JP2021525282A - 抗体ライブラリーの構築方法およびその使用 - Google Patents
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Abstract
Description
前記第1エレメントは、cisアクティベーターおよびスクリーニングマーカー遺伝子を含み、前記第2エレメントは、細胞外抗体ライブラリーコーディング領域、Notchコアドメイン、および細胞内転写ドメインを含む抗体ライブラリーの構築方法を提供する。
(1)cisアクティベーターおよびスクリーニングマーカー遺伝子を有するベクターを細胞にトランスフェクションするステップと、
(2)N端からC端まで順に細胞外抗体ライブラリーコーディング領域、Notchコアドメイン、細胞内転写ドメインを担持するベクターを、ステップ(1)の細胞内にトランスフェクションし、抗体発現細胞ライブラリーである抗体ライブラリーを取得するステップと、
を含む。
(1)抗体ライブラリーと抗原とを接触するステップと、
(2)スクリーニングマーカー遺伝子の発現状況に応じ、ターゲット抗体を発現した細胞をスクリーニングするステップと、
を含む第2態様に記載の抗体ライブラリーを用いてスクリーニングを行う抗体のスクリーニング方法であって、
前記抗体は、モノクローナル抗体またはポリクローナル抗体を含み、
前記抗原は、野生型細胞、特定の抗原遺伝子をトランスフェクションした細胞、特定の抗原を結合した細胞、培地に溶解した抗原、培養皿に被覆された抗原、マイクロビーズに被覆された抗原、および培養足場に被覆された抗原のうちのいずれか1種または少なくとも2種の組み合わせを含む抗体のスクリーニング方法を提供する。
cisアクティベーターおよびスクリーニングマーカー遺伝子を含む第1エレメントと、
細胞外抗体ライブラリーコーディング領域をコードする遺伝子、Notchコアドメインをコードする遺伝子、および細胞内転写ドメインをコードする遺伝子を含む第2エレメントと、
を含む抗体をスクリーニングするためのシステムを更に提供する。
cisアクティベーターおよびスクリーニングマーカー遺伝子を含む第1エレメントと、細胞外抗体ライブラリーコーディング領域をコードする遺伝子、Notchコアドメインをコードする遺伝子、および細胞内転写ドメインをコードする遺伝子を含む第2エレメントとを細胞にトランスフェクションすることと、
前記細胞に前記細胞外抗体ライブラリーコーディング領域を発現させることと、
前記細胞と抗原とを接触することと、
前記スクリーニングマーカー遺伝子の発現状況に応じ、ターゲット抗体を発現した細胞をスクリーニングすることにより、ターゲット抗体をスクリーニングすることと、
を含む上記システムを用いて抗体をスクリーニングする方法を更に提供する。
構築した発現ベクターをレンチウイルスに包装し、ウイルスによりK562細胞にトランスフェクションし、トランスフェクションしてから2日間後に、培地に1μg/mLのピューロマイシンを加えてスクリーニングし、CD19またはGPC3を安定して発現したK562細胞を得た。フローサイトメータにより青色蛍光タンパク質の発現がほぼ100%に達したことを検出し(図12)、抗原がK562細胞で安定して発現していることを示した。
(付記1)
第1エレメントおよび第2エレメントを同一のベクターまたは異なるベクターに挿入し、前記ベクターを細胞内にトランスフェクションし、抗体発現細胞ライブラリーである抗体ライブラリーを取得することを含む抗体ライブラリーの構築方法であって、
前記第1エレメントは、cisアクティベーターおよびスクリーニングマーカー遺伝子を含み、前記第2エレメントは、細胞外抗体ライブラリーコーディング領域、Notchコアドメイン、および細胞内転写ドメインを含む、抗体ライブラリーの構築方法。
前記スクリーニングマーカー遺伝子は、薬剤耐性遺伝子、自殺遺伝子、蛍光タンパク質遺伝子、および分子タグのうちのいずれか1種または少なくとも2種の組み合わせを含む、付記1に記載の方法。
前記薬剤耐性遺伝子は、ピューロマイシン耐性遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子、ブラストサイジン耐性遺伝子、およびハイグロマイシンB耐性遺伝子のうちのいずれか1種または少なくとも2種の組み合わせを含み、
前記自殺遺伝子は、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ遺伝子、シトシンデアミナーゼ遺伝子、およびiCasp9自殺システム遺伝子のうちのいずれか1種または少なくとも2種の組み合わせを含み、
前記蛍光タンパク質遺伝子は、EGFP、YFP、mCherry、DsRed、およびBFPのうちのいずれか1種または少なくとも2種の組み合わせを含み、
前記分子タグは、His−tag、Flag−tag、HA−tag、Myc−tag、およびStrep−tagのうちのいずれか1種または少なくとも2種の組み合わせを含む、付記2に記載の方法。
前記スクリーニングマーカー遺伝子のスクリーニング方法は、薬剤スクリーニング、フローサイトメータによる検出と選別、および磁気ビーズ選別のうちのいずれか1種または少なくとも2種の組み合わせを含む、付記1〜3のいずれか1つに記載の方法。
前記薬剤耐性遺伝子のスクリーニング薬剤は、ピューロマイシン、G418、ブラストサイジン、およびハイグロマイシンBのうちのいずれか1種または少なくとも2種の組み合わせを含み、
前記自殺遺伝子のスクリーニング薬剤は、ガンシクロビルまたはFIAU、5−フルオロシトシン、AP1903、およびAP20187のうちのいずれか1種または少なくとも2種の組み合わせを含む、付記3に記載の方法。
前記細胞外抗体ライブラリーコーディング領域は、抗体配列、抗体重鎖配列、抗体軽鎖配列、抗体可変領域配列、一本鎖抗体配列、単一ドメイン抗体配列、およびFab断片配列のうちのいずれか1種または少なくとも2種の組み合わせを含む、付記1〜5のいずれか1つに記載の方法。
前記細胞外抗体ライブラリーコーディング領域の由来は、免疫動物、患者、健康者、ワクチン接種者、および人工合成のうちのいずれか1種または少なくとも2種の組み合わせを含む、付記1〜6のいずれか1つに記載の方法。
前記Notchコアドメインは、ヒトのNotch、マウスのNotch、またはヒトのNotchもしくはマウスのNotchとの類似性が85%以上の配列を含み、
前記ヒトのNotchのアミノ酸配列はSEQ ID NO.1に示すとおりであり、
前記マウスのNotchのアミノ酸配列はSEQ ID NO.2に示すとおりである、付記1〜7のいずれか1つに記載の方法。
前記cisアクティベーターは、pTetおよび/またはUAS−pSV40を含む、付記1〜8のいずれか1つに記載の方法。
前記細胞内転写ドメインは、tTAおよび/またはGal4−VP64を含む、付記1〜9のいずれか1つに記載の方法。
前記トランスフェクションの方法は、ウイルストランスフェクション、化学トランスフェクション、試薬トランスフェクション、および電撃トランスフェクションのうちのいずれか1種または少なくとも2種の組み合わせを含む、付記1〜10のいずれか1つに記載の方法。
前記コーディング領域、ドメイン、または遺伝子は、コーディングタンパク質のアミノ酸配列、コーディングタンパク質のDNA配列、またはコーディングタンパク質のRNA配列のうちのいずれか1種または少なくとも2種の組み合わせを含む、付記1〜11のいずれか1つに記載の方法。
付記1〜12のいずれか1つに記載の方法で構築された抗体ライブラリー。
(1)前記抗体ライブラリーと抗原とを接触するステップと、
(2)スクリーニングマーカー遺伝子の発現状況に応じ、ターゲット抗体を発現した細胞をスクリーニングするステップと、
を含む付記13に記載の抗体ライブラリーを用いることで抗体をスクリーニングする方法であって、
前記抗体は、モノクローナル抗体またはポリクローナル抗体を含み、
前記抗原は、野生型細胞、特定の抗原遺伝子をトランスフェクションした細胞、特定の抗原を結合した細胞、培地に溶解した抗原、培養皿に被覆された抗原、マイクロビーズに被覆された抗原、および培養足場に被覆された抗原のうちのいずれか1種または少なくとも2種の組み合わせを含む、方法。
付記14に記載の方法でスクリーニングされた抗体。
cisアクティベーターおよびスクリーニングマーカー遺伝子を含む第1エレメントと、
細胞外抗体ライブラリーコーディング領域をコードする遺伝子、Notchコアドメインをコードする遺伝子、および細胞内転写ドメインをコードする遺伝子を含む第2エレメントと、
を含む、抗体をスクリーニングするためのシステム。
cisアクティベーターおよびスクリーニングマーカー遺伝子を含む第1エレメントと、細胞外抗体ライブラリーコーディング領域をコードする遺伝子、Notchコアドメインをコードする遺伝子、および細胞内転写ドメインをコードする遺伝子を含む第2エレメントとを細胞にトランスフェクションすることと、
前記細胞に前記細胞外抗体ライブラリーコーディング領域を発現させることと、
前記細胞と抗原とを接触することと、
前記スクリーニングマーカー遺伝子の発現状況に応じ、ターゲット抗体を発現した細胞をスクリーニングすることにより、ターゲット抗体をスクリーニングすることと、
を含む、付記16に記載のシステムを用いて抗体をスクリーニングする方法。
Claims (17)
- 第1エレメントおよび第2エレメントを同一のベクターまたは異なるベクターに挿入し、前記ベクターを細胞内にトランスフェクションし、抗体発現細胞ライブラリーである抗体ライブラリーを取得することを含む抗体ライブラリーの構築方法であって、
前記第1エレメントは、cisアクティベーターおよびスクリーニングマーカー遺伝子を含み、前記第2エレメントは、細胞外抗体ライブラリーコーディング領域、Notchコアドメイン、および細胞内転写ドメインを含む、抗体ライブラリーの構築方法。 - 前記スクリーニングマーカー遺伝子は、薬剤耐性遺伝子、自殺遺伝子、蛍光タンパク質遺伝子、および分子タグのうちのいずれか1種または少なくとも2種の組み合わせを含む、請求項1に記載の方法。
- 前記薬剤耐性遺伝子は、ピューロマイシン耐性遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子、ブラストサイジン耐性遺伝子、およびハイグロマイシンB耐性遺伝子のうちのいずれか1種または少なくとも2種の組み合わせを含み、
前記自殺遺伝子は、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ遺伝子、シトシンデアミナーゼ遺伝子、およびiCasp9自殺システム遺伝子のうちのいずれか1種または少なくとも2種の組み合わせを含み、
前記蛍光タンパク質遺伝子は、EGFP、YFP、mCherry、DsRed、およびBFPのうちのいずれか1種または少なくとも2種の組み合わせを含み、
前記分子タグは、His−tag、Flag−tag、HA−tag、Myc−tag、およびStrep−tagのうちのいずれか1種または少なくとも2種の組み合わせを含む、請求項2に記載の方法。 - 前記スクリーニングマーカー遺伝子のスクリーニング方法は、薬剤スクリーニング、フローサイトメータによる検出と選別、および磁気ビーズ選別のうちのいずれか1種または少なくとも2種の組み合わせを含む、請求項1〜3のいずれか1項に記載の方法。
- 前記薬剤耐性遺伝子のスクリーニング薬剤は、ピューロマイシン、G418、ブラストサイジン、およびハイグロマイシンBのうちのいずれか1種または少なくとも2種の組み合わせを含み、
前記自殺遺伝子のスクリーニング薬剤は、ガンシクロビルまたはFIAU、5−フルオロシトシン、AP1903、およびAP20187のうちのいずれか1種または少なくとも2種の組み合わせを含む、請求項3に記載の方法。 - 前記細胞外抗体ライブラリーコーディング領域は、抗体配列、抗体重鎖配列、抗体軽鎖配列、抗体可変領域配列、一本鎖抗体配列、単一ドメイン抗体配列、およびFab断片配列のうちのいずれか1種または少なくとも2種の組み合わせを含む、請求項1〜5のいずれか1項に記載の方法。
- 前記細胞外抗体ライブラリーコーディング領域の由来は、免疫動物、患者、健康者、ワクチン接種者、および人工合成のうちのいずれか1種または少なくとも2種の組み合わせを含む、請求項1〜6のいずれか1項に記載の方法。
- 前記Notchコアドメインは、ヒトのNotch、マウスのNotch、またはヒトのNotchもしくはマウスのNotchとの類似性が85%以上の配列を含み、
前記ヒトのNotchのアミノ酸配列はSEQ ID NO.1に示すとおりであり、
前記マウスのNotchのアミノ酸配列はSEQ ID NO.2に示すとおりである、請求項1〜7のいずれか1項に記載の方法。 - 前記cisアクティベーターは、pTetおよび/またはUAS−pSV40を含む、請求項1〜8のいずれか1項に記載の方法。
- 前記細胞内転写ドメインは、tTAおよび/またはGal4−VP64を含む、請求項1〜9のいずれか1項に記載の方法。
- 前記トランスフェクションの方法は、ウイルストランスフェクション、化学トランスフェクション、試薬トランスフェクション、および電撃トランスフェクションのうちのいずれか1種または少なくとも2種の組み合わせを含む、請求項1〜10のいずれか1項に記載の方法。
- 前記コーディング領域、ドメイン、または遺伝子は、コーディングタンパク質のアミノ酸配列、コーディングタンパク質のDNA配列、またはコーディングタンパク質のRNA配列のうちのいずれか1種または少なくとも2種の組み合わせを含む、請求項1〜11のいずれか1項に記載の方法。
- 請求項1〜12のいずれか1項に記載の方法で構築された抗体ライブラリー。
- (1)前記抗体ライブラリーと抗原とを接触するステップと、
(2)スクリーニングマーカー遺伝子の発現状況に応じ、ターゲット抗体を発現した細胞をスクリーニングするステップと、
を含む請求項13に記載の抗体ライブラリーを用いることで抗体をスクリーニングする方法であって、
前記抗体は、モノクローナル抗体またはポリクローナル抗体を含み、
前記抗原は、野生型細胞、特定の抗原遺伝子をトランスフェクションした細胞、特定の抗原を結合した細胞、培地に溶解した抗原、培養皿に被覆された抗原、マイクロビーズに被覆された抗原、および培養足場に被覆された抗原のうちのいずれか1種または少なくとも2種の組み合わせを含む、方法。 - 請求項14に記載の方法でスクリーニングされた抗体。
- cisアクティベーターおよびスクリーニングマーカー遺伝子を含む第1エレメントと、
細胞外抗体ライブラリーコーディング領域をコードする遺伝子、Notchコアドメインをコードする遺伝子、および細胞内転写ドメインをコードする遺伝子を含む第2エレメントと、
を含む、抗体をスクリーニングするためのシステム。 - cisアクティベーターおよびスクリーニングマーカー遺伝子を含む第1エレメントと、細胞外抗体ライブラリーコーディング領域をコードする遺伝子、Notchコアドメインをコードする遺伝子、および細胞内転写ドメインをコードする遺伝子を含む第2エレメントとを細胞にトランスフェクションすることと、
前記細胞に前記細胞外抗体ライブラリーコーディング領域を発現させることと、
前記細胞と抗原とを接触することと、
前記スクリーニングマーカー遺伝子の発現状況に応じ、ターゲット抗体を発現した細胞をスクリーニングすることにより、ターゲット抗体をスクリーニングすることと、
を含む、請求項16に記載のシステムを用いて抗体をスクリーニングする方法。
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