WO2018155686A1 - カテキン化合物を利用したレプチン分泌促進剤 - Google Patents

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leptin secretion
general formula
leptin
hydroxyl group
gallate
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PCT/JP2018/006961
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向井　克之
松山　彰収
貢 赤川
剛志 石井
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株式会社ダイセル
公立大学法人大阪府立大学
学校法人神戸学院
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    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/335—Heterocyclic compounds having oxygen as the only ring hetero atom, e.g. fungichromin
    • A61K31/35—Heterocyclic compounds having oxygen as the only ring hetero atom, e.g. fungichromin having six-membered rings with one oxygen as the only ring hetero atom
    • A61K31/352—Heterocyclic compounds having oxygen as the only ring hetero atom, e.g. fungichromin having six-membered rings with one oxygen as the only ring hetero atom condensed with carbocyclic rings, e.g. methantheline 
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    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00

Definitions

  • the present invention relates to a drug capable of promoting leptin secretion.
  • Obesity is a condition in which fat is excessively accumulated in the body and is considered to be one of the causes of lifestyle-related diseases such as diabetes, heart disease, cerebral infarction, and hypertension. Therefore, preventing and improving obesity also leads to prevention and improvement of these lifestyle-related diseases.
  • Leptin is a hormone secreted by adipocytes, which leads to suppression of feeding and increased energy consumption mainly via receptors in the hypothalamus, and is thought to cause obesity if its action is insufficient. ing. Leptin is known to be secreted from the stomach (Non-Patent Documents 1 and 2). Therefore, prevention or improvement of obesity can be expected by adjusting the secretion or secretion of leptin.
  • Patent Document 1 discloses a leptin production promoter containing capsanthin as an active ingredient.
  • Patent Document 2 discloses a leptin secretion promoter containing gamma-linolenic acid ( ⁇ -linolenic acid) as an active ingredient.
  • JP 2011-51912 A Japanese Patent Laying-Open No. 2015-205846
  • an object of the present invention is to provide a leptin secretion promoter that can easily promote leptin secretion in a living body.
  • a catechin compound having a specific structure that is, a catechin compound represented by the general formula (1) described later
  • the present invention has been completed by further studies based on these findings.
  • R 1 and R 2 are the same or different and are a hydroxyl group, a hydrogen atom, or an alkoxy group having 1 to 5 carbon atoms, and at least one of R 1 and R 2 is a hydroxyl group. is there.
  • R 3 and R 4 are the same or different and are a hydroxyl group, a hydrogen atom, or an alkoxy group having 1 to 5 carbon atoms, and at least one of R 3 and R 4 is a hydroxyl group. .
  • Item 2. Item 2.
  • the leptin secretion promoter according to Item 1 wherein, in the general formula (1), R 1 and R 2 are hydroxyl groups.
  • the catechin compound represented by the general formula (1) is (-)-gallocatechin gallate, (-)-epigallocatechin gallate, (-)-epigallocatechin-3-O- (3 ''-O-methyl) Item 3.
  • the leptin secretion promoter according to Item 1 or 2 which is at least one selected from the group consisting of gallate, ( ⁇ )-epigallocatechin-3′-O-methyl ether gallate, and ( ⁇ )-catechin gallate .
  • Item 4. Item 4.
  • Item 5. The leptin secretion promoter according to any one of Items 1 to 4, which is used to promote leptin secretion in the stomach.
  • Item 6. The leptin secretion promoter according to any one of Items 1 to 5, which is a food and drink for promoting leptin secretion.
  • R 1 and R 2 are the same or different and are a hydroxyl group, a hydrogen atom, or an alkoxy group having 1 to 5 carbon atoms, and at least one of R 1 and R 2 is a hydroxyl group. is there.
  • R 3 and R 4 are the same or different and are a hydroxyl group, a hydrogen atom, or an alkoxy group having 1 to 5 carbon atoms, and at least one of R 3 and R 4 is a hydroxyl group. .
  • a catechin compound represented by the following general formula (1) for use in treatment for promoting leptin secretion [In General Formula (1), R 1 and R 2 are the same or different and are a hydroxyl group, a hydrogen atom, or an alkoxy group having 1 to 5 carbon atoms, and at least one of R 1 and R 2 is a hydroxyl group. is there. In the general formula (1), R 3 and R 4 are the same or different and are a hydroxyl group, a hydrogen atom, or an alkoxy group having 1 to 5 carbon atoms, and at least one of R 3 and R 4 is a hydroxyl group. . ] Item 10. A method for promoting leptin secretion, comprising a step of administering a catechin compound represented by the following general formula (1) to a person who is required to promote leptin secretion.
  • the present invention it is possible to provide a leptin secretion promoter that can easily promote leptin secretion in vivo. Since the leptin secretion promoter of the present invention can be administered or ingested in the form of oral administration and food and drink, it is non-invasive and less burdensome to the patient, and can easily promote leptin secretion in vivo.
  • 10 is a graph showing an experimental result of Experimental Example 1.
  • 10 is a graph showing an experimental result of Experimental Example 2.
  • 10 is a graph showing an experimental result of Experimental Example 3.
  • 10 is a graph showing an experimental result of Experimental Example 4.
  • 10 is a graph showing an experimental result of Experimental Example 5.
  • 10 is a graph showing an experimental result of Experimental Example 6.
  • 10 is a graph showing an experimental result of Experimental Example 7.
  • Leptin secretion promoter The present invention is a leptin secretion promoter containing a catechin compound represented by the general formula (1) as an active ingredient.
  • a catechin compound represented by the general formula (1) as an active ingredient.
  • the leptin secretion promoter of the present invention contains a catechin compound represented by the following general formula (1) as an active ingredient.
  • R 1 and R 2 are the same or different and are a hydroxyl group, a hydrogen atom, or an alkoxy group having 1 to 5 carbon atoms, and at least one of R 1 and R 2 is a hydroxyl group.
  • the alkoxy group having 1 to 5 carbon atoms may be either linear or branched, but is preferably a linear alkoxy group having 1 to 3 carbon atoms, more preferably a methoxy group or an ethoxy group. Particularly preferred is a methoxy group.
  • R 1 and R 2 in the general formula (1) preferably aspect R 1 and R 2 is a hydroxyl group, one hydroxyl group of R 1 and R 2
  • R 3 and R 4 are the same or different and are a hydroxyl group, a hydrogen atom, or an alkoxy group having 1 to 5 carbon atoms, and at least one of R 3 and R 4 is a hydroxyl group.
  • the alkoxy group having 1 to 5 carbon atoms may be either linear or branched, but is preferably a linear alkoxy group having 1 to 3 carbon atoms, more preferably a methoxy group or an ethoxy group. Particularly preferred is a methoxy group.
  • R 3 and R 4 in the general formula (1) is preferably aspect R 3 and R 4 is a hydroxyl group is one hydroxyl group of R 3 and R 4, the other is an alkoxy group having 1 to 5 carbon atoms An embodiment is mentioned.
  • ( ⁇ )-gallocatechin gallate (catechin compound in which R 1 , R 2 , R 3 and R 4 are hydroxyl groups in the general formula (1))
  • ( ⁇ )-Epigallocatechin gallate (catechin compound in which R 1 , R 2 , R 3 , and R 4 are hydroxyl groups in general formula (1)
  • Catechin compound ( ⁇ )-epigallocatechin-3′-O-methyl ether gallate (catechin wherein R 1 is a methoxy group and R 2 , R 3 and R 4 are hydroxyl groups in general formula (1)) Compound), (-)-catechin gallate (general formula)
  • catechin compounds ( ⁇ )-gallocatechin gallate, ( ⁇ )-epigallocatechin gallate, ( ⁇ )-epigallocatechin-3 are preferable from the viewpoint of more effectively promoting leptin secretion.
  • -O- (3 ''-O-methyl) gallate is mentioned.
  • one type of compound may be used alone from among the catechin compounds represented by the general formula (1), or two or more types of compounds may be used in combination.
  • the catechin compound represented by the general formula (1) may be chemically synthesized, or may be extracted or purified from materials derived from natural products such as tea. Moreover, the catechin compound represented by the general formula (1) is commercially available, and a commercially available product may be used.
  • the tea extract may be used as an active ingredient of the leptin secretion promoter of the present invention.
  • Camellia genus for example, C.I. sinensis var. sinensis (including Yabutaki species), C.I. sinensis var. Examples include sencha,nadoha, mochi tea, potted tea, stem tea, stick tea, bud tea, etc., made from tea selected from assamica and hybrids thereof.
  • the tea extract can be obtained from tea by a known extraction means such as kneader extraction or column extraction using a water-soluble organic solvent such as hot water or ethanol.
  • the obtained tea extract may be concentrated or purified by a known method as necessary.
  • the content of the catechin compound represented by the general formula (1) in the leptin secretion promoter of the present invention is not particularly limited and can be appropriately adjusted depending on the use, dosage form, administration form, etc. More than 5% by mass and 30% by mass or less, preferably 1 to 30% by mass, more preferably 3 to 30% by mass, and still more preferably 5 to 30% by mass.
  • the leptin secretion promoter of the present invention contains other additive components in addition to the catechin compound represented by the general formula (1) described above, depending on the dosage form, as long as the effects of the present invention are not impaired. Also good.
  • the additive component that can be contained in the leptin secretion promoter of the present invention include water, fats and oils, waxes, hydrocarbons, fatty acids, higher alcohols, esters, plant extracts, water-soluble polymers, Surfactants, metal soaps, alcohols, polyhydric alcohols, pH adjusters, antioxidants, ultraviolet absorbers, preservatives, fragrances, powders, thickeners, dyes, chelating agents and the like can be mentioned.
  • These additive components may be used alone or in combination of two or more. The contents of these additive components are appropriately set according to the type of additive component used, the dosage form of the leptin secretion promoter of the present invention, and the like.
  • Dosage form / formulation form / use The dosage form of the leptin secretion promoter of the present invention is not particularly limited, and may be any of solid, semi-solid, or liquid. What is necessary is just to set suitably according to a use.
  • the administration method of the leptin secretion promoter of the present invention is not particularly limited, and may be appropriately selected according to the type of disease to be applied, and may be systemic administration or local administration. Specific examples include oral, intravascular (intraarterial or intravenous), transdermal, enteral, pulmonary, and nasal administration. Intravascular administration includes intravascular injection and continuous infusion. Of these, oral administration is preferable because administration is easy.
  • the preparation form of the leptin secretion promoter of the present invention is not particularly limited and can be appropriately set to a preparation form suitable for the administration method.
  • a preparation form suitable for the administration method for example, tablets, capsules, granules, powders, syrups, injections And any preparation form such as drops, suppositories and the like.
  • the administration form of the leptin secretion promoter of the present invention is oral administration, it is not particularly limited as long as oral administration is possible, and specific examples thereof include foods and drinks and drugs for internal use.
  • the secretion promoter of this invention has the preferable form melt
  • the leptin secretion promoter of the present invention may be prepared in a desired form as it is or in combination with other food materials and additive ingredients.
  • foods and drinks include foods for specified health use, dietary supplements, functional foods, foods for the sick, and the like in addition to general foods and drinks.
  • the form of these foods and drinks is not particularly limited, but specifically, supplements such as capsules (soft capsules, hard capsules), tablets, granules, powders, jellies, liposome preparations; energy drinks, fruit juices, carbonic acid
  • beverages such as beverages and lactic acid beverages; luxury items such as dumplings, ice, sherbet, gummy and candy.
  • beverages and supplements are preferable, beverages and capsules are more preferable, beverages and soft capsules are more preferable, and beverages are particularly preferable.
  • the leptin secretion promoter of the present invention When the leptin secretion promoter of the present invention is made into a pharmaceutical preparation for internal use, the leptin secretion promoter of the present invention may be prepared in a desired form as it is or in combination with other additive components.
  • specific examples of such pharmaceuticals for internal use include drinks, capsules (soft capsules, hard capsules), tablets, granules, powders, jellies, syrups, liposome preparations and the like.
  • the active ingredient is preferably dissolved in a liquid form, more preferably a drink, a soft capsule, a syrup, and still more preferably a drink.
  • the content of the catechin compound represented by the general formula (1) as an active ingredient is particularly limited as long as leptin secretion is promoted.
  • it may be set as appropriate according to the form of the preparation, for example, more than 0.5% by mass and 30% by mass or less, preferably 1-30% by mass, more preferably 3-30% by mass, more preferably 5 to 30% by mass.
  • the leptin secretion promoter of the present invention can be applied to diseases whose symptoms are reduced or ameliorated based on the promotion of leptin secretion.
  • leptin mainly leads to hypothalamic receptors through the suppression of feeding and increased energy consumption, so promoting leptin secretion can prevent obesity caused by overfeeding and lack of energy consumption. Conceivable. That is, the leptin secretion promoter of the present invention can be suitably used for obesity prevention applications.
  • the leptin secretion promoter of the present invention can be used for the purpose of expressing or promoting each of the above actions. Furthermore, the leptin secretion promoter of the present invention can be applied for the purpose of prevention or treatment against diseases whose symptoms are reduced or ameliorated by promoting each of the above actions.
  • the diseases whose symptoms are alleviated or ameliorated by promoting each action include, for example, hypertension, diabetes, hyperlipidemia, stroke, myocardial infarction, cerebral infarction, fatty liver, deformation Examples include knee osteoarthritis, cholelithiasis, and fat atrophy.
  • the leptin secretion-promoting agent of the present invention is not particularly limited as long as it promotes the secretion of leptin secreted by adipose tissue, but is preferably used for promoting leptin secretion in the stomach.
  • the intake / dosage of the leptin secretion promoter of the present invention is not particularly limited and may be appropriately set according to the product form, usage, etc.
  • the catechin compound represented by the general formula (1) per day What is necessary is just to set so that it may become about 0.01-100,000 mg.
  • the present invention further provides use of a catechin compound represented by the general formula (1) for production of a leptin secretion promoter.
  • the present invention also provides a leptin secretion promoting method comprising the step of administering the catechin compound represented by the general formula (1) to a person who is required to promote leptin secretion. Specific embodiments of the use and the leptin secretion promoting method are as described in the column of “1. Leptin secretion promoting agent”.
  • Experimental example 1 ⁇ Cell treatment method> Normal rat gastric mucosal epithelial cell line RGM1 cells (RIKEN BioResource Center) were cultured in a 48-well cell culture plate in 10% FBS DMEM / Ham's F12 medium (hereinafter referred to as “medium”). Was 80-90% confluent, the medium was replaced with FBS-free DMEM / Ham's F-12 medium (hereinafter referred to as “serum-free medium”) and cultured overnight. After overnight culture, the serum-free medium was removed, and 200 ⁇ L of serum-free medium was added.
  • medium 10% FBS DMEM / Ham's F12 medium
  • serum-free medium FBS-free DMEM / Ham's F-12 medium
  • a serum-free medium and various polyphenols were mixed to prepare a mixed solution having various polyphenol concentrations of 25 ⁇ M.
  • the medium in the culture plate was removed with an aspirator, quickly adding the mixed solution 200 ⁇ L in culture plates and incubated for 30 minutes at a CO 2 incubator (37 ° C.). Further, 200 ⁇ L of the mixed solution was added to a culture plate not seeded with cells, and incubated for 30 minutes in a CO 2 incubator (37 ° C.).
  • the medium was collected in a 180 ⁇ L eppen, centrifuged at 200 ⁇ g for 3 minutes, and the supernatant was used as a sample. The eppen was stored on ice after collection.
  • EC ⁇ -epicatechin
  • ECC ⁇ -epigallocatechin
  • EGCG ⁇ -epigallocatechin gallate
  • the amount of leptin secreted was measured by the ELISA method shown below.
  • ⁇ ELISA method> The day before the measurement, 100 ⁇ g / mL Capture antibody was diluted 100-fold with PBS, and 100 ⁇ L was added to each well of an ELISA plate (3801-096, IWAKI). Then, the plate was packed in a wrap and incubated overnight at 4 ° C. under light-shielding conditions. The solution was removed, and washing was performed by adding 300 ⁇ L of Wash buffer to each well (4 times). When the last washing was completed, the ELISA plate was lightly struck against Kim Towel (trade name, Nippon Paper Crecia Co., Ltd.) to thoroughly cut the liquid. 300 ⁇ L of Block buffer was added to each well, incubated at 4 ° C.
  • Kim Towel trade name, Nippon Paper Crecia Co., Ltd.
  • Avidin-HRP was diluted by adding 5.5 ⁇ L (1: 2,000) to 11 mL of Diluent, and 100 ⁇ L was added to each well, followed by incubation at 4 ° C. for 30 minutes. Washing was performed 4 times, and the liquid was thoroughly removed. Then, an equal amount of the coloring reagent and the substrate solution of the ELISA POD substrate TMB kit were mixed, and 100 ⁇ L was added to each well and observed. When the color was sufficiently developed, 50 ⁇ L of 1M H 2 SO 4 was added to each well as a reaction terminator, and the absorbance at 450 nm was measured using a microplate reader (Sunrise Remote, manufactured by TECAN).
  • the reagent used above is specifically as follows. Capture activity, Detection activity, Leptin, Avidin-HRP (Leptin, Murine ELISA Development Kit (900-K76) (Peprotech)) Coloring reagent, substrate solution (ELISA POD substrate TMB kit (Popular) (Nacalai Tesque)) Wash buffer (0.05% Tween-20 in PBS) Globulin free bovine serum albumin (globulin free BSA) (EIA / RIA grade) (Nacalai Tesque) Block buffer (1% globulin free BSA in PBS) Diluent (0.05% Tween-20, 0.1% globulin free BSA in PBS) DMEM / Ham's F12 medium (Nacalai Tesque) Penicillin-streptomycin mixed solution (containing penicillin 10,000 u / mL, streptomycin 10,000 ⁇ g / mL) (Nacalai Tesque) Fetal bovine serum (FBS) (Sigma
  • FIG. 1 shows the experimental results.
  • FIG. 1 shows a case where RGM1 cells were treated for 30 minutes with 25 ⁇ M of ( ⁇ )-epicatechin (EC), ( ⁇ )-epigallocatechin (EGC), or ( ⁇ )-epigallocatechin gallate (EGCG). It is the graph which showed the leptin secretion amount of the cell.
  • EC ⁇ -epicatechin
  • EGC ⁇ -epigallocatechin
  • EGCG ⁇ -epigallocatechin gallate
  • FIG. 2 shows ( ⁇ )-epigallocatechin gallate (EGCG), (+)-catechin (C), ( ⁇ )-catechin gallate (CG), (+)-gallocatechin (GC), or ( ⁇ )-gallo It is the graph which showed the leptin secretion amount of the cell at the time of mixing 25 micromol of catechin gallate (GCG)) and processing RGM1 cell for 30 minutes.
  • GCG catechin gallate
  • FIG. 3 shows the experimental results.
  • FIG. 3 shows ( ⁇ )-epigallocatechin gallate (EGCG), ( ⁇ )-epigallocatechin-3′-O-methyl ether gallate (EGCG3′Me), ( ⁇ )-epigallocatechin-4′-O -Methyl ether gallate (EGCG4'Me), (-)-epigallocatechin-3-O- (3 ''-O-methyl) gallate (EGCG3''Me), or (-)-epigallocatechin-3- It is the graph which showed the leptin secretion amount of the cell when 25-M O- (4 ''-O-methyl) gallate (EGCG4''Me) was mixed and the RGM1 cell was processed for 30 minutes.
  • catechin compounds in which R1 and R2 are hydroxyl groups (( ⁇ )-epigallocatechin gallate, ( ⁇ )-catechin gallate, ( ⁇ )-gallocatechin gallate, and ( ⁇ )-epigallo Catechin-3-O- (3 ′′ -O-methyl) gallate) was confirmed to have a significantly high leptin secretion promoting effect.
  • Experimental Example 4 RGM1 was determined by ELISA in the same manner as in Experimental Example 1, except that ( ⁇ )-epigallocatechin gallate (EGCG) was mixed with 0, 5, 10, 25, or 50 ⁇ M as a polyphenol, and RGM1 cells were treated for 30 minutes. The amount of leptin secretion in the cells was measured.
  • EGCG ⁇ -epigallocatechin gallate
  • FIG. 4 is a graph showing the leptin secretion amount of cells when ( ⁇ )-epigallocatechin gallate (EGCG) was mixed with 0, 5, 10, 25 or 50 ⁇ M and the cells were treated for 30 minutes.
  • FIG. 4 shows that the amount of leptin secretion in RGM1 cells increases as the amount of EGCG added increases.
  • Experimental Example 5 The amount of leptin secreted by RGM1 cells by ELISA in the same manner as in Experimental Example 1, except that 10 ⁇ M of ( ⁇ )-epigallocatechin gallate (EGCG) was mixed as a polyphenol and the RGM1 cells were treated for 0 to 60 minutes. Was measured.
  • EGCG ⁇ -epigallocatechin gallate
  • FIG. 5 is a graph showing changes over time in the amount of leptin secretion in cells when 10 ⁇ M of ( ⁇ )-epigallocatechin gallate (EGCG) was mixed as polyphenol and RGM1 cells were treated for 0 to 60 minutes. . From FIG. 6, it was confirmed that the leptin secretion amount of the cells reached the maximum leptin secretion amount within 10 minutes after treatment with EGCG, and thereafter the leptin secretion amount gradually decreased.
  • EGCG ⁇ M of ( ⁇ )-epigallocatechin gallate
  • the cell membrane injury test was performed as follows. That is, normal rat gastric mucosal epithelial cell line RGM1 cells (RIKEN BioResource Center) are cultured in a flat bottom 96-well cell culture plate in 10% FBS DMEM / Ham's F12 medium (hereinafter referred to as “medium”). When the cells became 80-90% confluent, the medium was replaced with FBS-free DMEM / Ham's F12 medium (hereinafter referred to as “serum-free medium”) and cultured overnight. After overnight culture, the serum-free medium was removed, and 100 ⁇ L of serum-free medium was added.
  • medium FBS-free DMEM / Ham's F12 medium
  • FIG. 6 is a graph showing the cytotoxic rate due to the difference in EGCG concentration. From FIG. 6, EGCG has low cytotoxicity, and in the concentration range of 10 ⁇ M to 50 ⁇ M, the cytotoxicity was lower than that of Vehicle (sterile water) treatment. It was confirmed from FIG. 6 that leptin secretion from RGM1 cells stimulated by EGCG was not caused by cell membrane damage.
  • Vehicle sterile water
  • the cytotoxicity test was performed as follows. That is, cells in the logarithmic growth phase were counted to a concentration of 5000 cells / well, and 100 ⁇ L was seeded in each well of a flat bottom 96-well cell culture plate. This was pre-cultured for 24 hours in a CO 2 incubator. Next, 10 ⁇ L of EGCG adjusted with FBS-free DMEM / Ham's F12 medium to a concentration of 0, 5, 10, 25, or 50 ⁇ M was added to each well, and cultured in a CO 2 incubator for 1 hour. The medium was replaced with 10% FBS DMEM / Ham's F12 medium, and then precultured in a CO 2 incubator for 24 hours.
  • FIG. 7 is a graph showing the cell viability (%) with respect to the difference in EGCG concentration. From FIG. 7, the cytotoxicity of EGCG in the concentration range of 5 to 50 ⁇ M was extremely low, and no significant cytotoxicity was observed as compared with cells treated with Vehicle (sterile water).

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Abstract

本発明の目的は、簡便にレプチンの分泌を促進することができるレプチン分泌促進剤を提供することである。　特定の構造のカテキン化合物（即ち、一般式（１）に示すカテキン化合物）が、レプチンの分泌を促進でき、レプチン分泌促進剤の有効成分として使用できる。

Description

カテキン化合物を利用したレプチン分泌促進剤
　本発明は、レプチンの分泌を促進することができる薬剤に関する。
　近年、脂質や糖質の過剰摂取や運動不足等による、肥満の増加が大きな社会問題となっている。肥満は、体内に脂肪が過剰に蓄積された状態であり、糖尿病、心臓病、脳梗塞、高血圧等の生活習慣病を引き起こす原因の一つとされる。そのため、肥満を予防・改善することは、これらの生活習慣病の予防・改善にもつながる。
　一方、レプチンは、脂肪細胞が分泌するホルモンであり、主に視床下部の受容体を介して摂食抑制やエネルギー消費亢進をもたらし、その作用が不十分であると、肥満症を引き起こすと考えられている。また、レプチンは胃から分泌されることが知られている（非特許文献１、２）。そのため、レプチンの分泌又は分泌を調整することにより、肥満の予防・改善を期待することができる。
　レプチンの産生又は分泌を調整する成分としては、これまでに種々知られている。例えば、特許文献１には、カプサンチンを有効成分とするレプチン産生促進剤が開示されている。また、例えば、特許文献２には、ガンマ－リノレン酸（γ－リノレン酸）を有効成分として含有するレプチン分泌促進剤が開示されている。
　しかしながら、エピガロカテキンガレートとレプチンの分泌との関連については、これまで十分には検討されていない。
特開２０１１－５１９１２号公報 特開２０１５－２０５８４６号公報
Andre Badoら、Nature, 1998, Vol.394, pp790-793 Catalina Picoら、British Journal of Nutrition, 2003, vol.90, pp735-741
　本発明は、このような技術背景に鑑みて、簡便に、生体内でのレプチンの分泌を促進することができるレプチン分泌促進剤を提供することを課題とする。
　本発明者等は、前記課題を解決するために鋭意研究を行ったところ、特定の構造のカテキン化合物（即ち、後記する一般式（１）に示すカテキン化合物）が、レプチンの分泌を促進しうることを見出した。本発明は、これらの知見に基づいて更に検討を重ねることにより完成したものである。
　即ち、本発明は、下記に掲げる態様の発明を提供する。
項１．　下記一般式（１）に示すカテキン化合物を有効成分とするレプチン分泌促進剤。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000005
 ［一般式（１）において、Ｒ1及びＲ2は、同一又は異なって、水酸基、水素原子、又は炭素数１～５のアルコキシ基であり、且つ、Ｒ1及びＲ2の少なくとも一方は水酸基である。
　一般式（１）において、Ｒ3及びＲ4は、同一又は異なって、水酸基、水素原子、又は炭素数１～５のアルコキシ基であり、且つ、Ｒ3及びＲ4の少なくとも一方は水酸基である。］
項２．　前記一般式（１）において、Ｒ1及びＲ2が水酸基である、項１に記載のレプチン分泌促進剤。
項３．　前記一般式（１）に示すカテキン化合物が、（－）－ガロカテキンガレート、（－）－エピガロカテキンガレート、（－）－エピガロカテキン－３－Ｏ－（３’’－Ｏ－メチル）ガレート、（－）－エピガロカテキン－３’－Ｏ－メチルエーテルガレート、及び（－）－カテキンガレートよりなる群から選択される少なくとも１種である、項１又は２に記載のレプチン分泌促進剤。
項４．　前記一般式（１）に示すカテキン化合物の含有量が０．５質量％超３０質量％以下である、項１～３のいずれかに記載のレプチン分泌促進剤。
項５．　胃におけるレプチンの分泌促進に使用される、項1～４のいずれかに記載のレプチン分泌促進剤。
項６．　レプチン分泌促進用飲食品である、項１～５のいずれかに記載のレプチン分泌促進剤。
項７．　レプチン分泌促進用医薬品である、項１～５のいずれかに記載のレプチン分泌促進剤。
項８．　下記一般式（１）に示すカテキン化合物のレプチン分泌促進剤の製造のための使用。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000006
 ［一般式（１）において、Ｒ1及びＲ2は、同一又は異なって、水酸基、水素原子、又は炭素数１～５のアルコキシ基であり、且つ、Ｒ1及びＲ2の少なくとも一方は水酸基である。
　一般式（１）において、Ｒ3及びＲ4は、同一又は異なって、水酸基、水素原子、又は炭素数１～５のアルコキシ基であり、且つ、Ｒ3及びＲ4の少なくとも一方は水酸基である。］
項９．　レプチンの分泌促進のための処置に使用される下記一般式（１）に示すカテキン化合物。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000007
 ［一般式（１）において、Ｒ1及びＲ2は、同一又は異なって、水酸基、水素原子、又は炭素数１～５のアルコキシ基であり、且つ、Ｒ1及びＲ2の少なくとも一方は水酸基である。
　一般式（１）において、Ｒ3及びＲ4は、同一又は異なって、水酸基、水素原子、又は炭素数１～５のアルコキシ基であり、且つ、Ｒ3及びＲ4の少なくとも一方は水酸基である。］
項１０．　下記一般式（１）に示すカテキン化合物を、レプチン分泌促進が求められる者に投与する工程を含む、レプチンの分泌促進方法。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000008
　本発明によれば、簡便に生体内でのレプチンの分泌を促進することができる、レプチン分泌促進剤を提供することができる。本発明のレプチン分泌促進剤は、経口投与、飲食品の形態で投与又は摂取できるので、非侵襲的で患者への負担が少なく、容易に生体内でのレプチン分泌を促進することができる。
実験例１の実験結果を表すグラフである。 実験例２の実験結果を表すグラフである。 実験例３の実験結果を表すグラフである。 実験例４の実験結果を表すグラフである。 実験例５の実験結果を表すグラフである。 実験例６の実験結果を表すグラフである。 実験例７の実験結果を表すグラフである。
１．レプチン分泌促進剤
　本発明は、一般式（１）に示すカテキン化合物を有効成分とするレプチン分泌促進剤である。以下、本発明のレプチン分泌促進剤について詳述する。
有効成分
　本発明のレプチン分泌促進剤は、有効成分として下記一般式（１）に示すカテキン化合物を含む。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000009
　一般式（１）において、Ｒ1及びＲ2は、同一又は異なって、水酸基、水素原子、又は炭素数１～５のアルコキシ基であり、且つ、Ｒ1及びＲ2の少なくとも一方は水酸基である。当該炭素数１～５のアルコキシ基としては、直鎖状又は分岐状のいずれであってもよいが、好ましくは炭素数１～３の直鎖状アルコキシ基、更に好ましくは、メトキシ基、エトキシ基、特に好ましくはメトキシ基が挙げられる。
　レプチンの分泌をより一層効果的に促進させるという観点から、一般式（１）におけるＲ1及びＲ2として、好ましくはＲ1及びＲ2が水酸基である態様、Ｒ1及びＲ2の一方が水酸基であり、他方が炭素数１～５のアルコキシ基である態様、Ｒ1及びＲ2の一方が水酸基であり、他方が水素原子である態様；更に好ましくはＲ1及びＲ2が水酸基である態様が挙げられる。
　一般式（１）において、Ｒ3及びＲ4は、同一又は異なって、水酸基、水素原子、又は炭素数１～５のアルコキシ基であり、且つ、Ｒ3及びＲ4の少なくとも一方は水酸基である。当該炭素数１～５のアルコキシ基としては、直鎖状又は分岐状のいずれであってもよいが、好ましくは炭素数１～３の直鎖状アルコキシ基、更に好ましくは、メトキシ基、エトキシ基、特に好ましくはメトキシ基が挙げられる。
　一般式（１）におけるＲ3及びＲ4として、好ましくはＲ3及びＲ4が水酸基である態様、Ｒ3及びＲ4の一方が水酸基であり、他方が炭素数１～５のアルコキシ基である態様が挙げられる。
　一般式（１）に示すカテキン化合物の好適な具体例として、（－）－ガロカテキンガレート（一般式（１）において、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、及びＲ4が水酸基であるカテキン化合物）、（－）－エピガロカテキンガレート（一般式（１）において、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、及びＲ4が水酸基であるカテキン化合物；（－）－ガロカテキンガレートのエピ異性体）、（－）－エピガロカテキン－３－Ｏ－（３’’－Ｏ－メチル）ガレート（一般式（１）において、Ｒ1、Ｒ2、及びＲ4が水酸基であり、Ｒ3がメトキシ基であるカテキン化合物）、（－）－エピガロカテキン－３’－Ｏ－メチルエーテルガレート（一般式（１）において、Ｒ1がメトキシ基であり、Ｒ2、Ｒ3、及びＲ4が水酸基であるカテキン化合物）、（－）－カテキンガレート（一般式（１）において、Ｒ1、Ｒ3、及びＲ4が水酸基であり、Ｒ2が水素原子であるカテキン化合物）が挙げられる。これらのカテキン化合物の中でも、レプチンの分泌をより一層効果的に促進させるという観点から、好ましくは（－）－ガロカテキンガレート、（－）－エピガロカテキンガレート、（－）－エピガロカテキン－３－Ｏ－（３’’－Ｏ－メチル）ガレートが挙げられる。
　本発明のレプチン分泌促進剤では、一般式（１）に示すカテキン化合物の中から、１種の化合物を単独で使用してもよく、２種以上の化合物を組み合わせて使用してもよい。
　一般式（１）に示すカテキン化合物は、化学合成したものであってもよいし、茶等の天然物由来の材料から抽出や精製等したものであってもよい。また、一般式（１）に示すカテキン化合物は、商業的に入手可能であり、市販品を使用してもよい。
　また、一般式（１）に示すカテキン化合物は茶抽出物に含まれるので、本発明のレプチン分泌促進剤の有効成分として茶抽出物を使用してもよい。茶としては、Ｃａｍｅｌｌｉａ属、例えば、Ｃ．ｓｉｎｅｎｓｉｓ　ｖａｒ．ｓｉｎｅｎｓｉｓ（やぶきた種を含む）、Ｃ．ｓｉｎｅｎｓｉｓ　ｖａｒ．ａｓｓａｍｉｃａ及びそれらの雑種から選択される茶から製茶された、煎茶、番茶、碾茶、釜入り茶、茎茶、棒茶、芽茶等が挙げられる。茶抽出物は、茶から熱水又はエタノール等の水溶性有機溶媒を用いてニーダー抽出、カラム抽出等の公知の抽出手段により得ることができる。得られた茶抽出物は、必要に応じて、公知の方法により濃縮又は精製を行ってもよい。
　本発明のレプチン分泌促進剤における一般式（１）に示すカテキン化合物の含有量としては、特に限定されず、用途、剤型、投与形態等に応じて適宜調整することができるが、一般に０．５質量％超３０質量％以下、好ましくは１～３０質量％、より好ましくは３～３０質量％、更に好ましくは５～３０質量％が挙げられる。
添加成分
　本発明のレプチン分泌促進剤は、前述した一般式（１）に示すカテキン化合物以外に、本発明の効果を損なわない範囲で、剤型に応じて、他の添加成分を含有していてもよい。本発明のレプチン分泌促進剤に含有され得る添加成分としては、例えば、水、油脂類、ロウ類、炭化水素類、脂肪酸類、高級アルコール類、エステル類、植物抽出エキス類、水溶性高分子、界面活性剤、金属石鹸、アルコール、多価アルコール、ｐＨ調整剤、酸化防止剤、紫外線吸収剤、防腐剤、香料、粉体、増粘剤、色素、キレート剤等が挙げられる。これらの添加成分は、１種単独で使用してもよく、また２種以上を組み合わせて使用してもよい。また、これらの添加成分の含有量については、使用する添加成分の種類や本発明のレプチン分泌促進剤の剤型等に応じて適宜設定される。
剤型・製剤形態・用途
　本発明のレプチン分泌促進剤の剤型については、特に限定されず、固体状、半固体状、又は液体状のいずれであってもよく、レプチン分泌促進剤の種類や用途に応じて適宜設定すればよい。
　本発明のレプチン分泌促進剤の投与方法としては、特に限定されず、適用する疾患の種類に応じて適宜選択すればよく、全身投与であっても、局所投与であってもよい。具体的には、経口、経血管内（動脈内又は静脈内）、経皮、経腸、経肺、経鼻投与等が挙げられる。経血管内投与には、血管内注射、持続点滴も含まれる。なかでも、投与が容易な点で、経口投与が好ましい。
　本発明のレプチン分泌促進剤の製剤形態については、特に限定されず、投与方法に適した製剤形態に適宜設定することができ、例えば、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、シロップ剤、注射剤、点滴剤、坐剤等の任意の製剤形態を挙げることができる。例えば、本発明のレプチン分泌促進剤の投与形態が経口投与である場合は、経口投与が可能であることを限度として特に制限されないが、具体的には、飲食品及び内服用医薬品が挙げられる。また、本発明の分泌促進剤は液体に溶解した形態が好ましい。
　本発明のレプチン分泌促進剤を飲食品の製剤形態にする場合、本発明のレプチン分泌促進剤を、そのまま又は他の食品素材や添加成分と組み合わせて所望の形態に調製すればよい。このような飲食品としては、一般の飲食品の他、特定保健用食品、栄養補助食品、機能性食品、病者用食品等が挙げられる。これらの飲食品の形態として、特に制限されないが、具体的にはカプセル剤（ソフトカプセル剤、ハードカプセル剤）、錠剤、顆粒剤、粉剤、ゼリー剤、リポソーム製剤等のサプリメント；栄養ドリンク、果汁飲料、炭酸飲料、乳酸飲料等の飲料；団子、アイス、シャーベット、グミ、キャンディー等の嗜好品；等が例示される。これらの飲食品の中でも、好ましくは飲料、サプリメント、より好ましくは飲料、カプセル剤、更に好ましくは飲料、ソフトカプセル剤、特に好ましくは飲料が挙げられる。
　本発明のレプチン分泌促進剤を内服用医薬品の製剤形態にする場合、本発明のレプチン分泌促進剤を、そのまま又は他の添加成分と組み合わせて所望の形態に調製すればよい。このような内服用医薬品としては、具体的には、ドリンク剤、カプセル剤（ソフトカプセル剤、ハードカプセル剤）、錠剤、顆粒剤、粉剤、ゼリー剤、シロップ剤、リポソーム製剤等が挙げられる。これらの内服用の医薬品の中でも、好ましくは有効成分が液体に溶解した形態が挙げられ、より好ましくはドリンク剤、ソフトカプセル剤、シロップ剤、更に好ましくはドリンク剤が挙げられる。
　本発明のレプチン分泌促進剤が飲食品又は内服用医薬品の製剤形態である場合、有効成分である一般式（１）に示すカテキン化合物の含有量としては、レプチンの分泌が促進される限り特に制限されず、製剤形態に応じて適宜設定すればよいが、例えば、０．５質量％超３０質量％以下が挙げられ、好ましくは１～３０質量％、より好ましくは３～３０質量％、より好ましくは５～３０質量％が挙げられる。
　本発明のレプチン分泌促進剤は、レプチンの分泌促進に基づいて、症状が軽減又は改善される疾患に対して適用することができる。例えば、レプチンは、主に視床下部の受容体を介して摂食抑制やエネルギー消費亢進をもたらすので、レプチンの分泌を促進すると、過剰摂食や消費エネルギー不足で起こる肥満を防止することができると考えられる。つまり、本発明のレプチン分泌促進剤は、肥満の予防用途に好適に使用できる。
　レプチンは、食欲抑制、体重減少（肥満抑制）、血液中の脂質量の減少、酸素消費量や活動性の増進、血糖値やインスリン分泌の低下、脂肪組織重量や肝臓重量の減少、動脈血栓の防止、高血圧の低下、胆石の防止等の作用を有している。そのため、本発明のレプチン分泌促進剤は、前記各作用の発現又は促進を目的として使用することができる。更に、本発明のレプチン分泌促進剤は、前記各作用が促進されることで症状が軽減又は改善される疾患に対して予防又は治療目的で適用することができる。前記各作用が促進されることにより症状が軽減又は改善される疾患としては、前記の肥満以外に、例えば、高血圧症、糖尿病、高脂血症、脳卒中、心筋梗塞、脳梗塞、脂肪肝、変形性膝関節症、胆石症、脂肪委縮症等が挙げられる。
　本発明のレプチン分泌促進剤は、脂肪組織が分泌するレプチンの分泌を促進するのであれば、特に制限されないが、なかでも胃におけるレプチンの分泌促進に使用されるのが好ましい。
　本発明のレプチン分泌促進剤の摂取・投与量については、特に制限されず、製品形態、用法等に応じて適宜設定すればよいが、例えば、１日当たり、一般式（１）に示すカテキン化合物が０．０１～１００，０００ｍｇ程度となるように設定すればよい。
２．レプチン分泌促進剤の製造のための使用、及びレプチンの分泌促進方法
　本発明は、更に、一般式（１）に示すカテキン化合物のレプチン分泌促進剤の製造のための使用をも提供する。また、本発明は、一般式（１）に示すカテキン化合物を、レプチン分泌促進が求められる者に投与する工程を含む、レプチンの分泌促進方法をも提供する。当該使用及びレプチンの分泌促進方法における具体的態様については、前記「１．レプチン分泌促進剤の欄に記載の通りである。
　次に、本発明を実施例によりさらに詳細に説明するが、本発明は、これらの例によってなんら限定されるものではない。
実験例１
＜細胞の処理方法＞
　４８ウェル細胞培養プレートに、正常ラット胃粘膜上皮細胞株ＲＧＭ１細胞(理化学研究所バイオリソースセンター)を１０％ＦＢＳ　ＤＭＥＭ／Ｈａｍ’ｓ　Ｆ１２培地（以下、「培地」と表記する。）で培養し、細胞が８０～９０％コンフルエントになったところで、培地をＦＢＳ－ｆｒｅｅ　ＤＭＥＭ／Ｈａｍ’ｓ　Ｆ－１２培地（以下、「無血清培地」と表記する。）に交換し、一晩培養した。一晩培養後に無血清培地を除去し、さらに２００μＬの無血清培地を添加した。
　無血清培地と各種ポリフェノールを混合して、各種ポリフェノールの濃度が２５μＭの混合溶液を調製した。培養プレート中の培地をアスピレーターで除去し、速やかに前記混合溶液２００μＬを培養プレートに添加し、３０分間ＣＯ2インキュベーター内（３７℃）で培養した。また、前記混合溶液２００μＬを、細胞を播種していない培養プレートに添加し、３０分間、ＣＯ2インキュベーター内（３７℃）でインキュベートした。培地を１８０μＬエッペンに回収し、２００×ｇで３分間遠心分離を行い、上清をサンプルとした。なお、回収後はエッペンを氷上で保管した。
　ポリフェノールとして、（－）－エピカテキン（ＥＣ）、（－）－エピガロカテキン（ＥＧＣ）、及び（－）－エピガロカテキンガレート（ＥＧＣＧ）を使用した。
　上記で処理したＲＧＭ１細胞について、下記に示すＥＬＩＳＡ法により、レプチンの分泌量を測定した。
＜ＥＬＩＳＡ法＞
　測定の前日に、１００μｇ／ｍＬのＣａｐｔｕｒｅ　ａｎｔｉｂｏｄｙをＰＢＳで１００倍希釈し、ＥＬＩＳＡプレート（３８０１－０９６、ＩＷＡＫＩ）の各ウェルに１００μＬ加えた。そして、プレートをラップで梱包して４℃、遮光条件下で一晩インキュベートした。溶液を除去し、Ｗａｓｈ　ｂｕｆｆｅｒを各ウェル３００μＬずつ添加して洗浄を行った（４回）。最後の洗浄が終わったら、キムタオル（商品名、日本製紙クレシア株式会社）にＥＬＩＳＡプレートを軽く叩きつけて液をよく切った。各ウェルにＢｌｏｃｋ　ｂｕｆｆｅｒを３００μＬ加え４℃で少なくとも１時間インキュベートし、洗浄を４回行い、液をよく切った。サンプルとレプチンスタンダード（ｌｅｐｔｉｎを無血清培地で０から２．０ｎｇ／ｍＬとなるように希釈）を各ウェルに１００μＬ加え、４℃で少なくとも２時間インキュベートした。洗浄を４回行い、液をよく切った。１００μｇ／ｍＬのＤｅｔｅｃｔｉｏｎ　ａｎｔｉｂｏｄｙをＤｉｌｕｅｎｔで１００倍希釈し、各ウェルに１００μＬ加え、４℃で少なくとも２時間インキュベートした。洗浄を４回行い、液をよく切った。１１ｍＬのＤｉｌｕｅｎｔにＡｖｉｄｉｎ－ＨＲＰを５．５μＬ（１：２，０００）加え希釈し、各ウェルに１００μＬ加え４℃で３０分インキュベートした。洗浄を４回行い、液をよく切った。そして、ＥＬＩＳＡ　ＰＯＤ基質ＴＭＢキットの発色試薬と基質溶液を等量ずつ混合し、各ウェルに１００μＬ添加し観察した。十分発色したら各ウェルに反応停止薬として１ＭのＨ2ＳＯ4を５０μＬ添加し、４５０ｎｍの吸光度を、マイクロプレートリーダー（サンライズリモート、ＴＥＣＡＮ社製）を使用して測定した。
　なお、上記で使用した試薬は、具体的には下記のとおりである。
　Ｃａｐｔｕｒｅ　ａｎｔｉｂｏｄｙ、Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　ａｎｔｉｂｏｄｙ、Ｌｅｐｔｉｎ、Ａｖｉｄｉｎ－ＨＲＰ（Ｌｅｐｔｉｎ，　Ｍｕｒｉｎｅ　ＥＬＩＳＡ　Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ　Ｋｉｔ　（９００－Ｋ７６）（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ））
　発色試薬、基質溶液（ＥＬＩＳＡ　ＰＯＤ基質ＴＭＢキット（Ｐｏｐｕｌａｒ）（ナカライテスク））
　Ｗａｓｈ　ｂｕｆｆｅｒ　（０．０５％Ｔｗｅｅｎ－２０　ｉｎ　ＰＢＳ）
　Ｇｌｏｂｕｌｉｎ　ｆｒｅｅ　ｂｏｖｉｎｅ　ｓｅｒｕｍ　ａｌｂｕｍｉｎ　（ｇｌｏｂｕｌｉｎ　ｆｒｅｅ　ＢＳＡ）（ＥＩＡ／ＲＩＡ　ｇｒａｄｅ）（ナカライテスク）
　Ｂｌｏｃｋ　ｂｕｆｆｅｒ　（１％　ｇｌｏｂｕｌｉｎ　ｆｒｅｅ　ＢＳＡ　ｉｎ　ＰＢＳ）
　Ｄｉｌｕｅｎｔ　（０．０５％Ｔｗｅｅｎ－２０，　０．１％ｇｌｏｂｕｌｉｎ　ｆｒｅｅ　ＢＳＡ　ｉｎ　ＰＢＳ）
　ＤＭＥＭ／Ｈａｍ’ｓ　Ｆ　１２培地　（ナカライテスク）
　ペニシリン－ストレプトマイシン混合溶液　（ペニシリン　１０，０００　ｕ／ｍＬ、ストレプトマイシン　１０，０００μｇ／ｍＬ含有）　（ナカライテスク）
　Ｆｅｔａｌ　ｂｏｖｉｎｅ　ｓｅｒｕｍ　（ＦＢＳ）　（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）
　図１に実験結果を示す。図１は、（－）－エピカテキン（ＥＣ）、（－）－エピガロカテキン（ＥＧＣ）、又は（－）－エピガロカテキンガレート（ＥＧＣＧ）を２５μＭ混合してＲＧＭ１細胞を３０分間処理した場合の細胞のレプチン分泌量を示したグラフである。この結果、ＥＣ、ＥＧＣ、及びＥＧＣＧを添加した場合では、ＲＧＭ１細胞においてレプチンの分泌が認められなかったが、ＥＧＣＧを添加した場合にのみ、ＲＧＭ１細胞においてレプチンの分泌が認められた。
実験例２
　ポリフェノールとして、（－）－エピガロカテキンガレート（ＥＧＣＧ）、（＋）－カテキン（Ｃ）、（－）－カテキンガレート（ＣＧ）、（＋）－ガロカテキン（ＧＣ）、又は（－）－ガロカテキンガレート（ＧＣＧ）を使用したこと以外は、実験例１と同条件でＲＧＭ１細胞におけるレプチンの分泌量を測定した。
　図２に実験結果を示す。図２は、（－）－エピガロカテキンガレート（ＥＧＣＧ）、（＋）－カテキン（Ｃ）、（－）－カテキンガレート（ＣＧ）、（＋）－ガロカテキン（ＧＣ）、又は（－）－ガロカテキンガレート（ＧＣＧ））を２５μＭ混合してＲＧＭ１細胞を３０分間処理した場合の細胞のレプチン分泌量を示したグラフである。この結果、Ｃ及びＧＣを添加した場合では、ＲＧＭ１細胞においてレプチンの分泌が認められなかったが、ＥＧＣＧ、ＣＧ及びＧＣＧを添加した場合にはＲＧＭ１細胞においてレプチンの分泌が認められた。
実験例３
　ポリフェノールとして、（－）－エピガロカテキンガレート（ＥＧＣＧ）、（－）－エピガロカテキン－３’－Ｏ－メチルエーテルガレート（ＥＧＣＧ３’Ｍｅ）、（－）－エピガロカテキン－４’－Ｏ－メチルエーテルガレート（ＥＧＣＧ４’Ｍｅ）、（－）－エピガロカテキン－３－Ｏ－（３’’－Ｏ－メチル）ガレート（ＥＧＣＧ３’’Ｍｅ）、又は（－）－エピガロカテキン－３－Ｏ－（４’’－Ｏ－メチル）ガレート（ＥＧＣＧ４’’Ｍｅ）を使用したこと以外は、実験例１と同条件でＲＧＭ１細胞におけるレプチンの分泌量を測定した。
　図３に実験結果を示す。図３は、（－）－エピガロカテキンガレート（ＥＧＣＧ）、（－）－エピガロカテキン－３’－Ｏ－メチルエーテルガレート（ＥＧＣＧ３’Ｍｅ）、（－）－エピガロカテキン－４’－Ｏ－メチルエーテルガレート（ＥＧＣＧ４’Ｍｅ）、（－）－エピガロカテキン－３－Ｏ－（３’’－Ｏ－メチル）ガレート（ＥＧＣＧ３’’Ｍｅ）、又は（－）－エピガロカテキン－３－Ｏ－（４’’－Ｏ－メチル）ガレート（ＥＧＣＧ４’’Ｍｅ）を２５μＭ混合してＲＧＭ１細胞を３０分間処理した場合の細胞のレプチン分泌量を示したグラフである。この結果、ＥＧＣＧ４’Ｍｅ及びＥＧＣＧ４’’Ｍｅを添加した場合では、ＲＧＭ１細胞においてレプチンの分泌が認められなかったが、ＥＧＣＧ、ＥＧＣＧ３’Ｍｅ及びＥＧＣＧ３’’Ｍｅを添加した場合にはＲＧＭ１細胞においてレプチンの分泌が認められた。
実験例１～３のまとめ
　実験例１～３において、レプチンの分泌が認められたカテキン化合物、及びレプチンの分泌が認められなかった化合物を以下に纏めた。実験例１～３の結果から、一般式（１）を満たすカテキン化合物であれば、レプチンの分泌を促進できることが明らかとなった。特に、一般式（１）において、Ｒ１及びＲ２が水酸基であるカテキン化合物（（－）－エピガロカテキンガレート、（－）－カテキンガレート、（－）－ガロカテキンガレート、及び（－）－エピガロカテキン－３－Ｏ－（３’’－Ｏ－メチル）ガレート）では、レプチンの分泌促進効果が顕著に高いことが確認された。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000010
実験例４
　ポリフェノールとして、（－）－エピガロカテキンガレート（ＥＧＣＧ）を０、５、１０、２５又は５０μＭ混合してＲＧＭ１細胞を３０分間処理したこと以外は、実験例１と同様にして、ＥＬＩＳＡ法によりＲＧＭ１細胞におけるレプチンの分泌量を測定した。
　図４に実験結果を示す。図４は、（－）－エピガロカテキンガレート（ＥＧＣＧ）を０、５、１０、２５又は５０μＭ混合して細胞を３０分間処理した場合の細胞のレプチン分泌量を示したグラフである。図４から、ＥＧＣＧの添加量が増大する程、ＲＧＭ１細胞におけるレプチン分泌量は増大することが認められた。
実験例５
　ポリフェノールとして、（－）－エピガロカテキンガレート（ＥＧＣＧ）を１０μＭ混合してＲＧＭ１細胞を０～６０分間処理したこと以外は、実験例１と同様にして、ＥＬＩＳＡ法によりＲＧＭ１細胞におけるレプチンの分泌量を測定した。
　図５に実験結果を示す。図５は、ポリフェノールとして、（－）－エピガロカテキンガレート（ＥＧＣＧ）を１０μＭ混合して、ＲＧＭ１細胞を０～６０分間処理した場合の細胞のレプチン分泌量の経時的変化を示したグラフである。図６から、細胞のレプチン分泌量は、ＥＧＣＧで処理して１０分以内にレプチン分泌量が最大になり、その後レプチン分泌量が徐々に減少することが確認された。
実験例６
　Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ　ＬＤＨ　Ａｓｓａｙ　Ｋｉｔ－ＷＳＴ（株式会社同仁化学研究所）を使用し、そのプロトコルに従って、ＥＧＣＧによる細胞の膜傷害（膜透過性）を評価した。細胞として、前記ＲＧＭ１細胞を使用した。培地として、前記ＤＭＥＭ／Ｈａｍ’ｓ　Ｆ１２培地（ナカライテスク）を使用した。具体的には、上記キットのプロトコルに従って、細胞数の最適化を行い、細胞膜傷害試験を行った。
　細胞膜傷害試験は、具体的には、下記のとおりに行った。すなわち、平底９６ウェル細胞培養プレートに、正常ラット胃粘膜上皮細胞株ＲＧＭ１細胞(理化学研究所バイオリソースセンター)を１０％ＦＢＳ　ＤＭＥＭ／Ｈａｍ’ｓ　Ｆ１２培地（以下、「培地」と表記する。）で培養し、細胞が８０～９０％コンフルエントになったところで、培地をＦＢＳ－ｆｒｅｅ　ＤＭＥＭ／Ｈａｍ’ｓ　Ｆ１２培地（以下、「無血清培地」と表記する。）に交換し、一晩培養した。一晩培養後に無血清培地を除去し、さらに１００μＬの無血清培地を添加した。無血清培地で０、５、１０、２５、又は５０μＭの濃度に調製したＥＧＣＧ溶液１００μＬを前記細胞懸濁液に添加し、３７℃で６０分間、ＣＯ2インキュベーション内でインキュベーションした。次いで、高コントロールウェルに無血清培地９０μＬとＬｙｓｉｓ　Ｂｕｆｆｅｒ　１０μＬを加え、３７℃、３０分間ＣＯ2インキュベーター内でインキュベーションした。各ウェルにＷｏｒｋｉｎｇ　Ｓｏｌｕｔｉｏｎ　１００μＬを加え、遮光下、室温で３０分間呈色反応を行った。そして、全てのウェルにＳｔｏｐ　Ｓｏｌｕｔｉｏｎ　５０μＬを加え、プレートリーダーを用いて４９０ｎｍの吸光度を測定した。ＥＧＣＧと各コントロールの吸光度からバックグランドコントロールの吸光度を引いた値を用いて細胞傷害率（％）を算出した（３重測定の平均値）。Ｌｙｓｉｓ　Ｂｕｆｆｅｒを添加した高コントロールウェルの値を１００％とした。
　図６に実験結果を示す。図６は、ＥＧＣＧの濃度の違いによる細胞傷害率を示すグラフである。図６から、ＥＧＣＧは細胞傷害性が低く、１０μＭ～５０μＭの濃度範囲では、Ｖｅｈｉｃｌｅ（滅菌水）処理より低い細胞傷害性であった。図６よりＥＧＣＧが刺激するＲＧＭ１細胞からのレプチンの分泌は、細胞膜障害に起因しないことが確認された。
実験例７
　Ｃｅｌｌ　Ｃｏｕｎｔ　Ｒｅａｇｅｎｔ　ＳＦ（ナカライテスク）のキットを使用して、そのプロトコルに従って、ＥＧＣＧによる細胞毒性を評価した。細胞として、前記ＲＧＭ１細胞を使用した。培地として、前記ＤＭＥＭ／Ｈａｍ’ｓ　Ｆ１２培地（ナカライテスク）を使用した。具体的には、上記キットのプロトコルに従って、細胞増殖アッセイを行い、細胞毒性試験を行った。
　細胞毒性試験は、具体的には、下記のとおりに行った。すなわち、対数増殖期にある細胞を５０００ｃｅｌｌ／ｗｅｌｌの濃度になるよう計数し、平底９６ウェル細胞培養プレートの各ウェルに１００μＬずつ播いた。これをＣＯ2インキュベーター内で２４時間前培養した。次いで、０、５、１０、２５又は５０μＭの濃度となるようＦＢＳ－ｆｒｅｅ　ＤＭＥＭ／Ｈａｍ’ｓ　Ｆ１２培地で調整したＥＧＣＧを各ウェルに１０μＬずつ添加し、ＣＯ2インキュベーターで１時間培養した。培地を１０％ＦＢＳ　ＤＭＥＭ／Ｈａｍ’ｓ　Ｆ１２培地に交換後にＣＯ2インキュベーター内で２４時間前培養した。そして、上記キットの試薬を各ウェルに１０μＬずつ添加し、ＣＯ2インキュベーター内で１～４時間呈色反応を行った後、マイクロプレートリーダー（製品名サンライズリモート、ＴＥＣＡＮ社製）を用い、４５０ｎｍの吸光度を測定し、細胞生存率（％）を測定した（５重測定の平均値）。得られたデータについて、Ｄｕｎｎｅｔｔ検定を行った。
　図７に実験結果を示す。図７は、ＥＧＣＧの濃度の違いに対する細胞生存率（％）を示すグラフである。図７から、５～５０μＭの濃度範囲におけるＥＧＣＧの細胞毒性は極めて低く、Ｖｅｈｉｃｌｅ（滅菌水）処理細胞と比較して有意な細胞毒性は認められなかった。
　以上の実験例６及び７の結果から、ＥＧＣＧは、５０μＭの濃度まで胃粘膜上皮細胞に対して細胞障害性を示さないことが確認された。

Claims (10)

  1. 　下記一般式（１）に示すカテキン化合物を有効成分とするレプチン分泌促進剤。
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000001
     ［一般式（１）において、Ｒ1及びＲ2は、同一又は異なって、水酸基、水素原子、又は炭素数１～５のアルコキシ基であり、且つ、Ｒ1及びＲ2の少なくとも一方は水酸基である。
    　一般式（１）において、Ｒ3及びＲ4は、同一又は異なって、水酸基、水素原子、又は炭素数１～５のアルコキシ基であり、且つ、Ｒ3及びＲ4の少なくとも一方は水酸基である。］
  2. 　前記一般式（１）において、Ｒ1及びＲ2が水酸基である、請求項１に記載のレプチン分泌促進剤。
  3. 　前記一般式（１）に示すカテキン化合物が、（－）－ガロカテキンガレート、（－）－エピガロカテキンガレート、（－）－エピガロカテキン－３－Ｏ－（３’’－Ｏ－メチル）ガレート、（－）－エピガロカテキン－３’－Ｏ－メチルエーテルガレート、及び（－）－カテキンガレートよりなる群から選択される少なくとも１種である、請求項１又は２に記載のレプチン分泌促進剤。
  4. 　前記一般式（１）に示すカテキン化合物の含有量が０．５質量％超３０質量％以下である、請求項１～３のいずれかに記載のレプチン分泌促進剤。
  5. 　胃におけるレプチンの分泌促進に使用される、請求項1～４のいずれかに記載のレプチン分泌促進剤。
  6. 　レプチン分泌促進用飲食品である、請求項１～５のいずれかに記載のレプチン分泌促進剤。
  7. 　レプチン分泌促進用医薬品である、請求項１～５のいずれかに記載のレプチン分泌促進剤。
  8. 　下記一般式（１）に示すカテキン化合物のレプチン分泌促進剤の製造のための使用。
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000002
     ［一般式（１）において、Ｒ1及びＲ2は、同一又は異なって、水酸基、水素原子、又は炭素数１～５のアルコキシ基であり、且つ、Ｒ1及びＲ2の少なくとも一方は水酸基である。
    　一般式（１）において、Ｒ3及びＲ4は、同一又は異なって、水酸基、水素原子、又は炭素数１～５のアルコキシ基であり、且つ、Ｒ3及びＲ4の少なくとも一方は水酸基である。］
  9. 　レプチンの分泌促進のための処置に使用される下記一般式（１）に示すカテキン化合物。
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000003
     ［一般式（１）において、Ｒ1及びＲ2は、同一又は異なって、水酸基、水素原子、又は炭素数１～５のアルコキシ基であり、且つ、Ｒ1及びＲ2の少なくとも一方は水酸基である。
    　一般式（１）において、Ｒ3及びＲ4は、同一又は異なって、水酸基、水素原子、又は炭素数１～５のアルコキシ基であり、且つ、Ｒ3及びＲ4の少なくとも一方は水酸基である。］
  10. 　下記一般式（１）に示すカテキン化合物を、レプチン分泌促進が求められる者に投与する工程を含む、レプチンの分泌促進方法。
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000004
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