本発明は、少なくとも1つのオープンリーディングフレームと少なくとも1つの3’−非翻訳領域エレメント(3’−UTRエレメント)及び/又は少なくとも1つの5’−非翻訳領域エレメント(5’−UTRエレメント)とを含む人工核酸分子であって、高い翻訳効率によって特徴付けられる人工核酸分子に関する。翻訳効率には、5’−UTRエレメント若しくは3’−UTRエレメント、又は5’−UTRエレメント及び3’−UTRエレメントの両方が少なくとも部分的に寄与する。本発明は、更に、遺伝子療法及び/又は遺伝子ワクチン接種におけるかかる人工核酸分子の使用に関する。更に、新規3’−UTRエレメント及び5’−UTRエレメントが提供される。
第1の態様では、本発明は、
a.少なくとも1つのオープンリーディングフレーム(ORF)と、
b.少なくとも1つの3’−非翻訳領域エレメント(3’−UTRエレメント)及び/又は少なくとも1つの5’−非翻訳領域エレメント(5’−UTRエレメント)とを含み、高い翻訳効率によって特徴付けられる人工核酸分子に関する。
例えば、本発明の人工核酸分子は、少なくとも1つの3’−UTRエレメント(好ましくは、1つの3’−UTRエレメント)が少なくとも1つの非同一の3’−UTRエレメント(好ましくは、1つの3’−UTRエレメント)に置換されているか、又は少なくとも1つの5’−UTRエレメント(好ましくは、1つの5’−UTRエレメント)が少なくとも1つの非同一の5’−UTRエレメント(好ましくは、1つの5’−UTRエレメント)に置換されている点で他の(例えば、野生型又は人工)核酸分子とは異なり得る。
一般的に、(出発核酸分子又はレファレンス核酸分子における)1つの(又は少なくとも1つの)3’−UTRエレメントの置換又は1つの(又は少なくとも1つの)5’−UTRエレメントの置換は、一般的に、前記3’−UTRエレメント又は前記5’−UTRエレメントの少なくとも幾つかのヌクレオチドの配列が、非同一の核酸配列によって置換されることを意味する。好ましくは、5’−UTRエレメントが置換されるとき、5’−UTRエレメントのヌクレオチドの連続配列が、非同一のヌクレオチドの連続配列(エレメント)によって置換され;3’−UTRエレメントが置換されるとき、3’−UTRエレメントのヌクレオチドの連続配列が、非同一のヌクレオチドの連続配列(エレメント)によって置換される。元の(置換される)エレメントのヌクレオチドの連続配列及び置換するエレメントのヌクレオチドの連続配列は、それぞれ独立して任意の長さ、例えば、1ヌクレオチド以上500ヌクレオチド超、20ヌクレオチド〜500ヌクレオチド、40ヌクレオチド〜400ヌクレオチド、60ヌクレオチド〜300ヌクレオチド、80ヌクレオチド〜200ヌクレオチド、又は100ヌクレオチド〜150ヌクレオチドであってよい。(5’−又は3’−)UTRエレメントが置換されるとき、これは、必ずしも、開始コドンの5’に位置する全てのヌクレオチド又は終止コドンの3’に位置する全てのヌクレオチドが置換されることを意味するものではない。好ましい実施形態では、それぞれ開始コドンの5’に位置する全てのヌクレオチドのサブセット又は終止コドンの3’に位置する全てのヌクレオチドのサブセットである連続配列が置換される。その例を図1B(5’)及び図1C(3’)に示す。出発配列又はレファレンス配列に存在する公知の5’−UTRエレメント又は公知の3’−UTRエレメントを正確に置換することが可能である。例えば、(例えば、レファレンス)核酸が配列番号208に係る配列に対応する5’−UTRエレメントを含むとき、本発明の人工核酸分子は、配列番号208に係る連続配列全体を、非同一の本発明に係る連続5’−UTRエレメント、即ち、高い翻訳効率を与える5’−UTRエレメントによって正確に置換することにより作製することができる。或いは、公知のUTRエレメントを正確には置換しない、例えば、追加のヌクレオチド(即ち、公知のUTRエレメントに加えて)を含む連続核酸配列を置換するか、又は例えば、公知のUTRエレメントの一部のみ(通常、大部分、即ち、長さの90%以上)を置換することも可能である。本明細書では5’−UTRエレメントの場合についてこれら可能性を説明してきたが、3’−UTRエレメントについても同じ可能性が存在する。言い換えれば、置換されるUTRエレメントは、必ずしも公知のUTRエレメントの正確な境界によって限定される必要はない。これら可能性については、一例として、それぞれ図1B及び図1Cを図1Aと比較することにより更に説明する。同様に、置換するUTRエレメントは、必ずしも、公知のUTRエレメントの正確な境界によって限定される必要はない。
好ましくは、本発明に係る人工核酸分子は、リボソームタンパク質S6、RPL36AL、rps16、又はリボソームタンパク質L9の3’−UTR(エレメント)及び/又は5’−UTR(エレメント)を含まない。より好ましくは、本発明に係る人工核酸分子は、リボソームタンパク質S6、RPL36AL、rps16、又はリボソームタンパク質L9の3’−UTR(エレメント)及び/又は5’−UTR(エレメント)を含まず、本発明に係る人工核酸分子のオープンリーディングフレームは、GFPタンパク質をコードしていない。更により好ましくは、本発明に係る人工核酸分子は、リボソームタンパク質S6、RPL36AL、rps16、又はリボソームタンパク質L9の3’−UTR(エレメント)及び/又は5’−UTR(エレメント)を含まず、本発明に係る人工核酸分子のオープンリーディングフレームは、例えば、グロビンタンパク質(特に、ベータ−グロビン)、ルシフェラーゼタンパク質、GFPタンパク質、グルクロニダーゼタンパク質(特に、ベータ−グルクロニダーゼ)、又はこれらの変異体、例えば、グロビンタンパク質、ルシフェラーゼタンパク質、GFPタンパク質、又はグルクロニダーゼタンパク質に対して少なくとも70%の配列同一性を示す変異体からなる群から選択されるレポータータンパク質をコードしていない。
用語「3’−UTRエレメント」は、3’−UTR又は3’−UTRの変異体若しくは断片に由来する核酸配列を含むか又はからなる核酸配列を指す。「3’−UTRエレメント」は、好ましくは、人工核酸配列(例えば、人工mRNA)の3’−UTRによって含まれる核酸配列を指す。したがって、本発明の意味において、好ましくは、3’−UTRエレメントは、mRNA(好ましくは、人工mRNA)の3’−UTRによって含まれていてもよく、3’−UTRエレメントは、それぞれの転写テンプレートの3’−UTRによって含まれていてもよい。好ましくは、3’−UTRエレメントは、mRNAの3’−UTR、好ましくは人工mRNA(例えば、遺伝的に改変されているベクターコンストラクトの転写によって得られるmRNA)の3’−UTRに相当する核酸配列である。好ましくは、本発明の意味における3’−UTRエレメントは、3’−UTRとして機能するか、又は3’−UTRの機能を発揮するヌクレオチド配列をコードしている。
したがって、用語「5’−UTRエレメント」は、5’−UTR又は5’−UTRの変異体若しくは断片に由来する核酸配列を含むか又はからなる核酸配列を指す。「5’−UTRエレメント」は、好ましくは、人工核酸配列(例えば、人工mRNA)の5’−UTRによって含まれる核酸配列を指す。したがって、本発明の意味において、好ましくは、5’−UTRエレメントは、mRNA(好ましくは人工mRNA)の5’−UTRによって含まれていてもよく、5’−UTRエレメントは、それぞれの転写テンプレートの5’−UTRによって含まれていてもよい。好ましくは、5’−UTRエレメントは、mRNAの5’−UTR、好ましくは人工mRNA(例えば、遺伝的に改変されているベクターコンストラクトの転写によって得られるmRNA)の5’−UTRに相当する核酸配列である。好ましくは、本発明の意味における5’−UTRエレメントは、5’−UTRとして機能するか、又は5’−UTRの機能を発揮するヌクレオチド配列をコードしている。
本発明に係る人工核酸分子における3’−UTRエレメント及び/又は5’−UTRエレメントは、前記人工核酸分子に高い翻訳効率を与える。したがって、本発明に係る人工核酸分子は、特に、以下を含んでいてよい:
− 前記人工核酸分子に高い翻訳効率を与える3’−UTRエレメント、
− 前記人工核酸分子に高い翻訳効率を与える5’−UTRエレメント、
− 前記人工核酸分子に高い翻訳効率を与える3’−UTRエレメント及び前記人工核酸分子に高い翻訳効率を与える5’−UTRエレメント。
好ましくは、本発明に係る人工核酸分子は、前記人工核酸分子に高い翻訳効率を与える3’−UTRエレメント及び前記人工核酸分子に高い翻訳効率を与える5’−UTRエレメントを含む。
好ましくは、本発明に係る人工核酸分子は、少なくとも1つの3’−UTRエレメント及び少なくとも1つの5’−UTRエレメント、即ち、前記人工核酸分子に高い翻訳効率を与える少なくとも1つの3’−UTRエレメント及び前記人工核酸分子に高い翻訳効率を与える少なくとも1つの5’−UTRエレメントを含む。
以下に詳細に記載する通り、前記人工核酸分子に高い翻訳効率を与える前記少なくとも1つの3’−UTRエレメント又は前記人工核酸分子に高い翻訳効率を与える前記少なくとも1つの5’−UTRエレメントは、自然界に存在する(好ましくは、異種の)3’−UTRエレメント及び5’−UTRエレメント(共に自然界に存在するUTRエレメント又は野生型UTRエレメント)、並びに人工3’−UTRエレメント及び人工5’−UTRエレメント(共に人工UTRエレメント)から選択することができる。野生型UTRエレメントは、文献及び公的にアクセス可能なデータベース、例えば、GenBank(NCBI)に公開されている野生型UTRエレメント、並びにこれまでに公開されていない野生型UTRエレメントを含む群から選択することができる。後者は、細胞、好ましくは哺乳類細胞にみられるmRNaの配列を決定することによって同定することができる。本発明者らは、このアプローチを使用してこれまでに公開されていない幾つかの野生型UTRエレメントを同定し、この種のUTRエレメントを本発明に提供する。人工UTRエレメントという用語は特に限定されず、自然界ではみられない、即ち、野生型UTRエレメントと非同一である任意の核酸配列を指すことができる。しかし、好ましい実施形態では、本発明で使用される人工UTRエレメントは、野生型UTRエレメントに対して特定の配列同一度、例えば、10%〜99.9%、20%〜99%、30%〜98%、40%〜97%、50%〜96%、60%〜95%、70%〜90%を示す核酸配列である。好ましい実施形態では、本発明で使用される人工UTRは、1つ、又は2つ、又は3つ、又は4つ、又は5つ、又は5超のヌクレオチドが同数のヌクレオチドによって置換されている(例えば、1つのヌクレオチドが1つのヌクレオチドによって置換されている)ことを除いて、野生型UTRと同一である。好ましくは、1つのヌクレオチドの置換は、それぞれの相補的ヌクレオチドによる置換である。好ましい人工UTRエレメントは、(i)野生型5’−UTRエレメント(存在する場合)におけるATGトリプレットの一部又は全てがトリプレットTAGに変換されている;及び/又は(ii)野生型5’−UTRエレメント若しくは野生型3’−UTRエレメント(存在する場合)における選択された特定の制限酵素の切断部位が、前記特定の制限酵素の切断部位内の1つのヌクレオチドを相補的ヌクレオチドで置換することによって除去され、それによって、前記特定の制限酵素の切断部位が除去されていることを除いて、野生型UTRエレメントに対応する。後者は、通常、(例えば、野生型)UTRエレメントが前記特定の制限酵素の切断部位を含むとき及び前記特定の制限酵素が後続のクローニング工程で使用される(ことが計画されている)ときに望ましい。5’−UTRエレメント及び3’−UTRエレメントのかかる内部切断は望ましくないので、前記特定の制限酵素の制限酵素切断部位が除去されている人工UTRエレメントを作製してよい。かかる置換は、当業者に公知の任意の公的な方法によって、例えば、PCRにより改変プライマーを使用することによって行うことができる。
任意で、本発明に係る人工核酸分子は、少なくとも1つの3’−UTRエレメント及び少なくとも1つの5’−UTRエレメント、即ち、前記人工核酸分子からのタンパク質産生を延長及び/又は増加させる少なくとも1つの3’−UTRエレメント並びに前記人工核酸分子からのタンパク質産生を延長及び/又は増加させる少なくとも1つの5’−UTRエレメントを含む。
タンパク質産生;タンパク質産生が延長及び/又は増加しているかどうかを判定するためのアッセイ
「前記人工核酸分子からのタンパク質産生を延長及び/又は増加させる」とは、一般的に、3’−UTR及び/又は5’−UTRが欠損している又はレファレンス3’−UTR及び/又はレファレンス5’−UTR(例えば、自然界においてORFと併存する3’−UTR及び/又は5’−UTR)を含むそれぞれのレファレンス核酸から産生されるタンパク質の量と比較した、それぞれの3’−UTRエレメント及び/又は5’−UTRエレメントを有する本発明に係る人工核酸分子から産生されるタンパク質の量に言及する。
特に、本発明に係る人工核酸分子の少なくとも1つの3’−UTRエレメント及び/又は5’−UTRエレメントは、3’−UTR及び/又は5’−UTRが欠損しているか又はレファレンス3’−UTR及び/又は5’−UTR(例えば、自然界においてORFと併存する3’−UTR及び/又は5’−UTR)を含むそれぞれの核酸と比較して、本発明に係る人工核酸分子(例えば、本発明に係るmRNA)からのタンパク質産生を延長する。
特に、本発明に係る人工核酸分子の少なくとも1つの3’−UTRエレメント及び/又は5’−UTRエレメントは、3’−UTR及び/又は5’−UTRが欠損しているか又はレファレンス3’−UTR及び/又は5’−UTR(例えば、自然界においてORFと併存する3’−UTR及び/又は5’−UTR)を含むそれぞれの核酸と比較して、本発明に係る人工核酸分子(例えば、本発明に係るmRNA)からのタンパク質産生、特に、タンパク質発現及び/又は総タンパク質産生を増加させる。
好ましくは、本発明に係る人工核酸分子の少なくとも1つの3’−UTRエレメント及び/又は少なくとも1つの5’−UTRエレメントは、3’−UTR及び/又は5’−UTRが欠損しているか又はレファレンス3’−UTR及び/又はレファレンス5’−UTR(例えば、自然界においてORFと併存する3’−UTR及び/又は5’−UTR)を含むそれぞれの核酸の翻訳効率と比較して、核酸の翻訳効率に負の影響を与えない。或いは、翻訳効率は、自然界の状況においてそれぞれのORFによってコードされているタンパク質の翻訳効率と比較して、前記3’−UTR及び/又は5’−UTRによって増強される。
用語「それぞれの核酸分子」又は「レファレンス核酸分子」とは、本明細書で使用するとき、様々な3’−UTR及び/又は5’−UTRは別にして、レファレンス核酸分子が、3’−UTRエレメント及び/又は5’−UTRエレメントを含む本発明の人工核酸分子と同等、好ましくは同一であることを意味する。
インビボ又は本明細書に定義されるインビトロ(即ち、インビトロとは、(「生」)細胞及び/又は組織(生体の組織を含む)を指し;細胞は、特に、細胞株、初代細胞、組織又は被験体における細胞を含み、哺乳類細胞(例えば、ヒト細胞及びマウス細胞)が好ましく、ヒト細胞株HeLa、HEPG2、及びU−937並びにマウス細胞株NIH3T3、JAWSII、及びL929が特に好ましく、更に、初代細胞が特に好ましく、特に好ましい実施形態では、ヒト皮膚線維芽細胞(HDF)である)における本発明の人工核酸分子によるタンパク質産生を評価するために、本発明の人工核酸分子の標的細胞/組織への注入/トランスフェクション後に、コードされているタンパク質の発現を測定し、レファレンス核酸によって誘導されるタンパク質発現と比較する。タンパク質発現を測定する定量的な方法は、当技術分野において公知である(例えば、ウエスタンブロット、FACS、ELISA、質量分析)。この状況において特に有用なのは、ルシフェラーゼ、緑色蛍光タンパク質(GFP)、又は分泌アルカリホスファターゼ(SEAP)等のレポータータンパク質の発現の測定である。したがって、好ましくは哺乳類の発現系(例えば、HDF、L929、HepG2、及び/又はHeLa細胞等の哺乳類細胞)において、例えば、トランスフェクション又は注入を介して、本発明に係る人工核酸分子又はレファレンス核酸を標的組織又は細胞に導入する。核酸分子の発現開始又は導入の数時間又は数日間(例えば、6時間、12時間、24時間、48時間、又は72時間)後に、標的細胞サンプルを回収し、FACSを介して測定する及び/又は溶解させる。その後、溶解物を用いて、例えば、ウエスタンブロット、FACS、ELISA、質量分析等の幾つかの方法を用いて、又は蛍光若しくは発光測定によって、発現したタンパク質を検出することができる(延いては、タンパク質発現の効率を求めることができる)。
したがって、特定の時点(例えば、核酸分子の発現開始又は導入の6時間後、12時間後、24時間後、48時間後、又は72時間後)において、本発明に係る人工核酸分子からのタンパク質発現をレファレンス核酸分子からのタンパク質発現と比較する場合、両核酸分子を別々に標的組織/細胞に導入し、特定の時点後に前記組織/細胞からサンプルを回収し、特定の検出方法(例えば、当技術分野において公知であるウエスタンブロット、ELISA、蛍光若しくは発光測定等)に合わせた特定のプロトコールに従ってタンパク質溶解物を調製し、選択した検出方法によってタンパク質を検出する。細胞溶解物中の発現タンパク質量を測定する代わりに、又は回収した細胞を溶解させる前に若しくは並行してアリコートを用いて細胞溶解物中のタンパク質量を測定することに加えて、FACS分析を用いることによってタンパク質量を求めてもよい。
人工核酸分子(例えば、人工mRNA)からの「タンパク質産生を延長する」という用語は、好ましくは、哺乳類発現系(例えば、HDF、L929、HEP2G、又はHeLa細胞)において(例えば、レファレンス3’−UTR及び/又は5’−UTRを含むか又は3’−UTR及び/又は5’−UTRが欠損している)レファレンス核酸分子(例えば、レファレンスmRNA)からのタンパク質産生と比べて、人工核酸分子(例えば、人工mRNA)からのタンパク質産生が延長されることを意味する。したがって、人工核酸分子(例えば、人工mRNA)から産生されるタンパク質は、レファレンス核酸分子から産生されるタンパク質についてみられ得る期間よりも長い期間観察可能である。言い換えれば、後続時点、例えば、トランスフェクションの48時間後又は72時間後に測定される人工核酸分子(例えば、人工mRNA)から産生されるタンパク質の量は、対応する後続時点におけるレファレンス核酸分子(例えば、レファレンスmRNA)から産生されるタンパク質の量よりも多い。かかる「後続時点」は、発現の開始後、例えば、核酸分子のトランスフェクション後24時間を超える任意の時点、例えば、発現の開始、即ち、トランスフェクションの36時間後、48時間後、60時間後、72時間後、96時間後であってよい。更に、同じ核酸については、後続時点で産生されたタンパク質の量を、より早い(レファレンス)時点で産生された量に対して正規化してもよく、例えば、後続時点におけるタンパク質の量を、トランスフェクションの24時間後におけるタンパク質の量の百分率として表してよい。
好ましくは、このタンパク質産生を延長する効果は、(i)好ましくは哺乳類発現系(例えば、HDF、L929、HEP2G、又はHeLa細胞)において、コードされているレポータータンパク質(例えば、ルシフェラーゼ)の発現によって得られるタンパク質量を経時的に測定し、(ii)「レファレンス」時点t1(例えば、t1=トランスフェクションの24時間後)において観察されるタンパク質の量を測定し、このタンパク質量を100%に設定し、(iii)1以上の後続時点t2、t3等(例えば、t2=トランスフェクションの48時間後及びt3=トランスフェクションの72時間後)において観察されるタンパク質の量を測定し、後続時点において観察される相対タンパク質量を時点t1におけるタンパク質量の百分率として計算することによって求められる。例えば、t1における量が「80」であり、t2における量が「20」であり、t3における量が「10」であると表されるタンパク質では、t2におけるタンパク質の相対量は25%であり、t3では12.5%である。次いで、工程(iv)において、後続時点におけるこれら相対量を、それぞれ3’−UTR及び/又は5’−UTRが欠損しているか又はそれぞれレファレンス3’−UTR及び/又は5’−UTRを含む核酸分子の対応する時点における相対タンパク質と比較してよい。本発明に係る人工核酸分子から産生される相対タンパク質量を、レファレンス核酸分子、即ち、それぞれ3’−UTR及び/又は5’−UTRが欠損しているか又はそれぞれレファレンス3’−UTR及び/又は5’−UTRを含む核酸分子から産生される相対タンパク質量と比較することによって、本発明に係る人工核酸分子からのタンパク質産生がレファレンス核酸分子からのタンパク質産生と比べて何倍延長されるかを決定することができる。
好ましくは、本発明に係る人工核酸分子における少なくとも1つの3’−UTRエレメント及び/又は5’−UTRエレメントは、それぞれ3’−UTR及び/又は5’−UTRが欠損しているか又はそれぞれレファレンス3’−UTR及び/又は5’−UTRを含むレファレンス核酸分子からのタンパク質産生と比べて、前記人工核酸分子からのタンパク質産生を少なくとも1.2倍、好ましくは少なくとも1.5倍、より好ましくは少なくとも2倍、更により好ましくは少なくとも2.5倍延長する。言い換えれば、上記特定の後続時点において本発明に係る人工核酸分子から産生されるタンパク質の(相対)量は、同じ後続時点においてレファレンス核酸分子(例えば、それぞれ3’−UTR及び/又は5’−UTRが欠損しているか又はそれぞれレファレンス3’−UTR及び/又は5’−UTRを含む)から産生されるタンパク質の(相対)量と比べて少なくとも1.2倍、好ましくは少なくとも1.5倍、より好ましくは少なくとも2倍、更により好ましくは少なくとも2.5倍増加する。
或いは、このタンパク質産生を延長する効果は、(i)好ましくは哺乳類発現系(例えば、HDF、L929、HEP2G、又はHeLa細胞)において、コードされているレポータータンパク質(例えば、ルシフェラーゼ)の発現によって得られるタンパク質量を経時的に測定し、(ii)タンパク質量が、人工核酸分子の発現開始の1時間後、2時間後、3時間後、4時間後、5時間後、又は6時間後(例えば、トランスフェクションの1時間後、2時間後、3時間後、4時間後、5時間後、又は6時間後)等に観察されるタンパク質量を下回る時点を求め、(iii)前記タンパク質量が発現開始の1時間後、2時間後、3時間後、4時間後、5時間後、又は6時間後に観察されたタンパク質量を下回る時点を、それぞれ3’−UTR及び/又は5’−UTRが欠損しているか又はそれぞれレファレンス3’−UTR及び/又は5’−UTRを含む核酸分子について求めた前記時点と比較することによって求めることもできる。
例えば、人工核酸分子(例えば、人工mRNA)からのタンパク質産生は、哺乳類の発現系(例えば、HDF、L929、HEP2G、又はHeLa細胞等の哺乳類細胞)において、レファレンス核酸分子(例えば、レファレンスmRNA)からのタンパク質産生と比べて、少なくとも核酸分子の発現開始(例えば、トランスフェクション)の1時間後、2時間後、3時間後、4時間後、5時間後、又は6時間後等の発現の初期相において観察される量である量において、少なくとも約5時間、好ましくは少なくとも約10時間、より好ましくは少なくとも約24時間延長される。したがって、本発明に係る人工核酸分子は、好ましくは、それぞれ3’−UTR及び/又は5’−UTRが欠損しているか又はそれぞれレファレンス3’−UTR及び/又は5’−UTRを含むレファレンス核酸分子と比べて、少なくとも発現開始(例えば、トランスフェクション)の1時間後、2時間後、3時間後、4時間後、5時間後、又は6時間後等、発現の初期相において観察される量である量において、タンパク質産生を少なくとも約5時間、好ましくは少なくとも約10時間、より好ましくは少なくとも約24時間延長することができる。
好ましい実施形態では、本発明に係る人工核酸分子からのタンパク質産生期間は、それぞれ3’−UTR及び/又は5’−UTRが欠損しているか又はそれぞれレファレンス3’−UTR及び/又は5’−UTRを含むレファレンス核酸分子からのタンパク質産生と比べて、少なくとも1.2倍、好ましくは少なくとも1.5倍、より好ましくは少なくとも2倍、更により好ましくは少なくとも2.5倍延びる。
好ましくは、このタンパク質産生を延長する効果が得られると同時に、例えば、48時間又は72時間の期間内に本発明に係る人工核酸分子から産生されるタンパク質の合計量は、それぞれ3’−UTR及び/又は5’−UTRが欠損しているか又はそれぞれレファレンス3’−UTR及び/又は5’−UTR(例えば、自然界において前記人工核酸分子のORFと併存している3’−UTR及び/又は5’−UTR)を含むレファレンス核酸分子から産生されるタンパク質の量に少なくとも対応する。したがって、本発明は、上に指定した哺乳類の発現系(例えば、HDF、L929、HEP2G、又はHeLa細胞等の哺乳類細胞)においてタンパク質産生を延長することができる人工核酸分子であって、例えば、48時間又は72時間の期間内に前記人工核酸分子から産生されるタンパク質の合計量が、少なくとも、例えば、前記期間内にそれぞれ3’−UTR及び/又は5’−UTRが欠損しているか又はそれぞれレファレンス3’−UTR及び/又は5’−UTR(例えば、自然界において前記人工核酸分子のORFと併存している3’−UTR及び/又は5’−UTR)を含むレファレンス核酸分子から産生されるタンパク質の合計量である人工核酸分子を提供する。
更に、用語「タンパク質発現の延長」は、「タンパク質発現の安定化」も含み、「タンパク質発現の安定化」とは、好ましくは、それぞれレファレンス3’−UTR及び/又は5’−UTRを含むか又はそれぞれ3’−UTR及び/又は5’−UTRが欠損しているレファレンス核酸分子(例えば、mRNA)と比べたとき、所定の期間、例えば、24時間、より好ましくは48時間、更により好ましくは72時間に亘って本発明に係る人工核酸分子からより均一にタンパク質が産生されることを意味する。
したがって、本発明に係る3’−UTRエレメント及び/又は5’−UTRエレメントを含む人工核酸分子(例えば、本発明に係るmRNA)からの(例えば、哺乳類系における)タンパク質産生のレベルは、好ましくは、レファレンス核酸分子(例えば、上記レファレンスmRNA)について観察される程度まで低下することはない。特定の核酸分子からのタンパク質産生が低下する程度を評価するために、例えば、発現開始の24時間後、例えば、本発明に係る人工核酸分子を細胞(例えば、哺乳類細胞)にトランスフェクトした24時間後に観察される(それぞれのORFによってコードされている)タンパク質の量を、発現開始の48時間後、例えば、トランスフェクションの48時間後に観察されるタンパク質の量と比較してよい。後続時点、例えば、発現開始(例えば、トランスフェクション)の48時間後に観察される、本発明に係る人工核酸分子のORFによってコードされているタンパク質の量、例えば、レポータータンパク質(例えば、ルシフェラーゼ)の量の、より早い時点、例えば、発現開始(例えば、トランスフェクション)の24時間後に観察されるタンパク質の量に対する比は、好ましくは、したがって、それぞれレファレンス3’−UTR及び/又は5’−UTRを含むか又はそれぞれ3’−UTR及び/又は5’−UTRが欠損しているレファレンス核酸分子についての対応する比(同時点を含む)よりも高い。
好ましくは、後続時点、例えば、発現開始(例えば、トランスフェクション)の48時間後に観察される、本発明に係る人工核酸分子のORFによってコードされているタンパク質、例えば、レポータータンパク質(例えば、ルシフェラーゼ)の量の、より早い時点、例えば、発現開始(例えば、トランスフェクション)の24時間後に観察されるタンパク質の量に対する比は、好ましくは少なくとも0.2、より好ましくは少なくとも約0.3、より好ましくは少なくとも約0.4、更により好ましくは少なくとも約0.5、特に好ましくは少なくとも約0.7である。それぞれレファレンス3’−UTR及び/又は5’−UTRを含むか又はそれぞれ3’−UTR及び/又は5’−UTRが欠損しているそれぞれのレファレンス核酸分子(例えば、mRNA)の場合、前記比は、例えば、約0.05〜約0.35であってよい。
したがって、本発明は、ORFと上記3’−UTRエレメント及び/又は5’−UTRエレメントとを含む人工核酸分子であって、好ましくは、哺乳類の発現系(例えば、HDF細胞又はHeLa細胞等の哺乳類細胞)における、発現開始の48時間後に観察されるタンパク質の量(例えば、ルシフェラーゼの量)の、発現開始の24時間後に観察されるタンパク質の量に対する比が、好ましくは少なくとも0.2、より好ましくは少なくとも約0.3、より好ましくは少なくとも約0.4、更により好ましくは少なくとも約0.5、更により好ましくは少なくとも約0.6、特に好ましくは少なくとも約0.7である人工核酸分子を提供する。それによって、好ましくは、例えば、48時間の期間内に前記人工核酸分子から産生されるタンパク質の合計量は、少なくとも、それぞれ3’−UTR及び/又は5’−UTRが欠損しているか又はそれぞれレファレンス3’−UTR及び/又は5’−UTR(例えば、自然界において人工核酸分子のORFと併存している3’−UTR及び/又は5’−UTR)を含むレファレンス核酸分子から、例えば、前記期間内に産生されるタンパク質の合計量に対応する。
好ましくは、本発明は、ORFと上記3’−UTRエレメント及び/又は5’−UTRエレメントとを含む人工核酸分子であって、好ましくは、哺乳類の発現系(例えば、HeLa細胞又はHDF細胞等の哺乳類細胞)における、発現開始の72時間後に観察されるタンパク質の量(例えば、ルシフェラーゼの量)の、発現開始の24時間後に観察されるタンパク質の量に対する比が、好ましくは約0.05超、より好ましくは約0.1超、更により好ましくは約0.2超、更により好ましくは約0.3超であり、好ましくは、例えば、72時間の期間内に前記人工核酸分子から産生されるタンパク質の合計量が、少なくとも、それぞれ3’−UTR及び/又は5’−UTRが欠損しているか又はそれぞれレファレンス3’−UTR及び/又は5’−UTR(例えば、自然界において人工核酸分子のORFと併存している3’−UTR及び/又は5’−UTR)を含むレファレンス核酸分子から、例えば、前記期間内に産生されるタンパク質の合計量である人工核酸分子を提供する。
本発明において、「タンパク質発現の増加」又は「タンパク質発現の増強」とは、好ましくは、レファレンス核酸分子によって誘導される発現と比べて発現開始後のある時点におけるタンパク質発現が増加/増強すること又は発現するタンパク質の合計量が増加/増強することを意味する。したがって、本発明に係る人工核酸分子の発現開始後(例えば、トランスフェクション後)、例えば、本発明に係るmRNAのトランスフェクション後の特定の時点、例えば、トランスフェクションの6時間後、12時間後、24時間後、48時間後、又は72時間後において観察されるタンパク質レベルは、好ましくは、レファレンス核酸分子(例えば、それぞれレファレンス3’−UTR及び/又は5’−UTRを含むか又はそれぞれ3’−UTR及び/又は5’−UTRが欠損しているレファレンスmRNA)の発現開始後(例えば、トランスフェクション後)の同時点で観察されるタンパク質レベルよりも高い。好ましい実施形態では、人工核酸分子から発現するタンパク質の最大量(例えば、タンパク質の活性又は質量によって決定)は、それぞれレファレンス3’−UTR及び/又は5’−UTRを含むか又はそれぞれ3’−UTR及び/又は5’−UTRが欠損しているレファレンス核酸から発現するタンパク質量に比べて増加する。例えば、トランスフェクション後好ましくは48時間以内、より好ましくは24時間以内、更により好ましくは12時間以内にピーク発現レベルに達する。
好ましくは、本発明に係る人工核酸分子からの「合計タンパク質産生量の増加」又は「合計タンパク質産生量の増強」という用語は、それぞれ3’−UTR及び/又は5’−UTRが欠損しているか又はそれぞれレファレンス3’−UTR及び/又は5’−UTRを含むレファレンス核酸分子と比べて、好ましくは哺乳類の発現系(例えば、HDF、L929、HEP2G、又はHeLa細胞等の哺乳類細胞)において、人工核酸分子からタンパク質が産生される期間、例えば、48時間又は72時間に亘って、タンパク質産生量が増加/増強することを指す。好ましい実施形態によれば、経時的に発現するタンパク質の累積量は、本発明に係る人工核酸分子を用いたときに増加する。
特定の期間における合計タンパク質量は、(i)人工核酸分子の導入後の幾つかの時点で(例えば、人工核酸分子の発現開始又は導入の6時間後、12時間後、24時間後、48時間後、及び72時間後)組織又は細胞を回収することによって求めることができ、上で説明した通り、時点当たりのタンパク質量を求めることができる。累積タンパク質量を計算するために、合計タンパク質量を求める数学的方法を用いてよく、例えば、以下の式に従って曲線下面積(AUC)を求めてよい。
合計タンパク質量についての曲線下面積を計算するために、各エンドポイント(a及びb)からの発現曲線の積分式を計算する。
したがって、「合計タンパク質産生量」は、好ましくは、経時的なタンパク質産生量を表す曲線下面積(AUC)を指す。
好ましくは、本発明に係る少なくとも1つの3’−UTRエレメント又は5’−UTRエレメントは、それぞれ3’−UTR及び/又は5’−UTRが欠損しているレファレンス核酸分子から産生されるタンパク質と比べて、前記人工核酸分子からのタンパク質産生を少なくとも1.5倍、好ましくは少なくとも2倍、より好ましくは少なくとも2.5倍増加させる。言い換えれば、特定の時点、例えば、発現の開始(例えば、トランスフェクション)の48時間後又は72時間後における本発明に係る人工核酸分子から産生されるタンパク質の合計量は、対応する後続時点におけるレファレンス核酸分子(例えば、それぞれ3’−UTR及び/又は5’−UTRが欠損しているか又はそれぞれレファレンス3’−UTR及び/又は5’−UTRを含む)から産生されるタンパク質の(相対)量と比べて少なくとも1.5倍、好ましくは少なくとも2倍、より好ましくは少なくとも2.5倍増加する。
本発明に係る人工核酸分子の少なくとも1つの3’−UTRエレメント及び/又は少なくとも1つの5’−UTRエレメントのmRNA及び/又はタンパク質産生の延長効果及び効率、及び/又はタンパク質産生の増加効果及び効率に加えて、3’−UTR及び/又は5’−UTRの変異体、断片、及び/又は変異体断片のmRNA及び/又はタンパク質産生の延長効果及び効率、及び/又はタンパク質産生の増加効果及び効率は、当業者に公知である、この目的に適した任意の方法によって求めることができる。
例えば、レポータータンパク質(例えば、ルシフェラーゼ)のコード配列/オープンリーディングフレーム(ORF)及び本発明に係る3’−UTRエレメントを含む、即ち、人工mRNA分子からのタンパク質産生を延長及び/又は増加させる人工mRNA分子を作製することができる。更に、かかる本発明のmRNA分子は、更に、本発明に係る、即ち、前記人工mRNA分子からのタンパク質産生を延長及び/又は増加させる5’−UTRエレメントを含んでいてもよく、5’−UTRエレメントを含んでいなくてもよく、本発明に係らない5’−UTRエレメント、例えば、レファレンス5’−UTRを含んでいてもよい。したがって、レポータータンパク質(例えば、ルシフェラーゼ)のコード配列/オープンリーディングフレーム(ORF)と、本発明に係る、即ち、前記人工mRNA分子からのタンパク質産生を延長及び/又は増加させる5’−UTRエレメントとを含む人工mRNA分子を作製することができる。更に、かかる本発明のmRNA分子は、更に、本発明に係る、即ち、前記人工mRNA分子からのタンパク質産生を延長及び/又は増加させる3’−UTRエレメントを含んでいてもよく、3’−UTRエレメントを含んでいなくてもよく、本発明に係らない3’−UTRエレメント、例えば、レファレンス3’−UTRを含んでいてもよい。
本発明によれば、mRNAは、例えば、T7プロモータとそれぞれのmRNA配列をコードしている配列とを含むそれぞれのベクター(例えば、プラスミドベクター)のインビトロ転写によって作製することができる。作製されたmRNA分子は、mRNAをトランスフェクトするのに適した任意のトランスフェクション法によって細胞にトランスフェクトしてよい。哺乳類細胞(例えば、HeLa細胞又はHDF細胞)にリポフェクトしてよく、トランスフェクション後の特定の時点、例えば、トランスフェクションの6時間後、24時間後、48時間後、及び72時間後にサンプルを分析してよい。前記サンプルは、当業者に周知の方法によってmRNA量及び/又はタンパク質量について分析してよい。例えば、サンプリング時点で細胞中に存在するレポーターmRNAの量は、定量PCR法によって求めることができる。それぞれのmRNAによってコードされているレポータータンパク質の量は、例えば、用いられるレポータータンパク質に依存して、ウエスタンブロット、ELISAアッセイ、FACS分析、又はレポーターアッセイ(例えば、ルシフェラーゼアッセイ)によって求めることができる。タンパク質発現の安定化及び/又はタンパク質発現の延長の効果は、例えば、トランスフェクションの48時間後に観察されるタンパク質レベルの、トランスフェクションの24時間後に観察されるタンパク質レベルに対する比を求めることによって分析することができる。前記値が1に近いほど、この期間内におけるタンパク質発現がより安定である。かかる測定は、無論、72時間以上の時点で実施してもよく、タンパク質発現の安定性を求めるために、トランスフェクションの72時間後に観察されるタンパク質レベルとトランスフェクションの24時間後に観察されるタンパク質レベルとの比を求めてもよい。
翻訳効率;翻訳効率を測定するためのアッセイ
上に詳細に記載した通り、翻訳効率は、オープンリーディングフレーム(ORF)を含む核酸分子(例えば、mRNA)の性質であり、典型的には、前記核酸分子に含まれる特定のUTRエレメント(特定の5’−UTRエレメント又は特定の3’−UTRエレメント)によって与えられる。翻訳効率は、典型的には、ORFから翻訳されるタンパク質の量を用いて測定される。これに関して、本発明は、一般的な方法及び具体的なアッセイを提供する。様々な、例えば2以上の核酸分子の翻訳効率は、例えば、ORFによってコードされているタンパク質の実験的定量によって比較することができる。
一般的に、翻訳効率を評価するために、細胞ベースの方法が使用される。翻訳効率は、本発明の人工核酸分子により、本明細書に定義される通りインビボ又はインビトロにおいて実験的に試験され(即ち、インビトロとは、(「生存」)細胞及び/又は組織(生存被験体の組織を含む)を指し;細胞は、特に、細胞株、初代細胞、組織又は被験体中の細胞を含み、哺乳類細胞、例えば、ヒト細胞及びマウス細胞が好ましく、ヒト細胞株HeLa、HEPG2、及びU−937並びにマウス細胞株NIH3T3、JAWSII、及びL929が特に好ましく、更に初代細胞が特に好ましく、特定の好ましい実施形態では、ヒト皮膚線維芽細胞(HDF))、コードされているタンパク質の発現は、本発明の人工核酸分子を標的細胞/組織に注入/トランスフェクションした後に測定され、レファレンス核酸分子によって誘導されるタンパク質発現と比較される。タンパク質発現を測定する定量的な方法は、当該技術分野において公知である(例えば、ウエスタンブロット、FACS、ELISA、質量分析)。この状況において特に有用なのは、ルシフェラーゼ、緑色蛍光タンパク質(GFP)、又は分泌アルカリホスファターゼ(SEAP)等のレポータータンパク質の発現の測定である。したがって、好ましくは哺乳類発現系、例えば哺乳類細胞、例えばHDF、L929、HepG2及び/又はHeLa細胞において、例えばトランスフェクション又は注入を介して、本発明に係る人工核酸又はレファレンス核酸を標的組織又は細胞に導入する。核酸分子の発現開始又は導入の数時間又は数日間(例えば、6時間、12時間、24時間、48時間、又は72時間)後に、標的細胞サンプルを回収し、FACSを介して測定する及び/又は溶解させる。その後、幾つかの方法、例えば、ウエスタンブロット、FACS、ELISA、質量分析を使用して、又は蛍光若しくは発光を測定することによって、発現したタンパク質を検出する(ひいては、翻訳効率を測定する)ために溶解物を使用することができる。
したがって、特定の時点(例えば、核酸分子の発現開始又は導入の6時間後、12時間後、24時間後、48時間後、又は72時間後)において、本発明に係る人工核酸分子からのタンパク質発現をレファレンス核酸分子からのタンパク質発現と比較する場合、両核酸分子を別々に標的組織/細胞に導入し、特定の時点後に前記組織/細胞からサンプルを回収し、特定の検出方法(例えば、当該技術分野において公知であるウエスタンブロット、ELISA、蛍光又は発光測定等)に合わせた特定のプロトコールに従ってタンパク質溶解物を調製し、選択した検出方法によってタンパク質を検出する。細胞溶解物中の発現タンパク質量を測定する代わりに、又は回収した細胞を溶解させる前に細胞溶解物中のタンパク質量を測定すること若しくは並行してアリコートを使用することに加えて、FACS分析を用いることによってタンパク質量を測定してもよい。
特に記載しない限り、他の一般的な態様は、タンパク質産生に関連して上に記載した態様に対応する。
好ましくは、高い翻訳効率は、少なくとも1つの3’−非翻訳領域エレメント(3’−UTRエレメント)及び/又は少なくとも1つの5’−非翻訳領域エレメント(5’−UTRエレメント)によって本発明の人工核酸分子に与えられる。「によって与えられる」とは、少なくとも1つの3’−非翻訳領域エレメント(3’−UTRエレメント)及び/又は少なくとも1つの5’−非翻訳領域エレメント(5’−UTRエレメント)の非存在下では、翻訳効率が本明細書に定義されるほど高くないことを意味する。
用語「高い翻訳効率」は、本発明の人工核酸分子の翻訳効率をレファレンス核酸分子と比較するために使用することができる。用語「レファレンス核酸分子」とは、本明細書で使用するとき、レファレンス核酸分子が、異なる3’−UTR及び/又は5’−UTRを除いて、3’−UTRエレメント及び/又は5’−UTRエレメントを含む本発明の人工核酸分子と同等、好ましくは同一であることを意味する。したがって、人工核酸分子の翻訳効率をレファレンス核酸分子の翻訳効率と比較することができる。翻訳効率を比較するそれぞれの方法を本明細書に提供する。
特に記載しない限り、タンパク質産生の測定に関連する上記全ての態様は、翻訳効率を比較する方法にも同様に当てはまる。翻訳効率を比較する方法は2つの核酸分子の比較を含むので、核酸分子の性質のみが異なる2つの並行実験を実施する。言い換えれば、他の全ての条件、例えば、成長培地、温度、pHは実験間で同一である。当業者は、共通一般知識及び本明細書に記載される指針に基づいて適切な条件を日常的に選択するが、但し両並行実験について同一の条件を選択する。典型的には、並行実験のうちの一方は、レファレンス核酸分子(野生型であっても人工であってもよい)に関し、他方は、人工核酸分子(サブジェクト核酸分子とも呼ばれる)に関する。この方法によって、サブジェクト核酸分子が高い翻訳効率によって特徴付けられるかどうか、即ち、本発明に係る人工核酸分子であるかどうかを比較することができるようになる。翻訳効率を比較する方法の具体的な態様は、以下の通りである。
この方法では、レファレンス核酸分子は、人工核酸分子の少なくとも1つのオープンリーディングフレーム(ORF)と同一の少なくとも1つのオープンリーディングフレーム(ORF)を含み;レファレンス核酸分子は、人工核酸分子の少なくとも1つの3’−非翻訳領域エレメント(3’−UTRエレメント)及び/又は人工核酸分子の少なくとも1つの5’−非翻訳領域エレメント(5’−UTRエレメント)を含まない。人工核酸分子の翻訳効率及びレファレンス核酸分子の翻訳効率は、以下の工程を含む方法によって比較される:
(i)哺乳類細胞に人工核酸分子をトランスフェクトし、トランスフェクション後の特定の時点(例えば、24時間又は48時間)において、人工核酸分子のORFによってコードされているタンパク質の発現量を測定する工程、
(ii)哺乳類細胞にレファレンス核酸分子をトランスフェクトし、トランスフェクション後の同時点において、レファレンス核酸分子のORFによってコードされているタンパク質の発現量を測定する工程、
(iii)前記人工核酸分子から発現したタンパク質の量の前記レファレンス核酸分子から発現したタンパク質の量に対する比を計算する工程。
(iii)において計算される比は、≧1、好ましくは>1である。
したがって、本発明に係るサブジェクト核酸分子から産生された相対タンパク質量をレファレンス核酸分子から産生された相対タンパク質量と比較することによって、本発明に係る人工核酸分子の翻訳効率をレファレンス核酸分子の翻訳効率と比べて増加せしめる要因を決定することができる。
「トランスフェクション後」は、細胞にサブジェクト核酸分子及びレファレンス核酸分子をトランスフェクトした時点を指すために使用される。
好ましくは、本発明に係る人工核酸分子における少なくとも1つの3’−及び/又は5’−UTRエレメントは、それぞれレファレンス3’−及び/又は5’−UTRを含むレファレンス核酸分子からのタンパク質産生と比べて、前記人工核酸分子の翻訳効率を少なくとも1.2倍、好ましくは少なくとも1.5倍、より好ましくは少なくとも2倍、更により好ましくは少なくとも2.5倍増加させる(即ち、(iii)において計算される比は、少なくとも1.2、好ましくは少なくとも1.5、より好ましくは少なくとも2、更により好ましくは少なくとも2.5である)。言い換えれば、翻訳効率は、同じ時点について、レファレンス核酸分子の翻訳効率と比べて少なくとも1.2倍、好ましくは少なくとも1.5倍、より好ましくは少なくとも2倍、更により好ましくは少なくとも2.5倍増加する。
高い翻訳効率は、サブジェクト核酸分子をレファレンス核酸分子と異ならしめる5’−UTR又は3’−UTRによって付与される。
本発明に係る翻訳効率を比較する方法の好ましい実施形態では、(i)レファレンス核酸分子は、人工核酸分子には存在しない3’−UTRエレメントを含むか、又は(ii)レファレンス核酸分子は、人工核酸分子には存在しない5’−UTRエレメントを含む。より好ましい実施形態では、(i)レファレンス核酸分子は、アルブミン遺伝子の3’−UTR、好ましくは、配列番号207に係る配列に対応する3’−UTRに由来する3’−UTRエレメントを含むか、又は(ii)レファレンス核酸分子は、TOP遺伝子の5’−UTR、好ましくは5’末端オリゴピリミジン領域が欠損しているヒトリボソームタンパク質ラージ32の5’−UTR、好ましくは配列番号208に係る配列に対応する5’−UTRに由来する5’−UTRエレメントを含む。
別の好ましい実施形態では、(i)レファレンス核酸分子は、任意の3’−非翻訳領域エレメント(3’−UTRエレメント)を含まないか、又は(ii)レファレンス核酸分子は、任意の5’−非翻訳領域エレメント(5’−UTRエレメント)を含まない。
好ましい実施形態では、人工核酸分子及びレファレンス核酸分子のトランスフェクション工程で使用される細胞は、好ましくはHDF、L929、HEP2G、及びHeLa細胞の群から選択される哺乳類細胞である。前記方法は、更に、1種超の哺乳類細胞において並行して、例えば、上記細胞株のうちの任意の2つ、好ましくは任意の3つ、より好ましくは4つ全ての組合せにおいて並行して実施することが好ましい場合がある。前記方法が1種超の哺乳類細胞において並行して実施されるとき、サブジェクト核酸分子は、使用される少なくとも1種の哺乳類細胞において、工程(iii)で計算される比が≧1、好ましくは>1であるとき、高い翻訳効率によって特徴付けられるとみなすことができる。しかし、サブジェクト核酸分子は、使用される哺乳類細胞の少なくとも2種、例えば少なくとも3種、例えば4種において、工程(iii)で計算される比が≧1、好ましくは>1であるとき、高い翻訳効率によって特徴付けられるとみなされることが好ましい。
人工核酸分子及びレファレンス核酸分子のORFによってコードされているタンパク質の発現量は、トランスフェクション後の特定の時点(例えば、12時間、24時間、36時間、48時間、又は72時間)で測定される。好ましくは、ORFによってコードされているタンパク質の発現量は、トランスフェクションの24時間後に測定される。
また、本発明は、本発明の方法において使用することができる特定の好ましいレファレンスコンストラクトを提供する。レファレンス核酸分子は配列番号205のmRNA(図1A)であることが特に好ましい。この場合、少なくとも1つの3’−UTRエレメントが少なくとも1つの他の3’−UTRエレメント(好ましくは1つの3’−UTRエレメント)によって置換されている点、又は少なくとも1つの5’−UTRエレメントが少なくとも1つの他の5’−UTRエレメント(好ましくは1つの5’−UTRエレメント)によって置換されている点においてのみ、レファレンス核酸分子が人工核酸分子と異なることが更に好ましい。いずれの場合も、これによって前記他の3’−UTRエレメント又は他の5’−UTRエレメントがそれぞれ高い翻訳効率を与えるかどうかを直接試験することができるようになる。
翻訳効率を測定する方法が更に以下の通り特徴付けられることが特に好ましい:
(a)トランスフェクション工程において、前記細胞が、HDF、L929、HEP2G、及びHeLa細胞の群から選択される哺乳類細胞であり;且つ
(b)測定時点がトランスフェクションの24時間後であり;且つ
(c)レファレンス核酸分子が、配列番号205のmRNA(図1A)であり;且つ
好ましくは、(d)(i)少なくとも1つの3’−UTRエレメント(好ましくは1つの3’−UTRエレメント)が少なくとも1つの他の3’−UTRエレメント(好ましくは1つの3’−UTRエレメント)によって置換されている点、又は(ii)少なくとも1つの5’−UTRエレメント(好ましくは1つの5’−UTRエレメント)が少なくとも1つの他の5’−UTRエレメント(好ましくは1つの5’−UTRエレメント)によって置換されている点においてのみ、レファレンス核酸分子が人工核酸分子と異なる;言い換えれば、少なくとも1つの5’−UTRエレメントが図1Aに示す5’−UTRと異なるか、又は少なくとも1つの3’−UTRエレメントが図1Aに示す3’−UTRとは異なることを除いて、サブジェクト核酸分子がレファレンス核酸分子と同一である。5’−UTRエレメント置換の例を図1Bに示し;3’−UTRエレメント置換の例を図1Cに示す。
(a)〜(d)の全てを満たすとき、前記方法は、「翻訳効率を測定するための標準化されたアッセイ」又は単に「翻訳効率を測定するためのアッセイ」とも称される。本発明の人工核酸分子は、この翻訳効率を測定するための標準アッセイによって測定可能な高い翻訳効率によって特徴付けられることが特に好ましい。この標準アッセイによって、特に有利な人工核酸分子を簡単に同定することができるようになる。
標準アッセイを本発明の実施例3で使用した。それによって、本発明者らは、新規人工核酸の群が、翻訳効率が高い、即ち、図1Aのレファレンス核酸分子の翻訳効率よりも翻訳効率が高いという有利な特徴を共有していることを見出した。実施例3.5を参照。これは、特に前記レファレンス核酸分子がアルブミン遺伝子の3’−UTR(配列番号207に係るDNA配列に対応する3’−UTR)に由来する3’−UTRエレメント及びTOP遺伝子の5’−UTR、特に5’末端オリゴピリミジン領域が欠損しているヒトリボソームタンパク質ラージ32の5’−UTR(配列番号208に係るDNA配列に対応する5’−UTR)に由来する5’−UTRエレメントを含むという背景から、非常に驚くべき且つ有利な知見である。かかる3’−UTRエレメント及び5’−UTRエレメントは、細胞におけるタンパク質翻訳の状況において有利であることが知られている(アルブミン遺伝子に由来する3’−UTRについては、国際公開第2013/143700号を参照;5’−TOP−UTRについては、国際公開第2013/143700号を参照)。本発明は、更なる改善を提供する。
幾つかの実施形態では、人工核酸分子のORFは、定量可能なタンパク質、好ましくはレポータータンパク質をコードしている。これら実施形態は、本発明に係る翻訳効率を比較する方法において非常に好適である。他の実施形態では、人工核酸分子のORFは、定量可能なタンパク質、好ましくはレポータータンパク質をコードしていない。例えば、定量可能なタンパク質をコードしている人工核酸分子のORFを使用して特定の5’−UTR又は3’−UTRが高い翻訳効率を与えると本発明の方法によって判定されているとき、前記5’−UTR又は3’−UTRを任意のORFと再結合させてよい。例えば、翻訳効率を測定するための標準化されたアッセイでは、ORFはレポータータンパク質をコードしているが、本発明の人工核酸分子は、標準化されたアッセイにおいて使用されるORFには限定されない。
また、これら方法は、繰り返し使用してもよく;即ち、高い翻訳効率によって特徴付けられると本明細書における方法によって判定されている人工核酸分子は、それ自体、本明細書における方法の後続ラウンドにおいて「レファレンスコンストラクト」として使用することができる。これによって、更なる人工核酸分子が更に高い翻訳効率によって特徴付けられるかどうか(又は更なる人工核酸分子に含まれるUTRが更に高い翻訳効率を与えるかどうか)を試験することが可能になる。これによって、更に改善された人工核酸分子及びUTRを同定することができるようになる。
安定なmRNA
幾つかの実施形態においては、更に、本発明に係る人工核酸分子における少なくとも1つの3’−UTRエレメント及び/又は少なくとも1つの5’−UTRエレメントは、安定なmRNAに由来する。それに関して、安定なmRNAに「由来する」とは、少なくとも1つの3’−UTRエレメント及び/又は少なくとも1つの5’−UTRエレメントが、安定なmRNAの3’−UTRエレメント及び/又は5’−UTRエレメントと少なくとも50%、好ましくは少なくとも60%、好ましくは少なくとも70%、より好ましくは少なくとも75%、より好ましくは少なくとも80%、より好ましくは少なくとも85%、更により好ましくは少なくとも90%、更により好ましくは少なくとも95%、特に好ましくは少なくとも98%の配列同一性を共有することを意味する。好ましくは、安定なmRNAは、自然界に存在するmRNAであり、したがって、安定なmRNAの3’−UTRエレメント及び/又は5’−UTRエレメントとは、自然界に存在するmRNAの3’−UTR及び/又は5’−UTR、又はこれらの断片若しくは変異体を指す。更に、安定なmRNAに由来する3’−UTRエレメント及び/又は5’−UTRエレメントとは、好ましくは、例えば、RNAの安定性を更に増大させる及び/又はタンパク質産生を延長及び/又は増加させるために、自然界に存在する3’−UTRエレメント及び/又は5’−UTRエレメントと比べて改変されている3’−UTRエレメント及び/又は5’−UTRエレメントも指す。言うまでもなく、かかる改変は、例えば、自然界に存在する(改変されていない)3’−UTRエレメント及び/又は5’−UTRエレメントと比べてRNAの安定性を損なわないことが好ましい。特に、本明細書で使用するとき、mRNAという用語は、mRNA分子を指すが、本明細書で定義するmRNA種を指す場合もある。
好ましくは、mRNAの安定性、即ち、mRNAの分解及び/又は半減期は、標準的な条件下、例えば、用いられる特定の細胞株についての標準的な条件(標準的な培地、インキュベーション等)下で評価される。
用語「安定なmRNA」とは、本明細書で使用するとき、一般的に、mRNAの分解が緩徐なmRNAを指す。したがって、「安定なmRNA」は、典型的には、長い半減期を有する。mRNAの半減期は、インビボ又はインビトロにおける既存のmRNA分子の50%を分解するのに必要な時間である。したがって、mRNAの安定性は、通常、インビボ又はインビトロにおいて評価される。それに関して、インビトロとは、特に、(「生」)細胞及び/又は組織(生体の組織を含む)を指す。細胞は、特に、細胞株、初代細胞、組織又は被験体における細胞を含む。特定の実施形態では、細胞培養可能な細胞型が本発明に好適であり得る。哺乳類細胞、例えば、ヒト細胞及びマウス細胞が特に好ましい。特に好ましい実施形態では、ヒト細胞株HeLa、HEPG2、及びU−937、並びにマウス細胞株NIH3T3、JAWSII、及びL929が用いられる。更に、初代細胞が特に好ましく、特に好ましい実施形態では、ヒト皮膚線維芽細胞(HDF)を用いてよい。或いは、被験体の組織を用いてもよい。
好ましくは、「安定なmRNA」の半減期は、少なくとも5時間、少なくとも6時間、少なくとも7時間、少なくとも8時間、少なくとも9時間、少なくとも10時間、少なくとも11時間、少なくとも12時間、少なくとも13時間、少なくとも14時間、及び/又は少なくとも15時間である。対象となるmRNAの半減期は、当業者に公知の様々な方法によって求めることができる。典型的には、対象となるmRNAの半減期は、分解定数を求めることによって求められ、ここでは、通常、対象となるmRNAの転写を完全に(又は少なくとも検出不可能なレベルまで)「オフにする」ことができる理想のインビボ(又は上に定義したインビトロ)状況であると仮定される。かかる理想の状況では、通常、mRNAの分解が一次速度論に従うと仮定する。したがって、mRNAの分解は、通常、以下の等式によって記載することができる:
(式中、A0は、0時点、即ち、分解開始前における対象となるmRNAの量(又は濃度)であり、A(t)は、分解中の時点tにおける対象となるmRNAの量(又は濃度)であり、λは、分解定数である)。したがって、0時点における対象となるmRNAの量(又は濃度)(A0)及び分解プロセス中の特定の時点tにおける対象となるmRNAの量(又は濃度)(A(t)及びt)が公知である場合、分解定数λを計算することができる。定義に従えば、t1/2ではA(t)/A0=1/2であるので、分解定数λに基づいて、以下の等式によって半減期t1/2を計算することができる。
したがって、対象となるmRNAの半減期を評価するために、通常、インビボ(又は上に定義したインビトロ)におけるRNA分解プロセス中のmRNAの量又は濃度が求められる。
インビボ(又は上に定義したインビトロ)におけるRNA分解プロセス中のmRNAの量又は濃度を求めるために、当業者に公知の様々な方法を用いてよい。かかる方法の非限定的な例としては、例えばアクチノマイシンD等の転写阻害剤を用いる転写の全体的な阻害、例えばc−fos血清誘導性プロモータ系及びTet−off制御性プロモータ系等の一時的転写を特異的に促進するための誘導性プロモータの使用、並びに例えば4−チオウリジン(4sU)、5−エチニルウリジン(EU)、又は5’−ブロモ−ウリジン(BrU)による動的標識技術(例えば、パルス標識)が挙げられる。RNA分解中のmRNAの量又は濃度を求める方法に関する更なる詳細及び好ましい実施形態については、本発明に係る3’−UTRエレメント及び/又は少なくとも1つの5’−UTRエレメントを同定する方法に関連して以下に概説する。RNA分解中のmRNAの量又は濃度を求める方法のそれぞれの記載及び好ましい実施形態は、同様に本明細書にも当てはまる。
好ましくは、本発明の意味における「安定なmRNA」は、好ましくはインビボ(又は上に定義したインビトロ)において評価される平均mRNAに比べて緩徐なmRNA分解を有する。例えば、「平均mRNA分解」は、複数のmRNA種、好ましくは100、少なくとも300、少なくとも500、少なくとも1,000、少なくとも2,000、少なくとも3,000、少なくとも4,000、少なくとも5,000、少なくとも6,000、少なくとも7,000、少なくとも8,000、少なくとも9,000、少なくとも10,000、少なくとも11,000、少なくとも12,000、少なくとも13,000、少なくとも14,000、少なくとも15,000、少なくとも16,000、少なくとも17,000、少なくとも18,000、少なくとも19,000、少なくとも20,000、少なくとも21,000、少なくとも22,000、少なくとも23,000、少なくとも24,000、少なくとも25,000、少なくとも26,000、少なくとも27,000、少なくとも28,000、少なくとも29,000、少なくとも30,000のmRNA種のmRNA分解を調べることによって評価し得る。トランスクリプトーム全体を評価するか、又はトランスクリプトームのできる限り多くのmRNA種を評価することが特に好ましい。これは、例えば、トランスクリプトーム全体を網羅するマイクロアレイを用いることによって行うことができる。
「mRNA種」は、本明細書で使用するとき、ゲノム転写単位、即ち、通常遺伝子に対応する。したがって、例えば、mRNAのプロセシングに起因して、1つの「mRNA種」内で異なる転写物が生じる場合がある。例えば、mRNA種は、マイクロアレイ上のスポットによって表すことができる。したがって、マイクロアレイは、例えば、mRNA分解中の特定の時点における複数のmRNA種の量を求めるための便利なツールを提供する。しかし、当業者に公知の他の技術、例えば、RNA−seq、定量PCR等を用いてもよい。
本発明では、安定なmRNAは、第1の時点における前記mRNAの量に対する第2の時点における前記mRNAの量の比が少なくとも0.5(50%)、少なくとも0.6(60%)、少なくとも0.7(70%)、少なくとも0.75(75%)、少なくとも0.8(80%)、少なくとも0.85(85%)、少なくとも0.9(90%)、又は少なくとも0.95(95%)であるmRNA分解を特徴とすることが特に好ましい。それに関して、第2の時点は、分解プロセスにおいて第1の時点よりも後である。
好ましくは、第1の時点は、mRNAが分解プロセスのみを受けていると考えられる、即ち、例えば、進行中の転写において、mRNAの出現が回避されるように選択される。例えば、動的標識技術(例えば、パルス標識)を用いる場合、第1の時点は、好ましくは、mRNAへの標識の取り込みが完了している、即ち、mRNAへの標識の進行中の取り込みが生じていないように選択される。したがって、動的標識を用いる場合、第1の時点は、実験的標識手順の終了、例えば、細胞と標識とのインキュベーション終了の少なくとも10分間後、少なくとも20分間後、少なくとも30分間後、少なくとも40分間後、少なくとも50分間後、少なくとも60分間後、少なくとも70分間後、少なくとも80分間後、又は少なくとも90分間後であってよい。
例えば、第1の時点は、好ましくは、(例えば、転写阻害剤による)転写の停止、誘導性プロモータの場合はプロモータ誘導の停止、又はパルス若しくは標識の供給の停止、例えば、標識の終了の0時間後〜6時間後であってよい。より好ましくは、第1の時点は、(例えば、転写阻害剤による)転写の停止、誘導性プロモータの場合はプロモータ誘導の停止、又はパルス若しくは標識の供給の停止、例えば、標識の終了の30分間後〜5時間後、更により好ましくは1時間後〜4時間後、特に好ましくは約3時間後であってよい。
好ましくは、第2の時点は、mRNA分解プロセス中のできる限り遅い時点になるように選択される。しかし、複数のmRNA種を考慮する場合、第2の時点は、好ましくは、相当量の複数のmRNA種、好ましくは、mRNA種の少なくとも10%が依然として検出可能な量、即ち、0よりも多い量で存在するように選択される。好ましくは、第2の時点は、転写の終了又は実験的標識手順の終了の少なくとも5時間後、少なくとも6時間後、少なくとも7時間後、少なくとも8時間後、少なくとも9時間後、少なくとも10時間後、少なくとも11時間後、少なくとも12時間後、少なくとも13時間後、少なくとも14時間後、又は少なくとも15時間後である。
したがって、第1の時点と第2の時点との時間間隔は、上記限度内でできる限り長いことが好ましい。したがって、第1の時点と第2の時点との時間間隔は、好ましくは、少なくとも4時間、少なくとも5時間、少なくとも6時間、少なくとも7時間、少なくとも8時間、少なくとも9時間、少なくとも10時間、少なくとも11時間、又は少なくとも12時間である。
更に、本発明に係る人工核酸分子における少なくとも1つの3’−UTRエレメント及び/又は少なくとも1つの5’−UTRエレメントは、本明細書に記載の通り、本発明に係る3’−UTRエレメント及び/又は5’−UTRエレメントを同定する方法によって同定されることができる。本発明に係る人工核酸分子における少なくとも1つの3’−UTRエレメント及び/又は少なくとも1つの5’−UTRエレメントは、本明細書に記載の通り、人工核酸分子に高い翻訳効率を与える3’−UTRエレメント及び/又は5’−UTRエレメントを同定する方法によって同定されることが特に好ましい。
本発明の人工核酸分子の好ましい実施形態
好ましくは、本発明に係る人工核酸分子における少なくとも1つの3’−UTRエレメント及び/又は少なくとも1つの5’−UTRエレメントは、真核生物のタンパク質をコードしている遺伝子の3’−UTR及び/又は5’−UTR、好ましくは、脊椎動物のタンパク質をコードしている遺伝子の3’−UTR及び/又は5’−UTR、より好ましくは、哺乳類のタンパク質(例えば、マウス及びヒトのタンパク質)をコードしている遺伝子の3’−UTR及び/又は5’−UTR、更により好ましくは、霊長類又はげっ歯類のタンパク質をコードしている遺伝子の3’−UTR及び/又は5’−UTR、特に、ヒト又はマウスのタンパク質をコードしている遺伝子の3’−UTR及び/又は5’−UTRに由来する核酸配列を含むか又はからなる。
一般的に、本発明に係る人工核酸分子における少なくとも1つの3’−UTRエレメントは、好ましくは自然界(天然)に存在する3’−UTRに由来する核酸配列を含むか又はからなり、一方、本発明に係る人工核酸分子における少なくとも1つの5’−UTRエレメントは、好ましくは自然界(天然)に存在する5’−UTRに由来する核酸配列を含むか又はからなることが理解される。
好ましくは、少なくとも1つのオープンリーディングフレームと少なくとも1つの3’−UTRエレメント及び/又は少なくとも1つの5’−UTRエレメントとは、異種である。これに関連して、用語「異種」とは、オープンリーディングフレームと3’−UTRエレメント及び/又はオープンリーディングフレームと5’−UTRエレメント等、人工核酸分子によって含まれる2つの配列エレメントが、自然界(天然)ではこの組合せで存在しないことを意味する。これらは、典型的には、組み換え体である。好ましくは、3’−UTRエレメント及び/又は5’−UTRエレメントは、オープンリーディングフレームとは異なる遺伝子に由来する。例えば、ORFは、例えば、異なるタンパク質をコードしているか又は同じタンパク質であるが異なる種のタンパク質をコードしている、3’−UTRエレメント及び/又は少なくとも1つの5’−UTRエレメントとは異なる遺伝子に由来していてよい。即ち、オープンリーディングフレームは、3’−UTRエレメント及び/又は少なくとも1つの5’−UTRエレメントが由来する遺伝子とは異なる遺伝子に由来する。好ましい実施形態では、ORFは、ヒト又は植物(特に、アラビドプシス)のリボソームタンパク質、好ましくは、ヒトリボソームタンパク質S6(RPS6)、ヒトリボソームタンパク質L36a様(RPL36AL)、又はアラビドプシスリボソームタンパク質S16(RPS16)をコードしていない。更に好ましい実施形態では、オープンリーディングフレーム(ORF)は、リボソームタンパク質S6(RPS6)、リボソームタンパク質L36a様(RPL36AL)、又はリボソームタンパク質S16(RPS16)をコードしていない。
具体的な実施形態では、オープンリーディングフレームは、例えば、グロビンタンパク質(特に、ベータ−グロビン)、ルシフェラーゼタンパク質、GFPタンパク質、又はこれらの変異体(例えば、グロビンタンパク質、ルシフェラーゼタンパク質、又はGFPタンパク質に対して少なくとも70%の配列同一性を示す変異体)からなる群から選択されるレポータータンパク質をコードしていないことが好ましい。したがって、オープンリーディングフレームは、GFPタンパク質をコードしていないことが特に好ましい。オープンリーディングフレーム(ORF)が、レポーター遺伝子をコードしてもおらず、レポーター遺伝子に由来してもおらず、前記レポーター遺伝子が、好ましくは、グロビンタンパク質(特にベータ−グロビン)、ルシフェラーゼタンパク質、ベータ−グルクロニダーゼ(GUS)、及びGFPタンパク質若しくはその変異体(好ましくはEGFP)、又は典型的に、これらレポーター遺伝子のいずれか、好ましくはグロビンタンパク質、ルシフェラーゼタンパク質、若しくはGFPタンパク質に対して少なくとも70%の配列同一性を示す上記遺伝子のいずれかの変異体からなる群からは選択されないことが特に好ましい。
更により好ましくは、3’−UTRエレメント及び/又は5’−UTRエレメントは、本明細書に定義する人工核酸に含まれる任意の他のエレメントと異種である。例えば、本発明に係る人工核酸分子が所与の遺伝子由来の3’−UTRエレメントを含む場合、それは、その遺伝子のORFの5’末端及び3’末端における調節配列を含む、同じ遺伝子由来の任意の他の核酸配列、特に、機能的核酸配列(例えば、コード配列エレメント又は調節配列エレメント)を含まないことが好ましい。したがって、本発明に係る人工核酸分子が所与の遺伝子由来の5’−UTRエレメントを含む場合、それは、その遺伝子のORFの5’末端及び3’末端における調節配列を含む、同じ遺伝子由来の任意の他の核酸配列、特に、機能的核酸配列(例えば、コード配列エレメント又は調節配列エレメント)を含まないことが好ましい。
更に、本発明に係る人工核酸は、少なくとも1つのオープンリーディングフレームと、少なくとも1つの3’−UTR(エレメント)と、少なくとも1つの5’−UTR(エレメント)とを含み、前記少なくとも1つの3’−UTR(エレメント)が本発明に係る3’−UTRエレメントである、及び/又は前記少なくとも1つの5’−UTR(エレメント)が本発明に係る5’−UTRエレメントであることが好ましい。少なくとも1つのオープンリーディングフレームと、少なくとも1つの3’−UTR(エレメント)と、少なくとも1つの5’−UTR(エレメント)とを含む本発明に係る好ましい人工核酸では、少なくとも1つのオープンリーディングフレーム、少なくとも1つの3’−UTR(エレメント)、及び少なくとも1つの5’−UTR(エレメント)がそれぞれ異種である、即ち、前記少なくとも1つの3’−UTR(エレメント)と前記少なくとも1つの5’−UTR(エレメント)との組合せも、前記オープンリーディングフレームと前記3’−UTR(エレメント)又は前記5’−UTR(エレメント)との組合せも、自然界(天然)ではこの組合せで存在しないことが特に好ましい。これは、人工核酸分子が、ORFと、3’−UTR(エレメント)と、5’−UTR(エレメント)とを含み、これらが全て互いに異種である、例えば、それぞれが異なる遺伝子(並びにその5’−UTR及び3’UTR)に由来する組み換え体であることを意味する。別の好ましい実施形態では、3’−UTR(エレメント)は、ウイルス遺伝子の3’−UTR(エレメント)に由来しないか、又はウイルス起源ではない。
好ましくは、少なくとも1つの3’−UTRエレメント及び/又は少なくとも1つの5’−UTRエレメントは、ORFに機能的に連結している。これは、好ましくは、例えば、コードされているペプチド若しくはタンパク質の発現に対する増強若しくは安定化機能又は人工核酸分子に対する安定化機能等の機能を発揮することができるように、3’−UTRエレメント及び/又は少なくとも1つの5’−UTRエレメントがORFに連結していることを意味する。好ましくは、ORF及び3’−UTRエレメントは、5’→3’方向に連結される、及び/又は5’−UTRエレメント及びORFは、5’→3’方向に連結される。したがって、好ましくは、人工核酸分子は、一般的に、以下の構造:5’−[5’−UTRエレメント]−(任意の)−リンカー−ORF−(任意の)−リンカー−[3’−UTRエレメント]−3’を含み、前記人工核酸分子は、5’−UTRエレメントのみを含んで3’−UTRエレメントを含んでいなくてもよく、3’−UTRエレメントのみを含んで5’−UTRエレメントを含んでいなくてもよく、又は3’−UTRエレメント及び5’−UTRエレメントの両方を含んでいてもよい。更に、リンカーは、存在していても存在していなくてもよい。例えば、リンカーは、1以上の制限酵素認識部位(制限酵素部位)を含むか又はからなる一続きの1ヌクレオチド〜50ヌクレオチド又は1ヌクレオチド〜20ヌクレオチド等、1以上のヌクレオチドであってよい。
好ましくは、少なくとも1つの3’−UTRエレメント及び/又は少なくとも1つの5’−UTRエレメントは、ZNF460、TGM2、IL7R、BGN、TK1、RAB3B、CBX6、FZD2、COL8A1、NDUFS7、PHGDH、PLK2、TSPO、PTGS1、FBXO32、NID2、ATP5D、EXOSC4、NOL9、UBB4B、VPS18、ORMDL2、FSCN1、TMEM33、TUBA4A、EMP3、TMEM201、CRIP2、BRAT1、SERPINH1、CD9、DPYSL2、CDK9、TFRC、PSMB3 5’−UTR、FASN、PSMB6、PRSS56、KPNA6、SFT2D2、PARD6B、LPP、SPARC、SCAND1、VASN、SLC26A1、LCLAT1、FBXL18、SLC35F6、RAB3D、MAP1B、VMA21、CYBA、SEZ6L2、PCOLCE、VTN、ALDH16A1、RAVER1、KPNA6、SERINC5、JUP、CPN2、CRIP2、EPT1、PNPO、SSSCA1、POLR2L、LIN7C、UQCR10、PYCRL、AMN、MAP1S、NDUFS7、PHGDH、TSPO、ATP5D、EXOSC4、TUBB4B、TUBA4A、EMP3、CRIP2、BRAT1、CD9、CDK9、PSMB3、PSMB6、PRSS56、SCAND1、AMN、CYBA、PCOLCE、MAP1S、VTN、ALDH16A1(いずれも好ましくはヒト)、及びDpysl2、Ccnd1、Acox2、Cbx6、Ubc、Ldlr、Nudt22、Pcyox1l、Ankrd1、Tmem37、Tspyl4、Slc7a3、Cst6、Aacs、Nosip、Itga7、Ccnd2、Ebp、Sf3b5、Fasn、Hmgcs1、Osr1、Lmnb1、Vma21、Kif20a、Cdca8、Slc7a1、Ubqln2、Prps2、Shmt2、Aurkb、Fignl1、Cad、Anln、Slfn9、Ncaph、Pole、Uhrf1、Gja1、Fam64a、Kif2c、Tspan10、Scand1、Gpr84、Fads3、Cers6、Cxcr4、Gprc5c、Fen1、Cspg4、Mrpl34、Comtd1、Armc6、Emr4、Atp5d、1110001J03Rik、Csf2ra、Aarsd1、Kif22、Cth、Tpgs1、Ccl17、Alkbh7、Ms4a8a、Acox2、Ubc、Slpi、Pcyox1l、Igf2bp1、Tmem37、Slc7a3、Cst6、Ebp、Sf3b5、Plk1、Cdca8、Kif22、Cad、Cth、Pole、Kif2c、Scand1、Gpr84、Tpgs1、Ccl17、Alkbh7、Ms4a8a、Mrpl34、Comtd1、Armc6、Atp5d、1110001J03Rik、Nudt22、Aarsd1(いずれも好ましくはマウス)からなる群から選択される遺伝子の転写物の3’−UTR及び/又は5’−UTRに由来する核酸配列を含むか又はからなる。
好ましくは、本発明に係る人工核酸分子の少なくとも1つの3’−UTRエレメント及び/又は少なくとも1つの5’−UTRエレメントは、遺伝子の転写物の3’−UTR及び/又は5’−UTRの「機能的断片」、「機能的変異体」、又は「変異体の機能的断片」を含むか又はからなる。
好ましくは、少なくとも1つの5’−UTRエレメントは、ZNF460−5’−UTR、TGM2−5’−UTR、IL7R−5’−UTR、BGN−5’−UTR、TK1−5’−UTR、RAB3B−5’−UTR、CBX6−5’−UTR、FZD2−5’−UTR、COL8A1−5’−UTR、NDUFS7−5’−UTR、PHGDH−5’−UTR、PLK2−5’−UTR、TSPO−5’−UTR、PTGS1−5’−UTR、FBXO32−5’−UTR、NID2−5’−UTR、ATP5D−5’−UTR、EXOSC4−5’−UTR、NOL9−5’−UTR、UBB4B−5’−UTR、VPS18−5’−UTR、ORMDL2−5’−UTR、FSCN1−5’−UTR、TMEM33−5’−UTR、TUBA4A−5’−UTR、EMP3−5’−UTR、TMEM201−5’−UTR、CRIP2−5’−UTR、BRAT1−5’−UTR、SERPINH1−5’−UTR、CD9−5’−UTR、DPYSL2−5’−UTR、CDK9−5’−UTR、TFRC−5’−UTR、PSMB3 5’−UTR、FASN−5’−UTR、PSMB6−5’−UTR、PRSS56−5’−UTR、KPNA6−5’−UTR、SFT2D2−5’−UTR、PARD6B−5’−UTR、LPP−5’−UTR、SPARC−5’−UTR、SCAND1−5’−UTR、VASN−5’−UTR、SLC26A1−5’−UTR、LCLAT1−5’−UTR、FBXL18−5’−UTR、SLC35F6−5’−UTR、RAB3D−5’−UTR、MAP1B−5’−UTR、VMA21−5’−UTR、CYBA−5’−UTR、SEZ6L2−5’−UTR、PCOLCE−5’−UTR、VTN−5’−UTR、ALDH16A1−5’−UTR、RAVER1−5’−UTR、KPNA6−5’−UTR、SERINC5−5’−UTR、JUP−5’−UTR、CPN2−5’−UTR、CRIP2−5’−UTR、EPT1−5’−UTR、PNPO−5’−UTR、SSSCA1−5’−UTR、POLR2L−5’−UTR、LIN7C−5’−UTR、UQCR10−5’−UTR、PYCRL−5’−UTR、AMN−5’−UTR、MAP1S−5’−UTR(いずれも好ましくはヒト)及びDpysl2−5’−UTR、Ccnd1−5’−UTR、Acox2−5’−UTR、Cbx6−5’−UTR、Ubc−5’−UTR、Ldlr−5’−UTR、Nudt22−5’−UTR、Pcyox1l−5’−UTR、Ankrd1−5’−UTR、Tmem37−5’−UTR、Tspyl4−5’−UTR、Slc7a3−5’−UTR、Cst6−5’−UTR、Aacs−5’−UTR、Nosip−5’−UTR、Itga7−5’−UTR、Ccnd2−5’−UTR、Ebp−5’−UTR、Sf3b5−5’−UTR、Fasn−5’−UTR、Hmgcs1−5’−UTR、Osr1−5’−UTR、Lmnb1−5’−UTR、Vma21−5’−UTR、Kif20a−5’−UTR、Cdca8−5’−UTR、Slc7a1−5’−UTR、Ubqln2−5’−UTR、Prps2−5’−UTR、Shmt2−5’−UTR、Aurkb−5’−UTR、Fignl1−5’−UTR、Cad−5’−UTR、Anln−5’−UTR、Slfn9−5’−UTR、Ncaph−5’−UTR、Pole−5’−UTR、Uhrf1−5’−UTR、Gja1−5’−UTR、Fam64a−5’−UTR、Kif2c−5’−UTR、Tspan10−5’−UTR、Scand1−5’−UTR、Gpr84−5’−UTR、Fads3−5’−UTR、Cers6−5’−UTR、Cxcr4−5’−UTR、Gprc5c−5’−UTR、Fen1−5’−UTR、Cspg4−5’−UTR、Mrpl34−5’−UTR、Comtd1−5’−UTR、Armc6−5’−UTR、Emr4−5’−UTR、Atp5d−5’−UTR、1110001J03Rik−5’−UTR、Csf2ra−5’−UTR、Aarsd1−5’−UTR、Kif22−5’−UTR、Cth−5’−UTR、Tpgs1−5’−UTR、Ccl17−5’−UTR、Alkbh7−5’−UTR、Ms4a8a−5’−UTR(いずれも好ましくはマウス)からなる群から選択される遺伝子の転写物の5’−UTRに由来する核酸配列を含む。
好ましくは、少なくとも1つの3’−UTRエレメントは、NDUFS7−3’−UTR、PHGDH−3’−UTR、TSPO−3’−UTR、ATP5D−3’−UTR、EXOSC4−3’−UTR、TUBB4B−3’−UTR、TUBA4A−3’−UTR、EMP3−3’−UTR、CRIP2−3’−UTR、BRAT1−3’−UTR、CD9−3’−UTR、CDK9−3’−UTR、PSMB3−3’−UTR、PSMB6−3’−UTR、PRSS56−3’−UTR、SCAND1−3’−UTR、AMN−3’−UTR、CYBA−3’−UTR、PCOLCE−3’−UTR、MAP1S−3’−UTR、VTN−3’−UTR、ALDH16A1−3’−UTR(いずれも好ましくはヒト)及びAcox2−3’−UTR、Ubc−3’−UTR、Slpi−3’−UTR、Pcyox1l−3’−UTR、Igf2bp1−3’−UTR、Tmem37−3’−UTR、Slc7a3−3’−UTR、Cst6−3’−UTR、Ebp−3’−UTR、Sf3b5−3’−UTR、Plk1−3’−UTR、Cdca8−3’−UTR、Kif22−3’−UTR、Cad−3’−UTR、Cth−3’−UTR、Pole−3’−UTR、Kif2c−3’−UTR、Scand1−3’−UTR、Gpr84−3’−UTR、Tpgs1−3’−UTR、Ccl17−3’−UTR、Alkbh7−3’−UTR、Ms4a8a−3’−UTR、Mrpl34−3’−UTR、Comtd1−3’−UTR、Armc6−3’−UTR、Atp5d−3’−UTR、1110001J03Rik−3’−UTR、Nudt22−3’−UTR、Aarsd1−3’−UTR(いずれも好ましくはマウス)からなる群から選択される遺伝子の転写物の3’−UTRに由来する核酸配列を含むか又はからなる。
また、本発明の人工核酸分子は、(i)少なくとも1つの好ましい5’−UTRと(i)少なくとも1つの好ましい3’−UTRの両方を含むことが好ましい。
特に好ましい実施形態においては、少なくとも1つの5’−UTRエレメントは、ZNF460−5’−UTR、TGM2−5’−UTR、IL7R−5’−UTR、COL8A1−5’−UTR、NDUFS7−5’−UTR、PLK2−5’−UTR、FBXO32−5’−UTR、ATP5D−5’−UTR、TUBB4B−5’−UTR、ORMDL2−5’−UTR、FSCN1−5’−UTR、CD9−5’−UTR、PYSL2−5’−UTR、PSMB3−5’−UTR、PSMB6−5’−UTR、KPNA6−5’−UTR、SFT2D2−5’−UTR、LCLAT1−5’−UTR、FBXL18−5’−UTR、SLC35F6−5’−UTR、VMA21−5’−UTR、SEZ6L2−5’−UTR、PCOLCE−5’−UTR、VTN−5’−UTR、ALDH16A1−5’−UTR、KPNA6−5’−UTR、JUP−5’−UTR、CPN2−5’−UTR、PNPO−5’−UTR、SSSCA1−5’−UTR、POLR2L−5’−UTR、LIN7C−5’−UTR、UQCR10−5’−UTR、PYCRL−5’−UTR、AMN−5’−UTR、MAP1S−5’−UTR(いずれもヒト)、Dpysl2−5’−UTR、Acox2−5’−UTR、Ubc−5’−UTR、Nudt22−5’−UTR、Pcyox1l−5’−UTR、Ankrd1−5’−UTR、Tspyl4−5’−UTR、Slc7a3−5’−UTR、Aacs−5’−UTR、Nosip−5’−UTR、Itga7−5’−UTR、Ccnd2−5’−UTR、Ebp−5’−UTR、Sf3b5−5’−UTR、Fasn−5’−UTR、Hmgcs1−5’−UTR、Osr1−5’−UTR、Lmnb1−5’−UTR、Vma21−5’−UTR、Kif20a−5’−UTR、Cdca8−5’−UTR、Slc7a1−5’−UTR、Ubqln2−5’−UTR、Prps2−5’−UTR、Shmt2−5’−UTR、Fignl1−5’−UTR、Cad−5’−UTR、Anln−5’−UTR、Slfn9−5’−UTR、Ncaph−5’−UTR、Pole−5’−UTR、Uhrf1−5’−UTR、Gja1−5’−UTR、Fam64a−5’−UTR、Tspan10−5’−UTR、Scand1−5’−UTR、Gpr84−5’−UTR、Cers6−5’−UTR、Cxcr4−5’−UTR、Gprc5c−5’−UTR、Fen1−5’−UTR、Cspg4−5’−UTR、Mrpl34−5’−UTR、Comtd1−5’−UTR、Armc6−5’−UTR、Emr4−5’−UTR、Atp5d−5’−UTR、Csf2ra−5’−UTR、Aarsd1−5’−UTR、Cth−5’−UTR、Tpgs1−5’−UTR、Ccl17−5’−UTR、Alkbh7−5’−UTR、Ms4a8a−5’−UTR(いずれもマウス)からなる群から選択される遺伝子の転写物の5’−UTRに由来する核酸配列を含む。係るUTRエレメントは、高い翻訳効率に寄与することが示された。
特に好ましい実施形態においては、少なくとも1つの3’−UTRエレメントは、NDUFS7−3’−UTR、PHGDH−3’−UTR、TSPO−3’−UTR、ATP5D−3’−UTR、EXOSC4−3’−UTR、TUBB4B−3’−UTR、TUBA4A−3’−UTR、EMP3−3’−UTR、CRIP2−3’−UTR、BRAT1−3’−UTR、CD9−3’−UTR、CDK9−3’−UTR、PSMB3−3’−UTR、PSMB6−3’−UTR、PRSS56−3’−UTR、SCAND1−3’−UTR、AMN−3’−UTR、CYBA−3’−UTR、PCOLCE−3’−UTR、MAP1S−3’−UTR、VTN−3’−UTR、ALDH16A1−3’−UTR(いずれも好ましくはヒト)及びAcox2−3’−UTR、Ubc−3’−UTR、Slpi−3’−UTR、Pcyox1l−3’−UTR、Igf2bp1−3’−UTR、Tmem37−3’−UTR、Slc7a3−3’−UTR、Cst6−3’−UTR、Ebp−3’−UTR、Sf3b5−3’−UTR、Plk1−3’−UTR、Cdca8−3’−UTR、Kif22−3’−UTR、Cad−3’−UTR、Cth−3’−UTR、Pole−3’−UTR、Kif2c−3’−UTR、Scand1−3’−UTR、Gpr84−3’−UTR、Tpgs1−3’−UTR、Ccl17−3’−UTR、Alkbh7−3’−UTR、Ms4a8a−3’−UTR、Mrpl34−3’−UTR、Comtd1−3’−UTR、Armc6−3’−UTR、Atp5d−3’−UTR、1110001J03Rik−3’−UTR、Nudt22−3’−UTR、Aarsd1−3’−UTR(いずれも好ましくはマウス)からなる群から選択される遺伝子の転写物の3’−UTRに由来する核酸配列を含む。係るUTRエレメントは、高い翻訳効率に寄与することが示された。
これらの特に好ましい実施形態は、本発明の人工核酸分子が、(i)少なくとも1つの特に好ましい5’−UTRと(i)少なくとも1つの特に好ましい3’−UTRの両方を含むように組み合わせることが可能である。
語句「遺伝子の転写物の3’−UTR及び/又は5’−UTRに由来する核酸配列」は、好ましくは、遺伝子又はその断片若しくは一部、好ましくは、自然界に存在する遺伝子又はその断片若しくは一部の転写物の3’−UTR配列及び/又は5’−UTR配列に基づく核酸配列を指す。この状況において、自然界に存在するという用語は、野生型という用語と同義的に用いられる。この語句は、遺伝子の転写物の3’−UTR配列全体及び/又は5’−UTR配列全体、即ち、完全長3’−UTR及び/又は5’−UTR配列に対応する配列、並びに遺伝子の転写物の3’−UTR配列及び/又は5’−UTR配列の断片に対応する配列を含む。好ましくは、遺伝子の転写物の3’−UTR及び/又は5’−UTRの断片は、遺伝子の転写物の完全長3’−UTR及び/又は5’−UTRの少なくとも5%、少なくとも10%、少なくとも20%、好ましくは少なくとも30%、より好ましくは少なくとも40%、より好ましくは少なくとも50%、更により好ましくは少なくとも60%、更により好ましくは少なくとも70%、更により好ましくは少なくとも80%、最も好ましくは少なくとも90%を表す、遺伝子の転写物の完全長3’−UTR及び/又は5’−UTRにおける連続する一続きのヌクレオチドに対応する連続する一続きのヌクレオチドからなる。かかる断片は、本発明の意味において、好ましくは本明細書に記載する機能的断片である。好ましくは、前記断片は、3’−UTR及び/又は5’−UTR又はこれらの断片に連結されているORFを翻訳するための調節機能を保持している。
用語「遺伝子の転写物の3’−UTRの変異体及び/又は5’−UTRの変異体」及び「これらの変異体」は、遺伝子の転写物の3’−UTR及び/又は5’−UTRに関連して、自然界に存在する遺伝子の転写物の3’−UTR及び/又は5’−UTRの変異体、好ましくは、脊椎動物の遺伝子の転写物の3’−UTR及び/又は5’−UTRの変異体、より好ましくは、哺乳類の遺伝子の転写物の3’−UTR及び/又は5’−UTRの変異体、更により好ましくは、霊長類の遺伝子(具体的には、上記ヒト遺伝子)の転写物の3’−UTR及び/又は5’−UTRの変異体を指す。かかる変異体は、遺伝子の転写物の改変された3’−UTR及び/又は5’−UTRであってもよい。例えば、変異体3’−UTR及び/又は5’−UTRの変異体は、その変異体が由来する自然界に存在する3’−UTR及び/又は5’−UTRに比べて、1以上のヌクレオチドの欠失、挿入、付加、及び/又は置換を示してよい。好ましくは、遺伝子の転写物の3’−UTRの変異体及び/又は5’−UTRの変異体は、その変異体が由来する自然界に存在する3’−UTR及び/又は5’−UTRと少なくとも40%、好ましくは少なくとも50%、より好ましくは少なくとも60%、より好ましくは少なくとも70%、更により好ましくは少なくとも80%、更により好ましくは少なくとも90%、最も好ましくは少なくとも95%同一である。好ましくは、変異体は、本明細書に記載する機能的変異体である。
語句「遺伝子の転写物の3’−UTRの変異体及び/又は5’−UTRの変異体に由来する核酸配列」は、好ましくは、遺伝子の転写物の3’−UTR配列及び/又は5’−UTRの変異体、又は上記これらの断片若しくは一部に基づく核酸配列を指す。この語句は、遺伝子の転写物の3’−UTR及び/又は5’−UTRの変異体の配列全体、即ち、遺伝子の転写物の完全長変異体3’−UTR配列及び/又は完全長変異体5’−UTR配列に対応する配列、並びに遺伝子の転写物の変異体3’−UTR配列の断片及び/又は変異体5’−UTR配列の断片に対応する配列を含む。好ましくは、遺伝子の転写物の3’−UTR及び/又は5’−UTRの変異体の断片は、遺伝子の転写物の3’−UTR及び/又は5’−UTRの完全長変異体の少なくとも20%、好ましくは少なくとも30%、より好ましくは少なくとも40%、より好ましくは少なくとも50%、更により好ましくは少なくとも60%、更により好ましくは少なくとも70%、更により好ましくは少なくとも80%、最も好ましくは少なくとも90%を表す、遺伝子の転写物の3’−UTR及び/又は5’−UTRの完全長変異体における連続する一続きのヌクレオチドに対応する連続する一続きのヌクレオチドからなる。かかる変異体の断片は、本発明の意味において、好ましくは本明細書に記載する変異体の機能的断片である。
本発明の状況において、用語「機能的変異体」、「機能的断片」、及び「変異体の機能的断片」(「機能的変異体断片」とも呼ばれる)は、遺伝子の転写物の3’−UTR及び/又は5’−UTRの断片、3’−UTR及び/又は5’−UTRの変異体、又は3’−UTR及び/又は5’−UTRの変異体の断片が、前記変異体、前記断片、又は前記変異体の断片が由来する遺伝子の転写物の自然界に存在する3’−UTR及び/又は5’−UTRの少なくとも1つの機能、好ましくは1超の機能を発揮することを意味する。かかる機能は、例えば、好ましくは哺乳類細胞(例えば、ヒト細胞)における、mRNAの安定化、及び/又はmRNAからのタンパク質産生の増強、安定化及び/又は延長、及び/又はmRNAからのタンパク質発現若しくは全タンパク質産生の増加であってよい。好ましくは、3’−UTR及び/又は5’−UTRの機能は、ORFによってコードされているタンパク質の翻訳に関する。より好ましくは、前記機能は、3’−UTR及び/又は5’−UTR又はこれらの断片若しくは変異体に連結されているORFの翻訳効率を増強することを含む。本発明の状況における変異体、断片、及び変異体の断片は、以下の機能を発揮することが特に好ましい:好ましくは哺乳類細胞(例えば、ヒト細胞)において、レファレンス3’−UTR及び/又はレファレンス5’−UTRを含むか又は3’−UTR及び/又は5’−UTRが欠損しているmRNAに比べてmRNAを安定化させる機能、及び/又は好ましくは哺乳類細胞(例えば、ヒト細胞)において、レファレンス3’−UTR及び/又はレファレンス5’−UTRを含むか又は3’−UTR及び/又は5’−UTRが欠損しているmRNAに比べてmRNAからのタンパク質産生を増強、安定化及び/又は延長する機能、及び/又は好ましくは哺乳類細胞(例えば、ヒト細胞)において、レファレンス3’−UTR及び/又はレファレンス5’−UTRを含むか又は3’−UTR及び/又は5’−UTRが欠損しているmRNAに比べてmRNAからのタンパク質産生を増加させる機能。レファレンス3’−UTR及び/又はレファレンス5’−UTRは、例えば、自然界においてORFと併存している3’−UTR及び/又は5’−UTRであってよい。更に、遺伝子の転写物の3’−UTR及び/又は5’−UTRの機能的変異体、機能的断片、又は機能的変異体断片は、これら変異体、断片、又は変異体断片が由来する野生型の3’−UTR及び/又は野生型の5’−UTRに比べて、かかる3’−UTR及び/又は5’−UTRの変異体、断片、又は変異体断片を含むmRNAの翻訳効率を実質的に減じる効果を有しないことが好ましい。本発明の状況において、遺伝子の転写物の3’−UTR及び/又は5’−UTRの「機能的断片」、「機能的変異体」又は「変異体の機能的断片」の特に好ましい機能は、上記機能的断片、機能的変異体、又は変異体の機能的断片を有するmRNAの発現によるタンパク質産生の増強、安定化及び/又は延長である。
好ましくは、機能的変異体、機能的断片、又は機能的変異体断片によって発揮される1以上の機能の効率、例えば、翻訳効率の提供は、前記変異体、前記断片、又は前記変異体断片が由来する遺伝子の転写物の自然界に存在する3’−UTR及び/又は5’−UTRによって発揮される翻訳効率に関して少なくとも5%、より好ましくは少なくとも10%、より好ましくは少なくとも20%、より好ましくは少なくとも30%、より好ましくは少なくとも40%、より好ましくは少なくとも50%、より好ましくは少なくとも60%、更により好ましくは少なくとも70%、更により好ましくは少なくとも80%、最も好ましくは少なくとも90%増加する。
本発明に関連して、遺伝子の転写物の3’−UTR及び/又は5’−UTRの断片、又は遺伝子の転写物の3’−UTR及び/又は5’−UTRの変異体の断片は、好ましくは、少なくとも約3ヌクレオチド長、好ましくは少なくとも約5ヌクレオチド長、より好ましくは少なくとも約10ヌクレオチド長、少なくとも約15ヌクレオチド長、少なくとも約20ヌクレオチド長、少なくとも約25ヌクレオチド長、又は少なくとも約30ヌクレオチド長、更により好ましくは少なくとも約50ヌクレオチド長、最も好ましくは少なくとも約70ヌクレオチド長を有する。好ましくは、遺伝子の転写物の3’−UTR及び/又は5’−UTRの断片、又は遺伝子の転写物の3’−UTR及び/又は5’−UTRの変異体の断片は、上記機能的断片である。好ましい実施形態では、遺伝子の転写物の3’−UTR及び/又は5’−UTR又はこれらの断片若しくは変異体は、3ヌクレオチド長〜約500ヌクレオチド長、好ましくは5ヌクレオチド長〜約150ヌクレオチド長、より好ましくは10ヌクレオチド長〜100ヌクレオチド長、更により好ましくは15ヌクレオチド長〜90ヌクレオチド長、最も好ましくは20ヌクレオチド長〜70ヌクレオチド長を有する。典型的には、5’−UTRエレメント及び/又は3’−UTRエレメントは、500ヌクレオチド未満、400ヌクレオチド未満、300ヌクレオチド未満、200ヌクレオチド未満、150ヌクレオチド未満、又は100ヌクレオチド未満であることを特徴とする。
5’−UTRエレメント
好ましくは、少なくとも1つの5’−UTRエレメントは、それぞれ、配列番号1〜151からなる群から選択される核酸配列、又は対応するRNA配列に対して少なくとも約1%、少なくとも約2%、少なくとも約3%、少なくとも約4%、少なくとも約5%、少なくとも約10%、少なくとも約15%、少なくとも約20%、少なくとも約30%、又は少なくとも約40%、好ましくは少なくとも約50%、好ましくは少なくとも約60%、好ましくは少なくとも約70%、より好ましくは少なくとも約80%、より好ましくは少なくとも約90%、更により好ましくは少なくとも約95%、更により好ましくは少なくとも約99%の同一性を有する核酸配列を含むか又はからなる、或いは少なくとも1つの5’−UTRエレメントは、それぞれ、配列番号1〜151からなる群から選択される核酸配列、又は対応するRNA配列に対して少なくとも約40%、好ましくは少なくとも約50%、好ましくは少なくとも約60%、好ましくは少なくとも約70%、より好ましくは少なくとも約80%、より好ましくは少なくとも約90%、更により好ましくは少なくとも約95%、更により好ましくは少なくとも約99%の同一性を有する核酸配列の断片を含むか又はからなる。
以下に詳述される配列のうち、配列番号1〜136は、野生型5’−UTR配列であると考えることができ、配列番号136〜151は、人工5’−UTR配列であると考えることができる。
これら野生型5’−UTRエレメントの一部は、NCBIのGenBankによって識別されている公的に利用可能な5’−UTR配列とは異なる。表1(実施例1)を参照。この表には、本発明者らによる配列決定結果が反映されている。
したがって、配列番号45、配列番号47、配列番号49、配列番号77、配列番号79、配列番号84、配列番号85、配列番号90、配列番号92、配列番号93、配列番号98、配列番号106、配列番号109、配列番号115、配列番号118、配列番号125、配列番号127、配列番号131、配列番号135からなる群から選択される5’−UTRエレメントは、本発明によって与えられ、本発明の任意の態様において使用することができる。
本発明において有用な人工5’−UTRエレメントの例
幾つかの実施形態では、本発明に係る5’−UTRエレメントは、野生型5’−UTRエレメントとは異なる。かかる5’−UTRエレメントは、「人工5’−UTRエレメント」と称される。
人工5’−UTRエレメントは、(a)100%未満であると同時に(B)10%超、20%超、30%超、40%超、50%超、60%超、70%超、80%超、90%超、95%超である、野生型5’−UTRエレメントに対する配列同一度を示し、かかる野生型5’−UTRエレメントは、配列番号1〜136からなる群から選択されることが好ましい。典型的には、人工5’−UTRエレメントは、野生型5’−UTRエレメントとは異なり、それは、少なくとも1個のヌクレオチド、例えば、2個のヌクレオチド、3個のヌクレオチド、4個のヌクレオチド、5個のヌクレオチド、6個のヌクレオチド、7個のヌクレオチド、8個のヌクレオチド、9個のヌクレオチド、10個のヌクレオチド、又は10個超のヌクレオチドが交換されている点に基づいている。例えば、野生型5’−UTRエレメントが不利であるとみなされるヌクレオチドエレメントを含む場合、かかるヌクレオチド交換を推奨することができる。例えば、幾つかの実施形態では、不利であるとみなされるヌクレオチドエレメントは、(i)内部ATGトリプレット(即ち、本発明の核酸のオープンリーディングフレームの開始コドン以外のATGトリプレット)又は(ii)制限酵素認識部位(切断部位)、特に、本発明の人工核酸を作製(クローニング)するプロセスにおいて使用される制限酵素によって認識される(切断可能な)制限酵素認識部位(切断部位)から選択される。したがって、(それぞれの野生型塩基の交換、好ましくは置換において)特定の塩基を特異的に導入することが可能であり、その結果、人工5’−UTRエレメントは、不利であるとみなされるヌクレオチドエレメントを含有しなくなる。特定の実施形態では、人工5’−UTRエレメントは、配列番号137〜151からなる群から選択される。
3’−UTRエレメント
好ましくは、少なくとも1つの3’−UTRエレメントは、それぞれ配列番号152〜204又は対応するDNA若しくはRNA配列からなる群から選択される核酸配列と少なくとも約1%、約2%、約3%、約4%、約5%、約10%、約15%、約20%、約30%、又は約40%、好ましくは少なくとも約50%、好ましくは少なくとも約60%、好ましくは少なくとも約70%、より好ましくは少なくとも約80%、より好ましくは少なくとも約90%、更により好ましくは少なくとも約95%、更により好ましくは少なくとも約99%の同一性を有する核酸配列を含むか又はからなるか、或いは少なくとも1つの3’−UTRエレメントは、それぞれ配列番号152〜204又は対応するDNA若しくはRNA配列からなる群から選択される核酸配列と少なくとも約40%、好ましくは少なくとも約50%、好ましくは少なくとも約60%、好ましくは少なくとも約70%、より好ましくは少なくとも約80%、より好ましくは少なくとも約90%、更により好ましくは少なくとも約95%、更により好ましくは少なくとも約99%の同一性を有する核酸配列の断片を含むか又はからなる。
以下に詳述する配列の中でも、配列番号152〜203は野生型3’−UTR配列とみなすことができ、配列番号204は人工5’−UTR配列とみなすことができる。
これら野生型3’−UTRエレメントの一部は、NCBIのGenBankによって識別されている公的に利用可能な3’−UTR配列とは異なる。表2(実施例1)を参照。この表には、本発明者らによる配列決定結果が反映されている。
したがって、配列番号179、配列番号180、配列番号182、配列番号183、配列番号197、配列番号200からなる群から選択される3’−UTRエレメントは、本発明によって与えられ、本発明の任意の態様において使用することができる。
本発明において有用な人工3’−UTRエレメントの例
幾つかの実施形態では、本発明に係る3’−UTRエレメントは、野生型3’−UTRエレメントとは異なる。かかる3’−UTRエレメントは、「人工3’−UTRエレメント」と称される。
人工3’−UTRエレメントは、(a)100%未満であると同時に(B)10%超、20%超、30%超、40%超、50%超、60%超、70%超、80%超、90%超、95%超である、野生型3’−UTRエレメントに対する配列同一度を示し、かかる野生型3’−UTRエレメントは、配列番号152〜203からなる群から選択されることが好ましい。典型的には、人工3’−UTRエレメントは、野生型3’−UTRエレメントとは異なり、それは、少なくとも1個のヌクレオチド、例えば、2個のヌクレオチド、3個のヌクレオチド、4個のヌクレオチド、5個のヌクレオチド、6個のヌクレオチド、7個のヌクレオチド、8個のヌクレオチド、9個のヌクレオチド、10個のヌクレオチド、又は10個超のヌクレオチドが交換されている点に基づいている。例えば、野生型3’−UTRエレメントが不利であるとみなされるヌクレオチドエレメントを含む場合、かかるヌクレオチド交換を推奨することができる。例えば、幾つかの実施形態では、不利であるとみなされるヌクレオチドエレメントは、制限酵素認識部位(切断部位)、特に、本発明の人工核酸を作製(クローニング)するプロセスにおいて使用される制限酵素によって認識される(切断可能な)制限酵素認識部位(切断部位)である。したがって、(それぞれの野生型塩基の交換、好ましくは置換において)特定の塩基を特異的に導入することが可能であり、その結果、人工3’−UTRエレメントは、不利であるとみなされるヌクレオチドエレメントを含有しなくなる。特定の実施形態では、人工3’−UTRエレメントは、配列番号204である。
新規5’−UTRエレメント及び新規3’−UTRエレメント
また、本発明は、新規5’−UTRエレメント及び新規3’−UTRエレメント、即ち、それぞれヒト細胞及びマウス細胞で発現することが本発明者らによって見出されたが、公的なデータベースからは知られていない5’−UTRエレメント及び3’−UTRエレメントを提供する(実施例1を参照)。配列番号45、配列番号47、配列番号49からなる群から選択される任意の5’−UTRが、本発明の幾つかの実施形態において好ましい場合がある。配列番号77、配列番号79、配列番号84、配列番号85、配列番号90、配列番号92、配列番号93、配列番号98、配列番号106、配列番号109、配列番号115、配列番号118、配列番号125、配列番号127、配列番号131、配列番号135からなる群から選択される任意の5’−UTRが、本発明の幾つかの実施形態において好ましい場合がある。配列番号179、配列番号180、配列番号182、配列番号183、配列番号197、配列番号200からなる群から選択される任意の3’−UTRが、本発明の幾つかの実施形態において好ましい場合がある。
5’−UTRエレメント及び好ましい3’−UTRエレメントの説明
好ましくは、本発明に係る人工核酸分子の少なくとも1つの3’−UTRエレメントは、NDUFS7−3’−UTR、PHGDH−3’−UTR、TSPO−3’−UTR、ATP5D−3’−UTR、EXOSC4−3’−UTR、TUBB4B−3’−UTR、TUBA4A−3’−UTR、EMP3−3’−UTR、CRIP2−3’−UTR、BRAT1−3’−UTR、PSMB3−3’−UTR、PSMB6−3’−UTR、SCAND1−3’−UTR、AMN−3’−UTR、CYBA−3’−UTR、PCOLCE−3’−UTR、MAP1S−3’−UTR、VTN−3’−UTR、ALDH16A1−3’−UTR(いずれもヒト)、Acox2−3’−UTR、Ubc−3’−UTR、Slpi−3’−UTR、Igf2bp1−3’−UTR、Tmem37−3’−UTR、Slc7a3−3’−UTR、Cst6−3’−UTR、Ebp−3’−UTR、Sf3b5−3’−UTR、Cdca8−3’−UTR、Kif22−3’−UTR、Cad−3’−UTR、Pole−3’−UTR、Kif2c−3’−UTR、Scand1−3’−UTR、Gpr84−3’−UTR、Tpgs1−3’−UTR、Ccl17−3’−UTR、Alkbh7−3’−UTR、Ms4a8a−3’−UTR、Mrpl34−3’−UTR、Comtd1−3’−UTR、Armc6−3’−UTR、Atp5d−3’−UTR、1110001J03Rik−3’−UTR、Nudt22−3’−UTR(いずれもマウス)からなる群から選択される遺伝子の転写物の3’−UTR配列に対して少なくとも約40%、好ましくは少なくとも約50%、好ましくは少なくとも約60%、好ましくは少なくとも約70%、より好ましくは少なくとも約80%、より好ましくは少なくとも約90%、更により好ましくは少なくとも約95%、更により好ましくは少なくとも約99%、最も好ましくは100%の同一性を有する核酸配列を含むか又はからなる。最も好ましくは、本発明に係る人工核酸分子の少なくとも1つの3’−UTRエレメントは、それぞれ、配列番号152、配列番号153、配列番号154、配列番号155、配列番号156、配列番号157、配列番号158、配列番号159、配列番号160、配列番号161、配列番号164、配列番号165、配列番号167、配列番号168、配列番号169、配列番号170、配列番号171、配列番号172、配列番号173、配列番号174、配列番号175、配列番号176、配列番号179、配列番号180、配列番号181、配列番号182、配列番号183、配列番号184、配列番号187、配列番号188、配列番号189、配列番号191、配列番号204(又は配列番号192)、配列番号193、配列番号194、配列番号195、配列番号196、配列番号197、配列番号198、配列番号199、配列番号200、配列番号201、配列番号202、配列番号203、配列番号177からなる群から選択される配列又は対応するRNA配列に対して少なくとも約40%、好ましくは少なくとも約50%、好ましくは少なくとも約60%、好ましくは少なくとも約70%、より好ましくは少なくとも約80%、より好ましくは少なくとも約90%、更により好ましくは少なくとも約95%、更により好ましくは少なくとも約99%、最も好ましくは100%の同一性を有する核酸配列を含むか又はからなる。
好ましくは、本発明に係る人工核酸分子の少なくとも1つの5’−UTRエレメントは、ZNF460−5’−UTR、TGM2−5’−UTR、IL7R−5’−UTR、COL8A1−5’−UTR、NDUFS7−5’−UTR、PLK2−5’−UTR、FBXO32−5’−UTR、ATP5D−5’−UTR、TUBB4B−5’−UTR、ORMDL2−5’−UTR、FSCN1−5’−UTR、CD9−5’−UTR、PYSL2−5’−UTR、PSMB3−5’−UTR、PSMB6−5’−UTR、KPNA6−5’−UTR、SFT2D2−5’−UTR、LCLAT1−5’−UTR、FBXL18−5’−UTR、SLC35F6−5’−UTR、VMA21−5’−UTR、SEZ6L2−5’−UTR、PCOLCE−5’−UTR、VTN−5’−UTR、ALDH16A1−5’−UTR、KPNA6−5’−UTR、JUP−5’−UTR、CPN2−5’−UTR、PNPO−5’−UTR、SSSCA1−5’−UTR、POLR2L−5’−UTR、LIN7C−5’−UTR、UQCR10−5’−UTR、PYCRL−5’−UTR、AMN−5’−UTR、MAP1S−5’−UTR(いずれもヒト)、Dpysl2−5’−UTR、Acox2−5’−UTR、Ubc−5’−UTR、Nudt22−5’−UTR、Pcyox1l−5’−UTR、Ankrd1−5’−UTR、Tspyl4−5’−UTR、Slc7a3−5’−UTR、Aacs−5’−UTR、Nosip−5’−UTR、Itga7−5’−UTR、Ccnd2−5’−UTR、Ebp−5’−UTR、Sf3b5−5’−UTR、Fasn−5’−UTR、Hmgcs1−5’−UTR、Osr1−5’−UTR、Lmnb1−5’−UTR、Vma21−5’−UTR、Kif20a−5’−UTR、Cdca8−5’−UTR、Slc7a1−5’−UTR、Ubqln2−5’−UTR、Prps2−5’−UTR、Shmt2−5’−UTR、Fignl1−5’−UTR、Cad−5’−UTR、Anln−5’−UTR、Slfn9−5’−UTR、Ncaph−5’−UTR、Pole−5’−UTR、Uhrf1−5’−UTR、Gja1−5’−UTR、Fam64a−5’−UTR、Tspan10−5’−UTR、Scand1−5’−UTR、Gpr84−5’−UTR、Cers6−5’−UTR、Cxcr4−5’−UTR、Gprc5c−5’−UTR、Fen1−5’−UTR、Cspg4−5’−UTR、Mrpl34−5’−UTR、Comtd1−5’−UTR、Armc6−5’−UTR、Emr4−5’−UTR、Atp5d−5’−UTR、Csf2ra−5’−UTR、Aarsd1−5’−UTR、Cth−5’−UTR、Tpgs1−5’−UTR、Ccl17−5’−UTR、Alkbh7−5’−UTR、Ms4a8a−5’−UTR(いずれもマウス)の転写物の5’−UTR配列に対して少なくとも約40%、好ましくは少なくとも約50%、好ましくは少なくとも約60%、好ましくは少なくとも約70%、より好ましくは少なくとも約80%、より好ましくは少なくとも約90%、更により好ましくは少なくとも約95%、更により好ましくは少なくとも約99%、最も好ましくは100%の同一性を有する核酸配列を含むか又はからなる。最も好ましくは、本発明に係る人工核酸分子の少なくとも1つの5’−UTRエレメントは、それぞれ、配列番号1、配列番号2、配列番号137(又は配列番号3)、配列番号138(又は配列番号9)、配列番号10、配列番号12、配列番号15、配列番号140(又は配列番号17)、配列番号20、配列番号22、配列番号23、配列番号143(又は配列番号31)、配列番号32、配列番号39、配列番号41、配列番号44、配列番号45、配列番号146(又は配列番号52)、配列番号53、配列番号54、配列番号57、配列番号60、配列番号61、配列番号63、配列番号64、配列番号66、配列番号68、配列番号69、配列番号72、配列番号34、配列番号35、配列番号36、配列番号37、配列番号144(又は配列番号42)、配列番号58、配列番号62、配列番号73、配列番号75、配列番号77、配列番号79、配列番号80、配列番号81、配列番号83、配列番号84、配列番号86、配列番号87、配列番号88、配列番号89、配列番号90、配列番号91、配列番号92、配列番号93、配列番号94、配列番号95、配列番号97、配列番号98、配列番号99、配列番号100、配列番号101、配列番号102、配列番号103、配列番号106、配列番号107、配列番号108、配列番号147(又は配列番号109)、配列番号148(又は配列番号110)、配列番号112、配列番号113、配列番号114、配列番号115、配列番号117、配列番号118、配列番号149(又は配列番号119)、配列番号123、配列番号126、配列番号127、配列番号128、配列番号129、配列番号130、配列番号131、配列番号132、配列番号133、配列番号134、配列番号151(又は配列番号136)、配列番号96、配列番号111、配列番号150(配列番号120に基づく)、配列番号121、配列番号124、配列番号125に係る配列又は対応するRNA配列に対して少なくとも約40%、好ましくは少なくとも約50%、好ましくは少なくとも約60%、好ましくは少なくとも約70%、より好ましくは少なくとも約80%、より好ましくは少なくとも約90%、更により好ましくは少なくとも約95%、更により好ましくは少なくとも約99%、最も好ましくは100%の同一性を有する核酸配列を含むか又はからなる。
また、本発明に係る人工核酸分子の少なくとも1つの3’−UTRエレメントは、遺伝子の転写物の3’−UTRの核酸配列、例えば、配列番号152〜204に係る配列の3’−UTRに対して少なくとも約40%、好ましくは少なくとも約50%、好ましくは少なくとも約60%、好ましくは少なくとも約70%、より好ましくは少なくとも約80%、より好ましくは少なくとも約90%、更により好ましくは少なくとも約95%、更により好ましくは少なくとも約99%、最も好ましくは100%の同一性を有する核酸配列の断片を含むか又はからなっていてよく、前記断片は、好ましくは、上記機能的断片又は機能的変異体断片である。かかる断片は、好ましくは、少なくとも約3ヌクレオチド長、好ましくは少なくとも約5ヌクレオチド長、より好ましくは少なくとも約10ヌクレオチド長、少なくとも約15ヌクレオチド長、少なくとも約20ヌクレオチド長、少なくとも約25ヌクレオチド長、又は少なくとも約30ヌクレオチド長、更により好ましくは少なくとも約50ヌクレオチド長、最も好ましくは少なくとも約70ヌクレオチド長を有する。好ましい実施形態では、これらの断片又は変異体は、3ヌクレオチド長〜約500ヌクレオチド長、好ましくは5ヌクレオチド長〜約150ヌクレオチド長、より好ましくは10ヌクレオチド長〜100ヌクレオチド長、更により好ましくは15ヌクレオチド長〜90ヌクレオチド長、最も好ましくは20ヌクレオチド長〜70ヌクレオチド長を有する。好ましくは、前記変異体、断片、又は変異体断片は、3’−UTRの機能的変異体、機能的断片、又は機能的変異体断片であり、配列番号152、配列番号153、配列番号154、配列番号155、配列番号156、配列番号157、配列番号158、配列番号159、配列番号160、配列番号161、配列番号164、配列番号165、配列番号167、配列番号168、配列番号169、配列番号170、配列番号171、配列番号172、配列番号173、配列番号174、配列番号175、配列番号176、配列番号179、配列番号180、配列番号181、配列番号182、配列番号183、配列番号184、配列番号187、配列番号188、配列番号189、配列番号191、配列番号204(又は配列番号192)、配列番号193、配列番号194、配列番号195、配列番号196、配列番号197、配列番号198、配列番号199、配列番号200、配列番号201、配列番号202、配列番号203、配列番号177からなる群から選択される核酸配列を含む人工核酸分子が示すタンパク質産生延長効率の少なくとも30%、好ましくは少なくとも40%、より好ましくは少なくとも50%、より好ましくは少なくとも60%、更により好ましくは少なくとも70%、更により好ましくは少なくとも80%、最も好ましくは少なくとも90%の効率で本発明に係る人工核酸分子からのタンパク質産生を延長する。
また、本発明に係る人工核酸分子の少なくとも1つの5’−UTRエレメントは、遺伝子の転写物の5’−UTRの核酸配列、例えば、配列番号1〜151に係る配列の5’−UTRに対して少なくとも約40%、好ましくは少なくとも約50%、好ましくは少なくとも約60%、好ましくは少なくとも約70%、より好ましくは少なくとも約80%、より好ましくは少なくとも約90%、更により好ましくは少なくとも約95%、更により好ましくは少なくとも約99%、最も好ましくは100%の同一性を有する核酸配列の断片を含むか又はからなっていてよく、前記断片は、好ましくは、上記機能的断片又は機能的変異体断片である。かかる断片は、好ましくは、少なくとも約3ヌクレオチド長、好ましくは少なくとも約5ヌクレオチド長、より好ましくは少なくとも約10ヌクレオチド長、少なくとも約15ヌクレオチド長、少なくとも約20ヌクレオチド長、少なくとも約25ヌクレオチド長、又は少なくとも約30ヌクレオチド長、更により好ましくは少なくとも約50ヌクレオチド長、最も好ましくは少なくとも約70ヌクレオチド長を有する。好ましい実施形態では、これらの断片又は変異体は、3ヌクレオチド長〜約500ヌクレオチド長、好ましくは5ヌクレオチド長〜約150ヌクレオチド長、より好ましくは10ヌクレオチド長〜100ヌクレオチド長、更により好ましくは15ヌクレオチド長〜90ヌクレオチド長、最も好ましくは20ヌクレオチド長〜70ヌクレオチド長を有する。好ましくは、前記変異体、断片、又は変異体断片は、5’−UTRの機能的変異体、機能的断片、又は機能的変異体断片であり、配列番号1、配列番号2、配列番号137(又は配列番号3)、配列番号138(又は配列番号9)、配列番号10、配列番号12、配列番号15、配列番号140(又は配列番号17)、配列番号20、配列番号22、配列番号23、配列番号143(又は配列番号31)、配列番号32、配列番号39、配列番号41、配列番号44、配列番号45、配列番号146(又は配列番号52)、配列番号53、配列番号54、配列番号57、配列番号60、配列番号61、配列番号63、配列番号64、配列番号66、配列番号68、配列番号69、配列番号72、配列番号34、配列番号35、配列番号36、配列番号37、配列番号144(又は配列番号42)、配列番号58、配列番号62、配列番号73、配列番号75、配列番号77、配列番号79、配列番号80、配列番号81、配列番号83、配列番号84、配列番号86、配列番号87、配列番号88、配列番号89、配列番号90、配列番号91、配列番号92、配列番号93、配列番号94、配列番号95、配列番号97、配列番号98、配列番号99、配列番号100、配列番号101、配列番号102、配列番号103、配列番号106、配列番号107、配列番号108、配列番号147(又は配列番号109)、配列番号148(又は配列番号110)、配列番号112、配列番号113、配列番号114、配列番号115、配列番号117、配列番号118、配列番号149(又は配列番号119)、配列番号123、配列番号126、配列番号127、配列番号128、配列番号129、配列番号130、配列番号131、配列番号132、配列番号133、配列番号134、配列番号151(又は配列番号136)、配列番号96、配列番号111、配列番号150(配列番号120に基づく)、配列番号121、配列番号124、配列番号125からなる群から選択される核酸配列を含む人工核酸分子が示すタンパク質産生増加効率の少なくとも30%、好ましくは少なくとも40%、より好ましくは少なくとも50%、より好ましくは少なくとも60%、更により好ましくは少なくとも70%、更により好ましくは少なくとも80%、最も好ましくは少なくとも90%の効率で本発明に係る人工核酸分子からのタンパク質産生を増加させる。
更なる好ましい実施形態
好ましくは、本発明に係る人工核酸分子の少なくとも1つの3’−UTRエレメント及び/又は少なくとも1つの5’−UTRエレメントは、少なくとも約3ヌクレオチド長、好ましくは少なくとも約5ヌクレオチド長、より好ましくは少なくとも約10ヌクレオチド長、少なくとも約15ヌクレオチド長、少なくとも約20ヌクレオチド長、少なくとも約25ヌクレオチド長、又は少なくとも約30ヌクレオチド長、更により好ましくは少なくとも約50ヌクレオチド長、最も好ましくは少なくとも約70ヌクレオチド長を有する。少なくとも1つの3’−UTRエレメント及び/又は少なくとも1つの5’−UTRエレメントの長さの上限は、500ヌクレオチド長以下、例えば、400ヌクレオチド長、300ヌクレオチド長、200ヌクレオチド長、150ヌクレオチド長、又は100ヌクレオチド長であってよい。他の実施形態では、上限は、50ヌクレオチド〜100ヌクレオチドの範囲内で選択してよい。例えば、これらの断片又は変異体は、3ヌクレオチド長〜約500ヌクレオチド長、好ましくは5ヌクレオチド長〜150ヌクレオチド長、より好ましくは10ヌクレオチド長〜100ヌクレオチド長、更により好ましくは15ヌクレオチド長〜90ヌクレオチド長、最も好ましくは20ヌクレオチド長〜70ヌクレオチド長を有し得る。
また、人工核酸分子に含まれるUTRエレメントは、本明細書に提供される配列番号1〜204から選択される任意の配列よりも短いが、それでも配列番号1〜204から選択されるそれぞれの配列任意の配列と70%以上、80%以上、90%以上、又は95%以上の同一度を共有している連続配列を含む(又はからなる)ことが好ましい場合もある。かかる場合、好ましくは、置換するUTRエレメントは、配列番号1〜204から選択される任意の配列と全長に亘って同一である連続配列を含むが、置換するUTRエレメントは、より短い、例えば、それ以外は同一であり、配列番号1〜204から選択される配列の全長に対して70%以上、80%以上、90%以上、又は95%以上の長さを有する。
更に、本発明に係る人工核酸分子は、上記の通り、1超の3’−UTRエレメント及び/又は1超の5’−UTRエレメントを含んでいてよい。例えば、本発明に係る人工核酸分子は、1つ、2つ、3つ、4つ、又はそれ以上の3’−UTRエレメント、及び/又は1つ、2つ、3つ、4つ、又はそれ以上の5’−UTRエレメントを含んでいてよく、個々の3’−UTRエレメントは、同じであっても異なっていてもよく、同様に、個々の5’−UTRエレメントは、同じであっても異なっていてもよい。例えば、本発明に係る人工核酸分子は、上記の通り2つの本質的に同一の3’−UTRエレメントを含んでいてよく、例えば、2つの3’−UTRエレメントは、上記の通り、遺伝子の転写物の3’−UTR、例えば、配列番号152〜204に係る配列に由来する核酸配列、又は遺伝子の転写物の3’−UTRの断片若しくは変異体、これらの機能的変異体、これらの機能的断片、若しくはこれらの機能的変異体断片に由来する核酸配列を含むか又はからなる。したがって、例えば、本発明に係る人工核酸分子は、上記の通り2つの本質的に同一の5’−UTRエレメントを含んでいてよく、例えば、2つの5’−UTRエレメントは、上記の通り、遺伝子の転写物の5’−UTR、例えば、配列番号1〜151に係る配列に由来する核酸配列、又は遺伝子の転写物の5’−UTRの断片若しくは変異体、これらの機能的変異体、これらの機能的断片、若しくはこれらの機能的変異体断片に由来する核酸配列を含むか又はからなる。
驚くべきことに、本発明者らは、上記3’−UTRエレメント及び/又は上記5’−UTRエレメントを含む人工核酸分子は、高い翻訳効率を示すmRNA分子を表し得るか又は提供し得ることを見出した。したがって、本明細書に記載の3’−UTRエレメント及び/又は本明細書に記載の5’−UTRエレメントは、mRNA分子の翻訳効率を改善し得る。
特に、本発明に係る人工核酸分子は、(i)高い翻訳効率を示す少なくとも1つの3’−UTRエレメント及び少なくとも1つの5’−UTRエレメントを含んでいてよい;(ii)高い翻訳効率を示す少なくとも1つの3’−UTRエレメントを含んでいてよいが、高い翻訳効率を示す5’−UTRエレメントは含まない;或いは(iii)高い翻訳効率を示す少なくとも1つの5’−UTRエレメントを含んでいてよいが、高い翻訳効率を示す3’−UTRエレメントは含まない。
しかし、特に(ii)及び(iii)の場合((i)の場合もあり得る)、本発明に係る人工核酸分子は、1以上の「更なる3’−UTRエレメント及び/又は5’−UTRエレメント」、即ち、上記の要件を満たさない3’−UTRエレメント及び/又は5’−UTRエレメントを更に含んでいてもよい。例えば、本発明に係る3’−UTRエレメント、即ち、前記人工核酸分子に高い翻訳効率を与える3’−UTRエレメントを含む本発明に係る人工核酸分子は、任意の更なる3’−UTR及び/又は任意の更なる5’−UTR、特に、更なる5’−UTR(例えば、5’−TOP UTR)又は任意の他の5’−UTR若しくは5’−UTRエレメントを更に含んでいてよい。同様に、例えば、本発明に係る5’−UTRエレメント、即ち、前記人工核酸分子に高い翻訳効率を与える5’−UTRエレメントを含む本発明に係る人工核酸分子は、任意の更なる3’−UTR及び/又は任意の更なる5’−UTR、特に、更なる3’−UTR(例えば、アルブミン遺伝子の3’−UTRに由来する3’−UTR)、特に好ましくは、配列番号206若しくは207、特に配列番号207に係る配列を含む3’−UTR、又は任意の他の3’−UTR若しくは3’−UTRエレメントを更に含んでいてよい。
高い翻訳効率を与える本発明の少なくとも1つの5’−UTRエレメント及び/又は本発明の少なくとも1つの3’−UTRエレメントに加えて、本発明に係る人工核酸分子中に更なる3’−UTR(エレメント)及び/又は更なる5’−UTR(エレメント)が存在する場合、更なる5’−UTR(エレメント)及び/又は更なる3’−UTR(エレメント)は、本発明の3’−UTRエレメント及び/又は本発明の5’−UTRエレメントと相互作用し得るので、それぞれ、本発明の3’−UTRエレメント及び/又は本発明の5’−UTRエレメントの翻訳効率効果を支援する。かかる更なる3’−UTR及び/又は5’−UTR(エレメント)は、安定性及び翻訳効率を更に支援し得る。更に、本発明の3’−UTRエレメント及び本発明の5’−UTRエレメントの両方が本発明に係る人工核酸分子中に存在する場合、本発明の5’−UTRエレメント及び本発明の3’−UTRエレメントの翻訳効率効果によって、好ましくは、相乗的に高い翻訳効率がもたらされる。
好ましくは、更なる3’−UTRは、アルブミン遺伝子、α−グロビン遺伝子、β−グロビン遺伝子、チロシンヒドロキシラーゼ遺伝子、リポキシゲナーゼ遺伝子、及びコラーゲンアルファ遺伝子(例えば、コラーゲンアルファ1(I)遺伝子)からなる群から選択される遺伝子の3’−UTR、又はその開示が参照によって本明細書に援用される国際公開第2013/143700号の配列番号1369〜1390に係るアルブミン遺伝子、α−グロビン遺伝子、β−グロビン遺伝子、チロシンヒドロキシラーゼ遺伝子、リポキシゲナーゼ遺伝子、及びコラーゲンアルファ遺伝子(例えば、コラーゲンアルファ1(I)遺伝子)からなる群から選択される遺伝子の3’−UTRの変異体に由来する核酸配列を含むか又はからなる。特に好ましい実施形態では、更なる3’−UTRは、アルブミン遺伝子、好ましくは脊椎動物のアルブミン遺伝子、より好ましくは哺乳類のアルブミン遺伝子、最も好ましくは配列番号206に係るヒトアルブミン遺伝子の3’−UTRに由来する核酸配列を含むか又はからなる:
別の特に好ましい実施形態では、更なる3’−UTRは、α−グロビン遺伝子、好ましくは、脊椎動物のα−又はβ−グロビン遺伝子、より好ましくは哺乳類のα−又はβ−グロビン遺伝子、最も好ましくは国際公開第2013/143700号の配列番号1370(ヒトヘモグロビンアルファ1(HBA1)の3’−UTR)に係る、又は国際公開第2013/143700号の配列番号1371(ヒトヘモグロビンアルファ2(HBA2)の3’−UTR)に係る、及び/又は国際公開第2013/143700号の配列番号1372(ヒトヘモグロビンベータ(HBB)の3’−UTR)に係るヒトのα−又はβ−グロビン遺伝子の3’−UTRに由来する核酸配列を含むか又はからなる。
例えば、更なる3’−UTRは、国際公開第2013/143700号の配列番号1393に係るα−グロビン遺伝子の3’−UTRの中心α−複合体結合部分を含み得るか又はなり得る。
この状況では、本発明の核酸分子は、国際公開第2013/143700号の配列番号1369〜1390に係る核酸に由来する更なる3’−UTR、又はその断片、ホモログ、若しくは変異体を含むことが特に好ましい。
最も好ましくは、更なる3’−UTRは、配列番号207に係るヒトアルブミン遺伝子の断片に由来する核酸配列を含む:
この状況では、本発明の人工核酸分子の更なる3’−UTRは、配列番号207に係る核酸配列又は対応するRNA配列を含む又はからなることが特に好ましい。
幾つかの実施形態では、更なる3’−UTRは、好ましくは国際公開第2015/101414号又は国際公開第2015/101415号(これらの開示は参照によって本明細書に援用される)に記載されているリボソームタンパク質をコードしている遺伝子に由来する核酸配列を含むか又はからなる。
また、更なる3’−UTRは、リボソームタンパク質をコードしている遺伝子に由来する核酸配列を含んでいてもよく、からなっていてもよく、したがって、更なる3’−UTRが由来し得るリボソームタンパク質をコードしている遺伝子としては、リボソームタンパク質L9(RPL9)、リボソームタンパク質L3(RPL3)、リボソームタンパク質L4(RPL4)、リボソームタンパク質L5(RPL5)、リボソームタンパク質L6(RPL6)、リボソームタンパク質L7(RPL7)、リボソームタンパク質L7a(RPL7A)、リボソームタンパク質L11(RPL11)、リボソームタンパク質L12(RPL12)、リボソームタンパク質L13(RPL13)、リボソームタンパク質L23(RPL23)、リボソームタンパク質L18(RPL18)、リボソームタンパク質L18a(RPL18A)、リボソームタンパク質L19(RPL19)、リボソームタンパク質L21(RPL21)、リボソームタンパク質L22(RPL22)、リボソームタンパク質L23a(RPL23A)、リボソームタンパク質L17(RPL17)、リボソームタンパク質L24(RPL24)、リボソームタンパク質L26(RPL26)、リボソームタンパク質L27(RPL27)、リボソームタンパク質L30(RPL30)、リボソームタンパク質L27a(RPL27A)、リボソームタンパク質L28(RPL28)、リボソームタンパク質L29(RPL29)、リボソームタンパク質L31(RPL31)、リボソームタンパク質L32(RPL32)、リボソームタンパク質L35a(RPL35A)、リボソームタンパク質L37(RPL37)、リボソームタンパク質L37a(RPL37A)、リボソームタンパク質L38(RPL38)、リボソームタンパク質L39(RPL39)、リボソームタンパク質、ラージ、P0(RPLP0)、リボソームタンパク質、ラージ、P1(RPLP1)、リボソームタンパク質、ラージ、P2(RPLP2)、リボソームタンパク質S3(RPS3)、リボソームタンパク質S3A(RPS3A)、リボソームタンパク質S4、X連鎖(RPS4X)、リボソームタンパク質S4、Y連鎖1(RPS4Y1)、リボソームタンパク質S5(RPS5)、リボソームタンパク質S6(RPS6)、リボソームタンパク質S7(RPS7)、リボソームタンパク質S8(RPS8)、リボソームタンパク質S9(RPS9)、リボソームタンパク質S10(RPS10)、リボソームタンパク質S11(RPS11)、リボソームタンパク質S12(RPS12)、リボソームタンパク質S13(RPS13)、リボソームタンパク質S15(RPS15)、リボソームタンパク質S15a(RPS15A)、リボソームタンパク質S16(RPS16)、リボソームタンパク質S19(RPS19)、リボソームタンパク質S20(RPS20)、リボソームタンパク質S21(RPS21)、リボソームタンパク質S23(RPS23)、リボソームタンパク質S25(RPS25)、リボソームタンパク質S26(RPS26)、リボソームタンパク質S27(RPS27)、リボソームタンパク質S27a(RPS27a)、リボソームタンパク質S28(RPS28)、リボソームタンパク質S29(RPS29)、リボソームタンパク質L15(RPL15)、リボソームタンパク質S2(RPS2)、リボソームタンパク質L14(RPL14)、リボソームタンパク質S14(RPS14)、リボソームタンパク質L10(RPL10)、リボソームタンパク質L10a(RPL10A)、リボソームタンパク質L35(RPL35)、リボソームタンパク質L13a(RPL13A)、リボソームタンパク質L36(RPL36)、リボソームタンパク質L36a(RPL36A)、リボソームタンパク質L41(RPL41)、リボソームタンパク質S18(RPS18)、リボソームタンパク質S24(RPS24)、リボソームタンパク質L8(RPL8)、リボソームタンパク質L34(RPL34)、リボソームタンパク質S17(RPS17)、リボソームタンパク質SA(RPSA)、ユビキチンA−52残基リボソームタンパク質融合生成物1(UBA52)、遍在的に発現するFinkel−Biskis−Reillyマウス肉腫ウイルス(FBR−MuSV)(FAU)、リボソームタンパク質L22様1(RPL22L1)、リボソームタンパク質S17(RPS17)、リボソームタンパク質L39様(RPL39L)、リボソームタンパク質L10様(RPL10L)、リボソームタンパク質L36a様(RPL36AL)、リボソームタンパク質L3様(RPL3L)、リボソームタンパク質S27様(RPS27L)、リボソームタンパク質L26様1(RPL26L1)、リボソームタンパク質L7様1(RPL7L1)、リボソームタンパク質L13aシュードジーン(RPL13AP)、リボソームタンパク質L37aシュードジーン8(RPL37AP8)、リボソームタンパク質S10シュードジーン5(RPS10P5)、リボソームタンパク質S26シュードジーン11(RPS26P11)、リボソームタンパク質L39シュードジーン5(RPL39P5)、リボソームタンパク質、ラージ、P0シュードジーン6(RPLP0P6)、及びリボソームタンパク質L36シュードジーン14(RPL36P14)が挙げられるが、これらに限定されない。
好ましくは、更なる5’−UTRが、TOP遺伝子の5’−UTRに由来するか、又はTOP遺伝子の5’−UTRの断片、ホモログ、若しくは変異体に由来する核酸配列を含むか又はからなる。
5’−UTRエレメントは、上に定義した通りTOPモチーフも5’TOPも含まないことが特に好ましい。特に、TOP遺伝子の5’−UTRは、TOPモチーフが欠損しているTOP遺伝子の5’−UTRであることが好ましい。
TOP遺伝子の5’−UTRに由来する核酸配列は、真核生物のTOP遺伝子、好ましくは、植物又は動物のTOP遺伝子、より好ましくは、脊索動物のTOP遺伝子、更により好ましくは、脊椎動物のTOP遺伝子、最も好ましくは、哺乳類のTOP遺伝子(例えば、ヒトのTOP遺伝子)に由来する。
例えば、更なる5’−UTRエレメントは、好ましくは、その開示が参照により本明細書に援用される国際公開第2013/143700号の配列番号1〜1363、配列番号1395、配列番号1421、及び配列番号1422からなる群から選択される核酸配列;国際公開第2013/143700号の配列番号1〜1363、配列番号1395、配列番号1421、及び配列番号1422のホモログ;これらの変異体;又は好ましくは、対応するRNA配列に由来する核酸配列を含むか又はからなる5’−UTRエレメントから選択される。「国際公開第2013/143700号の配列番号1〜1363、配列番号1395、配列番号1421、及び配列番号1422のホモログ」という用語は、国際公開第2013/143700号の配列番号1〜1363、配列番号1395、配列番号1421、及び配列番号1422に係る配列に対して相同である、ヒト以外の種の配列を指す。
好ましい実施形態では、更なる5’−UTRは、5位ヌクレオチド(即ち、配列において5位に位置するヌクレオチド)から(配列の3’末端に位置する)開始コドンの直ぐ5’側のヌクレオチド位置(例えば、国際公開第2013/143700号の配列番号1〜1363、配列番号1395、配列番号1421、及び配列番号1422;国際公開第2013/143700号の配列番号1〜1363、配列番号1395、配列番号1421、及び配列番号1422のホモログ;これらの変異体;又は対応するRNA配列から選択される核酸配列のATG配列の直ぐ5’側のヌクレオチド位置)まで延在する核酸配列に由来する核酸配列を含むか又はからなる。更なる5’−UTRは、5’TOPの直ぐ3’側のヌクレオチド位置から(配列の3’末端に位置する)開始コドンの直ぐ5’側のヌクレオチド位置(例えば、(例えば、国際公開第2013/143700号の配列番号1〜1363、配列番号1395、配列番号1421、及び配列番号1422から選択される核酸配列;国際公開第2013/143700号の配列番号1〜1363、配列番号1395、配列番号1421、及び配列番号1422のホモログ;これらの変異体;又は対応するRNA配列のATG配列の直ぐ5’側のヌクレオチド位置)まで延在する核酸配列に由来することが特に好ましい。
特に好ましい実施形態では、更なる5’−UTRは、リボソームタンパク質をコードしているTOP遺伝子の5’−UTR又はリボソームタンパク質をコードしているTOP遺伝子の5’−UTRの変異体に由来する核酸配列を含むか又はからなる。例えば、5’−UTRエレメントは、好ましくは5’TOPモチーフが欠損している、国際公開第2013/143700号の配列番号170、232、244、259、1284、1285、1286、1287、1288、1289、1290、1291、1292、1293、1294、1295、1296、1297、1298、1299、1300、1301、1302、1303、1304、1305、1306、1307、1308、1309、1310、1311、1312、1313、1314、1315、1316、1317、1318、1319、1320、1321、1322、1323、1324、1325、1326、1327、1328、1329、1330、1331、1332、1333、1334、1335、1336、1337、1338、1339、1340、1341、1342、1343、1344、1346、1347、1348、1349、1350、1351、1352、1353、1354、1355、1356、1357、1358、1359、又は1360のいずれかに係る核酸配列の5’−UTRに由来する核酸配列、対応するRNA配列、これらのホモログ、又は本明細書に記載のこれらの変異体を含むか又はからなる。上記の通り、5位から(配列の3’末端に位置する)ATGの直ぐ5’側のヌクレオチドまで延在する配列は、前記配列の5’−UTRに相当する。
好ましくは、更なる5’−UTRは、リボソームラージタンパク質(RPL)をコードしているTOP遺伝子の5’−UTR又はリボソームラージタンパク質(RPL)をコードしているTOP遺伝子の5’−UTRのホモログ若しくは変異体に由来する核酸配列を含むか又はからなる。例えば、5’−UTRエレメントは、好ましくは5’TOPモチーフが欠損している、国際公開第2013/143700号の配列番号67、259、1284〜1318、1344、1346、1348〜1354、1357、1358、1421、及び1422のいずれかに係る核酸配列、対応するRNA配列、これらのホモログ、又は本明細書に記載するこれらの変異体の5’−UTRに由来する核酸配列を含むか又はからなる。
特に好ましい実施形態では、5’−UTRエレメントは、リボソームタンパク質ラージ32遺伝子、好ましくは、脊椎動物リボソームタンパク質ラージ32(L32)遺伝子、より好ましくは、哺乳類リボソームタンパク質ラージ32(L32)遺伝子、最も好ましくは、ヒトリボソームタンパク質ラージ32(L32)遺伝子の5’−UTR、又はリボソームタンパク質ラージ32遺伝子、好ましくは、脊椎動物リボソームタンパク質ラージ32(L32)遺伝子、より好ましくは、哺乳類リボソームタンパク質ラージ32(L32)遺伝子、最も好ましくは、ヒトリボソームタンパク質ラージ32(L32)遺伝子の5’−UTRの変異体に由来する核酸配列を含むか又はからなり、好ましくは、更なる5’−UTRは、前記遺伝子の5’TOPを含まない。
したがって、特に好ましい実施形態では、更なる5’−UTRは、配列番号208に係る核酸配列(5’末端オリゴピリミジン領域が欠損しているヒトリボソームタンパク質ラージ32の5’−UTR:GGCGCTGCCTACGGAGGTGGCAGCCATCTCCTTCTCGGCATC(配列番号208);国際公開第2013/143700号の配列番号1368に対応)、又は好ましくは、対応するRNA配列に対して少なくとも約40%、好ましくは少なくとも約50%、好ましくは少なくとも約60%、好ましくは少なくとも約70%、より好ましくは少なくとも約80%、より好ましくは少なくとも約90%、更により好ましくは少なくとも約95%、更により好ましくは少なくとも約99%の同一性を有する核酸配列を含むか又はからなる、或いは、更なる5’−UTRは、配列番号208に係る核酸配列、又はより好ましくは対応するRNA配列に対して少なくとも約40%、好ましくは少なくとも約50%、好ましくは少なくとも約60%、好ましくは少なくとも約70%、より好ましくは少なくとも約80%、より好ましくは少なくとも約90%、更により好ましくは少なくとも約95%、更により好ましくは少なくとも約99%の同一性を有する核酸配列の断片を含むか又はからなり、好ましくは、前記断片は、上記の通りである、即ち、完全長5’−UTRの少なくとも20%等を表す連続する一続きのヌクレオチドである。好ましくは、前記断片は、少なくとも約20ヌクレオチド長以上、好ましくは少なくとも約30ヌクレオチド長以上、より好ましくは少なくとも約40ヌクレオチド長以上を有する。好ましくは、前記断片は、本明細書に記載する機能的断片である。
幾つかの実施形態では、人工核酸分子は、RPSA、RPS2、RPS3、RPS3A、RPS4、RPS5、RPS6、RPS7、RPS8、RPS9、RPS10、RPS11、RPS12、RPS13、RPS14、RPS15、RPS15A、RPS16、RPS17、RPS18、RPS19、RPS20、RPS21、RPS23、RPS24、RPS25、RPS26、RPS27、RPS27A、RPS28、RPS29、RPS30、RPL3、RPL4、RPL5、RPL6、RPL7、RPL7A、RPL8、RPL9、RPL10、RPL10A、RPL11、RPL12、RPL13、RPL13A、RPL14、RPL15、RPL17、RPL18、RPL18A、RPL19、RPL21、RPL22、RPL23、RPL23A、RPL24、RPL26、RPL27、RPL27A、RPL28、RPL29、RPL30、RPL31、RPL32、RPL34、RPL35、RPL35A、RPL36、RPL36A、RPL37、RPL37A、RPL38、RPL39、RPL40、RPL41、RPLP0、RPLP1、RPLP2、RPLP3、RPLP0、RPLP1、RPLP2、EEF1A1、EEF1B2、EEF1D、EEF1G、EEF2、EIF3E、EIF3F、EIF3H、EIF2S3、EIF3C、EIF3K、EIF3EIP、EIF4A2、PABPC1、HNRNPA1、TPT1、TUBB1、UBA52、NPM1、ATP5G2、GNB2L1、NME2、UQCRB又はこれらのホモログ若しくは変異体から選択される脊椎動物のTOP遺伝子(例えば、ヒト等の哺乳類のTOP遺伝子)の5’−UTRに由来する核酸配列を含むか又はからなる更なる5’−UTRを含み、好ましくは、前記更なる5’−UTRは、前記遺伝子のTOPモチーフも5’TOPも含まず、任意で、前記更なる5’−UTRは、その5’末端において、5’末端オリゴピリミジン領域(TOP)の下流の位置1、2、3、4、5、6、7、8、9又は10に位置するヌクレオチドで始まり、更に、任意で、TOP遺伝子の5’−UTRに由来する前記更なる5’−UTRは、その3’末端において、それが由来する遺伝子の開始コドン(A(U/T)G)の上流の位置1、2、3、4、5、6、7、8、9又は10に位置するヌクレオチドで終結する。
特定の実施形態では、更なる5’−UTRは、その開示が参照によって本明細書に援用される国際公開第2016/107877に記載されている5’−UTRに由来する核酸配列を含むか又はからなる。
本発明に係る人工核酸分子は、RNA(例えば、mRNA又はウイルスRNA又はレプリコン)、DNA(例えば、DNAプラスミド又はウイルスDNA)であってもよく、改変されたRNA又はDNA分子であってもよい。それは、例えば、センス鎖及びアンチセンス鎖を有する二本鎖分子として、例えば、センス鎖及びアンチセンス鎖を有するDNA分子として提供され得る。
本発明に係る人工核酸分子は、更に、任意で5’−キャップを含んでいてよい。任意の5’−キャップは、好ましくは、本発明に係る人工核酸分子内のORFの5’側、より好ましくは、少なくとも1つの5’−UTR又は任意の更なる5’−UTRの5’側に位置する。
好ましくは、本発明に係る人工核酸分子は、ポリ(A)配列及び/又はポリアデニル化シグナルを更に含む。好ましくは、任意のポリ(A)配列は、少なくとも1つの3’−UTRエレメント又は任意の更なる3’−UTRの3’側に位置し、より好ましくは、任意のポリ(A)配列が、3’−UTRエレメントの3’末端に連結されている。直接連結されていてもよく、又は(例えば、1以上の制限酵素部位を含むか又はからなる1ヌクレオチド〜50ヌクレオチド、好ましくは1ヌクレオチド〜20ヌクレオチドのリンカーを介する等、一続きの2ヌクレオチド、4ヌクレオチド、6ヌクレオチド、8ヌクレオチド、10ヌクレオチド、20ヌクレオチド等を介して)間接的に連結されていてもよい。しかし、本発明に係る人工核酸分子が3’−UTRを含まない場合、例えば、少なくとも1つの5’−UTRエレメントしか含まない場合でさえも、好ましくは、依然としてポリ(A)配列及び/又はポリアデニル化シグナルを含む。
1つの実施形態では、任意のポリアデニル化シグナルは、3’−UTRエレメントの3’の下流に位置する。好ましくは、ポリアデニル化シグナルは、コンセンサス配列NN(U/T)ANA(N=A又はU)、好ましくはAA(U/T)AAA又はA(U/T)(U/T)AAAを含む。かかるコンセンサス配列は、大部分の動物及び細菌の細胞系によって、例えば、CstF、PAP、PAB2、CFI及び/又はCFIIと協働する切断/ポリアデニル化特異性因子(CPSF)等のポリアデニル化因子によって認識され得る。好ましくは、ポリアデニル化シグナル、好ましくは、コンセンサス配列NNUANAは、3’−UTRエレメント、又は3’−UTRエレメントが存在しない場合はORFの3’末端の約50ヌクレオチド未満下流、より好ましくは約30塩基未満下流、最も好ましくは約25塩基未満下流、例えば、21塩基下流に位置する。
3’−UTRエレメント(又はORF)の下流にポリアデニル化シグナルを含む本発明に係る人工核酸分子(例えば、人工DNA分子)の転写により、その3’−UTRエレメント(又はORF)の下流にポリアデニル化シグナルを含有する未成熟RNAが得られる。
次いで、適切な転写系を用いることにより、ポリ(A)配列を未成熟RNAに結合させる。例えば、本発明の人工核酸分子は、上記3’−UTRエレメントとポリアデニル化シグナルとを含むDNA分子であってよく、このことにより、このDNA分子の転写時にRNAがポリアデニル化され得る。したがって、得られるRNAは、本発明の3’−UTRエレメントとそれに続くポリ(A)配列との組合せを含んでいてよい。
潜在的な転写系は、インビトロ転写系又は細胞転写系等である。したがって、本発明に係る人工核酸分子の転写、例えば、オープンリーディングフレームと、3’−UTRエレメント及び/又は5’−UTRエレメントと、任意でポリアデニル化シグナルとを含む人工核酸分子の転写により、オープンリーディングフレームと、3’−UTRエレメントと、任意でポリ(A)配列とを含むmRNA分子を得ることができる。
したがって、本発明は、また、オープンリーディングフレームと、上記3’−UTRエレメント及び/又は上記5’−UTRエレメントと、任意でポリ(A)配列とを含むmRNA分子である人工核酸分子を提供する。
別の実施形態では、本発明に係る人工核酸分子の3’−UTRは、ポリアデニル化シグナルもポリ(A)配列も含まない。更に好ましくは、本発明に係る人工核酸分子は、ポリアデニル化シグナルもポリ(A)配列も含まない。より好ましくは、人工核酸分子又は本発明の人工核酸分子の3’−UTRは、ポリアデニル化シグナルを含まず、特に、ポリアデニル化シグナルAAU/TAAAを含まない。
好ましい実施形態では、本発明は、オープンリーディングフレームと、上記配列番号1、配列番号2、配列番号137(又は配列番号3)、配列番号138(又は配列番号9)、配列番号10、配列番号12、配列番号15、配列番号140(又は配列番号17)、配列番号20、配列番号22、配列番号23、配列番号143(又は配列番号31)、配列番号32、配列番号39、配列番号41、配列番号44、配列番号45、配列番号146(又は配列番号52)、配列番号53、配列番号54、配列番号57、配列番号60、配列番号61、配列番号63、配列番号64、配列番号66、配列番号68、配列番号69、配列番号72、配列番号34、配列番号35、配列番号36、配列番号37、配列番号144(又は配列番号42)、配列番号58、配列番号62、配列番号73、配列番号75、配列番号77、配列番号79、配列番号80、配列番号81、配列番号83、配列番号84、配列番号86、配列番号87、配列番号88、配列番号89、配列番号90、配列番号91、配列番号92、配列番号93、配列番号94、配列番号95、配列番号97、配列番号98、配列番号99、配列番号100、配列番号101、配列番号102、配列番号103、配列番号106、配列番号107、配列番号108、配列番号147(又は配列番号109)、配列番号148(又は配列番号110)、配列番号112、配列番号113、配列番号114、配列番号115、配列番号117、配列番号118、配列番号149(又は配列番号119)、配列番号123、配列番号126、配列番号127、配列番号128、配列番号129、配列番号130、配列番号131、配列番号132、配列番号133、配列番号134、配列番号151(又は配列番号136)、配列番号96、配列番号111、配列番号150(配列番号120に基づく)、配列番号121、配列番号124、配列番号125又はこれらの断片からなる群から選択されるDNA配列に対応するRNA配列とを含む人工RNA分子である人工核酸分子を提供する。更に、対応する人工DNA分子も提供される。
別の好ましい実施形態では、本発明は、オープンリーディングフレームと、配列番号1、配列番号2、配列番号137(又は配列番号3)、配列番号138(又は配列番号9)、配列番号10、配列番号12、配列番号15、配列番号140(又は配列番号17)、配列番号20、配列番号22、配列番号23、配列番号143(又は配列番号31)、配列番号32、配列番号39、配列番号41、配列番号44、配列番号45、配列番号146(又は配列番号52)、配列番号53、配列番号54、配列番号57、配列番号60、配列番号61、配列番号63、配列番号64、配列番号66、配列番号68、配列番号69、配列番号72、配列番号34、配列番号35、配列番号36、配列番号37、配列番号144(又は配列番号42)、配列番号58、配列番号62、配列番号73、配列番号75、配列番号77、配列番号79、配列番号80、配列番号81、配列番号83、配列番号84、配列番号86、配列番号87、配列番号88、配列番号89、配列番号90、配列番号91、配列番号92、配列番号93、配列番号94、配列番号95、配列番号97、配列番号98、配列番号99、配列番号100、配列番号101、配列番号102、配列番号103、配列番号106、配列番号107、配列番号108、配列番号147(又は配列番号109)、配列番号148(又は配列番号110)、配列番号112、配列番号113、配列番号114、配列番号115、配列番号117、配列番号118、配列番号149(又は配列番号119)、配列番号123、配列番号126、配列番号127、配列番号128、配列番号129、配列番号130、配列番号131、配列番号132、配列番号133、配列番号134、配列番号151(又は配列番号136)、配列番号96、配列番号111、配列番号150(配列番号120に基づく)、配列番号121、配列番号124、配列番号125に係る配列からなる群から選択される配列とを含む人工DNA分子である人工核酸分子を提供する。
したがって、本発明は、高い翻訳効率によって特徴付けられるRNA分子、好ましくはmRNA分子のテンプレートとして機能し得る人工核酸分子を提供する。言い換えれば、人工核酸分子は、mRNAを産生するためのテンプレートとして用いることができるDNAであってよい。得ることができるmRNAは、次いで、オープンリーディングフレームによってコードされている所望のペプチド又はタンパク質を産生するために翻訳され得る。人工核酸分子がDNAである場合、例えば、インビトロ又はインビボでmRNAを継続して繰り返し産生するための二本鎖保管形態として用いてよい。したがって、インビトロとは、特に、(「生」)細胞及び/又は組織(生体の組織を含む)を指す。細胞は、特に、細胞株、初代細胞、組織又は被験体における細胞を含む。特定の実施形態では、細胞培養可能な細胞型が本発明に好適であり得る。哺乳類細胞、例えば、ヒト細胞及びマウス細胞が特に好ましい。特に好ましい実施形態では、ヒト細胞株HeLa、HEPG2、及びU−937、並びにマウス細胞株NIH3T3、JAWSII、及びL929が用いられる。更に、初代細胞が特に好ましく、特に好ましい実施形態では、ヒト皮膚線維芽細胞(HDF)を用いてよい。細胞株の好ましいグループは、含む。
或いは、被験体の組織を用いてもよい。
1つの実施形態では、本発明に係る人工核酸分子は、ポリ(A)配列を更に含む。例えば、ORFに続いて任意で3’UTRを含むDNA分子は、得られるmRNAにおいてポリ(A)配列に転写され得る一続きのチミジンヌクレオチドを含有し得る。ポリ(A)配列の長さは、変動してよい。例えば、ポリ(A)配列は、約20アデニンヌクレオチド〜約300アデニンヌクレオチド、好ましくは約40アデニンヌクレオチド〜約200アデニンヌクレオチド、より好ましくは約50アデニンヌクレオチド〜約100アデニンヌクレオチド、例えば、約60アデニンヌクレオチド、約70アデニンヌクレオチド、約80アデニンヌクレオチド、約90アデニンヌクレオチド、又は約100アデニンヌクレオチドの長さを有していてよい。最も好ましくは、本発明の核酸分子は、約60ヌクレオチド〜約70ヌクレオチド、最も好ましくは64アデニンヌクレオチドのポリ(A)配列を含む。
人工RNA分子は、必ずしもDNA前駆体から転写されることなしに一般的な化学合成法によってインビトロで得ることもできる。
特に好ましい実施形態では、本発明に係る人工核酸分子は、5’から3’方向に、オープンリーディングフレームと、上記3’−UTRエレメントと、ポリ(A)配列とを含むか、又は5’から3’方向に、上記5’−UTRエレメントと、オープンリーディングフレームと、ポリ(A)配列とを含むRNA分子、好ましくはmRNA分子である。
好ましい実施形態では、オープンリーディングフレームは、本発明の人工核酸の3’−UTRエレメント及び/又は5’−UTRエレメントが由来する遺伝子とは異なる遺伝子に由来する。幾つかの更なる好ましい実施形態では、オープンリーディングフレームは、ZNF460、TGM2、IL7R、BGN、TK1、RAB3B、CBX6、FZD2、COL8A1、NDUFS7、PHGDH、PLK2、TSPO、PTGS1、FBXO32、NID2、ATP5D、EXOSC4、NOL9、UBB4B、VPS18、ORMDL2、FSCN1、TMEM33、TUBA4A、EMP3、TMEM201、CRIP2、BRAT1、SERPINH1、CD9、DPYSL2、CDK9、TFRC、PSMB3、FASN、PSMB6、PRSS56、KPNA6、SFT2D2、PARD6B、LPP、SPARC、SCAND1、VASN、SLC26A1、LCLAT1、FBXL18、SLC35F6、RAB3D、MAP1B、VMA21、CYBA、SEZ6L2、PCOLCE、VTN、ALDH16A1、RAVER1、KPNA6、SERINC5、JUP、CPN2、CRIP2、EPT1、PNPO、SSSCA1、POLR2L、LIN7C、UQCR10、PYCRL、AMN、MAP1S、NDUFS7、PHGDH、TSPO、ATP5D、EXOSC4、TUBB4B、TUBA4A、EMP3、CRIP2、BRAT1、CD9、CDK9、PSMB3、PSMB6、PRSS56、SCAND1、AMN、CYBA、PCOLCE、MAP1S、VTN、ALDH16A1(いずれも好ましくはヒト)及びDpysl2、Ccnd1、Acox2、Cbx6、Ubc、Ldlr、Nudt22、Pcyox1l、Ankrd1、Tmem37、Tspyl4、Slc7a3、Cst6、Aacs、Nosip、Itga7、Ccnd2、Ebp、Sf3b5、Fasn、Hmgcs1、Osr1、Lmnb1、Vma21、Kif20a、Cdca8、Slc7a1、Ubqln2、Prps2、Shmt2、Aurkb、Fignl1、Cad、Anln、Slfn9、Ncaph、Pole、Uhrf1、Gja1、Fam64a、Kif2c、Tspan10、Scand1、Gpr84、Fads3、Cers6、Cxcr4、Gprc5c、Fen1、Cspg4、Mrpl34、Comtd1、Armc6、Emr4、Atp5d、1110001J03Rik、Csf2ra、Aarsd1、Kif22、Cth、Tpgs1、Ccl17、Alkbh7、Ms4a8a、Acox2、Ubc、Slpi、Pcyox1l、Igf2bp1、Tmem37、Slc7a3、Cst6、Ebp、Sf3b5、Plk1、Cdca8、Kif22、Cad、Cth、Pole、Kif2c、Scand1、Gpr84、Tpgs1、Ccl17、Alkbh7、Ms4a8a、Mrpl34、Comtd1、Armc6、Atp5d、1110001J03Rik、Nudt22、Aarsd1(いずれも好ましくはマウス)又はこれらの変異体からなる群から選択される遺伝子をコードしないが、但し、3’−UTRエレメント及び/又は5’−UTRエレメントは、配列番号1〜配列番号204に係る配列からなる群から選択される配列である。
好ましい実施形態では、ORFは、ヒト又は植物、特にアラビドプシスのリボソームタンパク質をコードしておらず、特に、ヒトリボソームタンパク質S6(RPS6)、ヒトリボソームタンパク質L36a様(RPL36AL)、又はアラビドプシスリボソームタンパク質S16(RPS16)をコードしていない。更に好ましい実施形態では、オープンリーディングフレーム(ORF)は、どんな起源であろうと、リボソームタンパク質S6(RPS6)、リボソームタンパク質L36a様(RPL36AL)、又はリボソームタンパク質S16(RPS16)をコードしていない。
1つの実施形態では、本発明は、オープンリーディングフレーム、好ましくは、3’−UTRエレメント及び/又は5’−UTRエレメントが由来する遺伝子とは異なる遺伝子に由来するオープンリーディングフレームと;配列番号152、配列番号153、配列番号154、配列番号155、配列番号156、配列番号157、配列番号158、配列番号159、配列番号160、配列番号161、配列番号164、配列番号165、配列番号167、配列番号168、配列番号169、配列番号170、配列番号171、配列番号172、配列番号173、配列番号174、配列番号175、配列番号176、配列番号179、配列番号180、配列番号181、配列番号182、配列番号183、配列番号184、配列番号187、配列番号188、配列番号189、配列番号191、配列番号204(又は配列番号192)、配列番号193、配列番号194、配列番号195、配列番号196、配列番号197、配列番号198、配列番号199、配列番号200、配列番号201、配列番号202、配列番号203、配列番号177に係る配列からなる群から選択されるDNA配列に対して少なくとも約60%、好ましくは少なくとも約70%、より好ましくは少なくとも約80%、より好ましくは少なくとも約90%、更により好ましくは少なくとも約95%、更により好ましくは少なくとも99%、更により好ましくは100%の配列同一性を有する配列を含むか又はからなる3’−UTRエレメント、及び/又は配列番号1、配列番号2、配列番号137(又は配列番号3)、配列番号138(又は配列番号9)、配列番号10、配列番号12、配列番号15、配列番号140(又は配列番号17)、配列番号20、配列番号22、配列番号23、配列番号143(又は配列番号31)、配列番号32、配列番号39、配列番号41、配列番号44、配列番号45、配列番号146(又は配列番号52)、配列番号53、配列番号54、配列番号57、配列番号60、配列番号61、配列番号63、配列番号64、配列番号66、配列番号68、配列番号69、配列番号72、配列番号34、配列番号35、配列番号36、配列番号37、配列番号144(又は配列番号42)、配列番号58、配列番号62、配列番号73、配列番号75、配列番号77、配列番号79、配列番号80、配列番号81、配列番号83、配列番号84、配列番号86、配列番号87、配列番号88、配列番号89、配列番号90、配列番号91、配列番号92、配列番号93、配列番号94、配列番号95、配列番号97、配列番号98、配列番号99、配列番号100、配列番号101、配列番号102、配列番号103、配列番号106、配列番号107、配列番号108、配列番号147(又は配列番号109)、配列番号148(又は配列番号110)、配列番号112、配列番号113、配列番号114、配列番号115、配列番号117、配列番号118、配列番号149(又は配列番号119)、配列番号123、配列番号126、配列番号127、配列番号128、配列番号129、配列番号130、配列番号131、配列番号132、配列番号133、配列番号134、配列番号151(又は配列番号136)、配列番号96、配列番号111、配列番号150(配列番号120に基づく)、配列番号121、配列番号124、配列番号125に係る配列からなる群から選択されるDNA配列に対して少なくとも約60%、好ましくは少なくとも約70%、より好ましくは少なくとも約80%、より好ましくは少なくとも約90%、更により好ましくは少なくとも約95%、更により好ましくは少なくとも99%、更により好ましくは100%の配列同一性を有する配列を含むか又はからなる5’−UTRエレメントと;ポリアデニル化シグナル及び/又はポリ(A)配列とを含む人工DNA分子を提供する。
更に、本発明は、オープンリーディングフレーム、好ましくは、3’−UTRエレメント及び/又は5’−UTRエレメントが由来する遺伝子とは異なる遺伝子に由来するオープンリーディングフレームと;配列番号152、配列番号153、配列番号154、配列番号155、配列番号156、配列番号157、配列番号158、配列番号159、配列番号160、配列番号161、配列番号164、配列番号165、配列番号167、配列番号168、配列番号169、配列番号170、配列番号171、配列番号172、配列番号173、配列番号174、配列番号175、配列番号176、配列番号179、配列番号180、配列番号181、配列番号182、配列番号183、配列番号184、配列番号187、配列番号188、配列番号189、配列番号191、配列番号204(又は配列番号192)、配列番号193、配列番号194、配列番号195、配列番号196、配列番号197、配列番号198、配列番号199、配列番号200、配列番号201、配列番号202、配列番号203、配列番号177に係る配列からなる群から選択されるDNA配列に対応するRNA配列に対して少なくとも約60%、好ましくは少なくとも約70%、より好ましくは少なくとも約80%、より好ましくは少なくとも約90%、更により好ましくは少なくとも約95%、更により好ましくは少なくとも99%、更により好ましくは100%の配列同一性を有する配列を含むか又はからなる3’−UTRエレメント、及び/又は配列番号1、配列番号2、配列番号137(又は配列番号3)、配列番号138(又は配列番号9)、配列番号10、配列番号12、配列番号15、配列番号140(又は配列番号17)、配列番号20、配列番号22、配列番号23、配列番号143(又は配列番号31)、配列番号32、配列番号39、配列番号41、配列番号44、配列番号45、配列番号146(又は配列番号52)、配列番号53、配列番号54、配列番号57、配列番号60、配列番号61、配列番号63、配列番号64、配列番号66、配列番号68、配列番号69、配列番号72、配列番号34、配列番号35、配列番号36、配列番号37、配列番号144(又は配列番号42)、配列番号58、配列番号62、配列番号73、配列番号75、配列番号77、配列番号79、配列番号80、配列番号81、配列番号83、配列番号84、配列番号86、配列番号87、配列番号88、配列番号89、配列番号90、配列番号91、配列番号92、配列番号93、配列番号94、配列番号95、配列番号97、配列番号98、配列番号99、配列番号100、配列番号101、配列番号102、配列番号103、配列番号106、配列番号107、配列番号108、配列番号147(又は配列番号109)、配列番号148(又は配列番号110)、配列番号112、配列番号113、配列番号114、配列番号115、配列番号117、配列番号118、配列番号149(又は配列番号119)、配列番号123、配列番号126、配列番号127、配列番号128、配列番号129、配列番号130、配列番号131、配列番号132、配列番号133、配列番号134、配列番号151(又は配列番号136)、配列番号96、配列番号111、配列番号150(配列番号120に基づく)、配列番号121、配列番号124、配列番号125に係る配列からなる群から選択されるDNA配列に対応するRNA配列に対して少なくとも約60%、好ましくは少なくとも約70%、より好ましくは少なくとも約80%、より好ましくは少なくとも約90%、更により好ましくは少なくとも約95%、更により好ましくは少なくとも99%、更により好ましくは100%の配列同一性を有する配列を含むか又はからなる5’−UTRエレメントと;ポリアデニル化シグナル及び/又はポリ(A)配列とを含む人工RNA分子、好ましくは人工mRNA分子又は人工ウイルスRNA分子を提供する。
本発明は、高い翻訳効率を特徴とし得る人工核酸分子(好ましくは、人工mRNA)を提供する。いかなる理論にも束縛されるものではないが、高い翻訳効率は、人工核酸分子(例えば、本発明に係る人工mRNA分子)の分解減少に起因している可能性がある。したがって、本発明の3’−UTRエレメント及び/又は本発明の5’−UTRエレメントは、人工核酸が分解及び崩壊するのを防ぐことができる。
好ましくは、人工核酸分子は、更に、ヒストンステムループを含んでいてよい。したがって、本発明に係る人工核酸分子は、例えば、5’から3’方向に、ORFと、3’−UTRエレメントと、任意のヒストンステムループ配列と、任意のポリ(A)配列若しくはポリアデニル化シグナルと、任意のポリ(C)配列とを含んでいてもよく、又は5’から3’方向に、5’−UTRエレメントと、ORFと、任意のヒストンステムループ配列と、任意のポリ(A)配列若しくはポリアデニル化シグナルと、任意のポリ(C)配列とを含んでいてもよく、又は5’から3’方向に、5’−UTRエレメントと、ORFと、3’−UTRエレメントと、任意のヒストンステムループ配列と、任意のポリ(A)配列若しくはポリアデニル化シグナルと、任意のポリ(C)配列とを含んでいてもよい。また、5’から3’方向に、ORFと、3’−UTRエレメントと、任意のポリ(A)配列と、任意のポリ(C)配列と、任意のヒストンステムループ配列とを含んでいてもよく、又は5’から3’方向に、5’−UTRエレメントと、ORFと、任意のポリ(A)配列と、任意のポリ(C)配列と、任意のヒストンステムループ配列とを含んでいてもよく、又は5’から3’方向に、5’−UTRエレメントと、ORFと、3’−UTRエレメントと、任意のポリ(A)配列と、任意のポリ(C)配列と、任意のヒストンステムループ配列とを含んでいてもよい。
好ましい実施形態では、本発明に係る人工核酸分子は、少なくとも1つのヒストンステムループを更に含む。
かかるヒストンステムループ配列は、その開示が参照により本明細書に援用される国際公開第2012/019780号に開示されているヒストンステムループ配列から選択することが好ましい。
本発明において用いるのに好適なヒストンステムループ配列は、以下の式(I)又は(II)のうちの少なくとも1つから選択することが好ましい:
式(I)(ステム境界エレメントを含まないステムループ配列):
式(II)(ステム境界エレメントを含むステムループ配列):
(式中、
ステム1又はステム2の境界エレメントN1−6は、1個〜6個、好ましくは2個〜6個、より好ましくは2個〜5個、更により好ましくは3個〜5個、最も好ましくは4個〜5個、又は5個のNの連続配列であり、各Nは、互いに独立して、A、U、T、G、及びCから選択されるヌクレオチド、又はこれらのヌクレオチドアナログから選択され、
ステム1[N0−2GN3−5]は、エレメントステム2に対して逆相補的であるか又は部分的に逆相補的であり、且つ5個〜7個のヌクレオチドの連続配列であり、
N0−2は、0個〜2個、好ましくは0個〜1個、より好ましくは1個のNの連続配列であり、各Nは、互いに独立して、A、U、T、G、及びCから選択されるヌクレオチド、又はこれらのヌクレオチドアナログから選択され、
N3−5は、3個〜5個、好ましくは4個〜5個、より好ましくは4個のNの連続配列であり、各Nは、互いに独立して、A、U、T、G、及びCから選択されるヌクレオチド、又はこれらのヌクレオチドアナログから選択され、
Gは、グアノシン又はそのアナログであり、任意でシチジン又はそのアナログによって置換されてもよいが、但し、その場合、ステム2におけるその相補的ヌクレオチドであるシチジンも、グアノシンによって置換され、
ループ配列[N0−4(U/T)N0−4]は、エレメントステム1とステム2との間に位置し、且つ3個〜5個のヌクレオチド、より好ましくは4個のヌクレオチドの連続配列であり、
各N0−4は、互いに独立して、0個〜4個、好ましくは1個〜3個、より好ましくは1個〜2個のNの連続配列であり、各Nは、互いに独立して、A、U、T、G、及びCから選択されるヌクレオチド、又はこれらのヌクレオチドアナログから選択され、
U/Tは、ウリジン又は任意でチミジンを表し、
ステム2[N3−5CN0−2]は、エレメントステム1に対して逆相補的であるか又は部分的に逆相補的であり、且つ5個〜7個のヌクレオチドの連続配列であり、
N3−5は、3個〜5個、好ましくは4個〜5個、より好ましくは4個のNの連続配列であり、各Nは、互いに独立して、A、U、T、G、及びCから選択されるヌクレオチド、又はこれらのヌクレオチドアナログから選択され、
N0−2は、0個〜2個、好ましくは0個〜1個、より好ましくは1個のNの連続配列であり、各Nは、互いに独立して、A、U、T、G、若しくはCから選択されるヌクレオチド、又はこれらのヌクレオチドアナログから選択され、
Cは、シチジン又はそのアナログであり、任意でグアノシン又はそのアナログによって置換されてもよいが、但し、その場合、ステム1におけるその相補的ヌクレオチドであるグアノシンも、シチジンによって置換され、
ステム1及びステム2は、互いに塩基対合して逆相補的配列を形成することができる(前記塩基対合は、例えば、ヌクレオチドAとU/T若しくはGとCとのワトソン−クリック塩基対合、又は非ワトソン−クリック塩基対合(例えば、ゆらぎ塩基対合、逆ワトソン−クリック塩基対合、フーグスティーン塩基対合、逆フーグスティーン塩基対合)によってステム1とステム2との間で生じ得る)か、或いは、互いに塩基対合して部分的に逆相補的な配列を形成することができる(一方のステムにおける1以上の塩基が、他方のステムの逆相補的な配列において相補的塩基を有しないことに基づいて、ステム1とステム2との間で不完全な塩基対合が生じ得る)。
更に好ましい実施形態によれば、ヒストンステムループ配列は、以下の特定の式(Ia)又は(IIa)のうちの少なくとも1つに従って選択してよい:
式(Ia)(ステム境界エレメントを含まないステムループ配列):
式(IIa)(ステム境界エレメントを含むステムループ配列):
(式中、N、C、G、T、及びUは、上に定義した通りである)。
第1の態様の更により特に好ましい実施形態によれば、人工核酸分子配列は、以下の特定の式(Ib)又は(IIb)のうちの少なくともに係る少なくとも1つのヒストンステムループ配列を含んでよい:
式(Ib)(ステム境界エレメントを含まないステムループ配列):
式(IIb)(ステム境界エレメントを含むステムループ配列):
(式中、N、C、G、T、及びUは、上に定義した通りである)。
特に好ましいヒストンステムループ配列は、配列番号209:CAAAGGCTCTTTTCAGAGCCACCAに係る配列、又はより好ましくは、配列番号209に係る核酸配列に対応するRNA配列である。
一例として、単一エレメントは、以下の順に人工核酸分子中に存在してよい:
5’−キャップ−5’−UTR(エレメント)−ORF−3’−UTR(エレメント)−ヒストンステムループ−ポリ(A)/(C)配列;
5’−キャップ−5’−UTR(エレメント)−ORF−3’−UTR(エレメント)−ポリ(A)/(C)配列−ヒストンステムループ;
5’−キャップ−5’−UTR(エレメント)−ORF−IRES−ORF−3’−UTR(エレメント)−ヒストンステムループ−ポリ(A)/(C)配列;
5’−キャップ−5’−UTR(エレメント)−ORF−IRES−ORF−3’−UTR(エレメント)−ヒストンステムループ−ポリ(A)/(C)配列−ポリ(A)/(C)配列;
5’−キャップ−5’−UTR(エレメント)−ORF−IRES−ORF−3’−UTR(エレメント)−ポリ(A)/(C)配列−ヒストンステムループ;
5’−キャップ−5’−UTR(エレメント)−ORF−IRES−ORF−3’−UTR(エレメント)−ポリ(A)/(C)配列−ポリ(A)/(C)配列−ヒストンステムループ;
5’−キャップ−5’−UTR(エレメント)−ORF−3’−UTR(エレメント)−ポリ(A)/(C)配列−ポリ(A)/(C)配列;
5’−キャップ−5’−UTR(エレメント)−ORF−3’−UTR(エレメント)−ポリ(A)/(C)配列−ポリ(A)/(C)配列−ヒストンステムループ等。
幾つかの実施形態では、人工核酸分子は、更なるエレメント(例えば、5’−キャップ、ポリ(C)配列、及び/又はIRESモチーフ)を含む。5’−キャップは、転写中又は転写後にRNAの5’末端に付加してよい。更に、本発明の人工核酸分子は、特に核酸がmRNAの形態であるか又はmRNAをコードしている場合、少なくとも10個のシチジン、好ましくは少なくとも20個のシチジン、より好ましくは少なくとも30個のシチジンの配列(所謂「ポリ(C)配列」)によって修飾されてよい。具体的には、本発明の人工核酸分子は、特に核酸が(m)RNAの形態であるか又はmRNAをコードしている場合、典型的に約10シチジンヌクレオチド〜約200シチジンヌクレオチド、好ましくは約10シチジンヌクレオチド〜約100シチジンヌクレオチド、より好ましくは約10シチジンヌクレオチド〜約70シチジンヌクレオチド、又は更により好ましくは約20シチジンヌクレオチド〜約50シチジンヌクレオチド、又は更には20シチジンヌクレオチド〜30シチジンヌクレオチドのポリ(C)配列を含有していてよい。最も好ましくは、本発明の核酸は、30シチジン残基のポリ(C)配列を含む。したがって、好ましくは、本発明に係る人工核酸分子は、好ましくは5’から3’方向に、上記少なくとも1つの5’−UTRエレメントと、ORFと、上記少なくとも1つの3’−UTRエレメントと、ポリ(A)配列又はポリアデニル化シグナルと、ポリ(C)配列とを含むか、又は5’から3’方向に、任意で更なる5’−UTRと、ORFと、上記少なくとも1つの3’−UTRエレメントと、ポリ(A)配列又はポリアデニル化シグナルと、ポリ(C)配列とを含むか、又は5’から3’方向に、上記少なくとも1つの5’−UTRエレメントと、ORFと、任意で更なる3’−UTRと、ポリ(A)配列又はポリアデニル化シグナルと、ポリ(C)配列とを含む。
配列内リボソーム進入部位(IRES)配列又はIRESモチーフは、例えば、人工核酸分子が2以上のペプチド又はタンパク質をコードしている場合、幾つかのオープンリーディングフレームを分離することができる。IRES配列は、人工核酸分子が2シストロン性又は多シストロン性の核酸分子である場合、特に有用であり得る。
更に、人工核酸分子は、更なる5’−エレメント、好ましくは、プロモータ又はプロモータ含有配列を含んでいてよい。プロモータは、本発明に係る人工核酸分子、例えば、本発明に係る人工DNA分子の転写を駆動及び/又は制御することができる。
好ましくは、本発明に係る人工核酸分子、好ましくはオープンリーディングフレームは、少なくとも部分的にG/C改変されている。したがって、本発明の人工核酸分子は、前記分子のG(グアノシン)/C(シチジン)含量を改変することによって熱力学的に安定化させることができる。好ましくは遺伝コードの縮重を用いることによって、相当する野生型配列のオープンリーディングフレームのG/C含量と比べて本発明に係る人工核酸分子のオープンリーディングフレームのG/C含量を増加させてよい。したがって、人工核酸分子のコードされているアミノ酸配列は、特定の野生型配列のコードされているアミノ酸配列と比べて、G/C改変によって改変されないことが好ましい。したがって、翻訳されるアミノ酸配列を維持しながら含まれるG/Cヌクレオチドの量が増えるように、野生型コード配列と比べてコード配列又は人工核酸分子全体(例えば、mRNA)のコドンを変化させてよい。幾つかのコドンが1つの同じアミノ酸をコードしている(所謂、遺伝コードの縮重)という事実に起因して、コードされているペプチド/タンパク質配列を変化させることなくコドンを変化させることが実行可能である(所謂、代替コドンの利用)。したがって、(同じアミノ酸をコードしているそれぞれの野生型コドンへの交換において)特異的に特定のコドンを導入することが可能であり、これは、被験体におけるRNAの安定性及び/又はコドン利用に関してより好ましい(所謂、コドンの最適化)。
本明細書に定義する本発明の人工核酸分子のコード領域によってコードされているアミノ酸によっては、その野生型コード領域に対して、核酸配列、例えばオープンリーディングフレームを様々に改変できる可能性がある。G又はCヌクレオチドのみを含有するコドンによってコードされているアミノ酸の場合、コドンを改変する必要はない。したがって、Pro(CCC又はCCG)、Arg(CGC又はCGG)、Ala(GCC又はGCG)、及びGly(GGC又はGGG)のコドンは、AもU/Tも存在しないので、改変する必要がない。
対照的に、A及び/又はU/Tヌクレオチドを含有するコドンは、同じアミノ酸をコードしているがA及び/又はU/Tを含有していない他のコドンで置換することによって改変してよい。例えば、
Proのコドンは、CC(U/T)又はCCAからCCC又はCCGに改変してよい;
Argのコドンは、CG(U/T)又はCGA又はAGA又はAGGからCGC又はCGGに改変してよい;
Alaのコドンは、GC(U/T)又はGCAからGCC又はGCGに改変してよい;
Glyのコドンは、GG(U/T)又はGGAからGGC又はGGGに改変してよい。
他の場合、A又は(U/T)ヌクレオチドをコドンからなくすことはできないが、A及び/又は(U/T)ヌクレオチドの含量が低いコドンを使用することによってA及び(U/T)含量を減少させることができる。その例は、以下の通りである:
Pheのコドンは、(U/T)(U/T)(U/T)から(U/T)(U/T)Cに改変してよい;
Leuのコドンは、(U/T)(U/T)A、(U/T)(U/T)G、C(U/T)(U/T)又はC(U/T)AからC(U/T)C又はC(U/T)Gに改変してよい;
Serのコドンは、(U/T)C(U/T)又は(U/T)CA又はAG(U/T)から(U/T)CC、(U/T)CG又はAGCに改変してよい;
Tyrのコドンは、(U/T)A(U/T)から(U/T)ACに改変してよい;
Cysのコドンは、(U/T)G(U/T)から(U/T)GCに改変してよい;
Hisのコドンは、CA(U/T)からCACに改変してよい;
Glnのコドンは、CAAからCAGに改変してよい;
Ileのコドンは、A(U/T)(U/T)又はA(U/T)AからA(U/T)Cに改変してよい;
Thrのコドンは、AC(U/T)又はACAからACC又はACGに改変してよい;
Asnのコドンは、AA(U/T)からAACに改変してよい;
Lysのコドンは、AAAからAAGに改変してよい;
Valのコドンは、G(U/T)(U/T)又はG(U/T)AからG(U/T)C又はG(U/T)Gに改変してよい;
Aspのコドンは、GA(U/T)からGACに改変してよい;
Gluのコドンは、GAAからGAGに改変してよい;
終止コドン(U/T)AAは、(U/T)AG又は(U/T)GAに改変してよい。
他方、Met(A(U/T)G)及びTrp((U/T)GG)のコドンの場合、コードされているアミノ酸配列を変化させることなしに配列を改変することはできない。
上記置換は、その特定の野生型オープンリーディングフレーム(即ち、オリジナル配列)と比べて、本明細書に定義する本発明の人工核酸分子のオープンリーディングフレームのG/C含量を増加させるために個々に又は全ての可能な組合せで用いることができる。したがって、例えば、野生型配列に存在するThrの全てのコドンをACC(又はACG)に改変してもよい。
好ましくは、本明細書に定義する本発明の人工核酸分子のオープンリーディングフレームのG/C含量は、コードされているアミノ酸配列を変化させることなしに、即ち、遺伝子コードの縮重を用いて、野生型コード領域のG/C含量と比べて、少なくとも7%、より好ましくは少なくとも15%、特に好ましくは少なくとも20%増加させる。特定の実施形態によれば、本発明の人工核酸分子、又はその断片、変異体、若しくは誘導体のオープンリーディングフレームにおける置換可能なコドンのうちの少なくとも5%、少なくとも10%、少なくとも20%、少なくとも30%、少なくとも40%、少なくとも50%、少なくとも60%、より好ましくは少なくとも70%、更により好ましくは少なくとも80%、最も好ましくは少なくとも90%、少なくとも95%、又は更には100%を置換して、前記オープンリーディングフレームのG/C含量を増加させる。
これに関連して、本明細書に定義する本発明の人工核酸分子のオープンリーディングフレームのG/C含量を、コードされているアミノ酸配列を変化させることなしに、野生型オープンリーディングフレームと比べて最大限(即ち、置換可能なコドンの100%)増加させることが特に好ましい。
更に、オープンリーディングフレームは、好ましくは、少なくとも部分的にコドンが最適化されている。コドンの最適化は、細胞内のトランスファーRNA(tRNA)の発生頻度が異なることによって翻訳効率が決定され得るという知見に基づいている。したがって、本明細書に定義する本発明の人工核酸分子のコード領域に所謂「レアコドン」が存在している場合、前記レアコドンに対応する改変核酸配列は、比較的「高頻度の」tRNAをコードしているコドンが存在する場合よりも翻訳効率が低くなる確率が高い。
したがって、本発明の人工核酸分子のオープンリーディングフレームは、好ましくは、細胞内で比較的レアなtRNAをコードしている野生型配列のうちの少なくとも1つのコドンが、細胞内で比較的高頻度で存在するtRNAをコードしており且つ前記比較的レアなtRNAと同じアミノ酸を運搬するコドンと交換されるように、対応する野生型コード領域に対して改変される。この改変により、本明細書に定義する本発明の人工核酸分子のオープンリーディングフレームは、高頻度で存在するtRNAを利用可能なコドンが、レアなtRNAに対応するコドンに置き換わることができるように改変される。言い換えれば、本発明によれば、この改変により、レアなtRNAをコードしている野生型オープンリーディングフレームの全てのコドンを、細胞内においてより高頻度で存在し且つ前記レアなtRNAと同じアミノ酸を運搬するtRNAをコードしているコドンと交換してよい。どのtRNAが細胞内で比較的高頻度で存在するか、及び対照的にどのtRNAが比較的低頻度で存在するかは、当業者に公知である。例えば、Akashi,Curr.Opin.Genet.Dev.2001,11(6):660−666を参照されたい。したがって、好ましくは、オープンリーディングフレームは、好ましくは本発明に係る人工核酸分子が発現する系に関して、好ましくは本発明に係る人工核酸分子が翻訳される系に関して、コドンが最適化されている。好ましくは、オープンリーディングフレームのコドン使用頻度は、哺乳類のコドン使用頻度、より好ましくはヒトのコドン使用頻度に従ってコドンが最適化されている。好ましくは、オープンリーディングフレームは、コドンが最適化されており且つG/C含量が改変されている。
分解耐性、例えば、エキソヌクレアーゼ又はエンドヌクレアーゼによるインビボ(又は上に定義したインビトロ)における分解に対する耐性を更に改善するために、及び/又は本発明に係る人工核酸分子からのタンパク質発現の安定性を更に改善するために、人工核酸分子は、骨格修飾、糖修飾、及び/又は塩基修飾、例えば、脂質修飾等の修飾を更に含んでいてよい。好ましくは、本発明に係る人工核酸分子の転写及び/又は翻訳は、前記修飾によって殆ど損なわれない。
一般的に、本発明の人工核酸分子は、任意のネイティブ(=天然)ヌクレオチド、例えば、グアノシン、ウラシル、アデノシン、及び/又はシトシン、又はこれらのアナログを含んでいてよい。これに関して、ヌクレオチドアナログは、天然ヌクレオチドであるアデノシン、シトシン、チミジン、グアノシン、及びウリジンのネイティブ及び非ネイティブの変異体として定義される。したがって、アナログは、例えば、非ネイティブの官能基で化学的に誘導体化されたヌクレオチドであり、好ましくは、前記非ネイティブの官能基を天然ヌクレオチドに付加するか若しくは天然ヌクレオチドから欠失させる、又は前記非ネイティブの官能基でヌクレオチドの天然官能基を置換する。したがって、天然ヌクレオチドの各構成成分、即ち、RNA配列の骨格(上記を参照)を形成する塩基成分、糖(リボース)成分、及び/又はリン酸成分を修飾することができる。グアノシン、ウリジン、アデノシン、チミジン、及びシトシンのアナログとしては、限定するものではないが、(例えば、アセチル化、メチル化、ヒドロキシ化等によって、化学的に)改変されている、任意のネイティブ又は非ネイティブのグアノシン、ウリジン、アデノシン、チミジン、又はシトシンが挙げられ、例えば、1−メチル−アデノシン、1−メチル−グアノシン、1−メチル−イノシン、2,2−ジメチル−グアノシン、2,6−ジアミノプリン、2’−アミノ−2’−デオキシアデノシン、2’−アミノ−2’−デオキシシチジン、2’−アミノ−2’−デオキシグアノシン、2’−アミノ−2’−デオキシウリジン、2−アミノ−6−クロロプリンリボシド、2−アミノプリン−リボシド、2’−アラアデノシン、2’−アラシチジン、2’−アラウリジン、2’−アジド−2’−デオキシアデノシン、2’−アジド−2’−デオキシシチジン、2’−アジド−2’−デオキシグアノシン、2’−アジド−2’−デオキシウリジン、2−クロロアデノシン、2’−フルオロ−2’−デオキシアデノシン、2’−フルオロ−2’−デオキシシチジン、2’−フルオロ−2’−デオキシグアノシン、2’−フルオロ−2’−デオキシウリジン、2’−フルオロチミジン、2−メチル−アデノシン、2−メチル−グアノシン、2−メチル−チオ−N6−イソペネニル−アデノシン、2’−O−メチル−2−アミノアデノシン、2’−O−メチル−2’−デオキシアデノシン、2’−O−メチル−2’−デオキシシチジン、2’−O−メチル−2’−デオキシグアノシン、2’−O−メチル−2’−デオキシウリジン、2’−O−メチル−5−メチルウリジン、2’−O−メチルイノシン、2’−O−メチルシュードウリジン、2−チオシチジン、2−チオ−シトシン、3−メチル−シトシン、4−アセチル−シトシン、4−チオウリジン、5−(カルボキシヒドロキシメチル)−ウラシル、5,6−ジヒドロウリジン、5−アミノアリルシチジン、5−アミノアリル−デオキシ−ウリジン、5−ブロモウリジン、5−カルボキシメチルアミノメチル−2−チオ−ウラシル、5−カルボキシメチルアミノメチル−ウラシル、5−クロロ−アラ−シトシン、5−フルオロ−ウリジン、5−ヨードウリジン、5−メトキシカルボニルメチル−ウリジン、5−メトキシ−ウリジン、5−メチル−2−チオ−ウリジン、6−アザシチジン、6−アザウリジン、6−クロロ−7−デアザ−グアノシン、6−クロロプリンリボシド、6−メルカプト−グアノシン、6−メチル−メルカプトプリン−リボシド、7−デアザ−2’−デオキシ−グアノシン、7−デアザアデノシン、7−メチル−グアノシン、8−アザアデノシン、8−ブロモ−アデノシン、8−ブロモ−グアノシン、8−メルカプト−グアノシン、8−オキソグアノシン、ベンズイミダゾール−リボシド、ベータ−D−マンノシル−クエオシン、ジヒドロ−ウラシル、イノシン、N1−メチルアデノシン、N6−([6−アミノヘキシル]カルバモイルメチル)−アデノシン、N6−イソペンテニル−アデノシン、N6−メチル−アデノシン、N7−メチル−キサントシン、N−ウラシル−5−オキシ酢酸メチルエステル、ピューロマイシン、クエオシン、ウラシル−5−オキシ酢酸、ウラシル−5−オキシ酢酸メチルエステル、ワイブトシン(Wybutoxosine)、キサントシン、及びキシロアデノシンを含む。このようなアナログの調製は、例えば、米国特許第4,373,071号、米国特許第4,401,796号、米国特許第4,415,732号、米国特許第4,458,066号、米国特許第4,500,707号、米国特許第4,668,777号、米国特許第4,973,679号、米国特許第5,047,524号、米国特許第5,132,418号、米国特許第5,153,319号、米国特許第5,262,530号、及び米国特許第5,700,642号から当業者に公知である。上記アナログの場合、本発明の特定の実施形態に従って、コードされているペプチド若しくはタンパク質のタンパク質発現を増加させる、又は本発明の人工核酸分子の免疫原性を増大させる及び/又は導入されている人工核酸分子の更なる修飾に干渉しないアナログが特に好ましい場合がある。
特定の実施形態によれば、本発明の人工核酸分子は、脂質修飾を含有してよい。
好ましい実施形態では、人工核酸分子は、好ましくは、5’から3’方向に、以下のエレメントを含む:
前記人工核酸分子、好ましくは、配列番号1〜151のいずれかに係る核酸配列に高い翻訳効率を与える5’−UTRエレメント;又は更なる5’−UTR、好ましくは5’−TOP UTRの5’−UTRエレメント;
少なくとも1つのオープンリーディングフレーム(ORF)であって、好ましくは、野生型配列に対して少なくとも1つの修飾を含むORF;
前記人工核酸分子、好ましくは、配列番号152〜204のいずれかに係る核酸配列のいずれかに係る核酸配列に高い翻訳効率を与える3’−UTRエレメント;又は更なる3’−UTR、好ましくはalbumin7 3’−UTRの3’−UTRエレメント;
好ましくは64アデニラートを含むポリ(A)配列;
好ましくは30シチジラートを含むポリ(C)配列;
ヒストンステムループ配列。
特に好ましい実施形態では、本発明に係る人工核酸分子は、以下に記載する修飾のうちの1以上を更に含んでよい。
化学修飾:
人工核酸分子に関して本明細書で使用するとき、用語「修飾」とは、骨格修飾に加えて、糖修飾又は塩基修飾を含む化学修飾を指し得る。
この状況では、本明細書に定義する人工核酸分子、好ましくは、RNA分子は、ヌクレオチドアナログ/修飾、例えば、骨格修飾、糖修飾、又は塩基修飾を含有し得る。本発明に関連する骨格修飾は、本明細書に定義する核酸分子に含有されているヌクレオチドの骨格のリン酸が化学的に修飾されている修飾である。本発明に関連する糖修飾は、本明細書に定義する核酸分子のヌクレオチドの糖の化学修飾である。更に、本発明に関連する塩基修飾は、核酸分子の核酸分子のヌクレオチドの塩基部分の化学修飾である。この状況では、ヌクレオチドアナログ又は修飾は、好ましくは、転写及び/又は翻訳に適用可能なヌクレオチドアナログから選択される。
糖修飾:
修飾されたヌクレオシド及びヌクレオチド(本明細書に記載する通り、人工核酸分子、好ましくはRNAに組み込まれ得る)は、糖部分が修飾されていてよい。「オキシ」−2’ヒドロキシル基修飾の例としては、アルコキシ又はアリールオキシ(−OR、例えば、R=H、アルキル、シクロアルキル、アリール、アラルキル、ヘテロアリール、又は糖);ポリエチレングリコール(PEG)、−O(CH2CH2O)nCH2CH2OR;2’ヒドロキシルが、例えば、メチレン架橋によって、同じリボース糖の4’炭素に結合している「ロック」核酸(LNA);及びアミノ基(−O−アミノ)、式中、アミノ基、例えば、NRRは、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、ヘテロシクリル、アリールアミノ、ジアリールアミノ、ヘテロアリールアミノ、又はジヘテロアリールアミノ、エチレンジアミン、ポリアミノであり得る)又はアミノアルコキシが挙げられるが、これらに限定されない。
「デオキシ」修飾としては、水素、アミノ(例えば、NH2;アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、ヘテロシクリル、アリールアミノ、ジアリールアミノ、ヘテロアリールアミノ、ジヘテロアリールアミノ、又はアミノ酸)が挙げられ;又はアミノ基は、リンカーを介して糖に結合してもよく、前記リンカーは、原子C、N、及びOのうちの1以上を含む。
また、糖基は、リボースにおける対応する炭素とは逆の立体化学的配置を有する1以上の炭素を含有し得る。したがって、修飾された核酸分子は、例えば、糖としてアラビノースを含有するヌクレオチドを含み得る。
骨格修飾:
修飾されたヌクレオシド及びヌクレオチド(本明細書に記載する通り、人工核酸分子、好ましくはRNAに組み込まれ得る)は、リン酸骨格が更に修飾されていてもよい。骨格のリン酸基は、酸素原子のうちの1以上を異なる置換基で置換することによって修飾することができる。更に、修飾されたヌクレオシド及びヌクレオチドは、本明細書に記載する通り、非修飾リン酸部分を修飾リン酸で完全に置換することを含み得る。修飾リン酸基の例としては、ホスホロチオアート、ホスホロセレナート、ボラノホスファート、ボラノホスファートエステル、ホスホン酸水素、ホスホロアミダート、アルキル又はアリールホスホナート、及びホスホトリエステルが挙げられるが、これらに限定されない。ホスホロジチオアートは、非結合酸素が両方とも硫黄によって置換されている。また、リン酸リンカーは、窒素(架橋ホスホロアミダート)、硫黄(架橋ホスホロチオアート)、及び炭素(架橋メチレン−ホスホナート)で結合酸素を置換することによって修飾してもよい。
塩基修飾:
修飾されたヌクレオシド及びヌクレオチド(本明細書に記載する通り、人工核酸分子、好ましくはRNA分子に組み込まれ得る)は、ヌクレオ塩基部分が更に修飾されていてもよい。RNAにみられるヌクレオ塩基の例としては、アデニン、グアニン、シトシン、及びウラシルが挙げられるが、これらに限定されない。例えば、本明細書に記載するヌクレオシド及びヌクレオチドは、主溝面において化学修飾され得る。幾つかの実施形態では、主溝化学修飾は、アミノ基、チオール基、アルキル基、又はハロ基を含み得る。
本発明の特に好ましい実施形態では、ヌクレオチドアナログ/修飾は、塩基修飾から選択され、これは、好ましくは、2−アミノ−6−クロロプリンリボシド−5’−トリホスファート、2−アミノプリン−リボシド−5’−トリホスファート;2−アミノアデノシン−5’−トリホスファート、2’−アミノ−2’−デオキシシチジン−トリホスファート、2−チオシチジン−5’−トリホスファート、2−チオウリジン−5’−トリホスファート、2’−フルオロチミジン−5’−トリホスファート、2’−O−メチルイノシン−5’−トリホスファート4−チオウリジン−5’−トリホスファート、5−アミノアリルシチジン−5’−トリホスファート、5−アミノアリルウリジン−5’−トリホスファート、5−ブロモシチジン−5’−トリホスファート、5−ブロモウリジン−5’−トリホスファート、5−ブロモ−2’−デオキシシチジン−5’−トリホスファート、5−ブロモ−2’−デオキシウリジン−5’−トリホスファート、5−ヨードシチジン−5’−トリホスファート、5−ヨード−2’−デオキシシチジン−5’−トリホスファート、5−ヨードウリジン−5’−トリホスファート、5−ヨード−2’−デオキシウリジン−5’−トリホスファート、5−メチルシチジン−5’−トリホスファート、5−メチルウリジン−5’−トリホスファート、5−プロピニル−2’−デオキシシチジン−5’−トリホスファート、5−プロピニル−2’−デオキシウリジン−5’−トリホスファート、6−アザシチジン−5’−トリホスファート、6−アザウリジン−5’−トリホスファート、6−クロロプリンリボシド−5’−トリホスファート、7−デアザアデノシン−5’−トリホスファート、7−デアザグアノシン−5’−トリホスファート、8−アザアデノシン−5’−トリホスファート、8−アジドアデノシン−5’−トリホスファート、ベンズイミダゾール−リボシド−5’−トリホスファート、N1−メチルアデノシン−5’−トリホスファート、N1−メチルグアノシン−5’−トリホスファート、N6−メチルアデノシン−5’−トリホスファート、O6−メチルグアノシン−5’−トリホスファート、シュードウリジン−5’−トリホスファート、又はピューロマイシン−5’−トリホスファート、キサントシン−5’−トリホスファートから選択される。5−メチルシチジン−5’−トリホスファート、7−デアザグアノシン−5’−トリホスファート、5−ブロモシチジン−5’−トリホスファート、及びシュードウリジン−5’−トリホスファートからなる塩基修飾されたヌクレオチドの群から選択される塩基修飾のためのヌクレオチドが特に好ましい。
幾つかの実施形態では、修飾されたヌクレオシドとしては、ピリジン−4−オンリボヌクレオシド、5−アザ−ウリジン、2−チオ−5−アザ−ウリジン、2−チオウリジン、4−チオ−シュードウリジン、2−チオ−シュードウリジン、5−ヒドロキシウリジン、3−メチルウリジン、5−カルボキシメチル−ウリジン、1−カルボキシメチル−シュードウリジン、5−プロピニル−ウリジン、1−プロピニル−シュードウリジン、5−タウリノメチルウリジン、1−タウリノメチル−シュードウリジン、5−タウリノメチル−2−チオ−ウリジン、1−タウリノメチル−4−チオ−ウリジン、5−メチル−ウリジン、1−メチル−シュードウリジン、4−チオ−1−メチル−シュードウリジン、2−チオ−1−メチル−シュードウリジン、1−メチル−1−デアザ−シュードウリジン、2−チオ−1−メチル−1−デアザ−シュードウリジン、ジヒドロウリジン、ジヒドロシュードウリジン、2−チオ−ジヒドロウリジン、2−チオ−ジヒドロシュードウリジン、2−メトキシウリジン、2−メトキシ−4−チオ−ウリジン、4−メトキシ−シュードウリジン、及び4−メトキシ−2−チオ−シュードウリジンが挙げられる。
幾つかの実施形態では、修飾されたヌクレオシドとしては、5−アザ−シチジン、シュードイソシチジン、3−メチル−シチジン、N4−アセチルシチジン、5−ホルミルシチジン、N4−メチルシチジン、5−ヒドロキシメチルシチジン、1−メチル−シュードイソシチジン、ピロロ−シチジン、ピロロ−シュードイソシチジン、2−チオ−シチジン、2−チオ−5−メチル−シチジン、4−チオ−シュードイソシチジン、4−チオ−1−メチル−シュードイソシチジン、4−チオ−1−メチル−1−デアザ−シュードイソシチジン、1−メチル−1−デアザ−シュードイソシチジン、ゼブラリン、5−アザ−ゼブラリン、5−メチル−ゼブラリン、5−アザ−2−チオ−ゼブラリン、2−チオ−ゼブラリン、2−メトキシ−シチジン、2−メトキシ−5−メチル−シチジン、4−メトキシ−シュードイソシチジン、及び4−メトキシ−l−メチル−シュードイソシチジンが挙げられる。
他の実施形態では、修飾されたヌクレオシドとしては、2−アミノプリン、2,6−ジアミノプリン、7−デアザ−アデニン、7−デアザ−8−アザ−アデニン、7−デアザ−2−アミノプリン、7−デアザ−8−アザ−2−アミノプリン、7−デアザ−2,6−ジアミノプリン、7−デアザ−8−アザ−2,6−ジアミノプリン、1−メチルアデノシン、N6−メチルアデノシン、N6−イソペンテニルアデノシン、N6−(cis−ヒドロキシイソペンテニル)アデノシン、2−メチルチオ−N6−(cis−ヒドロキシイソペンテニル)アデノシン、N6−グリシニルカルバモイルアデノシン、N6−トレオニルカルバモイルアデノシン、2−メチルチオ−N6−トレオニルカルバモイルアデノシン、N6,N6−ジメチルアデノシン、7−メチルアデニン、2−メチルチオ−アデニン、及び2−メトキシ−アデニンが挙げられる。
他の実施形態では、修飾されたヌクレオシドとしては、イノシン、1−メチル−イノシン、ワイオシン、ワイブトシン、7−デアザ−グアノシン、7−デアザ−8−アザ−グアノシン、6−チオ−グアノシン、6−チオ−7−デアザ−グアノシン、6−チオ−7−デアザ−8−アザ−グアノシン、7−メチル−グアノシン、6−チオ−7−メチル−グアノシン、7−メチルイノシン、6−メトキシ−グアノシン、1−メチルグアノシン、N2−メチルグアノシン、N2,N2−ジメチルグアノシン、8−オキソ−グアノシン、7−メチル−8−オキソ−グアノシン、1−メチル−6−チオ−グアノシン、N2−メチル−6−チオ−グアノシン、及びN2,N2−ジメチル−6−チオ−グアノシンが挙げられる。
幾つかの実施形態では、ヌクレオチドは、主溝面で修飾されてよく、ウラシルのC−5における水素をメチル基又はハロ基で置換することを含んでよい。特定の実施形態では、修飾されたヌクレオシドは、5’−O−(1−チオホスファート)−アデノシン、5’−O−(1−チオホスファート)−シチジン、5’−O−(1−チオホスファート)−グアノシン、5’−O−(1−チオホスファート)−ウリジン、又は5’−O−(1−チオホスファート)−シュードウリジンである。
更に特定の実施形態では、人工核酸分子、好ましくは、RNA分子は、6−アザ−シチジン、2−チオ−シチジン、α−チオ−シチジン、シュード−イソ−シチジン、5−アミノアリル−ウリジン、5−ヨード−ウリジン、N1−メチル−シュードウリジン、5,6−ジヒドロウリジン、α−チオ−ウリジン、4−チオ−ウリジン、6−アザ−ウリジン、5−ヒドロキシ−ウリジン、デオキシ−チミジン、5−メチル−ウリジン、ピロロ−シチジン、イノシン、α−チオ−グアノシン、6−メチル−グアノシン、5−メチル−シチジン、8−オキソ−グアノシン、7−デアザ−グアノシン、N1−メチル−アデノシン、2−アミノ−6−クロロ−プリン、N6−メチル−2−アミノ−プリン、シュード−イソ−シチジン、6−クロロ−プリン,N6−メチル−アデノシン、α−チオ−アデノシン、8−アジド−アデノシン、7−デアザ−アデノシンから選択されるヌクレオシド修飾を含んでいてよい。
脂質修飾:
更なる実施形態によれば、本明細書に定義する人工核酸分子、好ましくはRNAは、脂質修飾を含有してよい。かかる脂質修飾されたRNAは、典型的に、本明細書に定義するRNAを含む。かかる脂質修飾された本明細書に定義するRNA分子は、典型的に、そのRNA分子と共有結合する少なくとも1つのリンカーと、それぞれのリンカーと共有結合する少なくとも1つの脂質とを更に含む。或いは、脂質修飾されたRNA分子は、本明細書に定義する少なくとも1つのRNA分子と、そのRNA分子と(リンカー無しで)共有結合する少なくとも1つの(二官能性)脂質とを含む。第3の代替例によれば、脂質修飾されたRNA分子は、本明細書に定義する人工核酸分子、好ましくはRNA分子と、そのRNA分子と共有結合する少なくとも1つのリンカーと、それぞれのリンカーと共有結合する少なくとも1つの脂質とを含み、また、そのRNA分子と(リンカー無しで)共有結合する少なくとも1つの(二官能性)脂質も含む。この状況では、脂質修飾は、直鎖状RNA配列の末端に存在することが特に好ましい。
修飾されたRNAの5’末端の修飾:
本発明の別の好ましい実施形態によれば、本明細書に定義する人工核酸分子、好ましくはRNA分子は、所謂「5’キャップ」構造の付加によって修飾してよい。
5’−キャップは、一般的に、成熟mRNAの5’−末端に「蓋をする」実体、典型的には、修飾されたヌクレオチド実体である。5’−キャップは、典型的に、修飾されたヌクレオチド、特に、グアニンヌクレオチドの誘導体によって形成され得る。好ましくは、5’−キャップは、5’−5’−三リン酸結合を介して5’−末端に結合する。5’−キャップは、メチル化されていてもよく、例えば、m7GpppN(式中、Nは、5’−キャップを有する核酸の5’末端のヌクレオチド、典型的に、RNAの5’末端である)である。m7GpppNは、ポリメラーゼIIによって転写されたmRNA中に天然に存在する5’−キャップ構造であり、したがって、本発明に係る修飾RNAに含まれる修飾とはみなされない。これは、本発明に係る人工核酸分子、好ましくはRNA分子は、5’−キャップとしてm7GpppNを含んでよいが、更に、人工核酸分子、好ましくはRNA分子は、本明細書に定義する少なくとも1つの更なる修飾を含む。
5’−キャップ構造の更なる例としては、グリセリル、逆転デオキシ非塩基残基(部分)、4’,5’メチレンヌクレオチド、1−(ベータ−D−エリトロフラノシル)ヌクレオチド、4’−チオヌクレオチド、炭素環式ヌクレオチド、1,5−アンヒドロヘキシトールヌクレオチド、L−ヌクレオチド、アルファ−ヌクレオチド、修飾塩基ヌクレオチド、トレオ−ペントフラノシルヌクレオチド、非環式3’,4’−セコヌクレオチド、非環式3,4−ジヒドロキシブチルヌクレオチド、非環式3,5ジヒドロキシペンチルヌクレオチド、3’−3’−逆転ヌクレオチド部分、3’−3’−逆転非塩基部分、3’−2’−逆転ヌクレオチド部分、3’−2’−逆転非塩基部分、1,4−ブタンジオールホスファート、3’−ホスホロアミダート、ヘキシルホスファート、アミノヘキシルホスファート、3’−ホスファート、3’ホスホロチオアート、ホスホロジチオアート、又は架橋若しくは非架橋メチルホスホナート部分が挙げられる。これら修飾5’−キャップ構造は、本発明に係る人工核酸分子、好ましくはRNA分子に含まれる少なくとも1つの修飾としてみなされる。
特に好ましい修飾5’−キャップ構造は、CAP1(m7Gに隣接するヌクレオチドのリボースのメチル化)、CAP2(m7Gの下流の2番目のヌクレオチドのリボースのメチル化)、CAP3(m7Gの下流の3番目のヌクレオチドのリボースのメチル化)、CAP4(m7Gの下流の4番目のヌクレオチドのリボースのメチル化)、ARCA(抗リバースCAPアナログ、修飾ARCA(例えば、ホスホチオアート修飾ARCA)、イノシン、N1−メチル−グアノシン、2’−フルオロ−グアノシン、7−デアザ−グアノシン、8−オキソ−グアノシン、2−アミノ−グアノシン、LNA−グアノシン、及び2−アジド−グアノシンである。
好ましい実施形態では、少なくとも1つのオープンリーディングフレームは、治療用タンパク質又はペプチドをコードしている。別の実施形態では、抗原は、病原性抗原、腫瘍抗原、アレルギー抗原、又は自己免疫抗原等、少なくとも1つのオープンリーディングフレームによってコードされている。ここでは、抗原が関与する疾患に対する遺伝子ワクチン接種アプローチにおいて、前記抗原をコードする人工核酸分子の投与を用いる。
別の実施形態では、抗体若しくは抗原特異的T細胞受容体、又はこれらの断片は、本発明に係る人工核酸分子の少なくとも1つのオープンリーディングフレームによってコードされている。
抗原:
病原性抗原:
本発明に係る人工核酸分子は、病原性抗原又はその断片、変異体、若しくは誘導体を含むタンパク質又はペプチドをコードしていてよい。かかる病原性抗原は、病原性生物、特に、細菌、ウイルス、又は原生動物(多細胞)の病原性生物に由来し、これらは、被験体、具体的には、哺乳類被験体、より具体的には、ヒトにおいて免疫反応を誘発する。より具体的には、病原性抗原は、好ましくは、ウイルス又は細菌又は原生動物の表面に位置する表面抗原、例えば、タンパク質(又はタンパク質の断片、例えば、表面抗原の外側部分)である。
病原性抗原は、好ましくは感染性疾患に関連する病原体に由来するペプチド又はタンパク質抗原であり、好ましくは、以下の病原体に由来する抗原から選択される:アシネトバクター・バウマンニ(Acinetobacter baumannii)、アナプラズマ(Anaplasma)属、アナプラズマ・ファゴサイトフィルム(Anaplasma phagocytophilum)、ブラジル鉤虫(Ancylostoma braziliense)、ズビニ鉤虫(Ancylostoma duodenale)、溶血性アルカノバクテリア(Arcanobacterium haemolyticum)、回虫(Ascaris lumbricoides)、アスペルギルス(Aspergillus)属、アストロウイルス(Astroviridae)科、バベシア(Babesia)属、炭疽菌(Bacillus anthracis)、セレウス菌(Bacillus cereus)、ヘンセラ菌(Bartonella henselae)、BKウイルス、ブラストシスチス・ホミニス(Blastocystis hominis)、ブラストマイセス・デルマチチジス(Blastomyces dermatitidis)、百日咳菌(Bordetella pertussis)、ライム病ボレリア(Borrelia burgdorferi)、ボレリア(Borrelia)属、ボレリア(Borrelia)属の種、ブルセラ(Brucella)属、マレー糸状虫(Brugia malayi)、ブニヤウイルス(Bunyaviridae)科、セパシア菌(Burkholderia cepacia)及び他のバークホルデリア(Burkholderia)属の種、鼻疽菌(Burkholderia mallei)、類鼻疽菌(Burkholderia pseudomallei)、カリシウイルス(Caliciviridae)科、カンピロバクター(Campylobacter)属、カンジダ・アルビカンス(Candida albicans)、カンジダ(Candida)属の種、トラコーマクラミジア(Chlamydia trachomatis)、肺炎クラミジア(Chlamydophila pneumoniae)、オウム病クラミジア(Chlamydophila psittaci)、CJDプリオン、肝臓ジストマ(Clonorchis sinensis)、ボツリヌス菌(Clostridium botulinum)、クロストリジウム・ディフィシル(Clostridium difficile)、ウェルシュ菌(Clostridium perfringens)、ウェルシュ菌(Clostridium perfringens)、クロストリジウム(Clostridium)属の種、破傷風菌(Clostridium tetani)、コクシジオイデス(Coccidioides)属の種、コロナウイルス、ジフテリア菌(Corynebacterium diphtheriae)、Q熱コクシエラ(Coxiella burnetii)、クリミア−コンゴ出血熱ウイルス、クリプトコッカス・ネオフォルマンス(Cryptococcus neoformans)、クリプトスポリジウム(Cryptosporidium)属、サイトメガロウイルス(CMV)、デングウイルス(DEN−1、DEN−2、DEN−3、及びDEN−4)、二核アメーバ(Dientamoeba fragilis)、エボラウイルス(EBOV)、エキノコックス(Echinococcus)属、エーリキア・シャフェンシス(Ehrlichia chaffeensis)、エーリキア・エウィンギイ(Ehrlichia ewingii)、エーリキア(Ehrlichia)属、赤痢アメーバ(Entamoeba histolytica)、エンテロコッカス(Enterococcus)属、エンテロウイルス(Enterovirus)属、エンテロウイルス、主にコクサッキーAウイルス及びエンテロウイルス71(EV71)、エピデルモフィトン(Epidermophyton)属の種、エプスタイン−バーウイルス(EBV)、大腸菌(Escherichia coli)O157:H7、O111、及びO104:H4、肝蛭(Fasciola hepatica)及び巨大肝蛭(Fasciola gigantica)、FFIプリオン、フィラリア(Filarioidea)上科、フラビウイルス、野兎病菌(Francisella tularensis)、フゾバクテリウム(Fusobacterium)属、ゲオトリクム・カンジドゥム(Geotrichum candidum)、ランブル鞭毛虫(Giardia intestinalis)、顎口虫(Gnathostoma)属の種、GSSプリオン、グアナリトウイルス、デュクレー菌(Haemophilus ducreyi)、インフルエンザ菌(Haemophilus influenzae)、ピロリ菌(Helicobacter pylori)、ヘニパウイルス(ヘンドラウイルス、ニパーウイルス)、A型肝炎ウイルス、B型肝炎ウイルス(HBV)、C型肝炎ウイルス(HCV)、D型肝炎ウイルス、E型肝炎ウイルス、単純ヘルペスウイルス1及び2(HSV−1及びHSV−2))、ヒストプラスマ・カプスラーツム(Histoplasma capsulatum)、HIV(ヒト免疫不全ウイルス)、ホルタエ・ウェルネッキー(Hortaea werneckii)、ヒトボカウイルス(HBoV)、ヒトヘルペスウイルス6(HHV−6)及びヒトヘルペスウイルス7(HHV−7)、ヒトメタニューモウイルス(hMPV)、ヒト乳頭腫ウイルス(HPV)、ヒトパラインフルエンザウイルス(HPIV)、日本脳炎ウイルス、JCウイルス、フニンウイルス、キンゲラ・キンゲ(Kingella kingae)、クレブシエラ・グラヌロマチス(Klebsiella granulomatis)、クーループリオン、ラッサウイルス、レジオネラ・ニューモフィラ(Legionella pneumophila)、リーシュマニア(Leishmania)属、レプトスピラ(Leptospira)属、リステリア菌(Listeria monocytogenes)、リンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス(LCMV)、マチュポウイルス、マラセジア(Malassezia)属の種、マールブルグウイルス、麻疹ウイルス、横川吸虫(Metagonimus yokagawai)、微胞子虫(Microsporidia)門、伝染性軟属腫ウイルス(MCV)、流行性耳下腺炎ウイルス、らい菌(Mycobacterium leprae)及びマイコバクテリウム・レプロマトシス(Mycobacterium lepromatosis)、結核菌(Mycobacterium tuberculosis)、マイコバクテリウム・ウルセランス(Mycobacterium ulcerans)、肺炎マイコプラスマ(Mycoplasma pneumoniae)、ネグレリア・フォーレリ(Naegleria fowleri)、アメリカ鉤虫(Necat又はamericanus)、淋菌(Neisseria gonorrhoeae)、髄膜炎菌(Neisseria meningitidis)、ノカルジア・アステロイデス(Nocardia asteroides)、ノカルジア(Nocardia)属の種、回旋糸状虫(Onchocerca volvulus)、オリエンティア・ツツガムシ(Orientia tsutsugamushi)、オルソミクソウイルス(Orthomyxoviridae)科(インフルエンザ)、ブラジルパラコクシジオイデス(Paracoccidioides brasiliensis)、肺吸虫(Paragonimus)属の種、ヴェステルマン肺吸虫(Paragonimus westermani)、パルボウイルスB19、パスツレラ(Pasteurella)属、プラスモディウム(Plasmodium)属、ニューモシスチス肺炎菌(Pneumocystis jirovecii)、ポリオウイルス、狂犬病ウイルス、RSウイルス(RSV)、鼻炎ウイルス、ライノウイルス、痘瘡リケッチア(Rickettsia akari)、リケッチア(Rickettsia)属、発疹チフスリケッチア(Rickettsia prowazekii)、斑点熱リケッチア(Rickettsia rickettsii)、発疹熱リケッチア(Rickettsia typhi)、リフトバレー熱ウイルス、ロタウイルス、風疹ウイルス、サビアウイルス(Sabia virus)、サルモネラ(Salmonella)属、ヒゼンダニ(Sarcoptes scabiei)、SARSコロナウイルス、住血吸虫(Schistosoma)属、赤痢菌(Shigella)属、シンノンブルウイルス、ハンタウイルス、スポロトリックス・シェンキィ(Sporothrix schenckii)、ブドウ球菌(Staphylococcus)属、ブドウ球菌(Staphylococcus)属、ストレプトコッカス・アガラクチア(Streptococcus agalactiae)、肺炎球菌(Streptococcus pneumoniae)、化膿性連鎖球菌(Streptococcus pyogenes)、糞線虫(Strongyloides stercoralis)、テニア(Taenia)属、有鉤条虫(Taenia solium)、ダニ媒介性脳炎ウイルス(TBEV)、イヌ回虫(Toxocara canis)又はネコ回虫(Toxocara cati)、トキソプラズマ・ゴンヂ(Toxoplasma gondii)、梅毒トレポネーマ(Treponema pallidum)、旋毛虫(Trichinella spiralis)、膣トリコモナス(Trichomonas vaginalis)、白癬菌(Trichophyton)属の種、ヒト鞭虫(Trichuris trichiura)、トリパノソーマ・ブルーセイ(Trypanosoma brucei)、クルーズトリパノソーマ(Trypanosoma cruzi)、ウレアプラズマ・ウレアリチカム(Ureaplasma urealyticum)、水痘帯状疱疹ウイルス(VZV)、水痘帯状疱疹ウイルス(VZV)、大痘瘡又は小痘瘡、vCJDプリオン、ベネズエラウマ脳炎ウイルス、コレラ菌(Vibrio cholerae)、西ナイルウイルス、西部ウマ脳炎ウイルス、バンクロフト糸状虫(Wuchereria bancrofti)、黄熱病ウイルス、腸炎エルシニア(Yersinia enterocolitica)、ペスト菌(Yersinia pestis)、及び偽結核エルジニア菌(Yersinia pseudotuberculosis)。
この状況では、インフルエンザウイルス、RSウイルス(RSV)、単純ヘルペスウイルス(HSV)、ヒト乳頭腫ウイルス(HPV)、ヒト免疫不全ウイルス(HIV)、プラスモディウム、黄色ブドウ球菌(Staphylococcus aureus)、デングウイルス、トラコーマクラミジア、サイトメガロウイルス(CMV)、B型肝炎ウイルス(HBV)、結核菌、狂犬病ウイルス、及び黄熱病ウイルスから選択される病原体由来の抗原が特に好ましい。
腫瘍抗原:
更なる実施形態では、本発明に係る人工核酸分子は、タンパク質又はペプチドをコードしてよく、前記タンパク質又はペプチドは、腫瘍抗原、前記腫瘍抗原の断片、変異体、又は誘導体を含むペプチド又はタンパク質を含み、好ましくは、前記腫瘍抗原は、メラニン形成細胞特異的抗原、癌−精巣抗原、又は腫瘍特異的抗原、好ましくは、CT−X抗原、非X CT抗原、CT−X抗原の結合パートナー、若しくは非X CT抗原の結合パートナー、又は腫瘍特異的抗原、より好ましくは、CT−X抗原、非X CT抗原の結合パートナー、又は腫瘍特異的抗原、又は前記腫瘍抗原の断片、変異体、若しくは誘導体であり;前記核酸配列は、それぞれ、異なるペプチド又はタンパク質をコードし;前記核酸配列の少なくとも1つは、以下をコードしている:5T4、707−AP、9D7、AFP、AlbZIP HPG1、アルファ−5−ベータ−1−インテグリン、アルファ−5−ベータ−6−インテグリン、アルファ−アクチニン−4/m、アルファ−メチルアシル補酵素Aラセマーゼ、ART−4、ARTC1/m、B7H4、BAGE−1、BCL−2、bcr/abl、ベータ−カテニン/m、BING−4、BRCA1/m、BRCA2/m、CA15−3/CA27−29、CA19−9、CA72−4、CA125、カルレチクリン、CAMEL、CASP−8/m、カテプシンB、カテプシンL、CD19、CD20、CD22、CD25、CDE30、CD33、CD4、CD52、CD55、CD56、CD80、CDC27/m、CDK4/m、CDKN2A/m、CEA、CLCA2、CML28、CML66、COA−1/m、コアクトシン様タンパク質、collage XXIII、COX−2、CT−9/BRD6、Cten、サイクリンB1、サイクリンD1、cyp−B、CYPB1、DAM−10、DAM−6、DEK−CAN、EFTUD2/m、EGFR、ELF2/m、EMMPRIN、EpCam、EphA2、EphA3、ErbB3、ETV6−AML1、EZH2、FGF−5、FN、Frau−1、G250、GAGE−1、GAGE−2、GAGE−3、GAGE−4、GAGE−5、GAGE−6、GAGE7b、GAGE−8、GDEP、GnT−V、gp100、GPC3、GPNMB/m、HAGE、HAST−2、ヘプシン、Her2/neu、HERV−K−MEL、HLA−A*0201−R17I、HLA−A11/m、HLA−A2/m、HNE、ホメオボックスNKX3.1、HOM−TES−14/SCP−1、HOM−TES−85、HPV−E6、HPV−E7、HSP70−2M、HST−2、hTERT、iCE、IGF−1R、IL−13Ra2、IL−2R、IL−5、未成熟ラミニン受容体、カリクレイン−2、カリクレイン−4、Ki67、KIAA0205、KIAA0205/m、KK−LC−1、K−Ras/m、LAGE−A1、LDLR−FUT、MAGE−A1、MAGE−A2、MAGE−A3、MAGE−A4、MAGE−A6、MAGE−A9、MAGE−A10、MAGE−A12、MAGE−B1、MAGE−B2、MAGE−B3、MAGE−B4、MAGE−B5、MAGE−B6、MAGE−B10、MAGE−B16、MAGE−B17、MAGE−C1、MAGE−C2、MAGE−C3、MAGE−D1、MAGE−D2、MAGE−D4、MAGE−E1、MAGE−E2、MAGE−F1、MAGE−H1、MAGEL2、マンマグロビンA、MART−1/melan−A、MART−2、MART−2/m、基質タンパク質22、MC1R、M−CSF、ME1/m、メソテリン、MG50/PXDN、MMP11、MN/CA IX−抗原、MRP−3、MUC−1、MUC−2、MUM−1/m、MUM−2/m、MUM−3/m、ミオシンクラスI/m、NA88−A、N−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ−V、Neo−PAP、Neo−PAP/m、NFYC/m、NGEP、NMP22、NPM/ALK、N−Ras/m、NSE、NY−ESO−1、NY−ESO−B、OA1、OFA−iLRP、OGT、OGT/m、OS−9、OS−9/m、オステオカルシン、オステオポンチン、p15、p190マイナー bcr−abl、p53、p53/m、PAGE−4、PAI−1、PAI−2、PAP、PART−1、PATE、PDEF、Pim−1−キナーゼ、Pin−1、Pml/Parアルファ、POTE、PRAME、PRDX5/m、プロステイン、プロテイナーゼ−3、PSA、PSCA、PSGR、PSM、PSMA、PTPRK/m、RAGE−1、RBAF600/m、RHAMM/CD168、RU1、RU2、S−100、SAGE、SART−1、SART−2、SART−3、SCC、SIRT2/m、Sp17、SSX−1、SSX−2/HOM−MEL−40、SSX−4、STAMP−1、STEAP−1、サバイビン、サバイビン−2B、SYT−SSX−1、SYT−SSX−2、TA−90、TAG−72、TARP、TEL−AML1、TGFベータ、TGFベータRII、TGM−4、TPI/m、TRAG−3、TRG、TRP−1、TRP−2/6b、TRP/INT2、TRP−p8、チロシナーゼ、UPA、VEGFR1、VEGFR−2/FLK−1、WT1、及びリンパ血球の免疫グロブリンイディオタイプ又はリンパ血球のT細胞受容体イディオタイプ、又は前記腫瘍抗原の断片、変異体、若しくは誘導体;好ましくは、サバイビン若しくはそのホモログ、MAGEファミリー若しくはその結合パートナー由来の抗原、又は前記腫瘍抗原の断片、変異体、若しくは誘導体。この状況では、腫瘍抗原NY−ESO−1、5T4、MAGE−C1、MAGE−C2、サバイビン、Muc−1、PSA、PSMA、PSCA、STEAP、及びPAPが特に好ましい。
好ましい実施形態では、人工核酸分子は、タンパク質又はペプチドをコードし、前記タンパク質又はペプチドは、治療用タンパク質、又はその断片、変異体、若しくは誘導体を含む。
本明細書に定義する治療用タンパク質は、任意の遺伝性疾患若しくは後天性疾患の治療に有益であるか、又は個体の症状を改善するペプチド又はタンパク質である。特に、治療用タンパク質は、数ある機能の中でも、遺伝子エラーを修正及び修復し、癌細胞又は病原体感染細胞を破壊し、免疫系疾患を治療し、代謝性疾患又は内分泌疾患を治療することができる治療剤の作製において重要な役割を果たす。例えば、タンパク質ホルモンであるエリスロポイエチン(EPO)は、腎臓合併症の一般的な原因である赤血球欠乏の患者の治療において利用することができる。更に、アジュバントタンパク質、治療用抗体も治療用タンパク質に含まれ、また、例えば閉経期の女性の治療において用いられるホルモン補充療法も含まれる。より最近のアプローチでは、患者の体細胞を用いて、前記体細胞の多能性幹細胞へのリプログラムが行われている。これは、論争になっている幹細胞療法に取って代わるものである。また、体細胞のリプログラム又は幹細胞の分化に用いられるこれらタンパク質も、本明細書では治療用タンパク質として定義される。更に、治療用タンパク質は、例えば、創傷治癒、組織再生、血管形成等の他の目的のために用いることもできる。更に、抗原特異的B細胞受容体、並びにこれらの断片及び変異体も、本明細書において治療用タンパク質として定義される。
したがって、治療用タンパク質は、遺伝性疾患であるか後天性疾患であるかにかかわらず、例えば、感染性疾患、新生物(例えば、癌又は腫瘍疾患)、血液及び造血器官の疾患、内分泌疾患、栄養疾患、代謝性疾患、神経系の疾患、循環系の疾患、呼吸器系の疾患、消化器系の疾患、皮膚及び皮下組織の疾患、筋骨格系及び結合組織の疾患、並びに尿生殖器系の疾患等の様々な疾患の治療を含む様々な目的のために使用することができる。
この状況では、特に代謝性疾患又は内分泌疾患の治療において用いることができる特に好ましい治療用タンパク質は、以下から選択される(括弧内は、治療用タンパク質が治療で用いられる具体的な疾患である):酸性スフィンゴミエリナーゼ(ニーマン−ピック病)、アジポタイド(肥満)、アガルシダーゼ−ベータ(ヒトガラクトシダーゼA)(ファブリー病;腎臓及び心血管系合併症を引き起こす可能性のある脂質の蓄積を防ぐ)、アルグルコシダーゼ(ポンペ病(II型糖原病))、アルファ−ガラクトシダーゼA(アルファ−GAL A、アガルシダーゼアルファ)(ファブリー病)、アルファ−グルコシダーゼ(糖原病(GSD)、ポンぺ病)、アルファ−L−イズロニダーゼ(ムコ多糖症(MPS)、ハーラー症候群、シャイエ症候群)、アルファ−N−アセチルグルコサミニダーゼ(サンフィリポ症候群)、アンフィレグリン(癌、代謝性疾患)、アンジオポエチン((Ang1、Ang2、Ang3、Ang4、ANGPTL2、ANGPTL3、ANGPTL4、ANGPTL5、ANGPTL6、ANGPTL7)(血管新生、脈管を安定化させる)、ベータセルリン(代謝性疾患)、ベータ−グルクロニダーゼ(スライ症候群)、骨形成タンパク質BMP(BMP1、BMP2、BMP3、BMP4、BMP5、BMP6、BMP7、BMP8a、BMP8b、BMP10、BMP15)(再生効果、骨関連症状、慢性腎疾患(CKD))、CLN6タンパク質(CLN6疾患−不定型遅発性小児型、遅発性異型、早発性若年型、神経セロイドリポフスチン症(NCL))、上皮成長因子(EGF)(創傷治癒、細胞の成長、増殖、及び分化の制御)、エピゲン(代謝性疾患)、エピレギュリン(代謝性疾患)、線維芽細胞成長因子(FGF、FGF−1、FGF−2、FGF−3、FGF−4、FGF−5、FGF−6、FGF−7、FGF−8、FGF−9、FGF−10、FGF−11、FGF−12、FGF−13、FGF−14、FGF−16、FGF−17、FGF−17、FGF−18、FGF−19、FGF−20、FGF−21、FGF−22、FGF−23)(創傷治癒、血管新生、内分泌疾患、組織再生)、ガルスルファーゼ(ムコ多糖症VI)、グレリン(過敏性腸症候群(IBS)、肥満、プラダー−ウィリー症候群、II型糖尿病)、グルコセレブロシダーゼ(ゴーシェ病)、GM−CSF(再生効果、白血球の産生、癌)、ヘパリン結合EGF様成長因子(HB−EGF)(創傷治癒、心臓肥大、並びに心臓の発生及び機能)、肝細胞成長因子HGF(再生効果、創傷治癒)、ヘプシジン(鉄代謝障害、ベータ−サラセミア)、ヒトアルブミン(アルブミン産生の減少(低タンパク血症)、アルブミン喪失の増加(ネフローゼ症候群)、血液量減少、高ビリルビン血症)、イズルスルファーゼ(イズロン酸−2−スルファターゼ)(ムコ多糖症II(ハンター症候群))、インテグリンαVβ3、αVβ5、及びα5β1(マトリクス高分子及びプロテイナーゼに結合、血管新生)、イズロン酸スルファターゼ(ハンター症候群)、ラロニダーゼ(ハーラー型及びハーラー−シャイエ型のムコ多糖症I)、N−アセチルガラクトサミン−4−スルファターゼ(rhASB;ガルスルファーゼ、アリールスルファターゼA(ARSA)、アリールスルファターゼB(ARSB))(アリールスルファターゼB欠乏症、マロトー−ラミー症候群、ムコ多糖症VI)、N−アセチルグルコサミン−6−スルファターゼ(サンフィリポ症候群)、神経成長因子(NGF、脳由来神経栄養因子(BDNF)、ニューロトロフィン−3(NT−3)、及びニューロトロフィン4/5(NT−4/5)(再生効果、心血管疾患、冠状動脈アテローム性硬化症、肥満、2型糖尿病、メタボリックシンドローム、急性冠状動脈症候群、痴呆、鬱病、統合失調症、自閉症、レット症候群、神経性食欲不振症、神経性過食症、創傷治癒、皮膚潰瘍、角膜潰瘍、アルツハイマー病)、ニューレグリン(NRG1、NRG2、NRG3、NRG4)(代謝性疾患、統合失調症)、ニューロピリン(NRP−1、NRP−2)(血管新生、軸索ガイダンス、細胞生存、遊走)、オベスタチン(過敏性腸症候群(IBS)、肥満、プラダー−ウィリー症候群、II型糖尿病)、血小板由来成長因子(PDGF(PDFF−A、PDGF−B、PDGF−C、PDGF−D)(再生効果、創傷治癒、血管新生の障害、動脈硬化症、線維症、癌)、TGFベータ受容体(エンドグリン、TGF−ベータ1受容体、TGF−ベータ2受容体、TGF−ベータ3受容体)(腎線維症、腎疾患、糖尿病、最後には末期腎疾患(ESRD)、血管新生)、トロンボポイエチン(THPO)(巨核球増殖発達因子(MGDF))(血小板疾患、輸血用血小板、骨髄抑制療法後の血小板数の回復)、トランスフォーミング成長因子(TGF(TGF−アルファ、TGF−ベータ(TGFベータ1、TGFベータ2、及びTGFベータ3)))(再生効果、創傷治癒、免疫、癌、心疾患、糖尿病、マルファン症候群、ロイス−ディーズ症候群)、VEGF(VEGF−A、VEGF−B、VEGF−C、VEGF−D、VEGF−E、VEGF−F、及びPIGF)(再生効果、血管新生、創傷治癒、癌、透過性)、ネシリチド(急性非代償性鬱血性心不全)、トリプシン(褥創、静脈瘤性潰瘍、焼痂デブリードマン、裂創、日焼け、胎便性イレウス)、副腎皮質刺激ホルモン(ACTH)(「アディソン病、小細胞癌、副腎白質ジストロフィー、先天性副腎過形成、クッシング症候群、ネルソン症候群、点頭てんかん)、心房性ナトリウム利尿ペプチド(ANP)(内分泌疾患)、コレシストキニン(多様)、ガストリン(高ガストリン血症)、レプチン(糖尿病、高トリグリセリド血症、肥満)、オキシトシン(母乳栄養を刺激、分娩の非進行)、ソマトスタチン(カルチノイド症候群の対症療法、急性静脈瘤出血、及び先端巨大症、肝臓及び腎臓の多嚢胞性疾患、先端巨大症、及び神経内分泌腫瘍によって引き起こされる症状)、バソプレシン(抗利尿ホルモン)(尿崩症)、カルシトニン(閉経後骨粗鬆症、高カルシウム血症、パジェット病、骨転移、幻肢痛、脊椎管狭窄症)、エクセナチド(メトホルミン及びスルホニルウレアによる治療に対して抵抗性である2型糖尿病)、成長ホルモン(GH)、ソマトトロピン(GH欠乏又は慢性腎不全による成長不全、プラダー−ウィリー症候群、ターナー症候群、抗ウイルス療法によるAIDS消耗又は悪液質)、インスリン(糖尿病、糖尿病性ケトアシドーシス、高カリウム血症)、インスリン様成長因子1 IGF−1(GH遺伝子欠損又は重症原発性IGF1欠乏の小児における成長不全、神経変性疾患、心血管疾患、心不全)、メカセルミンリンファベート、IGF−1アナログ(GH遺伝子欠損又は重症原発性IGF1欠乏の小児における成長不全、神経変性疾患、心血管疾患、心不全)、メカセルミン、IGF−1アナログ(GH遺伝子欠損又は重症原発性IGF1欠乏の小児における成長不全、神経変性疾患、心血管疾患、心不全)、ペグビソマント(先端巨大症)、プラムリンタイド(糖尿病、インスリンと組み合わせる)、テリパラチド(ヒト副甲状腺ホルモン残基1−34)(重症骨粗鬆症)、ベカプレルミン(糖尿病性潰瘍のデブリードマン補助)、ジボテルミン−アルファ(骨形成タンパク質2)(脊椎固定術、骨損傷修復)、酢酸ヒストレリン(性腺刺激ホルモン放出ホルモン;GnRH)(早発思春期)、オクトレオチド(先端巨大症、VIP分泌線腫及び転移カルチノイド腫瘍の症状緩和)、及びパリフェルミン(ケラチノサイト成長因子;KGF)(化学療法を受けている患者における重症口腔粘膜炎、創傷治癒)。
これら及び他のタンパク質は、内因的に産生される欠陥のある機能的タンパク質を十分な量置き換えることによって被験体を治療することを意味するので、治療用であると理解される。したがって、かかる治療用タンパク質は、典型的に、哺乳類、特にヒトのタンパク質である。
血液疾患、循環系の疾患、呼吸器系の疾患、癌若しくは腫瘍疾患、感染性疾患、又は免疫不全の治療のために、以下の治療用タンパク質を用いてよい:アルテプラーゼ(組織プラスミノーゲン活性化因子;tPA)(肺塞栓症、心筋梗塞、急性虚血発作、中心静脈アクセス装置の閉塞)、アニストレプラーゼ(血栓溶解)、抗トロンビンIII(AT−III)(遺伝性AT−III欠乏、血栓塞栓症)、ビバリルジン(冠状動脈形成術における血液凝固リスクの低減及びヘパリン誘発性血小板減少症)、ダルベポエチン−アルファ(慢性腎機能不全及び慢性腎不全の患者における貧血の治療(+/−透析))、ドロトレコギン−アルファ(活性化プロテインC)(死亡のリスクが高い重症敗血症)、エリスロポイエチン、エポエチン−アルファ、エリスロポエチン、エリスロポイエチン(慢性疾患の貧血、脊髄形成異常症、腎不全又は化学療法による貧血、術前調製)、第IX因子(血友病B)、第VIIa因子(血友病A又はBの患者における出血、及び第VIII因子又は第IX因子の阻害剤)、第VIII因子(血友病A)、レピルジン(ヘパリン誘発性血小板減少症)、プロテインC濃縮物(静脈血栓、電撃性紫斑病)、レテプラーゼ(tPAの欠損変異体)(急性心筋梗塞の管理、心室機能の改善)、ストレプトキナーゼ(急性貫壁性心筋梗塞、肺塞栓症、深部静脈血栓、動脈血栓又は塞栓症、動静脈カニューレの閉塞)、テネクテプラーゼ(急性心筋梗塞)、ウロキナーゼ(肺塞栓症)、アンギオスタチン(癌)、抗CD22免疫毒素(再発性CD33+急性骨髄性白血病)、デニロイキンジフチトクス(皮膚T細胞リンパ腫(CTCL))、イムノシアニン(膀胱及び前立腺癌)、MPS(メタロパンスチムリン)(癌)、アフリバーセプト(非小細胞肺癌(NSCLC)、転移性結直腸癌(mCRC)、ホルモン抵抗性転移性前立腺癌、滲出型黄斑変性症)、エンドスタチン(癌、関節リウマチ等の炎症性疾患に加えてクローン病、糖尿病性網膜症、乾癬、及び子宮内膜症)、コラゲナーゼ(慢性皮膚潰瘍及び重篤な焼損領域のデブリードマン、デュピュイトラン拘縮、ペイロニー病)、ヒトデオキシリボヌクレアーゼI、ドルナーゼ(嚢胞性線維症;FVCが40%超と予測される選択された患者における気道感染症の減少)、ヒアルロニダーゼ(注入された薬物、特に眼科手術における麻酔薬及び特定のイメージング剤の吸収及び分散を増加させる補助剤として使用される)、パパイン(壊死組織のデブリードマン、又は褥瘡、静脈瘤性潰瘍及び糖尿病性潰瘍、火傷、術後創、毛巣嚢胞創傷、癰、及び他の創傷等の急性及び慢性病変における瘡蓋の液化)、L−アスパラギナーゼ(急性リンパ性白血病、増殖に内因性アスパラギンを必要とする)、Peg−アスパラギナーゼ(急性リンパ性白血病、増殖に内因性アスパラギンを必要とする)、ラスブリカーゼ(腫瘍崩壊症候群を引き起こす可能性のある抗癌療法を受けている白血病、リンパ腫、及び固形腫瘍の小児患者)、ヒト絨毛性ゴナドトロピン(HCG)(生殖補助)、ヒト卵胞刺激ホルモン(FSH)(生殖補助)、ルトロピン−アルファ(黄体形成ホルモン欠乏による不妊)、プロラクチン(低プロラクチン血症、血清プロラクチン欠乏、女性の卵巣機能不全、不安症、動脈性勃起不全、精液早漏、乏精子症、精子無力症、精嚢の機能低下、男性の低アンドロゲン症)、アルファ−1−プロテイナーゼ阻害剤(先天性抗トリプシン欠乏症)、ラクターゼ(ラクトースを消化できないことによるガス、膨満感、痙攣、及び下痢)、膵臓酵素(リパーゼ、アミラーゼ、プロテアーゼ)(嚢胞性線維症、慢性膵炎、膵不全、ビルロートII法胃バイパス手術後、膵管閉塞、脂肪便、消化不良、ガス、膨満感)、アデノシンデアミナーゼ(ウシペガデマーゼ、PEG−ADA)(アデノシンデアミナーゼ欠乏による重症複合免疫不全症)、アバタセプト(関節リウマチ(特に、TNFアルファ阻害に対して不応である場合))、アレファセプト(尋常性乾癬)、アナキンラ(関節リウマチ)、エタネルセプト(関節リウマチ、多関節型若年性関節リウマチ、乾癬性関節炎、強直性脊椎炎、尋常性乾癬、強直性脊椎炎)、インターロイキン−1(IL−1)受容体アンタゴニスト、アナキンラ(関節リウマチに関連する炎症及び軟骨分解)、チムリン(神経変性疾患、リウマチ、神経性食欲不振症)、TNF−アルファアンタゴニスト(関節リウマチ、強直性脊椎炎、クローン病、乾癬、化膿性汗腺炎、難治性喘息等の自己免疫疾患)、エンフビルチド(HIV−1感染症)、及びチモシンα1(B型肝炎及びC型肝炎)。(括弧内は、治療用タンパク質が治療で用いられる具体的な疾患である)。
更なる態様では、本発明は、
a.オープンリーディングフレーム(ORF)及び/又は例えば、オープンリーディングフレーム若しくはオープンリーディングフレームを含む配列を挿入するためのクローニングサイトと、
b.少なくとも1つの3’−非翻訳領域エレメント(3’−UTRエレメント)及び/又は少なくとも1つの5’−非翻訳領域エレメント(5’−UTRエレメント)とを含み、前記人工核酸分子が高い翻訳効率によって特徴付けられるベクターを提供する。
一般的に、本発明に係るベクターは、上記本発明に係る人工核酸分子を含んでいてよい。特に、本発明に係る人工核酸分子について上に記載した好ましい実施形態は、本発明に係るベクターに含まれる本発明に係る人工核酸分子にも当てはまる。例えば、本発明のベクターでは、少なくとも1つの3’−UTRエレメント及び/又は少なくとも1つの5’−UTRエレメントとORFとは、好ましい実施形態を含む、本発明に係る人工核酸分子について上に記載した通りである。例えば、本発明に係るベクターでは、少なくとも1つの3’−UTRエレメント及び/又は少なくとも1つの5’−UTRエレメントが由来する安定なmRNAは、好ましくは、第1の時点における前記mRNAの量に対する第2の時点における前記mRNAの量の比が少なくとも0.5(50%)、少なくとも0.6(60%)、少なくとも0.7(70%)、少なくとも0.75(75%)、少なくとも0.8(80%)、少なくとも0.85(85%)、少なくとも0.9(90%)、又は少なくとも0.95(95%)であるmRNA分解を特徴とし得る。
クローニングサイトは、オープンリーディングフレームを導入するのに好適な任意の配列又はオープンリーディングフレームを含む配列、例えば、1以上の制限酵素部位等であってよい。したがって、クローニングサイトを含むベクターは、好ましくは、オープンリーディングフレームをベクターに挿入するのに好適である。好ましくは、オープンリーディングフレームを5’−UTRエレメントの3’側に及び/又は3’−UTRエレメントの5’側に挿入するのに好適である。好ましくは、クローニングサイト又はORFは、5’−UTRエレメントの3’側に及び/又は3’−UTRエレメントの5’側に、好ましくは5’−UTRエレメントの3’末端に及び/又は3’−UTRエレメントの5’末端に近接して位置する。例えば、クローニングサイト又はORFは、5’−UTRエレメントの3’末端に及び/又は3’−UTRエレメントの5’末端に直接連結していてもよく、本発明に係る人工核酸分子について上記した通り一続きのヌクレオチド(例えば、一続きの2ヌクレオチド、4ヌクレオチド、6ヌクレオチド、8ヌクレオチド、10ヌクレオチド、20ヌクレオチド等)を介して連結していてもよい。
好ましくは、本発明に係るベクターは、例えば、任意でオープンリーディングフレーム又はオープンリーディングフレームを含む配列をベクターに挿入し、前記ベクターを転写することによって、本発明に係る人工核酸分子を作製するのに、好ましくは、本発明に係る人工mRNAを作製するのに好適である。したがって、好ましくは、ベクターは、プロモータ(例えば、RNAポリメラーゼプロモータ)等の転写に必要なエレメントを含む。好ましくは、ベクターは、真核生物、原核生物、ウイルス若しくはファージの転写系(例えば、真核細胞、原核細胞等)、又は真核生物、原核生物、ウイルス、若しくはファージのインビトロ転写系を用いる転写に好適である。したがって、例えば、ベクターは、RNAポリメラーゼ等のポリメラーゼ(例えば、真核生物、原核生物、ウイルス、又はファージのRNAポリメラーゼ)によって認識されるプロモータ配列を含んでいてよい。好ましい実施形態では、ベクターは、SP6、T3、又はT7等のファージRNAポリメラーゼプロモータ、好ましくはT7プロモータを含む。好ましくは、ベクターは、ファージに基づくインビトロ転写系(例えば、T7RNAポリメラーゼに基づくインビトロ転写系等)を用いるインビトロ転写に好適である。別の好ましい実施形態では、ベクターは、コードされているペプチド又はタンパク質を細胞又は組織で発現させるために直接用いてよい。この目的のために、ベクターは、例えば、CMVプロモータ等の特定のプロモータ配列等、その細胞/組織における発現に必須の特定のエレメントを含む。
ベクターは、本発明に係る人工核酸分子について上記した通りポリ(A)配列及び/又はポリアデニル化シグナルを更に含んでいてよい。
ベクターは、RNAベクターであってもよく、DNAベクターであってもよい。好ましくは、ベクターは、DNAベクターである。ベクターは、ウイルスベクター又はプラスミドベクター等の当業者に公知の任意のベクターであってよい。好ましくは、ベクターは、プラスミドベクター、好ましくはDNAプラスミドベクターである。
好ましい実施形態では、本発明に係るベクターは、本発明に係る人工核酸分子を含む。
好ましくは、本発明に係るDNAベクターは、配列番号152〜204に係る核酸配列等、遺伝子の転写物の3’−UTRの核酸配列に対して少なくとも約1%、少なくとも約2%、少なくとも約3%、少なくとも約4%、少なくとも約5%、少なくとも約10%、少なくとも約15%、少なくとも約20%、少なくとも約30%、又は少なくとも約40%、好ましくは少なくとも約50%、好ましくは少なくとも約60%、好ましくは少なくとも約70%、より好ましくは少なくとも約80%、より好ましくは少なくとも約90%、更により好ましくは少なくとも約95%、更により好ましくは少なくとも約99%、最も好ましくは100%の同一性を有する核酸配列を含む。
好ましくは、本発明に係るDNAベクターは、配列番号1〜151に係る核酸配列等、遺伝子の転写物の5’−UTRエレメントの核酸配列に対して少なくとも約1%、少なくとも約2%、少なくとも約3%、少なくとも約4%、少なくとも約5%、少なくとも約10%、少なくとも約15%、少なくとも約20%、少なくとも約30%、又は少なくとも約40%、好ましくは少なくとも約50%、好ましくは少なくとも約60%、好ましくは少なくとも約70%、より好ましくは少なくとも約80%、より好ましくは少なくとも約90%、更により好ましくは少なくとも約95%、更により好ましくは少なくとも約99%、最も好ましくは100%の同一性を有する核酸配列を含む。
好ましくは、本発明に係るDNAベクターは、配列番号1、配列番号2、配列番号137(又は配列番号3)、配列番号138(又は配列番号9)、配列番号10、配列番号12、配列番号15、配列番号140(又は配列番号17)、配列番号20、配列番号22、配列番号23、配列番号143(又は配列番号31)、配列番号32、配列番号39、配列番号41、配列番号44、配列番号45、配列番号146(又は配列番号52)、配列番号53、配列番号54、配列番号57、配列番号60、配列番号61、配列番号63、配列番号64、配列番号66、配列番号68、配列番号69、配列番号72、配列番号34、配列番号35、配列番号36、配列番号37、配列番号144(又は配列番号42)、配列番号58、配列番号62、配列番号73、配列番号75、配列番号77、配列番号79、配列番号80、配列番号81、配列番号83、配列番号84、配列番号86、配列番号87、配列番号88、配列番号89、配列番号90、配列番号91、配列番号92、配列番号93、配列番号94、配列番号95、配列番号97、配列番号98、配列番号99、配列番号100、配列番号101、配列番号102、配列番号103、配列番号106、配列番号107、配列番号108、配列番号147(又は配列番号109)、配列番号148(又は配列番号110)、配列番号112、配列番号113、配列番号114、配列番号115、配列番号117、配列番号118、配列番号149(又は配列番号119)、配列番号123、配列番号126、配列番号127、配列番号128、配列番号129、配列番号130、配列番号131、配列番号132、配列番号133、配列番号134、配列番号151(又は配列番号136)、配列番号96、配列番号111、配列番号150(配列番号120に基づく)、配列番号121、配列番号124、配列番号125で表される5’−UTRエレメント、及び配列番号152、配列番号153、配列番号154、配列番号155、配列番号156、配列番号157、配列番号158、配列番号159、配列番号160、配列番号161、配列番号164、配列番号165、配列番号167、配列番号168、配列番号169、配列番号170、配列番号171、配列番号172、配列番号173、配列番号174、配列番号175、配列番号176、配列番号179、配列番号180、配列番号181、配列番号182、配列番号183、配列番号184、配列番号187、配列番号188、配列番号189、配列番号191、配列番号204(又は配列番号192)、配列番号193、配列番号194、配列番号195、配列番号196、配列番号197、配列番号198、配列番号199、配列番号200、配列番号201、配列番号202、配列番号203、配列番号177で表される3’−UTRエレメントに係るDNA配列からなる群から選択される配列、又は前記配列のいずれかに係るDNA配列に対して少なくとも約40%、好ましくは少なくとも約50%、好ましくは少なくとも約60%、好ましくは少なくとも約70%、より好ましくは少なくとも約80%、より好ましくは少なくとも約90%、更により好ましくは少なくとも約95%、更により好ましくは少なくとも約99%の配列同一性を有する配列、又は上記これらの断片、好ましくはこれらの機能的断片を含む。
好ましくは、本発明に係るRNAベクターは、本発明に係るDNAベクターに関連して上に記載したDNA配列に対応するRNA配列に係る配列からなる群から選択される配列を含む。
好ましくは、ベクターは、環状分子である。好ましくは、ベクターは、二本鎖DNA分子等の二本鎖分子である。かかる環状の、好ましくは二本鎖のDNA分子は、本発明の人工核酸分子の保管形態として便利に用いることができる。更に、細胞、例えば培養細胞のトランスフェクションに用いることができる。また、本発明に係る人工RNA分子を得るためのインビトロ転写に用いることができる。
好ましくは、ベクター、好ましくは環状ベクターは、例えば、制限酵素で切断することによって線形にすることができる。好ましい実施形態では、ベクターは、ORFの直ぐ3’側、又は(存在する場合)、3’−UTRエレメントの直ぐ3’側、又は(存在する場合)ポリ(A)配列若しくはポリアデニル化シグナルの3’側、又は(存在する場合)ポリ(C)配列の3’側、又は(存在する場合)ヒストンステムループの3’側に位置する制限酵素部位等の切断部位、好ましくは唯一の切断部位を含む。したがって、好ましくは、ベクターの線形化によって得られる生成物は、3’末端において、ORFの3’末端、又は(存在する場合)3’−UTRエレメントの3’末端、又は(存在する場合)ポリ(A)配列若しくはポリアデニル化シグナルの3’末端、又は(存在する場合)ポリ(C)配列の3’末端で終結する。本発明に係るベクターが、本発明に係る人工核酸分子を含む実施形態では、制限酵素部位、好ましくは唯一の制限酵素部位が、人工核酸分子の3’末端の直ぐ3’側に位置することが好ましい。
更なる態様では、本発明は、本発明に係る人工核酸分子又は本発明に係るベクターを含む細胞に関する。前記細胞は、細菌細胞、昆虫細胞、植物細胞、脊椎動物細胞(例えば、哺乳類細胞)等の任意の細胞であってよい。かかる細胞は、例えば、細菌細胞において本発明のベクターを複製するために用いることができる。更に、前記細胞は、本発明に係る人工核酸分子若しくはベクターを転写するため、及び/又は本発明に係る人工核酸分子若しくはベクターのオープンリーディングフレームを翻訳するために用いることができる。例えば、前記細胞は、組み換えタンパク質を産生するために用いることができる。
本発明に係る細胞は、例えば、標準的なトランスフェクション、形質移入、又は形質転換の方法等の標準的な核酸移入法によって得ることができる。例えば、本発明に係る人工核酸分子又はベクターは、エレクトロポレーション、(例えば、カチオン性脂質及び/又はリポソームに基づく)リポフェクション、リン酸カルシウム沈殿、ナノ粒子に基づくトランスフェクション、ウイルスに基づくトランスフェクション、又はカチオン性ポリマー(例えば、DEAE−デキストラン又はポリエチレンイミン等)に基づくトランスフェクション等によって細胞に移入してよい。
好ましくは、前記細胞は、哺乳類細胞、例えば、ヒト被験体、家畜、実験動物(例えば、マウス又はラット)の細胞等である。好ましくは、前記細胞は、ヒトの細胞である。前記細胞は、確立されている細胞株の細胞、例えば、CHO、BHK、293T、COS−7、HeLa、HEPG2、HEK等であってもよく、初代細胞、例えば、ヒト皮膚線維芽(HDF)細胞等であってもよい。好ましくは、生物から単離された細胞である。好ましい実施形態では、前記細胞は、哺乳類の被験体、好ましくはヒトの被験体の単離細胞である。例えば、前記細胞は、好ましくは哺乳類の被験体、好ましくはヒトの被験体の免疫細胞(例えば、樹状細胞)、癌細胞若しくは腫瘍細胞、又は任意の体細胞等であってよい。
更なる態様では、本発明は、本発明に係る人工核酸分子、本発明に係るベクター、又は本発明に係る細胞を含む医薬組成物を提供する。本発明に係る医薬組成物は、例えば、遺伝子ワクチン接種用のワクチンとして用いてよい。したがって、ORFは、ワクチン接種のために患者に投与される抗原をコードしていてよい。したがって、好ましい実施形態では、本発明に係る医薬組成物は、ワクチンである。更に、本発明に係る医薬組成物は、例えば、遺伝子治療に用いることができる。
好ましくは、医薬組成物は、更に、1以上の薬学的に許容できるビヒクル、希釈剤、及び/又は賦形剤、及び/又は1以上の補助剤を含んでいてよい。本発明では、薬学的に許容できるビヒクルは、典型的に、本発明の医薬組成物用の液体又は非液体の基剤を含む。1つの実施形態では、医薬組成物は、液体形態で提供される。これに関連して、前記ビヒクルは、好ましくは、パイロジェンフリー水、等張生理食塩水又は緩衝(水)溶液、例えば、リン酸、クエン酸等のバッファ溶液等の水に基づく。バッファは、特定のレファレンス媒体に対して高張、等張、又は低張であってよい。即ち、前記バッファは、特定のレファレンス媒体に対してより高い、同一の、又はより低い塩含量を有してよく、好ましくは、浸透圧又は他の濃度効果により哺乳類細胞を損傷させない濃度の前述の塩を用いてよい。レファレンス媒体は、例えば、血液、リンパ液、サイトゾル液、若しくは他の体液等の「インビボ」法で用いられる液体であるか、又は一般的なバッファ若しくは液体等の「インビトロ」法でレファレンス媒体として用いることができる液体である。かかる一般的なバッファ又は液体は、当業者に公知である。乳酸リンゲル液が、液体基剤として特に好ましい。
本発明の医薬組成物のために、患者に投与するのに適している1以上の相溶性の固体又は液体の充填剤又は希釈剤、或いは封入化合物を同様に用いてもよい。用語「相溶性」とは、本明細書で使用するとき、好ましくは、典型的な使用条件下で本発明の医薬組成物の薬学的有効性を実質的に低減させる相互作用が生じないように、本発明の医薬組成物のこれら成分と本明細書に定義する本発明の人工核酸、ベクター、又は細胞とを混合できることを意味する。
本発明に係る医薬組成物は、任意で、1以上の更なる医薬活性成分を更に含んでいてよい。これに関連して医薬活性成分とは、特定の適応症又は疾患を治癒させる、寛解させる、又は予防する治療効果を示す化合物である。前記化合物としては、限定するものではないが、ペプチド又はタンパク質、核酸、(治療的に活性のある)低分子量の有機化合物又は無機化合物(分子量:5,000未満、好ましくは1,000未満)、糖類、抗原又は抗体、関連技術において既に知られている治療剤、抗原細胞、抗原細胞断片、細胞画分、細胞壁成分(例えば、多糖類)、(例えば、化学的に又は放射線照射により)改変、弱毒化、又は不活化された病原体(ウイルス、細菌等)等が挙げられる。
更に、本発明の医薬組成物は、人工核酸分子又はベクター用の担体を含んでいてよい。かかる担体は、医薬的に活性のある人工核酸分子又はベクターの生理学的に許容できる液体への溶解、輸送、及び細胞内取り込みを媒介するのに好適であり得る。したがって、かかる担体は、本発明に係る人工核酸分子又はベクターのデポー製剤及び送達に好適であり得る成分であってよい。かかる成分は、例えば、トランスフェクション剤又は複合体化剤として機能し得るカチオン性又はポリカチオン性の担体又は化合物であってよい。
本発明に係る好ましい実施形態では、人工核酸分子又はベクターは、1以上のカチオン性又はポリカチオン性化合物、好ましくはカチオン性若しくはポリカチオン性ポリマー、カチオン性若しくはポリカチオン性ペプチド若しくはタンパク質、例えば、プロタミン、カチオン性若しくはポリカチオン性多糖類、及び/又はカチオン性若しくはポリカチオン性脂質と複合体化される。
好ましい実施形態によれば、人工核酸分子又はベクターは、1以上のリポソーム、リポプレックス、又は脂質ナノ粒子を形成するために脂質と複合体化され得る。したがって、一実施形態では、本発明の医薬組成物は、人工核酸分子又はベクター、好ましくはRNA、より好ましくはmRNAを含むリポソーム、リポプレックス、及び/又は脂質ナノ粒子を含む。
脂質ベースの製剤は、その生体適合性及び大規模生産の容易さから、核酸、特にRNAの最も有望な送達系の1つとして次第に認識されてきている。カチオン性脂質は、RNAを送達するための合成物質として広く研究されている。互いに混合した後、核酸をカチオン性脂質によって縮合させて、リポプレックスとして知られている脂質/核酸を形成する。これら脂質複合体は、ヌクレアーゼの作用から遺伝物質を保護し、負に帯電している細胞膜と相互作用することによって前記遺伝物質を細胞に送達することができる。リポプレックスは、生理学的pHにおいて正に帯電している脂質を負に帯電している核酸と直接混合することによって調製することができる。
従来のリポソームは、カチオン性、アニオン性、又は中性の(リン)脂質及びコレステロールで構成され得る脂質二重層からなり、これが水性コアを封入する。脂質二重層及び水性空間はいずれも、それぞれ、疎水性又は親水性の化合物を組み込むことができる。リポソーム表面に親水性ポリマーコーティング、例えば、ポリエチレングリコール(PEG)を付加することによって、インビボにおけるリポソームの特徴及び挙動を改変して、立体安定性を付与することができる。更に、リガンド(例えば、抗体、ペプチド、及び炭水化物)をリポソームの表面又は結合するPEG鎖の末端に結合させることによって、特異的ターゲティングのためにリポソームを使用することもできる(Front Pharmacol.2015 Dec 1;6:286)。
リポソームは、典型的には、水性コンパートメントを取り囲むリン脂質二重層で構成されるコロイド脂質ベース及び界面活性剤ベースの送達系である。リポソームは、球形ベシクルとして存在し得、20nmから数マイクロメートルのサイズ範囲であり得る。カチオン性脂質ベースのリポソームは、静電相互作用を介して負に帯電している核酸と複合体化することができ、その結果、生体適合性、低毒性、及びインビボ臨床応用に必要な大規模生産の可能性を与える複合体が得られる。リポソームは、取り込みのために原形質膜と融合し得;一旦細胞の内部に入ると、リポソームはエンドサイトーシス経路を介して処理され、次いで、エンドソーム/キャリアから遺伝物質が原形質に放出される。リポソームは、その優れた生体適合性により長年に亘って薬物送達ビヒクルとして認知されており、リポソームが基本的に生体膜のアナログであると仮定すると、天然及び合成リン脂質から調製することができる(Int J Nanomedicine.2014;9:1833−1843)。
カチオン性リポソームは、従来より、プラスミドDNA、アンチセンスオリゴ、及びsiRNA/低分子ヘアピン型RNA−shRNA)を含むオリゴヌクレオチドに最も一般的に使用されている非ウイルス送達系である。カチオン性脂質、例えば、DOTAP(1,2−ジオレオイル−3−トリメチルアンモニウム−プロパン)及びDOTMA((N−[1−(2,3−ジオレオイルオキシ)プロピル]−N,N,N−トリメチル−アンモニウムメチルサルファート)は、負に帯電している核酸と複合体又はリポプレックスを形成し、静電相互作用によってナノ粒子を形成することができるので、高いインビトロトランスフェクション効率を与える。更に、例えば中性1,2−ジオレオイル−sn−グリセロ−3−ホスファチジルコリン(DOPC)ベースのナノリポソームとして、RNA送達用の中性脂質ベースのナノリポソームが開発された(Adv Drug Deliv Rev.2014 Feb;66:110−116.)。
したがって、一実施形態では、本発明に係る医薬組成物の人工核酸分子又はベクター、好ましくはRNAは、カチオン性脂質及び/又は中性脂質と複合体化され、それによって、リポソーム、脂質ナノ粒子、リポプレックス、又は中性脂質ベースのナノリポソームを形成する。
更なる実施形態においては、特に好ましいトランスフェクション剤又は複合体化剤は、カチオン性又はポリカチオン性の化合物であり、例えば、プロタミン、ヌクレオリン、スペルミン若しくはスペルミジン、又は他のカチオン性のペプチド又はタンパク質(例えば、ポリ−L−リシン(PLL)、ポリアルギニン、塩基性ポリペプチド、細胞透過性ペプチド(CPP)(HIV結合ペプチド、HIV−1 Tat(HIV)、Tat由来ペプチド、ペネトラチン、VP22由来ペプチド又はアナログペプチドを含む)、HSV VP22(単純ヘルペス)、MAP、KALA、又はタンパク質形質導入ドメイン(PTD)、PpT620、プロリンリッチペプチド、アルギニンリッチペプチド、リシンリッチペプチド、MPG−ペプチド、Pep−1、L−オリゴマー、カルシトニンペプチド、アンテナペディア由来ペプチド(特に、ショウジョウバエのアンテナペディア由来)、pAntp、pIsl、FGF、ラクトフェリン、トランスポータン、ブフォリン−2、Bac715−24、SynB、SynB(1)、pVEC、hCT由来ペプチド、SAP、又はヒストン)が挙げられる。
更に、かかるカチオン性又はポリカチオン性の化合物又は担体は、好ましくは少なくとも1つの−SH部分を含むか又は含むように更に改変されているカチオン性又はポリカチオン性のペプチド又はタンパク質であってよい。好ましくは、カチオン性又はポリカチオン性の担体は、以下の合計式(I)を有するカチオン性ペプチドから選択される:
{(Arg)l;(Lys)m;(His)n;(Orn)o;(Xaa)x};式(I)
(式中、l+m+n+o+xは、3〜100であり、l、m、n、又はoは、互いに独立して、0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21〜30、31〜40、41〜50、51〜60、61〜70、71〜80、81〜90、及び91〜100から選択される任意の数であるが、但し、Arg(アルギニン)、Lys(リジン)、His(ヒスチジン)及びOrn(オルニチン)の総含量は、オリゴペプチドの全アミノ酸の少なくとも10%であり;Xaaは、Arg、Lys、His又はOrnを除くネイティブ(即ち、天然)又は非ネイティブなアミノ酸から選択される任意のアミノ酸であり;xは、0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21〜30、31〜40、41〜50、51〜60、61〜70、71〜80、81〜90から選択される任意の数であるが、但し、Xaaの総含量は、オリゴペプチドの全アミノ酸の90%を超えない)。アミノ酸Arg、Lys、His、Orn、及びXaaはいずれも、ペプチドの任意の位置に位置してよい。これに関連して、7アミノ酸〜30アミノ酸のカチオン性ペプチド又はタンパク質が特に好ましい。好ましいカチオン性ペプチド及びタンパク質は、その開示内容を参照により本明細書に援用する国際特許出願WO2009/030481号にも記載されている。
更に、カチオン性又はポリカチオン性のペプチド又はタンパク質は、上に示す通り、式{(Arg)l;(Lys)m;(His)n;(Orn)o;(Xaa)x}(式(I))に従って定義され、少なくとも1つの−SH部分を含むか又は含むように更に改変されているとき、限定されるものではないが、部分式(Ia)から選択してよい:
{(Arg)l;(Lys)m;(His)n;(Orn)o;(Xaa’)x(Cys)y} 部分式(Ia)
(式中、(Arg)l;(Lys)m;(His)n;(Orn)o;及びxは、本明細書に定義する通りであり、Xaa’は、Arg、Lys、His、Orn、又はCysを除くネイティブ(即ち、天然)又は非ネイティブなアミノ酸から選択される任意のアミノ酸であり、yは、0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21〜30、31〜40、41〜50、51〜60、61〜70、71〜80、81〜90から選択される任意の数であるが、但し、Arg(アルギニン)、Lys(リジン)、His(ヒスチジン)及びOrn(オルニチン)の総含量は、オリゴペプチドの全アミノ酸の少なくとも10%である)。この状況において、国際公開第2012/013326号の開示内容を、参照により本明細書に援用する。更に、カチオン性又はポリカチオン性のペプチドは、部分式(Ib)から選択してよい:
Cys1{(Arg)l;(Lys)m;(His)n;(Orn)o;(Xaa)x}Cys2 部分式(Ib)
(式中、経験式{(Arg)l;(Lys)m;(His)n;(Orn)o;(Xaa)x}(式(III))は、本明細書に定義する通りであり、(半経験)式(III)に係るアミノ酸配列のコアを形成し、Cys1及びCys2は、(Arg)l;(Lys)m;(His)n;(Orn)o;(Xaa)xに近接するか又は末端に存在するシステインである)。この状況において、国際公開第2011/026641号の開示内容を、参照により本明細書に援用する。
トランスフェクション剤又は複合体化剤として用いることができる更に好ましいカチオン性又はポリカチオン性の化合物は、カチオン性多糖類(例えば、キトサン)、ポリブレン、カチオン性ポリマー(例えば、ポリエチレンイミン(PEI))、カチオン性脂質(例えば、DOTMA:[1−(2,3−シオレイルオキシ)プロピル)]−N,N,N−トリメチルアンモニウムクロリド、DMRIE、ジ−C14−アミジン、DOTIM、SAINT、DC−Chol、BGTC、CTAP、DOPC、DODAP、DOPE:ジオレイルホスファチジルエタノールアミン、DOSPA、DODAB、DOIC、DMEPC、DOGS:ジオクタデシルアミドグリシルスペルミン、DIMRI:ジミリスト−オキシプロピルジメチルヒドロキシエチルアンモニウムブロミド、DOTAP:ジオレオイルオキシ−3−(トリメチルアンモニオ)プロパン、DC−6−14:O,O−ジテトラデカノイル−N−(α−トリメチルアンモニオアセチル)ジエタノールアミンクロリド、CLIP1:rac−[(2,3−ジオクタデシルオキシプロピル)(2−ヒドロキシエチル)]−ジメチルアンモニウムクロリド、CLIP6:rac−[2(2,3−ジヘキサデシルオキシプロピル−オキシメチルオキシ)エチル]トリメチルアンモニウム、CLIP9:rac−[2(2,3−ジヘキサデシルオキシプロピル−オキシスクシニルオキシ)エチル]−トリメチルアンモニウム、オリゴフェクタミン、又はカチオン性若しくはポリカチオン性のポリマー(例えば、β−アミノ酸ポリマー又は逆ポリアミド等の修飾ポリアミノ酸;PVP(ポリ(N−エチル−4−ビニルピリジニウムブロミド))等の修飾ポリエチレン;pDMAEMA(ポリ(ジメチルアミノエチルメチルメタクリラート))等の修飾アクリラート;pAMAM(ポリ(アミドアミン))等の修飾アミドアミン;ジアミン末端修飾1,4ブタンジオールジアクリラート−co−5−アミノ−1−ペンタノールポリマー等の修飾ポリベータアミノエステル(PBAE);ポリプロピルアミンデンドリマー又はpAMAM系デンドリマー等のデンドリマー;PEI:ポリ(エチレンイミン)、ポリ(プロピレンイミン)等のポリイミン;ポリアリルアミン;シクロデキストリン系ポリマー、デキストラン系ポリマー、キトサン等の糖骨格系ポリマー;PMOXA−PDMSコポリマー等のシラン骨格系ポリマー)、1以上のカチオン性ブロック(例えば、上述のカチオン性ポリマーから選択される)と1以上の親水性又は疎水性のブロックとの組合せからなるブロックポリマー(例えば、ポリエチレングリコール)等を含んでいてよい。
別の実施形態によれば、本発明に係る医薬組成物は、医薬組成物の免疫賦活性を増強するために、アジュバントを含んでよい。この状況では、アジュバントは、本発明に係る医薬組成物に含まれる人工核酸分子又はベクター等の成分の投与及び送達を支援するのに好適な任意の化合物として理解してよい。更に、かかるアジュバントは、理論に束縛されるものではないが、自然免疫系の免疫応答、即ち、非特異的免疫応答を開始又は増大させることができる。言い換えれば、投与したとき、本発明に係る医薬組成物は、典型的に、人工核酸分子によってコードされている抗原に対する適応免疫応答を開始させる。更に、本発明に係る医薬組成物は、本発明に定義するアジュバントを本発明に係る医薬組成物に添加することにより、(支持的)自然免疫応答を発生させることができる。
かかるアジュバントは、当業者に公知であり且つ本発明の場合に好適な、即ち、哺乳類における免疫応答の誘導を支援する任意のアジュバントから選択してよい。好ましくは、アジュバントは、TDM、MDP、ムラミルジペプチド、プルロニック、アルム溶液、水酸化アルミニウム、ADJUMER(登録商標)(ポリホスファゼン)、リン酸アルミニウムゲル、藻類由来のグルカン、アルガミュリン(algammulin)、水酸化アルミニウムゲル(アルム)、高タンパク質吸着性水酸化アルミニウムゲル、低粘度水酸化アルミニウムゲル、AF又はSPT(スクアレン(5%)、Tween80(0.2%)、Pluronic L121(1.25%)、リン酸緩衝生理食塩水のエマルジョン、pH7.4)、AVRIDINE(商標)(プロパンジアミン)、BAY R1005(登録商標)((N−(2−デオキシ−2−L−ロイシルアミノ−b−D−グルコピラノシル)−N−オクタデシル−ドデカノイル−アミドヒドロアセタート)、CALCITRIOL(商標)(1−アルファ,25−ジヒドロキシ−ビタミンD3)、リン酸カルシウムゲル、CAP(商標)(リン酸カルシウムナノ粒子)、コレラホロトキシン、コレラ毒素A1−プロテインA−D断片融合タンパク質、コレラ毒素のBサブユニット、CRL1005(ブロックコポリマーP1205)、サイトカイン含有リポソーム、DDA(ジメチルジオクタデシルアンモニウムブロミド)、DHEA(デヒドロエピアンドロステロン)、DMPC(ジミリストイルホスファチジルコリン)、DMPG(ジミリストイルホスファチジルグリセロール)、DOC/アルム複合体(デオキシコール酸ナトリウム塩)、フロイント完全アジュバント、フロイント不完全アジュバント、ガンマイヌリン、Gerbuアジュバント(以下の混合物:i)N−アセチルグルコサミニル−(P1−4)−N−アセチルムラミル−L−アラニル−Dグルタミン(GMDP)、ii)ジメチルジオクタデシルアンモニウムクロリド(DDA)、iii)亜鉛L−プロリン塩複合体(ZnPro−8))、GM−CSF)、GMDP(N−アセチルグルコサミニル−(b1−4)−N−アセチルムラミル−Lアラニル−D−イソグルタミン)、イミキモド(imiquimod)(1−(2−メチプロピル)−1H−イミダゾ[4,5−c]キノリン−4−アミン)、ImmTher(商標)(N−アセチルグルコサミニル−N−アセチルムラミル−L−Ala−D−イソGlu−L−Ala−グリセロールジパルミタート)、DRV類(脱水−再水和小胞から調製した免疫リポソーム)、インターフェロン−ガンマ、インターロイキン−1ベータ、インターロイキン−2、インターロイキン−7、インターロイキン−12、ISCOMS(商標)、ISCOPREP7.0.3.(商標)、リポソーム、LOXORIBINE(商標)(7−アリル−8−オキソグアノシン)、LT経口アジュバント(大腸菌(E.coli)易熱性内毒素プロトキシン)、任意の組成物のミクロスフェア及びミクロ粒子、MF59(商標)、(スクアレン水エマルジョン)、MONTANIDE ISA51(商標)(精製不完全フロイントアジュバント)、MONTANIDE ISA720(商標)(代謝可能油アジュバント)、MPL(商標)(3−Q−デスアシル−4’−モノホスホリル脂質A)、MTP−PE及びMTP−PEリポソーム((N−アセチル−L−アラニル−D−イソグルタミニル−L−アラニン−2−(1,2−ジパルミトイル−sn−グリセロ−3−(ヒドロキシホスホリルオキシ))−エチルアミド、一ナトリウム塩)、MURAMETIDE(商標)(Nac−Mur−L−Ala−D−Gln−OCH3)、MURAPALMITINE(商標)及びDMURAPALMITINE(商標)(Nac−Mur−L−Thr−D−イソGln−sn−グリセロールジパルミトイル)、NAGO(ノイラミニダーゼ−ガラクトースオキシダーゼ)、任意の組成物のナノスフェア又はナノ粒子、NISV類(非イオン性界面活性剤小胞)、PLEURAN(商標)(−グルカン)、PLGA、PGA及びPLA(乳酸及びグリコール酸のホモポリマー及びコポリマー、ミクロスフェア/ナノスフェア)、PLURONIC L121(商標)、PMMA(ポリメチルメタクリラート)、PODDS(商標)(プロテイノイドミクロスフェア)、ポリエチレンカルバマート誘導体、ポリ−rA:ポリ−rU(ポリアデニル酸−ポリウリジル酸複合体)、ポリソルベート80(Tween80)、渦巻き型タンパク質(Protein Cochleates)(Avanti Polar Lipids,Inc.(Alabaster、AL))、STIMULON(商標)(QS−21)、Quil−A(Quil−Aサポニン)、S−28463(4−アミノ−オテック−ジメチル−2−エトキシメチル−1H−イミダゾ[4,5−c]キノリン−1−エタノール)、SAF−1(商標)(「Syntexアジュバント配合物」)、センダイプロテオリポソーム及びセンダイ含有脂質マトリックス、Span−85(トリオレイン酸ソルビタン)、Specol(Marcol52、Span85、及びTween85のエマルジョン)、スクアレン又はRobane(登録商標)(2,6,10,15,19,23−ヘキサメチルテトラコサン及び2,6,10,15,19,23−ヘキサメチル−2,6,10,14,18,22−テトラコサヘキサン)、ステアリルチロシン(オクタデシルチロシンヒドロクロリド)、Theramid(登録商標)(N−アセチルグルコサミニル−N−アセチルムラミル−L−Ala−D−イソGlu−L−Ala−ジパルミトキシプロピルアミド)、スレオニル−MDP(Termurtide(商標)又は[thr1]−MDP、N−アセチルムラミル−L−スレオニル−D−イソグルタミン)、Ty粒子(Ty−VLP又はウイルス様粒子);Walter−Reedリポソーム(水酸化アルミニウムに吸着させた脂質Aを含有するリポソーム)及びリポペプチド(Pam3Cysを含む)、特に、Adju−phos、Alhydrogel及びRehydragel等のアルミニウム塩;CFA、SAF、IFA、MF59、Provax、TiterMax、Montanide、Vaxfectinを含むエマルジョン;Optivax(CRL1005)、L121、及びPoloaxmer4010を含むコポリマー;Stealthを含むリポソーム、BIORALを含む渦巻き型のもの;QS21、Quil A、Iscomatrix、ISCOMを含む植物由来のアジュバント;トマチンを含む同時刺激に好適なアジュバント、PLG、PMM、及びイヌリンを含むバイオポリマー;Romurtideを含む微生物由来のペプチド、DETOX、MPL、CWS、マンノース、CpG核酸配列、CpG7909、ヒトTLR1−10のリガンド、マウスTLR1−13のリガンド、ISS−1018、IC31、イミダゾキノリン類、Ampligen、Ribi529、IMOxine、IRIV類、VLP類、コレラ毒素、易熱性毒素、Pam3Cys、フラジェリン、GPIアンカー、LNFPIII/Lewis X、抗菌ペプチド、UC−1V150、RSV融合タンパク質、cdiGMP、並びにCGRP神経ペプチドを含むアンタゴニストとして好適なアジュバントからなる群から選択してよいが、これらに限定されない。
また、好適なアジュバントは、カチオン性又はポリカチオン性の化合物から選択してもよく、前記アジュバントは、好ましくは、医薬組成物の人工核酸分子又はベクターとカチオン性又はポリカチオン性の化合物とを複合体化させる際に調製される。医薬組成物の人工核酸分子又はベクターと本明細書に定義するカチオン性又はポリカチオン性の化合物とを会合又は複合体化させることにより、好ましくは、医薬組成物の人工核酸分子又はベクターにアジュバント特性が提供され、また、安定化効果が付与される。このように特に好ましいカチオン性又はポリカチオン性の化合物は、カチオン性又はポリカチオン性のペプチド又はタンパク質から選択され、例えば、以下が挙げられる:プロタミン、ヌクレオリン(nucleoline)、スペルミン又はスペルミジン、或いは他のカチオン性のペプチド又はタンパク質、例えば、ポリ−L−リジン(PLL)、ポリアルギニン、塩基性ポリペプチド、HIV結合ペプチドを含む細胞透過性ペプチド(CPP)、Tat、HIV−1 Tat(HIV)、Tat由来ペプチド、ペネトラチン、VP22由来又は類似のペプチド、HSV、VP22(単純ヘルペス)、MAP、KALA、又はタンパク質形質導入ドメイン(PTD、PpT620、プロリンリッチペプチド、アルギニンリッチペプチド、リジンリッチペプチド、MPGペプチド、Pep−1、L−オリゴマー、カルシトニンペプチド、アンテナペディア由来ペプチド(特に、ショウジョウバエアンテナペディア由来)、pAntp、pIsl、FGF、ラクトフェリン、トランスポータン、ブフォリン−2、Bac715−24、SynB、SynB(1)、pVEC、hCT由来ペプチド、SAP、プロタミン、スペルミン、スペルミジン、又はヒストン。更に好ましいカチオン性又はポリカチオン性の化合物は、例えば、キトサン等のカチオン性多糖類、ポリブレン、例えば、ポリエチレンイミン(PEI)等のカチオン性ポリマー、例えば、DOTMA:1−(2,3−シオレイルオキシ)プロピル)−N,N,N−トリメチルアンモニウムクロリド等のカチオン性脂質、DMRIE、ジ−C14−アミジン、DOTIM、SAINT、DC−Chol、BGTC、CTAP、DOPC、DODAP、DOPE:ジオレイルホスファチジルエタノールアミン、DOSPA、DODAB、DOIC、DMEPC、DOGS:ジオクタデシルアミドグリシルスペルミン、DIMRI:ジミリスト−オキシプロピルジメチルヒドロキシエチルアンモニウムブロミド、DOTAP:ジオレオイルオキシ−3−(トリメチルアンモニオ)プロパン、DC−6−14:O,O−ジテトラデカノイル−N−( −トリメチルアンモニオアセチル)ジエタノールアミンクロリド、CLIP1:rac−[(2,3−ジオクタデシルオキシプロピル)(2−ヒドロキシエチル)]−ジメチルアンモニウムクロリド、CLIP6:rac−[2(2,3−ジヘキサデシルオキシプロピル−オキシメチルオキシ)エチル]トリメチルアンモニウム、CLIP9:rac−[2(2,3−ジヘキサデシルオキシプロピル−オキシスクシニルオキシ)エチル]−トリメチルアンモニウム、オリゴフェクタミン、或いは、カチオン性又はポリカチオン性のポリマー、例えば、−アミノ酸ポリマー又は逆向きポリアミド等の修飾ポリアミノ酸、PVP(ポリ(N−エチル−4−ビニルピリジニウムブロミド))等の修飾ポリエチレン、pDMAEMA(ポリ(ジメチルアミノエチルメチルアクリラート))等の修飾アクリラート、pAMAM(ポリ(アミドアミン))等の修飾アミドアミン、ジアミン末端修飾1,4ブタンジオールジアクリラート−コ−5−アミノ−1−ペンタノールポリマー等の修飾ポリベータ−アミノエステル(PBAE)、ポリプロピルアミンデンドリマー又はpAMAM系デンドリマー等のデンドリマー、PEI:ポリ(エチレンイミン)、ポリ(プロピレンイミン)等のポリイミン、ポリアリルアミン、シクロデキストリン系ポリマー、デキストラン系ポリマー及びキトサン等の糖骨格系ポリマー、PMOXA−PDMSコポリマー等のシラン骨格系ポリマー、1以上のカチオン性ブロック(例えば、上述のカチオン性ポリマーから選択される)及び1以上の親水性ブロック又は疎水性ブロック(例えば、ポリエチレングリコール)の組合せからなるブロックポリマー。
更に、組成物の人工核酸分子又はベクター、好ましくはRNAを複合体化することによってアジュバントとして用いることができる好ましいカチオン性又はポリカチオン性のタンパク質又はペプチドは、以下の合計式(I):(Arg)l;(Lys)m;(His)n;(Orn)o;(Xaa)x(式中、l+m+n+o+x=8〜15であり、l、m、n又はoは、互いに独立して、0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14又は15から選択される任意の数であるが、但し、Arg、Lys、His及びOrnの全体含量がオリゴペプチドの全アミノ酸の少なくとも50%であり;Xaaは、Arg、Lys、His又はOrnを除くネイティブの(=天然)又は非ネイティブのアミノ酸から選択される任意のアミノ酸であってよく;xは、0、1、2、3又は4から選択される任意の数であってよいが、但し、Xaaの全体含量がオリゴペプチドの全アミノ酸の50%を超えない)を有する以下のタンパク質又はペプチドから選択してよい。この状況において特に好ましいオリゴアルギニンは、例えば、Arg7、Arg8、Arg9、Arg7、H3R9、R9H3、H3R9H3、YSSR9SSY、(RKH)4、及びY(RKH)2R等である。
人工核酸又はベクターのカチオン性又はポリカチオン性の化合物に対する比は、核酸複合体全体の窒素/リン酸比(N/P比)に基づいて計算することができる。例えば、1μgのRNAは、RNAが塩基の統計的分布を示す限り、典型的に、約3nmolのリン酸残基を含有する。更に、1μgのペプチドは、塩基性アミノ酸の分子量及び数に依存して、典型的に、約xnmolの窒素残基を含有する。例示として(Arg)9(分子量:1,424g/mol、9窒素原子)について計算する場合、1μgの(Arg)9は、約700pmolの(Arg)9を含有するので、700×9=6,300pmol塩基性アミノ酸=6.3nmol窒素原子である。質量比約1:1のRNA/(Arg)9については、N/P比約2と計算することができる。例示として、2μgのRNAとの質量比が約2:1であるプロタミン(分子量:約4,250g/mol、21窒素原子、サケ由来のプロタミンを用いる場合)について計算する場合、RNAについて6nmolのリン酸を計算すべきであり、1μgのプロタミンは、約235pmolのプロタミン分子を含有するので、235×21=4,935pmol塩基性アミノ酸=4.9nmol窒素原子である。RNA/プロタミンの質量比が約2:1の場合、N/P比は約0.81と計算することができる。RNA/プロタミンの質量比が約8:1の場合、N/P比は約0.2と計算することができる。本発明の状況では、N/P比は、好ましくは、約0.1〜約10の範囲、好ましくは、約0.3〜約4の範囲、最も好ましくは約0.5〜約2の範囲であるか、又は複合体中の核酸:ペプチドの比に関しては0.7〜2の範囲、最も好ましくは、約0.7〜約1.5の範囲である。
参照により本明細書に援用される国際公開第2010/037539号には、免疫賦活組成物及び免疫賦活組成物を調製する方法が記載されている。したがって、本発明の好ましい実施形態では、本発明に係る人工核酸分子の効率的な免疫賦活効果及び効率的な翻訳の両方を得るために、組成物を2つの別々の工程で得る。ここでは、所謂「アジュバント成分」は、第1の工程で、アジュバント成分の人工核酸分子又はベクター、好ましくはRNAとカチオン性又はポリカチオン性の化合物とを特定の比で複合体化させて、安定な複合体を形成することによって調製される。この状況では、核酸の複合体化後に、アジュバント成分中に遊離カチオン性又はポリカチオン性の化合物が存在しないか、又は無視できる程度に少ない量しか残っていないことが重要である。したがって、アジュバント成分中の核酸及びカチオン性又はポリカチオン性の化合物の比は、典型的に、核酸全部が複合体化され、且つ組成物中に遊離カチオン性又はポリカチオン性の化合物が存在しないか、又は無視できる程度に少ない量しか残らない範囲で選択される。好ましくは、アジュバント成分の比、即ち、核酸のカチオン性又はポリカチオン性の化合物に対する比は、約6:1(w/w)〜約0,25:1(w/w)、より好ましくは、約5:1(w/w)〜約0,5:1(w/w)、更により好ましくは、約4:1(w/w)〜約1:1(w/w)、又は約3:1(w/w)〜約1:1(w/w)、最も好ましくは約3:1(w/w)〜約2:1(w/w)の範囲から選択される。
好ましい実施形態によれば、本発明の(免疫賦活)組成物を形成するために、本発明に係る人工核酸分子又はベクター、好ましくはRNA分子を、第2の工程で、アジュバント成分の複合体化核酸分子、好ましくはRNAに添加する。ここでは、本発明の人工核酸分子又はベクター、好ましくはRNAは、遊離核酸、即ち、他の化合物と複合体化していない核酸として添加される。添加前、遊離人工核酸分子又はベクターは複合体化されておらず、アジュバント成分を添加した際、任意の検出可能な又は著しい複合体化反応を受けないことが好ましい。
好適なアジュバントは、更に、式(II):GlXmGn(式中、Gは、グアノシン(グアニン)、ウリジン(ウラシル)、又はグアノシン(グアニン)若しくはウリジン(ウラシル)のアナログであり;Xは、グアノシン(グアニン)、ウリジン(ウラシル)、アデノシン(アデニン)、チミジン(チミン)、シチジン(シトシン)、又は上記ヌクレオチド(ヌクレオシド)のアナログであり;lは、1〜40の整数であり、l=1であるとき、Gは、グアノシン(グアニン)又はそのアナログであり、l>1であるとき、ヌクレオチド(ヌクレオシド)の少なくとも50%が、グアノシン(グアニン)又はそのアナログであり;mは、整数であり且つ少なくとも3であり、m=3であるとき、Xは、ウリジン(ウラシル)又はそのアナログであり、m>3であるとき、少なくとも3つの連続するウリジン(ウラシル)又はウリジンのアナログが存在し;nは、1〜40の整数であり、n=1であるとき、Gは、グアノシン(グアニン)又はそのアナログであり、n>1であるとき、ヌクレオチド(ヌクレオシド)の少なくとも50%が、グアノシン(グアニン)又はそのアナログである)を有する核酸から選択してよい。
他の好適なアジュバントは、更に、式(III):ClXmCn(式中、Cは、シチジン(シトシン)、ウリジン(ウラシル)、又はシチジン(シトシン)若しくはウリジン(ウラシル)のアナログであり;Xは、グアノシン(グアニン)、ウリジン(ウラシル)、アデノシン(アデニン)、チミジン(チミン)、シチジン(シトシン)、又は上記ヌクレオチド(ヌクレオシド)のアナログであり;lは、1〜40の整数であり、l=1であるとき、Cは、シチジン(シトシン)又はそのアナログであり、l>1であるとき、ヌクレオチド(ヌクレオシド)の少なくとも50%が、シチジン(シトシン)又はそのアナログであり;mは、整数であり且つ少なくとも3であり、m=3であるとき、Xは、ウリジン(ウラシル)又はそのアナログであり、m>3であるとき、少なくとも3つの連続するウリジン(ウラシル)又はウリジン(ウラシル)のアナログが存在し;nは、1〜40の整数であり、n=1であるとき、Cは、シチジン(シトシン)又はそのアナログであり、n>1であるとき、ヌクレオチド(ヌクレオシド)の少なくとも50%が、シチジン(シトシン)又はそのアナログである)を有する核酸から選択してよい。
本発明に係る医薬組成物は、好ましくは、「安全且つ有効な量」の医薬組成物の成分、特に、本明細書に定義する本発明の人工核酸分子、ベクター、及び/又は細胞を含む。本明細書で使用するとき、「安全且つ有効な量」とは、本明細書に定義する疾患又は疾病の好ましい変化を著しく誘導するのに十分な量を意味する。しかし、同時に、「安全且つ有効な量」は、好ましくは、重篤な副作用を避け、且つ利益とリスクとの間の道理に適った関係を可能にする。これらの限度は、典型的に、道理に適った医学的判断の範囲内で決定される。
更なる態様では、本発明は、医薬として、例えば(遺伝子ワクチン接種における)ワクチンとして、又は遺伝子治療において用いるための本発明に係る人工核酸分子、本発明に係るベクター、本発明に係る細胞、又は本発明に係る医薬組成物を提供する。
本発明に係る人工核酸分子、本発明に係るベクター、本発明に係る細胞、又は本発明に係る医薬組成物は、ペプチド、ポリペプチド、若しくはタンパク質の治療作用又は効果を利用するか、又は特定のペプチド若しくはタンパク質の追加が必要である任意の医学的用途に特に好適である。したがって、本発明は、ペプチド、ポリペプチド、若しくはタンパク質の治療作用若しくは効果によって治療することができるか、又は特定のペプチド、ポリペプチド、若しくはタンパク質の追加によって治療することができる疾患又は疾病の治療又は予防において用いるための本発明に係る人工核酸分子、本発明に係るベクター、本発明に係る細胞、又は本発明に係る医薬組成物を提供する。例えば、本発明に係る人工核酸分子、本発明に係るベクター、本発明に係る細胞、又は本発明に係る医薬組成物は、例えば、遺伝子ワクチン接種又は遺伝子治療によって、遺伝性疾患、自己免疫疾患、癌性又は腫瘍関連疾患、感染性疾患、慢性疾患等を治療又は予防するために用いることができる。
特に、本発明の3’−UTRエレメントは、本発明の人工核酸分子又はベクターにコードされているペプチド又はタンパク質を安定的に長期に亘って発現させる及び/又は本発明の5’−UTRエレメントは、本発明の人工核酸分子又はベクターにコードされているペプチド又はタンパク質の発現を増加させるので、治療を受ける被験体において治療用のペプチド、ポリペプチド、又はタンパク質が増加し且つ長期に亘って存在することから利益を得るかかる治療的処置は、本発明に関連する医学的用途として特に好適である。したがって、本発明に係る人工核酸分子、本発明に係るベクター、本発明に係る細胞、又は本発明に係る医薬組成物に特に好適な医学的用途は、ワクチン接種である。したがって、本発明は、被験体、好ましくは哺乳類の被験体、より好ましくはヒトの被験体のワクチン接種のための本発明に係る人工核酸分子、本発明に係るベクター、本発明に係る細胞、又は本発明に係る医薬組成物を提供する。好ましいワクチン接種処理は、細菌、原生動物、又はウイルスによる感染症等の感染性疾患に対するワクチン接種、及び抗腫瘍ワクチン接種である。かかるワクチン接種処理は、予防的であってもよく、治療的であってもよい。
治療又は予防される疾患に応じてORFを選択してよい。例えば、オープンリーディングフレームは、遺伝性疾患に罹患している患者等、タンパク質が完全に欠失しているか又は機能が少なくとも部分的に喪失している患者に供給しなければならないタンパク質をコードしていてよい。更に、オープンリーディングフレームは、被験体の疾患又は症状に有益な影響を与えるペプチド又はタンパク質をコードしているORFから選択してよい。更に、オープンリーディングフレームは、天然のペプチド若しくはタンパク質の病的過剰産生をダウンレギュレートするか又は病的にタンパク質若しくはペプチドを発現する細胞を排除するペプチド又はタンパク質をコードしていてもよい。かかる欠失、機能喪失、又は過剰産生は、例えば、腫瘍及び新生物、自己免疫疾患、アレルギー、感染症、慢性疾患等に関連して生じる場合がある。更に、オープンリーディングフレームは、抗原又は免疫原(例えば、病原体又は腫瘍抗原のエピトープ)をコードしていてよい。したがって、好ましい実施形態では、本発明に係る人工核酸分子又はベクターは、抗原又は免疫原(例えば、病原体又は腫瘍関連抗原のエピトープ)と、上記3’−UTRエレメント及び/又は上記5’−UTRエレメントと、ポリ(A)配列等の任意の更なる成分とを含むか又はからなるアミノ酸配列をコードしているORFを含む。
医学的用途に関連して、特に、ワクチン接種に関連して、DNAは、抗DNA免疫応答を誘発するリスクを有し且つゲノムDNAに挿入される傾向を有するので、本発明に係る人工核酸分子は、RNA、好ましくはmRNAであることが好ましい。しかし、幾つかの実施形態では、例えば、アデノウイルス送達ビヒクル等のウイルス送達ビヒクルを、例えば、遺伝子治療的処置において本発明に係る人工核酸分子又はベクターを送達するために用いる場合、人工核酸分子又はベクターがDNA分子であることが望ましい場合もある。
本発明に係る人工核酸分子、本発明に係るベクター、本発明に係る細胞、又は本発明に係る医薬組成物は、経口的に、非経口的に、吸入スプレーによって、局所的に、直腸内に、経鼻的に、口腔内に、膣内に、埋め込まれたレザーバを介して、又はジェット注射を介して投与してよい。本明細書で使用するとき、非経口という用語は、皮下、静脈内、筋肉内、関節内、滑液包内、基質内、鞘内、肝臓内、病変内、頭蓋内、経皮、皮内、肺内、腹腔内、手根内、動脈内、及び舌下への注射又は注入技術を含む。好ましい実施形態では、本発明に係る人工核酸分子、本発明に係るベクター、本発明に係る細胞、又は本発明に係る医薬組成物は、無針注射(例えば、ジェット注射)を介して投与される。
好ましくは、本発明に係る人工核酸分子、本発明に係るベクター、本発明に係る細胞、又は本発明に係る医薬組成物は、非経口的に、例えば非経口注射によって投与され、より好ましくは、皮下、静脈内、筋肉内、関節内、滑液包内、基質内、鞘内、肝臓内、病変内、頭蓋内、経皮、皮内、肺内、腹腔内、手根内、動脈内、及び舌下への注射又は注入技術によって投与される。皮内及び筋肉内への注射が特に好ましい。本発明の医薬組成物の滅菌注射用形態は、水性又は油性の懸濁液であってよい。これら懸濁液は、好適な分散剤又は湿潤剤と懸濁化剤とを用いて当技術分野において公知の技術に従って製剤され得る。好ましくは、溶液又は懸濁液は、無針注射(例えば、ジェット注射)を介して投与される。
また、本発明に係る人工核酸分子、本発明に係るベクター、本発明に係る細胞、又は本発明に係る医薬組成物は、カプセル剤、錠剤、水性懸濁剤、又は液剤が挙げられるがこれらに限定されない任意の経口的に許容できる剤形で経口投与してよい。
また、本発明に係る人工核酸分子、本発明に係るベクター、本発明に係る細胞、又は本発明に係る医薬組成物は、例えば、皮膚又は任意の他のアクセス可能な上皮組織の疾患を含む、局所塗布によって容易にアクセス可能な領域又は器官が治療標的に含まれる場合は特に、局所投与してもよい。これら領域又は器官のそれぞれについて、好適な局所製剤は容易に調製される。局所塗布については、本発明に係る人工核酸分子、本発明に係るベクター、本発明に係る細胞、又は本発明に係る医薬組成物を、1以上の担体に懸濁又は溶解している好適な軟膏に製剤してよい。
1つの実施形態では、医薬としての使用は、哺乳類細胞のトランスフェクション、好ましくは哺乳類細胞のインビトロ又はエクスビボトランスフェクション、より好ましくは前記医薬により治療される被験体の単離細胞のインビトロトランスフェクションの工程を含む。前記使用が単離細胞のインビトロトランスフェクションを含む場合、医薬としての使用は、トランスフェクトされた細胞を患者に再投与することを更に含んでいてよい。医薬としての本発明の人工核酸分子又はベクターの使用は、トランスフェクションに成功した単離細胞を選択する工程を更に含んでいてよい。したがって、ベクターが選択マーカーを更に含むことが有益である場合がある。また、前記医薬としての使用は、単離細胞のインビトロトランスフェクションと、前記細胞からの発現産物(即ち、コードされているペプチド又はタンパク質)の精製とを含んでいてよい。この精製されたペプチド又はタンパク質は、後に、それを必要としている被験体に投与してよい。
また、本発明は、上記疾患又は疾病を治療又は予防する方法であって、本発明に係る人工核酸分子、本発明に係るベクター、本発明に係る細胞、又は本発明に係る医薬組成物をそれを必要としている被験体に投与することを含む方法を提供する。
更に、本発明は、疾患又は疾病を治療又は予防する方法であって、本発明に係る人工核酸分子又は本発明に係るベクターで細胞をトランスフェクトすることを含む方法を提供する。トランスフェクションは、インビトロで実施してもよく、エクスビボで実施してもよく、インビボで実施してもよい。好ましい実施形態では、細胞のトランスフェクションは、インビトロで実施され、トランスフェクトされた細胞は、それを必要としている被験体、好ましくはヒト患者に投与される。好ましくは、インビトロでトランスフェクトされる細胞は、被験体、好ましくはヒト患者の単離細胞である。したがって、本発明は、被験体、好ましくはヒト患者から細胞を単離する工程と、本発明に係る人工核酸又は本発明に係るベクターを前記単離細胞にトランスフェクトする工程と、前記トランスフェクトされた細胞を前記被験体、好ましくは前記ヒト患者に投与する工程とを含む治療方法を提供する。
本発明に係る疾患を治療又は予防する方法は、好ましくは、上記ワクチン接種方法又は遺伝子治療方法である。
上記の通り、本発明の3’−UTRエレメント及び/又は本発明の5’−UTRエレメントは、mRNAからのタンパク質産生を延長及び/又は増加させることができる。したがって、更なる態様では、本発明は、人工核酸分子、好ましくはmRNA分子又はベクターからのタンパク質産生を増加及び/又は延長させる方法であって、オープンリーディングフレームを3’−UTRエレメント及び/又は5’−UTRエレメント(前記3’−UTRエレメント及び/又は前記5’−UTRエレメントは、得られる人工核酸分子に高い翻訳効率を与える)に結合させて、上記の通り本発明に係る人工核酸分子、好ましくはmRNA分子、又は上記の通り本発明に係るベクターを得る工程を含む方法に関する。
好ましくは、本発明に係る、人工核酸分子からの、好ましくはmRNA分子又はベクターからのタンパク質産生を増加及び/又は延長させるための方法において、3’−UTRエレメント及び/又は5’−UTRエレメントは、ZNF460、TGM2、IL7R、BGN、TK1、RAB3B、CBX6、FZD2、COL8A1、NDUFS7、PHGDH、PLK2、TSPO、PTGS1、FBXO32、NID2、ATP5D、EXOSC4、NOL9、UBB4B、VPS18、ORMDL2、FSCN1、TMEM33、TUBA4A、EMP3、TMEM201、CRIP2、BRAT1、SERPINH1、CD9、DPYSL2、CDK9、TFRC、PSMB3、FASN、PSMB6、PRSS56、KPNA6、SFT2D2、PARD6B、LPP、SPARC、SCAND1、VASN、SLC26A1、LCLAT1、FBXL18、SLC35F6、RAB3D、MAP1B、VMA21、CYBA、SEZ6L2、PCOLCE、VTN、ALDH16A1、RAVER1、KPNA6、SERINC5、JUP、CPN2、CRIP2、EPT1、PNPO、SSSCA1、POLR2L、LIN7C、UQCR10、PYCRL、AMN、MAP1S、NDUFS7、PHGDH、TSPO、ATP5D、EXOSC4、TUBB4B、TUBA4A、EMP3、CRIP2、BRAT1、CD9、CDK9、PSMB3、PSMB6、PRSS56、SCAND1、AMN、CYBA、PCOLCE、MAP1S、VTN、ALDH16A1(いずれも好ましくはヒト)及びDpysl2、Ccnd1、Acox2、Cbx6、Ubc、Ldlr、Nudt22、Pcyox1l、Ankrd1、Tmem37、Tspyl4、Slc7a3、Cst6、Aacs、Nosip、Itga7、Ccnd2、Ebp、Sf3b5、Fasn、Hmgcs1、Osr1、Lmnb1、Vma21、Kif20a、Cdca8、Slc7a1、Ubqln2、Prps2、Shmt2、Aurkb、Fignl1、Cad、Anln、Slfn9、Ncaph、Pole、Uhrf1、Gja1、Fam64a、Kif2c、Tspan10、Scand1、Gpr84、Fads3、Cers6、Cxcr4、Gprc5c、Fen1、Cspg4、Mrpl34、Comtd1、Armc6、Emr4、Atp5d、1110001J03Rik、Csf2ra、Aarsd1、Kif22、Cth、Tpgs1、Ccl17、Alkbh7、Ms4a8a、Acox2、Ubc、Slpi、Pcyox1l、Igf2bp1、Tmem37、Slc7a3、Cst6、Ebp、Sf3b5、Plk1、Cdca8、Kif22、Cad、Cth、Pole、Kif2c、Scand1、Gpr84、Tpgs1、Ccl17、Alkbh7、Ms4a8a、Mrpl34、Comtd1、Armc6、Atp5d、1110001J03Rik、Nudt22、Aarsd1(いずれも好ましくはマウス)からなる群;好ましくは、ZNF460−5’−UTR、TGM2−5’−UTR、IL7R−5’−UTR、BGN−5’−UTR、TK1−5’−UTR、RAB3B−5’−UTR、CBX6−5’−UTR、FZD2−5’−UTR、COL8A1−5’−UTR、NDUFS7−5’−UTR、PHGDH−5’−UTR、PLK2−5’−UTR、TSPO−5’−UTR、PTGS1−5’−UTR、FBXO32−5’−UTR、NID2−5’−UTR、ATP5D−5’−UTR、EXOSC4−5’−UTR、NOL9−5’−UTR、UBB4B−5’−UTR、VPS18−5’−UTR、ORMDL2−5’−UTR、FSCN1−5’−UTR、TMEM33−5’−UTR、TUBA4A−5’−UTR、EMP3−5’−UTR、TMEM201−5’−UTR、CRIP2−5’−UTR、BRAT1−5’−UTR、SERPINH1−5’−UTR、CD9−5’−UTR、DPYSL2−5’−UTR、CDK9−5’−UTR、TFRC−5’−UTR、PSMB3 5’−UTR、FASN−5’−UTR、PSMB6−5’−UTR、PRSS56−5’−UTR、KPNA6−5’−UTR、SFT2D2−5’−UTR、PARD6B−5’−UTR、LPP−5’−UTR、SPARC−5’−UTR、SCAND1−5’−UTR、VASN−5’−UTR、SLC26A1−5’−UTR、LCLAT1−5’−UTR、FBXL18−5’−UTR、SLC35F6−5’−UTR、RAB3D−5’−UTR、MAP1B−5’−UTR、VMA21−5’−UTR、CYBA−5’−UTR、SEZ6L2−5’−UTR、PCOLCE−5’−UTR、VTN−5’−UTR、ALDH16A1−5’−UTR、RAVER1−5’−UTR、KPNA6−5’−UTR、SERINC5−5’−UTR、JUP−5’−UTR、CPN2−5’−UTR、CRIP2−5’−UTR、EPT1−5’−UTR、PNPO−5’−UTR、SSSCA1−5’−UTR、POLR2L−5’−UTR、LIN7C−5’−UTR、UQCR10−5’−UTR、PYCRL−5’−UTR、AMN−5’−UTR、MAP1S−5’−UTR(いずれも好ましくはヒト)及びDpysl2−5’−UTR、Ccnd1−5’−UTR、Acox2−5’−UTR、Cbx6−5’−UTR、Ubc−5’−UTR、Ldlr−5’−UTR、Nudt22−5’−UTR、Pcyox1l−5’−UTR、Ankrd1−5’−UTR、Tmem37−5’−UTR、Tspyl4−5’−UTR、Slc7a3−5’−UTR、Cst6−5’−UTR、Aacs−5’−UTR、Nosip−5’−UTR、Itga7−5’−UTR、Ccnd2−5’−UTR、Ebp−5’−UTR、Sf3b5−5’−UTR、Fasn−5’−UTR、Hmgcs1−5’−UTR、Osr1−5’−UTR、Lmnb1−5’−UTR、Vma21−5’−UTR、Kif20a−5’−UTR、Cdca8−5’−UTR、Slc7a1−5’−UTR、Ubqln2−5’−UTR、Prps2−5’−UTR、Shmt2−5’−UTR、Aurkb−5’−UTR、Fignl1−5’−UTR、Cad−5’−UTR、Anln−5’−UTR、Slfn9−5’−UTR、Ncaph−5’−UTR、Pole−5’−UTR、Uhrf1−5’−UTR、Gja1−5’−UTR、Fam64a−5’−UTR、Kif2c−5’−UTR、Tspan10−5’−UTR、Scand1−5’−UTR、Gpr84−5’−UTR、Fads3−5’−UTR、Cers6−5’−UTR、Cxcr4−5’−UTR、Gprc5c−5’−UTR、Fen1−5’−UTR、Cspg4−5’−UTR、Mrpl34−5’−UTR、Comtd1−5’−UTR、Armc6−5’−UTR、Emr4−5’−UTR、Atp5d−5’−UTR、1110001J03Rik−5’−UTR、Csf2ra−5’−UTR、Aarsd1−5’−UTR、Kif22−5’−UTR、Cth−5’−UTR、Tpgs1−5’−UTR、Ccl17−5’−UTR、Alkbh7−5’−UTR、Ms4a8a−5’−UTR(いずれも好ましくはマウス);及びNDUFS7−3’−UTR、PHGDH−3’−UTR、TSPO−3’−UTR、ATP5D−3’−UTR、EXOSC4−3’−UTR、TUBB4B−3’−UTR、TUBA4A−3’−UTR、EMP3−3’−UTR、CRIP2−3’−UTR、BRAT1−3’−UTR、CD9−3’−UTR、CDK9−3’−UTR、PSMB3−3’−UTR、PSMB6−3’−UTR、PRSS56−3’−UTR、SCAND1−3’−UTR、AMN−3’−UTR、CYBA−3’−UTR、PCOLCE−3’−UTR、MAP1S−3’−UTR、VTN−3’−UTR、ALDH16A1−3’−UTR(いずれも好ましくはヒト)及びAcox2−3’−UTR、Ubc−3’−UTR、Slpi−3’−UTR、Pcyox1l−3’−UTR、Igf2bp1−3’−UTR、Tmem37−3’−UTR、Slc7a3−3’−UTR、Cst6−3’−UTR、Ebp−3’−UTR、Sf3b5−3’−UTR、Plk1−3’−UTR、Cdca8−3’−UTR、Kif22−3’−UTR、Cad−3’−UTR、Cth−3’−UTR、Pole−3’−UTR、Kif2c−3’−UTR、Scand1−3’−UTR、Gpr84−3’−UTR、Tpgs1−3’−UTR、Ccl17−3’−UTR、Alkbh7−3’−UTR、Ms4a8a−3’−UTR、Mrpl34−3’−UTR、Comtd1−3’−UTR、Armc6−3’−UTR、Atp5d−3’−UTR、1110001J03Rik−3’−UTR、Nudt22−3’−UTR、Aarsd1−3’−UTR、(いずれも好ましくはマウス)からなる群から選択される遺伝子の転写物の3’−UTR及び/又は5’−UTRに由来する核酸配列を含むか又はからなる。
本発明の状況において、用語「人工核酸分子又はベクターを3’−UTRエレメント及び/又は5’−UTRエレメントと結合させる」とは、好ましくは、人工核酸分子又はベクターを3’−UTRエレメント及び/又は5’−UTRエレメントと機能的に結合させるか又は機能的に組み合わせることを意味する。これは、人工核酸分子又はベクターと3’−UTRエレメント及び/又は5’−UTRエレメント、好ましくは、上記3’−UTRエレメント及び/又は5’−UTRエレメントとを、3’−UTRエレメント及び/又は5’−UTRエレメントの機能(例えば、RNA及び/又はタンパク質の産生を延長及び/又は増加させる機能)が発揮されるように結合又はカップリングさせることを意味する。典型的に、これは、3’−UTRエレメント及び/又は5’−UTRエレメントが、人工核酸分子又はベクター(好ましくは、mRNA分子)の、オープンリーディングフレームのそれぞれ3’側及び/又は5’側、好ましくはオープンリーディングフレームの直ぐ3’側及び/又はオープンリーディングフレームの直ぐ5’側に組み込まれ、3’−UTRエレメントは、好ましくはオープンリーディングフレームとポリ(A)配列又はポリアデニル化シグナルとの間に組み込まれることを意味する。好ましくは、3’−UTRエレメント及び/又は5’−UTRエレメントは、人工核酸分子又はベクター(好ましくは、mRNA)に、任意で短いリンカー(例えば、1以上の制限酵素部位を含むか又はからなる配列)を介して連結されている、それぞれ3’−UTR及び/又は5’−UTRとして、即ち、前記3’−UTRエレメント及び/又は5’−UTRエレメントが、前記人工核酸分子又はベクター(好ましくは、mRNA)のそれぞれ3’−UTR及び/又は5’−UTRになるように、即ち、5’−UTRがORFの5’末端の直前で終わり、3’−UTRがオープンリーディングフレームの3’側からポリ(A)配列又はポリアデニル化シグナルの5’側まで延在するように組み込まれる。したがって、好ましくは、用語「人工核酸分子又はベクターと3’−UTRエレメント及び/又は5’−UTRエレメントとを結合させる」とは、人工核酸分子又はベクター(好ましくは、mRNA分子)内に位置するオープンリーディングフレームと3’−UTRエレメント及び/又は5’−UTRエレメントとを機能的に結合させることを意味する。3’−UTR及び/又は5’−UTR並びにORFは、本発明に係る人工核酸分子について上記した通りであり、例えば、好ましくは、それぞれORFと3’−UTRとは異種である及び/又はORFと5’−UTRとは異種であり、例えば、上記の通り異なる遺伝子に由来する。3’−UTRエレメント及び/又は5’−UTRエレメントとの結合は、個々のエレメントのデノボ結合によって、又は既存の核酸(テンプレート)を改変することによって行うことができる。後者の場合、例えば、例示目的のために、(i)テンプレートとして図1Aに示す配列に対応する核酸を使用し、(ii)(a)下線付5’−UTRエレメント(図1A中一重下線付)又は(b)3’−UTRエレメント(図1A中二重下線付)のうちの少なくとも1つを(a)異なる5’−UTRエレメント又は(b)異なる3’−UTRエレメントで置換することによって前記テンプレートを改変し、それによって、人工核酸分子を前記5’−UTRエレメント又は3’−UTRエレメントと結合させることにより、本発明に係る核酸分子を得ることができる。
更なる態様においては、本発明は、3’−UTRエレメント及び/又は5’−UTRエレメント、好ましくは、上記3’−UTRエレメント及び/又は上記5’−UTRエレメントの、人工核酸分子からの、好ましくはmRNA分子又はベクターからのタンパク質産生を増加及び/又は延長させるための使用を提供し、3’−UTRエレメント及び/又は5’−UTRエレメントは、ZNF460、TGM2、IL7R、BGN、TK1、RAB3B、CBX6、FZD2、COL8A1、NDUFS7、PHGDH、PLK2、TSPO、PTGS1、FBXO32、NID2、ATP5D、EXOSC4、NOL9、UBB4B、VPS18、ORMDL2、FSCN1、TMEM33、TUBA4A、EMP3、TMEM201、CRIP2、BRAT1、SERPINH1、CD9、DPYSL2、CDK9、TFRC、PSMB3 5’−UTR、FASN、PSMB6、PRSS56、KPNA6、SFT2D2、PARD6B、LPP、SPARC、SCAND1、VASN、SLC26A1、LCLAT1、FBXL18、SLC35F6、RAB3D、MAP1B、VMA21、CYBA、SEZ6L2、PCOLCE、VTN、ALDH16A1、RAVER1、KPNA6、SERINC5、JUP、CPN2、CRIP2、EPT1、PNPO、SSSCA1、POLR2L、LIN7C、UQCR10、PYCRL、AMN、MAP1S、NDUFS7、PHGDH、TSPO、ATP5D、EXOSC4、TUBB4B、TUBA4A、EMP3、CRIP2、BRAT1、CD9、CDK9、PSMB3、PSMB6、PRSS56、SCAND1、AMN、CYBA、PCOLCE、MAP1S、VTN、ALDH16A1(いずれも好ましくはヒト)及びDpysl2、Ccnd1、Acox2、Cbx6、Ubc、Ldlr、Nudt22、Pcyox1l、Ankrd1、Tmem37、Tspyl4、Slc7a3、Cst6、Aacs、Nosip、Itga7、Ccnd2、Ebp、Sf3b5、Fasn、Hmgcs1、Osr1、Lmnb1、Vma21、Kif20a、Cdca8、Slc7a1、Ubqln2、Prps2、Shmt2、Aurkb、Fignl1、Cad、Anln、Slfn9、Ncaph、Pole、Uhrf1、Gja1、Fam64a、Kif2c、Tspan10、Scand1、Gpr84、Fads3、Cers6、Cxcr4、Gprc5c、Fen1、Cspg4、Mrpl34、Comtd1、Armc6、Emr4、Atp5d、1110001J03Rik、Csf2ra、Aarsd1、Kif22、Cth、Tpgs1、Ccl17、Alkbh7、Ms4a8a、Acox2、Ubc、Slpi、Pcyox1l、Igf2bp1、Tmem37、Slc7a3、Cst6、Ebp、Sf3b5、Plk1、Cdca8、Kif22、Cad、Cth、Pole、Kif2c、Scand1、Gpr84、Tpgs1、Ccl17、Alkbh7、Ms4a8a、Mrpl34、Comtd1、Armc6、Atp5d、1110001J03Rik、Nudt22、Aarsd1(いずれも好ましくはマウス)からなる群;好ましくは、ZNF460−5’−UTR、TGM2−5’−UTR、IL7R−5’−UTR、BGN−5’−UTR、TK1−5’−UTR、RAB3B−5’−UTR、CBX6−5’−UTR、FZD2−5’−UTR、COL8A1−5’−UTR、NDUFS7−5’−UTR、PHGDH−5’−UTR、PLK2−5’−UTR、TSPO−5’−UTR、PTGS1−5’−UTR、FBXO32−5’−UTR、NID2−5’−UTR、ATP5D−5’−UTR、EXOSC4−5’−UTR、NOL9−5’−UTR、UBB4B−5’−UTR、VPS18−5’−UTR、ORMDL2−5’−UTR、FSCN1−5’−UTR、TMEM33−5’−UTR、TUBA4A−5’−UTR、EMP3−5’−UTR、TMEM201−5’−UTR、CRIP2−5’−UTR、BRAT1−5’−UTR、SERPINH1−5’−UTR、CD9−5’−UTR、DPYSL2−5’−UTR、CDK9−5’−UTR、TFRC−5’−UTR、PSMB3 5’−UTR、FASN−5’−UTR、PSMB6−5’−UTR、PRSS56−5’−UTR、KPNA6−5’−UTR、SFT2D2−5’−UTR、PARD6B−5’−UTR、LPP−5’−UTR、SPARC−5’−UTR、SCAND1−5’−UTR、VASN−5’−UTR、SLC26A1−5’−UTR、LCLAT1−5’−UTR、FBXL18−5’−UTR、SLC35F6−5’−UTR、RAB3D−5’−UTR、MAP1B−5’−UTR、VMA21−5’−UTR、CYBA−5’−UTR、SEZ6L2−5’−UTR、PCOLCE−5’−UTR、VTN−5’−UTR、ALDH16A1−5’−UTR、RAVER1−5’−UTR、KPNA6−5’−UTR、SERINC5−5’−UTR、JUP−5’−UTR、CPN2−5’−UTR、CRIP2−5’−UTR、EPT1−5’−UTR、PNPO−5’−UTR、SSSCA1−5’−UTR、POLR2L−5’−UTR、LIN7C−5’−UTR、UQCR10−5’−UTR、PYCRL−5’−UTR、AMN−5’−UTR、MAP1S−5’−UTR(いずれも好ましくはヒト)及びDpysl2−5’−UTR、Ccnd1−5’−UTR、Acox2−5’−UTR、Cbx6−5’−UTR、Ubc−5’−UTR、Ldlr−5’−UTR、Nudt22−5’−UTR、Pcyox1l−5’−UTR、Ankrd1−5’−UTR、Tmem37−5’−UTR、Tspyl4−5’−UTR、Slc7a3−5’−UTR、Cst6−5’−UTR、Aacs−5’−UTR、Nosip−5’−UTR、Itga7−5’−UTR、Ccnd2−5’−UTR、Ebp−5’−UTR、Sf3b5−5’−UTR、Fasn−5’−UTR、Hmgcs1−5’−UTR、Osr1−5’−UTR、Lmnb1−5’−UTR、Vma21−5’−UTR、Kif20a−5’−UTR、Cdca8−5’−UTR、Slc7a1−5’−UTR、Ubqln2−5’−UTR、Prps2−5’−UTR、Shmt2−5’−UTR、Aurkb−5’−UTR、Fignl1−5’−UTR、Cad−5’−UTR、Anln−5’−UTR、Slfn9−5’−UTR、Ncaph−5’−UTR、Pole−5’−UTR、Uhrf1−5’−UTR、Gja1−5’−UTR、Fam64a−5’−UTR、Kif2c−5’−UTR、Tspan10−5’−UTR、Scand1−5’−UTR、Gpr84−5’−UTR、Fads3−5’−UTR、Cers6−5’−UTR、Cxcr4−5’−UTR、Gprc5c−5’−UTR、Fen1−5’−UTR、Cspg4−5’−UTR、Mrpl34−5’−UTR、Comtd1−5’−UTR、Armc6−5’−UTR、Emr4−5’−UTR、Atp5d−5’−UTR、1110001J03Rik−5’−UTR、Csf2ra−5’−UTR、Aarsd1−5’−UTR、Kif22−5’−UTR、Cth−5’−UTR、Tpgs1−5’−UTR、Ccl17−5’−UTR、Alkbh7−5’−UTR、Ms4a8a−5’−UTR(いずれも好ましくはマウス);及びNDUFS7−3’−UTR、PHGDH−3’−UTR、TSPO−3’−UTR、ATP5D−3’−UTR、EXOSC4−3’−UTR、TUBB4B−3’−UTR、TUBA4A−3’−UTR、EMP3−3’−UTR、CRIP2−3’−UTR、BRAT1−3’−UTR、CD9−3’−UTR、CDK9−3’−UTR、PSMB3−3’−UTR、PSMB6−3’−UTR、PRSS56−3’−UTR、SCAND1−3’−UTR、AMN−3’−UTR、CYBA−3’−UTR、PCOLCE−3’−UTR、MAP1S−3’−UTR、VTN−3’−UTR、ALDH16A1−3’−UTR(いずれも好ましくはヒト)及びAcox2−3’−UTR、Ubc−3’−UTR、Slpi−3’−UTR、Pcyox1l−3’−UTR、Igf2bp1−3’−UTR、Tmem37−3’−UTR、Slc7a3−3’−UTR、Cst6−3’−UTR、Ebp−3’−UTR、Sf3b5−3’−UTR、Plk1−3’−UTR、Cdca8−3’−UTR、Kif22−3’−UTR、Cad−3’−UTR、Cth−3’−UTR、Pole−3’−UTR、Kif2c−3’−UTR、Scand1−3’−UTR、Gpr84−3’−UTR、Tpgs1−3’−UTR、Ccl17−3’−UTR、Alkbh7−3’−UTR、Ms4a8a−3’−UTR、Mrpl34−3’−UTR、Comtd1−3’−UTR、Armc6−3’−UTR、Atp5d−3’−UTR、1110001J03Rik−3’−UTR、Nudt22−3’−UTR、Aarsd1−3’−UTR(いずれも好ましくはマウス)からなる群から選択される遺伝子の転写物の3’−UTR及び/又は5’−UTRに由来する核酸配列を含むか又はからなる。
本発明に係る使用は、好ましくは、人工核酸分子、ベクター、又はRNAと上記3’−UTRエレメント及び/又は上記5’−UTRエレメントとを結合させることを含む。
本発明の医薬組成物の化合物及び成分は、互いに独立して製造及び取引されていてもよい。したがって、本発明は、更に、本発明に係る人工核酸分子、本発明に係るベクター、本発明に係る細胞、及び/又は本発明に係る医薬組成物を含むキット又はキットオブパーツに関する。好ましくは、かかるキット又はキットオブパーツは、更に、使用説明書と、トランスフェクション用の細胞と、アジュバントと、医薬組成物の投与手段と、人工核酸分子、ベクター、細胞、又は医薬組成物を溶解又は希釈するための薬学的に許容できる担体及び/又は薬学的に許容できる溶液とを含んでいてよい。
3’−非翻訳領域エレメント(3’−UTRエレメント)及び/又は5’−非翻訳領域エレメント(5’−UTRエレメント)を同定する方法
更なる態様では、本発明は、3’−非翻訳領域エレメント(3’−UTRエレメント)及び/又は5’−非翻訳領域エレメント(5’−UTRエレメント)を同定する方法であって、
a)mRNAの安定性を分析する工程であって、以下のサブ工程:
i. 前記mRNAの分解プロセス中の第1の時点における前記mRNAの量を測定する工程、
ii. 前記mRNAの分解プロセス中の第2の時点における前記mRNAの量を測定する工程、及び
iii. 工程(i)において測定された前記mRNAの量の工程(ii)において測定された前記mRNAの量に対する比を計算する工程
を含む工程と、
b)サブ工程(iii)において計算された比が、少なくとも0.5(50%)、少なくとも0.6(60%)、少なくとも0.7(70%)、少なくとも0.75(75%)、少なくとも0.8(80%)、少なくとも0.85(85%)、少なくとも0.9(90%)、又は少なくとも0.95(95%)である安定なmRNAを選択する工程と、
c)前記安定なmRNAの3’−UTRエレメント及び/又は5’−UTRエレメントのヌクレオチド配列を決定する工程と
を含む方法を提供する。
したがって、mRNAの安定性は、好ましくは、標準的な条件下、例えば、用いられる特定の細胞株又は細胞型について標準的な条件(標準的な培地、インキュベーション等)下で評価される。
mRNAの安定性を分析するために、前記mRNAの分解プロセス中の第1及び第2の時点における前記mRNAの量又は濃度を求めることによってこのmRNAの分解プロセスを評価する(工程a)i.及びa)ii.を参照)。
インビボ又は上に定義したインビトロ(即ち、インビトロとは、特に、(「生」)細胞及び/又は組織(生体の組織を含む)を指し、細胞としては、特に、細胞株、初代細胞、組織又は被験体における細胞が挙げられ、哺乳類細胞(例えば、ヒト細胞及びマウス細胞)が好ましく、ヒト細胞株HeLa、HEPG2、及びU−937並びにマウス細胞株NIH3T3、JAWSII、及びL929が特に好ましく用いられ、更に、初代細胞が特に好ましく、特に好ましい実施形態では、ヒト皮膚線維芽細胞(HDF)である)におけるRNA分解プロセス中のmRNAの量又は濃度を求めるために、当業者に公知の様々な方法を用いてよい。かかる方法の非限定的な例としては、例えば、アクチノマイシンD等の転写阻害剤を用いる転写の全体的な阻害、一時的転写を特異的に促進するための誘導性プロモータ(例えば、c−fos血清誘導性プロモータ系及びTet−off制御性プロモータ系)の使用、及び動的標識技術(例えば、パルス標識)が挙げられる。
例えば、インビボ又は上に定義したインビトロにおいてRNA分解プロセス中のmRNAの量又は濃度を測定するために工程a)で転写阻害剤媒介転写停止を用いる場合、アクチノマイシンD(ActD)、5,6−ジクロロ−1−D−リボフラノシル−ベンズイミダゾール(DRB)、又は−アマニチン(α−Am)等の転写阻害剤を用いてよい。その結果、mRNAの分解を評価するために、通常、転写阻害剤を細胞に添加し、それによって、転写が全体的に阻害され、進行中の転写に干渉することなしにRNA分解を観察することができる。
或いは、工程a)において一時的転写を特異的に促進するための誘導性プロモータを用いてもよく、この理論的根拠は、転写を活性化し且つmRNA合成の突発的増加を導く刺激を提供し、次いで、前記刺激を除去して転写を停止させ、mRNAの分解をモニタリングすることである。したがって、誘導性プロモータによってストリンジェントな制御が可能になり、その結果、狭い時間枠内で転写の誘導及びサイレンシングが達成される。哺乳類細胞では、cfosプロモータがこの目的のために有益であることが知られているが、その理由は、急速に且つ一時的に血清添加に応答して誘導され得るので、転写の一時的な突発的増加を達成する信頼できる簡単な方法が得られるためである。Tet−offプロモータ系は、哺乳類細胞においてmRNAのターンオーバーについて調べるために転写パルシングアプローチの用途を更に広げる別の選択肢を提供する。
しかし、本発明では、インビボ又は上に定義したインビトロにおけるRNA分解プロセス中のmRNAの量を測定するために、工程a)において動的標識技術が好ましい。動的標識では、RNAは通常標識され、標識としては、特に、標識されたヌクレオチド及び標識されたヌクレオシド及び標識されたウリジン及び標識されたウラシルが特に好ましい。好ましい標識の例としては、4−チオウリジン(4sU)、2−チオウリジン、6−チオグアノシン、5−エチニルウリジン(EU)、5−ブロモ−ウリジン(BrU)、ビオチン−16−アミノアリルウリジン、5−アミノアリルウリジン、5−アミノアリルシチジン等が挙げられ、4−チオウリジン(4sU)、5−エチニルウリジン(EU)、又は5’−ブロモ−ウリジン(BrU)がより好ましい。4−チオウリジン(4sU)が特に好ましい。4−チオウリジン(4sU)は、好ましくは、100μM〜500μMの濃度で用いられる。更に、例えば、ウリジン−3Hを用いる放射活性標識ヌクレオチドを用いてもよい。また、上述の標識されたヌクレオチドの組合せを用いてもよく、4−チオウリジンと6−チオグアノシンとの組合せが特に好ましい。
動的標識では、通常、例えば標識されたウリジン又はウラシルを転写中に取り込むことによって、生成されるRNAを標識する。少し間を置いて、標識の供給を停止し、次いで、特異的に標識されたRNAを評価することによって転写を全体的に阻害することなしにRNA分解を観察することができる。
工程a)においてRNA分解プロセス中にmRNAの量を測定するためには、パルス標識が好ましく、パルスチェイス法が特に好ましい。本明細書で使用するとき、用語「パルス標識」とは、生細胞内の化合物の合成及び/又は分解の速度を測定するために標識(例えば、上記標識)を用いる技術を指す。典型的には、短時間少量の標識に細胞を曝露するので、「パルス」という用語が用いられる。パルスチェイス法では、パルス標識後、通常、「パルス」に対応する遥かに多量の標識されていない化合物(例えば、標識されたウリジンをパルスとして用いる場合、標識されていないウリジン)を、必要な標識への曝露時間後に添加する。標識された化合物と標識されていない化合物との間の競合の効果によって、標識された化合物の更なる取り込みが無視できるレベルまで低下するので、「チェイス」という用語が用いられる。
mRNAの量又は濃度を測定するためには、通常、mRNAを単離しなければならない。RNAを単離するための様々な技術が当業者に知られており、例えば、チオシアン酸グアニジン−フェノール−クロロホルム抽出又はシリカカラムベースの抽出による。また、Qiagen製のRNeasy Kit等の市販されているキットを用いてもよい。
更に、(転写が全体的に阻害されるので、全RNAが「分解されている」RNAとなる転写阻害剤とは対照的に)特に動的標識を用いる場合、抽出工程が必要になる場合がある。抽出工程では、全単離RNAから標識RNA(即ち、「分解されている」RNAを表す)を抽出する。したがって、抽出の手段は、用いられる標識に依存して選択してよい。例えば、標識に対する抗体を用いる免疫精製を用いてよい。
更に、例えば、チオ標識(例えば、4−チオウリジン(4sU)標識)されたRNAを抽出する場合、HPDP−ビオチン(切断可能な(可逆的)ジスルフィド結合を介してコンジュゲートするピリジルジチオール活性化スルフヒドリル反応性ビオチン化試薬)を単離された「全RNA」と共にインキュベートしてよい。この試薬は、4−チオウリジン(4sU)標識されたRNAにおける還元チオール(−SH)と特異的に反応して、可逆的ジスルフィド結合を形成する。ビオチン化によって、チオ標識(例えば、4−チオウリジン(4sU)標識)されたRNAがストレプトアビジンに結合できるようになり、したがって、ジチオスレイトール又はベータ−メルカプトエタノール(又は任意の他の還元剤)でジスルフィド結合を還元することによって全RNAから抽出することができる。
ビオチン標識されたヌクレオチド(例えば、ビオチン−16−アミノアリルウリジン)の場合、ストレプトアビジンを直接用いて全RNAから標識RNAを抽出することができる。
例えば、新たに転写される5−エチニルウリジン(EU)標識された細胞RNAを全RNAから抽出するために、銅触媒環付加反応におけるEUのビオチン化(クリックケミストリーと称されることが多い)を使用してよく、この後、ストレプトアビジン親和性によって精製する。この方法は、Click−iT Nascent RNA Capture Kit(カタログ番号C10365、Invitrogen)として市販されている。このキットの製造業者による説明書では、EU用量0.5mMの場合は30分間〜60分間、又はEU用量0.1mM若しくは0.2mMの場合は1時間〜24時間のパルス標識時間が推奨されている。
例えば、BrU標識されたRNA分子は、抗ブロモデオキシウリジン抗体(例えば、Clone.2B1、カタログ番号MI−11−3、MBL)及びプロテインGセファロースを用いる免疫精製によって抽出してよい。
次いで、当業者に公知の様々な方法によって、mRNAの量又は濃度、即ち、転写レベルを測定してよい。かかる方法の非限定的な例としては、マイクロアレイ解析、ノーザンブロット解析、定量PCR、又は次世代シーケンシング(ハイスループットシーケンシング)が挙げられる。マイクロアレイ解析及び次世代シーケンシングが特に好ましい。更に、全ゲノムアプローチ/全トランスクリプトームアプローチ、例えば、マイクロアレイ解析では、全ゲノムマイクロアレイ解析(例えば、Affymetrix Human Gene 1.0ST若しくは2.0ST又はAffymetrix Mouse Gene 1.0ST若しくは2.0ST)又は次世代シーケンシングによる全トランスクリプトーム解析が特に好ましい。
工程a)のサブ工程i.及びii.では、mRNAの分解プロセス中の第1及び第2の時点におけるmRNAの量を測定する。典型的には、これは、特にmRNAの分解プロセス中の第1及び第2の時点においてmRNAを単離して、それぞれの量を測定することを意味する。したがって、「第1の時点」及び「第2の時点」は、特に、RNAを単離してRNA量を測定する、RNA分解プロセス中の時点である。一般的に、「第2の時点」は、RNA分解プロセスにおいて「第1の時点」よりも後である。
好ましくは、第1の時点は、mRNAが分解プロセスのみを受けていると考えられる、即ち、例えば、進行中の転写において、mRNAの出現が回避されるように選択される。例えば、動的標識技術(例えば、パルス標識)を用いる場合、第1の時点は、好ましくは、標識のmRNAへの取り込みが完了している、即ち、標識のmRNAへの取り込みが進行中ではないように選択される。したがって、動的標識を用いる場合、第1の時点は、実験的標識手順の終了、例えば、細胞と標識とのインキュベーションの終了の少なくとも10分間後、少なくとも20分間後、少なくとも30分間後、少なくとも40分間後、少なくとも50分間後、少なくとも60分間後、少なくとも70分間後、少なくとも80分間後、又は少なくとも90分間後であってよい。
例えば、第1の時点は、好ましくは、(例えば、転写阻害剤による)転写の停止、誘導性プロモータの場合はプロモータ誘導の停止、又はパルス若しくは標識の供給の停止(例えば、標識の終了)の0時間後〜6時間後であってよい。より好ましくは、第1の時点は、(例えば、転写阻害剤による)転写の停止、誘導性プロモータの場合はプロモータ誘導の停止、又はパルス若しくは標識の供給の停止(例えば、標識の終了)の30分間後〜5時間後、更により好ましくは1時間後〜4時間後、特に好ましくは3時間後であってよい。
好ましくは、第2の時点は、mRNA分解プロセス中においてできる限り遅くなるように選択される。しかし、複数のmRNA種を考慮する場合、第2の時点は、好ましくは、相当量の複数のmRNA種、好ましくは、mRNA種の少なくとも10%が依然として検出可能な量、即ち、0よりも多い量で存在するように選択される。好ましくは、第2の時点は、(例えば、転写阻害剤による)転写の停止、誘導性プロモータの場合はプロモータ誘導の停止、又はパルス若しくは標識の供給の停止(例えば、標識の終了)の少なくとも5時間後、少なくとも6時間後、少なくとも7時間後、少なくとも8時間後、少なくとも9時間後、少なくとも10時間後、少なくとも11時間後、少なくとも12時間後、少なくとも13時間後、少なくとも14時間後、又は少なくとも15時間後である。
例えば、第2の時点は、好ましくは、(例えば、転写阻害剤による)転写の停止、誘導性プロモータの場合はプロモータ誘導の停止、又はパルス若しくは標識の供給の停止(例えば、標識の終了)の3時間後〜48時間後であってよい。より好ましくは、第2の時点は、(例えば、転写阻害剤による)転写の停止、誘導性プロモータの場合はプロモータ誘導の停止、又はパルス若しくは標識の供給の停止(例えば、標識の終了)の6分間後〜36時間後、更により好ましくは10時間後〜24時間後、特に好ましくは約15時間後であってよい。
したがって、第1の時点と第2の時点との時間間隔は、上記限度内でできる限り大きいことが好ましい。したがって、第1の時点と第2の時点との時間間隔は、好ましくは、少なくとも4時間、少なくとも5時間、少なくとも6時間、少なくとも7時間、少なくとも8時間、少なくとも9時間、少なくとも10時間、少なくとも11時間、又は少なくとも12時間であり、約12時間の時間間隔が特に好ましい。一般的に、第2の時点は、第1の時点よりも少なくとも10分間遅い。
工程a)のサブ工程iii.では、工程(i)において測定されたmRNAの量の工程(ii)において測定されたmRNAの量に対する比を計算する。この目的のために、第2の時点において上記の通り測定したmRNAの量(転写物レベル)を第1の時点において上記の通り測定したmRNAの量(転写物レベル)で除する。この比は、第1の時点では非常に少量でしか存在してしない安定なmRNAが、大量に存在するmRNAに対して無視されることを防ぐ。
工程b)では、工程(a)のサブ工程(iii)において計算された比が少なくとも0.5(50%)、少なくとも0.6(60%)、少なくとも0.7(70%)、少なくとも0.75(75%)、少なくとも0.8(80%)、少なくとも0.85(85%)、少なくとも0.9(90%)、又は少なくとも0.95(95%)である安定なmRNAを選択する。かかるmRNAは、本発明において、特定の安定なmRNAであると考えられる。
工程c)では、前記mRNA、即ち、工程b)で選択されたmRNAの3’−UTRエレメント及び/又は5’−UTRエレメントのヌクレオチド配列を決定する。この目的のために、例えば、シーケンシング又は例えばNCBI(国立バイオテクノロジー情報センター)等の公的に利用可能なデータベースからの選択等の当業者に公知の様々な方法を適用してよい。例えば、工程b)で選択されたmRNAのmRNA配列をデータベースでサーチし、次いで、データベース中に存在するmRNA配列から3’−UTR及び/又は5’−UTRを抽出してよい。
特に、3’−非翻訳領域エレメント(3’−UTRエレメント)及び/又は5’−非翻訳領域エレメント(5’−UTRエレメント)を同定する上記方法では、用語「mRNA」及び/又は「安定なmRNA」とは、それぞれ、本明細書に定義するmRNA種及び/又は安定なmRNA種を指し得る。
更に、本明細書では、「安定なmRNA」は、好ましくはインビボ又は上に定義したインビトロにおいて評価した平均mRNA分解と比べてmRNA分解が緩徐であり得ることが好ましい。したがって、「平均mRNA分解」は、複数のmRNA種のmRNA分解を調べることによって評価し得る。
したがって、本明細書において、更なる態様では、3’−非翻訳領域エレメント(3’−UTRエレメント)及び/又は5’−非翻訳領域エレメント(5’−UTRエレメント)を同定する方法であって、
a)複数のmRNA種の安定性を分析する工程であって、以下のサブ工程:
i. 前記mRNA種の分解プロセス中の第1の時点における前記複数のmRNA種の各mRNA種の量を測定する工程、
ii. 前記mRNA種の分解プロセス中の第2の時点における前記複数のmRNA種の各mRNA種の量を測定する工程、及び
iii. 前記複数のmRNA種の各mRNA種について、工程(i)において測定された前記mRNA種の量の工程(ii)において測定された前記mRNA種の量に対する比を計算する工程
を含む工程と、
b)各mRNA種について、サブ工程(iii)において計算された比に従って前記複数のmRNA種のmRNA種を順位付けする工程と、
c)サブ工程(iii)において計算された1つ又は複数の最高比を有する1以上のmRNAを選択する工程と、
d)前記mRNAの3’−UTRエレメント及び/又は5’−UTRエレメントのヌクレオチド配列を決定する工程と
を含む方法を提供する。
「mRNA種」とは、本明細書で使用するとき、ゲノム転写単位、即ち、通常遺伝子に対応する。したがって、例えば、mRNAのプロセシングに起因して、1つの「mRNA種」内に異なる転写物が生じる場合がある。例えば、mRNA種は、マイクロアレイ上のスポットによって表すことができる。したがって、マイクロアレイは、例えば、mRNA分解中の特定の時点において複数のmRNA種の量を測定するのに好都合なツールを提供する。しかし、当業者に公知の他の技術、例えば、RNA−seq(全トランスクリプトームショットガンシーケンシングとも呼ばれる、所与の瞬間におけるゲノムからRNAの存在及び量のスナップショットを明らかにするために次世代シーケンシングの能力を使用する技術)、定量PCR等を用いてもよい。
好ましくは、「複数のmRNA種」とは、少なくとも100、少なくとも300、少なくとも500、少なくとも1,000、少なくとも2,000、少なくとも3,000、少なくとも4,000、少なくとも5,000、少なくとも6,000、少なくとも7,000、少なくとも8,000、少なくとも9,000、少なくとも10,000、少なくとも11,000、少なくとも12,000、少なくとも13,000、少なくとも14,000、少なくとも15,000、少なくとも16,000、少なくとも17,000、少なくとも18,000、少なくとも19,000、少なくとも20,000、少なくとも21,000、少なくとも22,000、少なくとも23,000、少なくとも24,000、少なくとも25,000、少なくとも26,000、少なくとも27,000、少なくとも28,000、少なくとも29,000、少なくとも30,000のmRNA種を指す。トランスクリプトーム全体を評価するか、又はトランスクリプトームのうちのできる限り多くのmRNA種を評価することが特に好ましい。これは、例えば、トランスクリプトーム全体を網羅するマイクロアレイを用いることによって行うことができる。
サブ工程i.〜iii.を含むこの方法の工程a)は、第1及び第2の時点において複数のmRNA種の各mRNA種の量を測定し、各mRNA種についての比を計算することのみを除いて、既に記載した本発明の方法のサブ工程i.〜iii.を含む工程a)と本質的に一致する。したがって、上に概説した詳細な方法及び好ましい実施形態がここでも適用され、更に、単一のmRNA種(及びそれぞれ、各単一のmRNA種)についての比は、「mRNA」について上に概説した通り決定してよい。
しかし、上記方法とは対照的に、mRNAの安定性は、比の絶対値ではなく、各mRNA種について工程a)のサブ工程(iii)で計算された比による複数のmRNA種のうちのmRNA種の順位によって評価される。サブ工程c)では、次いで、工程a)のサブ工程(iii)で計算された1つ又は複数の最高比を有する1以上のmRNA種を選択する。
この状況では、工程c)において0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%、0.6%、0.7%、0.8%、0.9%、1%、2%、3%、4%、5%、10%、15%、20%の最も安定なmRNAを選択することが特に好ましい。それに代えて又はそれに加えて、工程c)では、分析した全てのmRNA種から計算された平均比の少なくとも100%に対応する、工程a)のサブ工程iii.で計算された比を示すmRNA種を選択してよい。より好ましくは、分析した全てのmRNA種から計算された平均比の少なくとも150%、更により好ましくは少なくとも200%、最も好ましくは少なくとも300%の比を示すmRNA種を選択する。
工程d)では、工程c)において選択されたmRNAの3’−UTRエレメント及び/又は5’−UTRエレメントのヌクレオチド配列を、既に記載した本発明の方法の工程c)について上に記載した通り決定する。
好ましくは、本発明に係る3’−UTRエレメント及び/又は5’−UTRエレメントを同定する上記方法の両方において、第1の時点と第2の時点との間の時間間隔は、少なくとも5時間、好ましくは少なくとも6時間、好ましくは少なくとも7時間、より好ましくは少なくとも8時間、より好ましくは少なくとも9時間、更により好ましくは少なくとも10時間、更により好ましくは少なくとも11時間、特に好ましくは少なくとも12時間である。
好ましくは、本発明に係る3’−UTRエレメント及び/又は5’−UTRエレメントを同定する上記方法の両方において、mRNAの安定性は、パルス標識によって、好ましくは、パルスチェイス法を用いて分析される。
3’−非翻訳領域エレメント(3’−UTRエレメント)及び/又は5’−非翻訳領域エレメント(5’−UTRエレメント)を同定する方法
更なる態様では、本発明は、また、人工核酸分子に高い翻訳効率を与える3’−非翻訳領域エレメント(3’−UTRエレメント)及び/又は5’−非翻訳領域エレメント(5’−UTRエレメント)を同定する方法であって、
a) 上記方法のいずれかに従って3’−UTRエレメント及び/又は5’−UTRエレメントを同定する方法によって、安定なmRNAに由来する3’−UTRエレメント及び/又は5’−UTRエレメントを同定する工程と、
b) 少なくとも1つのオープンリーディングフレームと、工程a)において同定された前記3’−UTRエレメント及び/又は前記5’−UTRエレメントに対応するか又は含まれる少なくとも1つの3’−UTRエレメント及び/又は少なくとも1つの5’−UTRエレメントとを含む人工核酸分子を合成する工程と、
c) 工程b)において合成された前記人工核酸分子の前記少なくとも1つのオープンリーディングフレーム(ORF)によってコードされているタンパク質の発現を解析する工程と、
d) 3’−UTRエレメント及び/又は5’−UTRエレメントが欠損しているレファレンス人工核酸分子の少なくとも1つのオープンリーディングフレームによってコードされているタンパク質の発現を解析する工程と、
e) 工程c)において解析した前記人工核酸分子からのタンパク質発現を工程d)において解析した前記レファレンス人工核酸分子からのタンパク質発現と比較する工程と、
f) 工程d)において解析した前記レファレンス人工核酸分子からのタンパク質発現と比較して工程c)において解析した前記人工核酸分子からのタンパク質発現が延長及び/又は増加している場合、前記3’−UTRエレメント及び/又は前記5’−UTRエレメントを選択する工程と
を含む方法を提供する。
この方法では、上記の通り本発明に係る方法によって、まず、3’−UTRエレメント及び/又は5’−UTRエレメントを同定する。これによって、当業者に公知の方法、例えば、PCR増幅によって3’−UTRエレメント及び/又は5’−UTRエレメントを合成することができるようになる。かかるPCRに用いられるプライマーは、好ましくは、クローニングのための制限酵素部位を含んでいてよい。或いは、例えば、化学合成又はオリゴアニーリングによって3’−UTRエレメント及び/又は5’−UTRエレメントを合成してもよい。したがって、工程b)において、少なくとも1つのオープンリーディングフレームと、工程a)で同定された3’−UTRエレメント及び/又は5’−UTRエレメントに対応するか又は含まれている少なくとも1つの3’−UTRエレメント及び/又は少なくとも1つの5’−UTRエレメントとを含む人工核酸分子が合成される。特に、少なくとも1つの3’−UTRエレメント及び/又は少なくとも1つの5’−UTRエレメントは、通常、オープンリーディングフレームと組み合わせられ、その結果、3’−UTRエレメント及び/又は5’−UTRエレメントがそれぞれの要件を満たす場合、即ち、タンパク質発現を延長及び/又は増加させる場合、本発明に係る3’−UTRエレメント及び/又は5’−UTRエレメントを含む人工核酸分子が得られる。これを試験するために、それぞれのORFからのタンパク質発現を評価するために、工程a)で同定される3’−UTRエレメント及び/又は5’−UTRエレメント、又はそれぞれのPCR断片若しくは合成配列を特定のベクター、好ましくは、発現ベクターにクローニングしてよい。
次いで、少なくとも1つの3’−UTRエレメント及び/又は少なくとも1つの5’−UTRエレメントを含む人工核酸分子からのタンパク質発現を、本明細書に記載の通り工程c)において評価し、工程e)において本明細書に記載した通り3’−UTRエレメント及び/又は5’−UTRエレメントが欠損しているそれぞれのレファレンス人工核酸分子からの工程d)で評価したタンパク質発現と比較する。
その後、工程f)において、工程d)で分析したレファレンス人工核酸分子からのタンパク質発現と比べて工程c)で分析した人工核酸分子からのタンパク質産生を増加させる3’−UTRエレメント及び/又は5’−UTRエレメントを選択する。本発明の核酸分子のタンパク質発現のレファレンス人工核酸分子との比較は、本明細書に記載の通り、特に、本発明の人工核酸分子の状況において実施される。
更に、本発明は、人工核酸分子に高い翻訳効率を与える3’−非翻訳領域エレメント(3’−UTRエレメント)及び/又は5’−非翻訳領域エレメント(5’−UTRエレメント)を同定する特に好ましい方法であって、
a) 新たに転写されるRNA分子に取り込ませるために、標識されたヌクレオチドを細胞に供給/細胞と共にインキュベートする(パルスチェイス標識)工程と、
b) 第1の時点及び少なくとも1つの第2の時点において前記細胞の全RNAを単離する工程と、
c) 工程b)で単離された前記全RNAから、標識されたRNA分子を抽出する工程と、
d) 前記標識されたRNAに含まれている様々なmRNA種の量/転写物レベルを測定する工程と、
e) 前記第1の時点において存在するmRNA種の量/転写物レベルに対する前記少なくとも1つの第2の後続時点において存在するmRNA種の量/転写物レベルの比を計算する工程と、
f) 工程e)で求められた前記比に従って前記mRNA種を順位付けする工程と、
g) 最も安定なmRNAを選択する工程と、
h) 工程g)において選択した前記最も安定なmRNAの3’−UTR及び/又は5’−UTRのヌクレオチド配列を決定する工程と、
i)工程h)において決定した前記3’−UTR及び/又は5’−UTRに含まれている3’−UTRエレメント及び/又は5’−UTRエレメントを合成する工程と、
j) 工程i)で合成した前記3’−UTRエレメント及び/又は5’−UTRエレメントをオープンリーディングフレームと組み合わせて、本明細書に記載する本発明に係る核酸を得る工程と、
k) 任意で、本発明の核酸中に存在する前記オープンリーディングフレームの発現を、本明細書に記載する3’−UTRエレメント及び/又は5’−UTRエレメントを有しないレファレンス核酸中に存在するオープンリーディングフレームの発現と比較する工程と
を含む方法を提供する。
したがって、上記本発明の方法について記載した詳細及び好ましい実施形態も、工程a)〜k)において概説したそれぞれの範囲内で、本明細書に適用される。
特に、本発明の方法の工程a)において細胞を供給するためには、以下の標識されたヌクレオチドが好ましい:4−チオウリジン(4sU)、2−チオウリジン、6−チオグアノシン、5−エチニルウリジン(EU)、5−ブロモ−ウリジン(BrU)、ビオチン−16−アミノアリルウリジン、5−アミノアリルウリジン、5−アミノアリルシチジン等。4−チオウリジン(4sU)が特に好ましい。4−チオウリジンは、好ましくは、100μM〜500μMの濃度で用いられる。或いは、例えばウリジン−3H等の放射活性標識ヌクレオチドを用いてもよい。上述の標識されたヌクレオチドの組合せを用いてもよい。4−チオウリジンと6−チオグアノシンとの組合せが特に好ましい。
工程a)における細胞と標識されたヌクレオチドとのインキュベーションは、変動し得る。10分間〜24時間のインキュベーション(供給時間)が特に好ましい。2時間〜6時間が特に好ましく、2時間〜3時間がより好ましい。
本発明の方法のために用いることができる細胞としては、特に、細胞株、初代細胞、組織又は被験体における細胞が挙げられる。特定の実施形態では、細胞培養可能な細胞型が本発明の方法に好適であり得る。哺乳類細胞、例えば、ヒト細胞及びマウス細胞が特に好ましい。特に好ましい実施形態では、ヒト細胞株HeLa、HEPG2、及びU−937、並びにマウス細胞株NIH3T3、JAWSII、及びL929が用いられる。更に、初代細胞が特に好ましく、特に好ましい実施形態では、特にヒト皮膚線維芽細胞(HDF)を用いてよい。或いは、標識されたヌクレオチドを被験体の組織に適用してもよく、インキュベーション時間後、前記組織のRNAを工程c)に従って単離する。
細胞(型)の最も安定なmRNAを決定するために、上記第1の時点、例えば、標識の0時間後〜6時間後、好ましくは標識の3時間後、及び上記第2の後続時点、例えば、標識の3時間後〜48時間後、好ましくは10時間後〜24時間後、最も好ましくは15時間後に全RNAを抽出する。第2の後続時点は、第1の時点よりも少なくとも10分間遅い。
工程f)では、工程e)で計算した比に従ってmRNA種を順位付けする。この状況では、0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%、0.6%、0.7%、0.8%、0.9%、1%、2%、3%、4%、5%、10%、15%、20%の最も安定なmRNA種を選択することが特に好ましい。
この状況では、第1の時点と比べて、第2の後続時点において少なくとも50%(0,5倍)、少なくとも60%(0,6倍)、少なくとも70%(0,7倍)、少なくとも90%(0,9倍)、又は少なくとも95%(0,95倍)のmRNA種の転写物レベル/量を示すmRNA種を選択することが更に好ましい。この実施形態は、標識の3時間後(第1の時点)及び15時間後(第2の時点)にRNAを単離する場合が特に好ましい。
それに代えて又はそれに加えて、分析された全てのmRNA種から計算された平均比の少なくとも100%に対応する、工程e)で計算された比を示すmRNA種を選択する。より好ましくは、分析された全てのmRNA種から計算された平均比の少なくとも150%、より好ましくは少なくとも200%、最も好ましくは少なくとも300%の比を示すmRNA種を選択する。
本発明の方法の更なる工程では、工程g)において選択された最も安定なmRNAの3’−UTR及び/又は5’−UTRのヌクレオチド配列を決定し、工程i)において、例えばPCR増幅によって3’−UTRエレメント及び/又は5’−UTRエレメントを合成する。PCRに用いられるプライマーは、好ましくは、クローニングのための制限酵素部位を含んでいてよい。或いは、(例えば、化学合成又はオリゴアニーリングによって)3’−UTRエレメント及び/又は5’−UTRエレメントを合成してもよい。
本発明の方法の工程j)では、得られたPCR断片又は合成された配列をオープンリーディングフレームと組み合わせて、本発明に係る3’−UTRエレメント及び/又は5’−UTRエレメントを含む人工核酸を得る。好ましくは、PCR断片又は配列をベクターにクローニングしてよい。
特に好ましい実施形態では、本発明は、3’−非翻訳領域エレメント(3’−UTRエレメント)及び/又は5’−非翻訳領域エレメント(5’−UTRエレメント)を同定するための工程a)〜k)を含む方法であって、前記3’−UTRエレメント及び/又は前記5’−UTRエレメントが、前記3’−UTRエレメントのうちの少なくとも1つ及び/又は前記5’−UTRエレメントのうちの少なくとも1つを含む人工核酸分子からのタンパク質産生を延長する方法を提供する。
更なる態様では、本発明は、また、人工核酸分子を作製する方法であって、少なくとも1つのオープンリーディングフレームと、上記の通り本発明に係る3’−UTRエレメント及び/又は5’−UTRエレメントを同定する方法によって同定された少なくとも1つの3’−UTRエレメント及び/又は少なくとも1つの5’−UTRエレメントとを含む前記人工核酸分子を合成する方法を提供する。かかる人工核酸分子の合成は、典型的には、当業者に公知の方法、例えば、一般的に知られているか又は本明細書に記載されているクローニング方法によって実施される。
好ましくは、本明細書に記載する本発明に係るベクターが、人工核酸分子を作製する本発明の方法において用いられる。
好ましくは、かかる人工核酸分子を作製する方法によって作製される人工核酸分子は、本明細書に記載する本発明に係る核酸分子である。
更に、本発明は、また、本明細書に記載する本発明に係る人工核酸分子を作製する方法によって得ることができる人工核酸分子を提供する。
実施例1:候補UTRエレメント
ヒト及びマウスの細胞におけるmRNA発現を実験的に評価した。これによって、それぞれの細胞において発現するmRNAが同定された。mRNA種の5’−及び/又は3’−UTRのヌクレオチド配列をデータベースサーチによって決定し、細胞のトランスクリプトームのハイスループットシークエンシングデータによって確認し、前記データに従って調整し、RCPによって増幅させるか又はオリゴアニーリングによって合成した。
同定されたmRNAはそのネイティブな細胞環境に由来しているので、これらmRNAは野生型mRNAであると理解される:
配列番号1〜72は、野生型ヒト5’−UTRエレメントを表す。
配列番号73〜136は、野生型マウス5’−UTRエレメントを表す。
配列番号152〜173は、野生型ヒト3’−UTRエレメントを表す。
配列番号174〜203は、野生型マウス3’−UTRエレメントを表す。
これらUTRエレメントのうちの幾つかは公知である(例えば、その野生型環境において)が、このアプローチによって、新規5’−UTRエレメント及び新規3’−UTRエレメント、即ち、それぞれヒト細胞及びマウス細胞において発現することが本発明者によって見出されたが、公的データベース(NCBI)からは知られていない5’−UTRエレメント及び3’−UTRエレメントも同定された。
具体的には、配列番号1〜72のヒト5’−UTRエレメントからなる群の中でも、以下の野生型5’−UTRエレメントは、公的データベース(NCBI)から知られている5’−UTRエレメントとは異なっている:配列番号45、配列番号47、配列番号49。
配列番号73〜136のマウス5’−UTRエレメントからなる群の中でも、以下の野生型5’−UTRエレメントは、公的データベース(NCBI)から知られている5’−UTRエレメントとは異なっている:配列番号77、配列番号79、配列番号84、配列番号85、配列番号90、配列番号92、配列番号93、配列番号98、配列番号106、配列番号109、配列番号115、配列番号118、配列番号125、配列番号127、配列番号131、配列番号135。
配列番号174〜203のマウス3’−UTRエレメントからなる群の中でも、以下の野生型3’−UTRエレメントは、公的データベース(NCBI)から知られている3’−UTRエレメントとは異なっている:配列番号179、配列番号180、配列番号182、配列番号183、配列番号197、配列番号200。
新たに同定された5’−UTRエレメント及び新たに同定された3’−UTRエレメントと公知の5’−UTRエレメント及び公知の3’−UTRエレメントとの差を、それぞれ、表1及び2に示す。具体的には、これら新たに同定されたエレメントは、これまで、それぞれ3’−UTRエレメント又は5’−UTRエレメントであると報告されたことがなかった。
人工5’−UTRエレメント及び人工3’−UTRエレメント
一部の場合、人工5’−UTRエレメント及び人工3’−UTRエレメントを調製した。これは、以下の通り、改変されたプライマーを用いるPCRをベースとしたアプローチにおいて、野生型5’−UTRエレメント及び3’−UTRエレメントを改変することによって行った。
(i)5’−UTR配列における幾つかのATGトリプレット(存在する場合)をトリプレットTAGに変換した。(i)更に、特定の制限酵素の特定の切断部位(存在する場合)が後続のクローニング実験に干渉するとみなされた場合、前記特定の切断部位の存在は望ましくなかった。後続のクローニング実験(例えば、実施例2及び3に記載)において使用される制限酵素が野生型3’−UTRエレメント又は5’−UTRエレメントを認識し、切断する場合、野生型配列に存在する切断部位が後続のクローニング実験に干渉するとみなした。5’−UTRエレメント及び3’−UTRエレメントのかかる内部切断は望ましくなかったので、前記特定の制限酵素の切断部位内の1つのヌクレオチドを相補的ヌクレオチドによって置換して前記特定の制限酵素の切断部位を除去することによって、前記特定の制限酵素の切断部位を除去した。
配列番号137(配列番号3に基づく)、配列番号138(配列番号9に基づく)、配列番号139(配列番号14に基づく)、配列番号140−(配列番号17に基づく)、配列番号141(配列番号18に基づく)、配列番号142(配列番号29に基づく)、配列番号143(配列番号31に基づく)、配列番号144(配列番号42に基づく)、配列番号145(配列番号43に基づく)、配列番号146(配列番号52に基づく)、配列番号147(配列番号109に基づく)、配列番号148(配列番号110に基づく)、配列番号149(配列番号119に基づく)、配列番号150(配列番号120に基づく)、及び配列番号151(配列番号136に基づく)は、人工5’−UTRエレメントを表す。配列番号204(配列番号192に基づく)は、人工3’−UTRエレメントを表す。それぞれの野生型配列に対する正確な差を上に示す。
要約すると、配列番号1〜136は、野生型5’−UTR配列とみなすことができ、配列番号137〜151は、人工5’−UTR配列とみなすことができ、配列番号152〜203は、野生型3’−UTR配列とみなすことができ、配列番号204は、人工3’−UTR配列とみなすことができる。
要約すると、この実施例は、(実施例2及び3において以下に記載する)レファレンスUTRエレメントを参照して、翻訳効率に対する相対的な影響についてそれぞれ試験することができる幾つかの5’−UTRエレメント及び3’−UTRエレメント(野生型及び人工)を提供する。
実施例2:レファレンスUTRエレメント及びそれを含むレファレンスコンストラクト
図1Aは、本発明において用いられるレファレンスコンストラクトのRNA配列を示す。図1AのRNA配列に対応するDNA配列を含むインビトロ転写用ベクターも構築した。前記ベクターは、T7プロモータ、32L4(リボソームタンパク質ラージ32)の5’−非翻訳領域(5’−UTR)の人工変異体である、北米ホタル(Photinus pyralis)ルシフェラーゼをコードしているGCリッチ配列(オープンリーディングフレーム、ORF)(PpLuc(GC))、ヒトアルブミン(ALB)の3’−非翻訳領域(3’−UTR)の人工変異体である、albumin7を含有している。A64ポリ(A)配列、それに続いて、C30及びヒストンステムループ配列が、albumin7の3’に存在していた。ヒストンステムループ配列の後には、インビトロ転写前にベクターを線状にするための制限酵素部位が続いていた。
実施例1に示す配列に対応するPCR断片を、図1のRNA配列に対応するDNA配列を含有するベクターに個別にクローニングした。実施例1の野生型配列が5’−UTRにATGトリプレットを含有していた及び/又は5’−UTR若しくは3’−UTRに望ましくない制限酵素部位を含有していた場合、実施例1で同定したそれぞれの人工配列を使用した(例えば、配列番号3の代わりに配列番号137を使用した)。
詳細には、候補5’−UTRエレメントを試験するためのコンストラクトを作製するために、図1A中の一重下線付5’−UTRエレメントを、試験する候補(野生型又は人工)5’−UTRエレメント(実施例1)によって置換し(その例を図1Bに示す);候補3’−UTRエレメントを試験するためのコンストラクトを作製するために、図1A中の二重下線付3’−UTRエレメントを、試験する候補(野生型又は人工)3’−UTRエレメント(実施例1)によって置換した(その例を図1Cに示す)。得られたベクター又はプラスミド(例えば、RNA配列、例えば、図1A〜Cに示すRNAに対応するDNAを含有)をDNAテンプレートと呼ぶこともある。
DNAテンプレートを線状化し、T7−RNAポリメラーゼ(国際公開第2015101416号)を使用してインビトロで転写させた。次いで、DNasa処理によってDNAテンプレートを分解した。mRNA転写物は、過剰のN7−メチル−グアノシン−5’−トリホスファート−5’−グアノシンを転写反応に添加することによって得られた5’−キャップ構造を含有していた。このようにして得られたmRNAを精製し、水に再懸濁させた。このようにして得られた、UTRエレメントを試験するためのmRNAは、レファレンスコンストラクトの5’−UTRエレメント又は3’−UTRエレメントが、試験するそれぞれのUTRエレメントによって置換されていることを除いて、図1Aに示すmRNA(レファレンスコンストラクト)に対応する。
実施例3:レファレンスコンストラクトを参照する候補UTRエレメントの翻訳効率
ヒト起源若しくはマウス起源の5’−UTRエレメント又はヒト起源若しくはマウス起源の3’−UTRエレメントを実験的に試験した。実施例の状況において、「ヒト起源」とは、ヒト野生型配列(例えば、配列番号1)又は1以上の塩基の置換によるヒト野生型配列に基づく人工配列(例えば、配列番号137)のいずれかを意味し得;用語「マウス起源」は、それに応じて使用される。表3及び4の人工配列がどのように野生型配列に基づいているかについての詳細は、実施例1に記載されている。
任意の試験した(5’−又は3’−)UTR(以下の表3及び4)が翻訳効率に対して有益な効果を有するかどうかを実験的に試験した。これは、
(i)哺乳類細胞に人工核酸分子をトランスフェクトし、トランスフェクション後の1つ又は2つの特定の時点(24時間及び48時間)において、人工核酸分子のORFによってコードされているタンパク質の発現量を測定する工程、
(ii)哺乳類細胞にレファレンス核酸分子(図1A)をトランスフェクトし、トランスフェクション後の同じ1つ又は2つの特定の時点(24時間及び48時間)において、レファレンス核酸分子のORFによってコードされているタンパク質の発現量を測定する工程、
(iii)人工核酸分子から発現したタンパク質の量のレファレンス核酸分子から発現したタンパク質の量に対する比を計算する工程
を含む方法によって行い、
(iii)において計算される比は≧1である。
この比は、高い翻訳効率に関連している。
この実施例で実験的試験に付された全てのUTR配列は、「実験的に試験されたUTRエレメント」又は「試験されたUTRエレメント」又は「実験的に試験されたUTR」又は「試験されたUTR」とも称される。
(i)の人工核酸分子は、試験されたUTRエレメントを含んでいた。具体的には、人工核酸分子(mRNA)は、レファレンス核酸分子の5’−UTRエレメント又は3’−UTRエレメントのいずれかが、試験されたUTRエレメントによって置換されていることを除いて(例示的な例については、図1B及び1Cを参照)、レファレンス核酸分子(図1A)と構造的に異なっていなかった。
3.1 ヒト起源のUTRエレメント
実験的試験に付されたヒト起源のUTRエレメントの詳細を以下の表3に示す。実験的試験は、上記及び「コンストラクトの詳細」の項に詳細に記載した通り、レファレンスコンストラクトを参照して実施した。
3.2 マウス起源のUTRエレメント
実験的試験に付されたマウス起源のUTRエレメントの詳細を以下の表4に示す。実験的試験は、上記及び「コンストラクトの詳細」の項に詳細に記載した通り、レファレンスコンストラクトを参照して実施した。
3.3 コンストラクトの詳細
5’−UTRを試験したとき、これは、レファレンスコンストラクト(即ち、32L4−PpLuc(GC)−albumin7−A64−C30−hSL;図1)の5’−UTRを、「試験された」5’−UTR、即ち、野生型5’−UTR配列(表3又は4の最初の列に記載したDNA配列に対応するmRNA配列)又はそれに基づく人工5’−UTR配列(表3又は4の2番目の列に記載したDNA配列に対応するmRNA配列)によって置換することにより行った。レファレンスコンストラクトの他の配列エレメントは、変化していなかった。
次に、3’−UTRを試験したとき、これは、レファレンスコンストラクト(即ち、32L4−PpLuc(GC)−albumin7−A64−C30−hSL;図1)の3’−UTRを、「試験された」3’−UTR、即ち、野生型3’−UTR配列(表3又は4の3番目の列に記載したDNA配列に対応するmRNA配列)又はそれに基づく人工3’−UTR配列(表3又は4の4番目の列に記載したDNA配列に対応するmRNA配列)によって置換することにより行った。レファレンスコンストラクトの他の配列エレメントは、変化していなかった。
3.4. 翻訳効率を決定するためのルシフェラーゼアッセイ
様々な哺乳類(ヒト、マウス)細胞株、即ち、HDF、L929、HepG2、及びHelaを使用する細胞トランスフェクションアッセイにおいて翻訳効率を実験的に試験した(図2〜9を参照)。
ヒト皮膚線維芽細胞(HDF)、L929細胞、HEPG2細胞、及びHeLa細胞を、1×104細胞/ウェルの密度で96ウェルプレートに播種した。次の日、細胞をOpti−MEMで洗浄し、次いで、Opti−MEM中にて、25ng/ウェルのLipofectamine2000と複合体化したPpLucをコードしているmRNAをトランスフェクトした。トランスフェクトしていない細胞は、対照として機能した。トランスフェクション効率についての対照としてウミシイタケ(Renilla reniformis)ルシフェラーゼ(RrLuc)をコードしているmRNAをPpLuc mRNAと共にトランスフェクトした(1ウェル当たりのRrLuc mRNA 1ng)。トランスフェクション開始の90分間後、Opti−MEMを培地に交換した。トランスフェクションの24時間後及び48時間後、培地を吸引し、細胞をPassive Lysisバッファ(Promega)100μLに溶解させた。ルシフェラーゼ活性を測定するまで溶解物を−80℃で保管した。
Hidex Chameleonプレートリーダーにおいて、ルシフェラーゼ活性を相対光単位(RLU)として測定した。デュアルルシフェラーゼアッセイにおいて単一のサンプルからPpluc及びRrlucの活性を逐次測定する。先ず、溶解物20μL及びBeetleジュース(pjk GmbH)50μLを用いて、2秒間の測定時間でPpLuc活性を測定した。1,500msの遅延後、Renillaジュース(pjk GmbH)50μLを用いてRrLuc活性を測定する。
これは96ウェルプレートにおいて実施し、全ての試験されたUTRエレメント(それが含有されているコンストラクトのフレームワークにおける、3.3を参照)を96ウェルプレートの位置に割り当てた。1枚はヒト起源のUTRエレメントを試験するため、そして、1枚はマウス起源のUTRエレメントを試験するために2枚の96ウェルプレートを使用した。各プレートにおいて、G12及びH12の位置は、レファレンスコンストラクト(図1Aに示すmRNA配列に対応する)であった。試験されたUTRエレメントは、それぞれ、表3及び4の最後の列に示す位置であった。例示すると、マウスAarsd1の3’−UTR(配列番号186)を含むコンストラクトは、F12の位置に存在していた(表4を参照)。
細胞のトランスフェクションの24時間後(1d、24h)にルシフェラーゼ活性を測定し、細胞トランスフェクションの48時間後(2d、48h)に再度測定した。
このアッセイの結果を以下の3.5に記載する。
3.5 結果−高い翻訳効率に関連するUTRエレメントの決定
様々な哺乳類細胞株(HDF、L929、HepG2、及びHela)にトランスフェクトした24時間後(1d、24h)及び48時間後(2d、48h)に再度測定したアッセイ(上記3.4を参照)の実験結果を図2〜9に示す。2セットの96ウェルプレートが存在し、1セットはヒト起源のUTRエレメントに関連し、1セットはマウス起源のUTRエレメントに関連することに留意すべきである。
図2〜9は96ウェルプレートにおける特定の位置(例えば、A1)に言及するが、表3及び4は、特定の試験された(5’−又は3’−)UTRエレメントを96ウェルプレートの特定の位置に割り当てる。例えば、試験したヒトUTRエレメントの96ウェルプレートの位置A1では、ZNF460−5’−UTRエレメント(配列番号1)を試験したこと等が表3から分かる。
特に好ましいUTRエレメントの群(「最終選択物」とも呼ばれる)を決定した。この群は、1日(24h)間後に測定した、試験された細胞株のうちの少なくとも1つにおける翻訳効率が、レファレンスコンストラクト(図1A)以上である、好ましくはより優れていることを特徴とする5’−UTRエレメント及び3’−UTRエレメントを含む。この群は、4つの下位群に分類される:(i)ヒト起源の5’−UTRエレメント(表5を参照)、(ii)ヒト起源の3’−UTRエレメント(表6を参照)、(iii)マウス起源の5’−UTRエレメント(表7を参照)、(ii)マウス起源の3’−UTRエレメント(表8を参照)。
したがって、ZNF460−5’−UTR、TGM2−5’−UTR、IL7R−5’−UTR、COL8A1−5’−UTR、NDUFS7−5’−UTR、PLK2−5’−UTR、FBXO32−5’−UTR、ATP5D−5’−UTR、TUBB4B−5’−UTR、ORMDL2−5’−UTR、FSCN1−5’−UTR、CD9−5’−UTR、PYSL2−5’−UTR、PSMB3−5’−UTR、PSMB6−5’−UTR、KPNA6−5’−UTR、SFT2D2−5’−UTR、LCLAT1−5’−UTR、FBXL18−5’−UTR、SLC35F6−5’−UTR、VMA21−5’−UTR、SEZ6L2−5’−UTR、PCOLCE−5’−UTR、VTN−5’−UTR、ALDH16A1−5’−UTR、KPNA6−5’−UTR、JUP−5’−UTR、CPN2−5’−UTR、PNPO−5’−UTR、SSSCA1−5’−UTR、POLR2L−5’−UTR、LIN7C−5’−UTR、UQCR10−5’−UTR、PYCRL−5’−UTR、AMN−5’−UTR、MAP1S−5’−UTRからなる群由来のヒト遺伝子の5’−UTRは、高い翻訳効率に寄与すると考えられる。
また、配列番号1、配列番号2、配列番号137(又はその野生型等価物である配列番号3)、配列番号138(又はその野生型等価物である配列番号9)、配列番号10、配列番号12、配列番号15、配列番号140(又はその野生型等価物である配列番号17)、配列番号20、配列番号22、配列番号23、配列番号143(又はその野生型等価物である配列番号31)、配列番号32、配列番号39、配列番号41、配列番号44、配列番号45、配列番号146−(又はその野生型等価物である配列番号52)、配列番号53、配列番号54、配列番号57、配列番号60、配列番号61、配列番号63、配列番号64、配列番号66、配列番号68、配列番号69、配列番号72、配列番号34、配列番号35、配列番号36、配列番号37、配列番号144(又はその野生型等価物である配列番号42)、配列番号58、配列番号62によって表される5’−UTRは、高い翻訳効率に寄与すると考えられる。
したがって、NDUFS7−3’−UTR、PHGDH−3’−UTR、TSPO−3’−UTR、ATP5D−3’−UTR、EXOSC4−3’−UTR、TUBB4B−3’−UTR、TUBA4A−3’−UTR、EMP3−3’−UTR、CRIP2−3’−UTR、BRAT1−3’−UTR、PSMB3−3’−UTR、PSMB6−3’−UTR、SCAND1−3’−UTR、AMN−3’−UTR、CYBA−3’−UTR、PCOLCE−3’−UTR、MAP1S−3’−UTR、VTN−3’−UTR、ALDH16A1−3’−UTRからなる群由来のヒト遺伝子の3’−UTRは、高い翻訳効率に寄与すると考えられる。
また、配列番号152、配列番号153、配列番号154、配列番号155、配列番号156、配列番号157、配列番号158、配列番号159、配列番号160、配列番号161、配列番号164、配列番号165、配列番号167、配列番号168、配列番号169、配列番号170、配列番号171、配列番号172、配列番号173によって表される3’−UTRは、高い翻訳効率に寄与すると考えられる。
したがって、Dpysl2−5’−UTR、Acox2−5’−UTR、Ubc−5’−UTR、Nudt22−5’−UTR、Pcyox1l−5’−UTR、Ankrd1−5’−UTR、Tspyl4−5’−UTR、Slc7a3−5’−UTR、Aacs−5’−UTR、Nosip−5’−UTR、Itga7−5’−UTR、Ccnd2−5’−UTR、Ebp−5’−UTR、Sf3b5−5’−UTR、Fasn−5’−UTR、Hmgcs1−5’−UTR、Osr1−5’−UTR、Lmnb1−5’−UTR、Vma21−5’−UTR、Kif20a−5’−UTR、Cdca8−5’−UTR、Slc7a1−5’−UTR、Ubqln2−5’−UTR、Prps2−5’−UTR、Shmt2−5’−UTR、Fignl1−5’−UTR、Cad−5’−UTR、Anln−5’−UTR、Slfn9−5’−UTR、Ncaph−5’−UTR、Pole−5’−UTR、Uhrf1−5’−UTR、Gja1−5’−UTR、Fam64a−5’−UTR、Tspan10−5’−UTR、Scand1−5’−UTR、Gpr84−5’−UTR、Cers6−5’−UTR、Cxcr4−5’−UTR、Gprc5c−5’−UTR、Fen1−5’−UTR、Cspg4−5’−UTR、Mrpl34−5’−UTR、Comtd1−5’−UTR、Armc6−5’−UTR、Emr4−5’−UTR、Atp5d−5’−UTR、Csf2ra−5’−UTR、Aarsd1−5’−UTR、Cth−5’−UTR、Tpgs1−5’−UTR、Ccl17−5’−UTR、Alkbh7−5’−UTR、Ms4a8a−5’−UTRからなる群由来のマウス遺伝子の5’−UTRは、高い翻訳効率に寄与すると考えられる。
また、配列番号73、配列番号75、配列番号77、配列番号79、配列番号80、配列番号81、配列番号83、配列番号84、配列番号86、配列番号87、配列番号88、配列番号89、配列番号90、配列番号91、配列番号92、配列番号93、配列番号94、配列番号95、配列番号97、配列番号98、配列番号99、配列番号100、配列番号101、配列番号102、配列番号103、配列番号106、配列番号107、配列番号108、配列番号147(又はその野生型等価物である配列番号109)、配列番号148(又はその野生型等価物である配列番号110)、配列番号112、配列番号113、配列番号114、配列番号115、配列番号117、配列番号118、配列番号149(又はその野生型等価物である配列番号119)、配列番号123、配列番号126、配列番号127、配列番号128、配列番号129、配列番号130、配列番号131、配列番号132、配列番号133、配列番号134、配列番号151(又はその野生型等価物である配列番号136)、配列番号96、配列番号111、配列番号150(配列番号120に基づく)、配列番号121、配列番号124、配列番号125によって表される5’−UTRは、高い翻訳効率に寄与すると考えられる。
したがって、Acox2−3’−UTR、Ubc−3’−UTR、Slpi−3’−UTR、Igf2bp1−3’−UTR、Tmem37−3’−UTR、Slc7a3−3’−UTR、Cst6−3’−UTR、Ebp−3’−UTR、Sf3b5−3’−UTR、Cdca8−3’−UTR、Kif22−3’−UTR、Cad−3’−UTR、Pole−3’−UTR、Kif2c−3’−UTR、Scand1−3’−UTR、Gpr84−3’−UTR、Tpgs1−3’−UTR、Ccl17−3’−UTR、Alkbh7−3’−UTR、Ms4a8a−3’−UTR、Mrpl34−3’−UTR、Comtd1−3’−UTR、Armc6−3’−UTR、Atp5d−3’−UTR、1110001J03Rik−3’−UTR、Nudt22−3’−UTRからなる群由来のマウス遺伝子の3’−UTRは、高い翻訳効率に寄与すると考えられる。
また、配列番号174、配列番号175、配列番号176、配列番号179、配列番号180、配列番号181、配列番号182、配列番号183、配列番号184、配列番号187、配列番号188、配列番号189、配列番号191、配列番号204(又はその野生型等価物である配列番号192)、配列番号193、配列番号194、配列番号195、配列番号196、配列番号197、配列番号198、配列番号199、配列番号200、配列番号201、配列番号202、配列番号203、配列番号177によって表される3’−UTRは、高い翻訳効率に寄与すると考えられる。