JP2018174945A - 非ウイルス性再プログラムによる多能性幹細胞 - Google Patents
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Abstract
Description
本明細書は、米国仮特許出願第61/108.362(出願日2008年10月24日)を参照によりその全体を説明したものとしてここに含める。
本発明は、NIH GM081629及びRR000167の機関を通してアメリカ合衆国政府助成を受けた。アメリカ合衆国は本発明にある一定の権利を保有する。
発現カセットの設計と作製
プライマーとして、かつ表1に収載の配列内リボソーム進入部位から得られるコード領域の最初と最後の20〜22の塩基を使用して、して、導入遺伝子の一部または全てから得られるオープン・リーディング・フレーム(ORF)をポリメラーゼ連鎖反応(PCR)法で直接増幅するという従来の方法を使って、適した発現カセットを作製した。SV40T抗原とヒトテロメラーゼ逆転写酵素、プラスミドpBABE−puro SV40 LT、および、pBABE−hygro−hTERT(ヒトテロメラーゼ逆転写酵素)の供給源は、プラスミド1390および1773としてそれぞれAddgene,Inc,Cambridge、MAから市販されている。 IRES1とIRES2、プラスミドpIRESpuro3とプラスミドpIRES2EGFPの供給源は、Clontech Laboratories,Inc.,Mountain View,CA.から市販されている。
口蹄疫ウイルスセグメント2を化学的に合成した。インフレームの発現カセットは、下記表1記載のコードを使って記述する。例えば、「E−O2S」とは、OCT4とSOX2コード領域(両者の間にIRES2)の上流に位置するEF1αプロモータを有する発現カセットを意味する。同様に、C−M2Kとは、c−MycとKlf4コード領域(両者の間にIRES2)の上流に位置するCMVプロモータを有する発現カセットを意味する。
いくつかのコンストラクトでは、上記のカセットは、一連の再プログラム中では使わなかった。O2Sとは異なるO2S変異体発現カセット(「O2S(2)」)を採用した。この変異体は、TKプロモータ−Hyg −TK polyAカセット(図5Aおよび図5Bを比較せよ)を含んでいた。指示した構造を有するカセットは、様々な因子の発現レベルを実験的に測定することによる再プログラムの方法で、後に使用するために選択した。
EF2(配列番号:12)として設計されたプロモータは、既知のEF1αプロモータ(配列番号:11)とはわずかに異なる変異体であったが、活性化中のEF1αとは異ならず、また後に以下のエピソームのベクターの再プログラムの試行には使用しなかった。F2Aは、単一のトランスクリプトから発現した異なるコード領域を同時翻訳するのを促進するペプチド・リンカーである。F2Aを試用したが、後のエピソームのベクターを使った再プログラム試行には使わなかった。IRES1を試用したが、後のエピソームのベクターを使った再プログラム試行には使わなかった。
レンチウイルス・コンストラクトを使用したヒト新生児包皮線維芽細胞の再プログラム化 予備的再プログラムの実験は、レンチウイルスベクターをヒト新生児の包皮線維芽細胞に導入することによって行った。図2Aは、OCT4、SOX2、LIN28、および、さらにc−MYCを導入する場合、NANOGが再プログラム効率にかなりのプラス効果をもたらすことを示し、 また、OCT4、SOX2、および、LIN28との組み合わせでは、c−MYCまたはKLF4が無い場合でもNANOGが再プログラムを補助できることを示す。使用したレンチウイルスのコンストラクトは、pSIN4−EF2−OCT4−IRES2−SOX2(O2S)、pSIN4−EF2−NANOG−IRES2−LIN28 (N2L)、pSIN4−EF2−LIN28−IRES1−PURO(L)、pSIN4−CMV−c−Myc−IRES1−PURO(M)、pSIN4−EF2−KLF4−IRES1−PURO(K)であった。形質導入20日後、アルカリ・ホスファターゼ-陽性ヒトiPS細胞コロニーを計数した。iPS細胞コロニーの数は、2.5×104個のヒト新生児包皮線維芽細胞(継代数9)の入力由来であった。薄灰色の棒は、再プログラムされて形成した、代表的なヒトES細胞形態を有するコロニーの合計数を表し、濃い灰色棒は、分化が最も少なかった大型コロニーの数を表す。
非ウイルス性エピソームのベクターを使ったヒト新生児包皮線維芽細胞の再プログラム
ヒト新生児包皮線維芽細胞(Cat# CRL−2097(商標),ATCC)は、10%熱失活したウシ胎仔血清(FBS,HyClone Laboratories,Logan,UT)、2mMのグルタマックス、0.1mMの非必須アミノ酸、および、0.1mMのβ−メルカプトエタノールを添加した包皮線維芽細胞培地(DMEM(Cat# 11965,Invitrogen))で維持した。
1.霊長類の体細胞を再プログラムする方法であって、
前記細胞を再プログラムするのに充分な条件の下で前記霊長類体細胞を複数の能力決定因子に曝露する工程と、
前記曝露された細胞を培養して前記霊長類体細胞より高い能力レベルを有する再プログラムされた細胞を得る工程と、
を含み、
前記再プログラムされた細胞は、前記体細胞に曝露する前記能力決定因子に関連するどのような構成要素も実質的に含まない再プログラム方法。
2.前記霊長類体細胞が胎児または出生後の個体から得られたものである、 上記1に記載の方法。
3.前記霊長類が、ヒトである、 上記1に記載の方法。
4.前記再プログラムされた細胞が、胎児または出生後の個体と遺伝的に同一である、 上記1に記載の方法。
5.前記曝露する工程が、1つまたは複数個の能力決定因子をコードする少なくとも1個のベクターを前記霊長類の体細胞に導入する工程を含む、 上記1に記載の方法。
6.前記ベクターが非ウイルス性エピソームのベクターである、 上記5に記載の方法。
7.前記1つまたは複数個の能力決定因子が、ヒトOCT−4、ヒトSOX2、ヒトLIN28、ヒトNANOG、ヒトc−Myc、およびヒトKLF4を含み、前記ベクターがc−Mycを含む場合、前記方法はさらに前記霊長類体細胞をSV40T抗原に曝露する工程を含む、 上記5に記載の方法。
8.前記少なくとも1つのベクターが単一ベクターである、 上記5に記載の方法。
9.前記単一ベクターが、少なくとも1つの配列内リボソーム進入部位を含む、 上記に記載の方法。
10.前記単一ベクターが、順番に、第一のプロモータ、OCT4、IRES2、SOX2、第二のプロモータ、SV40T抗原、IRES2、およびKLF4を含む、 上記8に記載の方法。
11.前記ベクターが、順番に、第一のプロモータ、OCT4、IRES2、SOX2、第二のプロモータ、c−Myc、IRES2、KLF4、第三のプロモータ、NANOG、IRES2、およびLN28を含む、 上記8に記載の方法。
12.第一のベクターが、順番に、第一のプロモータ、OCT4、IRES2、SOX2、第二のプロモータ、SV40T抗原、IRES2、およびKLF4を含み、第二のベクターが、順番に、第三のプロモータ、OCT4、IRES2、SOX2、第四のプロモータ、NANOG、IRES2、KLF4を含み、第三のベクターが、順番に、第五のプロモータ、c−Myc、IRES2、LN28を含み、前記プロモータは同一である必要がない、 上記5に記載の方法。
13.前記第一の、第二の、第三の、および第四の各プロモータが伸長因子1α(EF1α)遺伝子プロモータである、 上記12に記載の方法。
14.第一のベクターが、順番に、第一のプロモータ、OCT4、IRES2、SOX2、第二のプロモータ、KLF4、IRES2、c−Myc、第三のプロモータ、NANOG、IRES2、およびLN28を含み、第二のベクターが、順番に、第四のプロモータ、OCT4、IRES2、SOX2、第五のプロモータ、SV40T抗原、IRES2、およびKLF4を含み、前記プロモータは同一である必要がない、 上記5に記載の方法。
15.前記第一の、第三の、第四の、および第五の、各プロモータが、EF1α遺伝子プロモータであり、また第二のプロモータが、サイトメガロウイルス・前初期遺伝子(CMV)プロモータである、 上記14に記載の方法。
16.第一のベクターが、順番に、第一のプロモータ、OCT4、IRES2、SOX2、第二のプロモータ、NANOG、IRES2、およびLN28を含み、第二のベクターが、順番に、第三のプロモータ、OCT4、IRES2、SOX2、第四のプロモータ、SV40T抗原、IRES2、およびKLF4を含み、ならびに、第三のベクターが、順番に、第五のプロモータ、OCT4、IRES2、SOX2、第六のプロモータ、c−Myc、IRES2、およびKLF4を含み、前記プロモータは同一である必要がない、 上記5に記載の方法。
17.霊長類多能性細胞の濃縮された集団であって、
能力決定因子を発現するのに充分な条件の下で霊長類体細胞を能力決定因子に曝露することにより、前記体細胞を再プログラムして前記霊長類体細胞を産生する工程を含む方法により産生され、
前記細胞が、前記体細胞に曝露する前記能力決定因子に関連するどのような構成要素も実質的に含まない霊長類多能性細胞の濃縮された集団。
18.前記霊長類体細胞が、胎児または出生後の個体から得られたものである、 上記17に記載の前記集団。
19.霊長類が、ヒトである、 上記17に記載の前記集団。
20.前記多能性細胞が、実質的に出生後の個体と遺伝的に同一である、 上記17に記載の集団。
21.前記曝露する工程が、1つまたは複数個の能力決定因子をコードする少なくとも1個のベクターを前記霊長類体細胞に導入する工程を含む、 上記17に記載の集団。
22.前記ベクターが、非ウイルス性のエピソームのベクターである、 上記21に記載の集団。
23.1つまたは複数個の能力決定因子が、ヒトOCT−4、ヒトSOX2、ヒトLIN28、ヒトNANOG、ヒトc−Myc、およびヒトKLF4を含み、前記ベクターが、c−Mycを含む場合、前記方法は、さらに前記霊長類体細胞をSV40T抗原に曝露する工程を含む、 上記21に記載の集団。
24.多能性の誘導に関連するどのような構成要素も実質的に含まない霊長類誘導多能性細胞。
Claims (8)
- 霊長類の体細胞を再プログラムする方法であって、以下の工程、
(1)SV40T抗原およびヒトOCT−4、ヒトSOX2、ヒトLIN28、ヒトNANOG、ヒトc−MycおよびヒトKLF4からなる群から選択される能力決定因子をコードする複数の非ウイルスエピソームベクターを、霊長類体細胞を再プログラムするのに充分な条件の下で、該霊長類体細胞に導入する工程であって、前記複数の非ウイルスエピソームベクターが、ヒトOCT−4及びヒトSOX2を単一のベクター内に含み、前記霊長類体細胞が、出生後の個体から得られたものである工程、
(2)前記細胞を培養して、再プログラムされた細胞を得る工程であって、該再プログラムされた細胞が、胎児または出生後の個体と遺伝的に同一である工程、
を含み、
前記能力決定因子が、(1)ヒトOCT−4、ヒトSOX2、ヒトc−MycおよびヒトKLF4の組合せであるか、(2)ヒトOCT−4、ヒトSOX2、ヒトLIN28およびヒトNANOGの組合せであり、前記非ウイルスエピソームベクターが、TERTを含まないことを特徴とする方法。 - 前記霊長類が、ヒトである、請求項1に記載の方法。
- 第1の非ウイルスエピソームベクターが、順番に、第一のプロモータ、OCT4、IRES2、SOX2、第二のプロモータ、SV40T抗原、IRES2、およびKLF4を含む、請求項1又は2に記載の方法。
- 前記第一のプロモータが、伸長因子1α(EF1α)遺伝子プロモータである、請求項3に記載の方法。
- 第一のベクターが、順番に、第一のプロモータ、OCT4、IRES2、SOX2、第二のプロモータ、KLF4、IRES2、c−Myc、第三のプロモータ、NANOG、IRES2、およびLIN28を含む、請求項1に記載の方法。
- 前記第一のプロモータが、EF1α遺伝子プロモータであり、また第二のプロモータが、サイトメガロウイルス・前初期遺伝子(CMV)プロモータである、請求項5に記載の方法。
- 第一のベクターが、順番に、第一のプロモータ、OCT4、IRES2、SOX2、第二のプロモータ、NANOG、IRES2、およびLIN28を含み、第二のベクターが、順番に、第三のプロモータ、OCT4、IRES2、SOX2、第四のプロモータ、SV40T抗原、IRES2、およびKLF4を含み、ならびに、第三のベクターが、順番に、第五のプロモータ、OCT4、IRES2、SOX2、第六のプロモータ、c−Myc、IRES2、およびKLF4を含み、前記プロモータが、同一である必要がない、請求項1に記載の方法。
- 前記複数の非ウイルスエピソームベクターの組合せが、以下の配列を有するベクターの組合せから選択される、請求項1に記載の方法。
(1)pEP4−E−O2S−E−T2K、pEP4−E−O2S−E−N2K、およびpCEP4−M2L、
(2)pEP4−E−O2S−C−K2M−E−N2L、およびpEP4−E−O2S−E−T2K、または
(3)pEP4−E−O2S−E−N2L、pEP4−E−O2S−E−T2K、およびpEP4−E−O2S−E−M2K。
(上記配列中、pEP4及びpCEP4は、発現ベクター、Eは、EF1α遺伝子プロモータ、Oは、OCT4遺伝子、2は、IRES2、Sは、SOX2遺伝子、Tは、SV40T抗原遺伝子、Kは、KLF4遺伝子、Nは、NANOG遺伝子、Mは、c−Myc遺伝子、Cは、CMVプロモータ、Lは、LIN28遺伝子を意味する。)
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