JP7113645B2 - 試料保持容器及びライトシート顕微鏡 - Google Patents

Description

本発明は、試料保持容器及びライトシート顕微鏡に関する。

近年、例えば薬剤の開発又は病態の評価等に用いられる試料として、生体内の細胞に近い三次元状の細胞（例えばスフェロイド）が注目されている。このような試料について評価等を行うために、励起光の照射に伴って試料から発せられる検出光を撮像して画像を取得する顕微鏡が用いられることがある。このような顕微鏡として、例えば落射顕微鏡又はライトシート顕微鏡が挙げられる。落射顕微鏡では、同一の対物レンズを用いて、励起光の試料への照射と、試料からの検出光の導光とが行われる。一方、ライトシート顕微鏡では、２つの対物レンズをそれぞれの光軸が互いに直交するように配置し、一方の対物レンズを用いてシート状の励起光を試料に照射し、他方の対物レンズを用いて試料からの検出光を撮像する。

非特許文献１には、ライトシート顕微鏡に用いられる、試料を固定するための容器が開示されている。非特許文献１では、この容器に試料を固定する手法として、試料をアガロースゲルに包埋し、アガロースゲルごと試料を容器に固定する手法が挙げられている。特許文献１には、三次元状の細胞を作製する円筒状の細胞培養容器が開示されている。細胞培養容器では、複数の窪みが底部に形成されており、それぞれの窪みに細胞を集めることにより細胞の凝集を促進している。

特許第６１８５８１６号公報

ビーエム機器株式会社 製品カタログ、ＬＶ ＳＹ ＵＭＢＡＳ２、２０１６年４月２０日

例えば三次元状の細胞のように厚さを有する試料の画像の取得に落射顕微鏡を用いる場合、試料の厚さ方向における各位置に同時に励起光が照射される。このため、試料において対物レンズの焦点面（試料の厚さ方向に垂直な面）に対応する部分からの検出光に加えて、試料において当該焦点面以外の位置に対応する部分からの検出光が同時に発せられる。しかし、このような場合、試料において当該焦点面以外の位置に対応する部分からの検出光の影響によって、撮像された画像にボケが生じやすくなり、画像の解像度が低下するおそれがある。一方、このような試料の画像の取得にライトシート顕微鏡を用いる場合、励起光がシート状であるため、試料の当該焦点面に対応する部分のみに励起光を照射することができる。このため、試料の当該焦点面に対応する部分から発せられる検出光のみを撮像することができる。その結果、撮像された画像の解像度の低下を抑えることができる。

ライトシート顕微鏡を用いた試料観察では、試料をゲルに包埋してゲルごと試料を容器に固定することが考えられる（例えば非特許文献１）。しかし、このように試料をゲルに包埋すると、ゲル内において試料の位置が安定せず、試料を観察視野内に収めることが困難となり得る。その結果、試料の画像の取得に手間及び時間がかかるという問題が生じ得る。また、例えば生きている細胞を試料としてゲルに包埋する場合、細胞が死滅するおそれがあるので、細胞を経時的に観察することができなくなるといった問題も生じ得る。また、試料を保持する容器として円筒状の容器（例えば特許文献１）を用いた場合、容器の曲面状の側面においてレンズ効果等が発生し、当該側面から外部に出力された検出光が発散しやすくなる。このような場合、撮像対象となる検出光を対物レンズに十分に集めることが難しくなり、撮像された試料の画像の解像度が低下するおそれがある。

本発明は、上記課題の解決のためになされたものであり、試料の位置の安定化により、試料の画像の容易かつ高解像度な取得を可能にする試料保持容器及びライトシート顕微鏡を提供することを目的とする。

本発明の一側面に係る試料保持容器は、試料を保持する試料保持容器であって、一端側に開口部が設けられた中空かつ筒状の本体部と、開口部と対向するように本体部の筒内に設けられ、試料の保持領域を有するメッシュ状部材と、を備え、本体部の側面には、保持領域に向けて光が入力される光入力面と、保持領域からの光が出力される光出力面とが設けられ、光入力面及び光出力面のうち、少なくとも光出力面が平坦面となっている。

この試料保持容器では、開口部から本体部の筒内に導入した試料を本体部の筒内のメッシュ状部材によって容易かつ安定して保持することができる。これにより、この試料保持容器では、三次元細胞などを試料として用いた場合においても、開口部から培地と共に三次元細胞を本体部の筒内に供給し、メッシュ状部材で保持した三次元細胞を培地内に位置させることで、生きたままの三次元細胞の観察が可能となる。また、この試料保持容器では、光入力面及び光出力面のうち、少なくとも光出力面が平坦面となっている。このため、光出力面から出力される光にレンズ効果が生じることを抑制でき、試料の観察画像の解像度が低下することを抑制できる。

また、メッシュ状部材には、疎水性コーティングが施されていてもよい。この場合、本体部の筒内に導入した試料がメッシュ状部材に吸着されやすくなるので、メッシュ状部材によって試料をより確実に保持することが可能となる。

また、メッシュ状部材には、親水性コーティングが施されていてもよい。この場合、本体部の筒内に導入した試料をメッシュ状部材により保持しつつ、メッシュ状部材上で回転させることが可能となるので、試料の観察画像を多面的に取得することができる。

また、光入力面及び光出力面の双方が平坦面となっていてもよい。これにより、光入力面及び光出力面でレンズ効果が生じることを抑制できる。したがって、光入力面に入力した光の照射位置の調整が容易となり、試料の観察画像の解像度が低下することを抑制できる。

また、本体部の他端側には、開口部と対向する底部が設けられていてもよい。この構成によれば、開口部から培地と共に試料を本体部の筒内に供給した場合に、培地及び試料を本体部の筒内に留めることができる。これにより、本体部の筒内に培地及び試料を収容した状態で試料保持容器を持ち運ぶことができる。この場合、観察後の試料を試料培養用のインキュベータに移すことができ、観察後の試料をインキュベータにて培養し続けることができる。その結果、長期間にわたって試料を経時的に観察することができる。

また、底部には、本体部の筒内と連通する開閉自在の孔部が設けられていてもよい。この構成によれば、培地と共に試料が本体部の筒内に収容されている場合に、孔部の開放によって本体部の筒内から外部に培地を排出することができる。これにより、本体部の筒内から試料を取り出すことなく、本体部の筒内に新たな培地を供給することができる。その結果、試料の構造を壊すことなく、本体部の筒内の培地を交換することができる。また、底部の孔部を利用して本体部の筒内の培地をかん流させることも可能となる。また、孔部から薬剤を本体部の筒内に投与して試料を刺激することも可能となる。

また、メッシュ状部材は、光入力面に対して傾斜していてもよい。これにより、メッシュ状部材に保持する複数の試料の位置を光入力面に対してずらすことが可能となる。したがって、光入力面から入力した光を各試料に照射することができ、試料容器を代えずに複数の試料の観察画像を取得することができる。

また、本体部は、断面矩形状をなしており、光入力面と光出力面とが直交していてもよい。これにより、試料保持容器の形状の簡単化が図られる。

本発明の一側面に係るライトシート顕微鏡は、上述したいずれかの試料保持容器と、試料に向けてシート状の光を導光する励起光学系と、試料からの検出光を導光する検出光学系と、検出光学系によって導光された検出光を検出する光検出器と、を備え、励起光学系は、光入力面に対向して配置され、光入力面を介して励起光を試料保持容器内の保持領域に入力する第１の対物レンズを有し、検出光学系は、光出力面に対向して配置され、光出力面を介して保持領域から試料保持容器外に出力される検出光を光検出器に導光する第２の対物レンズを有している。

このライトシート顕微鏡では、第１の対物レンズにより導光される励起光は、光入力面を介して、試料保持容器内の保持領域に保持される試料に入力する。試料に励起光が入力すると、試料から検出光が発せられる。この検出光は、光出力面を介して試料保持容器外に出力され、第２の対物レンズによって光検出器に導光される。このライトシート顕微鏡は上述したいずれかの試料保持容器を備えるので、上述したように、生きたままの三次元細胞の観察が可能となる。また、このライトシート顕微鏡では、開口部から本体部の筒内に導入した試料をメッシュ状部材によって安定して保持することができる。このため、第２の対物レンズの観察視野内に試料を収めることが容易となり、試料の観察画像を容易に取得することができる。また、このライトシート顕微鏡では、第２の対物レンズが、試料保持容器の平坦な光出力面を介して試料からの検出光を導光するので、光出力面から試料保持容器外に出力される検出光にレンズ効果が生じることを抑制でき、試料の観察画像の解像度が低下することを抑制できる。

本発明によれば、試料の位置の安定化により、試料の画像の容易かつ高解像度な取得を可能にする。

試料保持容器の一実施形態を示す斜視図である。 図１のＩＩ－ＩＩ線断面図である。 図１に示した試料保持容器を適用したライトシート顕微鏡の構成の一例を示すブロック図である。 図３に示したライトシート顕微鏡の要部拡大斜視図である。 ライトシート顕微鏡の変形例を示す要部拡大斜視図である。 試料保持容器の変形例を示す斜視図である。 試料保持容器の別の変形例を示す斜視図である。

以下、図面を参照しながら、本発明の一側面に係る試料保持容器及びライトシート顕微鏡の好適な実施形態について詳細に説明する。なお、本発明はこれらの例示に限定されるものではなく、特許請求の範囲によって示され、特許請求の範囲と均等の意味及び範囲内でのすべての変更が含まれることが意図される。以下の説明では、図面の説明において同一の要素には同一の符号を付し、重複する説明を適宜省略する。

図１は、試料保持容器１の一実施形態を示す斜視図である。同図には、理解の容易のため、ＸＹＺ直交座標系が示されている。また、同図は、試料保持容器１内に培地２及び試料Ｓが収容された状態を示している。試料保持容器１は、例えばライトシート顕微鏡等の顕微鏡による観察に用いられる容器であって、観察対象となる試料Ｓを保持する容器である。試料Ｓは、例えば、蛍光色素又は蛍光遺伝子等の蛍光物質を含む三次元細胞（例えばスフェロイド）又は生体等のサンプルである。試料Ｓは、所定の波長域の光が照射された場合に、例えば蛍光等の検出光Ｌ２を発する。試料Ｓが例えばスフェロイドである場合、スフェロイドの大きさは、例えば２００μｍ～９００μｍである。

試料保持容器１は、図１に示されるように、本体部１０と、メッシュ状部材２０とを備えている。本体部１０は、中空の角筒状をなしている。本実施形態では、本体部１０は、Ｚ方向における一端側に矩形状の開口部Ａが設けられた有底矩形筒状をなしており、本体部１０のＸＹ断面は矩形状をなしている。本体部１０のＸ方向における幅は例えば７．０ｍｍ以内であり、本体部１０のＹ方向における幅は例えば６．６ｍｍ以内であり、本体部１０のＺ方向における高さは例えば１．５ｃｍ以上である。

本体部１０は、開口部ＡからＺ方向に沿って延びる矩形板状の４つの側壁部（側面）１０ａ，１０ｂ，１０ｃ，及び１０ｄと、開口部Ａとは反対側の一端に接する矩形板状の底壁部（底部）１０ｅとを有している。各側壁部１０ａ，１０ｂ，１０ｃ，及び１０ｄのそれぞれは、例えばガラス又はプラスチックによって形成され、蛍光観察に用いられる波長の光に対して透過性を有している。各側壁部１０ａ，１０ｂ，１０ｃ，及び１０ｄの厚さは、例えばカバーガラスと同程度の厚さであり、例えば０．１２ｍｍ～０．１８ｍｍである。

側壁部１０ａ及び１０ｂのそれぞれは、ＹＺ平面に沿って延びており、Ｘ方向において互いに対向している。一例では、側壁部１０ａ及び１０ｂのそれぞれは、ＹＺ平面に平行である。側壁部１０ｃ及び１０ｄのそれぞれは、ＸＺ平面に沿って延びており、Ｙ方向において互いに対向している。一例では、側壁部１０ｃ及び１０ｄのそれぞれは、ＸＺ平面に平行であり、側壁部１０ａ及び１０ｂと直交している。

側壁部１０ａ，１０ｂ，１０ｃ，及び１０ｄには、本体部１０の外部から励起光Ｌ１（後述する図４参照）が入力する光入力面Ｓ１、及び、本体部１０の外部へ検出光Ｌ２（後述する図４参照）を出力する光出力面Ｓ２が設けられている。本実施形態では、側壁部１０ａに光入力面Ｓ１が設けられており、側壁部１０ｄに光出力面Ｓ２が設けられている。光入力面Ｓ１及び光出力面Ｓ２のうち少なくとも光出力面は、平坦面となっている。本実施形態では、光入力面Ｓ１及び光出力面Ｓ２の双方が平坦面となっている。光入力面Ｓ１は、少なくとも励起光Ｌ１に対して透過性を有しており、光出力面Ｓ２は、少なくとも検出光Ｌ２に対して透過性を有している。光出力面Ｓ２が設けられる側壁部１０ｄは、例えばガラスにより形成されることが好ましい。

底壁部１０ｅは、本体部のＺ方向における他端側に設けられており、Ｚ方向において開口部Ａと対向している。底壁部１０ｅは、ＸＹ平面に沿って延びている。一例では、底壁部１０ｅは、各側壁部１０ａ，１０ｂ，１０ｃ，及び１０ｄと直交している。試料Ｓは、底壁部１０ｅと各側壁部１０ａ，１０ｂ，１０ｃ，及び１０ｄとによって画定される収容空間内（本体部１０の筒内）に培地２と共に収容されている。開口部Ａは、各側壁部１０ａ，１０ｂ，１０ｃ，及び１０ｄにおいて底壁部１０ｅとは反対側に位置する縁部によって画定されている。開口部Ａの大きさは、培地２及び試料Ｓを受け入れ可能な大きさとなっている。本体部１０には、開口部Ａを塞ぐ蓋が着脱自在に設けられてもよい。この場合、開口部Ａを蓋で塞ぐことにより、本体部１０の筒内に収容される培地２の蒸発や汚染（黴菌によるコンタミネーション）を抑制できる。

図２は、図１に示されるII－II線に沿った断面図である。図２に示されるように、本体部１０の内壁面１１（すなわち、各側壁部１０ａ，１０ｂ，１０ｃ，及び１０ｄの内側面）には、Ｚ方向において底壁部１０ｅと開口部Ａとの間にＺ方向における開口部Ａ側を向く段差面１１ａが設けられている。段差面１１ａは、本体部１０の内壁面１１の全周にわたって設けられている。

メッシュ状部材２０は、図１に示されるように、Ｚ方向に貫通する多数の孔２０ａが設けられたメッシュ状の部材である。メッシュ状部材２０の材質は、例えば、四フッ化エチレン－エチレン共重合体（ＥＴＦＥ）、四フッ化エチレン－六フッ化プロピレン共重合体（ＦＥＰ）、ポリフッ化ビニリデン樹脂（ＰＶＤＦ）、熱可塑性エラストマー（ＴＰＥ）、又はポリ四フッ化エチレン樹脂（ＴＦＥ）等である。

メッシュ状部材２０は、本体部１０の筒内に配置され、ＸＹ平面に沿って延びている。一例では、メッシュ状部材２０は、ＸＹ平面に対して平行であり、平坦となっている。メッシュ状部材２０の各孔２０ａの大きさは、試料Ｓの大きさ（最大寸法）よりも小さくなっており、例えば１００μｍ～８００μｍである。メッシュ状部材２０は、本体部１０の筒内に配置された試料Ｓを保持する保持領域Ｒを有する。保持領域Ｒは、例えばＺ方向から見てメッシュ状部材２０の全面に位置する。

メッシュ状部材２０の周縁部は、図２に示されるように、Ｚ方向において本体部１０の段差面１１ａに当接すると共に、例えば医療用の接着剤によって段差面１１ａに固定されている。メッシュ状部材２０のＺ方向における高さは、段差面１１ａのＺ方向における高さによって調整することが可能である。メッシュ状部材２０のＺ方向における高さは、例えば、第１及び第２の対物レンズ４８，５１（後述する図４参照）の観察視野に応じて設定される。メッシュ状部材２０には、試料Ｓを保持するためのコーティング２０ｂが施されている。コーティング２０ｂは、例えば、疎水性コーティングであってもよく、親水性コーティングであってもよい。コーティング２０ｂは、少なくともメッシュ状部材２０の保持領域Ｒに施されていればよいが、本実施形態では、メッシュ状部材２０の全体にわたって施されている。

図３は、図１に示した試料保持容器１を適用したライトシート顕微鏡３０の構成の一例を示すブロック図である。図３に示されるライトシート顕微鏡３０は、シート状（面状）の励起光Ｌ１を試料Ｓに照射し、励起光Ｌ１の照射に伴って試料Ｓから発せられる検出光Ｌ２を検出することで、試料Ｓの画像を取得する装置である。ライトシート顕微鏡３０では、励起光Ｌ１の光軸と直交する方向（例えばＹ方向）に沿って励起光Ｌ１の集光位置が試料Ｓに対して走査され、各集光位置において試料Ｓの画像が取得される。ライトシート顕微鏡３０では、励起光Ｌ１が試料Ｓに照射される領域が狭いため、例えば光退色又は光毒性等の試料Ｓの劣化を抑制することができると共に、画像取得を高速化することができる。

図３に示されるように、ライトシート顕微鏡３０は、試料保持容器１と、励起光学系４０と、検出光学系５０と、光検出器６０とを備えている。試料保持容器１は、例えば、水が収容されたチャンバーＣ内に配置される。励起光学系４０は、試料保持容器１の本体部１０の筒内の試料Ｓに励起光Ｌ１を照射する。検出光学系５０は、励起光Ｌ１の照射に伴って試料Ｓから発せられる検出光Ｌ２を光検出器６０へ導光する。光検出器６０は、検出光学系５０によって導光された検出光Ｌ２を検出して撮像する。

励起光学系４０は、光源４１と、ミラー４２と、第１の光学系４３と、スリット部４４と、シリンドリカルレンズ４５と、光走査部４６と、第２の光学系４７と、第１の対物レンズ４８とを有している。光源４１は、試料Ｓを励起させる波長を含む励起光Ｌ１を出力する。光源４１は、例えば、コヒーレント光又はインコヒーレント光を出射する。コヒーレント光源としては、例えば、レーザダイオード（ＬＤ）といったレーザ光源等が挙げられる。インコヒーレント光源としては、例えば発光ダイオード（ＬＥＤ）、スーパールミネッセントダイオード（ＳＬＤ）、ランプ系光源等が挙げられる。レーザ光源としては、連続波（Continuous Wave)を発振する光源が好ましく、超短パルス光等のパルス光を発振する光源が用いられてもよい。パルス光を発振する光源としては、パルス光を出力する光源と、光シャッタ又はパルス変調用のＡＯＭ（Acousto-Optic Modulator）とを組み合わせたユニットが用いられてもよい。光源４１は、複数の波長域を含む励起光Ｌ１を出力するように構成されてもよい。この場合、音響光学可変フィルタ（Acousto-Optic Tunable Filter）等の光学フィルタにより励起光Ｌ１の波長の一部を選択的に透過させてもよい。

ミラー４２には、光源４１から出力された励起光Ｌ１が入射する。ミラー４２は、入射した励起光Ｌ１を第１の光学系４３に向けて反射する。第１の光学系４３は、ミラー４２によって反射された励起光Ｌ１のビーム径を調整しつつ、励起光Ｌ１をコリメート（平行化）する。第１の光学系４３は、ミラー４２によって反射された励起光Ｌ１のビーム径を拡大する発散レンズ４３ａと、発散レンズ４３ａからの励起光Ｌ１をコリメートするコリメートレンズ４３ｂとを有する。コリメートレンズ４３ｂは、その光軸方向に沿って移動可能に構成されており、発散レンズ４３ａとコリメートレンズ４３ｂとの距離を調整することによって、励起光Ｌ１のビーム径を調整することが可能となる。

スリット部４４は、コリメートレンズ４３ｂとシリンドリカルレンズ４５との間の光路上に配置されている。スリット部４４は、Ｚ方向に延びる方向に開口が設けられ、開口を通過した励起光Ｌ１をシート状に整形する。シリンドリカルレンズ４５は、励起光Ｌ１のＺ方向成分に対してはレンズとして機能せず、励起光Ｌ１のＸ方向成分に対してはレンズとして機能する。この機能を利用することで、シリンドリカルレンズ４５は、スリット部４４により整形された励起光Ｌ１のシート形状を更に整えることが可能となる。

光走査部４６には、シリンドリカルレンズ４５から出力されたシート状の励起光Ｌ１が入射する。光走査部４６は、励起光Ｌ１の進行方向を変更することで、励起光Ｌ１を試料Ｓに対して走査する光スキャナである。これにより、第２の光学系４７及び第１の対物レンズ４８を介して試料Ｓに照射される励起光Ｌ１の照射位置が、第１の対物レンズ４８の光軸（励起光Ｌ１の光軸）と直交するＹ方向に沿って試料Ｓの面上で走査される。光走査部４６は、例えば、ガルバノミラー、レゾナントスキャナ、ポリゴンミラー、ＭＥＭＳ（Micro Electro Mechanical System）ミラー、又はＡＯＭ，ＡＯＤ（Acousto-Optic Deflector）等の音響光学素子等である。

第２の光学系４７は、光走査部４６から出力された励起光Ｌ１が第１の対物レンズ４８に導光されるように、光走査部４６と第１の対物レンズ４８とを光学的に結合している。第２の光学系４７は、光走査部４６からの励起光Ｌ１を第１の対物レンズ４８の瞳で集光させるように構成されたレンズ４７ａ及び４８ｂを有し、両側テレセントリック光学系を構成している。

第１の対物レンズ４８は、照明用の対物レンズであり、第２の光学系４７によって導光された励起光Ｌ１を集光する。第１の対物レンズ４８は、例えば水浸対物レンズであり、チャンバーＣ内の水に浸かるように配置される。第１の対物レンズ４８が水浸対物レンズである場合、第１の対物レンズ４８のワーキングディスタンスは、例えば３．５ｍｍである。

図４は、図３に示したライトシート顕微鏡３０を適用した試料保持容器１の要部拡大斜視図である。同図では、チャンバーＣが省略して示されている。第１の対物レンズ４８は、図４に示されるように、Ｘ方向において側壁部１０ａの光入力面Ｓ１と対向して配置されている。一例では、第１の対物レンズ４８は、その光軸が光入力面Ｓ１と直交するように配置される。第１の対物レンズ４８は、光入力面Ｓ１を介してシート状の励起光Ｌ１を試料Ｓに照射する。第１の対物レンズ４８は、ピエゾアクチュエータ又はステッピングモータ等の駆動素子により、その光軸に沿って移動可能となっている。これにより、励起光Ｌ１の集光位置が調整可能となっている。

再び、図３を参照する。検出光学系５０は、第２の対物レンズ５１と、フィルタ５２と、レンズ５３とを有している。第２の対物レンズ５１は、観察用の対物レンズである。第２の対物レンズ５１は、例えば水浸対物レンズであり、チャンバーＣ内の水に浸かるように配置される。第２の対物レンズ５１が水浸対物レンズである場合、第２の対物レンズ５１のワーキングディスタンスは、例えば３．３ｍｍである。

第２の対物レンズ５１は、図４に示されるように、Ｙ方向において側壁部１０ｄの光出力面Ｓ２と対向して配置されている。一例では、第２の対物レンズ５１の光軸は、光出力面Ｓ２と直交すると共に、第１の対物レンズ４８の光軸と直交している。第２の対物レンズ５１は、第１の対物レンズ４８からの励起光Ｌ１の照射に伴って試料Ｓから発せられる検出光Ｌ２を光出力面Ｓ２を介して光検出器６０に導光する。第２の対物レンズ５１は、ピエゾアクチュエータ又はステッピングモータ等の駆動素子により、その光軸に沿って移動可能となっている。これにより、第２の対物レンズ５１の焦点位置が調整可能となっている。

第１及び第２の対物レンズ４８及び５１のそれぞれは、乾燥対物レンズであってもよい。第１及び第２の対物レンズ４８及び５１のそれぞれが乾燥対物レンズである場合、試料保持容器１並びに第１及び第２の対物レンズ４８及び５１のそれぞれは、例えば、水が容れられていない状態のチャンバーＣ内に配置される。この場合、第１の対物レンズ４８のワーキングディスタンスは、例えば１０．０ｍｍとなり、第２の対物レンズ５１のワーキングディスタンスは、例えば２．１ｍｍとなる。

図３に示されるように、フィルタ５２は、第２の対物レンズ５１と光検出器６０との間の光路上に配置されている。フィルタ５２は、第２の対物レンズ５１により導光された光から励起光Ｌ１と検出光Ｌ２とを分離し、抽出された検出光Ｌ２を光検出器６０側に出力するための光学フィルタである。レンズ５３は、第２の対物レンズ５１から出力された検出光Ｌ２が光検出器６０に導光されるように、第２の対物レンズ５１と光検出器６０とを光学的に結合している。レンズ５３は、第２の対物レンズ５１からの検出光Ｌ２を光検出器６０の受光面で結像する。

光検出器６０は、第２の対物レンズ５１によって導光された検出光Ｌ２を検出して撮像する。光検出器６０としては、例えば、ＣＭＯＳカメラ、ＣＣＤカメラ、マルチアノードの光電子増倍管、ＳＰＡＤ（Single Photon Avalanche Diode）等の２次元イメージセンサ、又はラインセンサ等が挙げられる。或いは、光検出器６０は、アバランシェフォトダイオード等のポイント光センサ、又は分光器であってもよい。

次に、本実施形態に係る試料保持容器１及びライトシート顕微鏡３０によって得られる効果を説明する。試料保持容器１では、開口部Ａから本体部１０の筒内に導入した試料Ｓを本体部１０の筒内のメッシュ状部材２０によって容易かつ安定して保持することができる。これにより、この試料保持容器１では、三次元細胞などを試料Ｓとして用いた場合においても、開口部Ａから培地２と共に三次元細胞を本体部１０の筒内に供給し、メッシュ状部材２０で保持した三次元細胞を培地２内に位置させることで、生きたままの三次元細胞の観察が可能となる。また、試料保持容器１では、光出力面Ｓ２が平坦面となっている。このため、光出力面Ｓ２から出力される検出光Ｌ２にレンズ効果が生じることを抑制でき、試料Ｓの観察画像の解像度が低下することを抑制できる。

また、メッシュ状部材２０に施されるコーティング２０ｂは、疎水性コーティングであってもよい。この場合、本体部１０の筒内に導入した試料Ｓがメッシュ状部材２０に吸着されやすくなるので、メッシュ状部材２０によって試料Ｓをより確実に保持することが可能となる。

また、メッシュ状部材２０に施されるコーティング２０ｂは、親水性コーティングであってもよい。この場合、本体部１０の筒内に導入した試料Ｓを、メッシュ状部材２０により保持しつつメッシュ状部材２０上で回転させることが可能となるので、試料Ｓの観察画像を多面的に取得することができる。

また、光入力面Ｓ１及び光出力面Ｓ２の双方が平坦面となっている。これにより、光入力面Ｓ１及び光出力面Ｓ２でレンズ効果が生じることを抑制できる。したがって、光入力面Ｓ１に入力した励起光Ｌ１の照射位置の調整が容易となり、試料Ｓの観察画像の解像度が低下することを抑制できる。

また、本体部１０の他端側には、開口部Ａと対向する底壁部１０ｅが設けられている。この構成によれば、開口部Ａから培地２と共に試料Ｓを本体部１０の筒内に供給した場合に、培地２及び試料Ｓを本体部１０の筒内に留めることができる。これにより、本体部１０の筒内に培地２及び試料Ｓを収容した状態で試料保持容器１を持ち運ぶことができる。この場合、観察後の試料Ｓを細胞培養用のインキュベータに移すことができ、観察後の試料Ｓをインキュベータにて培養し続けることができる。その結果、長期間にわたって試料Ｓを経時的に観察することができる。

また、本体部１０は、断面矩形状をなしており、光入力面Ｓ１と光出力面Ｓ２とが直交していてもよい。これにより、試料保持容器１の形状の簡単化が図られる。

図５は、ライトシート顕微鏡３０の変形例を示す要部拡大斜視図である。上記実施形態では、第１の対物レンズ４８はシート状の励起光Ｌ１を試料Ｓに照射していたが、本変形例では、第１の対物レンズ４８はライン状の励起光Ｌ１を試料Ｓに照射している。本変形例では、励起光Ｌ１の光軸と直交するＺ方向に沿って励起光Ｌ１の集光位置を試料Ｓに対して走査したのち、励起光Ｌ１の光軸と直交するＹ方向に沿って励起光Ｌ１の集光位置を移動し、再びＺ方向に沿って励起光Ｌ１の集光位置を試料Ｓに対して走査する。この走査を繰り返すことで、各集光位置において試料Ｓの画像が取得される。試料Ｓに照射される励起光Ｌ１の照射位置は、例えば光走査部４６によって走査される。このような形態であっても、上記実施形態と同様の効果を奏する。

図６は、試料保持容器１の変形例を示す斜視図である。上記実施形態と本変形例との相違点は、底壁部の構成である。本変形例の試料保持容器１Ａでは、本体部１０Ａの底壁部１０ｆに孔部１０ｇが設けられている。孔部１０ｇは、底壁部１０ｆをＺ方向に貫通しており、本体部１０Ａの筒内と本体部１０Ａの外部とに連通している。孔部１０ｇには、孔部１０ｇを開閉自在に構成された円筒状の管部１０ｈが取り付けられる。孔部１０ｇのＸＹ平面における位置は、特に限定されず、底壁部１０ｆの中央部分であってもよく、底壁部１０ｆの周縁部であってもよい。また、孔部１０ｇは、底壁部１０ｆの一部に設けられてもよく、底壁部１０ｆの全体に設けられてもよい。また、複数の孔部１０ｇが底壁部１０ｆに設けられてもよい。また、孔部１０ｇは、側壁部１０ａ，１０ｂ，１０ｃ，又は１０ｄに設けられてもよい。この場合、孔部１０ｇは、側壁部１０ａ，１０ｂ，１０ｃ，又は１０ｄにおいて試料Ｓの観察に影響を与えない部分に設けられることが好ましい。例えば、孔部１０ｇは、側壁部１０ａ，１０ｂ，１０ｃ，又は１０ｄにおいて光入力面Ｓ１及び光出力面Ｓ２を除く部分に設けられることが好ましい。

本変形例の構成によれば、培地２と共に試料Ｓが本体部１０Ａの筒内に収容されている場合に、孔部１０ｇ及び管部１０ｈの開放によって本体部１０Ａの筒内から外部に培地２を排出することができる。これにより、本体部１０Ａの筒内から試料Ｓを取り出すことなく、本体部１０Ａの筒内に新たな培地２を供給することができる。その結果、試料Ｓの構造を壊すことなく、本体部１０Ａの筒内の培地２を交換することができる。また、孔部１０ｇ及び管部１０ｈを利用して本体部１０Ａの筒内の培地２をかん流させることも可能となる。また、孔部１０ｇ及び管部１０ｈから薬剤を本体部１０Ａの筒内に投与して試料Ｓを刺激することも可能となる。

図７は、第３変形例による試料保持容器１Ｂの近傍を拡大して示す斜視図である。上記実施形態と本変形例との相違点は、メッシュ状部材の角度、及び試料Ｓの保持数である。本変形例では、メッシュ状部材２０Ａは、光入力面Ｓ１に対して、開口部Ａ側に傾斜している。また、本変形例では、メッシュ状部材２０Ａは、複数（例えば３つ）の試料Ｓを保持している。複数の試料Ｓは、メッシュ状部材２０Ａ上において、Ｚ方向に互いに異なる位置に配置されている。本変形例では、メッシュ状部材２０Ａに保持する複数の試料Ｓの位置を光入力面Ｓ１に対してずらすことが可能となる。したがって、例えば試料保持容器１Ｂの位置をＺ方向に移動させることによって、光入力面Ｓ１からの励起光Ｌ１を複数の試料Ｓのそれぞれに照射させることができ、試料保持容器１Ｂを代えずに複数の試料Ｓのそれぞれの観察画像を取得することができる。

本発明の試料保持容器及びライトシート顕微鏡は、上述した実施形態及び各変形例に限られるものではなく、他に様々な変形が可能である。例えば、上述した実施形態及び各変形例を、必要な目的及び効果に応じて互いに組み合わせてもよい。また、上述した実施形態及び各変形例において、試料保持容器の本体部は底壁部を有していたが、底壁部を有していなくてもよい。また、本体部は、四角筒状をなしていたが、光入力面及び光出力面が設けられていれば他の形状をなしていてもよい。例えば、本体部は、三角筒状、五角筒状、六角筒状等の多角筒状をなしていてもよい。すなわち、本体部のＸＹ断面が、例えば、三角形状、五角形状、六角形状等の多角形状であってもよい。また、本体部の一部（例えば光入力面及び光出力面を除く部分）が円形状、湾曲形状をなしていてもよい。

１，１Ａ，１Ｂ…試料保持容器、２…培地、１０…本体部、１０ａ～１０ｄ…側壁部、１０ｅ，１０ｆ…底壁部、１０ｇ…孔部、１０ｈ…管部、１１…内壁面、１１ａ…段差面、２０，２０Ａ…メッシュ状部材、２０ａ…孔、２０ｂ…コーティング、３０…ライトシート顕微鏡、４０…励起光学系、４１…光源、４８…第１の対物レンズ、５０…検出光学系、５１…第２の対物レンズ、６０…光検出器、Ａ…開口部、Ｌ１…励起光、Ｌ２…検出光、Ｒ…保持領域、Ｓ…試料、Ｓ１…光入力面、Ｓ２…光出力面。

Claims (9)

1. 試料を保持する試料保持容器と、
   前記試料に向けてシート状の励起光を導光する励起光学系と、
   前記試料からの検出光を導光する検出光学系と、
   前記検出光学系によって導光された前記検出光を検出する光検出器と、を備え、
   前記試料保持容器は、
   一端側に開口部が設けられた中空かつ筒状の本体部と、
   前記開口部と対向するように前記本体部の筒内に設けられ、前記試料の保持領域を有するメッシュ状部材と、を有し、
   前記本体部の側面には、前記保持領域に向けて光が入力される光入力面と、前記保持領域からの光が出力される光出力面とが設けられ、
   前記光入力面及び前記光出力面のうち、少なくとも前記光出力面が平坦面となっており、
   前記メッシュ状部材は、前記光入力面に対して傾斜しており、
   前記励起光学系は、前記光入力面に対向して配置され、前記光入力面を介して前記励起光を前記試料保持容器内の前記保持領域に入力する第１の対物レンズを有し、
   前記検出光学系は、前記光出力面に対向して配置され、前記光出力面を介して前記保持領域から前記試料保持容器外に出力される前記検出光を前記光検出器に導光する第２の対物レンズを有している、ライトシート顕微鏡。
2. 前記メッシュ状部材には、疎水性コーティングが施されている、請求項１に記載のライトシート顕微鏡。
3. 前記メッシュ状部材には、親水性コーティングが施されている、請求項１に記載のライトシート顕微鏡。
4. 前記光入力面及び前記光出力面の双方が平坦面となっている、請求項１～３のいずれか一項に記載のライトシート顕微鏡。
5. 前記本体部の他端側には、前記開口部と対向する底部が設けられている、請求項１～４のいずれか一項に記載のライトシート顕微鏡。
6. 前記底部には、前記本体部の筒内と連通する開閉自在の孔部が設けられている、請求項５に記載のライトシート顕微鏡。
7. 前記本体部は、断面矩形状をなしており、
   前記光入力面と前記光出力面とが直交している、請求項１～６のいずれか一項に記載のライトシート顕微鏡。
8. 前記メッシュ状部材は、複数の前記試料を保持し、
   複数の前記試料は、前記メッシュ状部材上において、前記本体部が延びる方向に互いに異なる位置に配置されている、請求項１～７のいずれか一項に記載のライトシート顕微鏡。
9. 前記励起光学系は、
   前記励起光を出力する光源と、
   前記光源からの前記励起光をコリメートする第１の光学系と、
   前記第１の光学系からの前記励起光を前記第１の対物レンズに導光する第２の光学系と、
   前記第１の光学系と前記第２の光学系との間の光路上に配置され、前記励起光をシート状に整形するスリット部と、を更に有する、請求項１～８のいずれか一項に記載のライトシート顕微鏡。

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