JP2022523719A - Ａａｖキャプシドの転写依存性定方向進化を使用するための方法 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】開示されているのは、転写依存性定方向進化（ＴＲＡＤＥ）を実施する方法、およびそのような方法を使用して、選択された新しいＡＡＶキャプシドである。本開示は、新しいＡＡＶキャプシド突然変異体をさらに提供する。ＴＲＡＤＥ技術は、静脈内投与の後に、脳でのニューロンの形質導入を媒介する新しいＡＡＶベクターを同定するために使用された。インビボのＴＲＡＤＥの適用は、新しいＡＡＶキャプシドの投与の後に、脳でニューロンをＡＡＶ９より効率的かつより特異的に形質導入することができる、新しいＡＡＶキャプシドの同定という結果をもたらした。開示される方法は、様々な細胞集団を標的にするＡＡＶキャプシドを同定するために使用されてもよい。【選択図】図２Ａ
Description
連邦支援の研究に関する陳述
本発明は、アメリカ国立衛生研究所（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ）／アメリカ国立神経疾患・脳卒中研究所（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｎｅｕｒｏｌｏｇｉｃａｌ Ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ ａｎｄ Ｓｔｒｏｋｅ）によって与えられた第ＮＳ０８８３９９号の下の政府支援で実施された。政府は本発明において一定の権利を有している。
本発明は、アメリカ国立衛生研究所（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ）／アメリカ国立神経疾患・脳卒中研究所（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｎｅｕｒｏｌｏｇｉｃａｌ Ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ ａｎｄ Ｓｔｒｏｋｅ）によって与えられた第ＮＳ０８８３９９号の下の政府支援で実施された。政府は本発明において一定の権利を有している。
本開示は、遺伝子導入に使用されるウイルスベクターに関する。より具体的には、本開示は、転写依存性定方向進化のための方法、およびこの方法を使用することによって選択されるアデノ随伴ウイルス（「ＡＡＶ」）ベクターに関する。
組み換え型アデノ随伴ウイルス（「ＡＡＶ」）ベクターは、インビボの遺伝子導入のための最も有望なものの一つである。ＡＡＶベクターの有用性は、自然発生の新規な血清型およびサブタイプの多くがヒトと非ヒト霊長類の組織から分離されて以来、拡大している。Ｇａｏ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｖｉｒｏｌ ７８，６３８１－６３８８（２００４）ａｎｄ Ｇａｏ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ９９，１１８５４－１１８５９（２００２）。新しく同定されたＡＡＶ分離株のうち、ＡＡＶ血清型８（ＡＡＶ８）およびＡＡＶ血清型９（ＡＡＶ９）が注目されており、なぜならこれらの２つの血清型に由来したＡＡＶベクターは、全身投与後に肝臓、心臓、骨格筋、および中枢神経系を含む様々な器官を高効率で形質導入することができるからである。Ｇｈｏｓｈ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ １５，７５０－７５５ （２００７）；Ｐａｃａｋ ｅｔ ａｌ．，Ｃｉｒｃ Ｒｅｓ ９９，３－９（２００６）；Ｉｎａｇａｋｉ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ １４，４５－５３ （２００６）；Ｚｈｕ ｅｔ ａｌ．，Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ １１２，２６５０－２６５９（２００５）；Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ２３，３２１－３２８（２００５）；Ｎａｋａｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｖｉｒｏｌ ７９，２１４－２２４（２００５）；ａｎｄ Ｆｏｕｓｔ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ２３，３２１－３２８（２００９）。ＡＡＶ８およびＡＡＶ９のベクターによるこの安定した形質導入は、これらの細胞型の強力な屈性、ベクターの効率的な細胞取り込み、および／または細胞でのビリオンシェルの迅速な脱殻に起因した。Ｔｈｏｍａｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｖｉｒｏｌ ７８，３１１０－３１２２（２００４）。加えて、よりよい性能を有するキャプシド組み換えＡＡＶベクターの発生は、ベクターツールキットとしてＡＡＶの効用を大幅に広げた。Ａｓｏｋａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ ２０，６９９－７０８（２０１２）。
ＡＡＶを媒介とする遺伝子治療を使用する概念実証は、ヒト疾患の多くの前臨床動物モデルで示された。Ｉ／ＩＩ段階臨床研究は、血友病Ｂ（Ｎａｔｈｗａｎｉ ｅｔ ａｌ．，Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ ７１，１９９４－２００４（２０１４））リポプロテインリパーゼ欠損症（Ｃａｒｐｅｎｔｉｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｃｌｉｎ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ Ｍｅｔａｂ ９７，１６３５－１６４４（２０１２））、レーバー先天黒内障（Ｊａｃｏｂｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ａｒｃｈ Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ １３０，９－２４（２０１２）およびＰｉｅｒｃｅ ａｎｄ Ｂｅｎｎｅｔｔ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂ Ｐｅｒｓｐｅｃｔ Ｍｅｄ ５，ａ０１７２８５（２０１５））、他のもの（Ｍｉｎｇｏｚｚｉ ａｎｄ Ｈｉｇｈ，Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｇｅｎｅｔ １２，３４１－３５５（２０１１）およびＷａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖ １８，３５８－３７８（２０１９）で掲載された）の処置のための有望な結果を示した。
この期待にもかかわらず、人体研究は、ＡＡＶを媒介とする遺伝子治療で意外な問題および潜在的困難をさらに明らかにした。Ｍａｎｎｏ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｍｅｄ １２，３４２－３４７（２００６）。加えて、ＡＡＶ生物学およびキャプシド表現型の関係についての我々の理解（Ａｄａｃｈｉ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｃｏｍｍｕｎ ５，３０７５，（２０１４）；Ｇｒｉｍｍ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ ２８，１０７５－１０８６，（２０１７）；およびＯｇｄｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ３６６，１１３９－１１４３，（２０１９））の飛躍的進歩にもかかわらず、我々が合理的に設計することができない臨床的ＡＡＶベクターの多くの望ましい性質が残っている。
そのために、そのような望ましい表現型を有する新しいＡＡＶキャプシドを同定するハイスループットスクリーニング方法が使用されている。具体的に、インビボのＡＡＶライブラリー選択戦略の発達によって、以前は難治性だった細胞型の非常に効率的な形質導入に有能な様々なデザイナーＡＡＶ変異体（Ｋｏｔｔｅｒｍａｎ ａｎｄ Ｓｃｈａｆｆｅｒ，Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｇｅｎｅｔ １５，４４５－４５１（２０１４）およびＧｒｉｍｍ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ ２３，１８１９－１８３１（２０１５）で掲載された）が産生された。
インビボのライブラリー選択の最も初期の試み（第１世代）は、切開された組織からのベクターゲノムＤＮＡの回収に依存した。理論上、この戦略は、有効なＡＡＶ変異体と、ベクターを媒介とする導入遺伝子発現に必要とされる工程のすべてではないがいくつかを媒介するＡＡＶ変異体の両方を回収する（図１）。したがって、合成ＡＡＶ変異体の多様なライブラリーのスクリーニングは、場合によっては完全に非効果的な遺伝子治療ベクターであるＡＡＶ変異体の高いバックグラウンド回収を引き起こす。さらに、特定の細胞型を標的とすることは、蛍光活性化細胞選別またはレーザー・キャプチャー・マイクロダイセクションなどのさらなる処理を必要とする。それにもかかわらず、この技術を成功裡に使用したとの複数の報告がある。Ｅｘｃｏｆｆｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ １０６，３８６５－３８７０（２００９）；Ｇｒｉｍｍ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｖｉｒｏｌ ８２，５８８７－５９１１（２００８）；Ｌｉｓｏｗｓｋｉ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ５０６，３８２－３８６（２０１４）；ａｎｄ Ｄａｌｋａｒａ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉ Ｔｒａｎｓｌ Ｍｅｄ ５，１８９ｒａ１７６（２０１３）。しかしながら、２０１６年のＤｅｖｅｒｍａｎ ｅｔ ａｌ．の歴史的な研究は、このプロセスが、Ｃｒｅ依存性選択戦略（第２世代）の使用によって大幅に改善され得ることを示した。Ｄｅｖｅｒｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ３４，２０４－２０９（２０１６）。Ｃｒｅ－依存性ライブラリー選択は、プライマー結合配列を含むベクターゲノムＤＮＡを反転させるために、一本鎖ＤＮＡではなく二本鎖ＤＮＡに作用するＣｒｅレコンビナーゼの選択的な能力という利点を有する。この配列の反転は、方向選択的ＰＣＲが、二本鎖ＤＮＡが一本鎖のＡＡＶゲノムから形成される形質導入の後期を経ることができるＡＡＶ変異体によって細胞に送達されたウイルスＤＮＡを特異的に増幅することを可能にする。さらに、Ｃｒｅドライバーラインの使用は、効率的に形質導入する新しいＡＡＶ変異体の選択を可能にし、細胞型特異的方法でＣｒｅレコンビナーゼの選択的遺伝子発現を促進する。実際に、Ｃｒｅ依存性選択を使用することで、著者は、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスの全身投与後に親のＡＡＶ９よりも４０倍以上形質導入可能なＡＡＶ９変異体、ＡＡＶ－ＰＨＰ．Ｂを開発することができた。Ｄｅｖｅｒｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ３４，２０４－２０９（２０１６）。あいにく、マウスにＡＡＶ－ＰＨＰ．Ｂによって示された増強は、非ヒト霊長類では通用しないことが最近明らかになった（Ｍａｔｓｕｚａｋｉ ｅｔ ａｌ．２０１８ および Ｈｏｒｄｅａｕｘ ｅｔ ａｌ．２０１９）。意外にも、その増強は、一般的に使用されるすべてのマウス株にまで及ぶわけではない（Ｍａｔｓｕｚａｋｉ ｅｔ ａｌ．２０１８およびＨｏｒｄｅａｕｘ ｅｔ ａｌ．２０１９）。したがって、霊長類モデルにおいてＡＡＶライブラリー選択実験を実施することによって臨床的に関連するＡＡＶベクターの発達を加速する趨勢が強い。しかしながら、多量の細胞型特異的トランスジェニックＣｒｅドライバーラインが既に確立しているマウスでのＡＡＶ変異体の選択と異なり、非ヒト霊長類を含む臨床的に関連する大型の動物ではＣｒｅ依存性選択が扱いにくく、Ｃｒｅトランスジェニック動物は容易に入手可能ではないからである。
したがって、我々は、Ｃｒｅ依存性選択によって提供されるものと同様またはそれよりも優れた選択的ストリンジェンシーを有するが、Ｃｒｅレコンビナーゼを必要としない次世代選択戦略（第３世代）の開発を目指した。このゴールを遂行するために、我々は、転写依存性定方向進化（ＴＲＡｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ）システム、すなわち、ＴＲＡＤＥを開発した。転写依存性選択では、我々は、ＡＡＶキャップ遺伝子を、細胞型特異的エンハンサー－プロモーターによって誘導される非コードアンチセンスｍＲＮＡとして発現する。このアンチセンス転写産物をＲＴ－ＰＣＲによって回収させることで、Ｃｒｅレコンビナーゼを使用せずに、特定の細胞型でベクターを媒介とするｍＲＮＡ発現のレベルでＡＡＶキャップ遺伝子のストリンジェントな回収が可能となる。様々な細胞型の標的化には、様々な細胞型特異的エンハンサー－プロモーターをプラスミド構築物へクローニングすることが必要とされるだけである。したがって、ＴＲＡＤＥは、臨床の遺伝子治療のための増強されたＡＡＶベクターの開発のために非ヒト霊長類の状況を含む幅広い様々な状況に適用することができる、高度な柔軟性のあるシステムである。同じ原理が、センス配向のＡＡＶキャップ遺伝子の発現のために使用され得ることに注目されたい。しかしながら、センス鎖アプローチは、標的細胞での免疫原のキャプシドタンパク質の発現という結果をもたらし、したがって、ＴＲＡＤＥシステムによって使用されるアンチセンス鎖アプローチほど理想的ではない。
本開示は、転写依存性定方向進化（ＴＲＡｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ）（「ＴＲＡＤＥ」）を名付けた次世代の定方向進化戦略を提供し、これは、細胞型特異的またはユビキタスｍＲＮＡ発現のレベルでＡＡＶキャプシド形質導入を選択する。本明細書に記載される方法は、文献で報告されたＡＡＶキャプシド定方向進化の最先端の方法である、Ｃｒｅ組み換えベースのＡＡＶ標的とされた進化（「ＣＲＥＡＴＥ」）を上回る以下の利点を提供する。Ｄｅｖｅｒｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈ ３４，２０４－２０９（２０１６）。まずは、ＣＲＥＡＴＥシステムは、Ｃｒｅ発現を必要とし、それは外生的に送達されるＣｒｅ発現、またはＣｒｅトランスジェニック動物の使用のいずれかによって到達され得る。これに対して、ＴＲＡＤＥシステムは、Ｃｒｅトランスジェニック動物を必要とすることなく、したがって、それは動物および任意の動物種に由来した培養細胞に適用され得、非ヒト霊長類を含む大型の動物に容易に適合され得る。２番目に、細胞型特異的選択がＡＡＶウイルスゲノム転換のレベルで一本鎖ＤＮＡから二本鎖ＤＮＡに適用されるＣＲＥＡＴＥシステムと異なり、ＴＲＡＤＥは、ＡＡＶゲノム転写のレベルで細胞型特異的選択を可能にする。したがって、ＴＲＡＤＥシステムは、ＣＲＥＡＴＥシステムよりも大きな選択圧を提供することができる。３番目に、複数の定方向進化スキーム（例えば、ニューロン特異的、アストロサイト特異的、オリゴデンドロサイト特異的、およびミクログリア特異的）は、１つのＡＡＶキャプシドライブラリーへと統合可能であり、各細胞型を標的とするＡＡＶベクターの選択が１匹の動物で実施可能である。４番目に、任意の細胞型特異的、または、組織／器官特異的エンハンサー－プロモーター、あるいはユビキタスエンハンサー－プロモーターは、増強された効能を有する細胞型特異的、またはユビキタスの新しいＡＡＶキャプシドの同定を目的とするＡＡＶキャプシド定方向進化のために容易に使用可能である。５番目に、ＴＲＡＤＥ方法は、遺伝子送達に使用されていた一般のＡＡＶを含むデペンドパルボウウイルス属（Ｄｅｐｅｎｄｏｐａｒｖｏｖｉｒｕｓ）に制限されないが、さらに広くＡＡＶ（例えば、ボカウイルス）以外のボカパルボウイルス（Ｂｏｃａｐａｒｖｏｖｉｒｕｓｅｓ）属およびエリスロパルボウイルス（Ｅｒｙｔｈｒｏｐａｒｖｏｖｉｒｕｓｅｓ）属を含むパルボウイルス科、およびより広くＤＮＡウイルスにも適用されることができる。
本開示は、新しいＡＡＶキャプシド突然変異体をさらに提供する。ＴＲＡＤＥ技術は、静脈内投与後に、脳でのニューロン形質導入を媒介する新しいＡＡＶベクターを同定するために使用された。Ｃ５７ＢＬ／６ＪマウスおよびアカゲザルにおいてＴＲＡＤＥの適用は、静脈内投与後にマウスおよび非ヒト霊長類の脳において、ＡＡＶ９よりも効率的かつ具体的に、ニューロンを形質導入し得る新しいＡＡＶキャプシドを同定することという結果をもたらした。加えて、我々は、不確定の細胞集団、または肺に存在して潜在的にニューロンの起原である細胞集団を形質導入し得る新しいＡＡＶキャプシドをＡＡＶ９よりも５～１８倍良好に同定した。
本開示は、さらにＡＡＶキャプシド遺伝子のアンチセンスｍＲＮＡのスプライシングを防ぐ方法を提供する。ＡＡＶキャップ遺伝子オープン・リーディング・フレーム（「ＯＲＦ」）から転写されたアンチセンスｍＲＮＡ前駆体は、（ａ）切断したｍＲＮＡ種を作ってスプライシングされることができる。我々が知っている限りでは、これはこれまでに報告されていない新しい発見である。そのようなスプライシングは、キャップＯＲＦの幅広い部位に突然変異が起こされるときにＴＲＡＤＥにとって不可欠である、ＡＡＶキャップＯＲＦの完全長アンチセンスｍＲＮＡの有効な回収を妨害する可能性を有している。本開示は、キャップ遺伝子のアンチセンスｍＲＮＡのスプライシングを防ぐために新しい戦略を提供する。
本明細書に記載されるＴＲＡＤＥシステムは、キャプシド配列情報を回収するためにアンチセンスｍＲＮＡを使用し、センス鎖ｍＲＮＡを使用するＴＲＡＤＥ（すなわち、センス鎖ＴＲＡＤＥ）も、同じ原理を使用して、実施可能である。しかしながら、センス鎖ＴＲＡＤＥアプローチは、標的細胞の免疫原のキャプシドタンパク質の発現を引き起こすため、アンチセンス鎖アプローチほど理想的ではないと推測されることに留意する必要がある。
いくつかの実施形態では、本開示は、ＴＲＡＤＥシステムを提供し、該システムは、細胞型特異的またはユビキタスの方法で発現されたキャップＯＲＦのアンチセンスｍＲＮＡを使用して、ＡＡＶキャプシドの定方向進化を可能にする。このようなシステムは、Ｃｒｅトランスジェニック動物を必要としない。したがって、それは、Ｃｒｅトランスジェニック株が容易に利用可能でない非ヒト霊長類を含む大型の動物の細胞型特異的ＡＡＶキャプシド進化に適用され得る。いずれかの細胞型特異的または組織／器官特異的エンハンサー－プロモーターまたはユビキタスエンハンサー－プロモーターは、形質転換を必要とせず容易にシステムに適用され得る。細胞型特異的選択は、ｍＲＮＡレベルで与えられる。ある実施形態では、複数の定方向進化スキームは、１つの定方向進化スキームに組み合わせられてもよい。例えば、細胞型特異的導入遺伝子ｍＲＮＡ発現に基づくニューロン特異的ＡＡＶキャプシド、アストロサイト特異的ＡＡＶキャプシド、オリゴデンドロサイト特異的ＡＡＶキャプシドおよびミクログリア特異的ＡＡＶキャプシドの選択は、1匹の動物において同時に実施され得る。
いくつかの実施形態では、本開示は、センス鎖ＴＲＡＤＥシステムを提供し、該システムは、標的細胞のＡＡＶキャプシドタンパク質を発現可能な細胞型特異的またはユビキタス方法で発現されたキャップＯＲＦのｍＲＮＡを使用して、ＡＡＶキャプシドの定方向進化を可能にする。センス鎖ＴＲＡＤＥは、本明細書中のデータを提供されるアンチセンス鎖ＴＲＡＤＥの同じ利点を有しており、それは、Ｃｒｅトランスジェニック動物を必要としないこと、細胞型特異的選択はｍＲＮＡレベルで与えられること、および複数の定方向進化スキームを1匹の動物において行われる１つの定方向進化に組み合わせられ得ることである。しかし、見込まれる損失は、免疫原ＡＡＶキャプシドタンパク質が標的細胞中で不可避的に持続的に発現される場合があるというものであり、これにより、キャプシド選択工程の望ましくない結果が生じる場合がある。
いくつかの実施形態では、本開示はさらに新しいＡＡＶキャプシドを提供する。ある実施形態では、これらの新しいＡＡＶキャプシドは、静脈内注射後にＣ５７ＢＬ／６ＪマウスにおいてＡＡＶ９より数倍良好に脳ニューロンを形質導入することができる。ある実施形態では、新しいＡＡＶキャプシドは、静脈内注射後にＣ５７ＢＬ／６ＪマウスにおいてＡＡＶ９より最大８倍良好に形質導入された。ニューロン形質導入レベルは、ＡＡＶ ＰＨＰ．Ｂで得られたレベルに到達しない場合があっても、ＡＡＶ９と比較して、大いに増強される場合がある。ある実施形態では、新しいＡＡＶキャプシドは、脳ニューロンをＡＡＶ ＰＨＰ．Ｂより効率的に形質導入する場合がある。
いくつかの実施形態では、本開示は、静脈内注射後にＢＡＬＢ／ｃＪマウスにおいてＡＡＶ９より数倍良好に脳ニューロンを形質導入することができる新しいＡＡＶキャプシドを提供する。ある実施形態では、新しいＡＡＶキャプシドは、静脈内注射後にＢＡＬＢ／ｃＪマウスにおいてＡＡＶ９より脳ニューロンを最大７倍良好に形質導入することができる。形質導入レベルはＡＡＶ ＰＨＰ．Ｂよりはるかに高い。
いくつかの実施形態では、本開示は、静脈内注射後にアカゲザルにおいてＡＡＶ９より数倍良好に脳ニューロンを形質導入することができる新しいＡＡＶキャプシドを提供する。ある実施形態では、新しいＡＡＶキャプシドは、静脈内注射後にアカゲザルにおいてＡＡＶ９より脳ニューロンを最大４倍良好に形質導入することができる。これらの形質導入レベルは、ＡＡＶ ＰＨＰ．Ｂより良い。
いくつかの実施形態では、本開示は、ＡＡＶ９より数倍良好にニューロンの細胞マーカ発現で肺細胞を形質導入し得るＡＡＶキャプシドを提供する。ある実施形態では、ＡＡＶキャプシドは、そのような細胞をＡＡＶ９より最大１７倍良好に形質導入することができる。
いくつかの実施形態では、新しいＡＡＶキャプシドは肝臓標的解除表現型を示す。
いくつかの実施形態では、本開示は、アンチセンス方向に発現されると、スプライシングされないコドン修飾ＡＡＶキャップ配列を提供する。未修飾ＡＡＶキャップＯＲＦは、アンチセンス方向に発現されると（例えば、ＡＡＶ１、ＡＡＶ３およびＡＡＶ９）、スプライシングされると観察された。これに対して、本開示に記載されるコドン修飾ＡＡＶキャップＯＲＦのうちのいくつかはスプライシングされない。推定上のスプライスドナーおよびアクセプター部位に関する我々が展開した知識に基づいて、このようなスプライシングされていないＡＡＶキャップＯＲＦのバージョンを設計することが可能になった。このようなスプライシングされていないキャップＯＲＦの使用は、キャップ遺伝子の突然変異誘発がキャップＯＲＦの幅広い領域上に起こるときＴＲＡＤＥシステムを使用して、定方向進化に使用されてもよい。
本明細書で使用されるような用語「ＡＡＶベクター」は、ＡＡＶのコンポーネントを含む、またはＡＡＶのコンポーネントに由来する任意のベクターを意味し、脳、心臓、肺、骨格筋、肝臓、腎臓、脾臓または膵臓などの多くの組織型のうちのいずれかの、ヒト細胞を含む哺乳動物細胞をインビトロまたはインビボ感染させることに適切である。用語「ＡＡＶベクター」は、少なくとも対象タンパク質をコードする核酸分子を含むＡＡＶ型ウイルス粒子（またはビリオン）に言及するために使用されてもよい。
さらに、本明細書に開示されるＡＡＶは、血清型の組み合わせ（例えば、「偽型」ＡＡＶ）を含む様々な血清型、または様々なゲノム（例えば、一本鎖または自己補正的）に由来してもよい。特定の実施形態では、本明細書に開示されるＡＡＶベクターは、所望のタンパク質またはタンパク質変異体を含んでもよい。本明細書で使用されるような「変異体」は、１つ以上のアミノ酸によって改質されるアミノ酸配列を指す。変異体は「保守的な」変化を有する場合があり、この場合置換されたアミノ酸は、類似した構造的または化学的性質、例えば、ロイシンのイソロイシンでの置き換えを有してもよい。代替的に、変異体は「非保守的」変化、例えば、グリシンのトリプトファンでの置き換えを有してもよい。類似した小さな変更は、さらにアミノ酸の欠失または挿入、あるいは両方を含んでもよい。
本開示のタンパク質をコードする、ポリヌクレオチドなどのヌクレオチド配列は、本明細書に提供される。本開示のヌクレオチドは、ＲＮＡまたはＤＮＡのいずれかからなり得る。本開示は、本明細書に開示されるポリヌクレオチドに対して配列で相補的ポリヌクレオチドをさらに包含する。
遺伝子コードの縮退のため、多様な様々なポリヌクレオチドの配列は、本開示のタンパク質をコードすることができる。加えて、本明細書に開示されるタンパク質と同様の、または本質的に同様のものをコードする、代替的ポリヌクレオチド配列を作成することは、当業者が十分に対応できる範囲にある。これらの変異体または代替的ポリヌクレオチド配列は、本開示の範囲内である。本明細書で使用されるように、「本質的に同様の配列」の言及は、本開示のポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドの検出能を損なわないアミノ酸の置換、欠失、添加または挿入をコードする１つ以上の配列を指す。
本開示は、本明細書に開示されるポリヌクレオチドおよびポリペプチドの変異体をさらに含む。変異体配列は、配列の１つ以上のペプチドまたはヌクレオチドが置換され、欠失され、および／または挿入された配列を含む。
本開示のポリヌクレオチドおよびポリペプチド配列は、本明細書に記載されるポリヌクレオチドおよびポリペプチドとの特定の同一性および／または類似性の観点から定義され得る。配列同一性は一般的に、６０％超、好ましくは７５％超、さらに好ましくは８０％超、さらにいっそう好ましくは９０％超、および９５％超であり得る。配列の同一性および／または類似性は、本明細書に開示される配列と比較して、４９％、５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であり得る。別段の定めがない限り、本明細書で使用されるように、２つの配列のパーセント配列同一性および／または類似性は、（ＫａｒｌｉｎおよびＡｌｔｓｃｈｕｌ（１９９３）で修飾されたようなＫａｒｌｉｎおよびＡｌｔｓｃｈｕｌ（１９９０）のアルゴリズムを使用して決定され得る。このようなアルゴリズムは、Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．（１９９０）のＮＢＬＡＳＴおよびＸＢＬＡＳＴプログラムに取り込まれている。ＢＬＡＳＴ検索は、所望のパーセント配列同一性を有する配列を得るために、ＮＢＬＡＳＴプログラム、スコア＝１００、ワード長＝１２で実施され得る。比較の目的のためにギャップされた（ｇａｐｐｅｄ）アラインメントを得るために、Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．（１９９７）に記載されているようにＧａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴを使用することができる。ＢＬＡＳＴおよびＧａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴのプログラムを利用する際、それぞれのプログラム（ＮＢＬＡＳＴおよびＸＢＬＡＳＴ）のデフォルトパラメーターを使用することができる。
本明細書に開示されるようなＡＡＶベクターを産生する方法は、例えば、パッケージング細胞、補助のウイルスまたはプラスミド、および／またはバキュロウイルスシステムの使用の方法を含んで、当技術分野において公知されている。例えば、Ｓａｍｕｌｓｋｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ６３，３８２２（１９８９）；Ｘｉａｏ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ７２，２２２４（１９９８）；Ｉｎｏｕｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ７２，７０２４（１９９８）；ＷＯ１９９８／０２２６０７；およびＷＯ２００５／０７２３６４を参照。
インビボの投与後、それらの免疫原性を減少させるために、偽型ＡＡＶベクターを産生する方法（例えば、ＷＯ００／２８００４を参照）とともに、ＡＡＶベクターの様々な修飾または製剤も知られている（例えば、ＷＯ０１／２３００１；ＷＯ００／７３３１６；ＷＯ０４／１１２７２７；ＷＯ０５／００５６１０；またＷＯ９９／０６５６２を参照）。いくつかの実施形態では、ＡＡＶベクターは、キメラ（例えば、偽型）ＡＡＶウイルスを産生するために、ともに混合される、または他のタイプのウイルスと混合されてもよいＡＡＶの様々な血清型から調製または誘導され得る。
特定の実施形態では、ＡＡＶベクターはヒト血清型ＡＡＶベクターであってもよい。このような実施形態では、ヒトＡＡＶは、任意の既知の血清型、例えば、血清型１－１１のうちのいずれか１つ、例えば、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ４、ＡＡＶ６、またはＡＡＶ９に由来してもよい。
本明細書に開示されるＡＡＶベクターは、対象タンパク質をコードする核酸を含んでもよい。様々な実施形態では、核酸は、例えば、プロモーター、エンハンサー、ポリアデニル化シグナル、内部リボソーム導入部位（「ＩＲＥＳ」）、タンパク質形質導入ドメイン（「ＰＴＤ」）をコードする配列、２Ａペプチドなどの対象タンパク質の発現、およびいくつかの実施形態では分泌を可能にする、１つ以上の制御配列をさらに含んでもよい。したがって、いくつかの実施形態では、核酸は、感染細胞に対象タンパク質の発現を引き起こすまたは改善するために、コード配列に動作可能に連結したプロモーター領域を含んでもよい。そのようなプロモーターは、例えば、感染した組織でタンパク質の効率的で安定した産生を可能にするために、ユビキタスであり、細胞または組織に特異的であり、強く、弱く、調節された、キメラなどであってもよい。一般的に、プロモーターは、コードされたタンパク質に対して相同であってもよく、または異種であってもよいが、開示された方法で使用されるプロモーターは、ヒト細胞において官能性である。調節されたプロモーターの例は、限定されることなく、テトオン／オフ要素含有のプロモーター、ラパマイシン誘導可能なプロモーター、タモキシフェン誘導可能なプロモーター、およびメタロチオネインプロモーターを含む。使用されてもよい他のプロモーターは、腎臓、脾臓および膵臓などの組織に組織特異的プロモーターを含む。ユビキタスプロモーターの例は、ウイルスプロモーター、具体的にＣＭＶプロモーター、ＲＳＶプロモーター、ＳＶ４０プロモーターなど、およびホスホグリセレートキナーゼ（ＰＧＫ）プロモーターおよびβ－アクチンプロモーターなどの細胞のプロモーターを含む。
本明細書に開示されるＡＡＶベクターのいくつかの実施形態では、１つ以上のフィードバック要素は、対象タンパク質の過剰発現を弱めるために使用されてもよい。例えば、ＡＡＶベクターのいくつかの実施形態は、外因性の転写産物を標的とする１つ以上のｓｉＲＮＡ配列を含んでもよい。他の実施形態では、ＡＡＶベクターは、抑制的な転写因子によって認識され得る、１つ以上のさらなるプロモーターを含んでもよい。様々な実施形態では、本明細書に開示されるＡＡＶベクターは、生理的なレベルで対象タンパク質の発現レベルを維持し得る恒常性フィードバックループを作成し得る構築物を含んでもよい。
本明細書に開示されるＡＡＶベクターのいくつかの実施形態では、ゲノムを編集する機構は、部位特異的な方法で細胞ゲノムＤＮＡまたはｍＲＮＡ転写産物を遺伝子的に修飾するために使用されてもよい。Ｋｏｍｏｒ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ １６８，２０－３６（２０１７）；およびＫａｔｒｅｋａｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｔｈｏｄｓ １６：２３９－２４２，２０１９。例えば、ＡＡＶベクターのいくつかの実施形態は、部位特異的な方法で細胞の核酸を修飾するために、Ｃａｓ９などのＣＲＩＳＰＲ関連酵素、ＤＮＡ塩基エディター、ＲＮＡエディターゼ（ｅｄｉｔａｓｅ）および／またはガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を含んでもよい。さらに、ＡＡＶベクターは、ゲノム編集のための相同性修復鋳型（ＨＤＲ）を含んでもよい。
様々な実施形態では、本明細書に開示されるＡＡＶベクターは、コードされたタンパク質の分泌を可能にする先導配列を含む場合がある核酸を含み得る。いくつかの実施形態では、対象導入遺伝子と、分泌シグナルペプチド（通常、分泌されたポリペプチドのＮ末端に位置する）をコードする配列との融合は、形質導入された細胞から分泌され得る形態の治療用タンパク質の産生を可能にする場合がある。そのようなシグナルペプチドの例は、アルブミン、β－グルクロニダーゼ、アルカリ性プロテアーゼ、またはフィブロネクチン分泌シグナルペプチドを含む。
本明細書に記載されるように、脳、心臓、肺、骨格筋、腎臓、脾臓、または膵臓において治療用の対象タンパク質の効率的および長期的な発現は、ＡＡＶ９配列を有する非ＡＡＶ９ベクターなどの特定のＡＡＶベクターの末梢投与を通じて非侵襲性技術を用いて達成することができる。このような末梢投与は、脳、心臓、肺、骨格筋、腎臓、脾臓、または膵臓への直接注入を必要としない任意の投与経路を含んでもよい。より具体的に、末梢投与は、筋肉内注射、血管内（静脈内などの）注射、腹腔内注射、動脈内注射、または皮下注射などの全身注射を含んでもよい。いくつかの実施形態では、末梢投与は、さらに経口投与（例えば、ＷＯ９６／４０９５４を参照）、植込剤を使用する送達（例えば、ＷＯ０１／９１８０３を参照）、または呼吸器システムによる点滴注入による投与、例えば、噴霧剤、エアゾール剤または他の適切な製剤の使用を含んでもよい。
様々な実施形態では、ＡＡＶベクターの所望の投与量は、例えば、病状、被験体、治療スケジュールなどに応じて当業者によって変化されてもよい。いくつかの実施形態では、投与当たり１０５～１０１２のウイルスゲノム、例えば、１０６～１０１１、１０７～１０１１、１０８～１０１１が投与される。他の実施形態では、治療効果を達成するための例示的な投与は、少なくとも約１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１０１０、または１０１１ウイルスゲノムのウイルス力価を含むことがある。ウイルス力価は、形質導入単位の観点で発現されてもよく、それは当業者によって容易に計算されてもよい。
様々な実施形態では、本明細書に開示されるＡＡＶベクターは、任意の適切な形態で、例えば、液体溶液または懸濁液のいずれかとして、注射の前に液体の溶解または懸濁に適している固体形態として、ゲル、またはエマルジョンとして投与されてもよい。ベクターは、任意の適切で薬学的に許容可能な賦形剤、担体、アジュバント、希釈液などで製剤されてもよい。例えば、注射については、適切な担体または希釈液は、等張液、緩衝液、無菌および発熱物質なしの水、または例えば、無菌・発熱物質なしのリン酸緩衝生理食塩水であってもよい。吸入剤については、担体は微粒子の形態であってもよい。
ベクターは、「治療上有効な」量で、例えば、疾患状態に関連した症状の少なくとも１つを緩和する（例えば、減少する、縮小する）、または被験体の状態の改善を提供するのに十分な量で投与されてもよい。いくつかの実施形態では、反復投与が、例えば、同じまたは異なる末梢投与経路および／または、同じベクターまたは明確なベクターを使用して、実施されてもよい。
以下の実施例は説明のみを目的とする。本開示に照らして、当業者は、これらの実施例の変形および開示される主題の他の実施形態が、過度の実験無しに可能であることを認識するであろう。
全身性送達後に脳ニューロンを効率的に形質導入する、新しいＡＡＶキャプシドを同定するために、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスとアカゲザルの両方に、ＴＲＡＤＥシステムを適用した。ＴＲＡＤＥシステムは、ＩＴＲ配列によって隣接される、重なり合った、２シストロン性のＡＡＶゲノムを含むプラスミド構築物を利用する（図２Ａ）。センス方向では、ＡＡＶ２ ｐ４０プロモーターは、ＡＡＶキャップ遺伝子の発現を誘導して、ウイルス粒子の効率的な産性を促進する（図２Ｂ）。アンチセンス方向では、細胞型に特異的なエンハンサープロモーター（例えば、ヒトシナプシＩ（ｈＳｙｎＩ）エンハンサープロモーター）は、ＧＦＰと、ＡＡＶ２ゲノムに存在するイントロンに埋め込まれるポリアデニル化シグナル（ポリＡ）で終結するアンチセンスキャップ配列とをコード化する、転写産物の発現を誘導する（図２Ｂ）。ＴＲＡＤＥ構築物をクローニングバックボーン（ｃｌｏｎｉｎｇ ｂａｃｋｂｏｎｅ）として利用し、グリシン・セリン・リンカー（５’－ＧＧＧＳ；３’－ＧＧＧＧＳ）と共に、ＡＡＶ９キャプシドのＱ５８８位で置換される無作為の８量体ペプチドを含む、肝臓－標的解除（ｄｅｔａｒｇｅｔｅｄ）ＡＡＶ９－Ｎ２７２Ａ（ＰＣＴ／ＵＳ２０１７／０６８０５０）キャップ遺伝子プラットフォームに基づいて、ＡＡＶライブラリーを生成した。特定の細胞型（ニューロンなど）におけるインビボ選択は、ＲＴ－ＰＣＲによって脳組織から、アンチセンスキャップＯＲＦ ｍＲＮＡとしてキャプシド配列を回収することによって実行された。この方法は、回収された配列が、対象の感染細胞におけるＲＮＡ発現を仲介することができる、ＡＡＶ変異体に由来するのみであることを保証する。ｈＳｙｎＩエンハンサープロモーターが使用される場合、ニューロンを形質導入することができるＡＡＶキャプシドの配列のみが取り出され、そのため、ＡＡＶキャプシドのニューロンに特異的な選択を可能にする。
最初に、ＴＲＡＤＥシステムが、ＡＡＶ－ＰＨＰ．Ｂ－ｈＳｙｎＩ－ＧＦＰ－ＴＲＡＤＥベクターを使用して、細胞型に特異的なアンチセンスｍＲＮＡからＡＡＶキャップ遺伝子の配列を回収する能力をテストした（図３）。ｈＳｙｎＩエンハンサープロモーター誘導ＧＦＰ発現カセットは、ＴＲＡＤＥ構成のＡＡＶ－ＰＨＰ．Ｂキャプシド遺伝子含有ＡＡＶベクターゲノムに取り込まれた（図３Ａ）。このベクターゲノムはＡＡＶ－ＰＨＰ．Ｂキャプシドの中へパッケージ化され、そして、結果として生じるＡＡＶベクターは、２匹の８週齢のオスのＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスに静脈内注射された（図３Ｂ）。注射の１２日後に、脳組織が採取された。４％のパラホルムアルデヒドで固定された組織が、免疫蛍光顕微鏡検査法によって分析された。取り外された組織は、ＲＮＡ抽出およびＲＴ－ＰＣＲ分析のために利用された。ｅＧＦＰがニューロンでのみ発現することを確認し（図３Ｃと３Ｄ）、このことは、キャップ遺伝子から転写されたアンチセンスｍＲＮＡが、細胞型に特異的な方法で発現することを示す。キャップ遺伝子のアンチセンスのｍＲＮＡを、ＲＴ－ＰＣＲによって効率的に回収した（図３Ｅ）。アンチセンスｍＲＮＡに固有なスプライス連結のサンガー法で、ＲＴ－ＰＣＲ産物が実際にｈＳｙｎＩエンハンサープロモーター活性化アンチセンスｍＲＮＡに由来していたことが確認された（図３Ｆ）。さらに、サンガー法によって、ＰＨＰ．Ｂペプチド挿入の配列が確認された（図３Ｆ）。それと共に、これらの観察は、ＡＡＶベクター形質導入脳ニューロンにおいて発現したｈＳｙｎＩエンハンサープロモーター誘導アンチセンスｍＲＮＡから、ＡＡＶキャップ配列を成功裡に回収する、ＴＲＡＤＥシステムの能力を確立した。
ＴＲＡＤＥシステムの成功的確率によって、２つのＡＡＶキャプシド指向進化実験を実施した；一方は８週齢のオスのＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスを使用し、そして他方は８か月齢のオスのアカゲザルを使用した。Ｑ５８８の位置でＧＧＧＳ（Ｎ８）ＧＧＧＧＳ（配列番号：２）ペプチド挿入を有するＡＡＶ９由来の突然変異体キャプシドで構成される、ＡＡＶ９－Ｎ２７２Ａ－ｈＳｙｎＩ－ＧＦＰ－ＴＲＡＤＥ－Ｌｉｂライブラリーを作り出し、ここで、Ｎ８は、（ＮＮＫ）８によってコード化された無作為の８量体ペプチドを表わす。ペプチド挿入については、Ｑ５８８が各ペプチド配列で置換された。ＡＡＶライブラリーの多様性は、少なくとも１０７だった。マウス指向進化実験では、ＡＡＶライブラリーを、マウス１匹あたり３×１０１１のベクターゲノム（ｖｇ）の投与量で、尾静脈を介して注射した。２回目の選択については、２匹のマウスを使用して、１×１０１２、１×１０１１、１×１０１０、または１×１０９のベクターゲノム（ｖｇ）の投与量で、ＡＡＶライブラリー注射した。３回目の選択については、２匹のマウスを使用して、１×１０１１ｖｇの投与量で、ＡＡＶライブラリーを注射した。注射後１２日で脳組織を採取し、それを３つの領域（つまり大脳、小脳、脳幹）に分離した。大脳サンプルだけが指向進化実験に使用された。大脳から全ＲＮＡを抽出し、オリゴｄＴプライマーを使用してＲＮＡを逆転写し、そして１対のキャップ遺伝子特異的ＰＣＲプライマーによる隣接領域を含む、ペプチド領域を増幅させた。その後、ＲＴ－ＰＣＲ産物を使用して、次のＡＡＶ９－Ｎ２７２Ａ－ｈＳｙｎＩ－ＴＲＡＤＥ－Ｌｉｂプラスミドライブラリーを作成し、該ライブラリーは、その後、次のＡＡＶ９－Ｎ２７２Ａ－ｈＳｙｎＩ－ＴＲＡＤＥ－Ｌｉｂウイルスライブラリーを産生するのに使用された。２回目と３回目の選択については、ＧＦＰ ＯＲＦを欠くＡＡＶ９－Ｎ２７２Ａ－ｈＳｙｎＩ－ＴＲＡＤＥ－Ｌｉｂゲノムをパッケージ化した。非ヒト霊長類指向進化実験では、ＡＡＶ９－Ｎ２７２Ａ－ｈＳｙｎＩ－ＧＦＰ－ＴＲＡＤＥ－Ｌｉｂライブラリーを、１ｋｇ当たり２．０×１０１２ｖｇの投与量で、伏在静脈を介して注射した。注射後１２日で、脳全体を採取し、そして脳マトリックスを使用してスライスし、ＲＮＡｌａｔｅｒ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）で処理し、そして冷凍保存した。その後、全ＲＮＡを以下の脳領域から抽出した：前頭皮質、後頭皮質、小脳（プルキンエと顆粒層）、髄質、脳橋、前頭皮質、視床下部、視床、帯状回、尾状核、被殻、海馬、および視索前野。ペプチド配列を、ネステッドＰＣＲを実施した以外は上記と同じ方法で、ＲＴ－ＰＣＲによって取り出し、下流工程のイルミナシーケンシング（Ｉｌｌｕｍｉｎａ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）またはサンガー法の手順に十分なＰＣＲ産物を取得した。いくつかのサンプルについては、サンガー法のためにネステッドＰＣＲを実施せず、プラスミドバックボーンに直接、第１のＰＣＲ産物のクローンを作成した。マウスにおける３回の選択（表１）と、非ヒト霊長類における１回の選択の後に、ＡＡＶ９キャプシドに挿入された、いくつかの潜在的な形質導入増強ペプチドを同定した（表２）。その後、バーコード化ＡＡＶライブラリーを生成し、そして２つの一般に使用されるマウス系統（Ｃ５７ＢＬ／６ＪとＢＡＬＢ／ｃＪ）および１匹のアカゲザルに静脈内投与し、その後に、以前Ｎａｋａｉ Ｌａｂ（Ａｄａｃｈｉ ｅｔ ａｌ． Ｎａｔ Ｃｏｍｍｕｎ ５，３０７５ （２０１４）；およびＰＣＴ／ＵＳ２０１７／０６８０５０）で開発されたＤＮＡ／ＲＮＡバーコード－配列技術を利用して、２６の選択された新しいＡＡＶ変異体の、形質導入効率、向性／生体内分布、および薬物動態を比較した（表３）。結果として、以下を確認した。（１）ＴＲＡＤＥ技術によって同定された新しい変異体のいくつか、特にＡＡＶ９－Ｎ２７２Ａ－ＴＴＮＬＡＫＮＳ（ＨＮ１）とＡＡＶ９－Ｎ２７２Ａ－ＱＱＮＧＴＲＰＳ（ＨＮ２）は、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスの脳において、ＡＡＶ９より、最大で８倍優れた性能を見せた（図１４Ｂと１４Ｃ）。ＨＮｘ指定に関しては、表３を参照。（２）以前にＨｏｒｄｅａｕｘ等によって報告されたように（Ｈｏｒｄｅａｕｘ ｅｔ ａｌ． ２０１８）、ＡＡＶ－ＰＨＰ．Ｂは、ＢＡＬＢ／ｃＪマウスの脳を、ＡＡＶ９に匹敵するレベル以下にのみ形質導入し（図１４Ｂと１４Ｃ）、ＡＡＶ－ＰＨＰ．Ｂの堅調な神経向性増強に対するマウス株の依存性を実証している。（３）対照的に、ＡＡＶ９－Ｎ２７２Ａ－ＴＴＮＬＡＫＮＳ（ＨＮ１）とＡＡＶ９－Ｎ２７２Ａ－ＱＱＮＧＴＲＰＳ（ＨＮ２）は、ＢＡＬＢ／ｃＪマウスにおける堅調なニューロン形質導入を保持し、ＡＡＶ９より、最大で７倍優れた形質導入を示した（図１４Ｂ）。（４）アカゲザルでは、新しいＡＡＶ突然変異体の多くが、特定の脳領域でＡＡＶ９よりも最大で４倍大きなニューロン形質導入の増強を示す一方で、ＡＡＶ－ＰＨＰ．Ｂは、非ヒト霊長類の脳では、ＡＡＶ９同等以下で形質導入した。特に、ＡＡＶ９－Ｎ２７２Ａ－ＴＴＮＬＡＫＮＳ（ＨＮ１）は、複数の脳領域において、非ヒト霊長類脳の最も優れた形質導入を示した（図１４Ｃと１４Ｄ）。（５）ＨＮ１、ＨＮ２、およびＨＮ３を含む、ＡＡＶ９－Ｎ２７２Ａ由来の変異体の全ては、マウスとアカゲザルで、様々な程度の肝臓－標的解除特性を示した（図１７Ａ）。（６）ＡＡＶ９－Ｎ２７２Ａ－ＴＴＮＬＡＫＮＳ（ＨＮ１）とＡＡＶ９－Ｎ２７２Ａ－ＱＱＮＧＴＲＰＳ（ＨＮ２）は、マウスのＡＡＶ９よりも、最大で１７倍優れた肺のｈＳｙｎＩエンハンサープロモーター転写活性を有して、細胞を、形質導入することができる（図１７Ｂ、表４と６）。（７）ＡＡＶ９－Ｎ２７２Ａ－ＴＴＮＬＡＫＮＳ（ＨＮ１）は、ＡＡＶ９と比較して、より低程度の末梢器官へのベクターゲノムの広がりを示す（図１７Ｃと１７Ｄ）。ＡＡＶバーコード－配列データを、表４～９にまとめる。表４～９に提示された代表的データはまた、図１４と図１７でグラフフォーマットで示される。
実験中、ＡＡＶ９キャップ遺伝子ＯＲＦがＨＥＫ２９３細胞またはＮｅｕｒｏ２ａ細胞のアンチセンス配向で発現すると、アンチセンスＡＡＶ９キャップ遺伝子の、ｍＲＮＡ由来のＲＴ－ＰＣＲ産物の大部分は、およそ１．７ｋｂで切断される（図４）が、このことは、ＡＡＶ－ＰＨＰ．Ｂ－ｈＳｙｎＩ－ＧＦＰ－ＴＲＡＤＥ－形質導入マウス脳組織（図３）から回収されたＲＮＡの場合にはあてはまらない。切断したＲＴ－ＰＣＲ産物の配列決定は、１６９４ｂｐの長さの領域がＡＡＶ９キャップＯＲＦ内で欠けていることを明らかにした（図５）。いかなる特定の理論にも束縛されるものではないが、切断は、エキソン－イントロン連結の一般的特徴を有するＰＣＲ産物において、スプライスドナー部位とスプライスアクセプター部位とを同定することができた観察に基づいて、スプライシングイベントに起因すると思われる。興味深いことに、配列アラインメント試験は、エキソン－イントロン連結の一般的特徴を有する、潜在性スプライスドナー部位とスプライスアクセプター部位とがまた、ＡＡＶ９キャップ遺伝子で同定されるスプライスドナー部位とスプライスアクセプター部位とに対応する領域における多くの自然発生のＡＡＶ血清型で同定することができ、そしてそれらが高度に保存されていることを明らかにした（図６）。これは、スプライシングが、ＡＡＶ９のキャップＯＲＦ由来アンチセンスｍＲＮＡだけでなく、潜在的に、他のＡＡＶ株のキャップＯＲＦ由来のアンチセンスｍＲＮＡでも生じ得ることを示す。今日までに、スプライシングは、ＨｅｐＧ２細胞のヒト肝臓に特異的なプロモーター（ＬＳＰ）の制御化で発現する時に、ＡＡＶ３キャップＯＲＦ－由来アンチセンスｍＲＮＡで生じることがわかっている。完全な特徴付けが完了していなくても、アンチセンスｍＲＮＡに特異的なＲＴプライマーを使用する予備ＲＴ－ＰＣＲ（ｐｒｅｌｉｍｉｎａｒｙ ＲＴ－ＰＣＲ）は、完全長の、スプライシングされなかった産物に加えて、切断ＲＴ－ＰＣＲ産物を産生した。２つの切断ＲＴ－ＰＣＲ産物の配列決定分析は、複数のスプライシングイベントが、アンチセンスｍＲＮＡに存在したことを明らかにした（図７）。配列決定アライメント試験は、追加的で潜在的なスプライスドナー部位とスプライスアクセプター部位を同定した（図８と図９）。また、アンチセンスｍＲＮＡがＨＥＫ２９３細胞またはＮｅｕｒｏ２ａ細胞のｈＳｙｎＩエンハンサープロモーターによって転写された時に、ＡＡＶ１キャップＯＲＦ由来のアンチセンスｍＲＮＡにおけるスプライシングイベントが確認された（図１０）。同定されたスプライスドナー部位（ＧＴ／ＣＡ）とスプライスアクセプター部位（ＡＧ／ＴＣ）の多くは、異なる血清型にわたって高度に保存されており、これらの部位が潜在的に、未調査のＡＡＶ血清型のスプライシングドナー部位とスプライシングアクセプター部位としても利用されることを示す。実際、ＡＡＶ１、ＡＡＶ３、およびＡＡＶ９キャップＯＲＦのアンチセンスｍＲＮＡ転写産物のスプライシングが、いくつかの共通のスプライスドナー部位とスプライスアクセプター部位とを使用することが確認された（図１０）。今日まで、ＡＡＶ５キャップＯＲＦのアンチセンスｍＲＮＡ転写産物のスプライシングは、未だ観察されていない。ＡＡＶ１、３、５、および９以外の血清型については、ＡＡＶキャップＯＲＦのアンチセンスｍＲＮＡにおけるスプライシングイベントは未だ調査されていない。
キャップＯＲＦ由来のアンチセンスｍＲＮＡの潜在的なスプライシングは、科学的には興味深いが、完全長のキャップＯＲＦ配列をアンチセンスｍＲＮＡから回収する必要がある場合に、ＴＲＡＤＥシステムを妨げ得る。この潜在的問題を克服するために、エキソン－イントロン連結と分岐点とにおいて、おそらくは保存配列を妨害するサイレント突然変異を導入した。このアプローチの原理の証拠を実証するために、プラスミド、ｐＡＡＶ９－Ｎ２７２Ａ－ＰＨＰ．Ｂ－ｈＳｙｎ１－ＧＦＰ－ＴＲＡＤＥに含有されるＡＡＶ９キャップＯＲＦの中へサイレント突然変異を導入し、これが、スプライスアクセプター（ＳＡ）コンセンサス配列（ｐＡＡＶ９ＮＳ１構築物）、スプライスドナー（ＳＤ）コンセンサス配列（ｐＡＡＶ９ＮＳ２構築物）、およびスプライスアクセプターとスプライスドナー両方のコンセンサス配列（ｐＡＡＶ９ＮＳ３構築物）を妨害する。ＮＳが「スプライシングされていない」を省略したものであることに留意されたい。これらのコンセンサス配列を妨害するために使用する方法を、以下に説明する。
ヒト細胞発現のためのＡＡＶキャップＯＲＦ配列をコドン最適化する。
キャップＯＲＦに由来するアンチセンスｍＲＮＡで、潜在的なスプライスドナーとスプライスアクセプターとを同定するために、我々の実験的および生物情報科学的観察（つまり図５、６、７、８、９、および１０）に基づいたアンチセンスｍＲＮＡの潜在的なスプライスドナー部位とスプライスアクセプター部位とに関する、独自のデータベースを開発および使用する。
コドン最適化配列を使用して、少なくとも１つのヌクレオチドを変更することによって、ＧＴ（スプライスドナー）および／またはＡＧ（スプライスアクセプター）コンセンサス配列を破壊する。コドン最適化配列が利用可能でない場合、コンセンサス配列を破壊することができる代替ヌクレオチドを使用する。
コドン最適化配列に基づくサイレンス突然変異を導入することによって、スプライスアクセプター部位のＴ’ｓの上流のストレッチを取り出す。コドン最適化配列がＴ’ｓのストレッチを破壊するのには十分でない場合には、代替ヌクレオチドを使用する。
また、可能な限り、エキソン終端のＧを回避する。
分岐点（を予測することができるいくつかのプログラム例えば、ヒトスプライシングファインダー（Ｄｅｓｍｅｔ，Ｈａｍｒｏｕｎ ｅｔ ａｌ． ２００９））を使用して、潜在的な分岐点を同定し、そしてそれらをコドン最適化配列で置き換える。この方法で達成可能なヌクレオチド変化の程度が十分でない場合には、潜在的な分岐点を分裂させるために、代替ヌクレオチドを導入する。
この方法で、ＡＡＶ９ＮＳ１（ＳＡ、破壊されている）、ＡＡＶ９ＮＳ２（ＳＤ、破壊されている）、およびＡＡＶ９ＮＳ３（ＳＤとＳＡの両方、破壊されている）のキャップＯＲＦを作成した（図９）。アンチセンス配向のこれらのＯＲＦを、Ｎｅｕｒｏ２ａ細胞のｈＳｙｎＩエンハンサープロモーターの制御化で、一時的なプラスミドトランスフェクションによって発現させ、そしてアンチセンス転写産物をＲＴ－ＰＣＲによって分析した。この実験は、スプライシングが、ＮＳ１、ＮＳ２、およびＮＳ３キャップＯＲＦのすべてにおいて有効に抑制され得ることを明らかにした（図１０）。スプライシングがキャップＯＲＦ由来アンチセンスｍＲＮＡで生じた場合でも、キャップＯＲＦの比較的小さなペプチド挿入領域を、ＲＴ－ＰＣＲによってｍＲＮＡ前駆体から回収することがなお可能であることに留意されたい。
本明細書に記載のＴＲＡＤＥ方法は、ウイルスタンパク質の進化にアンチセンスｍＲＮＡを使用して、原理の実証を確立し、そして実施するべき方法が成功裡に削減されることを示す。ＴＲＡＤＥシステムはまた、ウイルスを産生することができ、そして指向進化手順中の標的細胞におけるウイルスタンパク質の潜在的発現が新しいキャプシドの連続的進化を妨げない限り、ｍＲＮＡをセンス配向で利用することができる。
核酸スプライシングとＡＡＶに関係する追加情報は、Ｄｅｓｍｅｔ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ３７，ｅ６７ （２００９）；Ｍａｔｓｕｚａｋｉ ｅｔ ａｌ．，Ｎｅｕｒｏｓｃｉ Ｌｅｔｔ ６６５，１８２－１８８ （２０１８）；および、Ｈｏｒｄｅａｕｘ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ ２６，６６４－６６８ （２０１８）に確認することができる。
本開示で引用される全ての参考文献は、参照によってその全体が組み込まれる。
Claims (41)
- 核酸であって、該核酸は、
ＩＴＲ配列によって隣接されるパルボウイルス科ゲノムであって、該パルボウイルス科ゲノムは、パルボウイルス科イントロン、パルボウイルス科キャップ遺伝子、および第１配向の第１ポリアデニル化シグナルを含む、パルボウイルス科ゲノムと、
アデノウイルスのヘルパー機能の存在下でパルボウイルス科キャップ遺伝子の発現を推進させる前記第１配向の第１プロモーターと、
前記第１配向に対してアンチセンスである第２配向の第２プロモーターおよび第２ポリアデニル化シグナルであって、前記第２ポリアデニル化シグナルは、パルボウイルス科キャップ遺伝子のアンチセンスｍＲＮＡ転写の終結を引き起こす位置に位置する、第２配向の第２プロモーターおよび第２ポリアデニル化シグナルと、を含む、核酸。 - 前記第２プロモーターは、細胞型特異的プロモーターである、請求項１に記載の核酸。
- 前記第２プロモーターは、ユビキタスプロモーターである、請求項１に記載の核酸。
- 前記パルボウイルス科ゲノムは、ＡＡＶイントロンおよびＡＡＶキャップ遺伝子を含むＡＡＶゲノムである、請求項１～３のいずれかに記載の核酸。
- 前記ＡＡＶキャップ遺伝子は、野生型のＡＡＶキャップ遺伝子である、請求項４に記載の核酸。
- 前記ＡＡＶキャップ遺伝子の配列は、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ１３、または他の天然のＡＡＶ単離キャップ遺伝子配列である、請求項５に記載の核酸。
- 前記ＡＡＶキャップ遺伝子は、組み換えＡＡＶキャップ遺伝子である、請求項４に記載の核酸。
- 前記ＡＡＶキャップ遺伝子は、多様なＡＡＶキャップ遺伝子のライブラリーの１つである、請求項４に記載の核酸。
- 請求項４に記載の複数の核酸を含む核酸ライブラリーであって、前記核酸は、複数の固有のＡＡＶキャップ遺伝子配列を含む、核酸ライブラリー。
- 前記核酸ライブラリーは、約１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７または１０８を上回る固有のＡＡＶキャップ遺伝子配列を含む、請求項９に記載の核酸ライブラリー。
- 前記第２配向の対象遺伝子をさらに含む、請求項１～８のいずれかに記載の核酸。
- 前記第２ポリアデニル化シグナルは、ＡＡＶイントロン内に位置する、請求項４～８または１１のいずれかに記載の核酸。
- 前記第２ポリアデニル化シグナルは、キャップ遺伝子が第１配向の完全長のキャプシドタンパク質に正確に翻訳され、およびキャップ遺伝子が、完全長のＡＡＶキャップ遺伝子コード配列を含むアンチセンスｍＲＮＡへと正確に転写されるように、位置する、請求項４～８または１１のいずれかに記載の核酸。
- 異なるキャップ遺伝子配列を有する少なくとも１つの他のＡＡＶベクターと比較して、対象組織から細胞を形質導入する能力が増大したキャップ遺伝子配列を有するＡＡＶベクターを同定する方法であって、該方法は、
請求項９または１０に記載の核酸ライブラリーをＡＡＶパッケージング細胞株へと導入し、およびパッケージング細胞株から第１回ＡＡＶ ＴＲＡＤＥベクターライブラリーを回収させることによって第１回ＡＡＶ ＴＲＡＤＥベクターライブラリーを調製する工程と、
第１回ＡＡＶ ＴＲＡＤＥベクターライブラリーを１つ以上の動物に注入する工程と、
動物の対象組織の細胞内で富化されるＡＡＶベクターのキャップ遺伝子配列を回収する工程と、
前記豊化されたＡＡＶベクターの回収されたキャップ遺伝子配列を含む第２回のＡＡＶ ＴＲＡＤＥ核酸ライブラリーを調製し、このライブラリーをＡＡＶパッケージング細胞株へ導入し、パッケージング細胞株から第２回ＡＡＶ ＴＲＡＤＥベクターライブラリーを回収する工程と、
第２回のＡＡＶ ＴＲＡＤＥベクターライブラリーを１つ以上の動物に注入し、および動物の対象組織の細胞内で豊化されるキャップ遺伝子配列を回収することによって第２回の富化を実施する工程と、
富化されたＡＡＶキャップ遺伝子配列を、第１回富化後、第２回富化後、およびその後任意の回の富化後に同定する工程と、を含む方法。 - ＡＡＶ ＴＲＡＤＥベクター、またはＡＡＶ ＴＲＡＤＥベクターライブラリーを産生する方法であって、該方法は、
請求項４～８または１１～１３のいずれかに記載の核酸、または請求項９または１０に記載の核酸ライブラリーを、ＡＡＶパッケージング細胞株へと導入する工程と、ＡＡＶ ＴＲＡＤＥベクターまたはＡＡＶ ＴＲＡＤＥベクターライブラリーをパッケージング細胞株から回収する工程と、を含む方法。 - 対象組織の細胞を形質導入する能力が増大したＡＡＶベクターの新しいキャップ遺伝子の配列を決定する方法であって、該方法は、
請求項１４に記載の方法でＡＡＶベクターを同定する工程と、
キャップ遺伝子配列を含むアンチセンスｍＲＮＡを回収する工程と、
新しいキャップ遺伝子配列を決定する工程と、を含む方法。 - 前記アンチセンスｍＲＮＡは、ＲＴ－ＰＣＲを使用して回収される、請求項１６に記載の方法。
- 前記キャップ遺伝子配列を決定する工程をさらに含む、請求項１６または１７に記載の方法。
- 請求項４～８または１１～１３のいずれかに記載の核酸を含む、ＡＡＶベクター。
- 核酸であって、該核酸は、
ＩＴＲ配列によって隣接されるパルボウイルス科ゲノムであって、該パルボウイルス科ゲノムは、パルボウイルス科イントロン、パルボウイルス科キャップ遺伝子、および第１配向の第１ポリアデニル化シグナルを含む、パルボウイルス科ゲノムと、
アデノウイルスのヘルパー機能の存在下でパルボウイルス科キャップ遺伝子の発現を推進させる前記第１配向の第１プロモーターと、
アデノウイルスのヘルパー機能の不在下でパルボウイルス科キャップ遺伝子の発現を推進させる前記第１配向の第２プロモーターと、を含む核酸。 - 前記第２プロモーターは、細胞型特異的プロモーターである、請求項２０に記載の核酸。
- 前記第２プロモーターは、ユビキタスプロモーターである、請求項２０に記載の核酸。
- 前記パルボウイルス科キャップ遺伝子は、野生型のＡＡＶキャップ遺伝子である、請求項２０～２２のいずれかに記載の核酸。
- 前記ＡＡＶキャップ遺伝子配列は、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ１３、または他の天然のＡＡＶ単離キャップ遺伝子配列である、請求項２３に記載の核酸。
- 前記パルボウイルス科キャップ遺伝子は、組み換えＡＡＶキャップ遺伝子である、請求項２０～２２のいずれかに記載の核酸。
- 前記パルボウイルス科キャップ遺伝子は、多様なＡＡＶキャップ遺伝子のライブラリーの１つである、請求項２０～２５のいずれかに記載の核酸。
- 請求項２０に記載の複数の核酸を含む核酸ライブラリーであって、前記核酸は、複数の固有のパルボウイルス科キャップ遺伝子配列を含む、核酸ライブラリー。
- 前記核酸ライブラリーは、約１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７または１０８を上回る固有のＡＡＶキャップ遺伝子配列を含む、請求項２７に記載の核酸ライブラリー。
- 対象遺伝子をさらに含む、請求項２０～２６のいずれかに記載の核酸。
- 異なるキャップ遺伝子配列を有する少なくとも１つの他のＡＡＶベクターと比較して、対象組織から細胞を形質導入する能力が増大したキャップ遺伝子配列を有するＡＡＶベクターを同定する方法であって、該方法は、
請求項２７または２８に記載の核酸ライブラリーをＡＡＶパッケージング細胞株へと導入し、およびパッケージング細胞株から第１回ＡＡＶ ＴＲＡＤＥベクターライブラリーを回収することによって第１回ＡＡＶ ＴＲＡＤＥベクターライブラリーを調製する工程と、
第１回ＡＡＶ ＴＲＡＤＥベクターライブラリーを１つ以上の動物に注入する工程と、
動物に対象組織の細胞内で富化されるＡＡＶベクターのキャップ遺伝子配列を回収する工程と、
前記豊化されたＡＡＶベクターのキャップ遺伝子配列を含む第２回のＡＡＶ ＴＲＡＤＥ核酸ライブラリーを調製し、このライブラリーをＡＡＶパッケージング細胞株へ導入し、パッケージング細胞株から第２回ＡＡＶ ＴＲＡＤＥベクターライブラリーを回収する工程と、
第２回のＡＡＶ ＴＲＡＤＥベクターライブラリーを１つ以上の動物に注入し、および動物に対象組織の細胞内で豊化されるキャップ遺伝子配列を回収することによって第２回の富化を実施する工程と、
富化されたＡＡＶキャップ遺伝子配列を、第１回富化後、第２回富化後、およびその後任意の回の富化後に同定する工程と、を含む方法。 - ＡＡＶ ＴＲＡＤＥベクター、またはＡＡＶ ＴＲＡＤＥベクターライブラリーを産生する方法であって、該方法は、
請求項２３～２６または２９のいずれかに記載の核酸、または請求項２７または２８に記載の核酸ライブラリーを、ＡＡＶパッケージング細胞株へと導入する工程と、ＡＡＶ ＴＲＡＤＥベクターまたはＡＡＶ ＴＲＡＤＥベクターライブラリーをパッケージング細胞株から回収する工程と、を含む方法。 - 対象組織の細胞を形質導入する能力が増大したＡＡＶベクターの新しいキャップ遺伝子の配列を決定する方法であって、該方法は、
請求項３０に記載の方法でＡＡＶベクターを同定する工程と、
キャップ遺伝子配列を含むセンスｍＲＮＡを回収する工程と、
新しいキャップ遺伝子配列を決定する工程と、を含む方法。 - 前記センスｍＲＮＡは、ＲＴ－ＰＣＲを使用して回収する、請求項３２に記載の方法。
- 前記キャップ遺伝子配列を決定する工程をさらに含む、請求項３２または３３に記載の方法。
- 請求項２３～２６または２９のいずれかに記載の核酸を含む、ＡＡＶベクター。
- 前記第２配向の少なくとも１つのｍＲＮＡスプライシング抑制突然変異をさらに含む、請求項１～８または１１～１３のいずれかに記載の核酸。
- 前記少なくとも１つのｍＲＮＡスプライシング抑制突然変異は、スプライスドナーおよび／またはスプライスアクセプター部位の１０のヌクレオチド内に位置する１つ以上のヌクレオチドの変質を含む、請求項３６に記載の核酸。
- 前記変質は、ＡＡＶキャップ遺伝子によってコードされたアミノ酸配列を変更しない、請求項３６または３７に記載の核酸。
- ＡＡＶキャップＯＲＦ配列であって、スプライシングドナー部位のエキソン－イントロン連結の１つ以上の以下の突然変異：
ＡＡＶ１ ＶＰ１キャップＯＲＦ １００９－ＣＴＴＡＣ（連結）ＣＡＧＣＡ－１０１８＊（配列番号：１９９）
ＡＡＶ３ ＶＰ１キャップＯＲＦ １００６－ＣＴＴＡＣ（連結）ＣＡＧＣＡ－１０１５＊（配列番号：１９９）
ＡＡＶ１ ＶＰ１キャップＯＲＦ １２２８－ＴＴＴＡＣ（連結）ＣＴＴＣＡ－１２３７（配列番号：２００）
ＡＡＶ３ ＶＰ１キャップＯＲＦ １２３７－ＴＡＴＡＣ（連結）ＣＴＴＣＧ－１２４６（配列番号：２０１）
ＡＡＶ１ ＶＰ１キャップＯＲＦ １３３１－ＡＴＴＡＣ（連結）ＣＴＧＡＡ－１３４０（配列番号：２０２）
ＡＡＶ１ ＶＰ１キャップＯＲＦ １４３４－ＧＣＴＡＣ（連結）ＣＴＧＧＡ－１４４３（配列番号：２０３）
ＡＡＶ１ ＶＰ１キャップＯＲＦ １５０２－ＴＴＴＡＣ（連結）ＣＴＧＧＡ－１５１０（配列番号：２０４）
ＡＡＶ１ ＶＰ１キャップＯＲＦ １８０３－ＡＴＴＡＣ（連結）ＣＴＧＧＣ－１８１２（配列番号：２０５）
ＡＡＶ３ ＶＰ１キャップＯＲＦ １８０３－ＣＴＴＡＣ（連結）ＣＴＧＧＣ－１８１２（配列番号：２０６）
ＡＡＶ１ ＶＰ１キャップＯＲＦ １８３５－ＴＧＴＡＣ（連結）ＣＴＧＣＡ－１８４４（配列番号：２０７）
ＡＡＶ１ ＶＰ１キャップＯＲＦ ２１８９－ＧＴＴＡＣ（連結）ＣＴＴＡＣ－２１９８（配列番号：２０８）
ＡＡＶ９ ＶＰ１キャップＯＲＦ ２１８９－ＧＡＴＡＣ（連結）ＣＴＧＡＣ－２１９８（配列番号：２０９）
ＡＡＶ１ ＶＰ１キャップＯＲＦ ２１９４－ＣＴＴＡＣ（連結）ＣＣＧＴＣ－２２０３（配列番号：２１０）
ＡＡＶ３ ＶＰ１はＯＲＦ ２１９４－ＣＴＣＡＣ（連結）ＡＣＧＡＡ－２２０３（配列番号：２１１）
（＊ヌクレオチド番号は異なるが、それらは配列アラインメントにおけるＡＡＶキャップＯＲＦの対応するヌクレオチドである。）を含む、ＡＡＶキャップＯＲＦ配列。 - ＡＡＶキャップＯＲＦ配列であって、スプライシングドナー部位のエキソン－イントロン連結の１つ以上の以下の突然変異：
ＡＡＶ１ ＶＰ１キャップＯＲＦ ３０５－ＡＧＣＧＴ（連結）ＣＴＧＣＡ－３１４（配列番号：２１２）
ＡＡＶ１ ＶＰ１キャップＯＲＦ ４１４－ＧＧＣＴＣ（連結）ＣＴＧＧＡ－４２３（配列番号：２１３）
ＡＡＶ３ ＶＰ１キャップＯＲＦ ４１４－ＧＧＣＴＣ（連結）ＣＴＧＧＡ－４２３（配列番号：２１３）
ＡＡＶ１ ＶＰ１キャップＯＲＦ ４９５－ＧＣＣＣＧ（連結）ＣＴＡＡＡ－５０４（配列番号：２１４）
ＡＡＶ９ ＶＰ１キャップＯＲＦ ４９５－ＧＣＣＣＧ（連結）ＣＴＡＡＡ－５０４（配列番号：２１４）
ＡＡＶ３ ＶＰ１キャップＯＲＦ １１３３－ＴＣＡＣＣ（連結）ＣＴＧＡＡ－１１４２（配列番号：２１５）
ＡＡＶ１ ＶＰ１キャップＯＲＦ １１８１－ＡＣＴＧＣ（連結）ＣＴＧＧＡ－１１９０（配列番号：２１６）
ＡＡＶ１ ＶＰ１キャップＯＲＦ １３３１－ＡＴＴＡＣ（連結）ＣＴＧＡＡ－１３４０＊＊（配列番号：２０２）
ＡＡＶ３ ＶＰ１キャップＯＲＦ １３２８－ＡＣＴＡＣ（連結）ＣＴＧＡＡ－１３３７＊＊（配列番号：２１７）
ＡＡＶ１ ＶＰ１キャップＯＲＦ １４６４－ＣＧＴＴＴ（連結）ＣＴＡＡＡ－１４７３（配列番号：２１８）
ＡＡＶ１ ＶＰ１キャップＯＲＦ １６５３－ＡＡＡＣＡ（連結）ＣＴＧＣＡ－１６６２（配列番号：２１９）
ＡＡＶ１ ＶＰ１キャップＯＲＦ ２０５４－ＧＧＧＡＧ（連結）ＣＴＧＣＡ－２０６３（配列番号：２２０）
ＡＡＶ３ ＶＰ１キャップＯＲＦ ２０５４－ＧＧＧＡＧ（連結）ＣＴＡＣＡ－２０６３（配列番号：４６３）
（＊＊ヌクレオチド番号は異なっても、それらは配列アラインメントにおけるＡＡＶキャップＯＲＦの対応するヌクレオチドである。）を含む、ＡＡＶキャップＯＲＦ配列。 - ＡＡＶキャップＯＲＦ配列であって、スプライシングドナーまたはスプライシングアクセプター部位のエキソン－イントロン連結の１つ以上の以下の突然変異：
スプライスドナー
ＡＡＶ１ ＶＰ１キャップＯＲＦ １００９－ＣＴＴＡＣ（連結）ＣＡＧＣＡ－１０１８＊（配列番号：１９９）
ＡＡＶ３ ＶＰ１キャップＯＲＦ １００６－ＣＴＴＡＣ（連結）ＣＡＧＣＡ－１０１５＊（配列番号：１９９）
ＡＡＶ１ ＶＰ１キャップＯＲＦ １２２８－ＴＴＴＡＣ（連結）ＣＴＴＣＡ－１２３７（配列番号：２００）
ＡＡＶ３ ＶＰ１キャップＯＲＦ １２３７－ＴＡＴＡＣ（連結）ＣＴＴＣＧ－１２４６（配列番号：２０１）
ＡＡＶ１ ＶＰ１キャップＯＲＦ １３３１－ＡＴＴＡＣ（連結）ＣＴＧＡＡ－１３４０（配列番号：２０２）
ＡＡＶ１ ＶＰ１キャップＯＲＦ １４３４－ＧＣＴＡＣ（連結）ＣＴＧＧＡ－１４４３（配列番号：２０３）
ＡＡＶ１ ＶＰ１キャップＯＲＦ １５０２－ＴＴＴＡＣ（連結）ＣＴＧＧＡ－１５１０（配列番号：２０４）
ＡＡＶ１ ＶＰ１キャップＯＲＦ １８０３－ＡＴＴＡＣ（連結）ＣＴＧＧＣ－１８１２（配列番号：２０５）
ＡＡＶ３ ＶＰ１キャップＯＲＦ １８０３－ＣＴＴＡＣ（連結）ＣＴＧＧＣ－１８１２（配列番号：２０６）
ＡＡＶ１ ＶＰ１キャップＯＲＦ １８３５－ＴＧＴＡＣ（連結）ＣＴＧＣＡ－１８４４（配列番号：２０７）
ＡＡＶ１ ＶＰ１キャップＯＲＦ ２１８９－ＧＴＴＡＣ（連結）ＣＴＴＡＣ－２１９８（配列番号：２０８）
ＡＡＶ９ ＶＰ１キャップＯＲＦ ２１８９－ＧＡＴＡＣ（連結）ＣＴＧＡＣ－２１９８（配列番号：２０９）
ＡＡＶ１ ＶＰ１キャップＯＲＦ ２１９４－ＣＴＴＡＣ（連結）ＣＣＧＴＣ－２２０３（配列番号：２１０）
ＡＡＶ３ ＶＰ１キャップＯＲＦ ２１９４－ＣＴＣＡＣ（連結）ＡＣＧＡＡ－２２０３（配列番号：２１１）
スプライスアクセプター
ＡＡＶ１ ＶＰ１キャップＯＲＦ ３０５－ＡＧＣＧＴ（連結）ＣＴＧＣＡ－３１４（配列番号：２１２）
ＡＡＶ１ ＶＰ１キャップＯＲＦ ４１４－ＧＧＣＴＣ（連結）ＣＴＧＧＡ－４２３（配列番号：２１３）
ＡＡＶ３ ＶＰ１キャップＯＲＦ ４１４－ＧＧＣＴＣ（連結）ＣＴＧＧＡ－４２３（配列番号：２１３）
ＡＡＶ１ ＶＰ１キャップＯＲＦ ４９５－ＧＣＣＣＧ（連結）ＣＴＡＡＡ－５０４（配列番号：２１４）
ＡＡＶ９ ＶＰ１キャップＯＲＦ ４９５－ＧＣＣＣＧ（連結）ＣＴＡＡＡ－５０４（配列番号：２１４）
ＡＡＶ３ ＶＰ１キャップＯＲＦ １１３３－ＴＣＡＣＣ（連結）ＣＴＧＡＡ－１１４２（配列番号：２１５）
ＡＡＶ１ ＶＰ１キャップＯＲＦ １１８１－ＡＣＴＧＣ（連結）ＣＴＧＧＡ－１１９０（配列番号：２１６）
ＡＡＶ１ ＶＰ１キャップＯＲＦ １３３１－ＡＴＴＡＣ（連結）ＣＴＧＡＡ－１３４０＊＊（配列番号：２０２）
ＡＡＶ３ ＶＰ１キャップＯＲＦ １３２８－ＡＣＴＡＣ（連結）ＣＴＧＡＡ－１３３７＊＊（配列番号：２１７）
ＡＡＶ１ ＶＰ１キャップＯＲＦ １４６４－ＣＧＴＴＴ（連結）ＣＴＡＡＡ－１４７３（配列番号：２１８）
ＡＡＶ１ ＶＰ１キャップＯＲＦ １６５３－ＡＡＡＣＡ（連結）ＣＴＧＣＡ－１６６２（配列番号：２１９）
ＡＡＶ１ ＶＰ１キャップＯＲＦ ２０５４－ＧＧＧＡＧ（連結）ＣＴＧＣＡ－２０６３（配列番号：２２０）
ＡＡＶ３ ＶＰ１キャップＯＲＦ ２０５４－ＧＧＧＡＧ（連結）ＣＴＡＣＡ－２０６３（配列番号：４６３）を含む、ＡＡＶキャップＯＲＦ配列。
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