JP2017534890A - 分光蛍光光度計のセルホルダー用のアダプター - Google Patents
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Abstract
標準的なセルホルダーを備えかつ複数の励起チャネルを有する通常の水平光線分光蛍光光度計においてマイクロセルの表面からの蛍光検出を可能にする、分光蛍光光度計中のセルホルダー用の分光蛍光分析用アダプター、および分光蛍光分析方法が、本明細書において開示される。
Description
関連特許出願の相互参照
本出願は、2015年6月30日出願の米国仮出願第62/186,449号および2014年11月13日出願の米国仮特許出願第62/079,273号の米国特許法119条(e)項に基づく優先権の恩典を主張し、その内容は全体として参照により本明細書に組み入れられる。
本出願は、2015年6月30日出願の米国仮出願第62/186,449号および2014年11月13日出願の米国仮特許出願第62/079,273号の米国特許法119条(e)項に基づく優先権の恩典を主張し、その内容は全体として参照により本明細書に組み入れられる。
本発明の分野は分光蛍光分析に関する。特に、本発明の分野は、分光蛍光光度計のセルホルダー用のアダプターに関し、ここで、アダプターは、マイクロセルをセルホルダーに保持し位置づけるように構成されている。
蛍光分光法は、タンパク質、代謝産物、およびシグナル伝達分子などの生物学的に重要な分子を検出するための最も高感度の方法の1つである。蛍光分光法においては、光子が励起プロセスにおいて分子に衝突し、励起プロセスでは、光子のエネルギーが蛍光を通じて分子により吸収および再放出されうる。多くの場合、発光光子の波長は、異なる色の蛍光として現れる励起光子の波長よりも著しく長い。例えば、青色光による励起は緑色蛍光を生じさせうる。この現象は蛍光発光可能な分子(すなわち「フルオロフォア」)の高感度検出を可能にする。というのも、蛍光発光の波長に基づいて発光光をバックグラウンド散乱励起光と容易に識別することができるからである。蛍光測定は多くの実験室アッセイおよび臨床アッセイにおいて広範に使用されている。蛍光検出用機器は、特定の分析専用の小型ベンチトップ装置から、試料中の複数のフルオロフォアの検出および複数のフルオロフォアの特性の分析を可能にする大型多用途設定までに及ぶ。
通常、蛍光測定は溶液中で行われる。通常の蛍光測定では、液体試料を石英セルまたはガラスセルに配置した後、セルを蛍光光度計のセルホルダーに配置する。次に励起源からの光線を側壁を通じて石英セルまたはガラスセル中に向けることで、セル内の蛍光を発する液体試料を照射する。蛍光は、ほぼ同等にすべての方向に発光され、一般的には、液体試料を照射する際に反射および散乱しうる励起光よりもはるかに弱い。したがって、正確な蛍光測定値を得るには、励起源の反射光および散乱光から蛍光信号を分離することが重要である。
最善の分離を実現するために、高感度分光蛍光光度計の最も一般的な設計は、励起光線の方向に対して90°の角度での蛍光の検出を包含する(図1参照)。図1Aに示すように、励起光線6は励起開口部8を通じて励起スクリーン9aに入射し、セル2の照射区域4と接触する。セル2に収容された試料溶液16中のフルオロフォアは励起されて蛍光14を発光し、蛍光は、検出器に向けて発光スクリーン9b中の発光開口部12を通過する際にセル2の観察区域10を通じて検出される。図1に示すように、散乱光の関与を減少させるために、通常は励起光または励起光線6を、細長い長方形または直線状の励起開口部8を有する励起スクリーン9aを使用して「トリミング」する。このスクリーンは、励起光線6がセル4の中央区域のみを照射することを可能にし、励起光線6がセル2の角部を照射することを防止する。同じ技術が蛍光を検出するためにも使用され、ここで、細長い長方形または直線状の励起開口部12を有する発光スクリーン9bは、発光光線14が観察区域10としてのセル2の中央から出射して検出のために検出器の発光チャネルに入射することを可能にする。結果として、蛍光信号は、「使用体積(working volume)」と呼ばれる試料セルの中央からのみ検出され(図1B参照)、これにより、セル壁面から生じるあらゆる光(蛍光または散乱)の検出が回避される。図1Bに示すように、励起光6が励起開口部を通じてセルホルダー11に入射する際に、試料溶液16の「使用体積」18が励起光と接触する。使用体積からの蛍光発光14はセルホルダー11中の発光開口部のみ通過可能である。可溶性分子からの蛍光を測定するためのこのアプローチは、大多数の市販の高感度分光蛍光光度計において利用されている。
高い光学濃度および試料濁度に起因して、蛍光を検出する上での難題が生じうる。例えば、励起光がセルの中央の「使用体積」に到達し得る前に該溶液がすべての励起光を吸収するほど溶液中のフルオロフォアの濃度が高くなる場合に、高い光学濃度に関する難題が生じることがあり、この現象は「内部フィルタリング効果」と呼ばれる。同じ困難は、懸濁粒子による試料中の混濁により励起光線が遮断される際に生じうる。これらの状況において蛍光の観察を可能にするために、従来型の回避策は、セルの前面を照射すること、および同表面を発光チャネルに露出することを包含する。この回避策は、発光信号が反射および散乱励起光線と識別可能であることを条件として、セル内壁近傍の溶液の部分からの蛍光信号の収集を可能にする。
近年、いくつかの研究は、ガラス表面上で吸収された分子構造(例えばリン脂質二重層)を調査するために、溶液-ガラス界面からの蛍光の観察に重点を置いている。これらの試験の大部分は水平ガラススライドを使用して行われており、ここでは、溶液滴がスライドの上部に配置され、観察がスライドの下部から蛍光顕微鏡を使用して行われる。この設定の利点は、表面の詳細に関するその顕微鏡レベルの分解能にある。しかし、この設定の欠点は、標準的な蛍光顕微鏡の限界による、蛍光強度の測定精度の低さ、ならびに、一般的には、励起チャネルおよび発光チャネルのスペクトル分解能の欠如である。蛍光顕微鏡とより精巧な多波長励起チャネルおよび発光チャネルとを組み合わせることは可能であるが、これは日常的な種類の蛍光顕微鏡ではなく、構築するには極めて高価である。
標準的な水平光線分光蛍光光度計を使用しての試料セルのガラス内面上で吸収された分子層の観察を可能にするための1つの市販の解決策は、高い光学濃度および/または濁度を有する試料の測定向けに本来設計された三角形セルの使用を包含する(図2参照)。そのようなセルはStarna Cells Inc.などの光学セル製造業者により提供される(図3参照)。
しかし、現在製造されているすべてのセルは、励起チャネルに対して45度の角度に配向した前面を有しており、これにより、高感度発光チャネル中への励起光線の強力な直接反射が作り出されて、測定の信号対雑音比が事実上消滅する。したがって、これらの三角形セルは、分子層の観察には利用されず、蛍光信号が相対的に高い強度を有する際の混濁溶液の分析にのみ使用される。
励起チャネルに対して45度ではない角度を有する非従来型のセルは市販されていないが、そのような非従来型のセルを設計することができた。しかし、そのような非従来型のセルを使用する上でのさらなる問題が、励起光線に対して45度ではない角度によってセルが非対称になり、したがってセルが、セルの1つの特定側面から入射する励起光線によってしか使用できないという事実により生じる。このことが問題であるのは、多くの市販の分光蛍光光度計が、対向する両側面からセルを照射する2つの励起チャネルを有し、例えば、分光蛍光光度計が、定常状態光源を備えた左側チャネルと、時間領域測定用のパルス光源を備えた右側チャネルとを有するからである。したがって、45度ではない角度を有する非従来型のセルを使用して同じ分子試料に対して定常状態測定および時間領域測定を行うことは不可能である。この状況では、ユーザーは、それぞれ特定方向の励起光向けに2つのセルを作製し、2つのセル中で2つの同一の試料を作り出す必要があり、これにより研究設計が複雑になり、コストが増加する。
生化学研究における光学セルの別の重要な要件は、通常の測定において試料量がわずかなことがあるという事実により生じる。したがって、試料の容量がマイクロリットルの範囲内(例えば100μl未満)となる、いわゆる「マイクロセル」が求められている。1cmセルホルダーを有する分光蛍光光度計中でマイクロセルを利用するために、マイクロセルをセルホルダーの中心に置き、かつ、セル角部を回避しながら試料溶液の中心の照射および観察用の小型開口部を設ける(すなわち照射スクリーンおよび発光スクリーンと同様)、アダプターが設計されている。
したがって、分光蛍光光度計のセルホルダー用の新規マイクロセルアダプターが望ましい。新規アダプターは、マイクロセルの内面で試料の蛍光を検出するために変動可能な位置(例えば変動可能な片側に寄った位置)にマイクロセルを収容および保持し、かつ、対向する両側面から(例えば右側チャネルおよび左側チャネルから)マイクロセルを照射するために複数の励起チャネルを利用する分光蛍光光度計中で同じマイクロセルの使用を可能にすることが好ましい。新規アダプターは、1cmセルホルダーを有する市販の分光蛍光光度計中で、該分光蛍光光度計の改造を必要とせずに使用されるように構成されていることが好ましい。
概要
標準的なセルホルダーを備えかつ複数の励起チャネルを有する通常の水平光線分光蛍光光度計においてマイクロセルの表面からの蛍光検出を可能にする、分光蛍光光度計中のセルホルダー用の分光蛍光分析用アダプター、および分光蛍光分析方法が、本明細書において開示される。
標準的なセルホルダーを備えかつ複数の励起チャネルを有する通常の水平光線分光蛍光光度計においてマイクロセルの表面からの蛍光検出を可能にする、分光蛍光光度計中のセルホルダー用の分光蛍光分析用アダプター、および分光蛍光分析方法が、本明細書において開示される。
本明細書に開示されるアダプターは、分光蛍光光度計のセルホルダー向けに構成されており、ここで、セルホルダーは実質的に正方形または長方形の水平断面を有し、アダプターは、セルホルダーに嵌合するアダプター本体を含む。セルホルダーおよびアダプター本体は、実質的に位置合わせされた中心垂直軸を有する。
アダプター本体は、マイクロセルを収容するための空洞を含み、マイクロセルは、実質的に正方形または長方形の水平断面を有する長方形の角柱である。マイクロセルがアダプター本体の空洞中に位置づけられる際に、マイクロセルの垂直軸がセルホルダーおよびアダプター本体の垂直軸に対してずれていることができるように、かつ/または、セルホルダーおよびアダプター本体に対して、マイクロセルがその垂直軸の周りを水平回転することができるように、マイクロセルは中心垂直軸を有する。したがって、マイクロセルは、励起光線がマイクロセルの前壁および/または後壁と接触して直交方向から発光チャネルにより観察されるように、その垂直軸の周りを回転しかつ/またはセルホルダーおよびアダプター本体の垂直軸に対して水平移動することができる。いくつかの態様では、励起光線は前壁および/または後壁と、90度以外の角度で、かつ、マイクロセルの前壁の中心以外および/または後壁の中心以外の位置で接触しうる。さらなる態様では、マイクロセルは、セルボリュームの中心の代わりにセル壁面の照射および観察を実現するために、セルホルダーに対して水平に片側に寄った位置に、かつ一般的にはオフセンターに配置される。なおさらなる態様では、マイクロセルの軸は、発光光線に対して水平に位置合わせされているが、マイクロセルの発光側面の内壁が励起光線に平行に位置合わせされるように後方に水平移動している。
いくつかの態様では、アダプター本体は、マイクロセルを収容するための下部空洞を有する実質的に正方形または長方形の下部、およびマイクロセルを収容するための上部空洞を有する実質的に正方形または長方形の上部を含む。通常、アダプター本体の下部および上部は、正方形に位置合わせされるように下部および上部を保持する下部と上部との間の少なくとも1つの垂直側面により接続されている。好ましくは、アダプター本体の下部および上部は、90度の角度を形成する2つの隣接する垂直側面であってもよい少なくとも2つの垂直側面により接続されており、ここで2つの垂直側面はアダプター本体の下部と上部との間にあり、アダプター本体の下部および上部を正方形または長方形に位置合わせされるように保持する。通常、アダプター本体の垂直側面は、励起光の入射または発光光の出射を可能にする側面窓を含む。場合によっては、垂直側面は、それを通って励起光線が入射可能または発光信号が出射可能である長方形または直線状の可変スリットを含んだ励起窓スクリーンまたは発光窓スクリーンを収容するための、垂直スリットを含む。
いくつかの態様では、アダプター本体の下部は、インサートを収容するための水平スリットを含み、ここでインサートは挿入された後に、マイクロセルを収容するための下部空洞を閉鎖し、ここでマイクロセルはインサート上に着座し、インサートはマイクロセルがアダプター本体の下部を通過することを防止する。好ましくは、アダプターはセルホルダーにおいて上下を反転させることができ、ここでアダプター本体の上部はアダプター本体の下部と同様に、インサートを収容するためのスリットを含み、これにより、下部空洞を開放しかつ上部空洞を閉鎖するために下部のスリット中のインサートが着脱可能かつ上部のスリットに再配置可能になる。次にアダプターはセルホルダーにおいて上下が反転され得、これにより上部が下部に反転し、下部が上部に反転する。したがって、1つの上下位置において、マイクロセルを保持し、左側励起チャネルからマイクロセルを照射し、発光チャネルにおいて蛍光を読み取るために、アダプターを利用することができる。続いて、マイクロセルをアダプターから取り外すことができ、アダプターを反対の上下位置に反転させることができ(すなわち、アダプター本体の下部にあるインサートを取り外し、インサートをアダプター本体の上部に再配置し、アダプターを反転させることによって)、マイクロセルを反転アダプター中に再配置することができ、マイクロセルを右側の励起チャネルから照射することができ(例えば、左側の励起チャネルを用いた時と同一の、励起光線入射角および励起光線に対する相対位置で)、蛍光を発光チャネルから読み取ることができる。
分光蛍光分析を行うための方法も開示される。本方法は、本明細書に開示されるアダプターを任意的に利用することができる。本明細書において想定される、試料に対して分光蛍光分析を行うための1つの方法は、(a) マイクロセルに試料を配置する段階、(b) 本明細書に開示されるアダプターにマイクロセルを配置する段階、(c) 分光蛍光光度計のセルホルダーにアダプターを配置する段階、および(d) 分光蛍光分析を行う段階を含む。本方法に好適な試料としては、マイクロセルの内面に形成される蛍光脂質二重層を挙げることができ、ここで、分光蛍光分析を行う段階は、マイクロセルの内面で蛍光を検出する段階を含む。
本明細書において想定される、試料に対して分光蛍光分析を行うための別の方法は、(a) マイクロセルに試料を配置する段階、(b) 本明細書に開示される反転させることができるアダプターにマイクロセルを配置する段階、(c) 分光蛍光光度計のセルホルダーにアダプターを配置する段階、(d) 分光蛍光分析を行う段階、(e) アダプターからマイクロセルを取り外す段階、(f) アダプターを反転させる段階、(g) アダプター中にマイクロセルを再配置する段階、および(h) 分光蛍光分析を行う段階を含む。本方法に好適な試料としては、マイクロセルの内面に形成される蛍光脂質二重層を挙げることができ、ここで、分光蛍光分析を行う段階は、マイクロセルの内面で蛍光を検出する段階を含む。
本明細書において想定される、試料に対して分光蛍光分析を行うための別の方法は、(a) 実質的に正方形または長方形の水平断面を有するマイクロセル(すなわち、三角形の水平断面を有するマイクロセルではない)に層状小胞を含む試料を配置し、マイクロセルの内面に支持蛍光脂質二重層を形成する段階、(b) アダプターにマイクロセルを配置する段階、(c) 分光蛍光光度計のセルホルダーにアダプターを配置する段階、(d) マイクロセルの内面にある支持脂質二重層からの蛍光を検出することで分光蛍光分析を行う段階を含む。この方法では、支持脂質二重層は、マイクロセル中に蛍光層状小胞を含む溶液または懸濁液を配置すること、蛍光層状小胞をマイクロセルの内壁と接触させて支持蛍光脂質二重層を形成すること、溶液または懸濁液、およびマイクロセルの内壁に結合しなかった過剰の蛍光層状小胞を、蛍光層状小胞を含まないフラッシング溶液で洗い流すこと、ならびにフラッシング溶液でマイクロセルを再び満たすことにより形成されうる。フラッシングは、フラッシング手順全体の間マイクロセルをフラッシング溶液で満たし続ける様式でフラッシング溶液を導入することで行うことができる。
詳細な説明
開示される主題は、以下に定義の用語を利用してさらに記述することができる。
開示される主題は、以下に定義の用語を利用してさらに記述することができる。
文脈により別途指定または指示しない限り、「a」、「an」、および「the」という用語は「1つまたは複数」を意味する。
本明細書において使用される「約(about)」、「約(approximately)」、「実質的に」、および「有意に」は当業者に理解されるものであり、それらが使用される文脈によってある程度異なる。用語が使用される文脈を考慮して、当業者に不明瞭にその用語が使用される場合、「約(about)」および「約(approximately)」は特定の用語のプラスまたはマイナス10%以下を意味し、「実質的に」および「有意に」は特定の用語のプラスまたはマイナス10%超を意味する。
本明細書において使用される「含む(include)」および「含む(including)」という用語は、「含む(comprise)」および「含む(comprising)」という用語と同一の意味を有する。「含む(comprise)」および「含む(comprising)」という用語は、特許請求の範囲に記載の構成要素に対してさらなる構成要素の包含をさらに許容する「非限定的な」移行語として解釈すべきである。「からなる(consist)」および「からなる(consisting of)」という用語は、特許請求の範囲に記載の構成要素以外のさらなる構成要素の包含を許容しない「限定的な」移行語として解釈すべきである。「から本質的になる(consisting essentially of)」という用語は、部分的に非限定的であって、特許請求される主題の本質を根本的に改変しないさらなる構成要素のみ、その包含を許容するものと解釈すべきである。
本明細書に開示されるアダプターは、通常のセルホルダー(例えば1cmまたは別のサイズのセルホルダー)を有する標準的な水平光線分光蛍光光度計中で、該分光蛍光光度計の改造を必要とせずに使用されるように構成されている。本アダプターは、本アダプターに配置されたマイクロセル中で表面蛍光の観察を可能にするように特別に構成されている。いくつかの態様では、本アダプターは、マイクロセルを収容および保持するための空洞を有するアダプター本体と、励起光の入射および/または発光光の出射を可能にする可変スリットを有する窓スクリーンと、上下を反転させることができるように、本アダプターがアダプター本体の上部に再配置可能な着脱式下部スリットとを含むか、またはそれらからなる。
アダプター本体は、標準的な石英またはガラスマイクロセルを、アダプター本体中の励起窓および発光窓に対してかつセルホルダーに対して選択された角度で位置づける。アダプター本体は、それを通って励起光線が入射可能または発光信号が出射可能である長方形または直線状の可変開口部を含んだ励起窓スクリーンおよび/または発光窓スクリーンを含みうる。長方形または直線状の可変開口部は、励起光線の入射をマイクロセルの選択された表面に限定し、また、発光窓中への励起光の散乱および反射を最小化しながらマイクロセルの照射面の選択された部分の露出を発光窓に限定する。蛍光信号の強度を最大化するために、また、発光窓により捕捉される励起光を減少させるために、本アダプターの本体中のマイクロセルの角度および位置、ならびに長方形または直線状の開口部の幅および位置を調整することができる。
マイクロセルの表面で蛍光の照射および観察を可能にするために、一般にマイクロセルは、セルホルダー中で、入射励起光線に対して、出射発光光線に対して、かつセルホルダーに対して片側に寄ったまたはオフセンターにかつ変動可能な角度で(例えば0度、45度、または90度以外の角度で)位置づけられる。いくつかの態様では、マイクロセルは、入射励起光線に対して、出射発光光線に対して、かつセルホルダーに対して垂直な軸の周りを回転することが検討され得る。この構成は本来的に非対称であり、励起光が常に1つの特定方向から入射することを必要とする。言い換えれば、この構成は、異なる方向に由来する複数の励起チャネルを許容しない。標準的蛍光光度計が、対向する両側面からマイクロセルを照射する2つの独立した励起チャネル(すなわち左側励起および右側励起)を有しうることから、本明細書に開示されるアダプターは「上下を反転させることができる」(すなわち上下逆転する)ように設計されており、第1の励起チャネルでの使用の場合、マイクロセルは本アダプターの一方の上下端に挿入され、第2の励起チャネルでの使用の場合、マイクロセルは本アダプターの反対の上下端に挿入される。反転可能な設計を可能にするために、アダプター本体の下部の水平スリットに配置されたインサートは、着脱可能であり、アダプター本体の上部の水平スリットに再び位置づけ可能である(すなわち、マイクロセルを保持するためにいずれかの端部で「上部」または「下部」を作り出すために、インサートをアダプター本体のいずれかの上下端に位置づけ可能である)。
ここで図面を参照すると、図4は、本明細書において想定されるアダプター15の一態様を示す。上部30aおよび下部30bの2つの水平区分を有するアダプター15が示され、水平区分は、マイクロセル2を保持するための正方形の空洞22を有し(図4Aおよび図4B参照)、励起側面50a、および励起側面50aに対して90度の角度の発光側面50bで垂直に隔てられている。アダプター15は、励起光線6を受け入れるための励起窓38を有する励起側面50aを有し、励起光線はアダプター15内のセル2の一部分と接触する。発光側面50bは発光窓42を有し、発光窓を通じて発光光線14が発光および検出可能になる。
励起光線6に露光されるマイクロセル2の量は、アダプター15の上部区分30a中の垂直スリット26に励起スクリーン40aを挿入することで変動または調整可能である(図4Aおよび図4C参照)。図4Cに示すように、励起スクリーン40aは垂直スリット26内に摺動し、励起窓38の一部分を覆う。励起光線6に露光されるセルの部分は、励起スクリーン40a中の開口部44のサイズを変動させることで変動可能である。アダプター15は、発光スクリーン40bを収容するための上部区分30a中の垂直スリット(図示せず)を含んでもよい。発光光線14の一部分のみが検出器に向けて発光窓42を通過可能になるように、発光スクリーン40bを発光窓42内に摺動させることができる。
図4Bに示すように、マイクロセル2は、アダプター15に対して片側に寄った位置、オフセンターの位置、および/または垂直な軸の周りを回転した位置にアダプターにより保持される。したがって、アダプター15は、正方形のセルホルダー中に配置される際に、マイクロセル2をセルホルダー中で、入射励起光線6に対して、出射発光光線14に対して、かつセルホルダーに対して片側に寄った位置、オフセンターの位置、および/もしくは垂直な軸の周りを回転した位置に、かつ/または変動可能な角度で(例えば0度、45度、もしくは90度以外の角度で)位置づける。
図4Dに示すように、アダプター15は上下を反転させることができうる。図示するように、アダプター15の上部区分30aおよび下部30bは、マイクロセル2がその上に着座しうる摺動インサート70を下部区分に挿入するための、正方形の空洞22を横切る水平スリット60を含みうる。続いて、マイクロセル2を取り外すことができ、アダプター15の上下を反転させることができ、摺動インサート70をアダプター15の下部区分30bに再配置することができ、マイクロセル2をアダプター15の正方形の空洞22中に再配置することができ、ここでマイクロセル2は摺動インサート70に着座する。図4Eは、アダプター15に挿入されたマイクロセル2を有する単一のプロトタイプの2つの異なる図を示す。
本開示のアダプターは、セルホルダー内の任意の選択された位置にマイクロセルを位置づけるように構成されうる。図5は、アダプターの例示的構成、ならびに励起光線および発光光線に対するマイクロセルの位置づけを示す。A. マイクロセル2は回転し、垂直軸がアダプター15(およびセルホルダー)に対してオフセンターである; B. マイクロセル2は回転し、垂直軸がアダプター15(およびセルホルダー)に対してオフセンターである; C. マイクロセル2は発光チャネル14に水平に位置合わせされているが、励起光線6に対して下方に垂直移動し、これにより実質的にマイクロセル2の発光側面のセル内壁が励起光線と平行に位置合わせされる; D. マイクロセル2は回転し、垂直軸がアダプター15(およびセルホルダー)に対してオフセンターである。
本開示のアダプターは、セルホルダー内の任意の選択された位置に長方形のマイクロセルを収容しかつ位置づけるように構成されうる。図6は、長方形のマイクロセル用のアダプターの構成、ならびに励起光線および発光光線に対する該マイクロセルの位置づけの態様を示す。A. マイクロセル2は励起光線6および発光チャネル14に位置合わせされている; B. マイクロセル2は発光チャネル14に水平に位置合わせされているが、励起光線6に対して後方に水平移動し、これにより実質的にマイクロセル2の発光側面のセル内壁が励起光線と平行に位置合わせされる; C. マイクロセル2は垂直軸がアダプター15に位置合わせされているが、アダプター15に対して反時計回りに垂直回転している; D. マイクロセル2は回転し、垂直軸がアダプター15に対してオフセンターである。
本アダプターは、本アダプターがマイクロセルをセルホルダー中で定位置に保持している間にマイクロセルを調整可能に回転させるように構成されうる。図7に示すように、本アダプターは、マイクロセルを挿入するための開口を有する回転板(図7A)と、固定板(図7B)とを含む。回転板は固定板中に配置可能であり(図7C)、固定板はセルホルダーに挿入可能である。アダプターがセルホルダーに位置づけられている間に、挿入されたマイクロセルを回転させ、かつ励起光線および発光光線に対する該マイクロセルの回転配向を変動させるために、本アダプターの回転板を調整可能に回転させることができる(図7D)。
図8: 蛍光光度計セルの内面に形成された支持脂質二重層の共焦点顕微鏡イメージング。(a) 対物レンズに対向するセル内壁を観察するための試料プラットフォーム上の長方形石英セル(3mm光路)。(b) マイクロセルの垂直断面。セル内壁の上方、セル内壁、およびセル内壁の下方(位置I、II、およびIII)のスライスを画像化するために、顕微鏡の焦点を3つの異なる垂直座標に合わせた。セルの断面を黒色の輪郭として模式的に示す。脂質二重層の場所を、正方形を形成する内側の線により示す。画像左側の蛍光セル内容物と画像右側のセル壁面の非蛍光光学材料との間に強いコントラストを作り出すために、対物レンズの中心を内壁の垂直境界に置いた。図面は原寸に比例していない。(c) 40倍対物レンズで取得した、ローダミン-DPPE 1%(mol)を含む支持脂質二重層を収容する3mmセルの画像。スライスを、25μm、0μm、および-200μmの相対Z座標にそれぞれ対応する共焦点面の3つの垂直位置(I、II、およびIII)において画像化した。光学切片の厚さは4.3μmとした。
以下の実施例は例示的なものであり、特許請求される主題の範囲を限定するようには意図されていない。
実施例1
本明細書に開示されるアダプターは、標準的1cmセルホルダーを備えた標準的水平光線蛍光光度計を使用して、蛍光光度計マイクロセルの内面上で吸収された分子層からの蛍光を検出するための方法において利用することができる。マイクロセルの内面上での蛍光の検出は、(1) セルホルダーに挿入された本開示のアダプターを用いて励起窓および発光窓に対する特定の位置および角度でマイクロセルを配置すること、ならびに(2) 本アダプターおよびマイクロセルを通過する励起経路および発光経路を制御する、可変開口部を有するカスタマイズスクリーンを、アダプター本体の窓内の特定位置で利用することで、蛍光対散乱光強度の比を最適化することにより可能になる。蛍光光度計セルホルダー内の蛍光光度計マイクロセルの表面を励起チャネルおよび発光チャネルに適切に露出する目的で該マイクロセルをオフセンターにかつ/または角度付きで位置づけるために、本アダプターを使用することができる。マイクロセルの所望の位置づけは、入射励起光線に対して、出射発光光線に対して、かつセルホルダーに対して片側に寄っているまたは角度付きでありうる(すなわち垂直な軸の周りを回転しうる)、アダプター本体および該本体内の正方形または長方形の空洞により実現される。したがって、マイクロセルが空洞に配置される際に、マイクロセルおよび該マイクロセルの表面は入射励起光線に対して、出射発光光線に対して、かつセルホルダーに対して片側に寄ってまたは角度付きで位置づけられる(すなわち垂直な軸の周りを回転する)。図4Aは、本アダプターの一態様を示し、マイクロセルを保持するための正方形の空洞を有する上部および下部の2つの水平区分を示す。この特定の態様における励起窓および発光窓に対するマイクロセルの位置を図4Bに示す。
本明細書に開示されるアダプターは、標準的1cmセルホルダーを備えた標準的水平光線蛍光光度計を使用して、蛍光光度計マイクロセルの内面上で吸収された分子層からの蛍光を検出するための方法において利用することができる。マイクロセルの内面上での蛍光の検出は、(1) セルホルダーに挿入された本開示のアダプターを用いて励起窓および発光窓に対する特定の位置および角度でマイクロセルを配置すること、ならびに(2) 本アダプターおよびマイクロセルを通過する励起経路および発光経路を制御する、可変開口部を有するカスタマイズスクリーンを、アダプター本体の窓内の特定位置で利用することで、蛍光対散乱光強度の比を最適化することにより可能になる。蛍光光度計セルホルダー内の蛍光光度計マイクロセルの表面を励起チャネルおよび発光チャネルに適切に露出する目的で該マイクロセルをオフセンターにかつ/または角度付きで位置づけるために、本アダプターを使用することができる。マイクロセルの所望の位置づけは、入射励起光線に対して、出射発光光線に対して、かつセルホルダーに対して片側に寄っているまたは角度付きでありうる(すなわち垂直な軸の周りを回転しうる)、アダプター本体および該本体内の正方形または長方形の空洞により実現される。したがって、マイクロセルが空洞に配置される際に、マイクロセルおよび該マイクロセルの表面は入射励起光線に対して、出射発光光線に対して、かつセルホルダーに対して片側に寄ってまたは角度付きで位置づけられる(すなわち垂直な軸の周りを回転する)。図4Aは、本アダプターの一態様を示し、マイクロセルを保持するための正方形の空洞を有する上部および下部の2つの水平区分を示す。この特定の態様における励起窓および発光窓に対するマイクロセルの位置を図4Bに示す。
図4Bにおいて、励起光はマイクロセルの内面を照射して蛍光を引き起こし、蛍光は発光窓を通じて観察される。窓スクリーン中の開口部の幅、および励起経路中の窓スクリーンの位置は、特定のセル表面に照射を限定するために調整可能である。図4Bの黒色棒は、光を遮断する窓スクリーンの部分を示し、各部分間の開口は、励起光がセルの特定部分を照射することを可能にする開口部である。同様に、発光チャネル(すなわち光検出器)に対向するアダプターの側面は、セルの特定部分を検出器に露出するための可変開口部を有する。可変開口部は、図4Aと同様に本アダプターの発光側面および励起側面中の垂直スリットに挿入された窓スクリーン(図4C)中に存在してもよく、可変開口部は、可変開口部が特定のセル区域の照射および/または観察を可能にするという条件で、アダプター本体の垂直側面の一体的な部分であってもよい。
励起光線の散乱光および反射光の関与を減少させながら内面からの観察蛍光信号の強度を増加させるために、開口部の幅、開口部の位置、ホルダー内のマイクロセルの位置づけ、および励起光線に対するマイクロセルの角度の特定の組み合わせを選択することができる。
アダプターの上部および下部は、マイクロセルがその上に着座しうる摺動インサート(図4D)を位置づけるためのセル空洞を横切る細長い水平スリットを特徴とする。したがって、摺動インサートは、マイクロセルがアダプターの下部を通過することを防止する。複数の励起チャネルを有する分光蛍光光度計中での(例えば左側および右側励起チャネルを有する分光蛍光光度計中での)本アダプターの使用を可能にするために、インサートを本アダプターのいずれかの端部(すなわち上端または下端)に配置することができる。したがって、2チャネル分光蛍光光度計中での使用には1個のアダプターしか必要ではない。図4Eは、据付発光窓および励起窓スクリーン、摺動インサート、ならびに標準的Starna 3mmマイクロセルを備えた1cmアダプターの実践的なプロトタイプを示す。
本アダプターおよび窓スクリーンの構成は、励起光線の幾何形状に応じて変動しうる。例えば、励起光線が焦点の合った定常状態源である場合、本アダプターは、マイクロセルの縁部からの強力な反射を回避するために、励起側面に相対的に細長い開口部を有する窓スクリーンを利用することができる。他方で、励起光線がパルスLEDである場合、本アダプターは、相対的に広い開口部を有する窓スクリーンを利用してもよく、本アダプターは、セル表面の照射を促進するために窓スクリーンを全く利用しなくてもよい。いくつかの例示的構成を図5に示す。
いくつかの態様では、本開示のアダプターを、マイクロセルの内面に固定化された二重層分子構造からの蛍光を分析することを含む実験において利用することができる。二重層分子構造が内面に固定化されることで、変動可能な条件での異なるリガンドと二重層およびそのタンパク質成分との相互作用の分析が可能になる。同じ二重層を一連の生化学剤に繰り返し曝露することによる複数回の実験が可能である。本提案のアダプターは、支持脂質二重層中の膜タンパク質に関する学術研究を進展させるための、かつ膜タンパク質機能に関する臨床試験の開発を促進するための、低コストの解決策である。
参考文献
1. Galush et al. (2008), "Quantitative fluorescence microscopy using support lipid bilayer standards," Biophy J. 95, 2512-9.
2. Crane et al. (2007), "Fluorescence Microscopy to Study Domains in Supported Lipid Bilayers." In Method in Membrane Lipids, Vol. 400, pp. 481-488.
3. Lakowicz, J.R. (2010) Principles of Fluorescence Spectroscopy. 3rd edit. Springer.
4. 米国特許第8,115,922号。
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3. Lakowicz, J.R. (2010) Principles of Fluorescence Spectroscopy. 3rd edit. Springer.
4. 米国特許第8,115,922号。
実施例2
本開示のアダプターの別の態様は、1つの狭い寸法および別の長い寸法を備えた長方形の断面を有するマイクロセルを利用するように設計されている。図6は、細長い長方形のセルが励起光線に対して異なる配向で本アダプター中に位置づけられた、本アダプターのこの態様の水平断面を示す。図6では、正方形のセルアダプターの水平断面を黒色の輪郭で示す。マイクロセルの外側境界および内側境界をそれぞれ濃いおよび薄い黒色の輪郭で示す。励起チャネルの光学系によって集束され、アダプタースリットによってトリミングされた、励起光線を、実線の輪郭で模式的に示す。水平破線は、励起光線の中心を示し、セル位置に関する基準の役割を果たす。発光チャネルに露出されたセルの部分を斜めの破線で示す。
本開示のアダプターの別の態様は、1つの狭い寸法および別の長い寸法を備えた長方形の断面を有するマイクロセルを利用するように設計されている。図6は、細長い長方形のセルが励起光線に対して異なる配向で本アダプター中に位置づけられた、本アダプターのこの態様の水平断面を示す。図6では、正方形のセルアダプターの水平断面を黒色の輪郭で示す。マイクロセルの外側境界および内側境界をそれぞれ濃いおよび薄い黒色の輪郭で示す。励起チャネルの光学系によって集束され、アダプタースリットによってトリミングされた、励起光線を、実線の輪郭で模式的に示す。水平破線は、励起光線の中心を示し、セル位置に関する基準の役割を果たす。発光チャネルに露出されたセルの部分を斜めの破線で示す。
図6に示すように、位置Aは、光学系が光線をセルホルダーの中央に集束するように調整されるという事実により、セル内壁を非常に鋭い角度で照射することを可能にする。入射励起光の角度が鋭いことから、発光チャネル中への散乱量が非常に少なくなり、したがって感度が増加する。さらに、セルの幾何形状が細長いことが理由で、セル角部は、発光チャネルにより観察される区域の外側に位置する。この位置においては、セルがセルホルダーに対して中心にあることから、両セル内壁は同様の程度に照射される。位置Bは、1つのセル内壁(すなわち図示されるセル前壁)の照射を、セルを本アダプター中で後方に移動させることで該前方セル内壁で吸収されたフルオロフォアの励起の効率を増加させることによって改善する。位置Cは、セル内壁に当たる光の強度を、本アダプター中のセルを中心軸の周りで回転させることでさらに増加させる。位置Dは、左側のセル角部からの散乱を、本アダプター中のセルを片側に寄った軸の周りで回転させる(すなわち、セルを本アダプターの中心位置から移動させて回転させる)ことで減少させる。
この態様における本開示の細長い長方形のマイクロセルは、正方形のマイクロセルに対する利点を示しうる。第1に、細長い長方形のマイクロセル中の発光チャネルに露出されうる有用な表面は、より幅広い。例えば、正方形のマイクロセルの断面がわずか3mm幅である一方で、細長い長方形のマイクロセルの断面セルは10mm幅である。また、細長い長方形のマイクロセルの角部は、発光窓の中心から遠くに位置し、したがって散乱に関与しにくい。図6の斜めの破線は、細長い長方形のマイクロセルを使用する発光窓の有用なおおよその幅を示す。さらに、細長い長方形のマイクロセルの前方内壁および後方内壁は、相対的に小さい距離(例えば1mm)で隔てられており、したがって、両セル内壁(すなわち前方セル内壁および後方セル内壁)は本アダプター中のマイクロセルの大部分の配向で励起光線に露光される。これにより、これらの内壁上で吸収された試料層から発光する有用な蛍光信号の量が実質的に2倍になり、したがって、細長い長方形のマイクロセルを使用する際に検出感度が増加する。
実施例3
本開示のアダプターのいくつかの態様では、例えば、いくつかの蛍光光度計の集束光学系の調節の小さなばらつきを補正するために、本アダプター中のセルの位置および配向が調整可能でありうる。セル内面の正確な照射は、そのような変動可能性に影響されやすく、最大信号を得るためにエンドユーザーがその中から選択可能な異なるセル位置を有する一組のアダプターを準備することにより、または直接位置調整機構を使用することにより、これに対処することができる。(A) マイクロセルを組み付けた回転板; (B) 固定板。励起光線および発光窓の方向を板上に矢印で示す; ならびに(CおよびD)励起光線および発光光線に対して異なる配向のセルを組み付けた固定板および回転板を含む、蛍光光度計中でセルの位置および配向を直接調整することを可能にするための本アダプターのそのような機構の1つのプロトタイプを、図7に示す。
本開示のアダプターのいくつかの態様では、例えば、いくつかの蛍光光度計の集束光学系の調節の小さなばらつきを補正するために、本アダプター中のセルの位置および配向が調整可能でありうる。セル内面の正確な照射は、そのような変動可能性に影響されやすく、最大信号を得るためにエンドユーザーがその中から選択可能な異なるセル位置を有する一組のアダプターを準備することにより、または直接位置調整機構を使用することにより、これに対処することができる。(A) マイクロセルを組み付けた回転板; (B) 固定板。励起光線および発光窓の方向を板上に矢印で示す; ならびに(CおよびD)励起光線および発光光線に対して異なる配向のセルを組み付けた固定板および回転板を含む、蛍光光度計中でセルの位置および配向を直接調整することを可能にするための本アダプターのそのような機構の1つのプロトタイプを、図7に示す。
固定板は、蛍光光度計セルホルダー上に装着されており、セルホルダーの空洞に位置合わせされた正方形の開口を有する。固定板は、固定板の位置を常に固定し続けるために板の表面から下ってホルダー空洞中に延伸する、フラップを有する。マイクロセル付きの回転板は、セルがセルホルダーの下部に到達し、かつ回転板が固定板上に着座するまで、固定板の開口に挿入される。この組立体においては、マイクロセルはセルホルダー中に垂直に位置づけられている(C)。マイクロセルの水平位置、ならびに励起光線および発光光線に対するその角度は、マイクロセル付きの回転板を固定板に対して相対的に移動させることで容易に調整される。光学位置(例えば、最大有用蛍光信号および最小散乱により評価される)を固定板上にマークすることができ、これにより、次回この位置を必要な精度で再現することが可能になる。記録された角度および位置のパラメータを使用して、それに対応する場所にセル空洞を有するアダプター本体を製造することで、調整不可能な最適化されたアダプターを得ることができる。あるいは、マイクロセルの位置を調整するための本明細書に記載の機構、または同様の機構を使用して、セル位置調整をすべての特定の実験において行うこともできる。
実施例4
Journal of Fluorescenceに投稿されたE.A. Kovriginaおよび E.L. Kovriginの「Fluorescence of supported phospholipid bilayers recorded in a conventional horizontal-beam spectrofluorometer」と題する添付の原稿を参照する。その内容は全体として参照により本明細書に組み入れられる。
Journal of Fluorescenceに投稿されたE.A. Kovriginaおよび E.L. Kovriginの「Fluorescence of supported phospholipid bilayers recorded in a conventional horizontal-beam spectrofluorometer」と題する添付の原稿を参照する。その内容は全体として参照により本明細書に組み入れられる。
標題
従来の水平光線分光蛍光光度計中で記録された支持リン脂質二重層の蛍光
従来の水平光線分光蛍光光度計中で記録された支持リン脂質二重層の蛍光
要旨
支持リン脂質二重層は、膜生物物理反応およびタンパク質-脂質相互作用に関する試験において好都合な細胞膜のモデルである。伝統的には、支持脂質二重層は、ガラススライドの平らな表面に形成されて、蛍光顕微鏡を通じて観察される。本論文では、顕微鏡の代わりに標準的水平光線分光蛍光光度計を使用して支持脂質二重層からの蛍光検出を可能にする方法を記述する。本提案のアプローチにおいて、われわれは標準的な蛍光マイクロセルの光学内面に支持脂質二重層を形成する。セル壁面上で吸収された二重層の観察を可能にするために、マイクロセルを、標準的な蛍光光度計セルホルダーに配置し、セル内壁が励起チャネルおよび発光チャネルの両方に露出されるようにカスタムセルアダプターを用いて特別に配向させる。われわれの測定では、標準的3mm光学マイクロセル中での1%(mol)のローダミン標識脂質が添加された支持二重層からの信号強度は、市販のマイクロセルアダプター中で記録されたローダミンの70〜80nM参照溶液の蛍光と同等であった。この方法においては、機器の改造を必要としないことから、標準的な水平光線分光蛍光光度計を使用して支持リン脂質二重層について種々の定常状態および時間領域蛍光測定を行うことができる。
支持リン脂質二重層は、膜生物物理反応およびタンパク質-脂質相互作用に関する試験において好都合な細胞膜のモデルである。伝統的には、支持脂質二重層は、ガラススライドの平らな表面に形成されて、蛍光顕微鏡を通じて観察される。本論文では、顕微鏡の代わりに標準的水平光線分光蛍光光度計を使用して支持脂質二重層からの蛍光検出を可能にする方法を記述する。本提案のアプローチにおいて、われわれは標準的な蛍光マイクロセルの光学内面に支持脂質二重層を形成する。セル壁面上で吸収された二重層の観察を可能にするために、マイクロセルを、標準的な蛍光光度計セルホルダーに配置し、セル内壁が励起チャネルおよび発光チャネルの両方に露出されるようにカスタムセルアダプターを用いて特別に配向させる。われわれの測定では、標準的3mm光学マイクロセル中での1%(mol)のローダミン標識脂質が添加された支持二重層からの信号強度は、市販のマイクロセルアダプター中で記録されたローダミンの70〜80nM参照溶液の蛍光と同等であった。この方法においては、機器の改造を必要としないことから、標準的な水平光線分光蛍光光度計を使用して支持リン脂質二重層について種々の定常状態および時間領域蛍光測定を行うことができる。
序論
支持リン脂質二重層は、細胞リン脂質膜のモデルとして長きにわたって定着している[1]。(ガラスに対する架橋ありまたはなしで)ガラス表面に結合したリン脂質二重層は、生物物理特性に関して他の膜模倣体と物理的に非常に似通っている[2]。そのような支持二重層からの蛍光信号を記録するための主要なアプローチは、ガラススライドの水平面に沈着しかつ水性緩衝液の層で覆われた二重層についての顕微鏡を通じたアプローチである[3,4]。支持二重層の蛍光顕微鏡観察は、自発的相分離の分析[5,6]および単分子分解能での二重層における分子事象の検出[7,8]を可能にする。支持脂質二重層の(リポソームに比べての)1つの非常に有用な特徴は、該二重層が固定化されることで、該二重層と接触する溶液の動的再配置が可能になるというものである。膜タンパク質と脂質および可溶性リガンドとの相互作用を明らかにするために、支持脂質二重層が顕微鏡設定によってフローセルモードで日常的に試験されている(例えば[9,10])。しかし、脂質結合フルオロフォアのスペクトル特性、およびリガンド相互作用によるその変化に特に関心が持たれている場合、顕微鏡は、多波長レーザーを使用しなければならず、高価で一般的には入手不可能なスペクトル分解能の検出器を含まなければならない(そのような設定の例は[11]を参照)。標準的な分光蛍光光度計中で脂質二重層の蛍光を記録するための最善の実用的アプローチは、リポソームまたはタンパク質-リポソーム複合体の溶液(懸濁液)を利用するというものであった[12-15]。しかし、リポソームは、自由に拡散する粒子であることから、非常に安定であるというわけではなく、周囲の緩衝液の容易な再配置を可能にしない。支持脂質二重層は、脂質小胞とガラス表面との自発的な融合によって容易に調製されることから[1,2]、好都合な代替物となるが、その分析のために精巧な蛍光顕微鏡の使用を必要とする。本論文は、支持脂質二重層が標準的な蛍光光度計マイクロセル中で作り出され、蛍光測定が通常の水平光線分光蛍光光度計中で行われるという、原理証明実験を報告する。われわれは、この安価なアプローチが、膜タンパク質と脂質および可溶性リガンドとの相互作用に関する試験におけるいくつかの要求を満たしうると考える。
支持リン脂質二重層は、細胞リン脂質膜のモデルとして長きにわたって定着している[1]。(ガラスに対する架橋ありまたはなしで)ガラス表面に結合したリン脂質二重層は、生物物理特性に関して他の膜模倣体と物理的に非常に似通っている[2]。そのような支持二重層からの蛍光信号を記録するための主要なアプローチは、ガラススライドの水平面に沈着しかつ水性緩衝液の層で覆われた二重層についての顕微鏡を通じたアプローチである[3,4]。支持二重層の蛍光顕微鏡観察は、自発的相分離の分析[5,6]および単分子分解能での二重層における分子事象の検出[7,8]を可能にする。支持脂質二重層の(リポソームに比べての)1つの非常に有用な特徴は、該二重層が固定化されることで、該二重層と接触する溶液の動的再配置が可能になるというものである。膜タンパク質と脂質および可溶性リガンドとの相互作用を明らかにするために、支持脂質二重層が顕微鏡設定によってフローセルモードで日常的に試験されている(例えば[9,10])。しかし、脂質結合フルオロフォアのスペクトル特性、およびリガンド相互作用によるその変化に特に関心が持たれている場合、顕微鏡は、多波長レーザーを使用しなければならず、高価で一般的には入手不可能なスペクトル分解能の検出器を含まなければならない(そのような設定の例は[11]を参照)。標準的な分光蛍光光度計中で脂質二重層の蛍光を記録するための最善の実用的アプローチは、リポソームまたはタンパク質-リポソーム複合体の溶液(懸濁液)を利用するというものであった[12-15]。しかし、リポソームは、自由に拡散する粒子であることから、非常に安定であるというわけではなく、周囲の緩衝液の容易な再配置を可能にしない。支持脂質二重層は、脂質小胞とガラス表面との自発的な融合によって容易に調製されることから[1,2]、好都合な代替物となるが、その分析のために精巧な蛍光顕微鏡の使用を必要とする。本論文は、支持脂質二重層が標準的な蛍光光度計マイクロセル中で作り出され、蛍光測定が通常の水平光線分光蛍光光度計中で行われるという、原理証明実験を報告する。われわれは、この安価なアプローチが、膜タンパク質と脂質および可溶性リガンドとの相互作用に関する試験におけるいくつかの要求を満たしうると考える。
材料および方法
リポソームの調製
脂質混合物はDOPC:DOPG:フルオロフォアをモル比89:10:1で含有した。Rhod-DPPEを脂質二重層の蛍光マーカーとして使用した。すべての脂質をAvanti Polar Lipids Inc.から得て、さらに精製せずに使用した。大型単層小胞(LUV)を、Avanti Mini-Extruderを使用する0.2μmポリカーボネート膜を通じた押出により調製した。押出中の総脂質濃度を1mMとした。支持脂質二重層の沈着用に脂質を0.1mMに希釈した。多層小胞(MLV)または小型単層小胞(SUV)の代わりにLUVを使用することは、このプロトコルにおける厳密な要件ではないようである。Brian and McConnell[1]はその先駆的研究においてMLVの利用に成功し、一方、Cremer and Boxer[16]は同じ目的でSUVを使用した。
リポソームの調製
脂質混合物はDOPC:DOPG:フルオロフォアをモル比89:10:1で含有した。Rhod-DPPEを脂質二重層の蛍光マーカーとして使用した。すべての脂質をAvanti Polar Lipids Inc.から得て、さらに精製せずに使用した。大型単層小胞(LUV)を、Avanti Mini-Extruderを使用する0.2μmポリカーボネート膜を通じた押出により調製した。押出中の総脂質濃度を1mMとした。支持脂質二重層の沈着用に脂質を0.1mMに希釈した。多層小胞(MLV)または小型単層小胞(SUV)の代わりにLUVを使用することは、このプロトコルにおける厳密な要件ではないようである。Brian and McConnell[1]はその先駆的研究においてMLVの利用に成功し、一方、Cremer and Boxer[16]は同じ目的でSUVを使用した。
支持脂質二重層の調製
長方形3mm蛍光光度計マイクロセル(Starna #3-3.45-Q-3)の内面上での支持脂質二重層の形成を、該セルを総脂質0.1mMのLUV溶液(安定した二重層の形成を可能にする最小濃度[1,5,16])で完全に満たすことで行った。負に帯電した脂質を有する二重層が生理学的pHおよびイオン強度で非常に速やかに形成されることが報告された[16]。空気-水の境界が付着二重層を破壊することから[16]、二重層を壁面に付着させ続けるには、セルを常に満たし続けなければならない。したがって、初期LUV溶液を取り除くために、われわれはセルをリン酸生理食塩水緩衝液の連続流でフラッシングした。フラッシングを行うために、セルを水平に位置づけ、緩衝液を針でセルの下部に向けて導入した。置換された溶液はセルから出て廃棄物容器中に滴り落ちた。毛管力は、手順全体の間セルを完全に満たし続けるために十分であった。マイクロセル中の壁面間の相対的に広い間隔(3mm)によって緩衝液交換プロセスは多少非効率的になった。マイクロセル内のバルク溶液からの残留LUVの除去完了を確実にするには、流量(約)2ml/分の緩衝液50〜100mlを必要とした。LUV除去の品質を、マイクロセル中のバルク溶液の残留蛍光により点検した。
長方形3mm蛍光光度計マイクロセル(Starna #3-3.45-Q-3)の内面上での支持脂質二重層の形成を、該セルを総脂質0.1mMのLUV溶液(安定した二重層の形成を可能にする最小濃度[1,5,16])で完全に満たすことで行った。負に帯電した脂質を有する二重層が生理学的pHおよびイオン強度で非常に速やかに形成されることが報告された[16]。空気-水の境界が付着二重層を破壊することから[16]、二重層を壁面に付着させ続けるには、セルを常に満たし続けなければならない。したがって、初期LUV溶液を取り除くために、われわれはセルをリン酸生理食塩水緩衝液の連続流でフラッシングした。フラッシングを行うために、セルを水平に位置づけ、緩衝液を針でセルの下部に向けて導入した。置換された溶液はセルから出て廃棄物容器中に滴り落ちた。毛管力は、手順全体の間セルを完全に満たし続けるために十分であった。マイクロセル中の壁面間の相対的に広い間隔(3mm)によって緩衝液交換プロセスは多少非効率的になった。マイクロセル内のバルク溶液からの残留LUVの除去完了を確実にするには、流量(約)2ml/分の緩衝液50〜100mlを必要とした。LUV除去の品質を、マイクロセル中のバルク溶液の残留蛍光により点検した。
共焦点蛍光顕微鏡観察
支持脂質二重層の画像をNikon Perfect Focus Ti-E研究用倒立顕微鏡を使用して取得した。3mmセルを対物レンズの前の水平位置で支持するために、カスタムセルホルダーを利用した。
支持脂質二重層の画像をNikon Perfect Focus Ti-E研究用倒立顕微鏡を使用して取得した。3mmセルを対物レンズの前の水平位置で支持するために、カスタムセルホルダーを利用した。
蛍光分光法
支持脂質二重層からの発光スペクトルを記録するためにPhoton Technologies International QuantaMaster 40分光蛍光光度計(Horiba)を使用した。蛍光光度計は標準的1cm試料ホルダー、発光および励起モノクロメーター、ならびにキセノン定常状態励起源を備えていた。Starnaの標準的3mmマイクロセル(カタログ番号3-3.45-Q-3)を保持するためにカスタムセルアダプターが設計された。アダプターは、励起光線をトリミングしかつ照射セル表面を発光チャネルに露出するための内部スリットを含んでいた。アダプター設計の詳細は、それぞれ2014年11月13日および2015年6月30日に米国特許庁に出願された米国仮特許出願第62/079,273号および第62/186,449号に記載されている。
支持脂質二重層からの発光スペクトルを記録するためにPhoton Technologies International QuantaMaster 40分光蛍光光度計(Horiba)を使用した。蛍光光度計は標準的1cm試料ホルダー、発光および励起モノクロメーター、ならびにキセノン定常状態励起源を備えていた。Starnaの標準的3mmマイクロセル(カタログ番号3-3.45-Q-3)を保持するためにカスタムセルアダプターが設計された。アダプターは、励起光線をトリミングしかつ照射セル表面を発光チャネルに露出するための内部スリットを含んでいた。アダプター設計の詳細は、それぞれ2014年11月13日および2015年6月30日に米国特許庁に出願された米国仮特許出願第62/079,273号および第62/186,449号に記載されている。
結果
支持脂質二重層の可視化
分光学的調査の前に、蛍光光度計セルの内面上での支持脂質二重層の形成を、蛍光顕微鏡観察を使用して確認することができる。図8は、3mm長方形マイクロセルの内部ボリュームの代表的なローダミン蛍光画像を示す。画像の左側が光学セルの内側に対応する一方で、右側が常に垂直セル壁面の材料内にあるように、試料プラットフォームを調整した(パネルaおよびb)。蛍光脂質が光学セルの内壁にのみ見られ、溶液中には見られないことを示すために、われわれは3つの垂直座標において共焦点面を画像化した(パネルbおよびc)。共焦点面が水平セル壁面内に完全に局在していることから、位置IIIは内壁よりも200μm下方にあり、蛍光を示さない。位置IIは、水平セル壁面の内面に位置合わせされており、セル内面をコーティングするリン脂質二重層中のローダミンに対応する明るい蛍光(セル壁面接合部の左)を示す。最上の位置Iは、水平セル壁面の内面よりも25μm上方にあり、画像中央の垂直セル内面と交差する。画像左側は、セル内の溶液からの著しい蛍光を示さなかった。これは、フラッシング手順によってすべての懸濁LUVの除去に成功したことを示している。中央の明るい直線は、垂直セル内壁に形成された支持脂質二重層の蛍光に由来する。脂質二重層の真の厚さは、この約400nmという波長での光学分光法に固有の分解能の限界が理由で、これらの画像からは推定することができない。したがって、われわれは、吸収された脂質が予想厚約5nmで二重層を形成するという、以前に実証された文献報告[5,16]に依存した。画像右側の黒色区域は、垂直セル壁面の非蛍光の内側に対応している。
支持脂質二重層の可視化
分光学的調査の前に、蛍光光度計セルの内面上での支持脂質二重層の形成を、蛍光顕微鏡観察を使用して確認することができる。図8は、3mm長方形マイクロセルの内部ボリュームの代表的なローダミン蛍光画像を示す。画像の左側が光学セルの内側に対応する一方で、右側が常に垂直セル壁面の材料内にあるように、試料プラットフォームを調整した(パネルaおよびb)。蛍光脂質が光学セルの内壁にのみ見られ、溶液中には見られないことを示すために、われわれは3つの垂直座標において共焦点面を画像化した(パネルbおよびc)。共焦点面が水平セル壁面内に完全に局在していることから、位置IIIは内壁よりも200μm下方にあり、蛍光を示さない。位置IIは、水平セル壁面の内面に位置合わせされており、セル内面をコーティングするリン脂質二重層中のローダミンに対応する明るい蛍光(セル壁面接合部の左)を示す。最上の位置Iは、水平セル壁面の内面よりも25μm上方にあり、画像中央の垂直セル内面と交差する。画像左側は、セル内の溶液からの著しい蛍光を示さなかった。これは、フラッシング手順によってすべての懸濁LUVの除去に成功したことを示している。中央の明るい直線は、垂直セル内壁に形成された支持脂質二重層の蛍光に由来する。脂質二重層の真の厚さは、この約400nmという波長での光学分光法に固有の分解能の限界が理由で、これらの画像からは推定することができない。したがって、われわれは、吸収された脂質が予想厚約5nmで二重層を形成するという、以前に実証された文献報告[5,16]に依存した。画像右側の黒色区域は、垂直セル壁面の非蛍光の内側に対応している。
水平光線分光蛍光光度計中の支持脂質二重層
リン脂質二重層からの蛍光の観察を目的として、われわれは、二重層を有する表面を励起チャネルおよび発光チャネルの両方に露出するためにマイクロセルを標準的1cmセルホルダー内に設置した。図9aは、標準的中心位置(パネルb)との比較で、二重層観察のために可能なマイクロセルの位置のうち1つを示す。パネルcは、支持脂質二重層および希釈参照LUV溶液から記録された発光スペクトルを示す。この測定では、われわれは、励起および発光モノクロメーター中の同一の5nmスリットによる560nm励起光を使用した。セルの表面の照射(パネルa)により、表面からの有用な蛍光およびマイクロセルの角部からの散乱光の両方が生じる。したがって、励起光線をトリミングしかつセル縁部に対する発光チャネルの露出を制限するさらなる調整可能なスリットを使用しなければならない。パネルc中の実線は、セル位置と調整可能なスリットとの最適な組み合わせによる蛍光信号を示す。この最適な組み合わせは、集束光学系の調節の差が理由で、おそらく機器毎にわずかに異なる。
リン脂質二重層からの蛍光の観察を目的として、われわれは、二重層を有する表面を励起チャネルおよび発光チャネルの両方に露出するためにマイクロセルを標準的1cmセルホルダー内に設置した。図9aは、標準的中心位置(パネルb)との比較で、二重層観察のために可能なマイクロセルの位置のうち1つを示す。パネルcは、支持脂質二重層および希釈参照LUV溶液から記録された発光スペクトルを示す。この測定では、われわれは、励起および発光モノクロメーター中の同一の5nmスリットによる560nm励起光を使用した。セルの表面の照射(パネルa)により、表面からの有用な蛍光およびマイクロセルの角部からの散乱光の両方が生じる。したがって、励起光線をトリミングしかつセル縁部に対する発光チャネルの露出を制限するさらなる調整可能なスリットを使用しなければならない。パネルc中の実線は、セル位置と調整可能なスリットとの最適な組み合わせによる蛍光信号を示す。この最適な組み合わせは、集束光学系の調節の差が理由で、おそらく機器毎にわずかに異なる。
記録された蛍光がバルク溶液中の残留LUVよりもむしろ支持二重層に由来することを確認するために、われわれは、セルが中心に置かれたパネルbに示す標準的マイクロセルアダプター(FCA3、Starna)を使用して同じ試料からの溶液蛍光を試験した。FCA3アダプターは、溶液の内部ボリュームからの蛍光の観察を可能にするように製造されており、その細長い窓は、励起チャネルおよび発光チャネルに対する露出からセルの角部を遮蔽する。支持二重層の調製において、われわれはいくつかの段階でマイクロセルを緩衝液でフラッシングし、各時点でFCA3アダプターを使用してマイクロセル中のバルク溶液からの残留LUV蛍光を記録した。緩衝液約50mlをセルに通した後、われわれは、ローダミン蛍光が図9cに一点鎖線として示される最小値に低下したことを観察した。別の50mlでさらにフラッシングしても蛍光はこれ以上減少しなかった。このことは、この残留蛍光信号が、おそらくは前壁および後壁(発光チャネルに対向する)上の支持二重層に由来するものであり、溶液中の散乱光によって間接的に励起されたものであることを示している。
支持脂質二重層試料からの測定の相対感度を、その蛍光を中心を合わせたアダプターFCA3中の参照LUV溶液の信号強度と比較することにより評価することができる。図9cの黒色破線は、測定前に総脂質濃度5μMに希釈された(結果的にローダミン濃度が50nMとなった)、支持脂質二重層の調製に使用される初期LUV溶液のスペクトルである。したがって、3mmマイクロセル中のローダミン1%(mol)を有する支持脂質二重層からの信号はLUV溶液中のローダミン70〜80nM(3mmセル中の5nm励起スリットおよび発光スリットで記録)と等しかった。
考察
支持脂質二重層の通常の応用では、何らかの種類の顕微鏡設定において下からまたは上から該二重層を観察するために水平に位置づけられたガラススライドまたはフローセルを利用した。蛍光光度計セルの内面に形成された支持脂質二重層は、垂直に配向させながら調査することができる。というのも、二重層が溶液で常に覆われていることを光学セルが確実にしている間、二重層を定位置に保持するファンデルワールス力が重力よりも強くなるからである。われわれの実験では、支持脂質二重層試料は4℃で1週間を超えて安定していた。われわれの方法における脂質二重層の垂直配向は、水平配向に対する別の利点を示す。すなわち、生体分子凝集物(またはダスト)がマイクロセルの下部に沈降することで、観察区域が残る。支持脂質二重層が顕微鏡設定において水平に位置すると、すべての凝集物が試験中の二重層上に直接沈降し、これにより測定結果が潜在的に偏向する。
支持脂質二重層の通常の応用では、何らかの種類の顕微鏡設定において下からまたは上から該二重層を観察するために水平に位置づけられたガラススライドまたはフローセルを利用した。蛍光光度計セルの内面に形成された支持脂質二重層は、垂直に配向させながら調査することができる。というのも、二重層が溶液で常に覆われていることを光学セルが確実にしている間、二重層を定位置に保持するファンデルワールス力が重力よりも強くなるからである。われわれの実験では、支持脂質二重層試料は4℃で1週間を超えて安定していた。われわれの方法における脂質二重層の垂直配向は、水平配向に対する別の利点を示す。すなわち、生体分子凝集物(またはダスト)がマイクロセルの下部に沈降することで、観察区域が残る。支持脂質二重層が顕微鏡設定において水平に位置すると、すべての凝集物が試験中の二重層上に直接沈降し、これにより測定結果が潜在的に偏向する。
セル表面近傍での溶液からの蛍光の観察は、古くは、光学的に密なキニーネ溶液の蛍光を記述したSir Frederick William Herschelまで遡る[17]。その後、高い光学濃度または/および著しい濁度の溶液が、入射光がセル内の薄い溶液層を透過して溶液層が蛍光を発する角度でのセル表面の照射によって日常的に試験された。通常、これらの応用では、発光チャネルおよび励起チャネルの両方に対して45°の角度に配向したセル表面を有する三角形セルを利用する。しかし、この構成は、支持脂質二重層からの蛍光検出には好適ではない。というのも、弱い蛍光信号が、モノクロメーター中に反射する励起光により圧倒され、したがって信号/雑音比が破壊されるからである。Lakowiczは、そのような三角形セルで散乱光を減少させるために、より小さな20〜30°の角度を推奨した[18]。これは、ほぼわれわれが図9aにおいて使用している角度である。しかし、これらの鋭角でセル前面を励起光線に露光させる光学セルは一般に入手可能ではない。標準的1cmセルホルダーのサイズよりも小さな市販のマイクロセルを利用することで、われわれは、異なる角度でセル表面の照射を実現するセルの複数の位置および配向を調査することができた。
生化学用途における別の要件は、試料のサイズが小さいことである。Starna製またはHellma製の三角形45°セルを満たすためには溶液1.7mlが必要である。ここでわれわれは、試料315μLを名目的に保持してそれを顕微鏡用途における容量範囲のフローセルに取り込む、3mm Starnaマイクロセルを利用した。セルキャップに針および入口-出口管を取り付けることで、蛍光光度計においてセル中の溶液を直接再配置可能なフローセルを構築することができる(この試験では、簡略化するために、われわれは機器の外側でセルをフラッシングした)。
膜タンパク質を包含する支持脂質二重層を作り出すためにプロテオリポソームを使用することができることが示された[1,2]。われわれの方法では、バルク溶液にリガンドを加えることで、受容体-リガンド相互作用の滴定試験を行うことができる。続いて、リガンドを洗い流すことで膜結合受容体の非結合形態が再生され、これにより同じ二重層試料による複数回の反復実験が可能になる。多くの分光蛍光光度計は温度制御セルホルダーを備えており、これにより、支持二重層試料の温度依存的な熱力学特性および動力学特性に関する試験への道が開かれる。また、支持二重層蛍光の観察に対するわれわれのアプローチは、励起光源の種類に依存せず、したがって、スペクトル記録に使用される同じ試料に対して時間領域試験が同等に可能である。要するに、簡単な二重層形成技術と、単純なカスタムアダプターと組み合わせた市販の光学セルと、標準的な分光蛍光光度計ハードウェアとの組み合わせにより、支持脂質二重層から蛍光を記録する安価なやり方が可能になり、したがって、脂質膜、膜タンパク質、およびそれらの相互作用に関する詳細な分光試験が可能になる。
参考文献
前述の説明において、当業者には本発明の範囲および真意を逸脱することなく本明細書に開示される本発明に様々な置換および修正を加えることができることが容易に明らかであろう。本明細書に例示的に記載されている本発明は、本明細書に具体的に開示されていない任意の1つまたは複数の要素、1つまたは複数の限定の非存在下で好適に実施することができる。使用された用語および表現は、限定ではなく記述の用語として使用されており、そのような用語および表現の使用において、提示および記述される特徴の任意の均等物またはその一部を排除するという意図はなく、本発明の範囲内で様々な修正が可能であると認識される。したがって、具体的な態様および任意的な特徴により本発明を説明してきたが、本明細書に開示される概念の修正および/または変形を当業者が使用することができること、および、そのような修正および変形が本発明の範囲内であると考えられることを理解すべきである。
いくつかの特許および非特許参考文献の引用が本明細書において行われる。引用参考文献はその全体が参照により本明細書に組み入れられる。本明細書における1つの用語の定義と引用参考文献におけるその用語の定義との間に齟齬がある場合、その用語は本明細書における定義に基づいて解釈すべきである。
Claims (20)
- 分光蛍光光度計のセルホルダー用のアダプターであって、
該セルホルダーが実質的に正方形または長方形の水平断面を有し、該アダプターが、該セルホルダーに嵌合する本体を含み、該セルホルダーおよびアダプター本体が、実質的に位置合わせされた中心垂直軸を有し、該アダプター本体が、マイクロセルを収容するための空洞を含み、該マイクロセルが長方形の角柱でありかつ実質的に正方形または長方形の水平断面を有し、以下の条件のうち少なくとも1つが満たされるように該マイクロセルが該アダプター本体の該空洞中に位置づけ可能になる中心垂直軸を該マイクロセルが有する、該アダプター:
(1) 該マイクロセルの該垂直軸が該セルホルダーおよびアダプター本体の該垂直軸に対してずれている; (2) 該セルホルダーおよびアダプター本体に対して、該マイクロセルがその垂直軸の周りを水平回転する; ならびに(3) 該マイクロセルの該軸が、発光光線に対して水平に位置合わせされているが、該マイクロセルの発光側面の内壁が励起光線に平行に位置合わせされるように後方に水平移動している。 - マイクロセルが、条件(1)および条件(2)の両方が満たされるようにアダプター本体の空洞中に位置づけられている、請求項1記載のアダプター。
- セルホルダーおよびアダプター本体に対して、マイクロセルがその垂直軸の周りを、セルホルダーに対して45度ではない角度で水平回転する、請求項1または2記載のアダプター。
- アダプター本体が、マイクロセルを収容するための下部空洞を有する実質的に正方形または長方形の下部、マイクロセルを収容するための上部空洞を有する実質的に正方形または長方形の上部、ならびに、該下部と該上部との間にありかつ正方形または長方形に位置合わせされるように該下部および上部を保持する少なくとも1つの垂直側面を含む、前記請求項のいずれか一項記載のアダプター。
- 実質的に正方形または長方形の下部と実質的に正方形または長方形の上部との間にありかつ正方形または長方形に位置合わせされるように該下部および上部を保持する少なくとも2つの垂直側面を含む、請求項4記載のアダプター。
- 2つの垂直側面が隣接しており、90度の角度を形成する、請求項5記載のアダプター。
- 垂直側面が、励起光の入射または発光光の出射を可能にする側面窓を含む、請求項4〜6のいずれか一項記載のアダプター。
- 垂直側面が、励起窓スクリーンまたは発光窓スクリーンを収容するための垂直スリットを含み、該窓スクリーンが、光の入射または出射を可能にするための開口部を含む、請求項7記載のアダプター。
- 下部が、インサートを収容するための水平スリットを含み、該インサートが、マイクロセルを収容するための下部空洞を閉鎖し、かつ該マイクロセルがアダプターの該下部を通過することを防止する、請求項4〜8のいずれか一項記載のアダプター。
- セルホルダーにおいて上下を反転させることができるアダプターであって、上部が、インサートを収容するためのスリットを含み、これにより、下部空洞を開放しかつ上部空洞を閉鎖するために下部のスリット中のインサートが取り外し可能かつ上部のスリットに再配置可能になり、次に該アダプターがセルホルダーにおいて上下が反転され、これにより、該上部が下部に反転し、該下部が上部に反転する、請求項9記載のアダプター。
- マイクロセルが挿入される回転板を含む、前記請求項のいずれか一項記載のアダプター。
- 前記アダプターが、回転板が挿入される固定板をさらに含み、該固定板が、該アダプターの本体に取り付けられているかまたは該アダプター本体の一体的な部分である、請求項11記載のアダプター。
- (a) マイクロセルに試料を配置する段階、(b) 前記請求項のいずれか一項記載のアダプターに該マイクロセルを配置する段階、(c) 分光蛍光光度計のセルホルダーに該アダプターを配置する段階、および(d) 分光蛍光分析を行う段階を含む、試料に対して分光蛍光分析を行うための方法。
- 試料が、マイクロセルの内面に形成されるフルオロフォア標識脂質二重層を含み、分光蛍光分析を行う段階が、該マイクロセルの該内面で蛍光を検出する段階を含む、請求項13記載の方法。
- (a) マイクロセルに試料を配置する段階、(b) 請求項10記載の反転させることができるアダプターに該マイクロセルを配置する段階、(c) 分光蛍光光度計のセルホルダーに該アダプターを配置する段階、(d) 分光蛍光分析を行う段階、(e) 該アダプターから該マイクロセルを取り外す段階、(f) 該アダプターを反転させる段階、(g) 該アダプター中に該マイクロセルを再配置する段階、および(h) 分光蛍光分析を行う段階を含む、試料に対して分光蛍光分析を行うための方法。
- 試料が、マイクロセルの内面に形成されるフルオロフォア標識脂質二重層を含み、分光蛍光分析を行う段階が、該マイクロセルの該内面で蛍光を検出する段階を含む、請求項15記載の方法。
- (a) 断面が実質的に正方形または長方形であるマイクロセルにフルオロフォア標識した層状小胞を含む試料を配置して、該マイクロセルの内面に支持フルオロフォア標識脂質二重層を形成する段階、および(b) 該マイクロセルの該内面で支持フルオロフォア標識脂質二重層からの蛍光を検出する段階を含む、支持脂質二重層を含む試料に対して分光蛍光分析を行うための方法。
- マイクロセル中に蛍光層状小胞を含む溶液または懸濁液を配置すること、該蛍光層状小胞を該マイクロセルの内壁に結合させて支持蛍光脂質二重層を形成すること、該溶液または懸濁液、および該マイクロセルの該内壁に結合しなかった過剰の蛍光層状小胞を、該蛍光層状小胞を含まないフラッシング溶液で、フラッシング手順全体の間該マイクロセルをフラッシング溶液で満たし続ける様式で洗い流すことにより、支持脂質二重層が形成される、請求項17記載の方法。
- 蛍光を検出する段階が、マイクロセルの内面と分光蛍光光度計の励起光線とを接触させる段階、および該マイクロセルの該内面を該分光蛍光光度計の発光チャネルに露出する段階を含む、請求項17または18記載の方法。
- マイクロセルの内面にある支持脂質二重層からの蛍光を検出する前に、該マイクロセルがアダプターに配置されて分光蛍光光度計に挿入され、該アダプターが、該分光蛍光光度計の励起光線をトリミングしかつ該マイクロセルの該内面を発光チャネルに露出する内部スリットを含む、請求項19記載の方法。
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