JP2018138529A - テアフラビン類を利用したレプチン分泌促進剤 - Google Patents
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Abstract
Description
項1. テアフラビン類を有効成分とするレプチン分泌促進剤。
項2. テアフラビン類の含有量が0.5質量%超30質量%以下である、項1に記載のレプチン分泌促進剤。
項3. 胃におけるレプチンの分泌促進に使用される、項1又は2に記載のレプチン分泌促進剤。
項4. レプチン分泌促進用飲食品である、項1〜3のいずれかに記載のレプチン分泌促進剤。
項5. レプチン分泌促進用医薬品である、項1〜3のいずれかに記載のレプチン分泌促進剤。
本発明のレプチン分泌促進剤は、テアフラビン類を有効成分とすることを特徴とする。
本発明において、テアフラビン類とは、下記の化学式(1)で表される化合物及び当該化合物と同じ骨格を有する類縁体である。
本発明におけるテアフラビン類としては、具体的には、下記の化学式(1)で表されるテアフラビン、化学式(2)で表されるテアフラビン3−O−ガレート、化学式(3)で表されるテアフラビン3’−O−ガレート、下記の化学式(4)で表されるテアフラビン3,3’−ジ−O−ガレートが挙げられる。本発明におけるテアフラビン類としては、これらの化合物のうち1種を含むものであってもよいし、2種以上を含むものであってもよい。
本発明のレプチン分泌促進剤は、前述したテアフラビン類以外に、本発明の効果を損なわない範囲で、剤型に応じて、他の添加成分を含有していてもよい。本発明のレプチン分泌促進剤に含有され得る添加成分としては、例えば、水、油脂類、ロウ類、炭化水素類、脂肪酸類、高級アルコール類、エステル類、植物抽出エキス類、水溶性高分子、界面活性剤、金属石鹸、アルコール、多価アルコール、pH調整剤、酸化防止剤、紫外線吸収剤、防腐剤、香料、粉体、増粘剤、色素、キレート剤等が挙げられる。これらの添加成分は、1種単独で使用してもよく、また2種以上を組み合わせて使用してもよい。また、これらの添加成分の含有量については、使用する添加成分の種類や本発明のレプチン分泌促進剤の剤型等に応じて適宜設定される。
本発明のレプチン分泌促進剤の剤型については、特に限定されず、固体状、半固体状、又は液体状のいずれであってもよく、レプチン分泌促進剤の種類や用途に応じて適宜設定すればよい。
また、本発明の分泌促進剤は液体に溶解した形態が好ましい。
<細胞の処理方法>
48ウェル細胞培養プレートに、正常ラット胃粘膜上皮細胞株RGM1細胞(理化学研究所バイオリソースセンター)を10%FBS DMEM/Ham’s F12培地(以下、「培地」と表記する。)で培養し、細胞が80〜90%コンフルエントになったところで、培地をFBS−free DMEM/Ham’s F12培地(以下、「無血清培地」と表記する。)に交換し、一晩培養した。一晩培養後に無血清培地を除去し、さらに200μLの無血清培地を添加した。
テアフラビン類と無血清培地を混合して、テアフラビン類の濃度が25μMの混合溶液を調製した。培養プレート中の培地をアスピレーターで除去し、速やかに前記混合溶液200μLを培養プレートに添加し、15〜60分間CO2インキュベーター内(37℃)で培養した。また、前記混合溶液200μLを、細胞を播種していない培養プレートに添加し、15〜60分間、CO2インキュベーター内(37℃)でインキュベートした。培地を180μLエッペンに回収し、200×gで3分間遠心分離を行い、上清をサンプルとした。なお、回収後はエッペンを氷上で保管した。
テアフラビン類として、テアフラビン(TF1)、テアフラビン3−O−ガレート(TF2A)、テアフラビン3’−O−ガレート(TF2B)、及びテアフラビン3,3’−ジ−O−ガレート(TF3)を使用した。
測定の前日に、100μg/mLのCapture antibodyをPBSで100倍希釈し、ELISAプレート(3801−096、IWAKI)の各ウェルに100μL加えた。そして、プレートをラップで梱包して4℃、遮光条件下で一晩インキュベートした。溶液を除去し、Wash bufferを各ウェル300μLずつ添加して洗浄を行った(4回)。最後の洗浄が終わったら、キムタオル(商品名、日本製紙クレシア株式会社)にELISAプレートを軽く叩きつけて液をよく切った。各ウェルにBlock bufferを300μL加え4℃で少なくとも1時間インキュベートし、洗浄を4回行い、液をよく切った。サンプルとレプチンスタンダード(leptinを無血清培地で0から2.0ng/mLとなるように希釈)を各ウェルに100μL加え、4℃で少なくとも2時間インキュベートした。洗浄を4回行い、液をよく切った。100μg/mLのDetection antibodyをDiluentで100倍希釈し、各ウェルに100μL加え、4℃で少なくとも2時間インキュベートした。洗浄を4回行い、液をよく切った。11mLのDiluentにAvidin−HRPを5.5μL(1:2,000)加え希釈し、各ウェルに100μL加え4℃で30分インキュベートした。洗浄を4回行い、液をよく切った。そして、ELISA POD基質TMBキットの発色試薬と基質溶液を等量ずつ混合し、各ウェルに100μL添加し観察した。十分発色したら各ウェルに反応停止薬として1MのH2SO4を50μL添加し、450nmの吸光度を、マイクロプレートリーダー(サンライズリモート、TECAN社製)を使用して測定した。
Capture antibody、Detection antibody、Leptin、Avidin−HRP(Leptin, Murine ELISA Development Kit (900−K76)(Peprotech))
発色試薬、基質溶液(ELISA POD基質TMBキット(Popular)(ナカライテスク))
Wash buffer (0.05%Tween−20 in PBS)
Globulin free bovine serum albumin (globulin free BSA)(EIA/RIA grade)(ナカライテスク)
Block buffer (1% globulin free BSA in PBS)
Diluent (0.05%Tween−20, 0.1%globulin free BSA in PBS)
DMEM/Ham’s F12培地 (ナカライテスク)
ペニシリン−ストレプトマイシン混合溶液(ペニシリン 10,000 u/mL、ストレプトマイシン 10,000μg/mL含有) (ナカライテスク)
Fetal bovine serum (FBS) (Sigma−Aldrich)
Cell Count Reagent SF(ナカライテスク)のキットを使用して、そのプロトコルに従って、テアフラビン類による細胞毒性を評価した。細胞として、前記RGM1細胞を使用した。培地として、前記DMEM/Ham’s F12培地(ナカライテスク)を使用した。具体的には、上記キットのプロトコルに従って、細胞増殖アッセイを行い、細胞毒性試験を行った。
Cytotoxicity LDH Assay Kit−WST(株式会社同仁化学研究所)を使用し、そのプロトコルに従って、テアフラビン類による細胞の膜傷害(膜透過性)を評価した。細胞として、前記RGM1細胞を使用した。培地として、前記DMEM/Ham’s F12培地(ナカライテスク)を使用した。具体的には、上記キットのプロトコルに従って、細胞数の最適化を行い、細胞膜傷害試験を行った。
Claims (5)
- テアフラビン類を有効成分とするレプチン分泌促進剤。
- テアフラビン類の含有量が0.5質量%超30質量%以下である、請求項1に記載のレプチン分泌促進剤。
- 胃におけるレプチンの分泌促進に使用される、請求項1又は2に記載のレプチン分泌促進剤。
- レプチン分泌促進用飲食品である、請求項1〜3のいずれかに記載のレプチン分泌促進剤。
- レプチン分泌促進用医薬品である、請求項1〜3のいずれかに記載のレプチン分泌促進剤。
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