JP2018520646A - ファブリー病の遺伝子治療 - Google Patents

Abstract

機能的α−ガラクトシダーゼＡタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子であって、ヌクレオチド配列が、配列番号１の配列に対して少なくとも８５％の同一性を有する、核酸分子が記載される。また、核酸分子を含むベクター、宿主細胞、又はトランスジェニック動物、及び核酸分子又はベクターを含む医薬組成物が記載される。更に、ファブリー病を治療する方法における核酸分子の使用が記載される。【選択図】なし

Description

発明の分野
本発明は、ファブリー病を治療するための新しい遺伝子治療法に関する。

発明の背景
ファブリー病は、稀なＸ連鎖遺伝性の、多系統のリソソーム蓄積障害であり、推定有病率はおよそ１：４０，０００である。それは、α−ガラクトシダーゼＡ酵素の欠損により引き起こされ、血管の内皮細胞及び平滑筋細胞を含む種々の臓器のリソソーム中に、中性スフィンゴ糖脂質の蓄積をもたらす。この蓄積は、末期の腎疾患、心合併症及び脳卒中に繋がる臓器機能の障害に繋がり、およそ５８年の平均余命減少を伴う。

造血幹細胞移植は、ファブリー病において臨床的利益を示すが、高い罹患率及び死亡率を伴う。２００２年において、欧州医薬品局（Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｍｅｄｉｃｉｎｅｓ Ａｇｅｎｃｙ）は、ファブリー病のための、現在利用可能な唯一の特異的治療を象徴する２つの組換え酵素：ａｇａｌｓｉｄａｓｅ ａｌｆａ（Ｓｈｉｒｅ ＨＧＴ，Ｂｏｓｔｏｎ ＭＡ，ＵＳＡ）及びａｇａｌｓｉｄａｓｅ ｂｅｔａ（Ｇｅｎｚｙｍｅ Ｉｎｃ，Ｂｏｓｔｏｎ ＭＡ，ＵＳＡ）を承認した。酵素補充療法（ＥＲＴ）は、ファブリー病の治療のための合理的且つ有望なアプローチであるが、治癒を意味せず、およそ２００，０００ポンド／年の、国民健康保険（ＮＨＳ）への推定費用で、患者の生涯にわたって週１回の静脈内投与を必要とする。更に、相当割合（５５〜８８％）の患者が、α−ガラクトシダーゼＡに対する中和抗体を有するようになり、従ってＥＲＴが無効になる。

対照的に、ファブリー病のための遺伝子治療は、罹患した患者への、正常コピーのαガラクトシダーゼＡ遺伝子導入を受けて、α−ガラクトシダーゼＡの持続的な体内産生による治癒の可能性を提供する。

本発明者らは、α−ガラクトシダーゼＡ遺伝子の導入及び発現を成立させるために、アデノ随伴ウイルスベクター（ＡＡＶ）を用いて、遺伝子治療法を開発した。ファブリー病は単一遺伝子における異常から生じるので、比較的低い水準の酵素調節（ｃｏｒｒｅｃｔｉｏｎ）がスフィンゴ糖脂質の蓄積を減少させる。更に、少数の細胞の調節により、調節された細胞が、バイスタンダー細胞（ｂｙｓｔａｎｄｅｒ ｃｅｌｌ）を調節できるα−ガラクトシダーゼＡを分泌する、代謝クロス調節機構（ｍｅｔａｂｏｌｉｃ ｃｒｏｓｓ−ｃｏｒｒｅｃｔｉｏｎ ｍｅｃｈａｎｉｓｍ）の結果として、距離を隔てた細胞も調節される可能性がある。最後に、本発明者のアプローチは、インビボの、ＡＡＶ媒介性の肝細胞遺伝子導入を受けた、肝臓媒介性のα−ガラクトシダーゼＡ発現を伴い、それがトランスジェニックタンパク質に対する耐性をもたらし、それによって、α−ガラクトシダーゼＡに対する中和抗体発生のリスクを低下させる。

要旨
本発明者らの研究プログラムの最優先目標は、安全で有効且つ広範に利用可能なファブリー病の治療法を確立することである。この目標を追求して、本発明者らは、特有のコドン最適化α−ガラクトシダーゼＡ配列を用い、肝臓を標的にしたＡＡＶ遺伝子導入法を開発した。

本発明の利点は：
１．α−ガラクトシダーゼＡをコードするＡＡＶの単回末梢静脈注入が、ファブリー病患者におけるα−ガラクトシダーゼＡの長期発現をもたらし得る。ＡＡＶ媒介性遺伝子導入後のα−ガラクトシダーゼＡの安定した長期発現が、
ａ．酵素補充療法（ＥＲＴ）によって可能なよりも顕著な臨床効果を発揮し、それによってファブリー病患者の末期臓器障害予防や平均余命改善の見通しを改善する；
ｂ．生涯にわたるα−ガラクトシダーゼＡの定期的な注入の必要性を無くし、従って生活の質を改善する；及び
ｃ．高価なＥＲＴの必要性の低下／除外から、ＮＨＳに対する節約の可能性がもたらされる
２．コドン最適化発現カセットからのより強力な発現により、治療上の利益が、より低用量のＡＡＶベクターの使用からもたらされる
３．ＡＡＶ媒介性遺伝子導入を受けて、血漿で高レベルのα−ガラクトシダーゼＡが継続し、従って中枢神経系内の病状改善の見通しが改善する、及び
４．肝臓からのα−ガラクトシダーゼＡの発現が、ＥＲＴ後の患者の５５〜８８％において起こる、このタンパク質に対する中和抗体発生のリスクを低下させる
ことである。

本発明者らは、成体（３月齢）及び新生（２日齢）のファブリー病モデルマウスにおけるｓｃＡＡＶ８媒介性遺伝子導入が、主要臓器におけるα−ｇａｌＡの取り込みに関連付けられる、この酵素の、生理学的レベルよりも実質的に高いレベルをもたらし、従って、ファブリー病患者における疾患の表現型を改善する可能性を生じさせることを観察した。若年齢でベクターを受容した動物での場合を含め、肝臓媒介性の導入遺伝子発現を受けた、タンパク質に対する免疫応答は観察されなかった。なお、若年齢でベクターを受容した動物は、結果としてα−ｇａｌＡ発現のレベルが低かったが、これは、肝臓が、成体のサイズに成長し続けるにつれ、エピソーム的に維持されたＡＡＶベクターゲノムを喪失することを反映している可能性が最も高い。

発明の詳細な説明
本発明は、これより、図面を参照してのみ例として詳細に説明される：

図１は、野生型（ｗｔ）α−ガラクトシダーゼＡ（左レーン（ラダーの隣））及びコドン最適化（ｃｏｄｏｐ）α−ガラクトシダーゼＡ（右レーン）を発現するｓｃＡＡＶ８ベクターが、両方、検出可能な部分ゲノムを伴わず、完全にパッケージングされることを説明するアルカリゲル解析を示す。これらのベクターを、血清型８キャプシドでシュードタイプ化した（ｗｔ又はコドン最適化α−ガラクトシダーゼＡ遺伝子は、肝臓特異的ＨＬＰプロモーターの制御下にある）。 図２は、１×１０⁷ｖｇ／細胞の感染多重度（ＭＯＩ）でＨＵＨ７肝臓がん細胞に形質導入した場合に、コドン最適化α−ガラクトシダーゼＡを含むｓｃＡＡＶベクター（ｓｃＡＡＶ−ＧＬＡ−ｃｏｄｏｐ）は、α−ガラクトシダーゼＡ転写産物の内在性レベルに影響しない（左上のパネル）が、高レベルのコドン最適化α−ガラクトシダーゼＡ ｍＲＮＡを発現する（右上のパネル）ことを示す。ｓｃＡＡＶ−ＧＬＡ−ｃｏｄｏｐで、増加させていったＭＯＩでＨＵＨ７細胞に形質導入した。これは、α−ガラクトシダーゼＡ転写産物の増加及び用量特異的発現をもたらした（下のパネル）。 図３は、野生型（ＷＴ−ＧＬＡ）及びコドン最適化（ｃｏｄｏｐ−ＧＬＡ）α−ガラクトシダーゼＡ（α−ｇａｌＡ）を発現するｓｃＡＡＶベクターを、ＨＵＨ７細胞に形質導入するために用いたことをデュプリケートで（ｉｎ ｄｕｐｌｉｃａｔｅ）示す。ＧＬＡ−ｃｏｄｏｐベクターが、より高いＧＬＡタンパク質発現を媒介することを示す。 図４は、４ｅ１０ｖｇ／マウス（＝〜２×１０¹²ｖｇ／ｋｇ）又は４ｅ１１ｖｇ／マウス（＝〜２ｘ１０¹³ｖｇ／ｋｇ）のいずれかのＡＡＶ８シュードタイプ化ｓｃＡＡＶ−ＧＬＡ−ｃｏｄｏｐの単回ボーラス尾静脈注射を受けた、成体ファブリー病マウス（３月齢）又は１週齢、２週齢若しくは３週齢の新生マウスにおけるα−ガラクトシダーゼＡ活性を示す。活性を、導入遺伝子の発現がピークに達すると予想される、遺伝子導入の３ヶ月後に測定した。データは、終末放血（血漿レベル）の時点で収集した。 図５は、４ｅ１０ｖｇ／マウス（＝〜２×１０¹²ｖｇ／ｋｇ）又は４ｅ１１ｖｇ／マウス（＝〜２ｘ１０¹³ｖｇ／ｋｇ）のいずれかのＡＡＶ８シュードタイプ化ｓｃＡＡＶ−ＧＬＡ−ｃｏｄｏｐの単回ボーラス尾静脈注射を受けた、成体ファブリー病マウス（３月齢）又は１週齢、２週齢若しくは１月齢の新生マウスにおけるα−ガラクトシダーゼＡ活性を示す。活性を、導入遺伝子の発現がピークに達すると予想される、遺伝子導入の３ヶ月後に測定した。データは、血液スポットを用いて「リアルタイム」で収集した。 図６は、形質導入した動物由来の肝臓のウェスタンブロット解析を示す。α−ガラクトシダーゼＡは、４ｅ１１ｖｇ／マウスの用量での形質導入後に、高レベルで発現したが、４ｅ１０ｖｇ／マウスの用量での形質導入後ではしなかった。 図７は、形質導入された動物由来の腎臓、白血球（ＷＢＣ）及び心臓におけるα−ガラクトシダーゼＡ発現のウェスタンブロット解析を示す。 図８は、ベクターの初期段階ｉ．ｐ．注射後のα−ＧＬＡノックアウトマウスの腎臓におけるスフィンゴ糖脂質沈着物の電子顕微鏡写真を示す。Ａ）未処置、Ｂ）１週齢での、低用量（２ｅ１２ｖｇ／ｋｇ）でのＡＡＶ処置マウス及びＣ）高用量（２ｅ１３ｖｇ／ｋｇ）でのＡＡＶ処置マウス。処置したマウスを、ｉ．ｐ．注射の５ヶ月後に処分した（倍率：×５０００及び×２０００）。 図９は、ベクターの中期段階ｉ．ｐ．注射後のα−ＧＬＡノックアウトマウスの腎臓におけるスフィンゴ糖脂質沈着物の電子顕微鏡写真を示す。Ａ）未処置、Ｂ）３週齢での、低用量（２ｅ１２ｖｇ／ｋｇ）でのＡＡＶ処置マウス及びＣ）高用量（２ｅ１３ｖｇ／ｋｇ）でのＡＡＶ処置マウス。処置したマウスを、ｉ．ｐ．注射の１ヶ月後に処分した（倍率：×５０００及び×２０００）。 図１０は、ベクターの中期段階ｉ．ｖ．注射後のα−ＧＬＡノックアウトマウスの腎臓におけるスフィンゴ糖脂質沈着物の電子顕微鏡写真を示す。Ａ）未処置、Ｂ）１月齢での、低用量（２ｅ１２ｖｇ／ｋｇ）でのＡＡＶ処置マウス及びＣ）高用量（２ｅ１３ｖｇ／ｋｇ）でのＡＡＶ処置マウス。処置したマウスを、ｉ．ｖ．注射の１０ヶ月後に処分した。（倍率：×５０００、×２０００及び×２００）。 図１１は、ベクターの後期段階ｉ．ｖ．注射後のα−ＧＬＡノックアウトマウスの腎臓におけるスフィンゴ糖脂質沈着物の電子顕微鏡写真を示す。Ａ）未処置、Ｂ）３月齢での、低用量（２ｅ１２ｖｇ／ｋｇ）でのＡＡＶ処置マウス及びＣ）高用量（２ｅ１３ｖｇ／ｋｇ）でのＡＡＶ処置マウス。処置したマウスを、ｉ．ｖ．注射の１３ヶ月後に処分した（倍率：×５０００、×２０００及び×２００）。

発明の要旨
本発明の第１の態様においては、機能的α−ガラクトシダーゼＡタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子であって、ヌクレオチド配列が、配列番号１の配列に対して少なくとも８５％の同一性を有する、核酸分子が提供される。

本発明者らは、驚くべきことに、野生型α−ガラクトシダーゼＡ ｃＤＮＡを含有する同一のコンストラクトと比較して、新規のコドン最適化配列である配列番号１が、ＡＡＶベクターで形質導入した肝細胞において、肝臓特異的プロモーターの制御下で、α−ガラクトシダーゼＡタンパク質の発現の増加をもたらすことを見出した。

ヌクレオチド配列は、配列番号１の配列に対して少なくとも８５％の同一性を有する。いくつかの実施形態においては、ヌクレオチド配列は、配列番号１の配列に対して少なくとも８６％の同一性を有する。他の実施形態においては、ヌクレオチド配列は、配列番号１の配列に対して少なくとも８７％の同一性を有する。特定の実施形態においては、ヌクレオチド配列は、配列番号１の配列に対して少なくとも８８％の同一性を有する。更なる実施形態においては、ヌクレオチド配列は、配列番号１の配列に対して少なくとも８９％の同一性を有する。いくつかの実施形態においては、ヌクレオチド配列は、配列番号１の配列に対して少なくとも９０％の同一性を有する。他の実施形態においては、ヌクレオチド配列は、配列番号１の配列に対して少なくとも９１％の同一性を有する。特定の実施形態においては、ヌクレオチド配列は、配列番号１の配列に対して少なくとも９２％の同一性を有する。更なる態様においては、ヌクレオチド配列は、配列番号１の配列に対して少なくとも９３％の同一性を有する。いくつかの実施形態においては、ヌクレオチド配列は、配列番号１の配列に対して少なくとも９４％の同一性を有する。他の実施形態においては、ヌクレオチド配列は、配列番号１の配列に対して少なくとも９５％の同一性を有する。特定の実施形態においては、ヌクレオチド配列は、配列番号１の配列に対して少なくとも９６％の同一性を有する。更なる実施形態においては、ヌクレオチド配列は、配列番号１の配列に対して少なくとも９７％の同一性を有する。いくつかの実施形態においては、ヌクレオチド配列は、配列番号１の配列に対して少なくとも９８％の同一性を有する。他の実施形態においては、ヌクレオチド配列は、配列番号１の配列に対して少なくとも９９％の同一性を有する。特定の実施形態においては、ヌクレオチド配列は、配列番号１の配列を有する。

ヌクレオチド配列は、機能的α−ガラクトシダーゼＡタンパク質をコードする。機能的α−ガラクトシダーゼＡタンパク質は、糖脂質及び糖タンパク質から末端アルファ−ガラクトシル部分を加水分解する。α−ガラクトシダーゼＡ活性についてアッセイするための好適な方法は、当業者に周知である。好ましくは、ヌクレオチド配列は、野生型アミノ酸配列を有するα−ガラクトシダーゼＡタンパク質をコードする。この配列は、当業者に周知である。例えば、この情報は、受入番号ＣＡＡ２９２３２．１（ＧＩ：７５７９１２）で、ＧｅｎＢａｎｋ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｇｅｎｂａｎｋ）において見出され得る。このタンパク質に関する更なる情報は、ＮＣＢＩ参照配列：ＮＰ＿０００１６０．１（ＧＩ：４５０４００９）で見出され得る。野生型タンパク質配列は４２９アミノ酸を有する。

本発明の第２の態様においては、α−ガラクトシダーゼＡタンパク質を発現させるためのベクターが提供される。

ベクターは、上記の核酸分子を含む。これは、ベクターが、機能的α−ガラクトシダーゼＡタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含有し、この配列が発現すると、ベクターが含有される細胞によって、機能的α−ガラクトシダーゼＡタンパク質が産生されることを意味する。

配列番号１の配列は、コドン最適化α−ガラクトシダーゼＡのヌクレオチド配列である。この配列は、通常の方法でコドンが最適化されているのではない。そうではなく、コドンが、肝臓中で高レベル発現するタンパク質について用いられるコドンに基づいて選択されている。この理由は、該ベクターが、通常、肝臓で発現するからである。この特別なコドン最適化過程は、驚くほど高い発現をもたらすヌクレオチド配列をもたらすことが見出された。

α−ガラクトシダーゼＡタンパク質をコードするヌクレオチド配列は、好ましくは１２６５〜１３１５ヌクレオチドの長さである。いくつかの実施形態においては、機能的α−ガラクトシダーゼＡタンパク質をコードするヌクレオチド配列は、１２７０〜１３１０ヌクレオチドの長さである。他の実施形態においては、機能的α−ガラクトシダーゼＡタンパク質をコードするヌクレオチド配列は、１２７５〜１３０５ヌクレオチドの長さである。特定の実施形態においては、機能的α−ガラクトシダーゼＡタンパク質をコードするヌクレオチド配列は、１２８０〜１３００ヌクレオチドの長さである。

好ましくは、ベクターはプロモーターを更に含む。プロモーターは、機能的α−ガラクトシダーゼＡタンパク質をコードするヌクレオチド配列の発現を引き起こす。ＨＬＰ、ＬＰ１、ＨＣＲ−ｈＡＡＴ、ＡｐｏＥ−ｈＡＡＴ、及びＬＳＰ等の、任意の適切なプロモーターが用いられ得る。これらのプロモーターは、以下の参考文献に、より詳細に記載されている：ＨＬＰ：ＭｃＩｎｔｏｓｈ Ｊ．ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ ２０１３ Ａｐｒ ２５，１２１（１７）：３３３５−４４；ＬＰ１：Ｎａｔｈｗａｎｉ ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ．２００６ Ａｐｒｉｌ １，１０７（７）：２６５３−２６６１；ＨＣＲ−ｈＡＡＴ：Ｍｉａｏ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ．２０００；１：５２２−５３２；ＡｐｏＥ−ｈＡＡＴ：Ｏｋｕｙａｍａ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ，７，６３７−６４５（１９９６）；及びＬＳＰ：Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ．１９９９ Ｍａｒｃｈ ３０，９６（７）：３９０６−３９１０。好ましいプロモーターは、国際公開第２０１１／００５９６８号にも記載されている。別の好ましいプロモーターは、配列番号２の配列を有し、ＨＬＰ２と呼ばれる。配列番号２を有するプロモーターは、肝臓において特に良好な発現をもたらすことが見出されている肝臓特異的プロモーターである。良好な発現をもたらす一方で、このプロモーターも比較的小さく、ベクターのより効率的なパッケージングを可能にする。好ましくは、プロモーターは肝臓特異的プロモーターである。

配列番号３は、プロモーター及び機能的α−ガラクトシダーゼＡタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含むベクターコンストラクトのヌクレオチド配列である。従って、本発明の核酸分子は、配列番号３の配列に対して少なくとも９０％の同一性を有するヌクレオチド配列を含み得る。他の実施形態においては、ヌクレオチド配列は、配列番号３の配列に対して少なくとも９１％の同一性を有する。特定の実施形態においては、ヌクレオチド配列は、配列番号３の配列に対して少なくとも９２％の同一性を有する。更なる実施形態においては、ヌクレオチド配列は、配列番号３の配列に対して少なくとも９３％の同一性を有する。いくつかの実施形態においては、ヌクレオチド配列は、配列番号３の配列に対して少なくとも９４％の同一性を有する。他の実施形態においては、ヌクレオチド配列は、配列番号３の配列に対して少なくとも９５％の同一性を有する。特定の実施形態においては、ヌクレオチド配列は、配列番号３の配列に対して少なくとも９６％の同一性を有する。更なる実施形態においては、ヌクレオチド配列は、配列番号３の配列に対して少なくとも９７％の同一性を有する。いくつかの実施形態においては、ヌクレオチド配列は、配列番号３の配列に対して少なくとも９８％の同一性を有する。他の実施形態においては、ヌクレオチド配列は、配列番号３の配列に対して少なくとも９９％の同一性を有する。特定の実施形態においては、ヌクレオチド配列は、配列番号３の配列を有する。

ベクターは、ウイルスベクター及び非ウイルスベクターを含む、α−ガラクトシダーゼＡタンパク質を発現させるための任意の好適なベクターであり得る。ウイルスベクターとしては、パルボウイルス、アデノウイルス、レトロウイルス、レンチウイルス又は単純ヘルペスウイルスが挙げられる。パルボウイルスは、アデノウイルス随伴ウイルス（ＡＡＶ）であり得る。ベクターは、好ましくは、組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ベクター又はレンチウイルスベクターである。より好ましくは、ベクターはｒＡＡＶベクターである。

本発明によるベクターは、遺伝子送達ベクターであり得る。かかる遺伝子送達ベクターは、ウイルス性の遺伝子送達ベクターであっても、非ウイルス性の遺伝子送達ベクターであってもよい。

従って、本発明は、哺乳動物細胞において、α−ガラクトシダーゼＡタンパク質の導入及び／又は発現のためのベクターとして使用するための、動物パルボウイルス、特に感染性ヒト又はサルＡＡＶ等のディペンドウイルス（ｄｅｐｅｎｄｏｖｉｒｕｓ）及びその構成要素（例、動物パルボウイルスゲノム）ベースの、遺伝子送達ベクターを提供する。従って、本明細書で用いられる場合、用語「パルボウイルスの」は、任意のタイプのＡＡＶ等のディペンドウイルスを包含する。

パルボウイルス科のウイルスは、小さな、ＤＮＡの動物ウイルスである。パルボウイルス科は２つの亜科：脊椎動物に感染するパルボウイルス亜科（Ｐａｒｖｏｖｉｒｉｎａｅ）、及び昆虫に感染するデンソウイルス亜科（Ｄｅｎｓｏｖｉｒｉｎａｅ）に分けられ得る。パルボウイルス亜科のメンバーは、本明細書中ではパルボウイルスと呼ばれ、ディペンドウイルス属（ｇｅｎｕｓ Ｄｅｐｅｎｄｏｖｉｒｕｓ）を含む。それらの属の名前から推測される通り、ディペンドウイルスのメンバーは、それらが、細胞培養における生産的感染のために、通常、アデノウイルス又はヘルペスウイルス等のヘルパーウイルスとの共感染を必要とする点で独特である。ディペンドウイルス属としては、通常、ヒト（例、血清型１、２、３Ａ、３Ｂ、４、５及び６）又は霊長類（例、血清型１及び４）に感染するＡＡＶ及び他の温血動物に感染する関連ウイルス（例、ウシ、イヌ、ウマ、及びヒツジアデノ随伴ウイルス）が含まれる。パルボウイルス及びパルボウイルス科の他のメンバーに関する更なる情報は、Ｋｅｎｎｅｔｈ Ｉ．Ｂｅｒｎｓ，“Ｐａｒｖｏｖｉｒｉｄａｅ：Ｔｈｅ Ｖｉｒｕｓｅｓ ａｎｄ Ｔｈｅｉｒ Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ，”Ｃｈａｐｔｅｒ ６９ ｉｎ Ｆｉｅｌｄｓ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ（３ｄ Ｅｄ．１９９６）に記載されている。便宜上、本発明は、ＡＡＶを参照することにより、本明細書において更に例示され、説明される。しかし、本発明はＡＡＶに限定されず、他のパルボウイルスに同様に適用され得ることが理解される。

既知のＡＡＶ血清型のゲノム構成は全て、非常に類似している。ＡＡＶのゲノムは、長さが約５，０００ヌクレオチド（ｎｔ）未満の、直鎖状の一本鎖ＤＮＡ分子である。逆位末端反復配列（Ｉｎｖｅｒｔｅｄ ｔｅｒｍｉｎａｌ ｒｅｐｅａｔ）（ＩＴＲ）は、非構造的な複製（Ｒｅｐ）タンパク質及び構造（ＶＰ）タンパク質についての固有のコードヌクレオチド配列に隣接する。ＶＰタンパク質（ＶＰ１、−２及び−３）がキャプシドを形成する。末端の１４５ｎｔは自己相補的であり、Ｔ字型ヘアピンを形成する、エネルギー的に安定な分子内二重鎖が形成され得るように構成される。これらのヘアピン構造は、細胞のＤＮＡポリメラーゼ複合体についてのプライマーとして機能し、ウイルスＤＮＡ複製のための起点としての役割を果たす。哺乳動物細胞における野生型（ｗｔ）ＡＡＶ感染に続いて、Ｒｅｐ遺伝子（即ち、Ｒｅｐ７８及びＲｅｐ５２タンパク質をコードする）が、それぞれＰ５プロモーター及びＰ１９プロモーターから発現し、両方のＲｅｐタンパク質が、ウイルスゲノムの複製における機能を有する。Ｒｅｐ ＯＲＦにおけるスプライシングイベントは、実際に４つのＲｅｐタンパク質（即ち、Ｒｅｐ７８、Ｒｅｐ６８、Ｒｅｐ５２及びＲｅｐ４０）の発現をもたらす。しかし、哺乳動物細胞中の、Ｒｅｐ７８及びＲｅｐ５２タンパク質をコードする、スプライシングされていないｍＲＮＡが、ＡＡＶベクター産生にとっては十分であることが示されている。昆虫細胞においても、Ｒｅｐ７８及びＲｅｐ５２タンパク質が、ＡＡＶベクター産生にとっては十分である。

遺伝子治療ベクターとして用いるのに好適なＡＡＶにおいて、ベクターゲノムは、典型的には、標的細胞への送達のためにパッケージングされる核酸を含む。この特定の実施形態によれば、異種ヌクレオチド配列は、ベクターゲノムの両末端のウイルスＩＴＲの間に位置する。更に好ましい実施形態においては、パルボウイルス（例、ＡＡＶ）のｃａｐ遺伝子及びパルボウイルス（例、ＡＡＶ）のｒｅｐ遺伝子は、鋳型ゲノムから（従ってそれから産生されるウイルス粒子ＤＮＡから）欠失される。この構成は、パルボウイルスキャプシドによって運搬され得る核酸配列（複数可）のサイズを最大にする。

この特定の実施形態によれば、核酸は、基体（ｓｕｂｓｔｒａｔｅ）の両末端のウイルスＩＴＲの間に位置する。パルボウイルスゲノムが１つのＩＴＲのみで機能することは可能である。従って、パルボウイルスベースの本発明の遺伝子治療ベクターにおいては、ベクターゲノムには、少なくとも１つのＩＴＲが隣接するが、より典型的には、２つのＡＡＶ ＩＴＲが（一般に、ベクターゲノムの両側、すなわち一つが５’末端、及び一つが３’末端に）隣接する。ベクターゲノム中の核酸と、１つ以上のＩＴＲとの間に、介在配列が存在し得る。

好ましくは、機能的α−ガラクトシダーゼＡタンパク質をコードするヌクレオチド配列（哺乳動物細胞における発現用）は、２つの正規のＩＴＲの間に位置するか、又は２つのＤ領域で改変されたＩＴＲのいずれかの側に位置するパルボウイルスゲノムに組み込まれる。

ＡＡＶ遺伝子治療ベクターの製造のために、本発明において用いられ得るＡＡＶ配列は、任意のＡＡＶ血清型のゲノムに由来し得る。一般に、ＡＡＶ血清型は、アミノ酸及び核酸レベルで顕著な相同性を有するゲノム配列を有し、一連の同一遺伝機能を提供し、物理的及び機能的に実質的同等であるウイルス粒子を産生し、実質的に同一のメカニズムによって複製及び集合する。様々なＡＡＶ血清型のゲノム配列及びゲノム類似性の概要については、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号Ｕ８９７９０；ＧｅｎＢａｎｋ受入番号Ｊ０１９０１；ＧｅｎＢａｎｋ受入番号番号ＡＦ０４３３０３；ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＡＦ０８５７１６；Ｃｈｉｏｒｉｎｉ ｅｔ ａｌ，１９９７；Ｓｒｉｖａｓｔａｖａ ｅｔ ａｌ，１９８３；Ｃｈｉｏｒｉｎｉ ｅｔ ａｌ，１９９９；Ｒｕｔｌｅｄｇｅ ｅｔ ａｌ，１９９８；及びＷｕ ｅｔ ａｌ，２０００（例）を参照。ＡＡＶ血清型１、２、３、４、５、６、７、８又は９が、本発明において用いられ得る。しかし、ＡＡＶ血清型１、５又は８が、本発明の関係において使用するための、ＡＡＶ配列の好ましいソースである。ＡＡＶ血清型由来の配列は、遺伝子治療ベクターの製造において用いられる場合、突然変異させられ得るか、又は改変され得る。

好ましくは、本発明の関係において使用するためのＡＡＶ ＩＴＲ配列は、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ４及び／又はＡＡＶ６に由来する。同様に、Ｒｅｐ（Ｒｅｐ７８及びＲｅｐ５２）のコード配列は、好ましくは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ４及び／又はＡＡＶ６に由来する。しかし、本発明の関係において使用するためのＶＰ１、ＶＰ２、及びＶＰ３キャプシドタンパク質をコードする配列は、既知の４２血清型のいずれかから、より好ましくはＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８若しくはＡＡＶ９、又は、キャプシドシャフリング技術及びＡＡＶキャプシドライブラリー（例）によって得られた、新規に開発されたＡＡＶ様粒子から採用され得る。

ＡＡＶのＲｅｐ配列及びＩＴＲ配列は、大部分の血清型間で特に保存される。様々なＡＡＶ血清型のＲｅｐ７８タンパク質は、８９％超同一（例）であり、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３Ａ、ＡＡＶ３Ｂ及びＡＡＶ６間のゲノムレベルでの全ヌクレオチド配列の同一性は約８２％である（Ｂａｎｔｅｌ−Ｓｃｈａａｌ ｅｔ ａｌ，１９９９）。更に、多くのＡＡＶ血清型のＲｅｐ配列及びＩＴＲが、哺乳動物細胞におけるＡＡＶ粒子の産生において、他の血清型由来の対応する配列を効率的に交差補完（即ち、機能的に置換）することが知られている。米国特許出願公開第２００３１４８５０６号は、ＡＡＶのＲｅｐ配列及びＩＴＲ配列が、昆虫細胞において、他のＡＡＶのＲｅｐ配列及びＩＴＲ配列を効率的に交差補完することも報告している。

ＡＡＶのＶＰタンパク質は、ＡＡＶウイルス粒子の細胞指向性を決定することが知られている。ＶＰタンパク質コード配列は、異なるＡＡＶ血清型間のＲｅｐタンパク質及び遺伝子よりも、保存具合が顕著に低い。Ｒｅｐ配列及びＩＴＲ配列が、他の血清型の対応する配列を交差補完する能力は、１つの血清型（例、ＡＡＶ１、５又は８）のキャプシドタンパク質と、別のＡＡＶ血清型（例、ＡＡＶ２）のＲｅｐ配列及び／又はＩＴＲ配列とを含むシュードタイプ化ＡＡＶ粒子の産生を可能にする。かかるシュードタイプ化ｒＡＡＶ粒子は、本発明の一部である。

改変された「ＡＡＶ」配列は、本発明の関係において、ＡＡＶ遺伝子治療ベクターの製造（例）においても用いられ得る。かかる改変配列としては、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８又はＡＡＶ９のＩＴＲ、Ｒｅｐ又はＶＰに対し、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％又はそれ以上のヌクレオチド配列及び／又はアミノ酸配列の同一性を有する配列（例、約７５〜９９％のヌクレオチド配列同一性を有する配列）（例）が挙げられ、野生型ＡＡＶのＩＴＲ配列、Ｒｅｐ配列又はＶＰ配列の代わりに用いられ得る。

ＡＡＶ５は、多くの点で他のＡＡＶ血清型と類似しているが、他の既知のヒト及びサルの血清型にも増して、他のヒト及びサルのＡＡＶ血清型とは異なる。それを考慮すると、ｒＡＡＶ５の製造は、昆虫細胞における他の血清型の製造とは異なり得る。ｒＡＡＶ５を製造するために本発明の方法が用いられる場合、１つ以上のコンストラクトが、（１超のコンストラクトの場合はトータルで）ＡＡＶ５のＩＴＲを含むヌクレオチド配列、ＡＡＶ５のＲｅｐコード配列を含むヌクレオチド配列（即ち、ＡＡＶ５のＲｅｐ７８を含むヌクレオチド配列）を含むことが好ましい。かかるＩＴＲ配列及びＲｅｐ配列を所望により改変して、ＡＡＶ５又はシュードタイプ化ＡＡＶ５ベクターの効率的製造を達成し得る。例えば、ＡＡＶ５ベクターの製造を向上するためには、Ｒｅｐ配列の開始コドンが改変され得、ＶＰのスプライス部位が改変又は除去され得、及び／又は、ＶＰ１の開始コドン及び隣接するヌクレオチドが改変され得る。

従って、本発明において用いられるウイルスキャプシドは、上記の通り、自律性パルボウイルス又はディペンドウイルスのいずれかの、任意のパルボウイルス由来であり得る。好ましくは、ウイルスキャプシドはＡＡＶキャプシド（例、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５又はＡＡＶ６キャプシド）である。一般に、ＡＡＶ１キャプシド又はＡＡＶ６キャプシドが好ましい。パルボウイルスキャプシドの選択は、例えば、標的細胞種、所望の発現レベル、発現する異種ヌクレオチド配列の性質、及びウイルス産生に関連する問題（例）等、当該技術分野において公知の、多くの検討事項に基づいてされ得る。例えば、ＡＡＶ１及びＡＡＶ６のキャプシドは、骨格筋用に；ＡＡＶ１、ＡＡＶ５及びＡＡＶ８は、肝臓及び中枢神経系の細胞（例、脳）用に；ＡＡＶ５は気道及び肺又は脳中の細胞用に；ＡＡＶ３は骨髄細胞用に；そしてＡＡＶ４は脳中の特定の細胞（例、アペンダブル（ａｐｐｅｎｄａｂｌｅ）細胞）用に好都合に用いられ得る。

最も適切なウイルス、ウイルスサブタイプ又はウイルス血清型を選択することは、当業者の技術的スキル（ｔｅｃｈｎｉｃａｌ ｓｋｉｌｌ）の範囲内である。いくつかのサブタイプ又は血清型は、特定のタイプの組織に対して、他のものよりも適切であり得る。

例えば、本発明の核酸の肝臓特異的発現は、ＡＡＶが媒介する、肝臓細胞の形質導入によって都合よく誘導され得る。肝臓は、ＡＡＶが媒介する形質導入がしやすく、種々の血清型が用いられ得る（例えば、ＡＡＶ１、ＡＡＶ５又はＡＡＶ８）。筋肉の形質導入は、核酸をコードするＡＡＶの、血流を介した投与によって達成され得る。従って、静脈内又は動脈内の投与が適用可能である。

本発明により調製されたパルボウイルス遺伝子治療ベクターは、ウイルスＴＲ及びウイルスキャプシドが、異なるパルボウイルスに由来する「ハイブリッド」粒子であり得る。好ましくは、ウイルスＴＲ及びキャプシドは、異なる血清型のＡＡＶ由来である。同様に、パルボウイルスは、「キメラ」キャプシド（例、異なるパルボウイルス、好ましくは異なるＡＡＶ血清型由来の配列を含有する）又は「標的化」キャプシド（例、標的指向性（ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｔｒｏｐｉｓｍ））を有し得る。

本発明の関係において、「少なくとも１つのパルボウイルスＩＴＲヌクレオチド配列」は、「Ａ」、「Ｂ」及び「Ｃ」領域とも呼ばれる、ほぼ相補的な、対称的に配置された配列を含むパリンドローム配列を意味すると理解される。ＩＴＲは、複製起点、複製において「シス」の役割を有する部位（即ち、パリンドローム、及び該パリンドロームの内部の特定の配列を認識する、Ｒｅｐ７８（又はＲｅｐ６８）（例）等の、トランスに作用する複製タンパク質の認識部位）として機能する。ＩＴＲ配列の対称性の例外の１つは、ＩＴＲの「Ｄ」領域である。それは独特である（１つのＩＴＲ内に相補（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ）を有さない）。一本鎖ＤＮＡのニッキングは、Ａ領域とＤ領域との間の接続部で生じる。それは新しいＤＮＡ合成が開始する領域である。Ｄ領域は、通常、パリンドロームの一方の側に位置し、核酸複製工程に方向性をもたらす。哺乳動物細胞中で複製するパルボウイルスは、典型的には２つのＩＴＲ配列を有する。しかし、結合部位がＡ領域の両方の鎖上にあり、及びＤ領域が対称的に、パリンドロームの各側に１つ存在するように、ＩＴＲを改変することが可能である。二本鎖環状ＤＮＡ鋳型（例、プラスミド）上では、Ｒｅｐ７８又はＲｅｐ６８が補助する核酸複製が、その場合、両方向に進行し、単一のＩＴＲが、環状ベクターのパルボウイルス複製にとっては十分である。従って、単一のＩＴＲヌクレオチド配列が、本発明の関係において用いられ得る。しかし、好ましくは、２つ又は別の偶数の正規のＩＴＲが用いられる。最も好ましくは、２つのＩＴＲ配列が用いられる。好ましいパルボウイルスＩＴＲは、ＡＡＶ ＩＴＲである。安全性の理由から、細胞への最初の導入後、更に増殖することができないパルボウイルス（ＡＡＶ）ベクターを構築することが望ましい場合がある。レシピエントにおける望ましくないベクター増殖を制限するかかる安全機構は、米国特許出願公開第２００３１４８５０６号に記載の通りのキメラＩＴＲを有するＡＡＶを用いることによって提供され得る。

当業者は、本発明のＡＡＶベクターを製造するために用いられるウイルスＲｅｐタンパク質（複数可）が、ウイルスＩＴＲのソースを考慮して選択され得ることを理解する。例えば、ＡＡＶ５ ＩＴＲは、典型的には、ＡＡＶ５ Ｒｅｐタンパク質とより効率的に相互作用するが、ＩＴＲとＲｅｐタンパク質（複数可）との血清型が一致する必要はない。

本発明において用いられるＩＴＲ（複数可）は、典型的には、機能的であり、即ち、それらは完全に解離可能であり得、ＡＡＶの配列であり、血清型１、２、３、４、５又は６が好ましい。本発明による解離可能なＡＡＶ ＩＴＲは、ＩＴＲが所望の機能、ウイルスパッケージング、組み込み、及び／又はプロウイルスレスキュー（ｐｒｏｖｉｒｕｓ ｒｅｓｃｕｅ）（例）等を媒介する限り、野生型ＩＴＲ配列を有する必要はない（例、野生型配列は、挿入、欠失、切断又はミスセンス変異により改変され得る）。

好都合なことに、遺伝子治療ベクターを用いることにより、以前のアプローチと比較して、タンパク質合成、即ちα−ガラクトシダーゼＡ合成の回復は、形質導入された細胞が永続的に又は長時間にわたって獲得する特徴であり、従って、治療効果を達成するための継続的な投与の必要が無くなる。

従って、本発明のベクターは、肝臓細胞等の適切な細胞種に効果的に形質導入する遺伝子治療ベクター内の核酸を改変することによる、α−ガラクトシダーゼＡヌクレオチド配列をインビボ送達するための戦略の開発用ツールに相当する。

ベクターは、一本鎖ベクター又は自己相補的ベクターであり得る。いくつかの実施形態においては、ベクターは一本鎖ベクターである。他の実施形態においては、ベクターは自己相補的ベクターである。

ベクターは、ポリＡ尾部を更に含み得る。好ましくは、これは機能的α−ガラクトシダーゼＡタンパク質をコードするヌクレオチド配列の下流に配置される。好ましくは、ポリＡ尾部は、ウシ成長ホルモンのポリＡ尾部である。好ましくは、これは、長さが２５０〜２７０ヌクレオチドである。

ベクターは、機能的α−ガラクトシダーゼＡタンパク質が発現することを可能にするための他の要素を含み得る。かかる要素は、当業者に周知である。

好ましくは、上記の核酸は単離される。

上記の核酸分子を製造することは、充分に当業者の能力の範囲内である。これは、例えば、ある特定の配列の化学合成を用いて行われ得る。

更に、当業者は、核酸が機能的タンパク質を発現するか否かを容易に決定することができる。好適な方法は、当業者にとって明らかである。例えば、１つの好適なインビトロ法は、核酸を、レンチウイルスベクター又はＡＡＶベクター等のベクターに挿入し、２９３Ｔ細胞又はＨｅＬａ細胞等の宿主細胞に該ベクターで形質導入し、α−ガラクトシダーゼＡ活性についてアッセイすることを含む。或いは、好適なインビボの方法は、ファブリー病を有するマウスに、核酸を含有するベクターを形質導入し、マウスの血漿中の機能的α−ガラクトシダーゼＡをアッセイすることを含む。好適な方法は、以下により詳細に記載されている。

核酸は、ヌクレオチドから成る任意のタイプの核酸であり得る。核酸は、タンパク質が産生されるように発現することができなければならない。好ましくは、核酸はＤＮＡ又はＲＮＡである。

本発明は、上記の核酸分子又はベクターのいずれか１つを含む宿主細胞も提供する。好ましくは、ベクターは、宿主中でα−ガラクトシダーゼＡヌクレオチド配列を発現させることができる。宿主は、任意の好適な宿主であり得る。

本明細書で用いられる場合、用語「宿主」は、本発明の核酸分子又はベクターを有する生物及び／又は細胞、並びに組換え遺伝子又はタンパク質の発現における使用に好適な生物及び／又は細胞を指す。本発明を任意の特定の種類の細胞又は生物に制限することは意図されていない。実際に、任意の好適な生物及び／又は細胞に、本発明における、宿主としての用途を見出すと考えられる。宿主細胞は、単一細胞、類似の、又は異なる細胞の集団の形態、例えば、（液体培養物又は固体基質上の培養物等の）培養物、生物又はその一部の形態であり得る。

本発明による宿主細胞は、本発明の核酸分子の発現を可能にし得る。従って、宿主細胞は、例えば、細菌、酵母、昆虫又は哺乳動物の細胞であり得る。

更に、本発明は、上記機能的α−ガラクトシダーゼＡタンパク質をコードする核酸分子又は上記ベクターを含む細胞を含む、トランスジェニック動物を提供する。好ましくは、動物は非ヒト哺乳動物、特に霊長類である。或いは、動物は、げっ歯類、特にマウスであり得、又はイヌ、ネコ、ヒツジ若しくはブタであり得る。

一態様においては、本発明は、本発明の核酸分子又はベクター、及び１つ以上の医薬的に許容可能な賦形剤を含む、医薬組成物を提供する。１つ以上の賦形剤としては、担体、希釈剤及び／又は他の薬剤、医薬品又はアジュバントなどが挙げられる。

本発明は、ファブリー病を治療する方法であって、ファブリー病に罹患している患者に、上記の通りのベクターの治療有効量を投与することを含む、方法を提供する。好ましくは、患者はヒトである。

ファブリー病が、上記方法で「治療」される場合、これは、ファブリー病の１つ以上の症状が改善されることを意味する。それは、ファブリー病の症状が、患者にもはや存在しないように、完全に治癒される（いくつかの方法においては、これがあてはまり得るのだが）ことを意味しない。治療方法は、ファブリー病の１つ以上の症状を、治療前よりも重篤でなくする。

「治療有効量」は、被験体において、（ファブリー病の症状を改善するのに十分なレベルまでの機能的α−ガラクトシダーゼＡ産生に繋がるように）機能的α−ガラクトシダーゼＡのレベルを上昇させる等、所要の投与量で所要の期間に、所望の治療結果を達成するのに有効な量を指す。

宿主細胞への、本発明の核酸又はベクターのインビボでの送達は、例えば、ファブリー病の１つ以上の症状を改善するレベルまでの、宿主における機能的α−ガラクトシダーゼＡの増加をもたらし得る。

ファブリー病に罹患している被験体における、天然に存在するα−ガラクトシダーゼＡのレベルは、ファブリー病の重篤度に応じて変動する。重症型の該疾患を有する患者は、α−ガラクトシダーゼＡレベルが、正常な健康被験体において見出されるレベル（本明細書においては「正常レベル」と呼ばれる）の約１％未満である。本発明の治療方法が用いられる場合、それが、機能的α−ガラクトシダーゼＡのレベルを、正常レベルの少なくとも約１％まで上昇させ得ることが見出されている。いくつかの実施形態においては、本発明の治療方法は、機能的α−ガラクトシダーゼＡのレベルを、正常レベルの少なくとも約２％、少なくとも約３％、少なくとも約４％、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、又は少なくとも約２５％まで上昇させる。特定の実施形態においては、本発明の治療方法は、機能的α−ガラクトシダーゼＡのレベルを、正常レベルの少なくとも約３０％まで上昇させる。

一実施形態においては、本発明の治療方法は、機能的α−ガラクトシダーゼＡのレベルを、最大で正常レベルまで上昇させる。

機能的α−ガラクトシダーゼＡの活性は比較的容易に測定され得、α−ガラクトシダーゼＡ活性を測定するための方法は当業者に周知である。α−ガラクトシダーゼの活性は、Ｃｌｉｎ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．４５（１５）：１２３３−８（２０１２）に記載の通り、血液スポットを用いて、血中で簡便に測定され得る。この方法の原理は、酸性ｐＨで、α−ガラクトシダーゼが、基質の４−メチルウンベリフェリル−ａ−Ｄ−ガラクトピラノシドを、４−メチルウンベリフェロン及びガラクトースに加水分解することである。アルカリ性緩衝液を加えることにより、酵素反応が停止し、４−メチルウンベリフェロンが未加水分解基質とは異なる波長で蛍光を発するよう惹起され、それによって膨大な過剰量未加水分解基質の存在下でのその測定が可能になる。白血球においては、通常全α−ガラクトシダーゼ活性の９５％超がα−ガラクトシダーゼＡであるが、血漿及び培養細胞においては、イソ酵素のα−ガラクトシダーゼＢが、全α−ガラクトシダーゼ活性に相当に寄与し得る。α−ガラクトシダーゼＡは、α−ガラクトシダーゼＢの存在下で、Ａアイソザイムのより一層の熱不安定性を利用することにより測定され得、血漿中においては、α−ガラクトシダーゼＢは、ａ−ＮＡｃガラクトサミンを加えることによって阻害され得る。この方法の鍵となる利点は、必要なろ紙上の乾燥全血のスポットがわずか５ｕｌなことである。これは、ベクター投与後にファブリー病ノックアウト（Ｋｏ）マウスにおける実験が進行するにつれて、リアルタイムでα−ガラクトシダーゼレベルを測定するという利点を提供する。

或いは、血漿中のα−ガラクトシダーゼＡ活性は、遺伝子導入後のマウスにおける終末放血（ｔｅｒｍｉｎａｌ ｂｌｅｅｄ）で評価され得る。この方法は、上記の通り、酸性ｐＨで、α−ガラクトシダーゼが基質、４−メチルウンベリフェリル−ａ−Ｄ−ガラクトピラノシドを４−メチルウンベリフェロン及びガラクトースに加水分解するという事実に基づく。更に、α−ガラクトシダーゼは、抗原レベルを示す標準的なウエスタンブロットアッセイ又は標準的な（ＥＬＩＳＡタイプ）免疫アッセイを用いても測定され得る。

更に、本発明は、治療において、例えばファブリー病の治療において使用するための、上記の通りの機能的α−ガラクトシダーゼＡタンパク質をコードする核酸分子、又は上記の通りのベクターを提供する。

更に、本発明は、ファブリー病を治療するための医薬の製造における、上記の通りの機能的α−ガラクトシダーゼＡタンパク質をコードする核酸分子又は上記の通りのベクターの使用を提供する。

本発明はまた、被験体に、機能的α−ガラクトシダーゼＡタンパク質をコードするヌクレオチド配列を送達するための方法であって、前記被験体に、上記の通りの機能的α−ガラクトシダーゼＡタンパク質をコードする核酸分子又は上記の通りのベクターを投与することを含む、方法を提供する。

上記説明においては、用語「同一性」は、２つの配列の類似性を指すために用いられる。本発明の目的のために、２つのヌクレオチド配列の同一性パーセントを決定するためには、配列が、最適な比較の目的のためにアラインメントされることが、本明細書で定められる（例、ギャップが、第１の核酸の配列に、第２のアミノ酸配列又は核酸配列との最適なアラインメントのために導入され得る）。次いで、ヌクレオチドの位置でヌクレオチド残基が比較される。第１の配列中の位置が第２の配列中の対応する位置と同じアミノ酸残基又はヌクレオチド残基によって占有される場合、分子はその位置で同一である。２つの配列間の同一性パーセントは、配列によって共有される同一位置の数の関数である（即ち、同一性％＝同一位置の数／位置（即ち、オーバーラップする位置（ｏｖｅｒｌａｐｐｉｎｇ ｐｏｓｉｔｉｏｎｓ）の総数）×１００）。好ましくは、２つの配列は同じ長さである。

配列比較は、比較される２つの配列の全長にわたって行われても、２つの配列の断片にわたって行われてもよい。典型的には、比較は、比較される２つの配列の全長にわたって行われる。しかし、配列同一性は、例えば、約２０、約５０、約１００、約２００、約５００、約１０００又は約２０００若しくはそれ以上の連続した核酸残基の領域にわたって行われ得る。

当業者は、２つの配列間の相同性又は同一性を決定するために、いくつかの異なるコンピュータプログラムが利用可能であるという事実を認識する。好ましい実施形態においては、２つの配列間の同一性は、ソフトウェアパッケージＣｌｏｎｅ Ｍａｎａｇｅｒ Ｐｒｏｆｅｓｓｉｏｎａｌ ｖｅｒｓｉｏｎ ９（好ましくは、ｖｅｒｓｉｏｎ ９．４）を用いて解析される。この解析ツールは、Ｓｃｉ−Ｅｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ ＆ Ｅｄｕｃａｔｉｏｎａｌ Ｓｏｆｔｗａｒｅ，１１０１０ Ｌａｋｅ Ｇｒｏｖｅ Ｂｌｖｄ，Ｓｔｅ １００，ＰＭＢ １２２，Ｍｏｒｒｉｓｖｉｌｌｅ，ＮＣ ２７５６０，ＵＳＡ−ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｓｃｉｅｄ．ｃｏｍ／ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍ）によって生産される。配列を比較するために使用される設定は、好ましくは、以下の通りである：アライメント：全体的なＤＮＡアライメント；パラメータ：両鎖；スコアリングマトリックス：リニアー（ミスマッチ２、オープンギャップ（ＯｐｅｎＧａｐ）４、エクステンションギャップ（ＥｘｔＧａｐ）１。或いは、以下の、Ｆａｓｔ Ｓｃａｎ−ＭａｘＳｃｏｒｅ及びＦａｓｔ Ｓｃａｎ ＭａｘＱｕａｌ等の方法も、ローカル設定を用いて、同じソフトウェアで用いられ得る。

他の方法も、配列同一性を決定するために用いられ得る。例えば、２つのアミノ酸配列又は核酸配列間の同一性パーセントは、Ａｃｃｅｌｒｙｓ ＧＣＧソフトウェアパッケージ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ａｃｃｅｌｒｙｓ．ｃｏｍ／ｐｒｏｄｕｃｔｓ／ｇｃｇ／で入手可能）中のＧＡＰプログラムに組み込まれているＮｅｅｄｌｅｍａｎ ａｎｄ Ｗｕｎｓｃｈ（１９７０）のアルゴリズムを用い、Ｂｌｏｓｕｍ ６２マトリックス又はＰＡＭ２５０マトリックスのいずれか、並びにギャップウェイト（ｇａｐ ｗｅｉｇｈｔ）１６、１４、１２、１０、８、６又は４、及びレングスウェイト（ｌｅｎｇｔｈ ｗｅｉｇｈｔ）１、２、３、４、５、又は６を用いて決定され得る。

本明細書において引用される全ての特許及び参考文献（ｌｉｔｅｒａｔｕｒｅ ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ）は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。

当業者は、本発明のすべての態様が、それらが例えば核酸、ベクター、宿主細胞又は使用に関係するか否かに関わらず、本発明の他のすべての態様に等しく適用可能であることを理解する。特に、治療方法の態様においては、例えば核酸又はベクターの投与は、例えば、ファブリー病を治療するための核酸又はベクターの使用に関する、本発明の他の態様のいくつかよりも詳細に記載されている場合がある。しかし、当業者は、本発明の特定の態様に関してより詳細な情報が与えられている場合、この情報は、一般に本発明の他の態様に等しく適用可能であることを理解する。更に、当業者は、治療方法に関する記載が、ファブリー病の治療における核酸又はベクターの使用に等しく適用可能であることも理解する。

材料及び方法
野生型（ＷＴ−ＧＬＡ）及びコドン最適化（ｃｏｄｏｐ ＧＬＡ）α−ガラクトシダーゼＡを発現させるｓｃＡＡＶ８ベクターで、肝臓がん細胞株のＨＵＨ７細胞に形質導入して効力を評価した。簡単に述べると、１０％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ中で培養し、６ウェル培養プレート中に１ウェルあたり５×１０⁴細胞でプレーティングしたＨＵＨ７細胞を、ＯＰＴＩＭＥＭ培地（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で２回洗浄し、次いでＡＡＶベクターで形質導入した。７２時間後、ＤＮＡ、ＲＮＡ又はタンパク質の抽出のために細胞を収集した。ＤＮＥａｓｙ Ｂｌｏｏｄ ａｎｄ Ｔｉｓｓｕｅ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いてＤＮＡ抽出を行い、ＱＰＣＲ法及び導入遺伝子特異的プライマー並びに細胞のハウスキーピング遺伝子（マウス又はヒトのＧＡＰＤＨ又はβ−アクチン）を用いてゲノムコピー数を算出した。ＱＰＣＲの間に、ＡＡＶベクターのゲノムコピー数の算出を可能にする標準曲線を設定した。宿主ゲノムコピー数は、抽出後のゲノムＤＮＡの濃度を決定し、各細胞のＤＮＡ含有量が６．６ｐｇであると仮定することにより算出した。これらの２つの値を割り算することにより、宿主細胞当たりのベクターゲノムコピーを算出した。ＲＮＡ抽出を、Ｔｒｉｚｏｌ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて行い、製造業者の指示書を用いて行った。またＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ ＩＩ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いてｃＤＮＡを生成した。ＱＲＴＰＣＲは、内在性又はコドン最適化形態のα−ガラクトシダーゼＡのいずれかに特異的なプライマーを用いて行った。ウェスタンブロッティングのために、細胞を、プロテアーゼ及びホスファターゼの阻害剤（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を加えたＲＩＰＡ緩衝液中で抽出した。

電子顕微鏡法解析
マウス腎実質の超微細構造を、コドン最適化α−ガラクトシダーゼＡの遺伝子導入後の様々な時点で、高分解能電子顕微鏡法によって評価した。ベクターは、低用量（２ｅ１２ｖｇ／ｋｇ）又は高用量（２ｅ１３ｖｇ／ｋｇ）で投与した。

遺伝子導入後の様々な時点でマウスを殺した。腎臓を取り出し、１０％中性緩衝化ホルマリン、メチルカルノア溶液中で固定し、２．５％グルタルアルデヒド及び２％パラホルムアルデヒドで小さな塊を固定し、続いて１％四酸化オスミウム中で後固定し、標準的な手順を用いてエポン（Ｅｐｏｎ）に包埋した。エポン包埋ブロックをダイヤモンドナイフで８０ｎｍで切断した。次いで、超薄切片を、電子顕微鏡法用に、酢酸ウラニル及びクエン酸鉛で二重染色した。ダイヤモンドナイフの代わりにサファイアナイフを用いて、同じブロック面を１μｍで切断した。切片をＨ−７６５０電子顕微鏡中で検証した。

結果
最初の評価は、肝臓特異的プロモーターの制御下でコドン最適化α−ガラクトシダーゼＡをコードするＡＡＶベクターによる肝細胞の形質導入が、トランスジェニックα−ガラクトシダーゼＡの発現を、野生型α−ガラクトシダーゼＡ ｃＤＮＡを含有する同一のコンストラクトで観察されるより４倍高いレベルでもたらすことを示したが、これは、先行技術からすると予想外であった（図２及び３）。

ファブリー病モデルマウスを、Ｋｕｌｋａｒｎｉ（Ｔ．Ｏｈｓｈｉｍａ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９４（１９９７），ｐｐ．２５４０−２５４４）から入手した、Ｃ５７ＢＬ／６ヘミ接合体雄性マウス（０／−）及びホモ接合体雌性マウス（−／−）から繁殖させた。成体ファブリー病マウス（３月齢）は、有効なｑ−ＰＣＲアッセイ及びゲルベースの定量アッセイに基づいて、４ｅ１０ｖｇ／マウス（＝〜２ｘ１０¹²ｖｇ／ｋｇ）又は４ｅ１１ｖｇ／マウス（〜２ｘ１０¹³ｖｇ／ｋｇ）のいずれかの、ＡＡＶ８シュードタイプ化ｓｃＡＡＶ−ＧＬＡ−ｃｏｄｏｐの単回ボーラス尾静脈注射を受容した。１週齢、２週齢又は３週齢の新生マウスに、同じ用量のベクターを与え（腹腔内注射し）た。その後２週間ごとに尾静脈から血液試料を採取した。α−ガラクトシダーゼＡ活性は、導入遺伝子発現がピークに達すると予想される、遺伝子導入の３ヶ月後に行われた終末放血（血漿レベル）時に、上記の通りの機能的アッセイによって決定した（図４）。α−ガラクトシダーゼＡの活性レベルは、血液スポット法（図５）を用いて、「リアルタイム」でも評価した。これに必要となるサンプル量が、より少ない（通常２０μｌの血液）ためである。

ベクターが、成体マウス（３月＝３Ｍ）に、又は１〜３週目の間の早期出生後の期間（１Ｗ、２Ｗ、３Ｗでの単回ボーラス注射）に投与されたかにかかわらず、すべてのコホート（Ｎ＝４ 動物／群）のマウスにおいて、高レベルの機能的α−ガラクトシダーゼＡ活性（Ｈｉｇｈ ｌｅｖｅｌ ｏｆ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ α−ｇａｌａｃｔｏｓｉｄａｓｅ Ａ ａｃｔｉｖｅ）が観察された。活性レベルは、平均±標準偏差＝５４４ｎｍｏｌ／時／ｍｌで、３ヶ月目に、２ｘ１０¹²ｖｇ／ｋｇのベクターを受容した動物でより高かった。同じ用量のベクターであるが出生後１週間に注射された動物におけるレベルは、８０ｎｍｏｌ／時／ｍｌで、７倍低かった。これは、４．０〜２１．９ｎｍｏｌ／時／ｍｌの範囲である、ヒトにおける正常レベルよりも、依然としてほぼ４倍高い。ホモ接合体ファブリー病マウスにおいては、０〜０．９ｎｍｏｌ／時／ｍｌの活性レベルが観察されたが、ヘテロ接合体動物は〜７．４ｎｍｏｌ／時／ｍｌに近いレベルであった。従って、遺伝子導入後、α−ガラクトシダーゼＡ活性の４〜２６倍の増加が観察された。血液スポットアッセイで観察されたレベルは幾分低かったが、この解析により、低用量及び高用量のコホートについてそれぞれ１１８±６及び１７６±４ｎｍｏｌ／時／ｍｌであった、成体マウスにおけるα−ガラクトシダーゼＡ活性の、用量依存的増加が確認された。１月齢でベクターを受容したコホートにおいて、同様のレベルが観察された。出生後２週間で形質導入した動物は、それぞれ低用量及び高用量のコホートについて、α−ガラクトシダーゼＡ活性が１０±２及び１１７±７ｎｍｏｌ／時／ｍｌであった。対照的に、１週齢でベクターを受容した動物は、それぞれ２×１０¹²又は２×１０¹³ｖｇ／ｋｇの用量レベルの腹腔内投与後の、α−ガラクトシダーゼＡ活性が、２±０．４及び８±３ｎｍｏｌ／時／ｍｌの極めて低いレベルであった。

本発明者らは、次に、主要臓器におけるα−ガラクトシダーゼＡレベルを評価した。４ｅ１１ｖｇ／マウスの用量での形質導入後の動物に由来する肝臓のウェスタンブロット解析は、高レベルの内在性ヒトα−ガラクトシダーゼＡ発現を示したが（図６）、４ｅ１０ｖｇ／マウスで形質導入した動物においてはしなかった。４ｅ１１ｖｇ／マウス（＝２ｅ１３ｖｇ／ｋｇ）での形質導入動物においては、白血球（ＷＢＣ）がヒトαガラクトシダーゼＡの存在を示し、血漿からの取り込みを示唆した。実際、これは腎臓及び心臓を含む他の組織において整合性のある知見であった（図７）。遺伝子導入後、α−ガラクトシダーゼＡのレベルは、野生型Ｃ５７Ｂ１６マウスに見られるものに匹敵し、生理学的レベルの１００％に近いレベルでの発現を示唆した。これは、酵素補充療法に関する我々の経験からすると、予期せぬ発見である。従って、これは、ＡＡＶ媒介遺伝子導入後のα−ガラクトシダーゼＡの継続的な長期発現が、ファブリー病に冒される重要な臓器におけるα−ガラクトシダーゼＡの取り込みを促進することを示唆する。これらの重要な臓器の機能不全は、ファブリー病患者における平均余命減少の理由であり、酵素補充療法の有効性について疑問を呈している。

腎臓の関与は、中性スフィンゴ糖脂質、主にグロボトリアオシルセラミド（Ｇｂ３）の蓄積に起因するファブリー病の顕著な特徴である。従って、マウス腎実質の超微細構造を高分解能電子顕微鏡法により評価した。未処理のファブリー病マウスにおいては、足細胞が足突起融合を形成し、Ｇｂ３の蓄積により貯蔵プロセスが起こり、一方、濾過スリットは多胞体を形成し、分解し、スリットダイアフラグム（ｓｌｉｔｓ ｄｉａｐｈｒａｇｍ）は複合体を形成した。かかる現象が起こると、タンパク尿及び糸球体硬化症が発症し得る。周産期の間、出生後１ヶ月目又は出生後３ヶ月目（未処置動物において腎臓の病状が確立する）でのＡＡＶ８シュードタイプ化ｓｃＡＡＶ−ＧＬＡ−ｃｏｄｏｐ投与後、用量依存的であるが大規模な腎実質の全体からの脂質蓄積の解除が観察され、正常な腎臓の構造がもたらされた（図８〜１１）。従って、すべての群の処置されたマウスの腎組織における、より少ない、より小さい、又はより密集していないリソソームの超微細構造的知見によって示される通り、２ｘ１０¹¹及び２ｘ１０¹²ｖｇ／ｋｇの用量レベルでは、蓄積されたＧｂ３が除去され得、且つ、その再蓄積も防止され得る。これらの知見は、α−ＧａｌＡが、腎臓において、基質を含有するリソソームによるその後のプロセシングのために、エンドソームへと容易にエンドサイトーシスされることを示唆する。

配列
配列番号１：コドン最適化α−ガラクトシダーゼＡのヌクレオチド配列。
配列番号２：プロモーターＨＬＰ２のヌクレオチド配列。
配列番号３：プロモーター及びコドン最適化α−ガラクトシダーゼＡ配列を含むベクターコンストラクト（ｓｃＡＡＶ８−ＬＰ１−ＧＬＡｃｏ）のヌクレオチド配列。この配列はＬＰ１プロモーターを含有する。コドン最適化α−ガラクトシダーゼＡ配列は、７２２〜２０１１塩基にある。

Claims (17)

1. 機能的α−ガラクトシダーゼＡタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子であって、ヌクレオチド配列が、配列番号１の配列に対して少なくとも８５％の同一性を有する、核酸分子。
2. ヌクレオチド配列が、配列番号１の配列に対して少なくとも９５％の同一性を有する、請求項１の核酸分子。
3. ヌクレオチド配列が配列番号１の配列を有する、請求項１又は請求項２の核酸分子。
4. α−ガラクトシダーゼＡタンパク質を発現するためのベクターであって、請求項１〜３のいずれか１項の核酸分子を含む、ベクター。
5. 肝臓特異的プロモーターを更に含む、請求項４のベクター。
6. ＡＡＶベクターである、請求項４又は請求項５のベクター。
7. 一本鎖ベクターである、請求項４〜６のいずれか１項のベクター。
8. 配列番号３の配列に対して少なくとも９０％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む、請求項４〜７のいずれか１項のベクター。
9. 配列番号３の配列を有するヌクレオチド配列を含む、請求項４〜８のいずれか１項のベクター。
10. 請求項１〜３のいずれか１項の核酸分子又は請求項４〜９のいずれか１項のベクターを含む、宿主細胞。
11. 請求項１〜３のいずれか１項の核酸分子又は請求項４〜９のいずれか１項のベクターを含む細胞を含む、トランスジェニック動物。
12. 請求項１〜３のいずれか１項の核酸分子又は請求項４〜９のいずれか１項のベクター、及び１つ以上の医薬的に許容可能な賦形剤を含む、医薬組成物。
13. ファブリー病を治療する方法であって、ファブリー病に罹患している患者に、請求項４〜９のいずれか１項のベクターの治療有効量を投与することを含む、方法。
14. 治療において使用するための、請求項１〜３のいずれか１項の核酸分子又は請求項４〜９のいずれか１項のベクター。
15. ファブリー病の治療において使用するための、請求項１〜３のいずれか１項の核酸分子又は請求項４〜９のいずれか１項のベクター。
16. ファブリー病を治療するための医薬の製造における、請求項１〜３のいずれか１項の核酸分子又は請求項４〜９のいずれか１項のベクターの使用。
17. 被験体に、α−ガラクトシダーゼＡタンパク質をコードするヌクレオチド配列を送達するための方法であって、前記被験体に、請求項１〜３のいずれか１項の核酸分子又は請求項４〜９のいずれか１項のベクターを投与することを含む、方法。