CN1588003A - 单分子荧光样品快速纵向超分辨的方法 - Google Patents

Abstract

一种单分子荧光样品快速纵向超分辨的方法，采用全内反射荧光探测系统，通过在探测过程中改变激光光束的入射角从而改变激发场的渗透深度，根据单分子荧光成像强度随渗透深度的变化函数关系，重构出荧光分子之间的纵向间隔、荧光分子的绝对纵向位置和荧光分子半径大小的信息。本发明可以实现荧光分子的纳米级的纵向超分辨，而且具有实验操作简单、快速、激发和探测对样品无接触，样品在固体状态和液态环境下均可进行探测。一次测量可以得到多个参数。

Description

单分子荧光样品快速纵向超分辨的方法

技术领域

本发明涉及单个分子、单个原子进行探测，是一种单分子荧光样品快速纵向超分辨的方法，更详细地说，是用近场激发全场探测的显微方法，实现单分子荧光样品快速纵向超分辨的方法。

背景技术

对单个分子、单个原子进行探测和操纵是人类长久以来的梦想。进入上世纪90年代，随着超灵敏的探测设备的飞速发展，单分子探测已经成为可能。它为科学家提供了一种全新的手段来研究诸如分子生物学、化学、医学以及纳米科学等领域的前沿课题。在单分子探测技术发展以前，所有的分子实验都是探测分子集团平均的结果，虽然这类研究给我们带来了丰富的资料，但是这种综合平均效应的研究有其不可逾越的缺陷，即整体对象的平均效应掩盖了来自单个分子的特殊反应，而对这些特殊反应的了解正是在我们了解生命本质、物理本源的根本基础。

当然，要实现单分子探测还面临着重重困难，尤其是对单分子三维探测。为了实现这一目的，国内外提出了很多新的方法。例如共焦扫描荧光显微技术[1]、近场扫描显微技术[2]、原子力显微技术[3]、全内反射显微技术[4]等。技术[1]在横向分辨率上可比传统的光学衍射极限分辨率提高1.2～1.5倍，并且在纵向上具有层析能力。差分共焦术、干涉共焦术等纵向分辨率甚至可以达到1nm，但是它的分辨样品主要是针对固体材料，分辨原理是利用共焦扫描的纵向响应曲线的线性段对材料的面形进行重构。在单分子探测领域，它们的纵向层析能力大大下降或根本无法分辨。技术[2]和技术[3]在横向分辨率上可以达到1nm或更高，在纵向上可达0.1nm，但是同样它们的纵向分辨也只是针对固态样品，当单分子样品是在液态环境下时则很难工作；同时在仪器上，这两种技术要求的控制精度非常高，价格昂贵，对环境及样品的要求苛刻。最重要的是，以上的技术均为扫描类显微技术、它们是以点扫描、点探测为基础来实现成像的，从而很难实现快速的实时成像和分辨。

技术[4]是一种近场激发的宽场荧光探测技术，不需要对样品进行扫描，所以可以进行实时成像和分辨。同时全内反射成像无需对样品进行准接触，对样品无严格要求，在固体状态和液体环境下均可以。将全内反射荧光显微术用于纵向分辨成像，国外也曾有文献报道[5][6]。应用较多的是多角度入射全内反射荧光成像(VATIRFM)，它需要从临界角开始连续改变入射角的大小，然后在数学上用反拉普拉斯变换实现纵向重构。这种重构的数学模型是使用高帽型数学函数或矩形函数来模拟荧光分子的纵向分布，但这些模型实际上是描述荧光分子数目较多，聚集形成薄层结构的情况，并不适用于单分子探测的情形。

发明内容

本发明要解决的技术问题是针对上述在先技术运用于单分子探测的不足，提出一种单分子荧光样品快速纵向超分辨的方法，以快速实现单分子的纵向超分辨探测。

本发明的单分子荧光样品快速纵向超分辨的方法是基于全内反射荧光显微术，采用全内反射荧光探测系统对被测单分子荧光样品进行探测，两次改变入射角，使得在这两种情况下隐失场的渗透深度之比为2∶1，记录下相应渗透深度时的单分子荧光成像的强度图，对强度分布图进行对比分析，从而精确重构出被测样品单个荧光分子之间的纵向间隔、荧光分子的绝对纵向位置和荧光分子半径的信息，其具体步骤是：

①制备单分子荧光待测样品；

②在一台全内反射荧光探测系统的载物台上放置该荧光样品，调节该系统使之正常工作，激光器发出的激光束由光纤导引，经过该系统同光轴地垂直照射荧光样品，并使样品在CCD成清晰的图像；

③调节光纤精密平移架，使激光束通过光纤离轴地入射，经该系统的成像物镜在全内反射荧光成像方式下对被测单分子荧光样品进行照明、探测成像，并记入射角为θ₁，相应的渗透深度为d₁，入射角与渗透深度之间的关系式为

$d_1={\mathrm{\λ}}_0/\left(4\mathrm{\π}\sqrt{n_1^2{\sin }^2{\mathrm{\θ}}_i-n_2^2}\right)$

即渗透深度d₁与离轴量χ₁之间的关系为

$d_1=\frac{{\mathrm{\λ}}_0}{4\mathrm{\π}\sqrt{{\mathrm{\χ}}^2/f^2-{n_2}^2}}$

式中：n₁为物镜浸没油折射率，n₂为样品折射率，χ为离轴量，f为所用物镜的焦距，λ₀为入射光的波长；

④用CCD记录荧光强度图1，其中包括各个单分子的强度信息；

⑤进一步增大入射角到θ₂，相应的渗透深度为d₂，使d₁和d₂之间满足关系式d₁＝2d₂，并用CCD记录此时的荧光强度图2；

⑥从荧光强度图1和荧光强度图2中获得待测样品中各个荧光分子的最大成像强度，分别记为F₁ ^d1、F₁ ^d2，F₂ ^d2、F₂ ^d2，F₃ ^d1、F₃ ^d2……，将荧光强度图1或荧光强度图2中不同分子的荧光强度进行比较，得到荧光分子之间的相对纵向间隔 $\mathrm{\Δc}=d_1\·\ln \frac{F_i^{d_1}}{F_j^{d_1}},$ i，j表示第i个分子和第j个分子；

⑦将同一分子在荧光强度图1和图2中的荧光强度进行比较，以确定单个荧光分子的绝对纵向位置 $c_i=-d_2\·\ln \left[F_i^{d_2}\frac{1-k^2}{4k}\right]$ 和荧光分子的半径 $R=-d_2\ln \frac{1-k}{1+k},$ 这里 $k={\left[F_i^{d_1}\right]}^2/F_i^{d_2}\·2I_0\·d_1.$

所述的样品是用通过旋涂的方法将待测样品溶液旋涂在玻片的表面上。

本发明方法的理论依据如下：

全内反射荧光探测系统的激发光场，即隐失场的强度是随离开界面的垂直距离成指数衰减的，即它对距离的变化非常灵敏。这样，不同纵向位置处的荧光物体所受到的激发场的强度不同，从而使其荧光发射的强度也不同，表现为被系统探测的荧光强度不同。Reichert W H和Truskey G A等人(J.Cell.Sci.96 219，1990)曾具体分析了全内反射探测系统下的荧光成像，得出公式为

$F={\∫}_0^{d_{\mathrm{eff}}}\mathrm{\φ}\left(Z\right)\·\mathrm{\α}\left(Z\right)\·C\left(Z\right)\·Q\left(Z\right)\·I^t(Z,{\mathrm{\θ}}_i)\mathrm{dZ}$

I^t(Z，θ_i)＝I^t(0，θ₂)exp[-Z/d_eff(θ_i)]

$d_{\mathrm{eff}}\left({\mathrm{\θ}}_i\right)={\mathrm{\λ}}_0/\left(4\mathrm{\π}\sqrt{n_1^2{\sin }^2{\mathrm{\θ}}_i-n_2^2}\right)$

式中，λ₀是入射光波长，θ_i是光束的入射角；φ(Z)是荧光分子的量子产率；α(Z)是荧光分子的摩尔消光比；C(Z)是荧光分子的浓度；I^t(0，θ_i)是界面处的隐失场强度，以下简写为I₀(θ_i)；I^t(Z，θ_i)是距离分界面Z处的隐失场强度；d_eff(θ_i)是隐失场的渗透深度，以下简写为d(θ_i)。一般情况下，荧光分子的量子产率和消光比近似与界面性质无关，并且探测效率在隐失场范围内可认为与z无关，请参见文献Loerke D，Preitz B，Stuhmer W et al，J.Biom.Optics 5 23，2000，即

                φ(z)·α(z)·Q(z)＝φ·α·Q＝K

K为与系统有关的常数。则全内反射的荧光成像强度可简化为：

$F(x,y,\mathrm{\θ})=K\·I^t(0,{\mathrm{\θ}}_i)\·\underset{0}{\overset{\∞}{\∫}}c(x,y,z)\·\exp (-z/d\left(\mathrm{\θ}\right))\mathrm{dz}--\left(1\right)$

对于单分子荧光样品，我们采用球形模型，荧光分子的分布可写为

其中(a_i，b_i，c_i)表示第i个荧光分子的坐标。将(2)式代入(1)式，我们可以得到在入射角θ_i下每个分子的成像

$F_1=I_0\left({\mathrm{\θ}}_i\right)\·d\left({\mathrm{\θ}}_i\right)\left\{\exp \right[-\frac{(c_1-\sqrt{R^2-{(x-a_1)}^2+{(y-b_1)}^2})}{d}]-\exp [-\frac{(c_1+\sqrt{R^2-{(x-a_1)}^2+{(y-b_1)}^2})}{d}\left]\right\}$

$F_2=I_0\left({\mathrm{\θ}}_i\right)\·d\left({\mathrm{\θ}}_i\right)\left\{\exp \right[-\frac{(c_2-\sqrt{R^2-{(x-a_2)}^2+{(y-b_2)}^2})}{d}]-\exp [-\frac{(c_2+\sqrt{R^2-{(x-a_2)}^2+{(y-b_2)}^2})}{d}\left]\right\}$

$F_3=I_0\left({\mathrm{\θ}}_i\right)\·d\left({\mathrm{\θ}}_i\right)\left\{\exp \right[-\frac{(c_2-\sqrt{R^2-{(x-a_3)}^2+{(y-b_3)}^2})}{d}]-\exp [-\frac{(c_2+\sqrt{R^2-{(x-a_3)}^2+{(y-b_3)}^2})}{d}\left]\right\}$

……

取出每个单分子成像的中心强度最大值为

${\left(F_1\right)}_{\max }=I_0\left({\mathrm{\θ}}_i\right)\·d\left({\mathrm{\θ}}_i\right)\·\left\{\exp \right[-\frac{c_1-R}{d}]-\exp [-\frac{c_1+R}{d}]\}$

${\left(F_2\right)}_{\max }=I_0\left({\mathrm{\θ}}_i\right)\·d\left({\mathrm{\θ}}_i\right)\·\left\{\exp \right[-\frac{c_2-R}{d}]-\exp [-\frac{c_2+R}{d}]\}$

${\left(F_3\right)}_{\max }=I_0\left({\mathrm{\θ}}_i\right)\·d\left({\mathrm{\θ}}_i\right)\·\left\{\exp \right[-\frac{c_3-R}{d}]-\exp [-\frac{c_3+R}{d}]\}$

……

分析以上描述单分子成像的超越方程，可以看出具有特殊的数学上的对称性。当改变一次入射角，使对应的渗透深度d₁＝2d₂，在两种渗透深度下分别对单分子荧光样品进行成像。对于任一荧光分子(记为荧光分子1)有：

解上述方程，我们可以得到荧光分子1的绝对位置

$c_1=-d_2\ln \left[F_1^{d_2}\frac{1-k^2}{4k}\right]$

$k={\left[F_1^{d_1}\right]}^2/[F_1^{d_2}\·2I\·d_1]$

同理可得通式为：

$c_i=-d_2\left({\mathrm{\θ}}_2\right)\·\ln \left[F_i^{d_2}\frac{1-k^2}{4k}\right]---\left(3\right)$

$k_i={\left[F_i^{d_1}\right]}^2/[F_i^{d_2}\·2I\·d_1]$

这里i表示第i个分子。同时还可确定荧光分子的半径大小

$R_i=-d_2\ln \frac{1-k_i}{1+k_i}--\left(4\right)$

荧光分子之间的相对纵向间隔为

$\mathrm{\Δc}=c_j-c_i=d_1\·\ln \frac{F_i^{d_1}}{F_j^{d_1}}---\left(5\right)$

这里i，j表示第i个和第j个分子。

本发明的优点在于：

1、本发明单分子荧光样品快速纵向超分辨的方法能够在全内反射荧光探测系统中实现单分子荧光样品的纵向超分辨，在整个实验过程中只需改变一次入射角，两次成像，实验操作简单。

2、由于全内反射荧光成像系统是宽场成像，同时本发明方法中提出的图像处理仅涉及简单的除运算等，因而本发明方法可以实时快速纵向分辨。

3、激发和探测均无需对样品进行接触，因此对样品操作空间大。同时对样品无特殊要求，在固体状态和液态环境下均可进行探测。

4、一次测量可以得到多个参数，包括荧光分子之间的相对间隔、荧光分子的绝对位置和荧光分子的半径。

附图说明

图1为本发明所采用的全内反射荧光探测系统结构示意图

图2为本发明全内反射荧光探测系统全内反射荧光成像状态示意图

图3为本发明全内反射荧光探测系统中全内反射隐失场激发待测样品示意图

图4为本发明隐失场渗透深度与离轴量之间关系图

图5单分子荧光成像图，箭头所指为A，B两分子。

具体实施方式

请参阅图1和图2，图1为本发明采用的全内反射荧光探测系统结构示意图，该全内反射荧光探测系统由光源1、光纤2、光纤精密平移架3、准直物镜4、会聚物镜5、双色分束镜6、成像物镜7、载物台和和用来记录荧光成像的电荷耦合器件(CCD)10构成。光源1为Ar离子激光器，模式为TEM00，波长488nm；光纤2为单模保偏光纤，数值孔径为0.4；成像物镜7为100×，数值孔径为1.65，油浸；浸没油8折射率1.78；所述的载物台即玻片上旋涂有待测样品9，玻片的折射率为1.78。

本发明单分子荧光样品快速纵向超分辨的方法包括下列步骤：

①制备单分子荧光待测样品(9)；本实施例中选用含荧光素的聚甲基丙烯酸甲酯(缩写为PMMA)高分子膜。它是通过将10ul的浓度为10^-6M/L的荧光素染料溶于10ml的PMMA的溶液中(溶剂为甲苯，溶质为PMMA，两者重量比为7％)，最终荧光素的浓度为10^-9M/L。然后通过旋涂的方法将溶液旋涂在玻片的表面。

②在一台全内反射荧光探测系统的载物台上放置该荧光样品9，调节该系统使之正常工作，由Ar离子激光光源1发射输出波长为488nm的激光束由光纤2导引，使光束中心和系统光轴同轴，再经准直透镜4、会聚透射5和双色分束镜6进入物镜，正入射到玻片的样品9上，此时调节物镜7和样品9之间的距离，使样品9在CCD10上成清晰的图像，如图1所示。

③调节光纤精密平移架(3)，使激光束通过光纤(2)离轴地入射，经该系统的成像物镜(7)在全内反射荧光成像方式下对被测单分子荧光样品(9)进行照明、探测成像，并记入射角为θ₁，相应的渗透深度为d₁，如图2所示，入射角与渗透深度之间的关系式为

$d_1={\mathrm{\λ}}_0/\left(4\mathrm{\π}\sqrt{n_1^2{\sin }^2{\mathrm{\θ}}_1-n_2^2}\right)$

即渗透深度d₁与离轴量χ₁之间的关系为

$d_1=\frac{{\mathrm{\λ}}_0}{4\mathrm{\π}\sqrt{{\mathrm{\χ}}^2/f^2-{n_2}^2}}$

式中：n₁为物镜浸没油折射率，n₂为样品折射率，χ为离轴量，f为所用物镜的焦距，λ₀为入射光的波长；

④用CCD记录荧光强度图1，其中包括各个单分子的强度信息；

⑤进一步增大入射角到θ₂，相应的渗透深度为d₂，使d₁和d₂之间满足关系式d₁＝2d₂，并用CCD记录此时的荧光强度图2；参见图3、图4和图5

⑥从荧光强度图1和荧光强度图2中获得待测样品(9)中各个荧光分子的最大成像强度，分别记为F₁ ^d1、F₁ ^d2，F₂ ^d1、F₂ ^d2，F₃ ^d1、F₃ ^d2……，将荧光强度图1或荧光强度图2中不同分子的荧光强度进行比较，得到荧光分子之间的相对纵向间隔 $\mathrm{\Δc}=d_1\·\ln \frac{F_i^{d_1}}{F_j^{d_1}},$ i，j表示第i个分子和第j个分子；

⑦将同一分子在荧光强度图1和图2中的荧光强度进行比较，以确定单个荧光分子的绝对纵向位置 $c_i=-d_2\·\ln \left[F_i^{d_2}\frac{1-k^2}{4k}\right]$ 和荧光分子的半径 $R=-d_2\ln \frac{1-k}{1+k},$ 这里 $k={\left[F_i^{d_1}\right]}^2/F_i^{d_2}\·{2I}_0\·d_1.$

单分子探测是一种超精密探测，整个实验过程及样品的制备均应在标准超净室中完成，并且要特别注意玻片的清洗和样品制备时的清洁。单分子荧光会发生淬灭，发生淬灭所需的时间与激光功率密切相关，因此应仔细选择入射激光的功率，使在CCD10的探测过程中不会发生荧光淬灭。选取荧光成像图如图5所示中的两个分子A和B，此图对应的离轴距离为133.5um，相应的入射角为60°，渗透深度为151.3nm，根据公式(5)计算出两个分子之间的纵向间隔为48nm。

Claims (2)

1、一种单分子荧光样品快速纵向超分辨的方法，其特征在于该方法是利用全内反射荧光探测系统对被测单分子荧光样品(9)进行全场成像，重构出单个荧光分子之间的纵向间隔、荧光分子的绝对纵向位置和荧光分子半径的信息，其具体步骤是：

①制备单分子荧光待测样品(9)；

②在一台全内反射荧光探测系统的载物台上放置该荧光样品(9)，调节该系统使之正常工作，激光器(1)发出的激光束由光纤(2)导引，经过该系统同光轴地垂直照射荧光样品(9)，并使样品(9)在CCD(10)成清晰的图像；

③调节光纤精密平移架(3)，使激光束通过光纤(2)离轴地入射，经该系统的成像物镜(7)在全内反射荧光成像方式下对被测单分子荧光样品(9)进行照明、探测成像，并记入射角为θ₁，相应的渗透深度为d₁，入射角与渗透深度之间的关系式为

$d_1={\mathrm{\λ}}_0/\left(4\mathrm{\π}\sqrt{n_1^2{\sin }^2{\mathrm{\θ}}_i-n_2^2}\right)$

即渗透深度d₁与离轴量x₁之间的关系为

$d_1=\frac{{\mathrm{\λ}}_0}{4\mathrm{\π}\sqrt{x^2/f^2-{n_2}^2}}$

式中：n₁为物镜浸没油折射率，n₂为样品折射率，x为离轴量，f为所用物镜的焦距，λ₀为入射光的波长；

④用CCD记录荧光强度图1，其中包括各个单分子的强度信息；

⑤进一步增大入射角到θ₂，相应的渗透深度为d₂，使d₁和d₂之间满足关系式d₁＝2d₂，并用CCD记录此时的荧光强度图2；

⑥从荧光强度图1和荧光强度图2中获得待测样品(9)中各个荧光分子的最大成像强度，分别记为F₁ ^d1、F₁ ^d2，F₂ ^d1、F₂ ^d2，F₃ ^d1、F₃ ^d2……，将荧光强度图1或荧光强度图2中不同分子的荧光强度进行比较，得到荧光分子之间的相对纵向间隔 $\mathrm{\Δc}{=d}_1\·\ln \frac{{F_i}^{d_1}}{{F_j}^{d_1}},$ i，j表示第i个分子和第j个分子；

⑦将同一分子在荧光强度图1和图2中的荧光强度进行比较，以确定单个荧光分子的绝对纵向位置 $c_i={-d}_2\·\ln \left[{F_i}^{d_2}\frac{{1-k}^2}{4k}\right]$ 和荧光分子的半径 $R={-d}_2\ln \frac{1-k}{1+k},$ 这里 $k={\left[{F_i}^{d_1}\right]}^2/{F_i}^{d_2}\·{2I}_0\·d_1.$

2、根据权利要求1所述的快速实现单分子荧光样品纵向超分辨的方法，其特征在于所述的样品(9)是用通过旋涂的方法将待测样品溶液旋涂在玻片的表面上。

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