JP2018183186A

JP2018183186A - アデノ随伴ウイルスプラスミド及びベクター

Info

Publication number: JP2018183186A
Application number: JP2018148966A
Authority: JP
Inventors: ナカイ，ヒロユキ; Hiroyuki Nakai; アダチ，ケイ; Kei Adachi
Original assignee: Oregon Health Science University; University of Pittsburgh
Current assignee: Oregon Health Science University; University of Pittsburgh
Priority date: 2012-05-09
Filing date: 2018-08-08
Publication date: 2018-11-22
Anticipated expiration: 2033-05-09
Also published as: EP3470523A1; WO2013170078A1; EP2847337A1; JP6921788B2; US20150126588A1; EP2847337A4; JP6385920B2; US9677088B2; JP2015517308A

Abstract

【課題】カプシドタンパク質が変更された新たなアデノ随伴ウイルスベクターを提供することを目的とする。【解決手段】ウイルスカプシドに1個以上の突然変異を含むアデノ随伴ウイルスプラスミド及びウイルスベクターを開示する。アデノ随伴ウイルスベクターを使用する方法も開示する。【選択図】図１

Description

全般的には、本開示は、遺伝子送達において用いられるアデノ随伴ウイルスに関する。より具体的には、本開示は、特定の標的組織への遺伝子送達において用いられるアデノ随伴ウイルスに関する。
政府支援への謝辞
本願は、国立衛生研究所(National Institutes of Health)により授与された助成金番号R01DK078388の下、米国政府の支援によって為された。米国政府は、本願に一定の権利を有する。

組換えアデノ随伴ウイルス(rAAV)は、in vivo遺伝子送達のための有望なベクターである。多数の天然起源の血清型及びサブタイプが、ヒト及び非ヒト霊長類組織から単離されている(両者共に参照により本明細書に援用する、Gao Gら、J Virol 78、6381〜6388(2004)及びGao Gら、Proc Natl Acad Sci USA 99、11854〜11859(2002))。新たに同定されたアデノ随伴ウイルス(AAV)分離株の中でも、AAV血清型8(AAV8)及びAAV血清型9(AAV9)に由来するrAAVベクターは、末梢を介した全身性投与後に高効率で肝臓、心臓、骨格筋及び中枢神経系を含む様々な器官を形質導入することができるため、これら2種の血清型は多くの注目を集めている(これら全て参照により本明細書に援用する、Foust KDら、Nat Biotechnol 27、59〜65(2009);Gaoら、2004、上記参照;Ghosh Aら、Mol Ther 15、750〜755(2007);Inagaki Kら、Mol Ther 14、45〜53(2006);Nakai Hら、J Virol 79、214〜224(2005);Pacak CAら、Circ Res 99、e3〜e9(2006);Wang Zら、Nat Biotechnol 23、321〜328(2005);及びZhu Tら、Circulation 112、2650〜2659(2005))。

rAAV8及びrAAV9ベクターによる頑強な形質導入は、これらの細胞型に対する強い指向性、ベクターの効率的な細胞取り込み、及び/又は細胞におけるビリオン殻の迅速な脱外被に帰するものと見なされている(参照により本明細書に援用する、Thomas CEら、J Virol 78、3110〜3122(2004))。加えて、より優れた性能を有する、カプシドが遺伝子操作されたrAAVの出現は、ベクターツールキットとしてのrAAVの有用性を大いに広げている(参照により本明細書に援用する、Asokan Aら、Mol Ther、印刷に先立つ公表、doi:10.1038/mt.2011.287(2012))。rAAV媒介性遺伝子療法の概念実証(Proof-of-concept)は、ヒト疾患の多くの前臨床動物モデルにおいて示されている。とりわけ、血友病B(両者共に参照により本明細書に援用する、Manno CSら、Nat Med 12、342〜347(2006)及びNathwani ACら、N Engl J Med 365、2357〜2365(2011));筋ジストロフィー(参照により本明細書に援用する、Mendell JRら、N Engl J Med 363、1429〜1437(2011));心不全(参照により本明細書に援用する、Jessup Mら、Circulation 124、304〜313(2011));盲目性(blinding)網膜症(参照により本明細書に援用する、Maguire AMら、Lancet 374、1597〜1605(2009));及びα1アンチトリプシン欠乏症(参照により本明細書に援用する、Flotte TRら、Hum Gene Ther 22、1239〜1247(2011))を含む遺伝性疾患のための第I/II相臨床試験が、開始又は完了されている。

Gao Gら、J Virol 78、6381〜6388(2004) Gao Gら、Proc Natl Acad Sci USA 99、11854〜11859(2002) Foust KDら、Nat Biotechnol 27、59〜65(2009) Ghosh Aら、Mol Ther 15、750〜755(2007) Inagaki Kら、Mol Ther 14、45〜53(2006) Nakai Hら、J Virol 79、214〜224(2005) Pacak CAら、Circ Res 99、e3〜e9(2006) Wang Zら、Nat Biotechnol 23、321〜328(2005) Zhu Tら、Circulation 112、2650〜2659(2005) Thomas CEら、J Virol 78、3110〜3122(2004) Asokan Aら、Mol Ther、印刷に先立つ公表、doi:10.1038/mt.2011.287(2012) Manno CSら、Nat Med 12、342〜347(2006) Nathwani ACら、N Engl J Med 365、2357〜2365(2011) Mendell JRら、N Engl J Med 363、1429〜1437(2011) Jessup Mら、Circulation 124、304〜313(2011) Maguire AMら、Lancet 374、1597〜1605(2009) Flotte TRら、Hum Gene Ther 22、1239〜1247(2011)

rAAVベクターは、前臨床動物試験において広く用いられ、臨床安全性試験において検査されているが、現在のrAAV媒介性遺伝子送達系は、依然として、より広範な臨床適用の次善策のままである。AAVウイルスカプシドタンパク質の配列は、特定のAAVベクターの多数の特色を定義する。例えば、カプシドタンパク質は、とりわけ、カプシド構造及びアセンブリ、Rep及びAAPタンパク質等、AAV非構造タンパク質との相互作用、宿主体液及び細胞外マトリクスとの相互作用、血液からのウイルスのクリアランス、血管透過性、抗原性、中和抗体に対する反応性、組織/器官/細胞型指向性、細胞付着及び内部移行の効率、細胞内輸送経路、ビリオン脱外被速度に影響を与える。さらに、所定のAAVカプシドアミノ酸配列とrAAVベクターの特徴との間の関係性は、予測不可能である。

従って、AAVに基づく治療法の利益を最大にするために、カプシドタンパク質が変更された新たなrAAVベクターが必要とされる。

本明細書において、ウイルスカプシドに1個以上の突然変異を含むrAAVベクターが開示される。本明細書に開示されている突然変異を含むAAVは、突然変異を含まないAAVと比べて変更された表現型を有し得る。突然変異を含むウイルスに起因し得る変更された表現型として、組織特異的標的化及び排除、ウイルス形質導入の増強、ウイルス収量の増強並びに未変異ウイルスに対する免疫血清による認識の欠如等が挙げられるがこれらに限定されない。

ある特定の実施形態において、開示されている突然変異は、単独であれ、互いに又はその他の突然変異と組み合わせたものであれ、配列番号1の以下の残基:L380、T381、L382、N383、I440、D441、Y446、L447、T450、I451、V465、P468、S469、N470、M471、Q474、G475、Y484、R485、E500、F501、W503、R514、N515、S516、又はL517のうち1つ以上における突然変異を含む。

ある特定の実施形態において、開示されている突然変異は、単独であれ、互いに又はその他の突然変異と組み合わせたものであれ、配列番号1の以下の残基:P504、G505及びQ590のうち1つ以上における突然変異を含む。

特定の実施形態において、これらの突然変異又はこれらの組み合わせは、これらの突然変異を含むウイルスベクターの、1種以上の組織に結合する又は1種以上の組織への結合を排除する能力に影響を与え得る。特定の実施形態において、これらの突然変異は、肝臓への結合を排除する。

他の実施形態において、開示されている突然変異は、単独であれ、その他の突然変異と組み合わせたものであれ、配列番号4の以下の残基:Q464、A467、D469、I470、R471、D472、S474、Y500、S501及びD514における突然変異も含む。

特定の実施形態において、これらの突然変異又はこれらの組み合わせは、これらの突然変異を含むウイルスベクターの、細胞型、特に、末端ガラクトースを含む糖鎖付加部位を有する細胞型に結合する能力に影響を与え得る。

図1は、AAV9-SBBANN2-BCのウイルスゲノムマップを示す図である。2個のN12バーコード(barcode)(ウイルスバーコード又はVBC)が、ポリAシグナル(pA)の下流に挿入されている。各VBCは、左又は右のVBC特異的プライマーセットによりPCR増幅することができる。定義された突然変異を有するPCR産物の効率的なクローニングのために、特有の制限酵素部位が導入されている。図2は、AAV2R585E-SBBXEB-BCのウイルスゲノムマップを示す図である。2個のN12バーコード(ウイルスバーコード又はVBC)が、ポリAシグナル(pA)の下流に挿入されている。各VBCは、左又は右のVBC特異的プライマーセットによりPCR増幅することができる。定義された突然変異を有するPCR産物の効率的なクローニングのために、特有の制限酵素部位が導入されている。図3は、AAV9-SBBANN2-BCにおけるAAV9カプシドタンパク質に、定義された突然変異を導入するためのブリッジ(bridging)PCR戦略の表示を示す図である。図4は、本明細書に開示されているAAVバーコード-Seq手順の表示を示す図である。VBC-1及びVBC-2は、試料特異的バーコード(SBC)に隣接するプライマーを用いて試料から個々に増幅される。6VBC-1及びVBC-2は、数百種の異なるVBC(例えば、図面に描写されているVBC1-1、VBC2-1、VBC3-1等)のいずれかとなり得る。全試料から得たSBC指標化VBC-1及びVBC-2 PCR産物を一体に混合し、Illumina配列決定に付して、試料におけるバーコードの総セットをプロファイルする。バーコードの総セットをプロファイルすることにより、試料における各変異体のウイルスゲノムを定量化し得る。図5は、AAVバーコード-Seq解析におけるIllumina配列リード(read)数とDNA鋳型の濃度との間の関係性を示す散布図である。4log範囲に亘って拡散する100種の異なるDNA濃度のデジタル配列リード数を、プラスミドDNA鋳型濃度に対しプロットした。別々の対照実験により決定されるVBC間のPCR効率に観察される僅かな差に基づき正規化を行った。図6A及び図6Bはそれぞれ、2種のプラスミドDNAライブラリーを用いた、AAVバーコード-Seq解析の統計的検定力を評価するためのモンテカルロ(Monte Carlo)シミュレーション試験を描写する図である。2種のライブラリーは、各クローンが特有のVBC1及びVBC2を有する118種のpAAV9-SBBANN2-BCクローンから構成された。図6Aにおけるライブラリーは、AAVライブラリーストックを模倣し、図6Bにおけるライブラリーは、様々な濃度で変異体クローンが存在する試料を模倣する。図6Cにおいて、2連の実験において、ライブラリーにおける異なる数の参照対照がランダムに選択され、シミュレート変異体と比較される。マンホイットニーのU検定を用いた統計的比較を500回行って、解析の検定力を決定した。図7A及び図7Bはそれぞれ、AAV形質導入組織のAAVバーコード-Seq解析の統計的検定力を評価するためのモンテカルロシミュレーション試験を描写する図である。それぞれ一対の特有のDNAバーコードを有する100種の同一AAV9クローンからなるDNAバーコード化AAVライブラリーをマウス(n=2)に静脈内投与し、注射11日後に肝臓組織を摘出した。試料から総DNAを抽出し、AAVバーコード-Seq解析に付した。データをモンテカルロシミュレーション試験において用いた。図7Aは、実験が2連で行われる場合の結果を示す。図7Bは、実験が3連で行われる場合の結果を示す。図8は、様々な血清型及びバリアントのHEK293細胞形質導入効率を描写する図である。HEK293細胞を、12種の異なるAAV血清型及びバリアントを含有するDNAバーコード化AAVライブラリーに感染させた。感染48時間後にAAVバーコード-Seqにより形質導入効率を決定した。AAV9の形質導入効率により値を正規化する。実験を3連で行った。縦棒はSEMである。図9は、マウスにおける様々なAAV血清型又はバリアントの静脈内注射後の血中ベクター濃度-時間曲線を描写する図である。図9Aにおいて、lacZ遺伝子を発現する組換えアデノ随伴ウイルス血清型1(rAAV1)、rAAV2、rAAV8又はrAAV9ベクターを、1.0×10¹³vg/kg(1群n=3〜7)の用量のボーラスで、尾静脈を介してマウスに注射した。血液におけるrAAV粒子の濃度を、注射後時間の関数としてプロットした。20匹のマウスを用いて(Kotchey NMら、2011、後述)に記載されている通りにデータを得た。全濃度をAAV9の濃度に対し正規化した。図9Bにおいて、バーコード化AAVライブラリーID394を投与し、上述と同じ様式で血液試料を採取し、配列決定した。データは、図9Aにおいても評価した血清型に限定した。図9Cは、図9Bに示す実験において得ることができる全薬物動態データを示す。図9B及び9Cに関して、n=2マウスであった。縦棒は、平均値の標準誤差を表す。図10は、AAVバーコード-Seqにより決定されるマウス抗AAV9中和抗体に対するその反応性に関する、示されている血清型の解析の結果を描写するグラフのセットを示す図である。無処置又はAAV9で予備免疫した成体マウス(各n=2)のいずれかに、尾静脈を介してバーコード化AAVライブラリーID394を注射し、注射1、10、30及び60分間後に血液試料を採取した。続いて、AAVバーコード-Seqにより、各試料における各血清型のAAVゲノムを定量化した。青及び赤色の線は、それぞれ無処置マウス及び抗AAV9抗体保持マウスにおける、AAV9のものと比べた血中ベクター濃度(即ち、相対濃度)を示す。AAV9粒子は、AAV9抗体保持マウスにおける血液循環から急速に排出されるため、非常に迅速に血液循環から排出されるAAV3を除いて、抗AAV9抗体で中和されないAAV血清型の相対血中濃度は、10分目に劇的な増加を提示し、その後高レベルを維持する。対照的に、中和されるAAV血清型は、AAV9のものと同様の薬物動態特性を提示する。緑色の線は、無処置マウスに対する抗AAV9抗体保持マウスにおける相対濃度の比である。図11A及び図11Bは、AAVバーコード-Seqにより決定される、様々なAAV血清型及びバリアントによるCHO Pro5及びLec2細胞における形質導入効率を描写する図である。CHO Pro5及びLec2細胞を、DNAバーコード化した様々なAAV血清型及びバリアント(AAVライブラリーID394)に感染させた。感染48時間後に、AAVバーコード-Seqにより形質導入効率を決定した。結果は、AAV9(A)又はAAV2(B)の値により正規化される。図11Bにおいて、AAV2が、同率でPro5及びLec2細胞を形質導入することが想定される(参照により本明細書に援用する、Bell CLら、J Clin Invest 121、2427〜2435(2011))。図12は、CHO Pro5及びLec2細胞の細胞表面グリカンの図画描写を示す図である。末端シアル酸は、AAV1、AAV5及びAAV6の受容体として働き、一方、末端ガラクトースは、AAV9の受容体である。図13は、Lec2細胞表面受容体への結合に重要であることが示されるアミノ酸の位置を示すAAV9カプシドのモデルを示す図である。色付きのアミノ酸の二重アラニン突然変異は、Lec2細胞表面受容体への結合を有意に損なう。赤及び青色のアミノ酸は、AAV1、2、3、6、7、8及び9の間で厳密に保存された残基である。緑色(V465、P468、S469及びN470)及び黄色(I451、E500、F501、N515及びL517)のアミノ酸は、血清型の間で可変性であり、厳密に保存されたY446/L447(青)によりブリッジされた2個のクラスターを形成し、より大型のクラスターを形成する。図14Aは、AAV2R585E.9-1、AAV2R585E.9-2、AAV2R585E.9-3、AAV2R585E.9-4及びAAV2R585E.9-5カプシドのアミノ酸配列を描写する図である。赤色の残基は、AAVバーコード-Seq解析を用いて同定されたガラクトース結合モチーフの一部(9-1、9-3及び9-4)又は全長(9-2)を作製するためにAAV2R585Eカプシドに導入された突然変異である。図14Bは、AAV2R585E.9-1、9-2、9-3、9-4及び9-5カプシドを有するLec2及びPro5細胞形質導入AAV-CMV-GFPベクターを描写する図である。陰性対照は、GFP発現プラスミドをトランスフェクトした293細胞のライセートである。図14Cは、Pro5及びLec2細胞に結合する各AAVベクターの能力を描写する棒グラフである。9-2及び9-3は、Lec2細胞に効率的に結合し、これらが、AAV9一次受容体、ガラクトースに結合する能力を有することを示す。図14Dは、各AAVベクターがPro5及びLec2細胞を形質導入する効率を描写する棒グラフである。AAV9-3は、ガラクトースに結合するが、9-3は、AAV9又はAAV9-2ほどには効率的にLec2細胞を形質導入しない。図14Eは、付着後(postattachment)ウイルスプロセシングに重要な、--EFAW--RNSL--モチーフ(右半分)を描写する図画である。図15は、本明細書に記載されているガラクトース結合モチーフの一部(potion)を保有する、ヘキサペプチド走査AAV2R585E変異体のLec2形質導入効率を描写する図である。n.a.、インタクトなウイルス粒子の不十分な産生のために適用されない。図16Aは、9-2のin vivo形質導入効率を示す画像のセットである。AAV-CMV-lacZベクターを、AAV2R585E.9-2カプシドによりパッケージングした。これを、マウス当たり1×10¹²ベクターゲノムの用量で、野生型C57Bl/6 Rag1-/-マウスに注射した。画像は、9-2が、AAV9と同じほど効率的に心臓及び肝臓を形質導入できることを示す。親AAV2R585Eは、効率的に心臓を形質導入したが、肝臓を形質導入しなかった。図16Bは、AAV2R585E(親)及び9-2の間の導入遺伝子発現の差を示す画像のセットである。9-2に取り込まれるアミノ酸置換は、動態を有意に加速する。図16Cは、サザンブロット解析によって決定される、示されている組織におけるベクターゲノムコピー数の描写を示す図である。図17は、4℃にてPro5及びLec2細胞に結合するAAV2、AAV9及びAAV9 Y484A/R485Aウイルス粒子を用いた細胞表面結合アッセイの結果を描写する棒グラフである。細胞表面に結合した粒子を、ウイルスゲノムqPCRによって定量化した。図18は、競合者としての100倍過剰のAAV5の存在又は非存在下での細胞表面結合アッセイの結果を描写する棒グラフである。AAV5は、AAV9 Y484A/R485Aの存在下を除いて細胞表面結合に効果がなかった。図19は、in vitroにおける4種の細胞株におけるY484及び/又はR485変異体の形質導入効率を描写する画像のセットである。Y484A/R485A突然変異は、細胞表面結合を増加させるが、形質導入の増加をもたらさない。各単一突然変異(Y484A単独又はR485A単独)は両者共に、形質導入効率を増加させたが、野生型ウイルスには同様の結合であった。図20は、後述する表4及び実施例12の結果を示す棒グラフである。示されている変異体は、肝臓に不十分に形質導入する。形質導入効率は、野生型AAV9の形質導入効率に対し正規化される。データは、3匹の動物の平均値及び標準偏差を表す。図21は、AAV9P504A/G505A及びAAV9Q590ベクターのin vivo形質導入効率を示す画像のセットである。AAV-CMV-lacZベクターをこれらのAAV9変異体カプシドによりパッケージングし、マウス当たり1×10¹²ベクターゲノムの用量でC57Bl/6又はRag1-/-マウスに投与した。注射6週間後にXGal染色により組織形質導入効率を評価した。2種の変異体は、野生型AAV9と同じほど効率的に心臓を形質導入しつつ、肝臓を回避した。図22は、P504/G505(青)及びQ590(赤)のトポロジー位置(topological location)の表示を示す図である。これらは、一次構造及び三次(3D)構造においては別々に存するが、四次構造においては3回対称軸領域に隣同士に位置する。図23は、サザンブロット解析によって決定される、組織におけるベクターゲノムコピー数を示す図である。値は、AAV9形質導入組織において観察される値により正規化される。図24は、肝臓標的解除(detargeting)突然変異AAV2R585E.9-2 T503A/G504A(mtTG)、AAV2R585E.9-2 Q589A(mtQ)及びAAV2R585E.9-2 T503A/G504A/Q589A(mtTGQ)を含む、AAV2R585E.9-2由来変異体の配列を描写する図である。図25は、AAV9を背景として同定される肝臓標的解除突然変異を保有するAAV2R585E.9-2由来変異体のin vitro形質導入効率を示す画像のセットである。全変異体、mtTG、mtQ及びmtTGQは、親AAV2R585E及び野生型AAV9と同じin vitro形質導入プロファイルを示す。図26は、細胞表面結合アッセイの結果を示す図である。全変異体、mtTG、mtQ及びmtTGQは、親AAV2R585E.9-2と同じほど効率的に、また野生型AAV9よりもおよそ3倍優れてLec2細胞に結合する。図27は、AAV9を背景として同定される肝臓標的解除突然変異を保有するAAV2R585E.9-2由来変異体のin vivo形質導入効率を示す画像のセットである。変異体、mtTG及びmtTGQは、心臓形質導入効率を保存した肝臓標的解除表現型を示した。mtQは、いかなる効果も持たなかったが、補助的役割を有した。C57BL/6野生型マウス及びRag1-/-マウスに、図に示されているAAVカプシドによりカプシド形成されたAAV-CMV-lacZベクターを注射した。注射11日(野生型マウス)及び6週間(Rag-/-マウス)後に、XGal染色により組織形質導入効率を決定した。

用語「AAVベクター」は、本明細書において、AAVの構成要素を含む又はこれに由来し、且つin vitroであれin vivoであれ、脳、心臓、肺、骨格筋、肝臓、腎臓、脾臓又は膵臓等、多数の組織型のいずれかの、ヒト細胞を含む哺乳動物細胞の感染に適したいずれかのベクターを意味する。用語「AAVベクター」は、対象とするタンパク質をコードする少なくとも核酸分子を含むAAV型ウイルス粒子(又はビリオン)を指すよう使用し得る。

その上、本明細書に開示されているAAVは、血清型の組み合わせを含む様々な血清型(例えば、「偽型」AAV)又は様々なゲノム(例えば、一本鎖又は自己相補的)に由来し得る。特定の実施形態において、本明細書に開示されているAAVベクターは、所望のタンパク質又はタンパク質バリアントを含み得る。「バリアント」は、本明細書において、1個以上のアミノ酸が変更されたアミノ酸配列を指す。バリアントは、置換アミノ酸が同様の構造的又は化学的特性を有する「保存的」変化、例えば、イソロイシンによるロイシンの置き換えを有し得る。より稀には、バリアントは、「非保存的」変化、例えば、トリプトファンによるグリシンの置き換えを有し得る。類似の僅かな変動は、アミノ酸欠失若しくは挿入又はその両方をも含み得る。ある特定の実施形態において、本明細書に開示されているAAVベクターは、配列番号1又は配列番号4とは1個以上のアミノ酸が異なるタンパク質を含み得る。

本開示のタンパク質をコードするポリヌクレオチド等、ヌクレオチド配列が、本明細書において提供される。本開示のヌクレオチドは、RNA又はDNAのいずれかで構成され得る。本開示は、本明細書に開示されているポリヌクレオチドと配列が相補的なポリヌクレオチドも包含する。

遺伝暗号の縮重のために、種々の異なるポリヌクレオチド配列が、本開示のタンパク質をコードすることができる。加えて、本明細書に開示されているものと同じ又は基本的に同じタンパク質をコードする代替的なポリヌクレオチド配列を作製することは、十分に当業者の技能範囲内である。これらのバリアント又は代替的なポリヌクレオチド配列は、本開示の範囲内に収まる。本明細書において、「基本的に同じ」配列の言及は、本開示のポリヌクレオチドにコードされるポリペプチドの検出性を除去しないアミノ酸置換、欠失、付加又は挿入をコードする配列を指す。

本開示は、本明細書に開示されているポリヌクレオチド及びポリペプチドのバリアントも含む。バリアント配列は、配列中の1個以上のペプチド又はヌクレオチドが置換、欠失、及び/又は挿入されている配列を含む。

本開示のポリヌクレオチド及びポリペプチド配列は、本明細書に記載されているある特定のポリヌクレオチド及びポリペプチドとの特定の同一性及び/又は類似性の観点から定義することもできる。配列同一性は、典型的には、60%を超え、好ましくは75%を超え、より好ましくは80%を超え、更により好ましくは90%を超え、また、95%を超えることができる。配列の同一性及び/又は類似性は、本明細書に開示されている配列と比較して、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、又は99%となり得る。他に規定がなければ、本明細書において、2つの配列のパーセント配列同一性及び/又は類似性は、Karlin and Altschul(1993)に記載されている通りに改変された、Karlin and Altschul(1990)のアルゴリズムを用いて決定することができる。そのようなアルゴリズムは、Altschulら(1990)のNBLAST及びXBLASTプログラムに取り込まれている。BLAST検索をNBLASTプログラム、スコア=100、ワード長(wordlength)=12により行って、所望のパーセント配列同一性を有する配列を得ることができる。比較目的のギャップ付きアライメントを得るために、ギャップ付きBLASTを、Altschulら(1997)に記載されている通りに用いることができる。BLAST及びギャップ付きBLASTプログラムを利用する場合、それぞれのプログラム(NBLAST及びXBLAST)のデフォルトパラメータを用いることができる。

本明細書に開示されているAAVベクターを産生する方法は、本技術分野において周知のものであり、例えば、パッケージング細胞、補助ウイルス若しくはプラスミド及び/又はバキュロウイルス系を用いる方法を含む(例えば、Samulskiら、J. Virology 63、3822(1989);Xiaoら、J. Virology 72、2224(1998);Inoueら、J. Virol. 72、7024(1998);国際公開第1998/022607号パンフレット;及び国際公開第2005/072364号パンフレットを参照)。

偽型AAVベクターを産生する方法(例えば、国際公開第00/28004号パンフレットを参照)と共に、in vivo投与においてその免疫原性を低下させるためのAAVベクターの様々な改変又は製剤も知られている(例えば、国際公開第01/23001号パンフレット;国際公開第00/73316号パンフレット;国際公開第04/112727号パンフレット;国際公開第05/005610号パンフレット;及び国際公開第99/06562号パンフレットを参照)。一部の実施形態において、AAVベクターは、一体に混合又は他の種類のウイルスと混合してキメラ(例えば、偽型)AAVウイルスを産生し得る、AAVの様々な血清型から調製してよく、或いはこれに由来してもよい。

特定の実施形態において、AAVベクターは、ヒト血清型AAVベクターであってもよい。このような実施形態において、ヒトAAVは、いかなる公知の血清型、例えば、血清型1〜11のいずれか1種、例えば、AAV1、AAV2、AAV4、AAV6又はAAV9に由来し得る。このようなAAVベクターの特異的な非限定的な一例として、対象とするタンパク質の発現カセットをコードする核酸、及び配列番号1又は配列番号4とは1個以上のアミノ酸が異なるAAV9由来カプシドにおける対象とするタンパク質をコードする核酸に動作可能に連結された、ITR及びパッケージング配列を含む核酸分子を含むベクターを挙げることができる。

ある特定の実施形態において、本明細書に開示されているAAVベクターは、そのウイルスカプシドのアミノ酸配列における以下の残基:L380、T381、L382、N383、I440、D441、Y446、L447、T450、I451、V465、P468、S469、N470、M471、Q474、G475、Y484、R485、E500、F501、W503、P504、G505、R514、N515、S516、L517、及びA590のうち1つ以上の少なくとも1つの突然変異を含み得る。例えば、本明細書に開示されているAAVベクターは、L380A、T381A、L382A、N383A、I440A、D441A、Y446A、L447A、T450A、I451A、V465A、P468A、S469A、N470A、M471A、Q474A、G475A、Y484A、R485A、E500A、F501A、W503A、P504A、G505A、R514A、N515A、S516A、L517A、及びA590Aから選択される少なくとも1つの突然変異を含み得る。更なる実施形態において、本明細書に開示されているAAVベクターは、L380A/T381A、L382A/N383A、I440A/D441A、Y446A/L447A、T450A/I451A、P468A/S469A、N470A/M471A、Q474A/G475A、Y484A/R485A、E500A/F501A、R514A/N515A及びS516A/L517Aから選択される少なくとも1つの二重突然変異を含み得る。

特定の実施形態において、本明細書に開示されているAAVベクターは、そのウイルスカプシドのアミノ酸配列における以下の残基:Q464、A467、D469、I470、R471、D472、S474、Y500、S501及びD514のうち1つ以上の少なくとも1つの突然変異を含み得る。例えば、本明細書に開示されているAAVベクターは、Q464R、Q464V、A467P、D469G、D469T、I470M、R471A、R471S、D472V、D472E、D472N、S474P、S474A、S474G、Y500E、S501F、及びD514Rから選択される少なくとも1つの突然変異を含み得る。

一部の実施形態において、本明細書に開示されているAAVベクターは、配列番号1、配列番号4、配列番号5、配列番号6、配列番号7、配列番号8、配列番号9、配列番号10、配列番号11、配列番号12、配列番号13、配列番号14、配列番号15、配列番号16、配列番号18、配列番号19、配列番号20、配列番号21、配列番号23、配列番号24、及び配列番号25又はこれらの断片のうち少なくとも1つから選択されるアミノ酸配列を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含み得る。

本明細書に開示されているAAVベクターは、対象とするタンパク質をコードする核酸を含み得る。様々な実施形態において、核酸は、例えば、プロモーター、エンハンサー、ポリアデニル化シグナル、配列内リボソーム進入部位(IRES)、タンパク質形質導入ドメイン(PTD)をコードする配列その他等、対象とするタンパク質の発現と、一部の実施形態においては、分泌を可能にする1種以上の調節配列も含み得る。よって、一部の実施形態において、核酸は、感染細胞における対象とするタンパク質の発現をもたらす又はこれを改善するために、コード配列に動作可能に連結されたプロモーター領域を含み得る。このようなプロモーターは、遍在性、細胞又は組織特異的、強い、弱い、調節された、キメラ等であってよく、例えば、感染組織におけるタンパク質の効率的且つ安定的な産生を可能にする。一般に、開示されている方法に有用なプロモーターは、ヒト細胞において機能的であるが、プロモーターは、コードされているタンパク質に同種であっても異種であってもよい。調節されるプロモーターの例として、Tet on/offエレメント含有プロモーター、ラパマイシン誘導性プロモーター、タモキシフェン誘導性プロモーター及びメタロチオネインプロモーターを限定することなく挙げられる。使用し得る他のプロモーターとしては、腎臓、脾臓及び膵臓等、組織に組織特異的なプロモーターがある。遍在性プロモーターの例として、ウイルスプロモーター、特に、CMVプロモーター、RSVプロモーター、SV40プロモーター等並びにPGK(ホスホグリセリン酸キナーゼ)プロモーター及びβ-アクチンプロモーター等の細胞プロモーターが挙げられる。

本明細書に開示されているAAVベクターの一部の実施形態において、1種以上のフィードバックエレメントを用いて、対象とするタンパク質の過剰発現の勢いを弱めてもよい。例えば、AAVベクターの一部の実施形態は、外因的転写物を標的化し得る1種以上のsiRNA配列を含み得る。他の実施形態において、AAVベクターは、阻害性転写因子により認識され得る1種以上の追加的なプロモーターを含み得る。様々な実施形態において、本明細書に開示されているAAVベクターは、対象とするタンパク質の発現レベルを生理的レベルに維持し得る恒常性フィードバックループを生じ得るコンストラクトを含み得る。

様々な実施形態において、本明細書に開示されているAAVベクターは、コードされるタンパク質の分泌を可能にするリーダー配列を含み得る核酸を含むことができる。一部の実施形態において、分泌シグナルペプチド(通常、分泌されるポリペプチドのN末端に位置する)をコードする配列と対象とする導入遺伝子との融合は、形質導入細胞から分泌され得る形態での治療タンパク質の産生を可能にし得る。そのようなシグナルペプチドの例として、アルブミン、β-グルクロニダーゼ、アルカリプロテアーゼ又はフィブロネクチン分泌シグナルペプチドが挙げられる。

本明細書に記載されている通り、脳、心臓、肺、骨格筋、腎臓、脾臓又は膵臓における、対象とする治療タンパク質の有効且つ長期の発現は、AAV9ベクター又はAAV2ベクター等、ある特定のAAVベクターの末梢投与による非観血的技法により達成し得る。そのような末梢投与は、脳、心臓、肺、骨格筋、腎臓、脾臓又は膵臓への直接注射を必要としないいずれかの投与経路を含み得る。より詳細には、末梢投与は、筋肉内、静脈内、腹腔内、動脈内又は皮下注射等、全身性注射を含み得る。一部の実施形態において、末梢投与は、経口投与(例えば、国際公開第96/40954号パンフレットを参照)、インプラントを用いた送達(例えば、国際公開第01/91803号パンフレットを参照)又は呼吸器系を介した滴下注入による投与、例えば、スプレー、エアロゾル若しくは他のいずれかの適切な製剤の使用を含んでもよい。

様々な実施形態において、AAVベクターの所望の用量は、例えば、疾患状態、被験体、処置スケジュール等に応じて、当業者によって容易に適応し得る。一部の実施形態において、用量当たり10⁵〜10¹²ウイルスゲノム、例えば、10⁶〜10¹¹、10⁷〜10¹¹又は10⁸〜10¹¹が投与される。他の実施形態において、治療効果を達成するための例示的な用量は、少なくとも約10⁵、10⁶、10⁷、10⁸、10⁹、10¹⁰若しくは10¹¹のウイルスゲノム又はそれ以上のウイルス力価を含み得る。ウイルス力価は、当業者であれば容易に計算し得る形質導入単位を単位として表現してもよい。

様々な実施形態において、本明細書に開示されているAAVベクターは、いずれかの適した形態で、例えば、液体の溶液若しくは懸濁液、注射に先立つ液体への溶解若しくは懸濁に適した固形、ゲル又はエマルションのいずれかとして投与し得る。ベクターは、いずれかの適切な且つ薬学的に許容される添加剤、担体、アジュバント、希釈剤等により製剤化し得る。例えば、注射のために、適した担体又は希釈剤は、等張性溶液、バッファー、無菌且つパイロジェン・フリー水、又は例えば、無菌且つパイロジェン・フリーリン酸緩衝生理食塩水であってよい。吸入のために、担体は、粒子状であってよい。

ベクターは、「治療的有効」量、例えば、疾患状態に関連する症状の少なくとも1種を軽減(例えば、減少、低下)するのに、又は被験体の状態に改善をもたらすのに十分な量で投与し得る。一部の実施形態において、例えば、同じ若しくは異なる末梢投与経路、及び/又はAAV9若しくはAAV2の異なる変異体型等の同じベクター若しくは別個のベクターのいずれかを用いて反復投与を行ってもよい。

配列
配列番号1は、未変異AAV9カプシドのアミノ酸配列である。

配列番号2は、未変異AAV9カプシドの核酸配列である。

配列番号3は、pAAV9-SBBANN2-BCプラスミドの核酸配列である。

配列番号4は、未変異AAV2カプシドのアミノ酸配列である。

配列番号5は、変異体AAVR585E-465-16000のアミノ酸配列である。

配列番号6は、変異体AAVR585E-465-00700のアミノ酸配列である。

配列番号7は、変異体AAVR585E-465-00080のアミノ酸配列である。

配列番号8は、変異体AAVR585E-465-00009のアミノ酸配列である。

配列番号9は、変異体AAVR585E-467-16000のアミノ酸配列である。

配列番号10は、変異体AAVR585E-467-00080のアミノ酸配列である。

配列番号11は、変異体AAVR585E-467-00009のアミノ酸配列である。

配列番号12は、変異体AAVR585E-469-00080のアミノ酸配列である。

配列番号13は、変異体AAVR585E-469-00009のアミノ酸配列である。

配列番号14は、変異体AAV2R585E.9-1のアミノ酸配列である。

配列番号15は、変異体AAV2R585E.9-2のアミノ酸配列である。

配列番号16は、変異体AAV2R585E.9-3のアミノ酸配列である。

配列番号17は、pUC118-AAV2R585E-SBBXEB-PBSのヌクレオチド配列である。

配列番号18は、変異体AAV2R585E.9-4のアミノ酸配列である。

配列番号19は、変異体AAV2R585E.9-5のアミノ酸配列である。

配列番号20は、P504A/G505A二重変異体のアミノ酸配列である。

配列番号21は、Q590A変異体のアミノ酸配列である。

配列番号22は、pHLP22-R585E.92プラスミドのヌクレオチド配列である。

配列番号23は、AAV2R585E.9-2 T503A/G504A二重変異体のアミノ酸配列である。

配列番号24は、AAV2R585E.9-2 Q589A変異体のアミノ酸配列である。

配列番号25は、AAV2R585E.9-2 T503A/G504A/Q589A三重変異体のアミノ酸配列である。

次の実施例は、開示されている方法を説明するものである。本開示を踏まえると、当業者であれば、過度の実験を行うことなく、これらの実施例の変種及び開示されている方法の他の実施例が可能となることを認識するであろう。

[実施例1]
AAVバーコード-Seq
pAAV9-SBBANN2-BCは、AAV9カプシドのハイスループットな部位特異的突然変異誘発を容易にするよう設計された野生型AAVプラスミドである。pAAV9-SBBANN2-BCの合成に用いられる親プラスミドは、野生型AAV2プラスミドpUC620(Avigen Inc.)及びAAV9ヘルパープラスミドp5E18-VD2/9(Gaoら、2004、上記参照)であった。

pAAV9-SBBANN2-BCプラスミドを次の通りに合成した。

pUC620におけるAAV2カプシド遺伝子を、p5E18-VD2/9由来のAAV9 cap遺伝子(配列番号2)に置き換えた。Bgl II部位もカプシド遺伝子オープンリーディングフレーム(ORF)の下流に導入した。その上、AAV2 rep遺伝子にサイレント突然変異を導入して、新たなSph I部位を作製した。また、AAV9 cap遺伝子内にサイレント突然変異を導入して、AAV9カプシド変異体の簡便な分子クローニングのための新たなBspEI、Afl II及びNde I部位を作製した。最後に、2個の12ヌクレオチドウイルスDNAバーコード(VBC)、VBCを効率的にPCR増幅するための3個のプライマー結合部位及び定量的PCRを容易にするプローブ配列のセットを含むカセットを、AAVゲノムのポリアデニル化シグナルの3'にサブクローニングした(図1)。

pAAV9-SBBANN2-BCにおけるNheI及びBsrGI制限部位の間にランダム配列を有する二本鎖オリゴヌクレオチドを挿入することにより、DNAバーコード化pAAV9-SBBANN2-BCに基づくプラスミドライブラリーを作製した。続いて、そのライブラリーをプラットフォームとして用いて、DNAバーコード化カプシド変異体AAVプラスミドライブラリーを作製した。pAAV9-SBBANN2-BCに基づくライブラリーは、7×10⁶種もの個々のプラスミドを含むことができる。

定義された位置に二重アラニン突然変異を有するDNAバーコード化pAAV9-SBBANN2-BCプラスミドコンストラクトを合成した。図3に図解されているブリッジPCR技法を用いて、AAV9カプシドタンパク質(配列番号1)における定義された位置に二重アラニン突然変異を導入する。そこで図3を参照すると、左及び右側のDNA断片が、対応するPCRプライマーセットによって個々に増幅され、Dpn Iで処理される。次に、増幅された断片は、ブリッジPCR反応の鋳型として用いられる。図中の星印は、導入するべき突然変異を示す。次に、増幅された断片は、RE1及びRE2に示される部位を切断する制限酵素で切断される。次に、増幅され制限酵素処理された断片を、pAAV9-SBBANN2-BCの対応する制限酵素部位に挿入する。突然変異誘発は、カプシドタンパク質への2つの連続したアラニン突然変異の導入に用いられるGCTGCT配列を含むPCRプライマーを用いて行う。

ブリッジPCR反応のおよそ10種の産物を混合し、対応する制限部位で切断した単一のプラスミドにこれを加え、プラスミド中にこれをライゲーションすることにより、プラスミドライブラリーを作製した。DNA配列決定により、また、制限酵素消化と続くDNAのゲル電気泳動により、プラスミドインサートの取り込み及び/又は所望の突然変異の存在の確認を行った。

図2は、AAV2R585E-SBBXEB-BCのウイルスゲノムマップである。AAV2R585E-SBBXEB-BCは、pUC118-AAV2R585E-SBBXEB-PBS(配列番号17)の派生体であるプラスミドpAAV2R585E-SBBXEB-BCを用いてHEK293細胞において産生することができる。pUC118-AAV2R585E-SBBXEB-PBSに次の変化を生じさせて、pAAV2R585E-SBBXEB-BCを作製した:cap遺伝子オープンリーディングフレーム(ORF)の下流にBgl II部位を導入し;AAV2 cap遺伝子にR585E突然変異を導入して、AAV2のヘパリン結合能力を除去し;AAV2 rep遺伝子にサイレント突然変異を導入して、Sph I部位を作製し;AAV2 cap遺伝子内にサイレント突然変異を導入して、AAV2カプシド変異体の簡便な分子クローニングのための新たなBspEI、Xba I及びEag I部位を作製し; AAV2 cap遺伝子内にサイレント突然変異を導入して、AAV2カプシド変異体の分子クローニングを容易にするために2個の位置に新たなDpn I部位を作製し;2個の12ヌクレオチドウイルスDNAバーコード(VBC)、VBCをPCR増幅するための3個のプライマー結合部位及びqPCRの標的配列のセットを含有するカセットをAAVゲノムのポリアデニル化シグナルの下流に置いた。

上述の通り、pAAV2R585E-SBBXEB-BCにおけるNheI及びBsrGI制限部位の間にランダム配列を有する二本鎖オリゴヌクレオチドを挿入することにより、DNAバーコード化pAAV2R585E-SBBXEB-BCプラスミドライブラリーを作製した。続いて、そのライブラリーをプラットフォームとして用いて、DNAバーコード化カプシド変異体AAVプラスミドライブラリーを作製した。pAAV2R585E-SBBXEB-BCライブラリーは、6×10⁶種もの個々のプラスミドを含むことができる。そのようなライブラリーは、定義された位置におけるヘキサペプチド置き換え突然変異により合成した(図2、右パネル)。

次に、そのプラスミドから、DNAバーコード化AAVウイルスライブラリーを産生した。AAV産生及び精製は、AAV産生においてAAVヘルパープラスミドが用いられないことを除いて、参照により本明細書に援用するGrimm Dら、Blood 102、2412〜2419(2003)に記載されている通りのものである。これは、rep及びcap遺伝子の両方を保有するライブラリーにおけるAAVのためである。従って、AAVヘルパープラスミドは、ライブラリープラスミドからのウイルスの産生に必要とされない。各ライブラリーは、それぞれそのウイルスゲノムにDNAバーコードの特有のセットを有する数百種の異なるAAVカプシド変異体を含有し得る。

AAVライブラリーが、複数の異なる変異体プラスミドを含有するプラスミドDNAプールを用いて産生される場合、遺伝子型-表現型解離、又はウイルスゲノムが必ずしもビリオンのカプシドタンパク質をコードしないかもしれないカプシドモザイク現象が起こり得る(参照により本明細書に援用するMuller OJら、Nat Biotechnol 21、1040〜1046(2003))。この可能性をなくすために、対照及び変異体の各AAVクローンは、個々に産生され、次にウイルス産生の完了後に混合される。続いて、Grimmら、2003、上記参照に記載されている手順に従って、ウイルスクローンプールを精製する。

図4は、AAVバーコード-Seq解析の概要を示す。対象とする試料から、AAVウイルスゲノムを抽出した。AAVウイルスゲノムは、この場合、ライブラリーに存在する様々なAAVクローンに由来するAAVウイルスゲノムであった。各AAVクローンのウイルスゲノムは、2種のウイルスDNAバーコード(図4においてVBCx-1及びVBCx-2として示し、xはクローン番号を表す)のクローン特異的セットを有する。試料に存在する全VBCx-1及びVBCx-2は、それぞれVBC-1及びVBC-2特異的プライマーセットによりPCR増幅することができる。各プライマーは、Illumina配列決定の多試料指標化のための試料特異的バーコード(SBC)によりタグ付けされる。用いられているSBCは、Craigら(参照により本明細書に援用するCraig DWら、Nat Methods 5、887〜893(2008))により以前に報告された5ヌクレオチド長のSBCであった。しかし、より長い又はより短いバーコードを用いてもよい。Illumina配列決定において1レーン当たりに用いられるSBC指標化PCR産物の最大数は、96種(48種のSBC×2種のVBC)であった。対象とする全試料から全VBC-1及びVBC-2 PCR産物が得られると、これらを一体に混合し、Illumina配列決定に付した。参照画像構築(参照により本明細書に援用するBentley DRら、Nature 456、53〜59(2008))におけるPCR産物の低い配列多様性が、PCR産物のIllumina配列決定の使用において生じ得るが、フレームシフトプライマーの使用により、この潜在的な問題を克服した。

1レーン当たりおよそ1千万〜1億のリード(read)を生じるIllumina GAIIx又はHiSeq2000を用いてIllumina配列決定を行った。Perlにおいて実行されるアルゴリズムによるSBC及びVBCに従って配列決定リードを選別した。

[実施例2]
試料におけるAAVゲノムを定量化するためのAAVバーコード-Seqの使用
AAVバーコード-Seqは、ウイルスゲノムが、試料におけるDNA分子の0.0001%未満のみを占め得るという特定の課題に直面する。結果として、試料に存在するウイルスゲノムは、配列決定前にPCR増幅される。

AAVバーコード-Seqが、どの程度正確に試料におけるウイルスゲノムを定量化することができるかについて取り組むために、3種のプラスミドDNAプールを作製した。各プールは、100種のpAAV9-SBBANN2-BCクローンからなり、各クローンは、特有のVBC1及びVBC2を有した。プール1は、同じ濃度のpAAV9-SBBANN2-BCクローンを含有し、一方、プール2及び3は、最大10000倍異なる様々な、但し公知の濃度のpAAV9-SBBANN2-BCクローンの混合物であった。プール2において、クローンNo.1及びクローンNo.100は、それぞれ最低及び最高濃度にセットされたが、プール3において、クローンno.1及びno.100の濃度は、それぞれ最高及び最低濃度としてセットされた。PCR鋳型として3種のプールを用いて、SBCタグ付きプライマーを用いた35サイクルのPCRにより、VBC1及びVBC2を独立的に増幅した。PCR反応を4連で行い、得られたPCR産物を配列決定した。

1種のPCR産物(即ち、1種のSBC指標化VBC1又はVBC2 PCR産物)につき400K〜3Mの範囲において配列リード数を得た。プール1を用いる場合、4連のPCR産物における100種のVBC配列リード数の変動係数の平均(分布の正規化された散布度)は、それぞれVBC1及びVBC2に対し0.63及び0.57であったが、4連のPCR産物における同じVBCの包括的に正規化された配列リード数の変動係数の平均は、VBC1及びVBC2に対し0.13及び0.19であった。VBC間の相対的に高い変動係数は、PCR増幅効率が、VBCの配列に応じてある程度変動し得ることを示す。4回の独立的PCR反応における同じVBCの正規化した配列リード数間の僅かな程度の分散は、高い再現性を示す。リード数が、プール1を用いた実験によって決定された相対PCR増幅効率により包括的に正規化及び補正される場合、プール2及び3は、配列リード数が、それぞれVBC1及びVBC2に対する0.93及び0.96のピアソン係数による少なくとも3log範囲において各バーコードの濃度と直線的に相関することを示した(図5を参照)。

AAVバーコード-Seqにおいて、DNAバーコード化AAVライブラリーは、変異体クローンに加えて、ヘパリン結合性変異体AAV2R585E由来のカプシドと同様に野生型AAV9カプシドを有する参照AAVクローンを含有し得る。その上、ライブラリーにおいて、参照当たり複数のクローン及び/又は変異体当たり複数のクローンが含まれ得る。その他の点では同一の2種の参照クローンが異なるVBCを有し得るように、このような複数のクローンのそれぞれは、その個々のVBCが異なり得る。

解析の感度及び検定力を調べるために、それぞれ118種のpAAV9-SBBANN2-BCクローンを含有する2種のプラスミドDNAプールを作製した。プール内の各クローンは、VBC1及びVBC2の特有のセットを有した(図6を参照)。1つのプールは、参照対照及びシミュレートされる変異体が等モル比で混合されたAAVライブラリーストックから回収されるウイルスゲノムを模倣する(図6Aを参照)。第2のプールは、変異体クローンが変動濃度で存在する実験試料から回収されるウイルスゲノムを模倣する - 例えば、1×のプールにおける表示を有する2種のゲノムを仮定すると、残るクローンは、濃度ごとの2種のゲノムにより、1/16×、1/8×、1/4×、1/2×、2×、4×、8×又は16×で表すことができる(図6Bを参照)。AAV-バーコードSeqを用いてプールを解析した。マンホイットニーのU検定と組み合わせたモンテカルロシミュレーションは、AAV-バーコードSeqに対し高い感度及び検定力を示した(図6Cを参照)。

[実施例3]
in vivoにおけるAAVライブラリーの分布を試験するためのAAVバーコード-Seqの使用
AAVライブラリー394を2匹のマウスに注射し、注射11日後に肝臓組織を摘出した。肝臓組織から抽出された総DNAからのPCRによりVBCをPCR増幅し、配列決定した。用いたAAVライブラリー(ライブラリーID394)は、遺伝的に同一であるが、別々の培養皿で合成された100種のAAV9ウイルス調製物の混合物から構成された。100種のAAV9クローンのそれぞれは、そのウイルスゲノムに取り込まれたDNAバーコードのクローン特異的セットを有するため、個々に同定することができる。AAV9の組成は、下表1に要約されている。各クローンの肝臓形質導入効率は、一方のマウスにおいて0.25の変動係数を提示し、他方のマウスにおいて0.42を提示した。モンテカルロシミュレーションアプローチにより解析すると、AAVライブラリーにおける8種以上の参照クローンを含むことにより、<0.05のp値による2倍の差(2倍の増加及び減少)の検出において殆ど0.8の検定力が達成可能であった(図7を参照)。

[実施例4]
AAVバリアントのin vitro形質導入効率を評価するためのAAVバーコード-Seqの使用
HEK293細胞の集団に、10⁵の感染多重度(MOI)でDNAバーコード化AAVライブラリー394を感染させた。ライブラリーは、示されているAAV血清型及びバリアントを含有した。結果を図8に示す。

[実施例5]
AAVバリアントの血液クリアランスを評価するためのAAVバーコード-Seqの使用
AAV9が、マウスに静脈内注入すると、他の血清型と比較して特徴的な血液クリアランスの遅延を提示することが報告されている。加えて、AAV1は、血液循環から迅速に除去され、AAV2は、静脈内投与後の最初の30分間に非常に迅速に排出され、その後ゆっくりと排出される(図9A及び参照により本明細書に援用するKotchey NMら、Mol Ther 19、1079〜1089(2011)を参照)。

図9Bにおいて、AAVバーコード-Seqを用いても同じ薬物動態特色が観察された。図9Cは、2匹のマウスのみを用いた後にその結果が観察されたことを示す。AAVバーコード-Seqがない場合、同じ情報を得るためには、少なくとも33匹のマウスと相当量の時間が必要とされるであろう。

[実施例6]
中和抗体AAVバリアントに対する反応性を評価するためのAAVバーコード-Seqの使用
無処置マウスと、AAVライブラリーID394の静脈内注入の3週間以上前にAAV9-CMV-lacZの1.0×10¹¹ベクターゲノム(vg)の静脈内注射により以前に免疫化したマウスに、AAVライブラリーID394(表2を参照)を静脈内注射することにより、AAVカプシドに対する中和抗体に対する反応性を調べた。次に、AAVバーコード-Seqにより各AAV血清型又はバリアントの血中濃度を定量化し、AAV9の血中濃度に対し正規化した。結果を図10に示す。

上述の通りAAVで以前に免疫化されたマウスの血液循環におけるAAV中和抗体のレベルが、注入されたAAVウイルス粒子の大部分を30分間以内に除去するために十分であることが以前に示されている(Kotchey NMら、2011、上記参照)。AAV9で以前に免疫化されたマウスにおいて、抗AAV9抗体により認識されない血清型のAAV9正規化された相対血中濃度は、AAV注射後の最初の1時間で有意に増加するであろう。増加は、抗AAV9抗体によって認識される血清型では生じない。各血清型又はバリアントの相対薬物動態プロファイルを、無処置動物及びAAV9抗体陽性動物の間で比較すると、抗AAV9抗体で中和されるAAV血清型又はバリアント(即ち、AAV8、AAVrh10及びAAV1.9-1)と、中和されないAAV血清型又はバリアントとの間で明らかな区別が観察された。抗AAV9中和抗体の交差反応性におけるこの観察は、AAVバーコード-Seqの結果が、他の方法(Gao Gら、2004、上記参照)によって得られる結果を繰り返すことを示す。

[実施例7]
AAVバリアントのin vivo形質導入を評価するためのAAVバーコード-Seqの使用
3匹のマウスに、1.0×10¹²vg/マウスの用量で尾静脈を介してAAVライブラリーID394を注射した。注射6〜8週間後に、様々な組織を摘出した。各組織試料から総DNAを抽出し、配列決定した。AAVバーコード-Seqは、高い形質導入効率を有することが知られたAAV8、AAV9及びAAVrh10が、AAVバーコード-Seqを用いても多くの組織において他の血清型と比較してより高い形質導入効率を提示することを明らかにした。同様に、AAV3は、低い形質導入を有することが知られ、この結果は、AAVバーコード-Seqを用いて繰り返される。

[実施例8]
AAVバーコード-Seqにより評価されるAAV9カプシドにおける突然変異
AAVの原子構造が最初に決定されたのは、2002年におけるAAV2であった(参照により本明細書に援用するXie Qら、Proc Natl Acad Sci USA 99、10405〜10410(2002))。それ以来、他の血清型、AAV1、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8及びAAV9の三次元構造が、X線結晶解析及び画像再構築と組み合わせたクライオ電子顕微鏡により完全に又は部分的に決定されている(これら全て参照により本明細書に援用する、DiMattia Mら、Acta Crystallogr Sect F Struct Biol Cryst Commun 61、917〜921(2005);Govindasamy Lら、J Virol 80、11556〜11570(2006);Lerch TFら、Virology 403、26〜36(2010);Miller EBら、Acta Crystallogr Sect F Struct Biol Cryst Commun 62、1271〜1274(2006);Nam Hら、J Virol 81、12260〜12271(2007);Padron Eら、J Virol 79、5047〜5058(2005);Quesada Oら、Acta Crystallogr Sect F Struct Biol Cryst Commun 63、1073〜1076(2007);Xie Qら、Virology 420、10〜19(2008))。

上述の構造は、AAVカプシド構造-機能関係性の知識を大いに前進させ、より優れた生物学的性能又は変更された指向性を有する新規AAVカプシドの作製を目標としたAAVカプシド遺伝子操作に関する研究を加速させている(参照により本明細書に援用するAsokan Aら、2012、上記参照及びGirod Aら、Nat Med 5、1438(1999))。タンパク質研究における主な戦略的パラダイムは、タンパク質構造情報を得てこれを用いて、潜在的な構造ドメインを同定し、その表現型的役割を予測し、続いて構造ドメインにおける標的化突然変異誘発を行って、表現型を解明することである。構造生物学アプローチは、対象とするタンパク質全体又はタンパク質複合体の包括的な実態を提示し、様々な種類のタンパク質の豊富な構造情報を活用して、機能を予測する(Thornton JMら、Nat Struct Biol 7、991〜994(2000))。そうであっても、このアプローチは、ウイルスカプシドの構造ドメインの役割を調べるために最も効率的な方法ではないかもしれない。カプシドの表現型的結果は、その四次構造に依存し、従って、ウイルスカプシドは、各ウイルス種に特異的な様式で、構造的に、機能的に及び多くの場合は共進化的に制約されている。結果として、突然変異誘発実験によって得られるデータを補完することなく専ら構造的試験によって、対象とする領域における各アミノ酸又はその群の機能的役割及び重要性を理解することは困難である。AAVカプシドに関して、ほんの1個又は数個のアミノ酸突然変異が、ウイルスカプシドの表現型を大いに変化させることができること、付与した突然変異とその結果得られる表現型との間の相関は、非常に予測不可能であることが示されている(これら全て参照により本明細書に援用する、Excoffon KJら、Proc Natl Acad Sci USA106、3865〜3870(2009);Pulicherla Nら、Mol Ther 19、1070〜1078(2011);及びVandenberghe LHら、Gene Ther 16、1416〜1428(2009))。

[実施例9]
pAAV2R585E-SBBXEB-BCプラスミドヘキサペプチドスクリーニング
AAV2カプシドにおけるヘキサペプチドが、AAV1、6、7、8又は9カプシドに由来する対応するヘキサペプチドに置き換えられたpAAV2R585E-SBBXEB-BCプラスミドコンストラクトを含むAAVバーコードSEQを用いて、追加的なライブラリーを作製する(図2)。これらのプラスミドコンストラクトを用いて、AAVウイルス粒子を産生する。AAV2R585Eカプシド変異体のこのセットにより、AAV1、6、7、8及び9カプシドの低保存性の短いアミノ酸ストレッチの機能的重要性を調べることができる。ブリッジPCR技法を用いて、定義された位置におけるヘキサペプチド配列をあるものから別のものへと変化させる(図2)。

[実施例10]
AAV2に末端ガラクトースの結合を付与する突然変異の同定
近年、2組の研究グループが、CHO細胞株、Pro5及びLec2を用いて、AAV9の一次受容体として細胞表面グリカンにおける末端ガラクトースを同定している(両者共に参照により本明細書に援用する、Bell CLら、J Clin Invest 121、2427〜2435(2011)及びShen Sら、J Biol Chem 286、13532〜13540(2011))。Lec2は、Pro5の派生体であり、シチジン一リン酸(CMP)シアル酸トランスポーターの欠損のため、その細胞表面グリカンにおける末端シアル酸を欠く(参照により本明細書に援用するEckhardt Mら、J Biol Chem 273、20189〜20195(1998))。これらの試験は、AAV9の表面結合及び形質導入効率が、無処理Pro5細胞と比べて、Lec2細胞及びノイラミニダーゼ処理Pro5細胞においてはるかに高いことを実証する。Lec5の形質導入の増強は、ガラクトース結合レクチンとの同時処理によって阻害される。ヘパラン硫酸プロテオグリカンは、AAV2の一次受容体であり、AAV2カプシドにおけるその結合モチーフが同定されている(両者共に参照により本明細書に援用する、Kern Aら、J Virol 77、11072〜11081(2003)及びOpie SRら、J Virol 77、6995〜7006(2003))。

AAV9二重アラニン変異体ライブラリーID401、406及び407を用いて、いずれのアミノ酸が、末端ガラクトース、AAV9の細胞表面受容体への結合に重要であるか調べた。細胞を4℃に予冷し、ライブラリーのそれぞれに曝露し、4℃で1時間インキュベートして、ウイルス粒子を細胞表面に結合させた。細胞表面に結合したAAV粒子を回収し、AAVバーコード-Seq解析に付した。

以下の突然変異のセット:L380A/T381A、L382A/N383A、I440A/D441A、Y446A/L447A、T450A/I451A、V465A、P468A/S469A、N470A/M471A、Q474A/G475A、Y484A/R485A、E500A/F501A、W503A、R514A/N515A及びS516A/L517Aを有する変異体は、野生型と比較して、Lec2細胞への細胞表面結合の有意な損失を提示した(即ち、細胞表面結合の>78%減少、p<0.05)。

ガラクトース結合に最も決定的なアミノ酸を絞り込むために、上に開示されているアミノ酸それぞれの進化的保存及びトポロジー位置を調べた。ガラクトース結合に決定的なアミノ酸は、進化的に可変性の、表面露出され、且つカプシドの表面上にクラスターを形成するアミノ酸であり、そのようなアミノ酸のそのようなセットは、AAV9に特有なものである筈である。

全AAVクレードのそれぞれを表すAAV1、2、3、6、7、8及び9のアミノ酸配列(Gaoら、2004)を、クレードに亘る保存のレベルに関して評価した。上述の26個のアミノ酸のうち、12個を除く全てが、AAV1、2、3、6、7、8及び9に亘って高度に保存されていた。このような非保存アミノ酸は、I451、V465、P468、S469、N470、M471、G475、Y484、E500、F501、N515及びL517であった。これら12個のアミノ酸のうち、9個(I451、V465、P468、S469、N470、E500、F501、N515及びL517)が、表面露出されて、カプシドの表面上に2個のサブクラスターを形成する:I451、E500、F501、N515及びL517は、一方のサブクラスターを形成し、V465、P468、S469及びN470は、もう一方のサブクラスターを形成する。これら2個のサブクラスターは、表面露出されたY446/L447によってブリッジされて、3回対称軸周りの3個の顕著なスパイクの間により大型のクラスターを形成する(図22)。AAV1、2、3、6、7、8及び9において完全に保存されているY446/L447の二重アラニン突然変異は、Lec2細胞結合能力の劇的な減少をもたらすため、本発明者らの観察は、その同族受容体への結合のためのAAV9特異的モチーフの機能の維持におけるY446/L447の重要な役割を示す。

この概念は、図13に図解されており、クラスターに収載されている9個のアミノ酸は、ウイルスカプシドタンパク質の表面上に2個のサブクラスターを構成した。I451、E500、F501、N515、L517は、中間的な灰色で示し、Y446及びL447は、濃い灰色で示し、V465、P468、S469及びN470は、薄い灰色で示す。

ガラクトース結合において役割を果たすアミノ酸として同定されたアミノ酸の役割を更に調べるために、AAV2カプシドがガラクトース結合モチーフを獲得するように、AAV2カプシドアミノ酸に変異導入した。この目的のために、本明細書において配列番号14、配列番号15、配列番号16、配列番号18及び配列番号19として同定された、AAV2R585E.9-1、AAV2R585E.9-2、AAV2R585E.9-3、AAV2R585E.9-4及びAAV2R585E.9-5を含むAAV2R585E.9シリーズを作製した。AAV2及びAAV9と比べたそれぞれにおける突然変異は、図14Aにおいて強調されている。図14B、図14C及び図14Dに示す通り、AAV2R585E.9-2は、AAV9に匹敵し、親AAV2R585Eよりもはるかに高いレベルでLec2細胞を形質導入し、一方、これは、AAV2R585E又はAAV9と同様の低レベルでPro5細胞を形質導入する。図14B、図14C及び図14Dは、Y500F/S501A/D514N突然変異のみを保有するAAV2R585E.9-1、Q464V/A476P/D469N/I470M/R471A/D472V/S474G突然変異のみを保有するAAV2R585E.9-3、A467P/D469N/I470M突然変異のみを保有するAAV2R585E.9-4及びA467P/D469N/I470M/R471A/D472V突然変異のみを保有するAAV2R585E.9-5は、AAV2R585E.9-2ほどには容易にLec2細胞を形質導入しなかったことも示す。この結果は、モチーフの右半分、--EFAW---RNSL--が、付着後ウイルスプロセシングに重要であり、ガラクトース結合に不要であることを示す。

このin vitro実験に加えて、マウスにおける9-2の生物学的特性を確立した。マウスに、9-2カプシドを含むAAV-CMV-lacZベクターを静脈内注射した。注射11日及び6週間後に、肝臓、心臓及び膵臓を含む様々な器官を摘出した。本明細書における図16A、図16B及び図16Cに示す通り、膵臓における形質導入効率は、AAV9のものに満たなかったが、9-2カプシドは、AAV9と同じほど効率的に肝臓及び心臓を形質導入した。9-2モチーフは、AAV2R585Eに、ガラクトースに結合し且つ肝臓を形質導入する能力を付与しただけではなく、AAV9のものと同様の程度まで導入遺伝子発現動態も加速した。

これらのデータは、AAV2R585E.9-2が、形質導入に関してAAV9様生物学的特性を獲得していること、そして細胞表面上におけるガラクトースに結合できることを示す。

DNAバーコード化ヘキサペプチド走査AAV2R585EライブラリーID396及び405を用いたPro5及びLec2細胞形質導入実験も、ガラクトース結合モチーフが、本発明者らが同定した領域に存するという本発明者らの結論を支持している。特に、ガラクトース結合モチーフに含有される「-P-NM-」配列は、Lec2への結合における観察される増強の重要なモチーフであると思われる。しかし、「-P-NM-」それだけでは、ガラクトース結合に十分ではなかった(図16)。AAV2R585Eが、追加的な突然変異、A464P/I470M又はI470M/R471Aを保有する場合、Lec2形質導入効率は、AAV2R585Eと比較して、統計的に有意に数倍増加する(表2)。しかし、A464P/I470M又はI470M/R471AのみのいずれかによるLec2形質導入の程度は、AAV2R585Eによるものにはるかに満たない。興味深いことに、R471A/D472Eが導入されると、A464P/I470M又はI470M/R471A突然変異による効果は消失する(AAVR585E-467-00700及びAAVR585E-469-00700を参照)。

[実施例11]
Y484A/R485A
特に、Y484A/R485A二重突然変異は、末端ガラクトースに結合する能力を欠くが、AAV9よりもはるかに高い効率で様々な細胞型に結合した。図17に示す通り、二重変異体は、親AAV9よりも60倍優れてPro5細胞に結合する。Pro5細胞のノイラミニダーゼ処理は、ウイルスの結合を損なわなかった。

単一突然変異AAV9Y484A及びAAV9R485Aを含むウイルスコンストラクトを開発し、AAV5を競合者として用いて細胞表面結合競合アッセイを行った。どちらの単一変異体も、細胞表面結合の増加を示さなかったが、驚くべき結果において、AAV9 Y484A/R485A二重変異体は、AAV5の存在下で、親野生型AAV9と比べて349倍優れた細胞表面結合を提示した(図18)。

細胞を形質導入するY484A及びR485A単一変異体の能力も検査した。図19は、Y484A/R485Y二重変異体が、形質導入効率を増加させなかったことを示す。しかし、驚くべきことに、各単一突然変異Y484A及びR485Aはそれぞれ、Lec2細胞における形質導入効率の増加を示した。

[実施例12]
肝臓への組織形質導入に影響を与えるAAV9カプシドアミノ酸突然変異の同定
総計3匹の成体雄マウスに、DNAバーコード化AAV9変異体ライブラリーID401、406及び407を静脈内注射した。次の12種の組織;脳、心臓、肺、肝臓、腎臓、脾臓、腸、膵臓、精巣、筋肉、脂肪及び皮膚、注射6〜8週間後。各組織から総DNAを抽出し、AAVバーコード-Seq解析に付した。表3は、二重アラニン変異体のためのAAV9変異体ライブラリーID#401、406、407の組成を示し、二重変異体の各セットの2種のクローンが含まれている。

表4及び図20は、P504A/G505A二重変異体及びQ590A単一変異体が、大部分の組織型の効率的な形質導入を呈するが、肝臓から排除されることを示す。

次に、これら2種の変異体をマウスにおいて検査した。AAV-CMV-lacZウイルスゲノムをこれらの変異体カプシドにパッケージングして、lacZマーカー遺伝子発現AAVベクターを作製した。次に、これらのベクターを、C57BL/6野生型マウス又はRag1-/-マウスへと静脈内注射して、組織形質導入効率を評価した。本発明者らは、注射11日後に野生型マウスから組織を摘出して、AAV媒介性遺伝子送達の初期相における導入遺伝子発現を調べた。より長期の評価のために、本発明者らは、注射6週間後にRag1-/-マウスから組織を摘出した。Rag1-/-免疫不全マウスを長期経過観察に用いて、免疫原性lacZ遺伝子産物に対する、有効性を限定する宿主免疫応答を回避した。結果として、本発明者らは、これら2種の変異体が、心臓を効率的に形質導入する能力を保存しつつ、肝臓標的解除表現型を有することを確認した(図21)。これらのアミノ酸は、タンパク質一次又は三次構造においては別々に位置するが、四次構造においては隣同士にある(図22)。これは、これら2種の突然変異が、ほぼ同じ表現型を示したという事実と整合する。肝臓標的解除性質は、ベクターゲノムコピー数の分子解析によっても確認された(図23)。

AAV2におけるT503/G504及びQ589は、AAV9におけるP504/G505及びQ590に対応する残基である。AAV2R585E.9-2カプシドにおけるこれらの残基へのアラニン突然変異の導入も、肝臓形質導入を媒介する能力を消失させるか調べるために、本発明者らは、T503A/G504A(mtTG)、Q589A(mtQ)及びT503A/G504A/Q589A(mtTGQ)を保有する3種のAAV2R585E.9-2カプシド変異体を作製し(図24)、これらにlacZ又はGFP発現AAVウイルスゲノムをパッケージングした。AAVベクター産生に用いたAAVヘルパープラスミドは、AAV2R585E.9-2の産生のためのAAVヘルパープラスミドであるpHLP22-R585E.9-2に基づき作製した。これらの変異体AAVベクターをin vitro及びin vivoの両方で検査した。in vitro形質導入パターンが、AAV9又は親AAV2R585E.9-2のものと同じであったという点において、in vitroにおける表現型の変化は観察されなかった(図25)。mtTG、mtQ及びmtTGQは全て、親AAV2R585E.9-2と同じほど効率的に、また、野生型AAV9よりもおよそ3倍優れてLec2細胞に結合した(図26)。しかし、マウスにおいて、mtTGが、肝臓形質導入を実質的に減弱化し、mtTGQが、肝臓形質導入を完全に消失させた一方、mtTG及びmtTGQが両者共に、心臓を形質導入する能力を保持したことが判明した(図27)。Q589Aは、AAV2R585E.9-2の背景では補助的な役割しか持たなかった。

Claims

L380、T381、L382、N383、I440、D441、Y446、L447、T450、I451、V465、P468、S469、N470、M471、Q474、G475、Y484、R485、E500、F501、W503、P504、G505、R514、N515、S516、L517及びQ590のうち少なくとも1つにおける突然変異を更に含む、配列番号1又はその断片のアミノ酸配列を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
を含む、アデノ随伴ウイルスプラスミド。
突然変異が、I451、V465、P468、S469、N470、M471、G475、Y484、E500、F501、N515及びL517のうち少なくとも1つにおけるものである、請求項1に記載のアデノ随伴ウイルスプラスミド。
突然変異が、Y484A及びR485Aのうち少なくとも1つである、請求項1に記載のアデノ随伴ウイルスプラスミド。
突然変異が、ウイルスカプシドタンパク質に存する、請求項1に記載のアデノ随伴ウイルスプラスミド。
Q464、A467、D469、I470、R471、D472、S474、Y500、S501及びD514のうち少なくとも1つにおける突然変異を更に含む、配列番号4又はその断片のアミノ酸配列を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
を含む、アデノ随伴ウイルスプラスミド。
突然変異が、Q464R、Q464V、A467P、D469G、D469T、I470M、R471A、R471S、D472V、D472E、D472N、S474P、S474A、S474G、Y500E、S501F及びD514Rのうち少なくとも1つである、請求項5に記載のアデノ随伴ウイルスプラスミド。
ポリヌクレオチドが、配列番号5、配列番号6、配列番号7、配列番号8、配列番号9、配列番号10、配列番号11、配列番号12、配列番号13、配列番号14、配列番号15、配列番号16、配列番号18、配列番号19、配列番号20、配列番号21、配列番号23、配列番号24、及び配列番号25のうち少なくとも1つから選択されるアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする、請求項6に記載のプラスミド。
突然変異が、ウイルスカプシドタンパク質に存する、請求項5に記載のアデノ随伴ウイルスプラスミド。
ポリヌクレオチドが、追加的なアミノ酸における突然変異を含むタンパク質をコードする、請求項1に記載のプラスミド。
請求項1〜9に記載のプラスミドのいずれかに由来するアデノ随伴ウイルスベクター。
有効量の請求項10に記載のアデノ随伴ウイルスベクターを被験体に投与するステップであって、アデノ随伴ウイルスベクターが、対象とするタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む、前記ステップ
を含む、対象とするタンパク質をコードするポリヌクレオチドを、被験体における組織へと送達する方法。