプロトコールに従って293fectin(Invitrogen)を使用して、293FreeStyle細胞に同時トランスフェクトした(1:1比)。抗体上清を、トランスフェクトの4日後に採集し、プロテインA親和性クロマトグラフィーで精製した。精製した抗体を、さらなるアッセイで使用する前にPBSで緩衝液交換した。
擬似ウイルス産生および中和アッセイ
HIV−1 Env発現プラスミドおよびEnv欠損ゲノムバックボーンプラスミド(pSG3ΔEnv)を293T細胞にトランスフェクトすることにより、擬似ウイルスを生成した。トランスフェクション72時間後に、擬似ウイルスを、中和アッセイで使用するために採集した。単一ラウンドの複製擬似ウイルスアッセイおよびTZM−Bl標的細胞を使用して、中和活性をアセスメントした。手短に言えば、TZM−Bl細胞を、96ウェル平底プレートに播種した。このプレートに、擬似ウイルスを添加し、それを、抗体の系列希釈物と共に37℃で1時間、事前にインキュベートした。感染72時間後に溶解し、Bright−Gloルシフェラーゼ基質(Promega)を添加して、ルシフェラーゼレポーター遺伝子発現を定量化した。IC50値を決定するために、用量反応曲線を非線形回帰法でフィッティングした。
卵巣腫瘍標的鎖の同定識別
エマルジョン中の卵巣解離腫瘍組織からBCRおよびTCRを同時に捕捉した後、以前に記載されるように分子および液滴バーコードを使用して読み取りをフィルタリングしたが、その後、4つの考え得る標的鎖タイプ(BCR VH、BCR VL、TCR Vα、TCR Vβ)の各々の存在を探した。各々が少なくとも2つの配列決定読み取りを有する少なくとも2つのmRNAにより支持されていた場合、標的鎖を保持した。BCR VHVLまたはTCR VαVβペアのみを含有する全ての液滴バーコードを、さらに分析した。BCR重鎖およびTCRベータ鎖クローンを、個別のCDR3アミノ酸配列に基づいてコールした。
DNA標識抗体染色によるエマルジョン内のタンパク質検出
一本鎖200bp DNAオリゴヌクレオチドを、固有の5bp抗原ID配列を含有するように設計し、5’アミノ基で修飾した(Integrated DNA Technologies)。マウスモノクローナル抗ヒトCD4(BioLegend、#300516)およびCD8a(BioLegend、#301018)抗体を、製造業者のプロトコールに従ってThunder−Linkキット(Innova Biosciences)を使用して、DNAオリゴヌクレオチドタグにコンジュゲートした。エマルジョン前の細胞標識化では、末梢血に由来する200万個のネガティブ選択されたT細胞を、400μL細胞緩衝液+2mM EDTA+0.05%アジ化ナトリウムで希釈した。一本鎖サケ精子DNAを、200μg/mLの最終濃度で細胞に添加し、細胞を室温で5分間回転させた。CD4およびCD8a DNA標識抗体の混合物(各々、5nMの最終濃度)を細胞に添加し、30分間室温でインキュベートした。細胞を、細胞緩衝液+2mM EDTA+0.05%アジ化ナトリウム+200μg/mL一本鎖サケ精子DNAで3回洗浄した。エマルジョン分析に入る前に、細胞を、細胞緩衝液+0.05%アジ化ナトリウムに再懸濁した。30,000個の細胞を、エマルジョン配列決定に使用した。
TCR抗原標的の識別
Claims (119)
- (a)ハイスループット並行単一細胞配列決定を使用して、対象由来の生物学的試料から、複数のネイティブに対合したTCR鎖を識別するステップ;
(b)1つまたは複数の操作された細胞においてTCRポリペプチドを発現させるステップであって、前記TCRポリペプチドが、前記ネイティブに対合したTCR鎖の少なくとも1つのペアを含む、ステップ;
(c)前記1つまたは複数の操作された細胞を、複数の操作された抗原提示細胞(APC)のうちの1つまたは複数に接触させるステップであって、前記複数の操作されたAPCの各操作されたAPCが、異なる抗原ポリペプチドを含む、ステップ;
(d)前記複数の操作されたAPCのうちの反応性の操作されたAPCを識別するステップであって、前記反応性の操作されたAPCが、前記TCRポリペプチドを発現する前記操作された細胞に対する反応性を有し、そして/または前記TCRポリペプチドを発現する前記操作された細胞に対する応答を示す、ステップ;および
(e)選択されたAPCの前記抗原ポリペプチドを決定するステップであって、それによって、前記ネイティブに対合したTCR鎖の標的抗原を決定するステップ
を含む、方法。 - (a)ハイスループット並行単一細胞配列決定を使用して、対象由来の生物学的試料から、複数のネイティブに対合したTCR鎖を識別するステップ;
(b)1つまたは複数の操作された細胞においてTCRポリペプチドを発現させるステップであって、前記TCRポリペプチドが、前記ネイティブに対合したTCR鎖の少なくとも1つのペアを含む、ステップ;
(c)前記1つまたは複数の操作された細胞を、複数の操作された抗原提示細胞(APC)のうちの1つまたは複数に接触させるステップであって、前記複数の操作されたAPCの各操作されたAPCが、異なる抗原ポリペプチドを含む、ステップ;
(d)前記複数の操作されたAPCのうちの活性化している操作されたAPCを識別するステップであって、前記活性化している操作されたAPCが、前記TCRポリペプチドを発現する前記操作された細胞を活性化する、ステップ;および
(e)選択され操作されたAPCの前記抗原ポリペプチドを決定するステップであって、それによって、前記ネイティブに対合したTCR鎖の標的抗原を決定するステップ
を含む、方法。 - (a)ハイスループット並行単一細胞配列決定を使用して、対象由来の生物学的試料から、複数のネイティブに対合したTCR鎖を識別するステップ;
(b)1つまたは複数の操作された細胞においてTCRポリペプチドを発現させるステップであって、前記TCRポリペプチドが、前記ネイティブに対合したTCR鎖の少なくとも1つのペアを含む、ステップ;
(c)前記1つまたは複数の操作された細胞を、複数の操作された抗原提示細胞(APC)のうちの1つまたは複数に接触させるステップであって、前記複数の操作されたAPCの各操作されたAPCが、異なる抗原ポリペプチドを提示する、ステップ;
(d)前記複数の操作されたAPCのうちの反応性の操作されたAPCを識別するステップであって、前記反応性の操作されたAPCが、前記TCRポリペプチドを発現する前記操作された細胞に対する反応性を有し、そして/または前記TCRポリペプチドを発現する前記操作された細胞に対する応答を示す、ステップ;および
(e)選択され操作されたAPCの細胞表面上に提示される前記抗原ポリペプチドを決定するステップであって、それによって、前記ネイティブに対合したTCR鎖の標的抗原を決定するステップ
を含む、方法。 - (a)ハイスループット並行単一細胞配列決定を使用して、対象由来の生物学的試料から、複数のネイティブに対合したTCR鎖を識別するステップ;
(b)1つまたは複数の操作された細胞においてTCRポリペプチドを発現させるステップであって、前記TCRポリペプチドが、前記ネイティブに対合したTCR鎖の少なくとも1つのペアを含む、ステップ;
(c)前記1つまたは複数の操作された細胞を、複数の操作された抗原提示細胞(APC)のうちの1つまたは複数に接触させるステップであって、前記複数の操作されたAPCの各操作されたAPCが、異なる抗原ポリペプチドを提示する、ステップ;
(d)前記複数の操作されたAPCのうちの活性化している操作されたAPCを識別するステップであって、前記活性化している操作されたAPCが、前記TCRポリペプチドを発現する前記操作された細胞を活性化する、ステップ;および
(e)選択され操作されたAPCの細胞表面上に提示される前記抗原ポリペプチドを決定するステップであって、それによって、前記ネイティブに対合したTCR鎖の標的抗原を決定するステップ
を含む、方法。 - (a)ハイスループット並行単一細胞配列決定を使用して、対象由来の生物学的試料から、複数のネイティブに対合したTCR鎖を識別するステップ;
(b)1つまたは複数の操作された細胞においてTCRポリペプチドを発現させるステップであって、前記TCRポリペプチドが、前記ネイティブに対合したTCR鎖の少なくとも1つのペアを含む、ステップ;
(c)前記1つまたは複数の操作された細胞を、複数の操作された抗原提示細胞(APC)に接触させるステップであって、前記複数の操作されたAPCの各操作されたAPCが、異なる抗原ポリペプチドを含む、ステップ;
(d)前記複数の操作されたAPCのうちの反応性の操作されたAPCを識別するステップであって、前記反応性の操作されたAPCが、前記TCRポリペプチドを発現する前記操作された細胞に対する反応性を有し、そして/または前記TCRポリペプチドを発現する前記操作された細胞に対する応答を示す、ステップ;ならびに
(e)選択されたAPCの前記抗原ポリペプチドを決定するステップであって、それによって、前記ネイティブに対合したTCR鎖の標的抗原を決定するステップ
を含む、方法。 - (a)ハイスループット並行単一細胞配列決定を使用して、対象由来の生物学的試料から、複数のネイティブに対合したTCR鎖を識別するステップ;
(b)1つまたは複数の操作された細胞においてTCRポリペプチドを発現させるステップであって、前記TCRポリペプチドが、前記ネイティブに対合したTCR鎖の少なくとも1つのペアを含む、ステップ;
(c)前記1つまたは複数の操作された細胞を、複数の操作された抗原提示細胞(APC)のうちの1つまたは複数に接触させるステップであって、前記複数の操作されたAPCの各操作されたAPCが、異なる抗原ポリペプチドを含む、ステップ;
(d)TCRポリペプチドを発現する前記1つもしくは複数の操作された細胞のうちの操作された細胞に対する反応性を有し、そして/またはTCRポリペプチドを発現する前記1つもしくは複数の操作された細胞のうちの操作された細胞に対する応答を示す、操作されたAPCの前記抗原ポリペプチドを決定するステップ、
(e)前記ネイティブに対合したTCR鎖の標的抗原を決定するステップであって、前記決定された標的抗原が、TCRポリペプチドを発現する前記1つもしくは複数の操作された細胞のうちの前記操作された細胞に対する反応性を有し、そして/またはTCRポリペプチドを発現する前記1つもしくは複数の操作された細胞のうちの前記操作された細胞に対する応答を示す、前記操作されたAPCの前記抗原ポリペプチドである、ステップ
を含む、方法。 - (a)ハイスループット並行単一細胞配列決定を使用して、対象由来の生物学的試料から、複数のネイティブに対合したTCR鎖を識別するステップ;
(b)1つまたは複数の操作された細胞においてTCRポリペプチドを発現させるステップであって、前記TCRポリペプチドが、前記識別されたネイティブに対合したTCR鎖の少なくとも1つのペアを含む、ステップ;
(c)前記1つまたは複数の操作された細胞を、複数の操作された抗原提示細胞(APC)のうちの1つまたは複数に接触させるステップであって、前記複数の操作されたAPCの各操作されたAPCが、異なる抗原ポリペプチドを提示する、ステップ;
(d)TCRポリペプチドを発現する前記1つもしくは複数の操作された細胞のうちの操作された細胞に対する反応性を有し、そして/またはTCRポリペプチドを発現する前記1つもしくは複数の操作された細胞のうちの操作された細胞に対する応答を示す、操作されたAPCの細胞表面上に提示される前記抗原ポリペプチドを決定するステップ;
(e)前記ネイティブに対合したTCR鎖の標的抗原を決定するステップであって、前記決定された標的抗原が、TCRポリペプチドを発現する前記1つもしくは複数の操作された細胞のうちの前記操作された細胞に対する反応性を有し、そして/またはTCRポリペプチドを発現する前記1つもしくは複数の操作された細胞のうちの前記操作された細胞に対する応答を示す、前記操作されたAPCの細胞表面上に提示される前記抗原ポリペプチドである、ステップ
を含む、方法。 - (a)ハイスループット並行単一細胞配列決定を使用して、対象由来の生物学的試料から、複数のネイティブに対合したTCR鎖を識別するステップ;
(b)1つまたは複数の操作された細胞においてTCRポリペプチドを発現させるステップであって、前記TCRポリペプチドが、前記識別されたネイティブに対合したTCR鎖の少なくとも1つのペアを含む、ステップ;
(c)前記1つまたは複数の操作された細胞を、複数の操作された抗原提示細胞(APC)のうちの1つまたは複数に接触させるステップであって、前記複数の操作されたAPCの各操作されたAPCが、異なる抗原ポリペプチドを含む、ステップ;
(d)TCRポリペプチドを発現する前記1つまたは複数の操作された細胞のうちの操作された細胞を活性化する操作されたAPCの前記抗原ポリペプチドを決定するステップ;
(e)前記ネイティブに対合したTCR鎖の標的抗原を決定するステップであって、前記決定された標的抗原が、TCRポリペプチドを発現する前記1つまたは複数の操作された細胞のうちの前記操作された細胞を活性化する前記操作されたAPCの前記抗原ポリペプチドである、ステップ
を含む、方法。 - (a)ハイスループット並行単一細胞配列決定を使用して、対象由来の生物学的試料から、複数のネイティブに対合したTCR鎖を識別するステップ;
(b)1つまたは複数の操作された細胞においてTCRポリペプチドを発現させるステップであって、前記TCRポリペプチドが、前記識別されたネイティブに対合したTCR鎖の少なくとも1つのペアを含む、ステップ;
(c)前記1つまたは複数の操作された細胞を、複数の操作された抗原提示細胞(APC)のうちの1つまたは複数に接触させるステップであって、前記複数の操作されたAPCの各操作されたAPCが、異なる抗原ポリペプチドを提示する、ステップ;
(d)TCRポリペプチドを発現する前記1つまたは複数の操作された細胞のうちの操作された細胞を活性化する操作されたAPCの細胞表面上に提示される前記抗原ポリペプチドを決定するステップ;
(e)前記ネイティブに対合したTCR鎖の標的抗原を決定するステップであって、前記決定された標的抗原が、TCRポリペプチドを発現する前記1つまたは複数の操作された細胞のうちの前記操作された細胞を活性化する前記操作されたAPCの細胞表面上に提示される前記抗原ポリペプチドである、ステップ
を含む、方法。 - (a)1つまたは複数の操作された細胞を、複数の抗原提示細胞(APC)のうちの1つまたは複数に接触させるステップであって、前記1つまたは複数の操作された細胞が、対象由来の単一の免疫細胞のネイティブに対合したTCR鎖の少なくとも1つのペアを含むT細胞受容体(TCR)ポリペプチドを発現する、ステップ;
(b)TCRポリペプチドを発現する前記1つまたは複数の操作された細胞のうちの操作された細胞に対する前記複数のAPCのうちのAPCの反応性についてアッセイするステップ;
(c)TCRポリペプチドを発現する前記1つまたは複数の操作された細胞のうちの前記操作された細胞に対する反応性を有するAPCを選択するステップ;および
(d)前記選択されたAPCの抗原ポリペプチドを決定するステップであって、それによって、前記ネイティブに対合したTCR鎖の標的抗原を決定するステップ
を含む、方法。 - (a)1つまたは複数の操作された細胞を、複数の抗原提示細胞(APC)のうちの1つまたは複数に接触させるステップであって、前記1つまたは複数の操作された細胞が、対象由来の単一の免疫細胞のネイティブに対合したTCR鎖の少なくとも1つのペアを含むT細胞受容体(TCR)ポリペプチドを発現する、ステップ;
(b)TCRポリペプチドを発現する前記1つまたは複数の操作された細胞のうちの操作された細胞による前記複数のAPCのうちのAPCの活性化についてアッセイするステップ;
(c)TCRポリペプチドを発現する前記1つまたは複数の操作された細胞のうちの前記操作された細胞を活性化するAPCを選択するステップ;および
(d)前記選択されたAPCの抗原ポリペプチドを決定するステップであって、それによって、前記ネイティブに対合したTCR鎖の標的抗原を決定するステップ
を含む、方法。 - (a)1つまたは複数の操作された細胞を、複数の抗原提示細胞(APC)のうちの1つまたは複数に接触させるステップであって、前記1つまたは複数の操作された細胞が、対象由来の単一の免疫細胞のネイティブに対合したTCR鎖の少なくとも1つのペアを含むT細胞受容体(TCR)ポリペプチドを発現する、ステップ;
(b)TCRポリペプチドを発現する前記1つまたは複数の操作された細胞のうちの操作された細胞に対する反応性を有する前記複数のAPCのうちのAPCによって提示される抗原ポリペプチドを決定するステップ;および
(c)前記ネイティブに対合したTCR鎖の標的抗原を決定するステップであって、前記決定された標的抗原が、TCRポリペプチドを発現する前記1つまたは複数の操作された細胞のうちの操作された細胞に対する反応性を有する前記複数のAPCのうちの前記APCによって提示される前記決定された抗原ポリペプチドである、ステップ
を含む、方法。 - (a)1つまたは複数の操作された細胞を、複数の抗原提示細胞(APC)に接触させるステップであって、前記1つまたは複数の操作された細胞が、対象由来の単一の免疫細胞のネイティブに対合したTCR鎖の少なくとも1つのペアを含むT細胞受容体(TCR)ポリペプチドを発現する、ステップ;
(b)TCRポリペプチドを発現する前記1つまたは複数の操作された細胞のうちの操作された細胞によって活性化される前記複数のAPCのうちの活性化されたAPCによって提示される抗原ポリペプチドを決定するステップ;および
(c)天然TCR鎖ペアの標的抗原を決定するステップであって、前記決定された標的抗原が、TCRポリペプチドを発現する前記1つまたは複数の操作された細胞のうちの操作された細胞によって活性化される前記複数のAPCのうちの前記活性化されたAPCによって提示される前記決定された抗原ポリペプチドである、ステップ
を含む、方法。 - (a)1つまたは複数の操作された細胞を、疾患と関連する抗原ポリペプチドを提示する複数の操作された抗原提示細胞(APC)に接触させるステップであって、前記1つまたは複数の操作された細胞が、対象由来の単一の免疫細胞のネイティブに対合したTCR鎖の少なくとも1つのペアを含むT細胞受容体(TCR)ポリペプチドを発現する、ステップ;
(b)前記1つもしくは複数の操作された細胞のうちの操作された細胞によって活性化されるか、または前記1つもしくは複数の操作された細胞のうちの操作された細胞に対する反応性を有する前記複数のAPCのうちの操作されたAPCを決定するステップ;
(c)前記1つもしくは複数の操作された細胞のうちの操作された細胞によって活性化されるか、または前記1つもしくは複数の操作された細胞のうちの操作された細胞に対する反応性を有する前記複数のAPCのうちの前記操作されたAPCを選択するステップ
を含む、方法。 - (a)1つまたは複数の操作された細胞を、複数の細胞を含む試料に接触させるステップであって、前記1つまたは複数の操作された細胞が、対象由来の単一の免疫細胞のネイティブに対合したTCR鎖の少なくとも1つのペアを含むT細胞受容体(TCR)ポリペプチドを発現する、ステップ;
(b)TCRポリペプチドを発現する前記1つまたは複数の操作された細胞のうちの操作された細胞に対する反応性と、前記複数の細胞のうちの細胞の前記複数の細胞を含む前記試料中の細胞に対する反応性とについてアッセイするステップ;
(c)前記複数の細胞を含む前記試料から、TCRポリペプチドを発現する前記1つまたは複数の操作された細胞のうちの前記操作された細胞に対する反応性を有する細胞を選択するステップ;および
(d)前記選択された細胞の抗原ポリペプチドを決定するステップであって、それによって、前記ネイティブに対合したTCR鎖の標的抗原を決定するステップ
を含む、方法。 - (a)1つまたは複数の操作された細胞を、複数の細胞を含む試料に接触させるステップであって、前記1つまたは複数の操作された細胞が、対象由来の単一の免疫細胞のネイティブに対合したTCR鎖の少なくとも1つのペアを含むT細胞受容体(TCR)を発現する、ステップ;
(b)TCRポリペプチドを発現する前記1つまたは複数の操作された細胞のうちの操作された細胞による前記複数の細胞のうちの細胞の活性化と、前記複数の細胞を含む前記試料中の細胞による前記複数の細胞のうちの細胞の活性化とについてアッセイするステップ;
(c)前記複数の細胞を含む前記試料から、TCRポリペプチドを発現する前記1つまたは複数の操作された細胞のうちの前記操作された細胞を活性化する細胞を選択するステップ;および
(d)前記選択された細胞の抗原ポリペプチドを決定するステップであって、それによって、前記ネイティブに対合したTCR鎖の標的抗原を決定するステップ
を含む、方法。 - (a)1つまたは複数の操作された細胞を、複数の細胞を含む試料に接触させるステップであって、前記1つまたは複数の操作された細胞が、対象由来の単一の免疫細胞のネイティブに対合したTCR鎖の少なくとも1つのペアを含むT細胞受容体(TCR)ポリペプチドを発現する、ステップ;
(b)前記複数の細胞を含む前記試料中の、TCRポリペプチドを発現する前記1つまたは複数の操作された細胞のうちの操作された細胞に対する反応性を有する細胞によって提示される抗原ポリペプチドを決定するステップ、
(c)前記ネイティブに対合したTCR鎖の標的抗原を決定するステップであって、前記決定された標的抗原が、前記複数の細胞を含む前記試料中の、TCRポリペプチドを発現する前記1つまたは複数の操作された細胞のうちの操作された細胞に対する反応性を有する細胞によって提示される前記決定された抗原ポリペプチドである、ステップ
を含む、方法。 - (a)1つまたは複数の操作された細胞を、複数の細胞を含む試料に接触させるステップであって、前記1つまたは複数の操作された細胞が、対象由来の単一の免疫細胞のネイティブに対合したTCR鎖の少なくとも1つのペアを含むT細胞受容体(TCR)ポリペプチドを発現する、ステップ;
(b)前記複数の細胞を含む前記試料中の、TCRポリペプチドを発現する前記1つまたは複数の操作された細胞のうちの操作された細胞を活性化する細胞によって提示される抗原ポリペプチドを決定するステップ、
(c)前記ネイティブに対合したTCR鎖の標的抗原を決定するステップであって、前記決定された標的抗原が、前記複数の細胞を含む前記試料中の、TCRポリペプチドを発現する前記1つまたは複数の操作された細胞のうちの操作された細胞を活性化する前記細胞によって提示される前記決定された抗原ポリペプチドである、ステップ
を含む、方法。 - 前記複数のネイティブに対合したTCR鎖が、同時に、または単一の反応から識別される、請求項1から18のいずれか一項に記載の方法。
- 前記APCが、操作されたAPCである、請求項10から13のいずれか一項に記載の方法。
- 前記TCRポリペプチドが、外因性ポリヌクレオチドから発現される、請求項1から20のいずれか一項に記載の方法。
- 前記抗原ポリペプチドが、外因性ポリヌクレオチド配列から発現される、請求項1から21のいずれか一項に記載の方法。
- 前記複数の操作されたAPCの各操作されたAPCが、異なる抗原をコードする外因性ポリヌクレオチド配列から発現される抗原ポリペプチドを含む、請求項1から9および14から22のいずれか一項に記載の方法。
- 前記1つまたは複数の操作された細胞が、外因性ポリヌクレオチド配列からTCRポリペプチドを発現する、請求項1から23のいずれか一項に記載の方法。
- 前記外因性ポリヌクレオチド配列が、第1のT細胞受容体(TCR)鎖および第2のTCR鎖をコードする、請求項24に記載の方法。
- 前記第1および第2のTCR鎖が、ネイティブに対合したTCR鎖の前記少なくとも1つのペアを含む、請求項25に記載の方法。
- 前記操作された細胞によって活性化されるか、または前記操作されたAPCに対する反応性を有する前記操作されたAPCが、免疫療法薬としての使用のためである、請求項14に記載の方法。
- 前記操作されたAPCが、複数の操作された細胞を認識する複数の操作されたAPCを含む、請求項14または27に記載の方法。
- 前記複数の操作されたAPCが、少なくとも1つのMHC型を発現する、請求項14、27または28に記載の方法。
- 前記複数の操作されたAPCが、少なくとも2つのMHC型を発現する、請求項14または27から29のいずれか一項に記載の方法。
- 前記操作された細胞によって活性化されるか、または前記操作された細胞に対する反応性を有する前記操作されたAPCが、前記操作された細胞の前記TCRポリペプチドに特異的なMHC型を発現する、請求項14または27から30のいずれか一項に記載の方法。
- 前記複数の操作された細胞が、前記複数の操作されたAPC中の前記操作されたAPCによって発現されるMHC型に特異的なTCRポリペプチドを発現する、請求項14または27から31のいずれか一項に記載の方法。
- 疾患と関連する前記抗原ポリペプチドが既知である、請求項14または27から32のいずれか一項に記載の方法。
- 前記1つまたは複数の操作された細胞が、第1の対象由来の第1の複数の操作された細胞と第2の対象由来の第2の複数の操作された細胞とを含み、前記複数の操作されたAPCが、第1の複数の操作されたAPCと第2の複数の操作されたAPCとを含む、請求項33に記載の方法。
- 前記第1の複数の操作された細胞を、前記第1の複数のAPCに接触させるステップ、および前記第2の複数の操作された細胞を、前記第2の複数のAPCに接触させるステップを含む、請求項33に記載の方法。
- 前記第1の複数の操作されたAPCと第2の複数の操作されたAPCとが、同じ抗原ポリペプチドを提示する、請求項33または35に記載の方法。
- 前記第1の複数の操作されたAPCが、第1のMHC型を発現し、前記第2の複数の操作されたAPCが、第2のMHC型を発現する、請求項33から36のいずれか一項に記載の方法。
- 前記第1の複数の操作された細胞が、前記第1の複数の操作されたAPCによって発現される前記第1のMHC型に特異的な第1のTCRポリペプチドを発現し、前記第2の複数の操作された細胞が、前記第2の複数の操作されたAPCによって発現される前記第2のMHC型に特異的な第2のTCRポリペプチドを発現する、請求項33から37のいずれか一項に記載の方法。
- 前記TCRポリペプチドが、免疫療法薬としての使用のためである、請求項1から38のいずれか一項に記載の方法。
- ハイスループット並行単一細胞配列決定を使用して、対象由来の生物学的試料から、複数のネイティブに対合したTCR鎖を識別するステップであって、前記複数のネイティブに対合したTCR鎖が、同時に、または単一の反応から識別される、ステップをさらに含む、請求項1から39のいずれか一項に記載の方法。
- 同時に、または単一の反応から識別された前記識別されたネイティブに対合したTCR鎖の少なくとも1つを発現する1つまたは複数の操作された細胞を生成するステップをさらに含む、請求項1から40のいずれか一項に記載の方法。
- 前記APCが、罹患対象由来である、請求項1から41のいずれか一項に記載の方法。
- 前記試料細胞が、対象由来である、請求項1から42のいずれか一項に記載の方法。
- 前記試料細胞が細胞株である、請求項1から43のいずれか一項に記載の方法。
- 前記試料細胞が、罹患対象由来である、請求項1から44のいずれか一項に記載の方法。
- 前記抗原提示細胞が、がんを有する対象由来である、請求項1から45のいずれか一項に記載の方法。
- 前記抗原提示細胞が、ウイルスが感染した対象由来である、請求項1から46のいずれか一項に記載の方法。
- 前記抗原提示細胞が、前記単一の免疫細胞と同じ対象由来である、請求項1から47のいずれか一項に記載の方法。
- 前記抗原提示細胞が、前記単一の免疫細胞を含む前記対象のMHCレパートリーと類似の主要組織適合性複合体(MHC)レパートリーを有する対象由来である、請求項1から48のいずれか一項に記載の方法。
- 前記抗原提示細胞が、前記単一の免疫細胞を含む前記対象のMHCハプロタイプと類似の主要組織適合性複合体(MHC)ハプロタイプを有する対象由来である、請求項1から49のいずれか一項に記載の方法。
- 前記抗原提示細胞が、前記単一の免疫細胞を含む前記対象と適合性の主要組織適合性複合体(MHC)レパートリーを有する対象由来である、請求項1から50のいずれか一項に記載の方法。
- 前記操作されたAPCが、前記対象とマッチしたMHC遺伝子を発現するように操作される、請求項1から51のいずれか一項に記載の方法。
- 前記操作されたAPCが、K562細胞株に由来する、請求項1から52のいずれか一項に記載の方法。
- 前記TCRポリペプチドを発現する前記操作された細胞が、Jurkat細胞株に由来する、請求項1から53のいずれか一項に記載の方法。
- 前記抗原提示細胞が初代細胞である、請求項1から54のいずれか一項に記載の方法。
- 前記抗原提示細胞が細胞株である、請求項1から55のいずれか一項に記載の方法。
- 対象由来の抗原提示細胞(APC)が、前記TCRポリペプチドを発現する前記操作された細胞に対する反応性を有する、請求項1から56のいずれか一項に記載の方法。
- 対象由来の抗原提示細胞(APC)が、前記TCRポリペプチドを発現する前記操作された細胞によって活性化される、請求項1から57のいずれか一項に記載の方法。
- 前記選択され操作されたAPCを単離するステップをさらに含む、請求項1から58のいずれか一項に記載の方法。
- 前記操作されたAPCの前記抗原を決定する前記ステップが、前記操作されたAPCによって提示される抗原をコードする前記操作されたAPCの配列を配列決定することを含む、請求項1から59のいずれか一項に記載の方法。
- 前記操作されたAPCが、蛍光活性化セルソーティングによって単離される、請求項1から60のいずれか一項に記載の方法。
- 第1のT細胞受容体(TCR)鎖および第2のTCR鎖をコードする前記外因性ポリヌクレオチド配列をトランスフェクトするステップをさらに含む、請求項1から61のいずれか一項に記載の方法。
- 異なる抗原をコードする前記外因性ポリヌクレオチド配列をトランスフェクトするステップをさらに含む、請求項1から62のいずれか一項に記載の方法。
- 前記操作されたAPCの細胞表面に異なる抗原を添加するステップをさらに含む、請求項1から63のいずれか一項に記載の方法。
- 前記接触させるステップの前に、前記対象由来の前記単一の免疫細胞の前記ネイティブに対合したTCR鎖配列を決定するステップをさらに含む、請求項1から64のいずれか一項に記載の方法。
- 複数のネイティブに対合したTCR鎖の各々の前記標的抗原を決定するステップをさらに含む、請求項1から65のいずれか一項に記載の方法。
- 前記操作された細胞が、ネイティブに対合したTCR鎖配列の異なるペアを各々が発現する複数の操作された細胞を含む、請求項1から66のいずれか一項に記載の方法。
- 前記操作された細胞が、内因性TCRポリペプチドを発現しない操作されたT細胞である、請求項1から67のいずれか一項に記載の方法。
- 前記操作された細胞が、内因性TCR遺伝子を転写しない操作されたT細胞である、請求項1から68のいずれか一項に記載の方法。
- 前記操作された細胞が、内因性TCR遺伝子を含まない操作されたT細胞である、請求項1から69のいずれか一項に記載の方法。
- 前記操作された細胞が、TCRノックアウト細胞である操作されたT細胞である、請求項1から70のいずれか一項に記載の方法。
- 前記抗原提示細胞が、異なる抗原を各々が提示する複数の抗原提示細胞を含む、請求項1から71のいずれか一項に記載の方法。
- 前記アッセイするステップの前記抗原提示細胞が、別々のベッセル中にある、請求項1から72のいずれか一項に記載の方法。
- 前記操作された細胞がT細胞である、請求項1から73のいずれか一項に記載の方法。
- 前記操作された細胞が、CD4を発現する、請求項1から74のいずれか一項に記載の方法。
- 前記操作された細胞が、CD8を発現する、請求項1から75のいずれか一項に記載の方法。
- 前記APCが、外因性レポーター配列を含む、請求項1から76のいずれか一項に記載の方法。
- 前記APCが、レポーター遺伝子をコードする外因性レポーター配列を含む、請求項1から77のいずれか一項に記載の方法。
- 前記レポーター遺伝子がルシフェラーゼ遺伝子である、請求項78に記載の方法。
- 前記レポーター遺伝子が、蛍光タンパク質をコードする、請求項79に記載の方法。
- 前記レポーター遺伝子が、細胞表面タンパク質をコードする、請求項80に記載の方法。
- 細胞表面に発現されたタンパク質リガンドの、前記操作されたAPC上の合成Notch(synNotch)受容体への結合が、前記レポーター遺伝子の発現を引き起こす、請求項78から81のいずれか一項に記載の方法。
- 前記細胞表面に発現されたタンパク質リガンドが、前記操作された細胞によって発現される、請求項82に記載の方法。
- 前記細胞表面に発現されたタンパク質リガンドが、誘導性プロモーターの制御下にある、請求項82または83に記載の方法。
- 前記誘導性プロモーターがNFATプロモーターである、請求項84に記載の方法。
- 前記synNotch受容体が切断され、GAL4−VP64ドメインなどの転写アクチベータードメインが生成される、請求項82から85のいずれか一項に記載の方法。
- 前記転写アクチベータードメインが、前記レポーター遺伝子の発現を誘導する、請求項86に記載の方法。
- 前記転写アクチベータードメインが、GAL4−UAS活性化性配列などの活性化性配列への結合によって、前記レポーター遺伝子の発現を誘導する、請求項87に記載の方法。
- 前記レポーター遺伝子の発現が、前記APCによる前記操作された細胞の活性化を示す、請求項78から88のいずれか一項に記載の方法。
- 前記レポーター遺伝子の発現が、前記操作された細胞に対する前記操作されたAPCの反応性を示す、請求項78から89のいずれか一項に記載の方法。
- 前記アッセイするステップが、前記レポーター遺伝子の発現についてアッセイすることを含む、請求項1から90のいずれか一項に記載の方法。
- 前記アッセイすることが、cDNAアレイ、mRNA検出またはタンパク質検出を含む、請求項91に記載の方法。
- 前記操作されたAPCが、レポーター遺伝子をコードする外因性レポーター配列を含む、請求項1から92のいずれか一項に記載の方法。
- 前記レポーター遺伝子がルシフェラーゼ遺伝子である、請求項93に記載の方法。
- 前記レポーター遺伝子が、蛍光タンパク質をコードする、請求項93に記載の方法。
- 前記レポーター遺伝子が、細胞表面タンパク質をコードする、請求項93に記載の方法。
- 前記レポーター遺伝子が、IL6、IL−12、IFNα、IL−23、IL−1、TNFまたはIL−10をコードする、請求項93に記載の方法。
- 前記細胞表面タンパク質が、CD80、CD86、MHCI、MHCII、CD11c、CD11b、CD8α、OX40−L、ICOS−1またはCD40である、請求項96に記載の方法。
- 前記レポーター遺伝子が、前記操作された細胞上のCD28への、前記操作されたAPC上のCD80/CD86の結合に応答して活性化される、請求項93から98のいずれか一項に記載の方法。
- 前記レポーター遺伝子が、前記操作されたAPC中のNotchシグナル伝達活性化の下流で活性化される、請求項93から99のいずれか一項に記載の方法。
- 前記レポーター遺伝子が、前記操作されたAPC中のPI3K/AKTシグナル伝達活性化の下流で活性化される、請求項93から100のいずれか一項に記載の方法。
- 前記レポーター遺伝子が、NF−κB経路またはNOTCH1シグナル伝達経路の下流で活性化される、請求項93から101のいずれか一項に記載の方法。
- 前記レポーター遺伝子が、第2の受容体の下流で活性化される、請求項93から102のいずれか一項に記載の方法。
- 前記第2の受容体が、前記操作された細胞によって分泌されるリガンドを結合した後に活性化される、請求項103に記載の方法。
- 前記リガンドの発現が、前記操作されたAPC上の合成Notch(synNotch)受容体の結合後に誘導される、請求項104に記載の方法。
- 前記操作されたAPCが、内因性MHCポリペプチドを発現しない、請求項1から105のいずれか一項に記載の方法。
- 前記操作されたAPCが、内因性MHC遺伝子を転写しない、請求項1から106のいずれか一項に記載の方法。
- 前記操作されたAPCが、内因性MHC遺伝子を含まない、請求項1から107のいずれか一項に記載の方法。
- 前記第1のTCR鎖が、TCR−アルファ鎖を含み、前記第2のTCR鎖が、TCR−ベータ鎖を含む、請求項1から108のいずれか一項に記載の方法。
- 前記第1のTCR鎖が、TCR−ガンマ鎖を含み、前記第2のTCR鎖が、TCR−デルタ鎖を含む、請求項1から109のいずれか一項に記載の方法。
- 処置の方法であって、請求項1から110のいずれか一項の方法に従って決定された前記抗原を含むタンパク質に対して標的化された治療薬を、それを必要とする対象に投与するステップを含む、方法。
- 前記対象がヒトである、請求項111に記載の方法。
- 前記治療薬が、小分子、ペプチド、タンパク質、抗体もしくはその断片、細胞療法または免疫療法である、請求項111または112に記載の方法。
- 前記細胞療法が、養子細胞療法を含む、請求項113に記載の方法。
- 請求項1から110のいずれか一項に記載の方法に従って識別された前記複数のTCR鎖のうちの1つまたは複数のネイティブに対合したTCR鎖を発現するように操作されたT細胞を投与するステップを含む、請求項114に記載の方法。
- 前記対象が、疾患または病状を有する、請求項111から115のいずれか一項に記載の方法。
- 前記疾患または病状ががんである、請求項116に記載の方法。
- 請求項38の前記第1のTCRポリペプチドおよび前記第2のTCRポリペプチドを含むTCRポリペプチドのライブラリー。
- 前記第1のTCRポリペプチドが、前記抗原ポリペプチドと前記第1のMHC型のMHCとを含む複合体に特異的であり、前記第2のTCRポリペプチドが、前記抗原ポリペプチドと前記第2のMHC型のMHCとを含む複合体に特異的である、請求項118に記載のライブラリー。
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