JPWO2015022781A1 - 細胞検出方法および細胞検出装置 - Google Patents

Abstract

第１の方向に所定の間隔で複数のマイクロチャンバーが配列されているマイクロチャンバー列が複数列配置され、マイクロチャンバーに蛍光物質で標識された１または２以上の細胞が収容されているチップを準備する。次いで、チップに励起光を照射して、検出領域における蛍光物質の蛍光を検出する。蛍光を検出するときには、検出領域を第１の方向および第１の方向に直交する第２の方向に走査することにより行う。第１の方向における検出領域の長さは、第１の方向において互いに隣接する２つのマイクロチャンバー間の間隔以下である。第２の方向における検出領域の長さは、第２の方向におけるマイクロチャンバーの長さ以上である。

Description

本発明は、細胞検出方法およびこの細胞検出方法を行うための細胞検出装置に関する。

循環腫瘍細胞（ＣＴＣ）や循環血管内皮細胞（ＣＥＣ）、循環血管内皮前駆細胞（ＣＥＰ）、各種幹細胞など（以下「希少細胞」ともいう）は、病態に応じて血液中に極めて稀に存在する。このような希少細胞の検出は、臨床的に有用であることは明らかであるが、極めて難しい。近年、様々な細胞分離手法を応用して希少細胞の検出が試みられており、様々な検出装置が製品化されている。たとえば、血液などの検体中に対象の希少細胞が存在するかどうかを検査する場合に、検体に由来する細胞懸濁液をデバイスに展開した後、展開された全細胞を解析することが提案されている。

一般的に、希少細胞の検出は、顕微鏡を用いて行われている。この方法では、細胞懸濁液を平面状に展開した後、顕微鏡により全細胞を観察して、希少細胞を検出する。

また、希少細胞の他の検出方法として、マイクロアレイスキャナーを用いた方法が開示されている（非特許文献１参照）。この方法では、複数のマイクロチャンバーを有するチップに細胞懸濁液を展開してマイクロチャンバー内に細胞を収容し、希少細胞を蛍光物質で標識する。そして、マイクロアレイスキャナーを用いて、細胞と同じ程度の大きさの照射スポットを走査して励起光を全細胞に照射し、希少細胞を標識した蛍光物質から放出された蛍光を検出することで、希少細胞を検出する。

S. Yatsushiro et al., "Rapid and Highly Sensitive Detection of Malaria-Infected Erythrocytes Using a Cell Microarray Chip", PloS ONE, Vol. 5, e13179.

顕微鏡を用いた希少細胞の検出方法では、例えば高い倍率で全細胞を観察すると、高感度で希少細胞を検出することができるが、視野が狭いため検出時間が長くなってしまう。一方、低い倍率で全細胞を観察すると、視野が広くなるため検出時間を短縮することができるが、検出感度が下がってしまい、一部の希少細胞を検出できないおそれがある。

また、非特許文献１に記載の希少細胞の検出方法では、細胞と同じ程度の大きさの照射スポットを走査して全細胞を解析するため、高感度で細胞を検出することができるが、検出時間が長くなってしまう。

このように、従来の希少細胞の検出方法では、高い検出感度および検出時間の短縮を両立することができなかった。

本発明の目的は、複数のマイクロチャンバーを有するチップを用いて、多数の細胞から目的の希少細胞を高感度かつ短時間で検出することができる細胞検出方法を提供することである。また、本発明の目的は、この細胞検出方法を行うための細胞検出装置を提供することでもある。

本発明者らは、マイクロチャンバーに対応した所定の大きさおよび形状の照射スポットを走査して、マイクロチャンバー内に収容された細胞に励起光を照射することで上記課題を解決できることを見出し、さらに検討を加えて本発明を完成させた。

すなわち、本発明は、以下の細胞検出方法に関する。

［１］第１の方向に所定の間隔で複数のマイクロチャンバーが配列されているマイクロチャンバー列が複数列配置され、かつ前記マイクロチャンバーに蛍光物質で標識された１または２以上の細胞が収容されているチップを準備する第１工程と、前記チップに励起光を照射して、検出領域における蛍光物質の蛍光を検出する第２工程と、を有し、前記第２工程は、前記検出領域を前記第１の方向に走査することと、前記第１の方向に直交する第２の方向に移動することとを繰り返すことにより行い、前記第１の方向における前記検出領域の長さは、前記第１の方向において互いに隣接する２つの前記マイクロチャンバー間の間隔以下であり、前記第２の方向における前記検出領域の長さは、前記第２の方向における前記マイクロチャンバーの長さ以上である、細胞検出方法。
［２］前記チップには、前記第１の方向に配列された複数の前記マイクロチャンバーを含むチャンバー列が、前記第２の方向に複数列配置されており、互いに隣接する２つの前記チャンバー列に含まれる、前記マイクロチャンバーのそれぞれは、前記第１の方向において重複しておらず、前記第１の方向における前記検出領域の長さは、前記２つのチャンバー列内で前記第１の方向において最も近接する２つの前記マイクロチャンバー間の前記第１の方向における間隔以下であり、前記第２の方向における前記検出領域の長さは、前記２つのチャンバー列の一方のチャンバー列に含まれる前記マイクロチャンバーの前記第２の方向における長さと、前記２つのチャンバー列の他方のチャンバー列に含まれる前記マイクロチャンバーの前記第２の方向における長さと、前記一方のチャンバー列に含まれる前記マイクロチャンバーと前記他方のチャンバー列に含まれる前記マイクロチャンバーとの間の前記第２の方向における間隔との合計以上である、［１］に記載の細胞検出方法。
［３］前記チップには、前記第１の方向に配列された複数の前記マイクロチャンバーを含むチャンバー列が、前記第２の方向に複数列配置されており、互いに隣接する２つの前記チャンバー列のうち、一方のチャンバー列に含まれる前記マイクロチャンバーと、他方のチャンバー列に含まれ、かつ前記一方のチャンバー列に含まれる前記マイクロチャンバーと最も近接する前記マイクロチャンバーとは、前記第１の方向において重複しており、前記第２の方向における前記検出領域の長さは、前記一方のチャンバー列に含まれる前記マイクロチャンバーの前記第２の方向における長さと、前記一方のチャンバー列に含まれる前記マイクロチャンバーと前記他方のチャンバー列に含まれる前記マイクロチャンバーとの間の前記第２の方向における間隔との合計未満である、［１］に記載の細胞検出方法。
［４］前記第２工程は、前記蛍光を検出するのと同時に、検出された前記蛍光の位置情報をさらに取得し、前記第２工程の後、前記蛍光の検出結果および前記位置情報に基づいて、前記蛍光が検出された前記マイクロチャンバーに収容された前記細胞を撮像する第３工程をさらに有する、［１］〜［３］のいずれか一項に記載の細胞検出方法。
［５］前記検出領域は、前記励起光の照射スポットに一致する、［１］〜［４］のいずれか一項に記載の細胞検出方法。
［６］前記検出領域は、前記励起光の照射スポットの一部である、［１］〜［４］のいずれか一項に記載の細胞検出方法。
［７］前記検出領域は、矩形であり、前記第１の方向における前記検出領域の長さは、１０〜２５μｍの範囲内であり、前記第２の方向における前記検出領域の長さは、５０〜５００μｍの範囲内である、［１］〜［６］のいずれか一項に記載の細胞検出方法。
［８］前記検出領域は、直径が２０〜５００μｍの円形である、［１］〜［６］のいずれか一項に記載の細胞検出方法。

また、本発明は、以下の細胞検出装置に関する。

［９］第１の方向に所定の間隔で複数のマイクロチャンバーが配列されているマイクロチャンバー列が複数列配置され、かつ前記マイクロチャンバーに蛍光物質で標識された１または２以上の細胞が収容されているチップを保持するためのホルダーと、前記チップに励起光を照射する光照射部と、前記光照射部から照射された励起光により検出領域における蛍光物質の蛍光を検出する光検出部と、前記光照射部と前記ホルダーとの間、または前記ホルダーと前記光検出部との間に配置され、前記検出領域を規定する検出領域規定部と、前記チップにおける前記検出領域の位置を移動させるために、前記ホルダーと、前記光照射部、前記検出領域規定部および前記光検出部とを相対的に移動させる移動部と、を有し、前記第１の方向における前記検出領域の長さは、前記第１の方向において互いに隣接する２つの前記マイクロチャンバー間の間隔以下であり、第２の方向における前記検出領域の長さは、前記第２の方向における前記マイクロチャンバーの長さ以上である、細胞検出装置。
［１０］前記光検出部により検出した前記蛍光物質の位置情報を取得する位置情報取得部と、前記光検出部による前記蛍光の検出結果および前記位置情報取得部により取得した前記位置情報に基づいて、前記マイクロチャンバーに収容された前記蛍光物質で標識された細胞を撮像する撮像部と、をさらに有する、［９］に記載の細胞検出装置。
［１１］前記検出領域規定部は、前記光照射部と前記ホルダーとの間に配置され、前記光照射部から出射された励起光のうち、前記検出領域に照射する光のみを通過させる絞りである、［９］または［１０］に記載の細胞検出装置。
［１２］前記検出領域規定部は、前記ホルダーと前記光検出部との間に配置され、前記照射スポットから放出された前記蛍光のうち、前記検出領域から放出された前記蛍光のみを通過させる絞りである、［９］または［１０］に記載の細胞検出装置。
［１３］前記検出領域は、矩形であり、前記第１の方向における前記検出領域の長さは、１０〜２５μｍの範囲内であり、前記第２の方向における前記検出領域の長さは、５０〜５００μｍの範囲内である、［９］〜［１２］のいずれか一項に記載の細胞検出装置。
［１４］前記検出領域は、直径が２０〜５００μｍの円形である、［９］〜［１２］のいずれか一項に記載の細胞検出装置。

本発明によれば、多数の細胞中から希少細胞を短時間で漏れなく検出することができる。

図１Ａ，Ｂは、細胞展開用デバイスの構成を示す図である。 図２Ａ〜Ｃは、細胞展開用デバイスの構成を示す図である。 図３は、チップの部分拡大断面図である。 図４は、チップにおけるマイクロチャンバーの配置を示す模式図である。 図５Ａ，Ｂは、マイクロチャンバーの他の配置を示す模式図である。 図６は、実施の形態１に係る細胞検出装置の模式図である。 図７Ａ，Ｂは、検出領域の大きさを説明するための模式図である。 図８Ａ，Ｂは、検出領域の大きさを説明するための模式図である。 図９Ａ〜Ｃは、照射スポットと検出領域との関係を説明するための模式図である。 図１０Ａ〜Ｃは、照射スポットと検出領域との関係を説明するための模式図である。 図１１は、照射スポットの走査および移動を説明するための図である。 図１２は、照射スポットの他の走査および移動を説明するための図である。 図１３は、実施の形態２に係る細胞検出装置の模式図である。 図１４Ａ〜Ｄは、実施例１における循環腫瘍細胞の検出結果である。 図１５Ａ，Ｂは、実施例２における循環腫瘍細胞の検出結果である。 図１６Ａ〜Ｃは、実施例３における循環腫瘍細胞の検出結果である。

以下、本発明の実施の形態について、図面を参照して詳細に説明する。

［実施の形態１］
実施の形態１における細胞検出装置は、細胞展開用デバイスを装着した状態で使用される。説明の便宜のため、以下の説明では、細胞展開用デバイス（チップ）を説明した後、細胞検出装置について説明する。

（細胞展開用デバイスの構成）
図１および図２は、細胞展開用デバイス１６０の構成を示す図である。図１Ａは、細胞展開用デバイス１６０の平面図であり、図１Ｂは、図１Ａに示されるＡ−Ａ線の断面図である。

図１Ａに示されるように、細胞展開用デバイス１６０は、チップ１６１、枠体１６２および天板１６３を有する。図２Ａは、チップ１６１の平面図であり、図２Ｂは、枠体１６２の平面図であり、図２Ｃは、天板１６３の平面図である。

図１および図２に示されるように、チップ１６１は、一方の面に複数のマイクロチャンバー１６５を有する（図１Ｂ参照）。このように、複数のマイクロチャンバー１６５を有するチップ１６１は、マイクロチャンバーアレイ（ＭＣＡ）とも言われる。ここで、「マイクロチャンバー」とは、１個または２個以上の細胞を収容し、保持するための微細な有底の凹部（マイクロウェル）を意味する。また、「細胞を保持する」とは、マイクロチャンバー１６５に収容された細胞が、後述する流路１６４内に液体を流したときにマイクロチャンバー１６５外に出難くすることを意味する。チップ１６１のマイクロチャンバー１６５が形成されている面は、細胞展開用デバイス１６０の流路１６４の底面となる。各マイクロチャンバー１６５は、流路１６４に対して開口している。チップ１６１の構成については、別途詳細に説明する。

枠体１６２は、チップ１６１と天板１６３との間に配置された、貫通孔を有する薄板である（図２Ｂ参照）。この貫通孔は、検体に由来する細胞懸濁液を流すための流路１６４となる。流路１６４（貫通孔）の形状は、マイクロチャンバー１６５上に細胞懸濁液を流すことが可能であれば、特に限定されず、用途に応じて適宜選択されうる。また、枠体１６２の厚みは、特に限定されず、所望の流路の高さ（深さ）に応じて適宜設定される。たとえば、枠体１６２の厚みは、５０〜５００μｍの範囲内であり、流路１６４の高さは、５０〜５００μｍの範囲内である。枠体１６２の素材は、特に限定されず、公知のマイクロプレートなどと同じ素材であってもよい。枠体１６２の素材の例には、ポリスチレン、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリアミド、ポリカーボネート、ポリジメチルシロキサン、ポリメチルメタクリレート、環状オレフィンコポリマーなどの樹脂が含まれる。

天板１６３は、枠体１６２の上に配置された、２つの貫通孔を有する薄板である（図２Ｃ参照）。これらの貫通孔は、それぞれ、流路１６４内に液体（例えば細胞懸濁液や洗浄液、染色液など）を導入するための導入口１６６と、流路１６４内から液体を排出するための排出口１６７となる。通常、導入口１６６は、流路１６４の一端に連通し、排出口１６７は、流路１６４の他端に連通する。導入口１６６および排出口１６７の形状は、特に限定されない。また、天板１６３の厚みも、必要な強度を確保できれば特に限定されない。天板１６３の素材は、特に限定されないが、後述の細胞検出装置１００により照射される励起光を透過する観点からは、光透過性を有する素材であることが好ましい。天板１６３の素材としては、枠体１６２と同じ樹脂を使用することができる。

チップ１６１、枠体１６２および天板１６３は、この順番で積層され、互いに固定されている。これらを固定する方法は特に限定されないが、観察やメンテナンスの観点からは、互いに取り外し可能に固定されることが好ましい。固定方法の例には、係合による固定、螺子を用いた固定、粘着剤を用いた固定が含まれる。

図１Ａおよび図２Ｂに示されるように、細胞展開用デバイス１６０内に形成された流路１６４は、導入口１６６および排出口１６７を介して外部に連通している。導入口１６６から液体（例えば細胞懸濁液）を導入することで、流路１６４内に液体を満たすことができる。このとき、液体は、導入口１６６から排出口１６７に向かって流路１６４内を流れる。細胞懸濁液で流路１６４内を満たした場合、細胞はチップ１６１上に沈降し、マイクロチャンバー１６５の底面に付着する。すなわち、細胞は、マイクロチャンバー１６５内に収容される。この後、洗浄や染色などを行い、外部からマイクロチャンバー１６５内に収容されている細胞を、細胞検出装置１００などを用いて観察することで、各種分析を行うことができる。

（チップの構成）
次に、チップ１６１について、図面を用いて詳細に説明する。

図３は、チップ１６１の部分拡大断面図である。図２Ａおよび図３に示されるように、チップ１６１の一方の面には、複数のマイクロチャンバー１６５（有底の凹部）が形成されている。チップ１６１の素材は、特に限定されないが、天板１６３と同様に光透過性を有する素材であることが好ましい。チップ１６１の素材は、枠体１６２および天板１６３と同じ樹脂を使用することができる。チップ１６１の厚みは、必要な強度を確保できれば特に限定されない。

図４は、チップ１６１における複数のマイクロチャンバー１６５の配置の一例を示した図である。図４において、左側に記載されている１〜ｎは、チャンバー列の番号を示している。ｍは、１≦ｍ＜ｎを満たす整数であり、任意のチャンバー列の番号を示している。

図４に示されるように、チップ１６１には、第１の方向Ｄ１において所定の間隔で配列された複数のマイクロチャンバー１６５を含むチャンバー列が、第２の方向Ｄ２に複数列配置されている。各チャンバー列に含まれるマイクロチャンバー１６５の数は、特に限定されない。本実施の形態では、各チャンバー列は、２００個のマイクロチャンバー１６５を有する。また、チャンバー列の数も、特に限定されない。本実施の形態では、チップ１６１は、１００列のチャンバー列を有する。すなわち、チップ１６１は、２００００個のマイクロチャンバー１６５を有する。

マイクロチャンバー１６５の開口部の形状は、特に限定されない。マイクロチャンバー１６５の開口部の形状の例には、円形、楕円形および多角形が含まれる。本実施の形態では、開口部の形状は、円形である。また、マイクロチャンバー１６５の開口部の大きさは、特に限定されず、収容する細胞の種類や１個のマイクロチャンバー１６５に収容する細胞の数などに応じて適宜設定されうる。通常は、開口部の大きさは、マイクロチャンバー１６５の底面に１０〜１５個程度の細胞が付着できる大きさであることが好ましい。たとえば、開口部の直径は、２０〜５００μｍの範囲内であり、マイクロチャンバー１６５の深さは、２０〜１００μｍの範囲内である。なお、開口部の直径は、複数のマイクロチャンバー１６５において同じであってもよいし、それぞれ異なっていてもよい。本実施の形態では、開口部の直径は、すべてのマイクロチャンバー１６５で同じである。

第１の方向Ｄ１において互いに隣接するマイクロチャンバー１６５間の間隔ｄ１は、特に限定されない。間隔ｄ１は、同じであってもよいし、それぞれ異なっていてもよい。本実施の形態では、間隔ｄ１は、一定である。すなわち、各チャンバー列において、複数のマイクロチャンバー１６５は、等間隔に配置されている。第２の方向Ｄ２におけるチャンバー列間の間隔ｄ２は、特に限定されず、適宜設定される。本実施の形態では、間隔ｄ２は、一定である。すなわち、複数のチャンバー列は、等間隔に配置されている。

第２の方向Ｄ２において互いに隣接する２つのチャンバー列に含まれるマイクロチャンバー１６５のそれぞれは、第１の方向Ｄ１において重複していない。すなわち、図４に示されるように、第ｍ列目のチャンバー列に含まれる特定のマイクロチャンバー１６５と、第（ｍ＋１）列目のチャンバー列に含まれ、かつ前記特定のマイクロチャンバー１６５に最も近接するマイクロチャンバー１６５とをチップ１６１の側面から見た場合、これらの間には間隔ｄ３が設けられている。間隔ｄ３の長さは、特に限定されない。間隔ｄ３の長さは、後述する蛍光の検出において蛍光のシグナルが重ならない程度であればよい。これにより、例えば２つのチャンバー列に跨がる照射スポットを第１の方向Ｄ１に走査しても、１つのマイクロチャンバー１６５ごとに蛍光を検出することができる。

本実施の形態では、複数のマイクロチャンバー１６５は、正三角格子（六角格子）状に配列されている。すなわち、図４に示されるように、チャンバー列に含まれる複数のマイクロチャンバー１６５のそれぞれの中心を通る直線Ｌ１と、各チャンバー列のマイクロチャンバー１６５の中心を通る直線であって、前記直線Ｌ１に対して最も傾斜角が大きい直線Ｌ２とを考える。この場合、直線Ｌ１と直線Ｌ２とのなす角度のうち、小さい角度θ１は、６０°である。互いに隣接する３つのマイクロチャンバー１６５は、正三角形の頂点に位置するように配置されている。

なお、本実施の形態では、流路１６４を有する閉鎖系の細胞展開用デバイス１６０を使用したが、流路１６４を有さない解放系の細胞展開用デバイスを使用してもよい。すなわち、チップ１６１を細胞展開用デバイスとしても使用することもできる。

また、本実施の形態では、複数のマイクロチャンバー１６５が図４に示されるように配列されている細胞展開用デバイス１６０を使用したが、複数のマイクロチャンバー１６５の配置はこれに限定されない。たとえば、第ｍ列目のチャンバー列に含まれる特定のマイクロチャンバー１６５と、第（ｍ＋１）列目のチャンバー列に含まれ、第ｍ列目のチャンバー列に含まれる前記特定のマイクロチャンバー１６５と最も近接するマイクロチャンバー１６５とは、第１の方向において部分的に重複していてもよいし（図５Ａ参照）、全部が重複していてもよい（図５Ｂ参照）。後者の場合は、複数のマイクロチャンバー１６５は、矩形格子（正方格子）状に配列される。

（細胞検出装置の構成）
次に、上述した細胞展開用デバイス１６０を装着して使用される本発明の実施の形態１に係る細胞検出装置１００について説明する。細胞検出装置１００は、細胞展開用デバイス１６０のマイクロチャンバー１６５内に収容された、蛍光物質で標識された希少細胞を含む全細胞に励起光を照射し、励起光の照射スポット内の検出領域から放出された蛍光を検出することで、全細胞中に含まれる希少細胞を検出するための装置である。

図６は、細胞検出装置１００の模式図である。図６に示されるように、細胞検出装置１００は、ホルダー１１０、光照射部１２０、光検出部１３０、検出領域規定部１４０、移動部１５０および制御部（図示省略）を有する。細胞検出装置１００には、チップ１６１を含む細胞展開用デバイス１６０が装着される。

ホルダー１１０は、細胞展開用デバイス１６０を所定の位置に保持する。この後説明するように、ホルダー１１０は、細胞展開用デバイス１６０を保持した状態で、移動部１５０により水平方向に移動させられる。

光照射部１２０および光検出部１３０は、ホルダー１１０の上方に配置されている。光照射部１２０は、ホルダー１１０に保持された細胞展開用デバイス１６０（チップ１６１）に励起光を照射する。光検出部１３０は、細胞展開用デバイス１６０（チップ１６１）から放出された蛍光を検出する。

光照射部１２０に含まれる励起光を照射するための光源の種類は、特に限定されず、使用する蛍光物質の種類などに応じて適宜選択すればよい。光源は、例えばレーザーダイオードである。励起光の波長は、細胞展開用デバイス１６０の自家蛍光の影響を排除する観点からは、長波長であることが好ましい。励起光の波長は、例えば６００〜７８０ｎｍの範囲内である。

光検出部１３０の種類は、微弱な蛍光を検出することが可能であれば特に限定されない。光検出部１３０の例には、光電子増倍管（ＰＭＴ：photo-multiplier tube）やフォトダイオードなどが含まれる。本実施の形態では、光検出部１３０は、光電子増倍管である。

光照射部１２０から細胞展開用デバイス１６０までの励起光の光路上には、第１レンズ１２１、検出領域規定部１４０、第２レンズ１２２、ダイクロイックミラー１２３および対物レンズ１２４が、光照射部１２０側から順番に配置されている。光照射部１２０から出射された励起光は、第１レンズ１２１、検出領域規定部１４０および第２レンズ１２２を通過した後、ダイクロイックミラー１２３で細胞展開用デバイス１６０に向けて反射される。ダイクロイックミラー１２３で反射した励起光は、対物レンズ１２４により細胞展開用デバイス１６０（チップ１６１）のマイクロチャンバー１６５の底面近傍に集光される。検出領域規定部１４０については、別途改めて説明する。

また、細胞展開用デバイス１６０から光検出部１３０までの蛍光の光路上には、対物レンズ１２４、ダイクロイックミラー１２３、フィルター１３１、ピンホール１３２および第３レンズ１３３が、細胞展開用デバイス１６０側から順番に配置されている。細胞展開用デバイス１６０から放出された蛍光は、対物レンズ１２４、ダイクロイックミラー１２３、フィルター１３１およびピンホール１３２を通過した後、第３レンズ１３３により光検出部１３０の受光面に結像させられる。フィルター１３１は、例えば励起光カットフィルターや減光フィルターなどである。励起光カットフィルターは、励起光や外光などを遮断し、Ｓ／Ｎ比を向上させる。減光フィルターは、蛍光強度を光検出部１３０に合わせて調整する。ピンホール１３２は、励起光の焦点（マイクロチャンバー１６５の底面近傍）から放出された蛍光以外の光を遮断し、Ｓ／Ｎ比を向上させる。ピンホール１３２の形状は、特に限定されず、例えば円形や矩形などである。ピンホール１３２の大きさは、励起光の照射スポットの形状や使用する光学素子に応じて適宜設定される。

検出領域規定部１４０は、光照射部１２０と細胞展開用デバイス１６０（ホルダー１１０）との間、または細胞展開用デバイス１６０（ホルダー１１０）と光検出部１３０との間に配置され、チップ１６１上の検出領域Ａを規定する。ここで「検出領域」とは、光検出部１３０により蛍光を検出される領域を意味する。通常、励起光の照射スポットＳ外からは検出すべき蛍光は放出されないため、検出領域Ａはチップ１６１上の励起光の照射スポットＳ内に設定される。検出領域Ａは、励起光の照射スポットＳと一致していてもよいし、照射スポットＳの一部であってもよい。

たとえば、検出領域規定部１４０は、光照射部１２０と細胞展開用デバイス１６０（ホルダー１１０）との間に配置され、光照射部１２０から出射された励起光のうち、検出領域Ａに照射する光のみを通過させる絞り（スリットやアパーチャーなど）であってもよい。この場合、検出領域Ａは、励起光の照射スポットＳと一致する。また、検出領域規定部１４０は、細胞展開用デバイス１６０（ホルダー１１０）と光照射部１２０との間に配置され、励起光の照射スポットＳから放出された蛍光のうち、検出領域Ａから放出された蛍光のみを通過させる絞り（スリットやアパーチャーなど）であってもよい。この場合、検出領域Ａは、励起光の照射スポットＳの一部である。図６に示されるように、本実施の形態では、検出領域規定部１４０は、光照射部１２０と細胞展開用デバイス１６０（ホルダー１１０）との間に配置されている。

励起光の照射スポットＳの大きさは、検出領域Ａの大きさ以上であれば特に限定されない。また、励起光の照射スポットＳの形状も、特に限定されない。通常、照射スポットＳの形状は円形であるが、本実施の形態のように光照射部１２０と細胞展開用デバイス１６０（ホルダー１１０）との間に検出領域規定部１４０が配置されている場合は、照射スポットＳ（検出領域Ａ）の形状は、様々な形状を採りうる。

一方、検出領域Ａの大きさおよび形状は、この後説明するように、細胞展開用デバイス１６０におけるマイクロチャンバー１６５の配置に応じて制限される。少なくとも、チップ１６１の第１の方向における検出領域Ａの長さは、第１の方向において互いに隣接する２つのマイクロチャンバー１６５間の間隔ｄ１（図４参照）以下であり、第２の方向における検出領域Ａの長さは、第２の方向におけるマイクロチャンバー１６５の長さ以上である。検出領域Ａの形状の例には、円形、楕円形および矩形が含まれる。検出領域Ａの形状は、検出感度を高める観点からは、楕円形または矩形であることが好ましい。本実施の形態では、照射スポットＳの形状は、横１０〜２５μｍ×縦５０〜５００μｍの矩形である。

図７および図８は、本実施の形態における、チップ１６１上の検出領域Ａの大きさを説明するための図である。これらの図では、照射スポットＳ（検出領域Ａ）の走査を、２列のチャンバー列ごとに行うことを前提としている（２列照射）。図７Ａおよび図８Ａは、図７Ｂおよび図８Ｂと比較して、検出領域Ａのより好ましい例を示している。

本実施の形態では、図７Ａに示されるように、第１の方向Ｄ１における検出領域Ａの長さは、互いに隣接する２つのチャンバー列内で第１の方向Ｄ１において最も近接する２つのマイクロチャンバー１６５間の第１の方向Ｄ１における間隔ｄ４以下である。第１の方向Ｄ１における検出領域Ａの長さが間隔ｄ４よりも長い場合、図７Ｂに示されるように、それぞれ異なるチャンバー列に含まれる２つのマイクロチャンバー１６５から放出される蛍光を同時に検出してしまうことになる。一方、第１の方向Ｄ１における検出領域Ａの長さの最小値は、特に限定されないが、検出感度の観点からは、検出対象の細胞の大きさと同程度が好ましい。

また、本実施の形態では、図８Ａに示されるように、第２の方向Ｄ２における検出領域Ａの長さは、相互に隣接する２つのチャンバー列の一方のチャンバー列に含まれるマイクロチャンバー１６５の第２の方向Ｄ２における長さｄ５ａと、２つのチャンバー列の他方のチャンバー列に含まれるマイクロチャンバー１６５の第２の方向における長さｄ５ｂと、一方のチャンバー列に含まれるマイクロチャンバー１６５と他方のチャンバー列に含まれるマイクロチャンバー１６５との間の第２の方向における間隔ｄ５ｃとの合計ｄ５以上である。また、図８Ｂに示されるように、第２の方向Ｄ２における検出領域Ａの長さは、上述したｄ５（ｄ５ａ、ｄ５ｂおよびｄ５ｃ）と、ｄ５ｃと同様の２つのマイクロチャンバー１６５との間の第２の方向における間隔ｄ５ｄとの合計ｄ５’以下である。第２の方向Ｄ２における検出領域Ａの長さがｄ５以上であって、かつｄ５’以下であれば、いずれかのチャンバー列に含まれるマイクロチャンバー１６５から放出された蛍光を検出することができる。

次に、照射スポットＳおよび検出領域Ａの関係について、図面を参照して詳細に説明する。図９および図１０は、照射スポットＳと、検出領域Ａとの関係を示す模式図である。図９は、光照射部１２０側に検出領域規定部１４０を配置した場合の照射スポットＳおよび検出領域Ａを示している。図９Ａは、励起光の光路を示す模式図であり、図９Ｂは、照射スポットＳおよび検出領域Ａを上側から見たときの模式図であり、図９Ｃは、蛍光の光路を示す模式図である。図１０は、光検出部１３０側に検出領域規定部１４０を配置した場合の照射スポットＳおよび検出領域Ａを示している。図１０Ａは、励起光の光路を示す模式図であり、図１０Ｂは、照射スポットＳおよび検出領域Ａを上側から見たときの模式図であり、図１０Ｃは、蛍光の光路を示す模式図である。

まず、図９を参照して、光照射部１２０側に検出領域規定部１４０が配置されている場合について説明する。図９Ａに示されるように、光照射部１２０側に検出領域規定部１４０が配置されている場合、光照射部１２０から出射された励起光の一部は、検出領域Ａと同じ形状の貫通孔を有する検出領域規定部１４０によって遮断され、検出領域規定部１４０の貫通孔を通過した励起光のみがチップ１６１に照射される。この場合、図９Ｂに示されるように、励起光の照射スポットＳの形状と検出領域Ａの形状とは一致する。そして、チップ１６１に励起光が照射されることによって、検出領域Ａにある蛍光物質から蛍光が放出される。このとき、励起光は、検出領域Ａのみに照射されているため、検出領域Ａのみから蛍光が放出される（図９Ｃ参照）。

次に、図１０を参照して、光検出部１３０側に検出領域規定部１４０が配置されている場合について説明する。図１０Ａに示されるように、光検出部１３０側に検出領域規定部１４０が配置されている場合、光照射部１２０から出射された励起光は、そのままチップ１６１に照射される。この場合、図１０Ｂに示されるように、照射スポットＳの大きさは、検出領域Ａよりも大きくなる。そして、チップ１６１に励起光が照射されることによって、検出領域Ａを含む照射スポットＳにある蛍光物質から蛍光が放出される。図１０Ｃに示されるように、照射スポットＳから放出された蛍光のうち、検出領域Ａ以外の領域から放出された蛍光は、検出領域Ａと同じ形状の貫通孔を有する検出領域規定部１４０によって遮断される。したがって、検出領域Ａから放出された蛍光のみが、光検出部１３０により検出される。このように、検出領域Ａは、例えば励起光を照射する領域を制限したり、蛍光を検出する領域を制限したり、またはそれらの組み合わせなどによって設定することができる。また、蛍光の検出精度や蛍光損失などの観点からは、検出領域Ａは、励起光の照射領域に設定されることが好ましい。

細胞検出装置１００の説明に戻る。移動部１５０は、ホルダー１１０を水平方向（ＸＹ方向）に移動させることで、ホルダー１１０に保持された細胞展開用デバイス１６０を水平方向（ＸＹ方向）に移動させる。光照射部１２０が励起光を細胞展開用デバイス１６０に照射している状態で、細胞展開用デバイス１６０を水平方向（ＸＹ方向）に移動させることで、励起光の照射スポットＳでチップ１６１を走査することができる。たとえば、移動部１５０は、ホルダー１１０をＸ軸方向（例えば第１の方向Ｄ１）に移動するＸ軸移動機構１５２と、ホルダー１１０をＹ軸方向（例えば第１の方向に直交する第２の方向Ｄ２）に移動するＹ軸移動機構１５４とを有する。移動部１５０は、Ｘ軸移動機構１５２およびＹ軸移動機構１５４を駆動させてホルダー１１０を任意の方向に移動させる。

図１１は、照射スポットＳ（検出領域Ａ）の走査および移動を説明するための図である。図１１に示されるように、移動部１５０は、照射スポットＳ（検出領域Ａ）が、互いに隣接する２つのチャンバー列（第ｍ列目および第（ｍ＋１）列目のチャンバー列）の一方の端部（移動開始位置）から他方の端部（移動終了位置）まで第１の方向Ｄ１に向かって移動するように、細胞展開用デバイス１６０を移動させる（図１１の実線矢印参照）。

次いで、照射スポットＳ（検出領域Ａ）を第２の方向Ｄ２に移動させる。具体的には、図１１に示されるように、前記２つのチャンバー列（第ｍ列目および第（ｍ＋１）列目のチャンバー列）の移動終了位置に到達した照射スポットＳ（検出領域Ａ）を、次の２つのチャンバー列（第（ｍ＋２）列目および第（ｍ＋３）列目のチャンバー列）の移動開始位置に移動させる（図１１の点線矢印参照）。このとき、光照射部１２０は、励起光を照射し続けていてもよいし、照射していなくてもよい。このように、一度走査したチャンバー列をもう一度走査しないように、かつ走査しないチャンバー列が無いように、照射スポットＳ（検出領域Ａ）を移動させる。これらの工程を、最後のチャンバー列（第ｎ列目のチャンバー列）を走査し終わるまで繰り返す。

制御部（図示省略）は、光照射部１２０、光検出部１３０および移動部１５０と接続されており、細胞検出装置１００を統括的に制御する。

このように、細胞検出装置１００は、励起光の照射スポットを走査しながら、蛍光を検出することによって、チップ１６１に形成された複数のマイクロチャンバー１６５に収容された細胞を連続して調べる。

（細胞検出方法）
次に、細胞検出装置１００を用いて、多数の細胞から目的の希少細胞を検出する方法について説明する。

まず、複数のマイクロチャンバー１６５に細胞が収容されたチップ１６１（細胞展開用デバイス１６０）を準備する（第１工程）。たとえば、流路１６４内を細胞懸濁液（例えば、血液またはその希釈液）で満たした後、細胞懸濁液中の細胞がわずかに移動するように細胞懸濁液を吸引することを２０回繰り返して（１回の吸引後に１０秒間停止）、マイクロチャンバー１６５内に細胞を収容する。そして、マイクロチャンバー１６５の開口部が上側を向くように、細胞が収容されたチップ１６１（細胞展開用デバイス１６０）をホルダー１１０に保持させる。

次いで、チップ１６１に励起光を照射するとともに、励起光の照射スポット内の検出領域Ａから放出された蛍光を検出する（第２工程）。まず、移動部１５０は、励起光の照射スポットＳが移動開始位置に位置するように、ホルダー１１０を介して細胞展開用デバイス１６０を移動させる。そして、移動部１５０は、照射スポットＳ（検出領域Ａ）が、互いに隣接する２つのチャンバー列（第ｍ列目および第（ｍ＋１）列目のチャンバー列）の移動開始位置から移動終了位置まで移動するように、細胞展開用デバイス１６０を第１の方向Ｄ１と１８０°逆方向に移動させる。

このとき、光照射部１２０は、移動部１５０がホルダー１１０を第１の方向Ｄ１と１８０°逆方向に移動させている間、所定の波長の励起光を出射し続ける。すなわち、光照射部１２０は、チャンバー列に含まれる複数のマイクロチャンバー１６５に収容された細胞（蛍光物質）に対して連続して励起光を照射する。蛍光物質は、励起光が照射されると同時に蛍光を発する。光検出部１３０は、このように放出される蛍光を連続して検出する。

次いで、移動部１５０は、励起光の照射スポットＳ（検出領域Ａ）が、次に互いに隣接する２つのチャンバー列（第（ｍ＋２）列目および第（ｍ＋３）列目のチャンバー列）の移動開始位置に移動するように、細胞展開用デバイス１６０を移動させる。

以上の照射スポットＳの走査および移動を繰り返すとともに、チップ１６１に励起光を照射しながら蛍光を検出することで、希少細胞を検出する。

以上の手順により、多数の細胞から目的の希少細胞を高感度、かつ短時間で検出することができる。なお、検出対象となる希少細胞の種類は、特に限定されない。検出対象の細胞の例には、血液循環癌細胞（ＣＴＣ）や循環血管内皮細胞（ＣＥＣ）、循環血管内皮前駆細胞（ＣＥＰ）、循環胎児細胞、抗原特異的Ｔ細胞、各種幹細胞などが含まれる。

なお、本実施の形態では、各チャンバー列について照射スポットが１回走査する例について説明したが、図１２に示されるように、各チャンバー列について照射スポットが２回走査するようにしてもよい。このようにすることで、より確実に希少細胞を検出することができる。

また、図５Ａまたは図５Ｂに示されるように、第１の方向Ｄ１において、互いに隣接するマイクロチャンバー１６５の少なくとも一部が重複して配置されている場合、第２の方向Ｄ２における検出領域Ａの長さは、第２の方向Ｄ２において隣接する２つのチャンバー列に同時に架からない長さである。具体的には、第２の方向Ｄ２における検出領域Ａの長さは、互いに隣接する２つのチャンバー列の一方のチャンバー列に含まれるマイクロチャンバー１６５の第２の方向Ｄ２における長さと、一方のチャンバー列に含まれるマイクロチャンバー１６５と他方のチャンバー列に含まれるマイクロチャンバー１６５との間の第２の方向における間隔との合計以下である。第２の方向Ｄ２における検出領域Ａの長さが、前述の長さ以下であれば、それぞれ異なるチャンバー列に含まれる２つのマイクロチャンバー１６５から放出される蛍光を同時に検出してしまうことがない。検出領域の第１の方向Ｄ１における長さについては、前述のとおりである。

また、このようなチップ１６１を装着した細胞検出装置１００を用いた細胞検出方法では、１つのチャンバー列ずつ希少細胞を検出することが好ましい。移動部１５０は、励起光の照射スポットＳ（検出領域Ａ）が、１つのチャンバー列第ｍ列目の移動開始位置から移動終了位置まで移動するように、細胞展開用デバイス１６０を第１の方向Ｄ１と１８０°逆方向に移動する。次いで、移動部１５０は、照射スポットＳ（検出領域Ａ）が、次のチャンバー列（第（ｍ＋１）列目）の移動開始位置に移動するように、細胞展開用デバイス１６０を移動する。このように、本実施の形態の細胞検出装置１００では、照射スポットＳ（検出領域Ａ）の走査をチャンバー列ごとに行ってもよい（１列照射）。

また、特に図示しないが、互いに隣接するチャンバー列（第ｍ列目および第（ｍ＋１）列目のチャンバー列）において、移動開始位置および移動終了位置は、互いに逆の位置に設定されていてもよい。この場合、移動部１５０は、照射スポットＳ（検出領域Ａ）が、第ｍ列目のチャンバー列の一方の端部（移動開始位置）から他方の端部（移動終了位置）まで第１の方向Ｄ１に向かって移動するように、細胞展開用デバイス１６０を移動させる。次いで、第ｍ列目のチャンバー列の他方の端部の移動終了位置に到達した照射スポットＳ（検出領域Ａ）を、第（ｍ＋１）列目のチャンバー列の移動開始位置に移動させる。このとき、第（ｍ＋１）列目のチャンバー列の移動開始位置は、第ｍ列目のチャンバー列の移動終了位置に隣接して位置する端部である。最後に、第（ｍ＋１）列目のチャンバー列の移動開始位置に到達した照射スポットＳ（検出領域Ａ）を、そのチャンバー列の他方の端部に位置する移動終了位置に移動させる。このとき、第（ｍ＋１）列目のチャンバー列の移動終了位置は、第ｍ列目のチャンバー列の移動開始位置に隣接して位置する端部である。これらの工程を、最後のチャンバー列を走査し終わるまで繰り返す。

［実施の形態２］
（細胞検出装置）
本発明の実施の形態２における細胞検出装置２００は、マイクロチャンバー１６５を撮像するための撮像部２５０を有し、かつ２種類の波長の励起光を照射可能に構成されている点において、実施の形態１に係る細胞検出装置１００と異なる。そこで、主として実施の形態１に係る細胞検出装置１００と異なる部分について説明する。

図１３は、実施の形態２における細胞検出装置２００の模式図である。図１３に示されるように、細胞検出装置２００は、ホルダー１１０、２つの光照射部１２０、２つの光検出部１３０、検出領域規定部１４０、移動部１５０、撮像部２５０および制御部（図示省略）を有する。なお、細胞検出装置２００には、実施の形態１と同じ細胞展開用デバイス１６０を使用することができる。

２つの光照射部１２０は、チップ１６１に対してそれぞれ異なる波長の励起光を照射する。２つの光検出部１３０は、２種類の励起光に対応するそれぞれ異なる波長の蛍光を検出する。

２つの光照射部１２０から細胞展開用デバイス１６０までの励起光の光路上には、２つの第１レンズ１２１、第１ダイクロイックミラー１３４、検出領域規定部１４０、第２レンズ１２２、第２ダイクロイックミラー１２３および対物レンズ１２４が光照射部１２０側から順番に配置されている。２つの光照射部１２０から出射された励起光は、第１レンズ１２２を通過して、第１ダイクロイックミラー１３４により結合される。そして結合した励起光は、検出領域規定部１４０および第２レンズ１２２を通過した後、第２ダイクロイックミラー１２３で細胞展開用デバイス１６０に向けて反射される。ダイクロイックミラー１２３で反射した励起光は、対物レンズ１２４により細胞展開用デバイス１６０（チップ１６１）のマイクロチャンバー１６５の底面近傍に集光される。

細胞展開用デバイス１６０から一方の光検出部１３０（図１３において下側に図示されている光検出部１３０）までの蛍光の光路上には、対物レンズ１２４、第２ダイクロイックミラー１２３、第３ダイクロイックミラー１３９、第４レンズ１３５、ピンホール１３２および第５レンズ１３６が配置されている。また、細胞展開用デバイス１６０から他方の光検出部１３０（図１３において上側に図示されている光検出部１３０）までの蛍光の光路上には、対物レンズ１２４、第２ダイクロイックミラー１２３、第３ダイクロイックミラー１３９、フィルター１３１、ハーフミラー１３７、第４レンズ１３５、ピンホール１３２および第５レンズ１３６が配置されている。また、細胞展開用デバイス１６０から撮像部２５０までの蛍光の光路上には、対物レンズ１２４、第２ダイクロイックミラー１２３、第３ダイクロイックミラー１３９、フィルター１３１、ハーフミラー１３７、第６レンズ１３８が配置されている。

細胞展開用デバイス１６０から放出された蛍光は、対物レンズ１２４および第２ダイクロイックミラー１２３を通過する。第２ダイクロイックミラー１２３を通過した蛍光の一部は、第３ダイクロイックミラー１３９で一方の光検出部１３０に向けて反射され、蛍光の残部は、第３ダイクロイックミラー１３９を通過する。第３ダイクロイックミラー１３９を通過した蛍光の一部は、フィルター１３１を通過した後、ハーフミラー１３７で他方の光検出部１３０に向けて反射される。第３ダイクロイックミラー１３９を通過した蛍光の残部は、ハーフミラー１３７を通過し、撮像部２５０に向かう。第３ダイクロイックミラー１３９またはハーフミラー１３７で反射した蛍光は、それぞれ、第４レンズ１３５、ピンホール１３２および第５レンズ１３６を通過して、光検出部１３０に到達する。ハーフミラー１３７を通過した蛍光は、第６レンズ１３８を通過して、撮像部２５０に到達する。

撮像部２５０は、光照射部１２０および光検出部１３０と一体に配置されている。撮像部２５０は、光検出部１２０による蛍光の検出結果および制御部（位置情報取得部）により取得した位置情報に基づいて、蛍光が検出されたマイクロチャンバー１６５に収容された細胞を撮像する。撮像部２５０の種類は、特に限定されない。撮像部２５０は、例えばＣＣＤカメラである。

制御部は、移動部１５０から送信される位置情報を記録する位置情報取得部としても機能する。制御部（位置情報取得部）は、光検出部１３０により検出された蛍光の強度と、位置情報とを関連付けて記録する。

（細胞検出方法）
実施の形態２に係る細胞検出装置２００の動作は、蛍光の位置情報を取得する点および希少細胞が収容されたマイクロチャンバー１６５を撮像する点において、実施の形態１に係る細胞検出装置１００の動作と異なる。そこで、実施の形態１に係る細胞検出装置１００の動作と異なる部分について主に説明する。

実施の形態２に係る細胞検出装置２００では、２種類の波長の励起光を照射し、２種類の波長の蛍光の検出を行うとともに、蛍光の位置情報を取得する。蛍光の位置情報は、例えば、基準位置に対するホルダー１１０（細胞展開用デバイス１６０）の移動距離として取得される。

そして、マイクロチャンバー１６５に収容された希少細胞を検出した後、撮像部２５０により、蛍光が検出されたマイクロチャンバー１６５内に収容された細胞を撮像する。移動部１５０は、蛍光が検出されたマイクロチャンバー１６５の位置情報に基づいて、撮像部２５０が当該マイクロチャンバー１６５の直上部に移動するように、細胞展開用デバイス１６０を移動させる。撮像部２５０は、直下に目的のマイクロチャンバー１６５が移動した後、マイクロチャンバー１６５内の細胞を撮像する。

以上のように、実施の形態２に係る細胞検出装置２００は、実施の形態１に係る細胞検出装置１００の効果に加えて、希少細胞の画像を取得することもできる。また、実施の形態２に係る細胞検出装置２００は、２波長の励起光を照射して、２波長の蛍光を同時に検出することもできる。

なお、撮像部２５０で複数色を観察する場合には、例えば第３ダイクロイックミラー１３９を取り外し、観察する色に対応してフィルター１３１の色を交換することによって行うことができる。また、例えば光検出部１３０が配置されている部分に撮像部２５０を切り替え可能に配置して、光検出と撮像とをそれぞれ行うようにしてもよい。

以下、本発明の実施例を参照して詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例により限定されない。

［実施例１］
実施例１では、実施の形態２に係る細胞検出装置２００を用いて、がん患者から採血された末梢血に含まれる血液循環癌細胞（ＣＴＣ）の検出を行った。

１．細胞懸濁液の調製
がん患者から採血した末梢血をリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）で希釈して血液の希釈液を得た。次いで、血液の希釈液１ｍＬにパラホルムアルデヒド（和光純薬工業株式会社）を４％の濃度となるように添加した後、緩やかに混和して、室温暗所にて１５分間反応させた。さらにＰＢＳを十分量添加して混和した後、懸濁液を遠心分離器により遠心分離した。遠心分離後の沈澱物に０．１％Ｔｗｅｅｎを含むＰＢＳを１ｍＬ、血液循環癌細胞（ＣＴＣ）標識用にAlexa Fluor 647で標識した抗ＣＫ抗体（Micromet社）溶液１０μＬ、白血球標識用にAlexa Fluor 488（ライフテクノロジーズ・ジャパン株式会社）で標識した抗ＣＤ４５抗体１０μＬをそれぞれ添加した。混合溶液を緩やかに混和しながら、室温暗所にて２５分間反応させた。さらに、細胞核染色用にＤＡＰＩ溶液（同仁化学研究所）を１０μＬ添加して、緩やかに混和しながら、室温暗所にて５分間反応させた。そして、遠心分離後に上澄み液とともに、細胞に結合していない抗体および蛍光色素を除去した。沈澱物にＰＢＳを添加して再び懸濁させて、細胞懸濁液を得た。なお、この細胞懸濁液に含まれている血液循環癌細胞（ＣＴＣ）の数は、他の検出方法により特定されている。

２．チャンバーの前処理および細胞の収容
深さ：５０μｍ、開口部の直径：１００μｍのマイクロチャンバー１６５を複数有するチップ１６１の上に、枠体１６２および天板１６３を配置して、幅：５ｍｍ、高さ：５００μｍの流路１６４を有する細胞展開用デバイス１６０を作製した。複数のマイクロチャンバー１６５は、第１の方向に３００μｍの間隔で配置されており、第２の方向に１５０μｍの間隔で配置されている。流路１６４内にブロッキング溶液（３％ＢＳＡを含むＰＢＳ）を１６ｍＬ／ｍｉｎで送液した。その後、ＰＢＳを流路１６４内に送液することで、余分なブロッキング液を流路１６４内から除去した。ブロッキング液を除去した流路１６４内に１６ｍＬ／ｍｉｎの流速で上記の細胞懸濁液を１０μＬ送液し、１０秒間静止した。細胞懸濁液の送液および静止を繰り返すことで、マイクロチャンバー１６５内にすべての細胞を収容した。

３．細胞の検出
実施の形態２に係る細胞検出装置２００を用いて、血液循環癌細胞（ＣＴＣ）の検出を行った。励起光は、ＣＴＣを標識したAlexa Fluor 647を励起するＨｅ−Ｎｅレーザー光（波長６３３ｎｍ）を使用した。検出領域規定部１４０として光照射部１２０側に矩形スリットを配置することで、照射スポットＳの形状を１０μｍ×１００μｍの矩形とした。本実施例では、照射スポットＳおよび検出領域Ａは、一致している。照射スポットＳの走査は、チャンバー列ごとに行った（１列照射）。このとき、照射スポットＳの走査（励起光の照射および蛍光の検出）およびチャンバー列間の走査スポットＳの移動に要した時間は、約２分であった。次いで、蛍光が検出されたマイクロチャンバー１６５に収容された細胞を、撮像部２５０により撮像した。

４．結果
図１４にＣＴＣの検出結果を示す。図１４Ａおよび図１４Ｂは、照射スポットＳの走査距離と、蛍光強度との関係を示すグラフである。図１４Ａは、１３個のマイクロチャンバー１６５を含む範囲を示している。図１４Ｂは、１個のマイクロチャンバー１６５を含む範囲を拡大して示している。なお、図１４Ａのグラフ中の曲線Ｃ１は、蛍光を示しており、曲線Ｃ２は、細胞展開用デバイス１６０からの反射光を示している。反射光の強度は、マイクロチャンバー１６５に応じて周期的に変化している。また、図１４Ｃは、蛍光が検出されたマイクロチャンバー１６５の写真であり、図１４Ｄは、図１４Ｃに示される写真の模式図である。なお、図１４Ｄでは、蛍光を発している細胞（ＣＴＣ）を黒色で示し、蛍光を発していない細胞を白色で示している。

図１４Ａ〜Ｄに示されるように、本実施の形態の方法により、血液循環癌細胞（ＣＴＣ）を短時間（約２分間）かつ高感度に検出することができた。また、検出したＣＴＣの数は、細胞展開用デバイス１６０内に導入したＣＴＣの数と完全に一致した（１００％）。

［実施例２］
１．細胞の検出
実施例２でも、実施の形態２に係る細胞検出装置２００を用いて、血液循環癌細胞（ＣＴＣ）の検出を行った。本実施例では、検出領域規定部１４０を光照射部１２０側ではなく光検出部１３０側に配置した。検出領域規定部１４０としては、矩形スリットを使用した。照射スポットＳの形状は、長径が３００μｍ、短径が５０μｍの楕円形であるが、検出領域Ａの形状は、１０μｍ×３００μｍの矩形である。照射スポットＳの走査は、２列のチャンバー列ごとに行った（図１１参照；２列照射）。このとき、照射スポットＳの走査（励起光の照射および蛍光の検出）およびチャンバー列間の走査スポットＳの移動に要した時間は、約１分であった。次いで、蛍光が検出されたマイクロチャンバー１６５に収容された細胞を撮像した。なお、実施例１と同じ細胞展開用デバイス１６０を使用した。

２．結果
図１５にＣＴＣの検出結果を示す。図１５Ａは、１２個のマイクロチャンバー１６５を含む範囲における、照射スポットＳの走査距離と、蛍光強度との関係を示すグラフである。グラフ中の曲線Ｃ１は、蛍光を示しており、曲線Ｃ２は、反射光を示している。また、図１５Ｂは、図１５Ａのグラフに対応する領域の細胞展開用デバイス１６０（マイクロチャンバー１６５）の写真である。黒い円は、マイクロチャンバー１６５であり、黒い円の中にある白い点は、蛍光を放出している細胞（ＣＴＣ）である。図１５に示されるように、隣接する２つのチャンバー列のマイクロチャンバー１６５の蛍光シグナルが重なることなく、マイクロチャンバー１６５ごとに区別して蛍光を検出することができた。また、検出したＣＴＣの数は、細胞展開用デバイス１６０内に導入したＣＴＣの数と完全に一致した（１００％）。

［実施例３］
１．細胞の検出
実施例３でも、実施の形態２に係る細胞検出装置２００を用いて、血液循環癌細胞（ＣＴＣ）の検出を行った。本実施例では、検出領域規定部１４０として、光照射部１２０側に円形スリットを配置することで、照射スポットＳの形状を直径１００μｍの円形とした。本実施例では、照射スポットＳおよび検出領域Ａは、一致している。照射スポットの走査は、チャンバー列ずつ行った（１列照射）。このとき、照射スポットＳの走査（励起光の照射および蛍光の検出）およびチャンバー列間の走査スポットＳの移動に要した時間は、約２分であった。

２．結果
図１６にＣＴＣの検出結果を示す。図１６Ａは、２つのマイクロチャンバー１６５を含む範囲を拡大した、照射スポットＳの走査位置と蛍光強度との関係を示すグラフである。図１６Ｂは、これらのマイクロチャンバー１６５の写真であり、図１６Ｃは、図１６Ｂに示される写真の模式図である。

本実施例においても、実施例１および実施例２と同様に、ＣＴＣを短時間でかつ高感度に検出することができた。また、検出したＣＴＣの数は、細胞展開用デバイス１６０内に導入したＣＴＣの数とほぼ一致した（９８％）。

［比較例］
１．細胞の検出
比較例では、マイクロアレイスキャナーを用いて、循環腫瘍細胞（ＣＴＣ）の検出を行った。比較例では、細胞展開用デバイス１６０の代わりに、平面基板上に細胞懸濁液を展開した。照射スポットＳの形状は、直径５μｍの円形である。基板全面（２５ｍｍ×７５ｍｍ）における蛍光の検出に要した時間は、約１５分であった。

２．結果
比較例においても、実施例１〜実施例３と同様に、ＣＴＣを検出することができた。また、検出したＣＴＣの数は、細胞展開用デバイス１６０内に導入したＣＴＣの数とほぼ一致した（９８％）。しかし、照射スポットが直径５μｍのマイクロアレイスキャナーを用いた検出のため、検出時間が約１５分と非常に長くなってしまった。

以上の結果から、本発明に係る細胞検出装置およびこの細胞検出装置を用いた細胞検出方法は、照射スポットが直径５μｍ程度のマイクロアレイスキャナーを用いた細胞検出と同程度以上の感度で、かつ短時間に希少細胞を検出することができることがわかる。

本発明の細胞検出方法および細胞検出装置は、高感度、かつ短時間で希少細胞を検出することができるため、例えば疾患の検査などに有用である。

本出願は、２０１３年８月１５日出願の特願２０１３−１６８７７８に基づく優先権を主張する。当該出願明細書および図面に記載された内容は、すべて本願明細書に援用される。

１００，２００ 細胞検出装置
１１０ ホルダー
１２０ 光照射部
１２１ 第１レンズ
１２２ 第２レンズ
１２３ ダイクロイックミラー（第２ダイクロイックミラー）
１２４ 対物レンズ
１３０ 光検出部
１３１ フィルター
１３２ ピンホール
１３３ 第３レンズ
１３４ 第１ダイクロイックミラー
１３５ 第４レンズ
１３６ 第５レンズ
１３７ ハーフミラー
１３８ 第６レンズ
１３９ 第３ダイクロイックミラー
１４０ 検出領域規定部
１５０ 移動部
１５２ Ｘ軸移動機構
１５４ Ｙ軸移動機構
１６０ 細胞展開用デバイス
１６１ チップ
１６２ 枠体
１６３ 天板
１６４ 流路
１６５ マイクロチャンバー
１６６ 導入口
１６７ 排出口
２５０ 撮像部
Ａ 検出領域
Ｓ 照射スポット

Claims (14)

1. 第１の方向に所定の間隔で複数のマイクロチャンバーが配列されているマイクロチャンバー列が複数列配置され、かつ前記マイクロチャンバーに蛍光物質で標識された１または２以上の細胞が収容されているチップを準備する第１工程と、
   前記チップに励起光を照射して、検出領域における蛍光物質の蛍光を検出する第２工程と、
   を有し、
   前記第２工程は、前記検出領域を前記第１の方向に走査することと、前記第１の方向に直交する第２の方向に移動することとを繰り返すことにより行い、
   前記第１の方向における前記検出領域の長さは、前記第１の方向において互いに隣接する２つの前記マイクロチャンバー間の間隔以下であり、
   前記第２の方向における前記検出領域の長さは、前記第２の方向における前記マイクロチャンバーの長さ以上である、
   細胞検出方法。
2. 前記チップには、前記第１の方向に配列された複数の前記マイクロチャンバーを含むチャンバー列が、前記第２の方向に複数列配置されており、
   互いに隣接する２つの前記チャンバー列に含まれる、前記マイクロチャンバーのそれぞれは、前記第１の方向において重複しておらず、
   前記第１の方向における前記検出領域の長さは、前記２つのチャンバー列内で前記第１の方向において最も近接する２つの前記マイクロチャンバー間の前記第１の方向における間隔以下であり、
   前記第２の方向における前記検出領域の長さは、前記２つのチャンバー列の一方のチャンバー列に含まれる前記マイクロチャンバーの前記第２の方向における長さと、前記２つのチャンバー列の他方のチャンバー列に含まれる前記マイクロチャンバーの前記第２の方向における長さと、前記一方のチャンバー列に含まれる前記マイクロチャンバーと前記他方のチャンバー列に含まれる前記マイクロチャンバーとの間の前記第２の方向における間隔との合計以上である、
   請求項１に記載の細胞検出方法。
3. 前記チップには、前記第１の方向に配列された複数の前記マイクロチャンバーを含むチャンバー列が、前記第２の方向に複数列配置されており、
   互いに隣接する２つの前記チャンバー列のうち、一方のチャンバー列に含まれる前記マイクロチャンバーと、他方のチャンバー列に含まれ、かつ前記一方のチャンバー列に含まれる前記マイクロチャンバーと最も近接する前記マイクロチャンバーとは、前記第１の方向において重複しており、
   前記第２の方向における前記検出領域の長さは、前記一方のチャンバー列に含まれる前記マイクロチャンバーの前記第２の方向における長さと、前記一方のチャンバー列に含まれる前記マイクロチャンバーと前記他方のチャンバー列に含まれる前記マイクロチャンバーとの間の前記第２の方向における間隔との合計未満である、
   請求項１に記載の細胞検出方法。
4. 前記第２工程は、前記蛍光を検出するのと同時に、検出された前記蛍光の位置情報をさらに取得し、
   前記第２工程の後、前記蛍光の検出結果および前記位置情報に基づいて、前記蛍光が検出された前記マイクロチャンバーに収容された前記細胞を撮像する第３工程をさらに有する、
   請求項１〜３のいずれか一項に記載の細胞検出方法。
5. 前記検出領域は、前記励起光の照射スポットに一致する、請求項１〜４のいずれか一項に記載の細胞検出方法。
6. 前記検出領域は、前記励起光の照射スポットの一部である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の細胞検出方法。
7. 前記検出領域は、矩形であり、
   前記第１の方向における前記検出領域の長さは、１０〜２５μｍの範囲内であり、
   前記第２の方向における前記検出領域の長さは、５０〜５００μｍの範囲内である、
   請求項１〜６のいずれか一項に記載の細胞検出方法。
8. 前記検出領域は、直径が２０〜５００μｍの円形である、請求項１〜６のいずれか一項に記載の細胞検出方法。
9. 第１の方向に所定の間隔で複数のマイクロチャンバーが配列されているマイクロチャンバー列が複数列配置され、かつ前記マイクロチャンバーに蛍光物質で標識された１または２以上の細胞が収容されているチップを保持するためのホルダーと、
   前記チップに励起光を照射する光照射部と、
   前記光照射部から照射された励起光により検出領域における蛍光物質の蛍光を検出する光検出部と、
   前記光照射部と前記ホルダーとの間、または前記ホルダーと前記光検出部との間に配置され、前記検出領域を規定する検出領域規定部と、
   前記チップにおける前記検出領域の位置を移動させるために、前記ホルダーと、前記光照射部、前記検出領域規定部および前記光検出部とを相対的に移動させる移動部と、
   を有し、
   前記第１の方向における前記検出領域の長さは、前記第１の方向において互いに隣接する２つの前記マイクロチャンバー間の間隔以下であり、
   第２の方向における前記検出領域の長さは、前記第２の方向における前記マイクロチャンバーの長さ以上である、
   細胞検出装置。
10. 前記光検出部により検出した前記蛍光物質の位置情報を取得する位置情報取得部と、
    前記光検出部による前記蛍光の検出結果および前記位置情報取得部により取得した前記位置情報に基づいて、前記マイクロチャンバーに収容された前記蛍光物質で標識された細胞を撮像する撮像部と、
    をさらに有する、請求項９に記載の細胞検出装置。
11. 前記検出領域規定部は、前記光照射部と前記ホルダーとの間に配置され、前記光照射部から出射された励起光のうち、前記検出領域に照射する光のみを通過させる絞りである、請求項９または請求項１０に記載の細胞検出装置。
12. 前記検出領域規定部は、前記ホルダーと前記光検出部との間に配置され、前記照射スポットから放出された前記蛍光のうち、前記検出領域から放出された前記蛍光のみを通過させる絞りである、請求項９または請求項１０に記載の細胞検出装置。
13. 前記検出領域は、矩形であり、
    前記第１の方向における前記検出領域の長さは、１０〜２５μｍの範囲内であり、
    前記第２の方向における前記検出領域の長さは、５０〜５００μｍの範囲内である、
    請求項９〜１２のいずれか一項に記載の細胞検出装置。
14. 前記検出領域は、直径が２０〜５００μｍの円形である、請求項９〜１２のいずれか一項に記載の細胞検出装置。