JP2017534846A - 蛍光剤による染色後に紫外線励起を利用した蛍光顕微鏡検査によって組織内の撮像深度を制御するシステムおよび方法 - Google Patents
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Abstract
Description
アプタマー、Somamers(商標)、核酸オリゴマー、LNA、およびその他を含む。これらのプローブは、直接または間接的に蛍光標識と複合体を形成することができ、蛍光標識は、これに限定されないが、カーボンナノチューブ、カーボン量子ドット、有機蛍光標識(フルオレセイン、ローダミン、アレクサ染料、Cy2、Cy3、Cy5、Cy5.5等、テキサスレッド、クマリン系蛍光物質、IRDye800、インドシアニングリーン、BODIPY、DyLight染料、オレゴングリーン、フィコエリトリン等)、希土類元素、半導体量子ドット、有機量子ドット、ポリマードット(pDot)、蛍光ナノ粒子(シリカビーズ、ポリマーソーム、ポルフィリン系ミセルおよびリポソーム等)、およびFRET系染色複合体等の標識クラスを含む。
A)適切に最適化された造影剤の選択および/または発見
使用される上記造影剤は、病理組織学的診断または特性解析に適した組織のミクロ構造および構成の可視化を可能にするために、例えば、pH、イオン強度、細胞および細胞下構造の透過性、水和状態、溶媒、タンパク質および核酸の構造および架橋結合、抗原の入手可能性等を変更することにより、新鮮な組織標本の細胞下および細胞内区画の染色(染色を最適化する調整溶液に短時間晒す、または晒さないこと、が可能であればよい。上記造影剤は、励起に使用される紫外線スペクトル域で吸収し、可視スペクトルのようなより長い波長で発光すればよい。上記造影剤は、処理時間を最小限にするため、できるだけ早く物理的に晒して組織を染色すればよい。上記造影剤は、実質的に、組織のマクロ構造またはミクロ構造を変更したり損傷したりすべきではない。造影剤を含む溶液に組織を晒す時間は最適化してもよい。
B)計測にかかる費用を最小限にする方法
計測の費用は、撮像および処理方法に直接関係するが、撮像された画像の品質および診断に必要な情報量にも直接関係している。このような一連の動作パラメータ内において、費用を最小限にするために、好適な計測を選択することができる。そのような費用は、顕微鏡の対物レンズおよびフィルタを含む光学的要素の取得費用、光源の費用、カメラや検出器の費用に依存する。これらの部品の入手可能性および費用に応じて、特定の計測構造を設計することができる。具体的には、1つのモノクロカメラを使用して、複数のスペクトル画像を得ることができるが、大きな標本の走査により長い時間がかかる。一方、大きな標本の走査にかかる時間を最小限にするために、明るい光源とあわせて複数のカメラを使用することもできるが、計測の費用が増加する。または、解像度および光度が十分であれば、消費者レベルのRGBカメラが適している場合がある。これにより、一度晒すだけで、異なる蛍光成分(内因性または外因性)の発光のフルカラー撮像が可能になる。または、小型レンズアレイおよび設定可能なフィルタ挿入部を有するフィルタピクセルマスクまたは光照射野撮像を使用するカメラ等のスナップショットスペクトルカメラは、一度晒すだけで、複数の波長画像を生成することができる。
C)大きな標本の走査に要する時間を最小限にする方法
走査時間は、検出システムの感度、レンズシステムの開口数、任意のフィルタの透過効率、励起強度、カメラおよび検出器の少なくともいずれかの量子効率、および造影剤の濃度等の計測に関連する多くのパラメータに依存している。造影剤の光退色前の最大励起強度、または実際の組織の光損傷または組織の焼灼等も限定要因である。
上述のセクションA、B、およびCで挙げた様々な技術的検討事項に関する説明では、本開示のシステムおよび方法の技術内容を実施するために使用できる器具の様々な可能な構造および種類に注目した。これらは、撮像装置および走査の速度や方法に関連する。以下の技術的検討事項F)で扱う照明形状から別の側面が生じる。概して、上記撮像方法には、照明、集光およびフィルタリング、画像取得、大きな標本の走査、複合デジタル画像の作成、画像の分析および向上のための装置が必要となる。特に、低価格での実装は、世界の健康用途、携帯電話または類似するセンサの強化、および演算および通信プラットフォーム、に関連する資源の乏しい状況で使用するために設計することができる。
E)画像の保存、送信、および処理
上記サンプルの画像は、直ちにデジタル化され、様々な種類のデジタル記録媒体に保存されてもよい。画像ファイルは、遠隔診察が容易になるように現在および未来の情報技術を使用して、直ちに送信されてもよい。機械学習(または他の様相)による画像の分割、分類、および定量化の能力を追加することにより、本開示のシステムおよび方法の性能および有用性が向上し、自動診断をもたらすのに役立つ可能性がある。
F)撮像深度の制御方法
撮像深度の制御は、診断分析用に適した品質の画像を生成するために特に重要である。現在の組織病理学分析における撮像深度は、染色および顕微鏡での観察を実施する前に、処理済みの組織の切片を切断することで制御される。本開示のシステムおよび方法によれば、高品質の画像を得るために、上記サンプルは、平坦面がクリアな光学サンプル支持体に並置できるように切断しなければならない可能性があるが、切片化の実施は、組織サンプルを物理的に薄く切るのではなく、光学的に行うことができる。従来のカバースリップ同様に、上記サンプル支持体表面は、最適な画像品質を得るために適した厚さと屈折率を有している必要がある。照明光源12からの励起光子の組織サンプル14への透過深度を光学的に制御することは、システム10の重要な特徴である。最適な透過深度は多少変わる可能性があるが、現時点での好ましい透過深度は約5〜25マイクロメートルであり、より好ましくは約10マイクロメートルである。この深度は、ある比率で照明の減衰が起こる、組織サンプル14の表面からの距離を表す。しかしながら、この深度よりも深い地点まで到達できる光子があり、そのようなより深く透過する光子により、意図する撮像区域(すなわち、表面とその表面下約10マイクロメートルとの間の区域)の外にある信号が提供されるであろう。選択された撮像深度よりも深い層からのそのような光子により生成された蛍光信号を除外することが有用である場合がある。
G)画像取得のための標本の処理方法
本発明の技術内容における撮像においては、顕微鏡システムに対して、サンプルの比較的平坦な面を提示することが非常に好ましい。この平坦面は、様々な手段により実現できる。その手段としては、これに限定されないが、以下のものが挙げられる。
a)表面がもともと平坦であってよい。
b)サンプルの撮像された小切片それぞれを、画像取得のために(画像平面と比較して)平らな方向に提示できるように、サンプルを複数の方向に回転させて平行移動させることができるホルダーにサンプルが付着している。
c)上記標本が、画像取得のために、励起光の透過および生成された信号の送信を可能にする平坦な光学面に接触させられるが、平坦な面を生成するのに十分な圧力(自身の重量、サンプルの重量、または外部の重量または圧力を追加的に加えることによる)が加えられる。
d)上記サンプルは、標本のほぼすべての露出面を覆う標本の複数の平坦面を示すため、画像取得のために、励起の透過および生成された信号の送信を可能にする、表面が平坦または場合によっては湾曲した(キュベット等)適した容器内に挿入される。
Claims (21)
- 組織を分析する方法であって、
組織サンプルを取得する工程と、
上記組織サンプルを、組織または細胞成分に選択的に蓄積する蛍光染料または蛍光標識分子プローブを含む1つ以上の蛍光物質に晒す工程と、
約200nmから約400nmの波長であって、上記組織サンプルにおける紫外線の透過が、表面からの選択された深度の近傍のみに制限されるように選択される波長を有する紫外線光源を、上記組織サンプルの表面に照射するために照明励起光源を使用する工程と、
上記組織サンプルを撮像するために顕微鏡光学システムを使用する工程と、
1つ以上の画像を記録するため、上記顕微鏡光学システムから光情報を受け取る画像取得システムを使用する工程と、
分析のために上記画像の処理および表示を行うため、上記画像取得システムと通信する表示システムを使用する工程と、
を含むことを特徴とする方法。 - 上記組織サンプルへの紫外線の照射は、
350nm、
340nm、
330nm、
320nm、
310nm、
290nm、
280nm、
270nm、
260nm、
250nm、
245nm、
240nm、
235nm、
230nm、
225nm、
220nm、
210nm、
200nm
を中心とするまたはそれら付近の光の波長より選択される波長域を有する紫外線光源を使用する工程を含み、
上記紫外線光源は、
LED、
レーザ、
波長可変レーザ、または
連続レーザ光源、アーク灯、レーザ点火アーク灯、クリプトン臭素エキシマランプ、または所望のスペクトル域の十分な明るさを持つ他の光源の少なくとも1つを含む連続光源、
の少なくとも1つを含むことを特徴とする請求項1に記載の方法。 - 上記サンプルは、石英、溶融シリカ、サファイア、またはTPX(登録商標)ポリメチルペンテンを含む紫外線透過プラスチックを含み得る紫外線透過材により形成される支持体によって支持され、
上記支持体は、
接触面において良好な光学特性を確保するように上記サンプルを押し付けることができる平面窓として構成することができる支持体、または、
場合によっては使い捨て可能であり、上記組織を導入することができるキュベット形状部材として構成することができ、周囲の撮像のために4つ以上の平坦または場合によっては湾曲した表面を提供する支持体、
の少なくともいずれかであることを特徴とする請求項1に記載の方法。 - 上記1つ以上の蛍光染料または蛍光標識分子プローブは、通常は顕微鏡で観察される組織または細胞成分であって、
細胞核、
細胞質、
細胞膜、および
ミトコンドリア、
の少なくとも1つからなる組織または細胞成分のコントラストを高めるように選択されることを特徴とする請求項1に記載の方法。 - 上記1つ以上の蛍光染料または蛍光標識分子プローブは、顕微鏡で観察される組織または細胞成分であって、
細胞内小器官、
脂質、
コラーゲンおよび細胞外マトリックスを含む結合組織を少なくとも1つ含む細胞外組織成分、
嚢胞内容物、
異物、
感染因子、
色素、
配向用外因性マーキング染料、
の少なくとも1つからなる組織または細胞成分のコントラストを高めるように選択され、
分子プローブの場合は、
特異タンパク質、
翻訳後修飾、
遺伝子、染色体領域、またはDNA成分を含む特異DNAまたはRNA配列、
RNA転写、コーディング、非コーディング、および
脂質ラフト、
であることを特徴とする請求項1に記載の方法。 - 上記蛍光物質は、350nmから200nmのスペクトル域において十分に励起可能であり、350nmから950nmのスペクトル域において有用な発光帯域を有する組織学的または組織化学的蛍光染料を含み、上記蛍光物質は、エオシン染料類、トルイジンブルーO、メチレンブルー、DAPI、アクリジンオレンジ、DRAQ5、Hoechst33342および33528、カルセイン−AM、プロピジウムヨウ化物、ナイルブルー、ナイルレッド、オイルレッドO、コンゴレッド、ファストグリーンFCF、DiI、DiO、DiD等、TOTO(登録商標)、YO−PRO(登録商標)、ニュートラルレッド、ニュークリアファストレッド、ピロニンY、酸性フクシン、アストラゾン類染料、MitoTrackerおよび他のミトコンドリア染料、LysoTrackerおよび他のリソソーム染料、サフラニン染料、チオフラビン染料、蛍光ファロイジン、形質膜染料、および感染因子に結合する蛍光化合物、の少なくとも1つを含むことを特徴とする請求項1に記載の方法。
- 抗体および関連分子、アプタマー、Somamers(商標)、核酸オリゴマー、LNAを含む分子プローブは、直接または間接的に蛍光標識と複合体を形成し、上記蛍光標識は、カーボンナノチューブ;カーボン量子ドット;フルオレセイン、ローダミン、アレクサ染料、Cy2、Cy3、Cy5、Cy5.5、テキサスレッド、クマリン系蛍光物質、IRDye800、インドシアニングリーン、bodipy、DyLight染料、オレゴングリーン、フィコエリトリン)を含む有機蛍光標識;希土類元素;半導体量子ドット;有機量子ドット;ポリマードット(pDot);シリカビーズ、ポリマーソーム、ポルフィリン系ミセルおよびリポソームを含む蛍光ナノ粒子;およびFRET系染色複合体;の標識クラスを少なくとも1つ含む部材を含むことを特徴とする請求項1に記載の方法。
- 上記1つ以上の蛍光物質は、細胞外成分、細胞、または細胞成分内の特定の分子に結合する分子プローブに連結する、または正常上皮または間質、または感染因子に対して異なる細胞型によって選択的に吸収されるまたは特異的に処理される方法であって、
標識化処理は、患者が、所望の組織または細胞特異性を有する1つ以上の蛍光化合物を投与される場合、患者(生体内)において組織の切除前に行われる、
標識化処理は、組織の切除または採取後、生体外短期培養中に、酸素を含む温かい組織培地で保持することを含む、細胞の生存性を支持可能な状況下で行われる、または、
標識化処理は、細胞または組織において、免疫蛍光検査によりプローブに晒す、または原位置ハイブリダイゼーション状態を含む、生存性を要求しない状況下で行われる、
ことを特徴とする請求項1に記載の方法。 - 画像取得システムを使用する工程は、
CCD、cMOS、ICCD、またはEMCCDカメラ等の少なくとも1つを含む二次元エリアセンサであって、天然組織分子の蛍光および/または造影剤の蛍光を使用して組織サンプルの領域から少なくとも一つの画像を記録する二次元エリアセンサ、または、
天然組織分子の蛍光および/または造影剤の蛍光を使用して組織サンプルの領域から少なくとも一つの画像を生成するために、上記組織サンプルの切片を点ごとに走査する点検出器、または、
天然組織分子の蛍光および/または造影剤の蛍光を使用して組織サンプルの切片から少なくとも一つの画像を生成するために、上記組織サンプルの切片を線ごとに走査する線検出器、
の少なくとも1つとして動作することを特徴とする請求項1に記載の方法。 - 上記画像取得システムを使用する工程は、後に連結することで上記組織サンプルのより大きい切片または上記組織サンプル全体の1つの拡大画像を形成するように、上記組織サンプルの異なる切片から取得した複数の画像を提供する工程を含むことを特徴とする請求項9に記載の方法。
- 上記紫外線の上記組織サンプルにおける透過深度は、ひとつには上記照明励起光源を上記組織サンプルの表面に対して所望の入射角に配置することによって、またひとつには上記励起波長を調整することによって、制御されることを特徴とする請求項1に記載の方法。
- 上記入射角は、上記組織サンプルの表面に対して40°から80°の間であることを特徴とする請求項1に記載の方法。
- 上記入射角は、上記組織サンプルの表面に対して90°以下であることを特徴とする請求項11に記載の方法。
- 上記紫外線の上記組織サンプルの表面下への透過深度は、約5マイクロメートルから約25マイクロメートルの間であることを特徴とする請求項1に記載の方法。
- 上記透過深度は、約10マイクロメートルであることを特徴とする請求項14に記載の方法。
- 上記画像取得システムを使用する工程の動作は、焦点信号と不要な信号成分との相対寄与が異なる複数の画像を取得する工程を含むことを特徴とする請求項1に記載の方法。
- 複数の画像を取得する工程の動作は、
a)撮像のための、2つ以上の励起波長および1つの発光スペクトル帯域を使用して、画像を取得する工程と、
b)同じ励起波長またはスペクトル帯域を使用して、2つ以上の異なる発光スペクトル帯域を取得する工程と、
c)撮像のための、2つ以上の励起波長および2つ以上の異なる発光スペクトル帯域を使用して、画像を取得する工程と、
d)同じ励起波長を使用する2つ以上の光励起入射角を使用して、画像を取得する工程と、
e)異なる励起波長を使用する2つ以上の光励起入射角を使用して、画像を取得する工程と、
f)撮像のための、同じ発光スペクトル帯域を使用する2つ以上の光励起入射角を使用して、画像を取得する工程と、
g)撮像のための、異なる発光スペクトル帯域を使用する2つ以上の光励起入射角を使用して、画像を取得する工程と、
h)撮像のために使用される、発光の同じ偏光状態を使用する励起の2つ以上の偏光状態を使用して、画像を取得する工程と、
i)撮像のための、発光の異なる偏光状態を使用する励起の1つの偏光状態を取得する工程と、
j)撮像のための、異なる発光スペクトル帯域を使用する特定の入射角における2つ以上の光励起回転角を使用して、画像を取得する工程と、
k)a)からj)の組み合わせを使用する工程と、
l)様々な空間変調照明(励起)パターンを使用して、2つ以上の画像を取得する工程と、
m)画像処理を介して、より深いまたは表面的な信号を除外するために使用される画像を提供するように構成された、異なる空間変調照明(励起)構造を使用して、画像の配列を取得する工程と、
の少なくとも1つを含むことを特徴とする請求項16に記載の方法。 - 組織サンプルを分析するシステムであって、上記組織サンプルは、組織または細胞成分に選択的に蓄積する蛍光染料または蛍光標識分子プローブを含む1つ以上の蛍光物質に晒された組織サンプルであり、上記システムは、
上記組織サンプルにおける紫外線の透過が、表面からの選択された深度の近傍のみに制限されるように選択される波長を有する紫外線を、上記組織サンプルの表面に照射するように構成された照明励起光源と、
上記組織サンプルに関する光情報を提供する顕微鏡と、
上記顕微鏡によって提供された上記光情報から1つ以上の画像を生成する画像取得システムと、
分析のために上記1つ以上の画像の処理および表示を行うため、上記画像取得システムと通信する表示システムと、
を含むことを特徴とするシステム。 - 上記組織サンプルへの紫外線の照射は、
350nm、
340nm、
330nm、
320nm、
310nm、
290nm、
280nm、
270nm、
260nm、
250nm、
245nm、
240nm、
235nm、
230nm、
225nm、
220nm、
210nm、
200nm
の少なくとも1つを中心とする光の波長より選択される波長域を有する紫外線光源を含み、
上記紫外線光源は、
LED、
レーザ、
波長可変レーザ、または
連続レーザ光源、アーク灯、レーザ点火アーク灯、クリプトン臭素エキシマランプ、または所望のスペクトル域の十分な明るさを持つ別の光源のうち、少なくとも1つを含む連続光源、
の少なくとも1つを含むことを特徴とする請求項18に記載のシステム。 - 上記サンプルは、石英、溶融シリカ、サファイア、またはTPX(登録商標)ポリメチルペンテンを含む紫外線透過プラスチックの少なくとも1つを含む紫外線透過材により形成される支持体によって支持され、
上記支持体は、
接触面において良好な光学特性を確保するように上記サンプルを押し付けることができる平面窓として構成することができる支持体、または、
場合によっては使い捨て可能であり、上記組織を導入することができるキュベット形状部材として構成することができ、周囲の撮像のために、4つ以上の平坦または場合によっては湾曲した表面を提供する支持体、
の少なくともいずれかであることを特徴とする請求項18に記載のシステム。 - 上記画像取得システムは、焦点信号と不要な信号成分との相対寄与が異なる複数の画像を取得するように構成され、上記複数の画像は、
a)撮像のための、2つ以上の励起波長および1つの発光スペクトル帯域を使用する画像と、
b)同じ励起波長またはスペクトル帯域を使用する2つ以上の異なる発光スペクトル帯域と、
c)撮像のための、2つ以上の励起波長および2つ以上の異なる発光スペクトル帯域を使用する画像と、
d)同じ励起波長を使用する2つ以上の光励起入射角を使用する画像と、
e)異なる励起波長を使用する2つ以上の光励起入射角を使用する画像と、
f)撮像のための、同じ発光スペクトル帯域を使用する2つ以上の光励起入射角を使用する画像と、
g)撮像のための、異なる発光スペクトル帯域を使用する2つ以上の光励起入射角を使用する画像と、
h)撮像のために使用される、発光の同じ偏光状態を使用する励起の2つ以上の偏光状態を使用する画像と、
i)撮像のための、発光の異なる偏光状態を使用する励起の1つの偏光状態と、
j)撮像のための、異なる発光スペクトル帯域を使用する、特定の入射角における2つ以上の光励起回転角を使用する画像と、
k)a)からj)の組み合わせを使用する工程と、
l)様々な空間変調照明(励起)パターンを使用する2つ以上の画像と、
m)画像処理を介して、より深いまたは表面的な信号を除外するために使用される画像を提供するように構成された、異なる空間変調照明(励起)構造を使用する画像の配列と、
の少なくとも1つを含むことを特徴とする請求項18に記載のシステム。
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