JP2018134085A - 改良された脂肪酸誘導体産生方法 - Google Patents
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Abstract
Description
本出願は、その全体が参照により本明細書に組み入れられる、2012年4月2日に提出された米国仮出願第61/619,324号の恩典を主張する。
本出願は、その全体が参照により本明細書に組み入れられる、EFS-Webを介してASCII形式で提出されている配列表を含む。2013年4月2日に作成されたASCIIコピーの名称はLS00042PCT_SL.txtであり、サイズは143,098バイトである。
本開示は、脂肪酸誘導体の力価、収量および/または産生能を改良するために有効な系統改変を含む組換え宿主細胞に関する。本開示はさらに、脂肪酸誘導体およびそれらの組成物の発酵産生のための組換え宿主細胞を含む細胞培養物にも関する。
脂肪アルデヒド、脂肪アルコール、炭化水素(アルカンおよびオレフィン)、脂肪エステル(例えば、蝋、脂肪酸エステル、または脂肪エステル)およびケトンを含む脂肪酸誘導体は、産業用化学品および燃料の重要なカテゴリーを成している。これらの分子およびそれらの誘導体は、界面活性剤、潤滑剤、可塑剤、溶媒、乳化剤、軟化剤、増粘剤、香味剤、芳香剤および燃料としての利用を非限定的に含む、数多くの用途がある。原油は現在、石油化学品および燃料を産生するための主な原料源となっている。石油に由来する原料には、短鎖オレフィン(例えば、エチレンおよびプロピレン)および芳香族化合物(例えば、ベンゼン異性体およびキシレン異性体)という2つの主要クラスがある。これらの原料は、原油中の長鎖炭化水素から、触媒分解、水蒸気分解または接触改質などの種々の方法を用いて、かなりの費用をかけてそれを分解することによって導き出される。これらの原料は、原油から直接精製することができない石油化学品、例えばモノマー、溶媒、洗剤および接着剤などを製造するために用いることができる。次に、これらの石油化学品を用いて、プラスチック、樹脂、繊維素材、エラストマー、医薬品、潤滑剤、ゲルなどの特殊化学品を製造することができる。石油化学原料から産生することができる具体的な特殊化学品には、脂肪酸、炭化水素、脂肪アルデヒド、脂肪アルコール、エステルおよびケトンが非限定的に含まれる。
本開示の1つの局面は、遺伝子操作されたポリヌクレオチド配列を有する組換え宿主細胞であって、ポリヌクレオチド配列が特異的酵素活性を有する1つまたは複数のポリペプチドをコードする、組換え宿主細胞を提供する。ポリヌクレオチド配列は宿主細胞にとって外因性または内因性である。したがって、本開示は、3-ヒドロキシデカノイル-[acp]デヒドラターゼ(E.C. 4.2.1.60)活性;β-ケトアシル-ACPシンターゼI(E.C. 2.3.1.41)活性;β-ケトアシル-ACPシンターゼII(E.C. 2.3.1.179)活性;[acp]S-マロニルトランスフェラーゼ{マロニル-CoA-ACPトランスアシラーゼ}(E.C. 2.3.1.39)活性;3-オキソアシル-{β-ケトアシル}-ACPレダクターゼ(E.C. 1.1.1.100)活性;β-ケトアシル-ACPシンターゼIII(E.C. 2.3.1.180)活性;エノイル-ACPレダクターゼ(NADH)(E.C. 1.3.1.9)活性;エノイル-ACPレダクターゼ(NADPH)(E.C. 1.3.1.10)活性;3-ヒドロキシ-アシル-[acp]デヒドラターゼ(E.C. 4.2.1.59)活性;およびtrans-2,cis-3-デセノイル-ACPイソメラーゼ(E.C. 5.3.3.14)活性を非限定的に含む群から選択される活性を有する1つまたは複数のポリペプチドをコードする遺伝子操作されたポリヌクレオチド配列を有する組換え宿主細胞であって、炭素源を含有する培地中で、ポリヌクレオチドを発現するのに有効な条件下で培養された場合に、対応する野生型宿主細胞よりも高い力価、収量または産生能で脂肪酸誘導体組成物を産生する、組換え宿主細胞を提供する。関連した1つの局面において、組換え宿主細胞は、ポリペプチドが酵素活性を有する少なくとも1つの他のポリペプチドと組み合わせて発現された場合に、脂肪酸誘導体組成物をより高い力価、収量および/または産生能で産生する。もう1つの局面において、組換え宿主細胞は、ポリペプチドが酵素活性を有する少なくとも5種の他のポリペプチドと組み合わせて発現された場合に、脂肪酸誘導体組成物をより高い力価、収量または産生能で産生する。さらにもう1つの局面において、組換え宿主細胞は、酵素活性を有する少なくとも2種または3種または4種または5種または6種またはそれ以上のポリペプチドと組み合わせて発現された時に、脂肪酸誘導体組成物をより高い力価、収量または産生能で産生する。もう1つの関連した局面において、組換え宿主細胞は、アシルキャリアータンパク質(ACP)であるポリペプチドをさらにコードする、1つまたは複数の遺伝子操作されたポリヌクレオチド配列を含む。ACPは、何らかの酵素活性をコードする1つまたは複数のポリペプチドと組み合わせて発現させることができ、ここでACPは、適切な条件下で培養された場合に、組換え宿主細胞の力価、収量および/または産生能をさらに高める。さらにもう1つの関連した局面において、遺伝子操作されたポリヌクレオチド配列は、accABCD活性(E.C. 6.4.1.2)を有するポリペプチドをさらにコードする。accABCDは、何らかの酵素活性をコードする1つまたは複数のポリペプチドと組み合わせて発現させることができ、ここでaccABCDは、適切な条件下で培養された場合に、組換え宿主細胞の力価、収量および/または産生能をさらに高める。
[本発明1001]
3-ヒドロキシデカノイル-[acp]デヒドラターゼ(E.C. 4.2.1.60)活性;β-ケトアシル-ACPシンターゼI(E.C. 2.3.1.41)活性;β-ケトアシル-ACPシンターゼII(E.C. 2.3.1.179)活性;[acp]S-マロニルトランスフェラーゼ{マロニル-CoA-ACPトランスアシラーゼ}(E.C. 2.3.1.39)活性;3-オキソアシル-{β-ケトアシル}-ACPレダクターゼ(E.C. 1.1.1.100)活性;β-ケトアシル-ACPシンターゼIII(E.C. 2.3.1.180)活性;エノイル-ACPレダクターゼ(NADH)(E.C. 1.3.1.9)活性;エノイル-ACPレダクターゼ(NADPH)(E.C. 1.3.1.10)活性;3-ヒドロキシ-アシル-[acp]デヒドラターゼ(E.C. 4.2.1.59)活性;およびtrans-2,cis-3-デセノイル-ACPイソメラーゼ(E.C. 5.3.3.14)活性からなる群より選択される活性を有する1つまたは複数のポリペプチドをコードする遺伝子操作されたポリヌクレオチド配列を含む組換え宿主細胞であって、炭素源を含有する培地中で、該ポリヌクレオチドを発現するのに有効な条件下で培養された場合に、対応する野生型宿主細胞よりも高い力価、収量または産生能で脂肪酸誘導体組成物を産生する、組換え宿主細胞。
[本発明1002]
前記ポリペプチドが前記活性を有する少なくとも1つの他のポリペプチドと組み合わせて発現された場合に、脂肪酸誘導体組成物をより高い力価、収量または産生能で産生する、本発明1001の組換え宿主細胞。
[本発明1003]
前記ポリペプチドが前記活性を有する少なくとも5種の他のポリペプチドと組み合わせて発現された場合に、脂肪酸誘導体組成物をより高い力価、収量または産生能で産生する、本発明1001の組換え宿主細胞。
[本発明1004]
trans-2,cis-3-デセノイル-ACPイソメラーゼ活性がfabAまたはfabMである、本発明1001の組換え宿主細胞。
[本発明1005]
β-ケトアシル-ACPシンターゼIIがfabFである、本発明1001の組換え宿主細胞。
[本発明1006]
マロニル-CoA-ACPトランスアシラーゼがfabDである、本発明1001の組換え宿主細胞。
[本発明1007]
β-ケトアシル-ACPシンターゼIがfabFまたはfabBである、本発明1001の組換え宿主細胞。
[本発明1008]
β-ケトアシル-ACPレダクターゼがfabGである、本発明1001の組換え宿主細胞。
[本発明1009]
β-ケトアシル-ACPシンターゼIIIがfabHである、本発明1001の組換え宿主細胞。
[本発明1010]
エノイル-ACPレダクターゼがfabIまたはfabLまたはfabVまたはfabKである、本発明1001の組換え宿主細胞。
[本発明1011]
3-ヒドロキシ-アシル-[acp]デヒドラターゼがfabAまたはfabZである、本発明1001の組換え宿主細胞。
[本発明1012]
trans-2-エノイル-ACPレダクターゼIIがfabKである、本発明1001の組換え宿主細胞。
[本発明1013]
前記ポリペプチドが、fabA、fabB、fabD、fabF、fabG、fabH、fabI、fabL、fabV、fabZ、fabM、およびfabKからなる群より選択される、本発明1001の組換え宿主細胞。
[本発明1014]
前記ポリペプチドが、ネズミチフス菌(Salmonella typhimurium)由来のFabA(NP_460041);大腸菌(Escherichia coli)由来のFabB(NP_416826);ネズミチフス菌由来のFabD(NP_460164);ネズミチフス菌由来のFabG(NP_460165);ネズミチフス菌由来のFabH(NP_460163);ネズミチフス菌由来のFabZ(NP_459232);ストレプトコッカス・ミュータンス(Streptococcus mutans)由来のFabM(AAN59379);肺炎球菌(Streptococcus pneumoniae)由来のFabK(AAF98273);コレラ菌(Vibrio cholera)由来のFabV(YP_001217283);クロストリジウム・アセトブチリカム(Clostridium acetobutylicum)由来のFabF(NP_350156);枯草菌亜種サブチリス168株(Bacillus subtillis subsp. subtilis str. 168)由来のFabI(NP_389054);枯草菌亜種サブチリス168株由来のFabL(NP_388745);アシネトバクター属種ADP1(Acinetobacter sp. ADP1)由来のFabI(YP_047630);マリノバクター・アクアエオレイVT8(Marinobacter aquaeoli VT8)由来のFabI(YP_958813);ロドコッカス・オパクスB4(Rhodococcus opacus B4)由来のFabI(YP_002784194);アシネトバクター属種ADP1由来のFabH(YP_046731);マリノバクター・アクアエオレイVT8由来のFabH(YP_958649);およびロドコッカス・オパクスB4由来のFabH(YP_00278448)からなる群より選択される、本発明1001の組換え宿主細胞。
[本発明1015]
前記遺伝子操作されたポリヌクレオチド配列によってコードされる前記ポリペプチドが外来性である、本発明1001の組換え宿主細胞。
[本発明1016]
アシルキャリアータンパク質(ACP)をコードする遺伝子操作されたポリヌクレオチド配列をさらに含む、本発明1001の組換え宿主細胞。
[本発明1017]
ACPが前記力価、収量または産生能をさらに増大させる、本発明1016の組換え宿主細胞。
[本発明1018]
ACPポリペプチドをコードする遺伝子操作されたポリヌクレオチド配列を含む組換え宿主細胞であって、炭素源を含有する培地中で、該ACPポリペプチドを発現するのに有効な条件下で培養された場合に、対応する野生型宿主細胞よりも高い力価、収量または産生能で脂肪酸誘導体組成物を産生する、組換え宿主細胞。
[本発明1019]
ホスホパンテテイニルトランスフェラーゼ(E.C. 2.7.8.7)活性を有するポリペプチドをコードする組換えポリヌクレオチドをさらに含む、本発明1018の組換え宿主細胞。
[本発明1020]
前記ポリヌクレオチドがsfp遺伝子をコードする、本発明1019の組換え宿主細胞。
[本発明1021]
accABCD活性(E.C. 6.4.1.2)を有するポリペプチドをコードする組換えポリヌクレオチドをさらに含む、本発明1001または1018の組換え宿主細胞。
[本発明1022]
ACPが、前記組換え宿主細胞において発現される末端経路酵素(terminal pathway enzyme)と同じ生物に由来する、本発明1001または1018の組換え宿主細胞。
[本発明1023]
ACPが外来性である、本発明1018の組換え宿主細胞。
[本発明1024]
トランスポゾンを含む遺伝子操作されたポリヌクレオチド配列を含む組換え宿主細胞であって、yijP遺伝子への該トランスポゾンの挿入が、該yijP遺伝子に隣接する第2の遺伝子に影響を及ぼし、該第2の遺伝子が、アップレギュレートまたはダウンレギュレートされるポリヌクレオチドをコードし、かつ、該アップレギュレートまたはダウンレギュレートされるポリヌクレオチドが、炭素源を含有する培地中で、該ポリペプチドを発現させるのに有効な条件下で該宿主細胞を培養した場合に、脂肪酸誘導体組成物の産生に影響を及ぼすポリペプチドをコードする、組換え宿主細胞。
[本発明1025]
yijP遺伝子への前記トランスポゾンの挿入が前記yijP遺伝子またはそのポリヌクレオチドの不活性化をもたらし、これにより該yijP遺伝子に隣接する第2の遺伝子が影響を受け、該第2の遺伝子が、炭素源を含有する培地中で、該ポリペプチドを発現させるのに有効な条件下で前記宿主細胞を培養した場合に、脂肪酸誘導体組成物の産生に影響を及ぼすポリペプチドをコードする、本発明1024の組換え宿主細胞。
[本発明1026]
第2の遺伝子またはそのポリヌクレオチドが、ppc、yijO、frwD、pflC、pflDまたはargEからなる群より選択される、本発明1024の組換え宿主細胞。
[本発明1027]
ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ(ppc)ポリペプチドをコードする遺伝子操作されたポリヌクレオチド配列を含む組換え宿主細胞であって、炭素源を含有する培地中で、該ppcポリペプチドを発現するのに有効な条件下で培養された場合に、対応する野生型宿主細胞よりも高い力価、収量または産生能で脂肪酸誘導体組成物を産生する、組換え宿主細胞。
[本発明1028]
本発明1001〜1027のいずれかの組換え宿主細胞を含む、細胞培養物。
[本発明1029]
前記培地が脂肪酸誘導体組成物を含む、本発明1028の細胞培養物。
[本発明1030]
前記脂肪酸誘導体組成物が、脂肪酸、脂肪エステル、脂肪アルコール、脂肪アルデヒド、アルカン、末端オレフィン、内部オレフィン、およびケトンからなる群より選択される少なくとも1つの脂肪酸誘導体を含む、本発明1029の細胞培養物。
[本発明1031]
前記脂肪酸誘導体が、C6、C8、C10、C12、C13、C14、C15、C16、C17、またはC18脂肪酸誘導体である、本発明1028の細胞培養物。
[本発明1032]
前記脂肪酸誘導体が、C10:1、C12:1、C14:1、C16:1、またはC18:1不飽和脂肪酸誘導体である、本発明1028の細胞培養物。
[本発明1033]
前記脂肪酸誘導体組成物が、C8、C10、C12、C14、C16および、C18脂肪酸誘導体のうち1つまたは複数を含む、本発明1029の細胞培養物。
[本発明1034]
前記脂肪酸誘導体組成物が脂肪酸を含む、本発明1029の細胞培養物。
[本発明1035]
前記脂肪酸誘導体組成物が脂肪アルデヒドを含む、本発明1029の細胞培養物。
[本発明1036]
前記脂肪酸誘導体組成物が脂肪アルコールを含む、本発明1029の細胞培養物。
[本発明1037]
前記脂肪酸誘導体組成物が脂肪エステルを含む、本発明1029の細胞培養物。
[本発明1038]
前記脂肪酸誘導体組成物がアルカンを含む、本発明1029の細胞培養物。
[本発明1039]
前記脂肪酸誘導体組成物が末端オレフィンを含む、本発明1029の細胞培養物。
[本発明1040]
前記脂肪酸誘導体組成物が内部オレフィンを含む、本発明1029の細胞培養物。
[本発明1041]
前記脂肪酸誘導体組成物がケトンを含む、本発明1029の細胞培養物。
[本発明1042]
前記脂肪酸誘導体組成物が、前記脂肪アルコールの還元末端からC7〜C8の間の炭素鎖における7番目の位置に二重結合を有する脂肪酸誘導体を含む、本発明1029の細胞培養物。
[本発明1043]
前記脂肪酸誘導体組成物が不飽和脂肪酸誘導体を含む、本発明1029の細胞培養物。
[本発明1044]
前記脂肪酸誘導体組成物が飽和脂肪酸誘導体を含む、本発明1029の細胞培養物。
[本発明1045]
前記脂肪酸誘導体組成物が分枝鎖脂肪酸誘導体を含む、本発明1029の細胞培養物。
[本発明1046]
前記組換え宿主細胞が、該組換え宿主細胞と同じ条件下で培養された場合の対応する野生型宿主細胞の力価よりも少なくとも約5%高い力価を有する、本発明1028の細胞培養物。
[本発明1047]
前記組換え宿主細胞が約1g/L〜約250g/Lの力価を有する、本発明1046の細胞培養物。
[本発明1048]
前記組換え宿主細胞が約90g/L〜約120g/Lの力価を有する、本発明1047の細胞培養物。
[本発明1049]
前記組換え宿主細胞が少なくとも約10%〜約40%の収量を有する、本発明1028の細胞培養物。
[本発明1050]
約25%の収量を有する、本発明1049の組換え宿主細胞。
[本発明1051]
産生能が約0.7mg/L/hr〜約3g/L/hrの範囲にわたる、本発明1028の細胞培養物。
全体的概観
本開示は、少なくとも一部には、組換え宿主細胞における脂肪酸生合成経路のさまざまな局面の改変により、宿主細胞による脂肪酸誘導体の産生強化が促進されるという発見に基づく。本開示は、所望の特性を有する脂肪酸誘導体の組成物、およびそれを産生するための方法に関する。さらに、本開示は、組換え宿主細胞(例えば、微生物)、組換え宿主細胞の培養物、組換え宿主細胞の作製および使用の方法、例えば、所望の特性を有する脂肪酸誘導体の発酵産生における培養組換え宿主細胞の使用にも関する。
本明細書および添付の特許請求の範囲において用いる場合、単数形の「1つの(a)」、「1つの(an)」および「その(the)」は、文脈によって明らかに別様に規定されている場合を除き、複数形の指示物も含む。したがって、例えば、「1つの組換え宿主細胞」への言及は2つまたはそれ以上のそのような組換え宿主細胞を含み、「1つの脂肪アルコール」への言及は1つもしくは複数の脂肪アルコール、または脂肪アルコールの混合物への言及を含み、「1つの核酸コード配列」への言及は1つまたは複数の核酸コード配列を含み、「1つの酵素」への言及は1つまたは複数の酵素を含み、他についても同様である。
脂肪酸誘導体の高い力価、収量および/または産生能を引き起こすために、産生宿主細胞にいくつかの改変を加えた。FadRは、脂肪酸分解経路および脂肪酸生合成経路に関与する重要な調節因子である(Cronan et al., Mol Microbiol, 29(4): 937-943 (1998))。大腸菌のACS酵素FadDおよび脂肪酸輸送タンパク質FadLは、脂肪酸取り込み系の構成成分である。FadLは細菌細胞内への脂肪酸の輸送を媒介し、FadDはアシル-CoAエステルの形成を媒介する。他の炭素源が利用できない場合には、外来性の脂肪酸が細菌によって取り込まれてアシル-CoAエステルに変換され、これは、転写因子FadRと結合して、脂肪酸の輸送(FadL)、活性化(FadD)およびβ-酸化(FadA、FadB、FadEおよびFadH)を担うタンパク質をコードするfad遺伝子の発現を低下させることができる。代替的な炭素源が利用できる場合には、細菌は脂肪酸をアシル-ACPとして合成し、これは、リン脂質合成には用いられるがβ-酸化の基質ではない。したがって、アシル-CoAおよびアシル-ACPはいずれも、異なる最終産物をもたらしうる、脂肪酸の独立した供給源である(Caviglia et al., J Biol. Chem., 279(12): 1163-1169 (2004))。
本開示は、本明細書に記載の脂肪酸生合成経路における使用に適する活性を有するポリペプチド(すなわち、酵素)の数多くの例を提供する。そのようなポリペプチドは、本明細書において「脂肪酸生合成ポリペプチド」または「脂肪酸生合成酵素」と総称される。本開示の組換え宿主細胞における使用に適する脂肪酸経路ポリペプチドの非限定的な例は、本明細書において提供される。いくつかの態様において、本開示は、脂肪酸生合成ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含む組換え宿主細胞を含む。脂肪酸生合成ポリペプチドをコードするオープンリーディングフレームおよび機能的に連結された調節配列を含むポリヌクレオチド配列を、組換え宿主細胞の染色体中に組み込むこと、組換え宿主細胞内に常在する1つもしくは複数のプラスミド発現系の中に組み入れること、またはその両方が可能である。1つの態様において、脂肪酸生合成ポリヌクレオチド配列は、操作される組換え宿主細胞の親宿主細胞(すなわち、対照細胞)にとって内因性であるポリペプチドをコードする。そのような内因性ポリペプチドのいくつかは、組換え宿主細胞において過剰発現される。もう1つの態様において、脂肪酸生合成ポリヌクレオチド配列は、外来性または異種ポリペプチドをコードする。換言すれば、ポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドは親宿主細胞にとって外来性である。さらにもう1つの態様において、遺伝子改変された宿主細胞は、宿主細胞が脂肪酸生合成酵素の基質、すなわち脂肪アシル-チオエステル基質を産生する速度を増大させるポリペプチド(タンパク質)をコードする遺伝子を過剰発現する。ある態様において、発現される遺伝子によってコードされる酵素は脂肪酸生合成に直接関与する。そのような組換え宿主細胞を、1つまたは複数の脂肪酸生合成ポリペプチド(すなわち、脂肪酸生合成に関与する酵素)をコードするポリヌクレオチド配列を含むようにさらに操作してもよい。そのようなポリペプチドの例としては、チオエステラーゼ活性を有するポリペプチドもしくはタンパク質(組換え宿主細胞は脂肪酸を合成する);またはチオエステラーゼ活性およびカルボン酸レダクターゼ(CAR)活性を有するポリペプチドもしくはタンパク質(組換え宿主細胞は脂肪アルデヒドおよび脂肪アルコールを合成する);または、チオエステラーゼ活性、カルボン酸レダクターゼ活性およびアルコールデヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチドもしくはタンパク質(組換え宿主細胞は脂肪アルコールを合成する);またはアシル-CoAレダクターゼ(AAR)活性を有するポリペプチドもしくはタンパク質(組換え宿主細胞は脂肪アルデヒドおよび脂肪アルコールを合成する);または、アシル-CoAレダクターゼ(AAR)活性およびアルコールデヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチドもしくはタンパク質(組換え宿主細胞は脂肪アルコールを合成する);または脂肪アルコール生成性のアシル-CoAレダクターゼ(FAR)活性を有するポリペプチドもしくはタンパク質(組換え宿主細胞は脂肪アルコールを合成する);またはチオエステラーゼ活性、カルボン酸レダクターゼ活性およびアルデヒドデカルボニラーゼ活性を有するポリペプチドもしくはタンパク質(組換え宿主細胞はアルカンを合成する);またはアシル-CoAレダクターゼ活性およびアルデヒドデカルボニラーゼ活性を有するポリペプチドもしくはタンパク質(組換え宿主細胞はアルカンを合成する);またはエステルシンターゼ活性を有するポリペプチドもしくはタンパク質(例えば、一酵素系;図5参照)(組換え宿主細胞は脂肪エステルを合成する);またはチオエステラーゼ活性、アシル-CoAシンターゼ活性およびエステルシンターゼ活性を有するポリペプチドもしくはタンパク質(例えば、三酵素系;図5参照)(組換え宿主細胞は脂肪エステルを合成する);またはOleA活性を有するポリペプチドもしくはタンパク質(組換え宿主細胞は脂肪族ケトンを合成する);またはOleABCD活性を有するポリペプチドもしくはタンパク質(組換え宿主細胞は内部オレフィンを合成する);またはチオエステラーゼ活性およびデカルボキシラーゼ活性を有するポリペプチドもしくはタンパク質(組換え宿主細胞は末端オレフィンを合成する);またはそれらの組み合わせが挙げられる。いくつかの態様において、脂肪酸生合成ポリヌクレオチドによってコードされる少なくとも1つのポリペプチドは、外来性(または異種)ポリペプチド(例えば、親宿主細胞以外の生物から生じたポリペプチド、または親微生物細胞にとって天然であるポリペプチドの変異体)または内因性ポリペプチド(すなわち、親宿主細胞にとって天然であるポリペプチド)であり、ここで内因性ポリペプチドは組換え宿主細胞において過剰発現される。
組換え宿主細胞は、チオエステラーゼ、例えば、酵素委員会番号(Enzyme Commission number)EC 3.1.1.5またはEC 3.1.2‐(例えば、EC 3.1.2.14)をコードするオープンリーディングフレームを、組換え宿主細胞におけるタンパク質の発現を促進する機能的に連結された調節配列とともに含む、1つまたは複数のポリヌクレオチド配列を含みうる。組換え宿主細胞において、オープンリーディングフレームコード配列および/または調節配列は、チオエステラーゼをコードする対応する野生型遺伝子に比して改変される。組換え宿主細胞におけるチオエステラーゼの活性は、対応する宿主細胞において対応する野生型遺伝子から発現されるチオエステラーゼの活性に比して改変される。いくつかの態様において、脂肪酸を含む脂肪酸誘導体組成物は、組換え細胞を、炭素源の存在下で、チオエステラーゼを発現させるのに適した条件下で培養することによって産生される。関連した態様において、組換え宿主細胞は、チオエステラーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、および、他の脂肪酸生合成酵素活性を有するポリペプチドをコードする1つまたは複数のさらなるポリヌクレオチドを含む。いくつかのそのような場合には、チオエステラーゼの作用によって生成された脂肪酸が、異なる脂肪酸生合成酵素活性を有する1つまたは複数の酵素によって、別の脂肪酸誘導体、例えば脂肪エステル、脂肪アルデヒド、脂肪アルコール、または炭化水素などに変換される。
1つの態様において、組換え宿主細胞は脂肪アルデヒドを産生する。いくつかの態様において、組換え宿主細胞によって産生された脂肪酸は脂肪アルデヒドに変換される。いくつかの態様において、組換え宿主細胞によって産生された脂肪アルデヒドは、続いて脂肪アルコールまたは炭化水素に変換される。いくつかの態様においては、天然(内因性)脂肪アルデヒド生合成ポリペプチド、例えばアルデヒドレダクターゼなどが宿主細胞(例えば、大腸菌)に存在し、脂肪アルデヒドを脂肪アルコールに変換させるのに有効である。他の態様においては、天然(内因性)脂肪アルデヒド生合成ポリペプチドを過剰発現させる。さらなる他の態様においては、外来性脂肪アルデヒド生合成ポリペプチドを組換え宿主細胞に導入して、発現または過剰発現させる。天然宿主細胞または組換え宿主細胞は、脂肪アルデヒド生合成活性を有する酵素(例えば、脂肪アルデヒド生合成ポリペプチドまたは脂肪アルデヒド生合成ポリペプチドまたは酵素)をコードするポリヌクレオチドを含みうる。脂肪アルデヒドは、脂肪アルデヒド生合成酵素が宿主細胞において発現または過剰発現された時に産生される。脂肪アルデヒドを産生するように操作された組換え宿主細胞は、典型的には、脂肪アルデヒドの一部を脂肪アルコールに変換する。いくつかの態様において、脂肪アルデヒドは、脂肪アルデヒド生合成活性、例えばカルボン酸レダクターゼ(CAR)活性などを有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを、組換え宿主細胞において発現または過剰発現させることによって産生される。CarBは例示的なカルボン酸レダクターゼの1つである。本開示の実施に当たっては、カルボン酸レダクターゼポリペプチドをコードする遺伝子を、宿主細胞において発現または過剰発現させる。いくつかの態様において、CarBポリペプチドはSEQ ID NO:7のアミノ酸配列を有する。他の態様において、CarBポリペプチドはSEQ ID NO:7の変異体または突然変異体である。カルボン酸レダクターゼ(CAR)ポリペプチドおよびそれらをコードするポリヌクレオチドの例には、FadD9(EC 6.2.1.-、UniProtKB Q50631、GenBank NP_217106、SEQ ID NO:34)、CarA(GenBank ABK75684)、CarB(GenBank YP889972;SEQ ID NO:33)、ならびに参照により本明細書に明示的に組み入れられるPCT公開第WO2010/042664号および米国特許第8,097,439号に記載された関連ポリペプチドが非限定的に含まれる。いくつかの態様において、組換え宿主細胞は、チオエステラーゼをコードするポリヌクレオチドをさらに含む。いくつかの態様において、脂肪アルデヒドは、脂肪アルデヒド生合成ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、例えばアシル-ACPレダクターゼ(AAR)活性を有するポリペプチドなどを、組換え宿主細胞において発現または過剰発現させることによって産生される。組換え宿主細胞におけるアシル-ACPレダクターゼの発現は、脂肪アルデヒドおよび脂肪アルコールの産生(図4参照)。組換え宿主細胞(例えば、大腸菌)に存在する天然(内因性)アルデヒドレダクターゼは、脂肪アルデヒドを脂肪アルコールに変換することができる。例示的なアシル-ACPレダクターゼポリペプチドは、PCT公開第WO2009/140695号および第WO/2009/140696号に記載されており、これらはいずれも参照により本明細書に明示的に組み入れられる。脂肪アルデヒドを含む組成物(脂肪アルデヒド組成物)は、炭素源の存在下で、脂肪アルデヒド生合成酵素を発現させるのに有効な条件下で宿主細胞を培養することによって、産生される。いくつかの態様において、脂肪アルデヒド組成物は脂肪アルデヒドおよび脂肪アルコールを含む。典型的には、脂肪アルデヒド組成物は、組換え宿主細胞の細胞外環境、すなわち細胞培養培地から回収される。
いくつかの態様において、組換え宿主細胞は、脂肪アルコール生合成活性を有するポリペプチド(酵素)(脂肪アルコール生合成ポリペプチドまたは脂肪アルコール生合成酵素)をコードするポリヌクレオチドを含み、脂肪アルコールが組換え宿主細胞によって産生される。脂肪アルコールを含む組成物(脂肪アルコール組成物)は、炭素源の存在下で、脂肪アルコール生合成酵素を発現させるのに有効な条件下で組換え宿主細胞を培養することによって、産生させうる。いくつかの態様において、脂肪アルコール組成物は脂肪アルコールを含むが、脂肪アルコール組成物が他の脂肪酸誘導体を含んでもよい。典型的には、脂肪アルコール組成物は、組換え宿主細胞の細胞外環境、すなわち細胞培養培地から回収される。1つのアプローチでは、アシル-ACPの遊離脂肪酸(FFA)への変換を触媒するチオエステラーゼ、および遊離脂肪酸を脂肪アルデヒドに変換するカルボン酸レダクターゼ(CAR)を発現させることによって、脂肪アルコールを産生するように組換え宿主細胞を操作した。宿主細胞(例えば、大腸菌)に存在する天然(内因性)アルデヒドレダクターゼは、脂肪アルデヒドを脂肪アルコールに変換することができる。いくつかの態様において、宿主細胞に存在する天然(内因性)脂肪アルデヒド生合成ポリペプチド、例えばアルデヒドレダクターゼなどは、脂肪アルデヒドを脂肪アルコールに変換するのに十分でありうる。しかし、他の態様において、天然(内因性)脂肪アルデヒド生合成ポリペプチドは過剰発現され、さらに別の態様において、外来性脂肪アルデヒド生合成ポリペプチドは組換え宿主細胞に導入されて、発現または過剰発現される。いくつかの態様において、脂肪アルコールは、脂肪アルデヒドを脂肪アルコールに変換する脂肪アルコール生合成活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを、組換え宿主細胞において発現または過剰発現させることによって産生される。例えば、アルコールデヒドロゲナーゼ(アルデヒドレダクターゼ、例えば、EC 1.1.1.1)を、本開示の実施に際して用いてもよい。本明細書で用いる場合、アルコールデヒドロゲナーゼとは、脂肪アルデヒドのアルコール(例えば、脂肪アルコール)への変換を触媒しうるポリペプチドのことを指す。当業者は、ある種のアルコールデヒドロゲナーゼは他の反応も触媒しうることを理解していると考えられ、これらの非特異的アルコールデヒドロゲナーゼもアルコールデヒドロゲナーゼの範囲に含まれる。本開示に従って有用なアルコールデヒドロゲナーゼポリペプチドの例には、アシネトバクター属種M-1(Acinetobacter sp. M-1)のAlrA(SEQ ID NO:3)またはAlrAホモログ、例えばAlrAadp1(SEQ ID NO:4)など、および内因性大腸菌アルコールデヒドロゲナーゼ、例えばYjgB(AAC77226)(SEQ ID NO:5)、DkgA(NP_417485)、DkgB(NP_414743)、YdjL(AAC74846)、YdjJ(NP_416288)、AdhP(NP_415995)、YhdH(NP_417719)、YahK(NP_414859)、YphC(AAC75598)、YqhD(446856)およびYbbO[AAC73595.1]などが非限定的に含まれる。そのほかの例は、国際特許出願公開第WO2007/136762号、WO2008/119082号およびWO 2010/062480号に記載されており、これらはそれぞれ、参照により本明細書に明示的に組み入れられる。ある態様において、脂肪アルコール生合成ポリペプチドはアルデヒドレダクターゼ活性またはアルコールデヒドロゲナーゼ活性を有する(EC 1.1.1.1)。
本明細書で用いる場合、「脂肪エステル」という用語は、エステルに関して用いることができる。本明細書において言及される脂肪エステルは、脂肪酸から作られるあらゆるエステル、例えば脂肪酸エステルでありうる。いくつかの態様において、脂肪エステルはA側およびB側を含む。本明細書で用いる場合、エステルの「A側」とは、エステルのカルボン酸酸素に結びついた炭素鎖のことを指す。本明細書で用いる場合、エステルの「B側」とは、エステルの親カルボン酸を含む炭素鎖のことを指す。脂肪エステルが脂肪酸生合成経路に由来する態様において、A側はアルコールにより与えられ、B側は脂肪酸により与えられる。あらゆるアルコールを、脂肪エステルのA側を形成するために用いることができる。例えば、アルコールが脂肪酸生合成経路に由来してもよい。または、アルコールを非脂肪酸生合成経路を介して生成させることもできる。さらに、アルコールを外来的に与えることもできる。例えば、脂肪エステルが生物によって産生される場合には、アルコールを発酵ブロス中に供給することができる。または、脂肪エステルがアルコールも産生しうる生物によって産生される場合には、脂肪酸または酢酸などのカルボン酸を外来的に供給することもできる。A側またはB側を含む炭素鎖は、任意の長さであってよい。1つの態様において、エステルのA側は少なくとも約1、2、3、4、5、6、7、8、10、12、14、16、または18炭素長である。脂肪エステルが脂肪酸メチルエステルである場合、エステルのA側は1炭素長である。脂肪エステルが脂肪酸エチルエステルである場合、エステルのA側は2炭素長である。エステルのB側は、少なくとも約4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、または26炭素長であってよい。A側および/またはB側は、直鎖または分枝鎖でありうる。分枝鎖は1つまたは複数の分枝点を有しうる。加えて、分枝鎖が環状分枝を含むこともできる。その上、A側および/またはB側は飽和性でも不飽和性でもよい。不飽和である場合には、A側および/またはB側は1つまたは複数の不飽和点を有しうる。1つの態様において、脂肪エステルは生合成で生成される。この態様においては、第1の脂肪酸が活性化される。「活性化」脂肪酸の非限定的な例には、アシル-CoA、アシルACPおよびアシルリン酸がある。アシル-CoAは脂肪酸の生合成または分解の直接的な生成物でありうる。加えて、アシル-CoAを、遊離脂肪酸、CoAおよびアデノシンヌクレオチド三リン酸(ATP)から合成することもできる。アシル-CoAを生成する酵素の一例はアシル-CoAシンターゼである。いくつかの態様において、組換え宿主細胞は、エステルシンターゼ活性を有するポリペプチド、例えば、酵素(エステルシンターゼポリペプチドまたはエステルシンターゼ)をコードするポリヌクレオチドを含む。
本開示のこの局面は、少なくとも一部には、組換え宿主細胞において、脂肪アルデヒド生合成ポリペプチド、例えばアシル-ACPレダクターゼポリペプチド(EC 6.4.1.2)、および炭化水素生合成ポリペプチド、例えばデカルボニラーゼの発現レベルを変更することにより、組換え宿主細胞による炭化水素の産生強化が促進されるという発見に基づく。1つの態様において、組換え宿主細胞は、アルカンまたはアルケン(例えば、末端オレフィンもしくは内部オレフィン)またはケトンなどの炭化水素を産生する。いくつかの態様において、組換え宿主細胞によって産生された脂肪アルデヒドは、脱カルボニルによって変換され、炭素原子が除去されて炭化水素となる。他の態様において、組換え宿主細胞によって産生された脂肪酸は脱カルボキシルによって変換され、炭素原子が除去されて末端オレフィンとなる。いくつかの態様において、アシル-ACP中間体は脱カルボキシルによって変換され、炭素原子が除去されて内部オレフィンまたはケトンとなる(図6参照)。いくつかの態様において、組換え宿主細胞は、炭化水素生合成活性を有するポリペプチド(酵素)(炭化水素生合成ポリペプチドまたは炭化水素生合成酵素)をコードするポリヌクレオチドを含み、組換え宿主細胞における炭化水素生合成酵素の発現または過剰発現によって炭化水素が産生されるアシル-アシルキャリアータンパク質レダクターゼ(AAR)およびアルデヒドデカルボニラーゼ(ADC)(これらは一緒になって脂肪酸代謝の中間体をアルカンおよびアルケンに変換する)からなるシアノバクテリウム由来のアルカン生合成経路を用いて、炭化水素の産生のための組換え宿主細胞を遺伝子操作した(図6)。シアノバクテリウムにおいて飽和アシル-ACPがアルカンに変換されるこの経路における2つの反応のうち第2のものは、組成不明の複核金属補因子を伴うフェリチン様タンパク質である酵素アルデヒドデカルボニラーゼ(ADC)による、脂肪アルデヒド中間体のC1-C2結合の分断を伴う。いくつかの態様において、炭化水素は、アルデヒドデカルボニラーゼ(ADC)活性(例えば、EC 4.1.99.5)などの炭化水素生合成活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを、組換え宿主細胞において発現または過剰発現させることによって産生される。この態様に従って有用なアルデヒドデカルボニラーゼをコードする例示的なポリヌクレオチドには、参照により本明細書に明示的に組み入れられるPCT公開第WO2008/119082号およびWO2009/140695号に記載されたもの、ならびに以下の表2に提示された配列が非限定的に含まれる。いくつかの態様において、組換え宿主細胞は、脂肪アルデヒド生合成ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドをさらに含む。いくつかの態様において、組換え宿主細胞は、アシル-ACPレダクターゼをコードするポリヌクレオチドをさらに含む。例えば、以下の表2を参照されたい。
組換え宿主細胞による脂肪酸誘導体の産生を増加させるための戦略には、産生宿主における、天然脂肪酸生合成遺伝子の過剰発現および異なる生物由来の外因性脂肪酸生合成遺伝子の発現による、脂肪酸生合成経路を経由する流れの増大が含まれる。本明細書で用いる場合、組換え宿主細胞または操作された宿主細胞とは、例えば、新たな遺伝因子の人為的導入、および/または宿主細胞内に天然に存在する遺伝因子の人為的改変によって、対応する野生型宿主細胞に比して遺伝子構造が変更された宿主細胞のことを指す。そのような組換え宿主細胞の子孫も、これらの新たな、および/または改変された遺伝因子を含有する。本明細書に記載の本開示の諸局面の任意のものにおいて、宿主細胞は、植物細胞、昆虫細胞、真菌細胞(例えば、カンジダ属種(Candida sp.)などの糸状菌、またはサッカロミセス属種(Saccharomyces sp.)などの出芽酵母)、藻類細胞および細菌細胞からなる群より選択されうる。1つの好ましい態様において、組換え宿主細胞は組換え微生物細胞である。微生物細胞である宿主細胞の例には、エシェリキア属(Escherichia)、バチルス属(Bacillus)、ラクトバチルス属(Lactobacillus)、ザイモモナス属(Zymomonas)、ロドコッカス属(Rhodococcus)、シュードモナス属(Pseudomonas)、アスペルギルス属(Aspergillus)、トリコデルマ属(Trichoderma)、ニューロスポラ属(Neurospora)、フザリウム属(Fusarium)、ヒューミコーラ属(Humicola)、リゾムコール属(Rhizomucor)、クリベロミセス属(Kluyveromyces)、ピキア属(Pichia)、ムコール属(Mucor)、ミセリオフトラ属(Myceliophtora)、ペニシリウム属(Penicillium)、ファネロカエテ属(Phanerochaete)、プレウロタス属(Pleurotus)、トラメテス属(Trametes)、クリソスポリウム属(Chrysosporium)、サッカロミセス属(Saccharomyces)、ステノトロホモナス属(Stenotrophamonas)、シゾサッカロミセス属(Schizosaccharomyces)、ヤロウイア属(Yarrowia)、またはストレプトミセス属(Streptomyces)に由来する細胞が非限定的に含まれる。いくつかの態様において、宿主細胞はグラム陽性細菌細胞である。他の態様において、宿主細胞はグラム陰性細菌細胞である。いくつかの態様において、宿主細胞は大腸菌細胞である。他の態様において、宿主細胞は、バチルス・レンタス(Bacillus lentus)細胞、バチルス・ブレビス(Bacillus brevis)細胞、バチルス・ステアロサーモフィラス(Bacillus stearothermophilus)細胞、バチルス・リケニフォルミス(Bacillus lichenoformis)細胞、バチルス・アルカロフィラス(Bacillus alkalophilus)細胞、バチルス・コアギュランス(Bacillus coagulans)細胞、バチルス・サーキュランス(Bacillus circulans)細胞、バチルス・プミルス(Bacillus pumilis)細胞、バチルス・チューリンゲンシス(Bacillus thuringiensis)細胞、バチルス・クラウジ(Bacillus clausii)細胞、バチルス・メガテリウム(Bacillus megaterium)細胞、バチルス・サブティリス(Bacillus subtilis)細胞、またはバチルス・アミロリクエファシエンス(Bacillus amyloliquefaciens)細胞である。他の態様において、宿主細胞は、トリコデルマ・コニンギ(Trichoderma koningii)細胞、トリコデルマ・ビリデ(Trichoderma viride)細胞、トリコデルマ・リーゼイ(Trichoderma reesei)細胞、トリコデルマ・ロンギブラキアタム(Trichoderma longibrachiatum)細胞、アスペルギルス・アワモリ(Aspergillus awamori)細胞、アスペルギルス・フミガータス(Aspergillus fumigates)細胞、アスペルギルス・フェチダス(Aspergillus foetidus)細胞、アスペルギルス・ニディランス(Aspergillus nidulans)細胞、アスペルギルス・ニガー(Aspergillus niger)細胞、アスペルギルス・オリゼ(Aspergillus oryzae)細胞、ヒューミコラ・インソレンス(Humicola insolens)細胞、ヒューミコラ・ラヌギノサ(Humicola lanuginose)細胞、ロドコッカス・オパクス(Rhodococcus opacus)細胞、リゾムコール・ミエヘイ(Rhizomucor miehei)細胞、またはムコール・ミエヘイ(Mucor michei)細胞である。さらに他の態様において、宿主細胞は、ストレプトミセス・リビダンス(Streptomyces lividans)細胞またはストレプトミセス・ムリヌス(Streptomyces murinus)細胞である。さらに他の態様において、宿主細胞はアクチノミセス(Actinomycetes)細胞である。いくつかの態様において、宿主細胞はサッカロミセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)細胞である。他の態様において、宿主細胞は、真核植物、藻類、ラン色細菌、緑色硫黄細菌、緑色非硫黄細菌、紅色硫黄細菌、紅色非硫黄細菌、好極限性細菌、酵母、真菌、それらの操作された生物、または合成生物に由来する細胞である。いくつかの態様において、宿主細胞は、光依存性であるかまたは炭素を固定する。いくつかの態様において、いくつかの態様において、宿主細胞は独立栄養活性を有する。いくつかの態様において、宿主細胞は、光の存在下などにおいて光独立栄養活性を有する。いくつかの態様において、宿主細胞は、光の非存在下において従属栄養性または混合栄養性である。ある態様において、宿主細胞は、アラビドプシス・タリアナ、パニカム・ウィルガツム(Panicum virgatum)、ミスカンサス・ギガンテス(Miscanthus giganteus)、トウモロコシ(Zea mays)、ボツリオコッカス・ブラウニー(Botryococcuse braunii)、クラミドモナス・レインハルディ(Chlamydomonas reinhardtii)、ドナリエナ・サリナ(Dunaliela salina)、シネココッカス属種PCC7002、シネココッカス属種PCC7942、シネコシスティス(Synechocystis)属種PCC 6803、サーモシネココッカス・エロンガタス(Thermosynechococcus elongates)BP-1、クロロビウム・テピダム(Chlorobium tepidum)、クロロフレクサス・オウランティアカス(Chlorojlexus auranticus)、クロマチウム・ビノサム(Chromatiumm vinosum)、ロドスピリラム・ラブラム(Rhodospirillum rubrum)、ロドバクター・カプスラータ(Rhodobacter capsulatus)、ロドシュードモナス・パルストリス(Rhodopseudomonas palusris)、クロストリジウム・リュングダーリイ(Clostridium ljungdahlii)、クロストリジウム・サーモセラム(Clostridiuthermocellum)、ペニシリウム・クリソゲナム(Penicillium chrysogenum)、ピキア・パストリス(Pichia pastoris)、サッカロミセス・セレビシエ、シゾサッカロミセス・ポンベ(Schizosaccharomyces pombe)、シュードモナス・フルオレセンス(Pseudomonas fluorescens)、またはザイモモナス・モビリス(Zymomonas mobilis)に由来する細胞である。
脂肪酸、アシル-CoA、脂肪アルデヒド、短鎖および長鎖アルコール、炭化水素(例えば、アルカン、アルケンまたはオレフィン、例えば末端オレフィンもしくは内部オレフィンなど)、脂肪アルコール、エステル(例えば、蝋エステル、脂肪酸エステル(例えば、メチルエステルまたはエチルエステル))、ならびにケトンを非限定的に含む多種多様な脂肪酸誘導体を、本明細書に述べるような菌株改良を含む組換え宿主細胞によって産生させることができる。本開示のいくつかの態様において、ある特定の組成物における脂肪酸誘導体の力価がより高いとは、組換え宿主細胞培養物によって産生されるある特定の種類の脂肪酸誘導体(例えば、脂肪アルコール、脂肪酸エステルまたは炭化水素)の力価が、対応する野生型宿主細胞の対照培養物によって産生される同じ脂肪酸誘導体の力価に比してより高いことをいう。そのような場合に、脂肪酸誘導体組成物は、例えば、種々の鎖長および飽和性または分枝の特性を有する脂肪アルコールの混合物を含みうる。本開示の他の態様において、特定の組成物における脂肪酸誘導体の力価がより高いとは、複数の異なる脂肪酸誘導体の組み合わせ(例えば、脂肪アルデヒドおよびアルコール、または脂肪酸およびエステル)の力価が、対応する野生型宿主細胞の対照培養物によって産生される同じ脂肪酸誘導体の力価に比してより高いことをいう。
いくつかの態様においては、ポリヌクレオチド(または遺伝子)配列が、ポリヌクレオチド配列と機能的に連結したプロモーターを含む組換えベクターにより、宿主細胞に与えられる。ある態様において、プロモーターは、発生段階調節性の、オルガネラ特異的な、組織特異的な、誘導性の、構成性の、または細胞特異的なプロモーターである。いくつかの態様において、組換えベクターは、(a)ポリヌクレオチド配列と機能的に結びついた発現制御配列;(b)ポリヌクレオチド配列と機能的に結びついた選択マーカー;(c)ポリヌクレオチド配列と機能的に結びついたマーカー配列;(d)ポリヌクレオチド配列と機能的に結びついた精製部分;(e)ポリヌクレオチド配列と機能的に結びついた分泌配列;および(f)ポリヌクレオチド配列と機能的に結びついたターゲティング配列、を非制限的に含む、少なくとも1つの配列を含む。本明細書に記載の発現ベクターは、本明細書に記載のポリヌクレオチド配列を、宿主細胞におけるポリヌクレオチド配列の発現に適した形態で含む。当業者には、発現ベクターの設計が、形質転換させようとする宿主細胞の選択、所望のポリペプチドの発現レベルなどの要因に依存しうることが理解されるであろう。本明細書に記載のポリヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチド、例えば融合ポリペプチドを産生させるために、本明細書に記載の発現ベクターは宿主細胞に導入することができる。原核生物、例えば大腸菌(E. coli)におけるポリペプチドをコードする遺伝子の発現は、融合または非融合ポリペプチドのいずれかの発現を導く構成性または誘導性プロモーターを含有するベクターを用いて実施されることが最も多い。融合ベクターは、その中にコードされているポリペプチド、通常は組換えポリペプチドのアミノ末端またはカルボキシ末端に、いくつかのアミノ酸を付加する。そのような融合ベクターは、典型的には、以下の3つの目的の1つまたは複数に役立つ:(1)組換えポリペプチドの発現を増大させること;(2)組換えポリペプチドの溶解性を高めること;および(3)アフィニティー精製におけるリガンドとして作用することによって、組換えポリペプチドの精製を助けること。多くの場合、融合発現ベクターでは、融合部分と組換えポリペプチドの接合部にタンパク質分解切断部位が導入されている。これにより、融合ポリペプチドの精製後に、融合部分からの組換えポリペプチドの分離が可能になる。そのような酵素およびそれらのコグネイト認識配列の例には、第Xa因子、トロンビンおよびエンテロキナーゼが含まれる。例示的な融合発現ベクターには、pGEX(Pharmacia Biotech, Inc., Piscataway, NJ;Smith et al., Gene, 67: 31-40 (1988))、pMAL(New England Biolabs, Beverly, MA)、およびpRITS(Pharmacia Biotech, Inc., Piscataway, N. J.)が含まれ、これらはそれぞれ、グルタチオンS-トランスフェラーゼ(GST)、マルトースE結合タンパク質またはプロテインAを標的組換えポリペプチドと融合させるものである。誘導性の非融合大腸菌発現ベクターの例には、pTrc(Amann et al., Gene (1988) 69:301-315)およびpET 11d(Studier et al., Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, Calif. (1990) 60-89)が含まれる。pTrcベクターからの標的遺伝子発現は、ハイブリッドtrp-lac融合プロモーターからの宿主RNAポリメラーゼ転写に依拠する。pET 11dベクターからの標的遺伝子発現は、共発現させたウイルスRNAポリメラーゼ(T7 gn1)によって媒介されるT7 gn10-lac融合プロモーターからの転写に依拠する。このウイルスポリメラーゼは、宿主菌株BL21(DE3)またはHMS174(DE3)により、lacUV 5プロモーターの転写制御下にあるT7 gn1遺伝子を保有する常在性λプロファージから供給される。原核細胞および真核細胞の両者に適した発現系は、当技術分野において周知である;例えば、Sambrook et al., "Molecular Cloning: A Laboratory Manual," second edition, Cold Spring Harbor Laboratory, (1989)を参照されたい。誘導性の非融合大腸菌発現ベクターの例には、pTrc(Amann et al., Gene, 69: 301-315 (1988))およびPET 11d(Studier et al., Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA, pp. 60-89 (1990))が含まれる。ある態様において、本開示のポリヌクレオチド配列は、バクテリオファージT5に由来するプロモーターと機能的に連結されている。1つの態様において、宿主細胞は酵母細胞である。この態様において、発現ベクターは酵母発現ベクターである。ベクターは、外来性核酸(例えば、DNA)を宿主細胞に導入するための、当技術分野で認知された種々の手法を介して原核細胞または真核細胞に導入することができる。宿主細胞の形質転換またはトランスフェクションのために適した方法は、例えば、Sambrook et al.(前記)に見いだすことができる。細菌細胞の安定的な形質転換に関しては、用いる発現ベクターおよび形質転換手法によっては、発現ベクターを取り込んで複製する細胞の割合はわずかに過ぎないことが知られている。これらの形質転換体の同定および選択のために、選択マーカー(例えば、抗生物質に対する耐性)をコードする遺伝子を、関心対象の遺伝子とともに宿主細胞に導入することができる。選択マーカーには、アンピシリン、カナマイシン、クロラムフェニコール、またはテトラサイクリンなど、ただしこれらには限定されない薬物に対する耐性を付与するものが含まれる。選択マーカーをコードする核酸は、本明細書に記載のポリペプチドをコードするベクターと同一ベクター上で宿主細胞中に導入することができ、または別個のベクター上で導入することもできる。導入された核酸によって安定的に形質転換された細胞は、適切な選択薬の存在下における増殖によって同定することができる。
本明細書で用いる場合、操作された宿主細胞または組換え宿主細胞とは、本明細書にさらに述べるような脂肪酸誘導体組成物を産生させるために用いられる細胞のことである。宿主細胞は、宿主細胞における1つまたは複数のポリヌクレオチドまたはポリペプチドの発現が、同じ条件下にある対応する野生型宿主細胞(例えば、対照細胞)におけるそれらの発現と比較して変更または改変されているならば、操作された宿主細胞または組換え宿主細胞と称される。本明細書に記載の本開示の局面の任意のものにおいて、宿主細胞は、真核植物、藻類、ラン色細菌、緑色硫黄細菌、緑色非硫黄細菌、紅色硫黄細菌、紅色非硫黄細菌、好極限性細菌、酵母、真菌、それらの操作された生物、または合成生物からなる群より選択することができる。いくつかの態様において、宿主細胞は光依存性であるかまたは炭素を固定する。宿主細胞は独立栄養活性を有する。本明細書に述べるように、さまざまな宿主細胞を、脂肪酸誘導体を産生させるために用いることができる。
いくつかの態様において、ポリペプチドは、本明細書に記載のポリペプチドのいずれかの突然変異体または変異体である。突然変異型および変異体という用語は、本明細書で用いる場合、野生型ポリペプチドとは少なくとも1つのアミノ酸が異なるアミノ酸配列を有するポリペプチドのことを指す。例えば、突然変異体は、以下の保存的アミノ酸置換のうち1つまたは複数を含みうる:脂肪族アミノ酸、例えばアラニン、バリン、ロイシンおよびイソロイシンなどの、別の脂肪族アミノ酸による置き換え;セリンのトレオニンによる置き換え;トレオニンのセリンによる置き換え;酸性残基、例えばアスパラギン酸およびグルタミン酸などの、別の酸性残基による置き換え;アミド基を保有する残基、例えばアスパラギンおよびグルタミンなどの、アミド基を保有する別の残基による置き換え;塩基性残基、例えばリジンおよびアルギニンなどの、別の塩基性残基との交換;ならびに、芳香族残基、例えばフェニルアラニンおよびチロシンなどの、別の芳香族残基による置き換え。いくつかの態様において、突然変異型ポリペプチドは、約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、30、40、50、60、70、80、90、100個、またはそれ以上のアミノ酸置換、付加、挿入または欠失を有する。ポリペプチドの好ましい断片または突然変異体は、対応する野生型ポリペプチドの生物学的機能(例えば、酵素活性)の一部またはすべてを保っている。いくつかの態様において、断片または突然変異体は、対応する野生型ポリペプチドの生物学的機能の少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも90%、少なくとも95%または少なくとも98%、またはそれ以上を保っている。他の態様において、断片または突然変異体は、対応する野生型ポリペプチドの生物学的機能の約100%を保っている。生物活性に影響を及ぼさずにどのアミノ酸残基を置換し、挿入し、または欠失させることができるかを判定する上での手引きは、当技術分野において周知のコンピュータプログラム、例えば、LASERGENE(商標)ソフトウェア(DNASTAR, Inc., Madison, WI)を用いて見いだすことができる。さらに他の態様において、断片または突然変異体は、対応する野生型ポリペプチドと比較して増大した生物学的機能を示す。例えば、断片または突然変異体は、対応する野生型ポリペプチドと比較して、酵素活性の点で少なくとも10%、少なくとも25%、少なくとも50%、少なくとも75%または少なくとも90%の改善を呈しうる。他の態様において、断片または突然変異体は、対応する野生型ポリペプチドと比較して、酵素活性の点で少なくとも100%(例えば、少なくとも200%または少なくとも500%)の改善を呈する。本明細書に記載のポリペプチドが、ポリペプチドの機能に実質的な影響を及ぼさないさらなる保存的または非必須のアミノ酸置換を有してもよいことは理解されよう。ある特定の置換が許容される(すなわち、カルボン酸レダクターゼ活性といった所望の生物学的機能に有害な影響を及ぼさない)か否かは、Bowie et al. (Science, 247: 1306-1310 (1990))に記載されたようにして判定することができる。保存的アミノ酸置換とは、アミノ酸残基が類似の側鎖を有するアミノ酸残基によって置き換えられたもののことである。類似の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは、当技術分野において定義されている。これらのファミリーには、塩基性側鎖(例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジン)、酸性側鎖(例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸)、非荷電極性側鎖(例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、チロシン、システイン)、非極性側鎖(例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン)、β-分枝側鎖(例えば、トレオニン、バリン、イソロイシン)および芳香族側鎖(例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン)を有するアミノ酸が含まれる。
本明細書で用いる場合、「発酵」という用語は、組換え宿主細胞の培養物を炭素源を含む培地中で繁殖させることによる、宿主細胞による有機材料の標的物質への変換、例えば、組換え宿主細胞による炭素源の脂肪酸またはその誘導体への変換のことを広く指す。本明細書で用いる場合、「産生を許容する条件」という用語は、宿主細胞が所望の生成物、例えば脂肪酸または脂肪酸誘導体などを産生することを可能にする、あらゆる条件のことを意味する。同様に、「ベクターのポリヌクレオチド配列が発現される条件」という用語は、宿主細胞がポリペプチドを合成することを可能にする、あらゆる条件のことを意味する。適した条件には、例えば、発酵条件が含まれる。発酵条件は、温度範囲、通気レベル、供給速度および培地組成を非限定的に含む多くのパラメーターを含みうる。これらの条件のそれぞれは、個々に、または組み合わされて、宿主細胞が増殖することを可能にする。発酵は、好気性、嫌気性、またはそれらの変形物(微好気性など)であってよい。例示的な培養培地には、ブロスまたはゲルが含まれる。一般に、培地は、宿主細胞によって直接代謝されうる炭素源を含む。加えて、炭素源の動態化(例えば、デンプンまたはセルロースの発酵性糖への解重合)およびその後の代謝を促進するために、培地中に酵素を用いることもできる。小規模産生のためには、遺伝子操作された宿主細胞を、例えば約100mL、500mL、1L、2L、5Lまたは10Lバッチ中で増殖させ、発酵させて、所望のポリヌクレオチド配列、例えばCARポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列などを発現するように誘導することができる。大規模産生のためには、遺伝子操作された宿主細胞を、約10L、100L、1000L、10,000L、100,000L、および1,000,000Lまたはそれ以上のバッチ中で増殖させ、発酵させて、所望のポリヌクレオチド配列を発現するように誘導することができる。または、大規模流加発酵を実施することもできる。本明細書に記載の脂肪酸誘導体組成物は、組換え宿主細胞培養物の細胞外環境において認められ、培養培地から容易に単離することができる。脂肪酸誘導体は組換え宿主細胞によって分泌され、組換え宿主細胞培養物の細胞外環境に輸送されるか、または細胞外環境に受動的に移行する。脂肪酸誘導体は、当技術分野において公知の慣行的な方法を用いて、組換え宿主細胞培養物から単離される。
本明細書で用いる場合、「現代炭素分率(fraction of modern carbon)」すなわちfMという用語は、米国国立標準技術研究所(National Institute of Standards and Technology(NIST))標準物質(Standard Reference Material(SRM))4990Bおよび4990C、それぞれシュウ酸標準品HOxIおよびHOxIIとして知られるもの、によって定義されるものと同じ意味を有する。基本的定義はHOxIの14C/12C同位体比の0.95倍に相当する(西暦1950年を基準とする)。これは、減衰補正された産業革命前の木とおおむね等しい。現在の生体生物圏(植物材料)については、fMはおよそ1.1である。生物的に産生された有機化合物、特に本明細書における脂肪酸生合成経路を用いて産生された脂肪酸誘導体を含むバイオ生成物(bioproduct)(例えば、本開示に従って産生された脂肪酸誘導体は、これまで再生可能資源から産生されたことはなく、したがって新規な組成物である。これらの新たなバイオ生成物は、石油化学炭素由来の有機化合物とは、二核種炭素同位体フィンガープリント法(dual carbon-isotopic fingerprinting)または14C年代測定法(14C dating)に基づいて区別することができる。さらに、生物起源炭素の具体的な供給源(例えば、グルコースとグリセロールとの対比)を、二核種炭素同位体フィンガープリント法によって決定することもできる(例えば、米国特許第7,169,588号を参照されたい。これは参照により本明細書に組み込まれる)。バイオ生成物を石油ベースの有機化合物と区別しうることは、これらの材料の流通下でのトラッキングに有益である。例えば、生物学に基づく炭素同位体プロファイルと石油ベースの炭素同位体プロファイルの両方を含む有機化合物または化学物質は、石油ベースの材料だけでできた有機化合物および化学物質と区別することができる。それ故に、本明細書におけるバイオ生成物は、そのユニークな炭素同位体プロファイルに基づいて、流通下で追跡またはトラッキングすることができる。バイオ生成物は、各試料中の安定炭素同位体比(13C/12C)を比較することによって、石油ベースの有機化合物と区別することができる。所与のバイオ生成物における13C/12C比は、二酸化炭素が固定された時点の大気中の二酸化炭素における13C/12C比の結果である。それはまた、厳密な代謝経路も反映する。地域的変動も起こる。石油、C3植物(広葉植物)、C4植物(イネ科草本)、および海洋炭酸塩はすべて、13C/12Cおよび対応するδ13C値の点で有意差を示す。さらに、C3植物およびC4植物の脂質物質は、代謝経路の結果として、同じ植物の炭水化物成分から誘導される材料とは異なる分析結果を示す。測定精度内で、13Cは同位体分別効果に起因する大きな変動を示し、バイオ生成物に関して最も重要なのは光合成機構である。植物における炭素同位体比の違いの主因は、植物における光合成炭素代謝の経路の違い、特に一次カルボキシル化(すなわち、大気CO2の初期固定)時に起こる反応の違いと密接に関連している。草木の二大クラスは、「C3」(またはカルビン・ベンソン)光合成回路が組み込まれているものと、「C4」(またはハッチ・スラック)光合成回路が組み込まれているものである。C3植物では、一次CO2固定またはカルボキシル化反応にリブロース-1,5-二リン酸カルボキシラーゼ酵素が関与し、最初の安定生成物は3-炭素化合物である。広葉樹および針葉樹などのC3植物は、温帯気候帯において優勢である。C4植物では、もう1つの酵素であるホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼが関与するさらなるカルボキシル化反応が、一次カルボキシル化反応である。最初の安定炭素化合物は4-炭素酸であり、それが後に脱炭酸される。そのようにして放出されたCO2は、C3回路によって再び固定される。C4植物の例には、暖地型牧草、トウモロコシ、およびサトウキビがある。C4植物およびC3植物はいずれも、ある範囲の13C/12C同位体比を示すが、典型的な値は、C4植物については約-7〜約-13パーミル、C3植物については約-19〜約-27パーミルである(例えば、Stuiver et al, Radiocarbon 19:355 (1977)を参照)。石炭および石油は一般に後者の範囲に含まれる。13C測定尺度は、元はピーディー(Pee Dee)ベレムナイト(PDB)石灰石によって設定されたゼロ点によって定義されたものであり、ここでの値は、この材料からの千分の一偏位(parts per thousand deviations)で与えられる。「δ13C」値は、千分率(パーミル)で表されて‰と略記され、以下のように計算される:
δ13C(‰)=[(13C/12C)試料-(13C/12C)標準物質]/(13C/12C)標準物質×1000
条件が発現を可能とするのに十分であるかを判定するために、宿主細胞を、例えば、約4、8、12、24、36または48時間にわたって培養することができる。培養中および/または培養後に、試料を集菌して分析し、該条件が発現を可能にするかを判定することができる。例えば、試料中の宿主細胞または宿主細胞を増殖させた培地を、所望の生成物の存在について調べることができる。ある生成物の存在について調べる場合には、例えば、TLC、HPLC、GC/FID、GC/MS、LC/MS、MSなど、ただしこれらには限定されないアッセイを用いることができる。「総脂肪種」に関しては、GC/FIDアッセイを用いて、96ウェルプレートレベルで、1リットルおよび5リットルのタンクレベルで、ならびに1000Lパイロットプラントレベルで、組換え宿主細胞培養物をスクリーニングする。
脂肪酸は、長い脂肪族尾部(鎖)を有するカルボン酸であり、これは飽和性または不飽和性のいずれかである。天然に存在するほとんどの脂肪酸は、4〜28個の偶数の炭素原子の鎖を有する。脂肪酸は通常、トリグリセリドに由来する。それらに他の分子が結びついていない場合、それらは「遊離」脂肪酸として知られる。脂肪酸は通常、工業的には、トリグリセリドの加水分解により、グリセロールが除去されて製造される。現在は、ヤシ油、ダイズ油、ナタネ油、ココナッツ油およびヒマワリ油などが、脂肪酸の最も一般的な供給源である。そのような供給源に由来する脂肪酸の大半は、ヒトの食品に用いられる。ココナッツ油およびパーム核油(主として炭素12個および14個の脂肪酸からなる)。これらは、洗浄剤およびクレンジング剤ならびに化粧品用の界面活性剤としてさらに加工するのに特に適する。ヤシ油、ダイズ油、ナタネ油およびヒマワリ油、さらには獣脂などの動物性脂肪は、主として長鎖脂肪酸(例えば、C18、飽和および不飽和)を含有し、それらはポリマー用途および潤滑剤のための原料として用いられる。生態学的および毒物学的研究により、再生可能資源をベースとする脂肪酸由来生成物は石油化学品ベースの物質よりも好適な特性を有することが示唆されている。脂肪アルデヒドは、多くの特殊化学物質を産生するために用いられる。例えば、アルデヒドは、ポリマー、樹脂(例えば、ベークライト)、染料、香味剤、可塑剤、香料、医薬品および他の化学物質を産生するために用いられ、溶媒、保存料、または消毒薬として用いられるものもある。加えて、ビタミンおよびホルモンなどのある種の天然化合物および合成化合物はアルデヒドであり、多くの糖類はアルデヒド基を含有する。脂肪アルデヒドは、化学的または酵素的還元によって脂肪アルコールに変換することができる。脂肪アルコールは多くの商業用途を有する。全世界での脂肪アルコールおよびその誘導体の年間売上高は10億米ドルを超える。短鎖(shorter chain)脂肪アルコールは、化粧品産業および食品産業において、乳化剤、軟化剤、および増粘剤として用いられる。脂肪アルコールは、その両親媒性ゆえに、パーソナルケア用品および家事用品、例えば洗剤などに役立つ非イオン界面活性剤として作用する。また、脂肪アルコールは、蝋、ゴム、樹脂、医薬軟膏およびローション、潤滑油添加物、繊維用帯電防止剤および表面処理剤、可塑剤、化粧品、工業用溶媒、ならびに脂肪用の溶媒として使用される。本開示はまた、本明細書に記載の方法のいずれかによって産生された脂肪アルコールを含む界面活性剤組成物または洗剤組成物も提供する。当業者は、界面活性剤組成物または洗剤組成物の意図する目的に応じて、異なる脂肪アルコールを産生して用いることができることを理解するであろう。例えば、本明細書に記載の脂肪アルコールが、界面活性剤または洗剤の産生のための原料として用いられる場合、当業者は、脂肪アルコール原料の特性が、産生される界面活性剤または洗剤組成物の特性に影響を及ぼすことを理解するであろう。それ故に、原料として用いるための特定の脂肪アルコールを産生することにより、界面活性剤または洗剤組成物の特性を選択することができる。本明細書に記載の脂肪アルコールベースの界面活性剤および/または洗剤組成物は、当技術分野において周知の他の界面活性剤および/または洗剤と混合することができる。いくつかの態様において、混合物は、重量比で少なくとも約10%、少なくとも約15%、少なくとも約20%、少なくとも約30%、少なくとも約40%、少なくとも約50%、少なくとも約60%、または前記の値の任意の2つを境界とする範囲の脂肪アルコールを含むことができる。他の例では、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21または22炭素長である炭素鎖を含む脂肪アルコールを、重量比で少なくとも約5%、少なくとも約10%、少なくとも約20%、少なくとも約30%、少なくとも約40%、少なくとも約50%、少なくとも約60%、少なくとも約70%、少なくとも約80%、少なくとも約85%、少なくとも約90%、少なくとも約95%、または前記の値の任意の2つを境界とする範囲で含む界面活性剤または洗剤組成物を製造することができる。そのような界面活性剤または洗剤組成物は、非微生物源由来のマイクロエマルションまたは界面活性剤または洗剤などの少なくとも1つの添加物も含むことができ、それらは脂肪アルコールとの重量比で少なくとも約5%、少なくとも約10%、少なくとも約15%、少なくとも約20%、少なくとも約30%、少なくとも約40%、少なくとも約50%、少なくとも約60%、少なくとも約70%、少なくとも約80%、少なくとも約85%、少なくとも約90%、少なくとも約95%または前記の値のいずれか2つを境界とする範囲の量で存在しうる。エステルには多くの商業的用途がある。例えば、代替燃料の1つであるバイオディーゼル油は、エステル(例えば、脂肪酸メチルエステル、脂肪酸エチルエステルなど)で構成される。ある種の低分子量エステルは心地よい香りの揮発性物質であり、そのため芳香剤または香味剤として有用である。加えて、エステルは、ラッカー、塗料およびワニス用の溶媒としても用いられる。その上、蝋、脂肪および油といった天然物にも、エステルで構成されるものがある。エステルはまた、樹脂およびプラスチック中の柔軟剤および可塑剤、難燃剤、ならびにガソリンおよび油中の添加物としても用いられる。加えて、エステルは、ポリマー、フィルム、繊維、染料および医薬品の製造にも用いることができる。炭化水素には多くの商業的用途がある。例えば、比較的短鎖のアルカンは燃料として用いられる。より長鎖のアルカン(例えば、炭素が5〜16個)は、輸送燃料(例えば、ガソリン、ディーゼル油、または航空燃料)として用いられる。16個を上回る炭素原子を有するアルカンは、燃料油および潤滑油の重要な構成成分である。室温では固体であるさらに長いアルカンは、例えば、パラフィン蝋として用いることができる。加えて、より長鎖のアルカンを分解して、商業的に有用な短鎖炭化水素を製造することもできる。短鎖アルカンと同様に、短鎖アルケンも輸送燃料に用いられる。より長鎖のアルケンは、プラスチック、潤滑剤および合成潤滑剤に用いられる。加えて、アルケンは、アルコール、エステル、可塑剤、界面活性剤、第三級アミン、石油増進回収剤、脂肪酸、チオール、アルケニルコハク酸無水物、エポキシド、塩素化アルカン、塩素化アルケン、蝋、燃料添加物、および牽引流低減剤を産生するための原料としても用いられる。ケトンは、溶媒として商業的に用いられる。例えば、アセトンは溶媒としてよく用いられるが、ポリマーを製造するための原料でもある。ケトンはまた、ラッカー、塗料、爆薬、香料、および繊維の加工にも用いられる。さらに、ケトンは、アルコール、アルケン、アルカン、イミン、およびエナミンを製造するのにも用いられる。潤滑剤は、典型的には、オレフィン、特にポリオレフィンおよびα-オレフィンで構成される。潤滑剤は、原油から精製することができ、または原油から精製された原料を用いて製造することもできる。原油からこれらの特殊化学品を得るには、莫大な金融投資ならびに大量のエネルギーを必要とする。それはまた、多くの場合、より小さいモノマーを産生するために原油中の長鎖炭化水素が分解されることから、非効率な工程でもある。続いて、これらのモノマーは、より複雑な特殊化学品を製造するための原料として用いられる。以下の実施例によって、本開示をさらに例示する。これらの実施例は例示の目的で提示されるのにすぎない。決して、これらの実施例を、本開示の範囲または内容を限定するものと解釈してはならない。
産生宿主の改変‐アシル-CoAデヒドロゲナーゼの減弱化
本実施例では、脂肪酸分解酵素の発現が減弱化されている、遺伝子操作された宿主細胞の構築について述べる。
プラスミド:pDG109、pLC56およびpV171.1は、carBおよびtesAのさまざまな発現を伴うpCL_PtrccarB_tesA_alrA_fabB_fadRオペロンである。iFAB138はSEQ ID NO:19である。
脂肪酸合成経路を経由する流れの増大‐アセチルCoAカルボキシラーゼ媒介性
脂肪エステル産生:
脂肪酸生合成のための主な前駆体はマロニル-CoAおよびアセチル-CoAである(図1)。これらの前駆体は大腸菌における脂肪酸生合成の速度を制限することが示唆されている。本実施例では、合成accオペロン[コリネバクテリウム・グルタミクム(Corynebacterium glutamicum)accABCD(±birA)]を過剰発現させ、この遺伝子改変が、大腸菌におけるアセチル-coAおよびマロニル-CoAの産生の増大をもたらした。1つのアプローチでは、マロニル-CoAレベルを上昇させる目的で、コリネバクテリウム・グルタミクム(C.グルタミクム)由来のアセチル-CoAカルボキシラーゼ酵素複合体を大腸菌で過剰発現させた。アセチル-CoAカルボキシラーゼ(acc)は、4つの別個のサブユニット、accA、accB、accCおよびaccDからなる(図3)。C.グルタミクムaccの利点は、2つのサブユニットが、融合タンパク質accCBおよびaccDAとしてそれぞれ発現されることであり、これにより、その均衡のとれた発現が容易になる。さらに、accBサブユニットをビオチン化するC.グルタミクムbirA(図3)も過剰発現させた。例示的なC.グルタミクムbirA DNA配列は、SEQ ID NO:55およびSEQ ID NO:56として提示されている。C.グルタミクムbirAタンパク質配列はSEQ ID NO:57として提示されている。
0.06g/L リボフラビン
6g/L ナイアシン
5.4g/L パントテン酸
1.4g/L ピリドキシン
0.06g/L ビオチン
0.01g/L 葉酸
1000倍濃縮した微量金属溶液
2mL/L 濃塩酸
0.5g/L ホウ酸
1.9g/L 硫酸銅、五水和物、USP
1g/L 無水塩化亜鉛
2g/L モリブデン酸ナトリウム(sodium molybdenate)脱水物
2g/L 塩化カルシウム脱水物
アセチル-CoAカルボキシラーゼ酵素複合体の共発現が脂肪アルコールの産生に及ぼす影響を、シネココッカス・エロンガタス由来のアシル-ACPレダクターゼ(AAR)(SEQ ID NO:38)を、大腸菌DV2におけるacc遺伝子とともに、またはそれを伴わずに発現させることによって評価した。accD+オペロンの構成を選んだのは、エステルシンターゼと共発現させた時に最も優れた結果が得られたためである(前出の例を参照)。Infusion技術(Clontech Laboratories, Inc., Mountain View, CA)を用いて、accDABC-birAオペロンをpLS9-185(pCL1920誘導体)中のaar遺伝子の下流にクローニングした。その結果得られたプラスミドを大腸菌DV2に形質転換導入し、対応する形質転換体を、100mg/Lのスペクチノマイシンを加えたLBプレート上で選択した。産生された脂肪アルコールを図11に示している。AARとaccD+との共発現により、AARのみの対照(pLS9-185)と比較して、脂肪アルコール力価のおよそ1.5倍の増大が導かれた。このデータには再現性があった(三重反復試験試料を示した)。これらの結果は、マロニル-CoAレベルを増大させることにより、このアシル-ACPレダクターゼを用いた場合に脂肪酸産生の改善が導かれることを実証している。加えて、実施例3では、acc遺伝子とfabオペロン全体との共発現について述べる。
脂肪酸合成経路を経由する流れの増大‐iFAB
脂肪酸誘導体の産生:
組換え宿主細胞における脂肪酸合成経路を経由する流れを増大させるための戦略には、大腸菌における、天然大腸菌脂肪酸生合成遺伝子の過剰発現および異なる生物由来の外因性脂肪酸生合成遺伝子の発現の両方が含まれる。本研究では、異なる生物由来の脂肪酸生合成遺伝子を、大腸菌DV2のゲノム中で組み合わせ(表3)、lacUV5プロモーターの制御下に置き、IS5-11部位に組み込んだ。iFAB 130〜145を含む16種の菌株を評価した。iFAB 130〜145の詳細な構造は表4および5に提示されている。
プラスミドpCL_Ptrc_tesAを菌株のそれぞれに形質転換導入し、FA2培地中での発酵を、導入から集菌まで20時間かけて32℃および37℃の両方で行った。二重反復プレートスクリーニングによる総脂肪種の産生に関するデータを図12Aおよび12Bに示している。このスクリーニングにより、最も優れた構築物はiFAB 138を伴うDV2であると判定された。EG149のゲノム中でのiFAB138の配列は、SEQ ID NO:19として提示されている。
完全合成fabオペロンを大腸菌染色体に組み込み、大腸菌DAM1 pDS57における発現によるFAME産生の増加に関して評価した。加えて、コリネバクテリウム・グルタミクム由来の4種の合成accオペロンを共発現させて、FAME産生能の改善に関して評価した。FAMEをより高い速度かつより高い力価で産生するいくつかの菌株が得られた。16種類のiFABオペロン(表5)をlacUV5プロモーターの制御下に置き、大腸菌DAM1のIS5-11部位に組み込んだ。これらの菌株をDAM1 ifab130〜145と命名した。それらに、FAME産生の評価のために、pDS57(エステルシンターゼ377を含む)または異なる型のaccオペロンを共発現するpDS57(上記参照)による形質転換を行った。例示的なプラスミドは表6に記載されている。
pDS57=pCL_ptrc-ES9
組換え宿主細胞における脂肪酸合成経路を経由する流れを増大させるための戦略には、天然脂肪酸生合成遺伝子の過剰発現および異種脂肪酸生合成遺伝子の発現の両方が含まれる。FabHおよびfabIは、フィードバック阻害されることが示されている2つの脂肪酸生合成酵素である(Heath and Rock, JBC 271 : 1833-1836 (1996))。FabHおよびFabIがFAME産生の速度を律するか否かを明らかにするための研究を実施した。FabH相同体およびfabI相同体(大腸菌、枯草菌、アシネトバクター・バイリイADP1、マリノバクター・アクアエオレイVT8、およびロドコッカス・オパクスに由来)を、大腸菌DAM1 pDS57(優れたFAME産生株であることが観察されている菌株)において合成オペロンとして過剰発現させて評価した。1つのアプローチでは、蝋(A.バイリイ、M.アクアエオレイ)またはトリアシルグリセリド(R.オパクス)を蓄積する生物からfabHfabIオペロンを構築し、大腸菌DAM1 pDS57の染色体に組み込んだ。1つの関連したアプローチでは、C.グルタミクム由来の合成accオペロンを共発現させた(上記の実施例2に記載した通り)。表7にまとめたように、11種類のfabHIオペロンを構築した(アセンブリはインビトロで行った)。fabHIオペロンをIPTG誘導性lacUV5プロモーターの制御下に置き、大腸菌DAM1のIS5-11部位に組み込んだ。これらの菌株を、以下の表に示すように命名した。それらに、FAME産生の評価のために、pDS57(エステルシンターゼ377を含む)または異なる型のaccオペロンを共発現するpDS57による形質転換を行った。
iFAB138のlacUV5プロモーターを、iFAB138のより高いレベルでの発現を導くT5プロモーター(SEQ ID NO:2)に置き換え、そのことはmRNA分析によって確かめられた。T5プロモーターからのiFAB138の発現は、脂肪エステルのより高い力価、収量および産生能をもたらした。菌株shu.002(表3)は、iFAB138オペロンの発現を制御するT5プロモーター(SEQ ID NO:19)を含む点を除き、菌株BD64(表3)の同質遺伝子である。
rphおよびilvGの突然変異を修復することによって、遊離脂肪酸(FFA)生成物の量を増加させる
この菌株においてilvGおよびrph突然変異を修復した結果、FFAがより多く産生された。菌株EG149およびV668(表3)を、pCL_Ptrc_tesAで形質転換した。FA2培地中での発酵を32℃で40時間行って、pCL_Ptrc_tesAを有する菌株EG149およびV668のFFA産生を比較した。rphおよびilvG突然変異の修復は、pCL_Ptrc_tesAを有する基準菌株と比べてFFA産生の116%の増加をもたらした。図17に見られるように、V668/pCL_Ptrc_tesAは、EG149/pCL_Ptrc_tesA対照よりも多くのFFAを産生した。FFAはLS9生成物の前駆体であるため、FFA産生の増加は、新たな菌株がLS9生成物をより高レベルで産生しうることの優れた指標となる。
トランスポゾン突然変異誘発による脂肪酸誘導体産生の増大‐yijP
脂肪アルコール産生:
大腸菌による脂肪アルコールの産生の力価、収量、産生能を改善するために、トランスポゾン突然変異誘発およびハイスループットスクリーニングを実施し、有益な突然変異のシークエンシングを行った。yijP菌株におけるトランスポゾン挿入は、振盪フラスコ発酵および流加発酵のいずれにおいても、該菌株の脂肪アルコール収量を改善することが示された。SL313菌株は脂肪アルコールを産生する。この菌株の遺伝子型を表3に提示している。続いて、脂肪アルコールの産生を測定するために、トランスポゾンクローンをハイスループットスクリーニングに供した。手短に述べると、コロニーを選び取り、LBを含有するディープウェルプレートに入れて、終夜増殖させ、新たなLBに播種して、3時間増殖させ、新たなFA2.1培地に播種して、16時間増殖させ、続いて酢酸ブチルを用いて抽出した。粗抽出物をBSTFA(N,O-ビス[トリメチルシリル]トリフルオロアセトアミド)で誘導体化した後に、GC/FIDを用いて分析した。pDG109プラスミドの選択を維持するために、すべての培地にスペクチノマイシン(100mg/L)を含めた。対照菌株SL313と同程度に総脂肪種を産生するが対照よりも脂肪アルコール種のパーセンテージが高くかつ遊離脂肪酸のパーセンテージが低いクローンを選ぶことにより、ヒットを選択した。菌株68F11がヒットとして同定され、これを、FA2.1培地を用いる振盪フラスコ発酵で検証した。トランスポゾンヒット68F11と対照菌株SL313との比較により、68F11は対照よりも高いパーセンテージで脂肪アルコール種を産生する一方で、両方の菌株とも総脂肪種は同程度の力価で産生することが示された。LC535と名付けられたヒット68F11の単一コロニーについて、トランスポゾン挿入の場所を同定するためにシークエンシングを行った。手短に述べると、キットZR Fungal/Bacterial DNA MiniPrep(商標)(Zymo Research Corporation, Irvine, CA)を製造元の説明書に従って用いて、10mLの終夜LB培養物からゲノムDNAを精製した。精製されたゲノムDNAのシークエンシングを、トランスポゾンの内部にあるプライマーを用いて、トランスポゾンから外側に向かって行った:
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タンクでの脂肪酸および脂肪酸誘導体の産生について評価するために、所望の菌株のグリセロールバイアルを用いて振盪フラスコ内の20mL LB+スペクチノマイシンに播種し、32℃でおよそ6時間培養した。4mLのLB培養物を用いて125mLの低PFA播種培地(以下)に播種し、これを続いて32℃の振盪機にて終夜培養した。50mLの終夜培養物を用いて1Lのタンク培地に播種した。タンクを、pH 7.2および30.5℃でpH固定条件下、最大供給速度16g/L/hr グルコースで動作させた。
脂肪酸合成経路を経由する流れの増大‐アシルキャリアータンパク質(ACP)により媒介される脂肪アルコール産生
大腸菌以外の供給源に由来する末端経路酵素を異種宿主としての大腸菌において発現させて、脂肪アシル-ACPを生成物に変換させる場合には、組換え経路酵素の大腸菌脂肪アシル-ACPに対する認識、親和性および/または代謝回転の点で制約が存在する可能性がある。ACPタンパク質はあらゆる生物を通じてある程度は保存されているものの、それらの一次配列は大きく異なる可能性があることに留意されたい。この仮説を検証するために、いくつかのシアノバクテリウム由来のacp遺伝子を、pCL1920誘導体であるpLS9-185に存在するシネココッカス・エロンガタスPCC7942アシル-ACPレダクターゼ(AAR)の下流にクローニングした。加えて、広い基質特異性を有するホスホパンテテイニルトランスフェラーゼをコードする枯草菌由来のsfp遺伝子(アクセッション番号X63158;SEQ ID NO:53)も、各々のacp遺伝子の下流にクローニングした。この酵素は、活性のないapo-ACPの、活性のあるholo-ACPへの変換に関与する。構築したプラスミドは表12に記載されている。
ACPの過剰発現が遊離脂肪酸の産生も増加させうるか否かを評価するために、sfpを伴う1つのシアノバクテリウムACP遺伝子をpDS171s(表12)から増幅させて、pCLベクター中の'tesAの下流にクローニングした。その結果得られたオペロンはPtrc3プロモーターの制御下に置かれており、そのためにPtrc野生型プロモーターよりも幾分低い転写レベルがもたらされる。構築物を大腸菌DV2中にクローニングし、脂肪酸産生に関して評価した。対照菌株には、シアノバクテリウムACPおよび枯草菌sfpを含まない同一のプラスミドを含有させた。標準的なマイクロタイタープレート発酵実験による結果を図20に示している。異種ACPを共発現する菌株において脂肪酸力価の有意な改善が観察され、このことは、このケースではおそらく脂肪酸生合成経路を経由する流れが増大することによって、ACP過剰発現が脂肪アルコールの産生に有益となりうることを実証している。
Claims (51)
- 3-ヒドロキシデカノイル-[acp]デヒドラターゼ(E.C. 4.2.1.60)活性;β-ケトアシル-ACPシンターゼI(E.C. 2.3.1.41)活性;β-ケトアシル-ACPシンターゼII(E.C. 2.3.1.179)活性;[acp]S-マロニルトランスフェラーゼ{マロニル-CoA-ACPトランスアシラーゼ}(E.C. 2.3.1.39)活性;3-オキソアシル-{β-ケトアシル}-ACPレダクターゼ(E.C. 1.1.1.100)活性;β-ケトアシル-ACPシンターゼIII(E.C. 2.3.1.180)活性;エノイル-ACPレダクターゼ(NADH)(E.C. 1.3.1.9)活性;エノイル-ACPレダクターゼ(NADPH)(E.C. 1.3.1.10)活性;3-ヒドロキシ-アシル-[acp]デヒドラターゼ(E.C. 4.2.1.59)活性;およびtrans-2,cis-3-デセノイル-ACPイソメラーゼ(E.C. 5.3.3.14)活性からなる群より選択される活性を有する1つまたは複数のポリペプチドをコードする遺伝子操作されたポリヌクレオチド配列を含む組換え宿主細胞であって、炭素源を含有する培地中で、該ポリヌクレオチドを発現するのに有効な条件下で培養された場合に、対応する野生型宿主細胞よりも高い力価、収量または産生能で脂肪酸誘導体組成物を産生する、組換え宿主細胞。
- 前記ポリペプチドが前記活性を有する少なくとも1つの他のポリペプチドと組み合わせて発現された場合に、脂肪酸誘導体組成物をより高い力価、収量または産生能で産生する、請求項1記載の組換え宿主細胞。
- 前記ポリペプチドが前記活性を有する少なくとも5種の他のポリペプチドと組み合わせて発現された場合に、脂肪酸誘導体組成物をより高い力価、収量または産生能で産生する、請求項1記載の組換え宿主細胞。
- trans-2,cis-3-デセノイル-ACPイソメラーゼ活性がfabAまたはfabMである、請求項1記載の組換え宿主細胞。
- β-ケトアシル-ACPシンターゼIIがfabFである、請求項1記載の組換え宿主細胞。
- マロニル-CoA-ACPトランスアシラーゼがfabDである、請求項1記載の組換え宿主細胞。
- β-ケトアシル-ACPシンターゼIがfabFまたはfabBである、請求項1記載の組換え宿主細胞。
- β-ケトアシル-ACPレダクターゼがfabGである、請求項1記載の組換え宿主細胞。
- β-ケトアシル-ACPシンターゼIIIがfabHである、請求項1記載の組換え宿主細胞。
- エノイル-ACPレダクターゼがfabIまたはfabLまたはfabVまたはfabKである、請求項1記載の組換え宿主細胞。
- 3-ヒドロキシ-アシル-[acp]デヒドラターゼがfabAまたはfabZである、請求項1記載の組換え宿主細胞。
- trans-2-エノイル-ACPレダクターゼIIがfabKである、請求項1記載の組換え宿主細胞。
- 前記ポリペプチドが、fabA、fabB、fabD、fabF、fabG、fabH、fabI、fabL、fabV、fabZ、fabM、およびfabKからなる群より選択される、請求項1記載の組換え宿主細胞。
- 前記ポリペプチドが、ネズミチフス菌(Salmonella typhimurium)由来のFabA(NP_460041);大腸菌(Escherichia coli)由来のFabB(NP_416826);ネズミチフス菌由来のFabD(NP_460164);ネズミチフス菌由来のFabG(NP_460165);ネズミチフス菌由来のFabH(NP_460163);ネズミチフス菌由来のFabZ(NP_459232);ストレプトコッカス・ミュータンス(Streptococcus mutans)由来のFabM(AAN59379);肺炎球菌(Streptococcus pneumoniae)由来のFabK(AAF98273);コレラ菌(Vibrio cholera)由来のFabV(YP_001217283);クロストリジウム・アセトブチリカム(Clostridium acetobutylicum)由来のFabF(NP_350156);枯草菌亜種サブチリス168株(Bacillus subtillis subsp. subtilis str. 168)由来のFabI(NP_389054);枯草菌亜種サブチリス168株由来のFabL(NP_388745);アシネトバクター属種ADP1(Acinetobacter sp. ADP1)由来のFabI(YP_047630);マリノバクター・アクアエオレイVT8(Marinobacter aquaeoli VT8)由来のFabI(YP_958813);ロドコッカス・オパクスB4(Rhodococcus opacus B4)由来のFabI(YP_002784194);アシネトバクター属種ADP1由来のFabH(YP_046731);マリノバクター・アクアエオレイVT8由来のFabH(YP_958649);およびロドコッカス・オパクスB4由来のFabH(YP_00278448)からなる群より選択される、請求項1記載の組換え宿主細胞。
- 前記遺伝子操作されたポリヌクレオチド配列によってコードされる前記ポリペプチドが外来性である、請求項1記載の組換え宿主細胞。
- アシルキャリアータンパク質(ACP)をコードする遺伝子操作されたポリヌクレオチド配列をさらに含む、請求項1記載の組換え宿主細胞。
- ACPが前記力価、収量または産生能をさらに増大させる、請求項16記載の組換え宿主細胞。
- ACPポリペプチドをコードする遺伝子操作されたポリヌクレオチド配列を含む組換え宿主細胞であって、炭素源を含有する培地中で、該ACPポリペプチドを発現するのに有効な条件下で培養された場合に、対応する野生型宿主細胞よりも高い力価、収量または産生能で脂肪酸誘導体組成物を産生する、組換え宿主細胞。
- ホスホパンテテイニルトランスフェラーゼ(E.C. 2.7.8.7)活性を有するポリペプチドをコードする組換えポリヌクレオチドをさらに含む、請求項18記載の組換え宿主細胞。
- 前記ポリヌクレオチドがsfp遺伝子をコードする、請求項19記載の組換え宿主細胞。
- accABCD活性(E.C. 6.4.1.2)を有するポリペプチドをコードする組換えポリヌクレオチドをさらに含む、請求項1または18記載の組換え宿主細胞。
- ACPが、前記組換え宿主細胞において発現される末端経路酵素(terminal pathway enzyme)と同じ生物に由来する、請求項1または18記載の組換え宿主細胞。
- ACPが外来性である、請求項18記載の組換え宿主細胞。
- トランスポゾンを含む遺伝子操作されたポリヌクレオチド配列を含む組換え宿主細胞であって、yijP遺伝子への該トランスポゾンの挿入が、該yijP遺伝子に隣接する第2の遺伝子に影響を及ぼし、該第2の遺伝子が、アップレギュレートまたはダウンレギュレートされるポリヌクレオチドをコードし、かつ、該アップレギュレートまたはダウンレギュレートされるポリヌクレオチドが、炭素源を含有する培地中で、該ポリペプチドを発現させるのに有効な条件下で該宿主細胞を培養した場合に、脂肪酸誘導体組成物の産生に影響を及ぼすポリペプチドをコードする、組換え宿主細胞。
- yijP遺伝子への前記トランスポゾンの挿入が前記yijP遺伝子またはそのポリヌクレオチドの不活性化をもたらし、これにより該yijP遺伝子に隣接する第2の遺伝子が影響を受け、該第2の遺伝子が、炭素源を含有する培地中で、該ポリペプチドを発現させるのに有効な条件下で前記宿主細胞を培養した場合に、脂肪酸誘導体組成物の産生に影響を及ぼすポリペプチドをコードする、請求項24記載の組換え宿主細胞。
- 第2の遺伝子またはそのポリヌクレオチドが、ppc、yijO、frwD、pflC、pflDまたはargEからなる群より選択される、請求項24記載の組換え宿主細胞。
- ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ(ppc)ポリペプチドをコードする遺伝子操作されたポリヌクレオチド配列を含む組換え宿主細胞であって、炭素源を含有する培地中で、該ppcポリペプチドを発現するのに有効な条件下で培養された場合に、対応する野生型宿主細胞よりも高い力価、収量または産生能で脂肪酸誘導体組成物を産生する、組換え宿主細胞。
- 請求項1〜27のいずれか一項記載の組換え宿主細胞を含む、細胞培養物。
- 前記培地が脂肪酸誘導体組成物を含む、請求項28記載の細胞培養物。
- 前記脂肪酸誘導体組成物が、脂肪酸、脂肪エステル、脂肪アルコール、脂肪アルデヒド、アルカン、末端オレフィン、内部オレフィン、およびケトンからなる群より選択される少なくとも1つの脂肪酸誘導体を含む、請求項29記載の細胞培養物。
- 前記脂肪酸誘導体が、C6、C8、C10、C12、C13、C14、C15、C16、C17、またはC18脂肪酸誘導体である、請求項28記載の細胞培養物。
- 前記脂肪酸誘導体が、C10:1、C12:1、C14:1、C16:1、またはC18:1不飽和脂肪酸誘導体である、請求項28記載の細胞培養物。
- 前記脂肪酸誘導体組成物が、C8、C10、C12、C14、C16および、C18脂肪酸誘導体のうち1つまたは複数を含む、請求項29記載の細胞培養物。
- 前記脂肪酸誘導体組成物が脂肪酸を含む、請求項29記載の細胞培養物。
- 前記脂肪酸誘導体組成物が脂肪アルデヒドを含む、請求項29記載の細胞培養物。
- 前記脂肪酸誘導体組成物が脂肪アルコールを含む、請求項29記載の細胞培養物。
- 前記脂肪酸誘導体組成物が脂肪エステルを含む、請求項29記載の細胞培養物。
- 前記脂肪酸誘導体組成物がアルカンを含む、請求項29記載の細胞培養物。
- 前記脂肪酸誘導体組成物が末端オレフィンを含む、請求項29記載の細胞培養物。
- 前記脂肪酸誘導体組成物が内部オレフィンを含む、請求項29記載の細胞培養物。
- 前記脂肪酸誘導体組成物がケトンを含む、請求項29記載の細胞培養物。
- 前記脂肪酸誘導体組成物が、前記脂肪アルコールの還元末端からC7〜C8の間の炭素鎖における7番目の位置に二重結合を有する脂肪酸誘導体を含む、請求項29記載の細胞培養物。
- 前記脂肪酸誘導体組成物が不飽和脂肪酸誘導体を含む、請求項29記載の細胞培養物。
- 前記脂肪酸誘導体組成物が飽和脂肪酸誘導体を含む、請求項29記載の細胞培養物。
- 前記脂肪酸誘導体組成物が分枝鎖脂肪酸誘導体を含む、請求項29記載の細胞培養物。
- 前記組換え宿主細胞が、該組換え宿主細胞と同じ条件下で培養された場合の対応する野生型宿主細胞の力価よりも少なくとも約5%高い力価を有する、請求項28記載の細胞培養物。
- 前記組換え宿主細胞が約1g/L〜約250g/Lの力価を有する、請求項46記載の細胞培養物。
- 前記組換え宿主細胞が約90g/L〜約120g/Lの力価を有する、請求項47記載の細胞培養物。
- 前記組換え宿主細胞が少なくとも約10%〜約40%の収量を有する、請求項28記載の細胞培養物。
- 約25%の収量を有する、請求項49記載の組換え宿主細胞。
- 産生能が約0.7mg/L/hr〜約3g/L/hrの範囲にわたる、請求項28記載の細胞培養物。
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- 2023-06-29 US US18/344,219 patent/US20240150774A1/en active Pending
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