CN116626011A - 一种用于单分子动力学检测的纳米光学器件 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种用于单分子动力学检测的纳米光学器件，包括：纳米结构芯片和激光器；激光器用于向纳米结构芯片发射激光；纳米结构芯片包括纳米孔，纳米孔用于检测单分子的结合行为以及在激光照射下的解离行为，纳米孔的直径范围为50nm至200nm。本发明实施例提供的单分子动力学检测的纳米光学器件，通过设置纳米结构芯片中纳米孔的直径为50nm至200nm，该纳米孔能够对入射的激光产生阻挡效应，产生有效激发体积小于典型的零模波导，获得更高的时间分辨率。从而解决目前对于单分子动力学检测时间分辨率较差的技术问题。
Description
技术领域
本发明涉及生物检测芯片技术领域，具体涉及一种用于单分子动力学检测的纳米光学器件。
背景技术
随着基于光学、机械、电、化学和流体动力学的单分子操纵技术的出现，单个分子的构象变化及其机械性能的研究得以实现，即单分子动力学检测。单分子的动力学研究可以一次监测一个单体的结合和解离行为。分子反应的模式可以通过相应的反应速率常数来解析。荧光标签标记的单分子检测方法可以实现生物单分子检测，在蛋白相互作用、生物膜作用机制、核酸测序等领域获得了广泛应用。
由于单分子荧光的特性，检测需要高空间分辨率和高时间分辨率的仪器和方法。目前，共焦显微镜、全内反射荧光显微镜、零模波导以及等离激元纳米天线等技术可以克服光学衍射极限，实现毫秒（ms）级别的时间分辨率。但对于单分子动力学，更高的时间分辨率意味着更高的准确性。目前对于微秒（μs）级别时间分辨率的单分子动力学检测研究，尚且缺少研究手段。
另一方面，在高时间分辨率的需求下，相比于目标检测信号，背景噪声水平和其他干扰噪声水平也相应提高，所以需要提高目标检测信号的收集效率。收集效率越高，意味着采集到的目标信号强度越大，信噪比越高。同时，在核酸测序、单分子动力学、蛋白测序等领域需要进行同时并行检测，以提高检测结果的准确性。因此单分子检测手段，须具有高通量的特点。
发明内容
有鉴于此，本发明实施例提供一种用于单分子动力学检测的纳米光学器件，以解决现有技术中对于单分子动力学检测时间分辨率较差的技术问题。
本发明实施例提供的技术方案如下：
本发明实施例提供一种用于单分子动力学检测的纳米光学器件，包括：纳米结构芯片和激光器；所述激光器用于向所述纳米结构芯片发射激光；所述纳米结构芯片包括纳米孔，所述纳米孔用于检测单分子的结合行为以及在激光照射下的解离行为，所述纳米孔的直径范围为50nm至200nm。
本发明实施例提供的单分子动力学检测的纳米光学器件，通过设置纳米结构芯片中纳米孔的直径为50nm至200nm，该纳米孔能够对入射的激光产生阻挡效应，产生有效激发体积小于典型的零模波导，获得更高的时间分辨率。从而解决目前对于单分子动力学检测时间分辨率较差的技术问题。
可选地，所述激光的入射角为0°至85°。
可选的，用于单分子动力学检测的纳米光学器件还包括：聚焦控制系统、物镜、二向色镜以及相机；所述聚焦控制系统、所述物镜以及所述二向色镜设置在所述激光器和所述纳米结构芯片之间，所述聚焦控制系统用于调整所述激光入射至所述纳米结构芯片的激光的入射角，所述二向色镜用于将所述聚焦控制系统调整后的激光反射后通过所述物镜照射至所述纳米结构芯片上，所述二向色镜还用于将单分子结合和解离时产生的荧光信号透射至所述相机。
可选地，所述聚焦控制系统包括：第一反射镜、第二反射镜以及聚焦透镜，所述第一反射镜将所述激光器输出的激光反射至所述第二反射镜，所述第二反射镜将第一反射镜反射的激光反射至所述聚焦透镜，所述聚焦透镜用于将接收的激光聚焦后输出，改变所述第二反射镜和所述聚焦透镜相对于所述第一反射镜的位置，改变激光入射至所述纳米结构芯片上的入射角。
可选地，所述纳米结构芯片包括依次设置的基底和金属薄膜，多个阵列设置的纳米孔穿过所述金属薄膜并延伸至所述基底预设深度。
本实施例中，通过设置纳米孔延伸至基底预设深度，能够使得在有效激发体积内形成更大的平均激发功率。
可选地，用于单分子动力学检测的纳米光学器件还包括：荧光聚焦增强元件，设置在所述纳米孔的回转轴线方向上，所述荧光聚焦增强元件设置在所述基底和所述金属薄膜之间。
本实施例中，通过设置荧光聚焦增强元件，能够将结合或解离形成产生的荧光信号增强，由此，单位时间内可采集到荧光信号量提高，在相机的感应灵敏度相同的情况下，可以进一步缩小采样时间，同时不影响荧光信号的采集，由此通过荧光聚焦增强元件的设置进一步提高了时间分辨率。并且，荧光信号的增强，意味着可以使用低数值孔径的物镜，即采用低倍物镜进行荧光成像。而低倍物镜的成像视野更大，可以同时对更多的纳米孔进行成像，实现并行检测，从而实现高通量的目标。
可选地，所述荧光聚焦增强元件包括反射镜或光学透镜，所述反射镜包括曲面反射镜、二元反射镜或斜面反射镜中的任一种，所述光学透镜包括透镜过渡层和透镜本体，所述透镜过渡层设置在所述透镜本体和所述纳米孔之间，所述透镜本体的折射率大于所述透镜过渡层和所述基底的折射率，所述透镜本体包括曲面光学透镜、二元光学透镜或斜面光学透镜中的任一种。
可选地，所述曲面反射镜和/或所述曲面光学透镜的空间形状为采用抛物线截面、双曲线截面或标准圆曲线截面沿纳米孔轴线旋转而形成的回转体，所述曲面反射镜的高度范围为1μm至6μm，所述曲面光学透镜的高度范围为0.36μm至3μm。
可选地，所述二元反射镜和/或所述二元光学透镜的空间形状为多级台阶轮廓截面旋转而形成的回转体，多级台阶的阶数为2阶、4阶、6阶或8阶，所述二元反射镜和/或所述二元光学透镜纵截面的轮廓拟合形状为抛物线、双曲线、标准圆曲线或直线，当轮廓拟合形状为直线时，所述直线与纳米孔轴线的夹角范围为5°至70°，所述二元反射镜顶面直径范围为1μm至4μm，所述二元反射镜的高度范围为1μm至6μm，所述二元光学透镜远离纳米孔一侧的端面的直径范围为0.5μm至7μm，所述二元光学透镜的高度范围为0.36μm至3μm。
可选地，所述斜面反射镜和/或所述斜面光学透镜的空间形状为梯形轮廓截面旋转而形成的回转体，所述斜面反射镜和/或所述斜面光学透镜的纵截面与纳米孔轴线的夹角范围为5°至70°，所述斜面反射镜的顶面直径范围为1μm至4μm，所述斜面反射镜的高度范围为1μm至6μm，所述斜面光学透镜远离纳米孔一侧的端面的直径范围为0.5μm至7μm，所述斜面光学透镜的高度范围为0.36μm至3μm。
可选地，用于单分子动力学检测的纳米光学器件还包括：钝化层、修饰层和连接层，所述钝化层设置在所述纳米孔的侧壁以及所述金属薄膜远离所述基底的表面，所述修饰层设置在所述纳米孔底部，所述修饰层用于控制所述纳米孔中所述连接层的位点数量；当纳米孔中加入待测溶液时，待测溶液中的锚定蛋白和连接层固定连接；当纳米孔中加入荧光标记的目标蛋白时，目标蛋白和锚定蛋白反应结合，并在激光的照射下进行解离。
本实施例中，设置钝化层能够防止荧光染料、蛋白质等非特异性吸附。同时通过设置修饰层和连接层，便于进行蛋白质结合和解离相互作用的动力学检测。
可选地，用于单分子动力学检测的纳米光学器件还包括：钝化层、磷脂修饰层和脂质体类生物膜，所述钝化层设置在所述纳米孔的侧壁以及所述金属薄膜远离所述基底的表面，所述磷脂修饰层设置在所述纳米孔底部，所述磷脂修饰层用于固定所述脂质体类生物膜；当纳米孔中加入待测溶液时，待测溶液中的膜蛋白和脂质体类生物膜固定连接；当纳米孔中加入荧光标记的目标蛋白时，目标蛋白和膜蛋白反应结合，并在激光的照射下进行解离。
本实施例中，通过设置磷脂修饰层和脂质体类生物膜，便于进行膜蛋白结合和解离相互作用的动力学检测。
可选地，用于单分子动力学检测的纳米光学器件还包括：处理器，所述处理器接收所述相机转发的荧光信号，提取所述荧光信号中的上升沿或者下降沿之间的时间间隔，对所述时间间隔进行统计拟合，得到包含结合时间常数或解离时间常数的曲线。
本实施例中，通过对荧光信号中的上升沿或者下降沿之间的时间间隔，进行统计拟合，实现了对单分子结合和解离作用的检测和分析。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明实施例中用于单分子动力学检测的纳米光学器件的结构框图；
图2为本发明实施例中纳米结构芯片的结构示意图；
图3为本发明实施例中激光在纳米孔内分布的仿真计算结果示意图；
图4a为本发明另一实施例中纳米结构芯片的结构示意图；
图4b为图4a中A-A剖面的结构示意图；
图5为本发明实施例中曲面反射镜的结构示意图；
图6为本发明实施例中曲面光学透镜的结构示意图；
图7为本发明实施例中二元反射镜的结构示意图；
图8为本发明实施例中二元光学透镜的结构示意图；
图9为本发明实施例中斜面反射镜的结构示意图；
图10为本发明实施例中斜面光学透镜的结构示意图；
图11为本发明实施例中纳米孔表面钝化及底部修饰处理的示意图；
图12为本发明实施例中蛋白质单分子动力学检测的示意图；
图13为本发明实施例中生物膜表面蛋白质单分子动力学检测的示意图
图14为本发明实施例中单分子反应动力学停留时间概念示意图；
图15为本发明实施例中停留时间分析及等待时间直方图的示意图。
具体实施方式
下面将结合附图对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
在本发明的描述中，需要说明的是，术语“中心”、“上”、“下”、“左”、“右”、“竖直”、“水平”、“内”、“外”等指示的方位或位置关系为基于附图所示的方位或位置关系，仅是为了便于描述本发明和简化描述，而不是指示或暗示所指的装置或元件必须具有特定的方位、以特定的方位构造和操作，因此不能理解为对本发明的限制。此外，术语“第一”、“第二”、“第三”仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性。
在本发明的描述中，需要说明的是，除非另有明确的规定和限定，术语“安装”、“相连”、“连接”应做广义理解，例如，可以是固定连接，也可以是可拆卸连接，或一体地连接；可以是机械连接，也可以是电连接；可以是直接相连，也可以通过中间媒介间接相连，还可以是两个元件内部的连通，可以是无线连接，也可以是有线连接。对于本领域的普通技术人员而言，可以具体情况理解上述术语在本发明中的具体含义。
此外，下面所描述的本发明不同实施方式中所涉及的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互结合。
本发明实施例提供一种用于单分子动力学检测的纳米光学器件，如图1和图2所示，包括：纳米结构芯片1和激光器20；所述激光器20用于向所述纳米结构芯片1发射激光2；所述纳米结构芯片1包括纳米孔13，所述纳米孔13用于检测单分子的结合行为以及在激光照射下的解离行为，如图2所示，所述纳米孔的直径范围d为50nm至200nm。例如，纳米孔的直径可以是50nm、80nm、100nm、120nm、150nm、180nm以及200nm等等。在一可选的实施方式中，所述激光的入射角θ为0°至85°，例如可以是0°、10°、20°、30°、40°、50°、60°、70°、80°以及85°等。
其中，纳米孔的水平截面为圆形、椭圆形或者四边形等，即纳米孔的结构可以是圆柱体、球形、长方体或者正方体等结构。具体地，可以以纳米孔的中心轴线作为法线，入射光线和法线的夹角为入射角，因此，当入射角为0°时，激光垂直入射至纳米孔。当激光入射至纳米孔时，如图2和图3所示，由于纳米孔周围的结构对倾斜入射的激光形成阻挡效应，所以入射的激光无法到达纳米孔顶部，只照亮纳米孔底部。而且随着入射角增加，光线的偏折增大，并阻挡的光线越多。即纳米孔中对于待测溶液14形成的有效激发体积15随入射角的增大而减小。并且，在发生结合行为和解离行为时会产生荧光信号的变化，例如由灭变亮，或者由亮变灭，可以通过对荧光信号的采样进行单分子检测。在相同的采样时间下，由于游离荧光干扰信号的扩散速度一定，随着有效激发体积的减小，则驻留时间更短（可以理解为路程减小，速度一定时，时间减小），采集的信号量更小。而目标检测分子的反应是结合在纳米孔底部的，即反应时一直在孔底，因此不受激发体积影响，即采集的目标荧光信号的驻留时间不变，采集的荧光量保持不变。所以在缩小采样时间的情况下，游离的荧光干扰信号与目标荧光信号也能区分开。由此可知，激发体积的减小意味着更高的时间分辨率。本实施例中，当纳米孔的直径为50nm至200nm时，纳米孔均能对入射的激光形成阻挡效应，使得有效激发体积减小，从而得到满足要求的时间分辨率，即比相关技术中更高的时间分辨率。同时设置入射角为0°至85°，在该入射角度时，结合直径为50nm至200nm的纳米孔也能够实现较高的时间分辨率。
在一实施方式中，如图1所示，用于单分子动力学检测的纳米光学器件还包括：聚焦控制系统6、物镜4、二向色镜5以及相机7；所述聚焦控制系统6、所述物镜4以及所述二向色镜5设置在所述激光器20和所述纳米结构芯片1之间，所述聚焦控制系统6用于调整所述激光器20入射至所述纳米结构芯片1的激光的入射角，所述二向色镜5用于将所述聚焦控制系统6调整后的激光反射后通过所述物镜4照射至所述纳米结构芯片1上，所述二向色镜5还用于将单分子结合和解离时产生的荧光信号3透射至所述相机7。
其中，如图1所示，所述聚焦控制系统6包括：第一反射镜61、第二反射镜62以及聚焦透镜63，所述第一反射镜61将所述激光器20输出的激光2反射至所述第二反射镜62，所述第二反射镜62将第一反射镜61反射的激光2反射至所述聚焦透镜63，所述聚焦透镜63用于将接收的激光聚焦后输出，改变所述第二反射镜62和所述聚焦透镜63相对于所述第一反射镜61的位置，改变激光入射至所述纳米结构芯片1上的入射角。
具体地，如图1所示，激光器20输出的激光2通过第一反射镜61、第二反射镜62、聚焦透镜63、二向色镜5以及物镜4后照射至纳米结构芯片1上；同时纳米结构芯片1的纳米孔中通过结合行为和解离行为产生的荧光信号3通过物镜4以及二向色镜5后由相机7采集，或者说由相机7对结合行为和解离行为产生的荧光信号进行快速动态成像，从而实现荧光信号的采集。该相机7可以是具有单分子荧光探测能力的EMCCD（Electron-Multiplying CCD，电子倍增CCD）工业相机。相机采集荧光信号后可以输出至外部进行单分子检测。
在一实施方式中，如图2、图4a和图4b所示，所述纳米结构芯片1包括依次设置的基底11和金属薄膜12，多个阵列设置的纳米孔13穿过所述金属薄膜12并延伸至所述基底预设深度P。其中，纳米孔的延伸能够使得在有效激发体积内形成更大的平均激发功率。具体地，基底的材料可以是单一的熔融石英、普通玻璃、碳化硅、氮化硅等材料，也可以是这些材料中的两种、三种或四种组合。金属薄膜的材料可以是单一的金、铝、氧化铝、铬、钛等，也可以是两种、三种或四种金属和/或金属氧化物的两层、三层、四层或五层堆叠组合。其中该纳米结构芯片在制备时，可以在基底的表面先形成金属薄膜，然后对金属薄膜进行刻蚀，形成多个穿透金属薄膜的纳米孔，多个纳米孔可以按照阵列形式排列。纳米孔在形成时，可以延伸到基底中，例如延伸到基底的深度为10nm至20nm。如图4a或图4b所示，单个纳米结构芯片上纳米孔的数量可以是100、2500、10000、40000、150000或10000000。各纳米孔之间的间距L可以是2μm、3μm、5μm、10μm、15μm、20μm、50μm或100μm。
在一实施方式中，用于单分子动力学检测的纳米光学器件还包括：荧光聚焦增强元件，设置在所述纳米孔的回转轴线方向上，所述荧光聚焦增强元件设置在所述基底和所述金属薄膜之间。所述荧光聚焦增强元件包括反射镜或光学透镜，所述反射镜包括曲面反射镜、二元反射镜或斜面反射镜中的任一种，所述光学透镜包括透镜过渡层和透镜本体，所述透镜过渡层设置在所述透镜本体和所述纳米孔之间，所述透镜本体的折射率大于所述透镜过渡层和所述基底的折射率，所述透镜本体包括曲面光学透镜、二元光学透镜或斜面光学透镜中的任一种。其中光学透镜中透镜过渡层的设置能够实现调整透镜本体的焦距的效果，从而使得光学透镜达到更好的聚焦增强效果。
其中，通过设置荧光聚焦增强元件，能够将结合或解离形成产生的荧光信号增强，由此，单位时间内可采集到荧光信号量提高，在相机的感应灵敏度相同的情况下，可以进一步缩小采样时间，同时不影响荧光信号的采集，由此通过荧光聚焦增强元件的设置进一步提高了时间分辨率。并且，荧光信号的增强，意味着可以使用低数值孔径的物镜，即采用低倍物镜进行荧光成像。而低倍物镜的成像视野更大，可以同时对更多的纳米孔进行成像，实现并行检测，从而实现高通量的目标。
具体地，当未采用荧光聚焦增强元件时，从纳米孔底部发出的荧光向基底那侧传输时在空间上是发散的。当采用反射镜作为荧光聚焦增强元件时，荧光会被金属薄膜反射，从而在反射镜靠近基底的一侧形成聚焦或者平行的传输，不再发散。当采用光学透镜作为荧光聚焦增强元件时，荧光信号穿过光学透镜时，会被光学透镜改变传输方向，从而在光学透镜靠近基底的一侧形成聚焦或者平行的传输，不再发散。
其中，如图5和图6所示，所述曲面反射镜131和/或所述曲面光学透镜134的空间形状为采用抛物线截面、双曲线截面或标准圆曲线截面沿纳米孔轴线旋转而形成的回转体，所述曲面反射镜的高度H的范围为1μm至6μm，所述曲面光学透镜的高度H范围为0.36μm至3μm。图6中的虚线为回转轴线。
如图7和图8所示，所述二元反射镜132和/或所述二元光学透镜135的空间形状为多级台阶轮廓截面旋转而形成的回转体，多级台阶的阶数为2阶、4阶、6阶或8阶，所述二元反射镜132和/或所述二元光学透镜135纵截面的轮廓拟合形状为抛物线、双曲线、标准圆曲线或直线，当轮廓拟合形状为直线时，所述直线与纳米孔轴线的夹角范围为5°至70°，所述二元反射镜132顶面直径D范围为1μm至4μm，所述二元反射镜132的高度H（图7中台阶的阶数为2阶，高度H包括2阶对应的高度H1和高度H2）范围为1μm至6μm，所述二元光学透镜135远离纳米孔一侧的端面的直径D范围为0.5μm至7μm，所述二元光学透镜135的高度H（图8中台阶的阶数为2阶，高度H包括2阶对应的高度H1和高度H2）范围为0.36μm至3μm。
如图9和图10所示，所述斜面反射镜133和/或所述斜面光学透镜136的空间形状为梯形轮廓截面旋转而形成的回转体，所述斜面反射镜133和/或所述斜面光学透镜136的纵截面与纳米孔轴线的夹角范围为5°至70°，所述斜面反射镜133的顶面直径D范围为1μm至4μm，斜面反射镜的高度H范围为1μm至6μm，所述斜面光学透镜136远离纳米孔一侧的端面的直径D范围为0.5μm至7μm，所述斜面光学透镜136的高度H范围为0.36μm至3μm。
具体地，通过按照上述参数设置曲面反射镜、二元反射镜或斜面反射镜、曲面光学透镜、二元光学透镜或斜面光学透镜的结构，能够实现光学聚焦增强元件更好的聚焦增强效果。同时在相应尺寸范围内时也便于光学聚焦增强元件的加工。另外，曲面反射镜、二元反射镜以及斜面反射镜的材料可以选择和基底相同的材料。由此，在制备包含反射镜的纳米结构芯片时，可以先对基底表面进行刻蚀，形成如上述结构的曲面反射镜、二元反射镜以及斜面反射镜，然后再形成金属薄膜，最后对金属薄膜刻蚀形成纳米孔。如图6、图8以及图10所示，对于光学透镜，透镜过渡层17可以选择和基底11相同的材料，曲面光学透镜、二元光学透镜或斜面光学透镜等透镜本体可以采用碳化钙或硫化钙等材料。在制备光学透镜时，可以先对基底表面进行刻蚀，然后在基底刻蚀的结构上沉积碳化钙或硫化钙等材料，形成如上述结构的曲面光学透镜、二元光学透镜或斜面光学透镜，之后再依次形成透镜过渡层和金属薄膜，最后对金属薄膜刻蚀形成纳米孔。此外，需要说明的是，二元反射镜、斜面反射镜、二元光学透镜或斜面光学透镜属于是对曲面结构的轮廓形状近似，因此曲面反射镜或曲面光学透镜相比二元反射镜、斜面反射镜、二元光学透镜或斜面光学透镜能形成更好的聚焦效果，但是曲面反射镜或曲面光学透镜的加工工艺较为困难，而二元反射镜、斜面反射镜、二元光学透镜或斜面光学透镜在加工时工艺较为简单。在实际应用中，可以基于具体需求选择不同的荧光聚焦增强元件。
在一实施方式中，如图11和图12所示，用于单分子动力学检测的纳米光学器件还包括：钝化层121、修饰层111和连接层112，所述钝化层121设置在所述纳米孔13的侧壁以及所述金属薄膜12远离所述基底11的表面，所述修饰层111设置在所述纳米孔底部，所述修饰层111用于控制所述纳米孔13中所述连接层112的位点数量；当纳米孔13中加入待测溶液时，待测溶液中的锚定蛋白113和连接层112固定连接；当纳米孔13中加入荧光标记的目标蛋白114时，目标蛋白114和锚定蛋白113反应结合，并在激光的照射下进行解离。
具体地，设置钝化层能够防止荧光染料、蛋白质等非特异性吸附。对于钝化层的材料可以根据金属薄膜材料确定。例如金属薄膜为金时，钝化层材料为巯基-聚乙二醇（HS-PEG）；金属薄膜为铝或氧化铝时，钝化层材料为聚乙烯膦酸（PVPA）。修饰层的材料为聚乙二醇衍生物（mPEG），连接层材料为硅烷-聚乙二醇-生物素。修饰层控制连接层的位点数量时，例如控制位点数量为1个/孔。其中，当待测溶液中包括锚定蛋白时，锚定蛋白上的亲和素位点能够和连接层中的生物素作用，从而被连接层固定在纳米孔的孔底。由此，在纳米孔中再加入荧光标记的目标蛋白时，目标蛋白自由扩散到达纳米孔的孔底，并与锚定蛋白反应结合，此时产生的荧光信号位于信号的上升沿。当采用温度或PH调节（本实施例采用激光照射），能够使得已经反应的目标蛋白和锚定蛋白发生解离，此时荧光本身自然淬灭，产生的荧光信号位于下降沿。
在一实施方式中，如图13所示，用于单分子动力学检测的纳米光学器件还包括：钝化层121、磷脂修饰层115和脂质体类生物膜116，所述钝化层121设置在所述纳米孔13的侧壁以及所述金属薄膜12远离所述基底11的表面，所述磷脂修饰层115设置在所述纳米孔底部，所述磷脂修饰层115用于固定所述脂质体类生物膜116；当纳米孔13中加入待测溶液时，待测溶液中的膜蛋白117和脂质体类生物膜116固定连接；当纳米孔13中加入荧光标记的目标蛋白114时，目标蛋白114和膜蛋白117反应结合，并在激光的照射下进行解离。
具体地，钝化层的设置和上一实施方式相同，在此不再赘述。当待测溶液中包括膜蛋白时，设置脂质体类生物膜固定膜蛋白，同时设置磷脂修饰层固定脂质体类生物膜。脂质体类生物膜的材料可以是外泌体、细胞外囊泡、凋亡小体、细胞器等。当加入待测溶液时，待测溶液中的膜蛋白和脂质体类生物膜固定连接；当纳米孔中加入荧光标记的目标蛋白时，目标蛋白和膜蛋白反应结合，此时产生的荧光信号位于信号的上升沿。当采用温度或PH调节（本实施例采用激光照射），能够使得已经反应的目标蛋白和膜蛋白发生解离，此时荧光本身自然淬灭，产生的荧光信号位于下降沿。
在一实施方式中，用于单分子动力学检测的纳米光学器件还包括：处理器，所述处理器接收所述相机转发的荧光信号，提取所述荧光信号中的上升沿或者下降沿之间的时间间隔，对所述时间间隔进行统计拟合，得到包含结合时间常数或解离时间常数的曲线。其中，如图14所示，定义结合作用on的反应速率常数为结合时间常数Kc，解离作用off的反应速率常数为解离时间常数Kd。
具体地，在单分子检测中，随着结合和解离行为的不断发生，则采集得到如图15所示的荧光信号强度随时间变化的曲线。将曲线中上升沿之间的时间间隔或下降沿之间的时间间隔定义为停留时间或驻留时间。对整个检测过程中的停留时间进行统计，得到停留时间直方图。如图15所示，对该停留时间直方图进行指数曲线拟合，获取含有结合时间常数Kc或解离时间常数Kd的曲线K。由此通过对该曲线进行分析，从而实现对单分子结合和/或解离行为的动力学检测。
虽然关于示例实施例及其优点已经详细说明，但是本领域技术人员可以在不脱离本发明的精神和所附权利要求限定的保护范围的情况下对这些实施例进行各种变化、替换和修改，这样的修改和变型均落入由所附权利要求所限定的范围之内。对于其他例子，本领域的普通技术人员应当容易理解在保持本发明保护范围内的同时，工艺步骤的次序可以变化。
此外，本发明的应用范围不局限于说明书中描述的特定实施例的工艺、机构、制造、物质组成、手段、方法及步骤。从本发明的公开内容，作为本领域的普通技术人员将容易地理解，对于目前已存在或者以后即将开发出的工艺、机构、制造、物质组成、手段、方法或步骤，其中它们执行与本发明描述的对应实施例大体相同的功能或者获得大体相同的结果，依照本发明可以对它们进行应用。因此，本发明所附权利要求旨在将这些工艺、机构、制造、物质组成、手段、方法或步骤包含在其保护范围内。
Claims (13)
1.一种用于单分子动力学检测的纳米光学器件，其特征在于，包括：纳米结构芯片和激光器；
所述激光器用于向所述纳米结构芯片发射激光；
所述纳米结构芯片包括纳米孔，所述纳米孔用于检测单分子的结合行为以及在激光照射下的解离行为，所述纳米孔的直径范围为50nm至200nm。
2.根据权利要求1所述的用于单分子动力学检测的纳米光学器件，其特征在于，所述激光的入射角为0°至85°。
3.根据权利要求1所述的用于单分子动力学检测的纳米光学器件，其特征在于，还包括：聚焦控制系统、物镜、二向色镜以及相机；
所述聚焦控制系统、所述物镜以及所述二向色镜设置在所述激光器和所述纳米结构芯片之间，所述聚焦控制系统用于调整所述激光入射至所述纳米结构芯片的激光的入射角，所述二向色镜用于将所述聚焦控制系统调整后的激光反射后通过所述物镜照射至所述纳米结构芯片上，所述二向色镜还用于将单分子结合和解离时产生的荧光信号透射至所述相机。
4.根据权利要求3所述的用于单分子动力学检测的纳米光学器件，其特征在于，所述聚焦控制系统包括：第一反射镜、第二反射镜以及聚焦透镜，所述第一反射镜将所述激光器输出的激光反射至所述第二反射镜，所述第二反射镜将第一反射镜反射的激光反射至所述聚焦透镜，所述聚焦透镜用于将接收的激光聚焦后输出，改变所述第二反射镜和所述聚焦透镜相对于所述第一反射镜的位置，改变激光入射至所述纳米结构芯片上的入射角。
5.根据权利要求1所述的用于单分子动力学检测的纳米光学器件，其特征在于，所述纳米结构芯片包括依次设置的基底和金属薄膜，多个阵列设置的纳米孔穿过所述金属薄膜并延伸至所述基底预设深度。
6.根据权利要求5所述的用于单分子动力学检测的纳米光学器件，其特征在于，还包括：荧光聚焦增强元件，设置在所述纳米孔的回转轴线方向上，所述荧光聚焦增强元件设置在所述基底和所述金属薄膜之间。
7.根据权利要求6所述的用于单分子动力学检测的纳米光学器件，其特征在于，所述荧光聚焦增强元件包括反射镜或光学透镜，所述反射镜包括曲面反射镜、二元反射镜或斜面反射镜中的任一种，所述光学透镜包括透镜过渡层和透镜本体，所述透镜过渡层设置在所述透镜本体和所述纳米孔之间，所述透镜本体的折射率大于所述透镜过渡层和所述基底的折射率，所述透镜本体包括曲面光学透镜、二元光学透镜或斜面光学透镜中的任一种。
8.根据权利要求7所述的用于单分子动力学检测的纳米光学器件，其特征在于，所述曲面反射镜和/或所述曲面光学透镜的空间形状为采用抛物线截面、双曲线截面或标准圆曲线截面沿纳米孔轴线旋转而形成的回转体，所述曲面反射镜的高度范围为1μm至6μm，所述曲面光学透镜的高度范围为0.36μm至3μm。
9.根据权利要求7所述的用于单分子动力学检测的纳米光学器件，其特征在于，所述二元反射镜和/或所述二元光学透镜的空间形状为多级台阶轮廓截面旋转而形成的回转体，多级台阶的阶数为2阶、4阶、6阶或8阶，所述二元反射镜和/或所述二元光学透镜纵截面的轮廓拟合形状为抛物线、双曲线、标准圆曲线或直线，当轮廓拟合形状为直线时，所述直线与纳米孔轴线的夹角范围为5°至70°，所述二元反射镜顶面直径范围为1μm至4μm，所述二元反射镜的高度范围为1μm至6μm，所述二元光学透镜远离纳米孔一侧的端面的直径范围为0.5μm至7μm，所述二元光学透镜的高度范围为0.36μm至3μm。
10.根据权利要求7所述的用于单分子动力学检测的纳米光学器件，其特征在于，所述斜面反射镜和/或所述斜面光学透镜的空间形状为梯形轮廓截面旋转而形成的回转体，所述斜面反射镜和/或所述斜面光学透镜的纵截面与纳米孔轴线的夹角范围为5°至70°，所述斜面反射镜的顶面直径范围为1μm至4μm，所述斜面反射镜的高度范围为1μm至6μm，所述斜面光学透镜远离纳米孔一侧的端面的直径范围为0.5μm至7μm，所述斜面光学透镜的高度范围为0.36μm至3μm。
11.根据权利要求5所述的用于单分子动力学检测的纳米光学器件，其特征在于，还包括：钝化层、修饰层和连接层，所述钝化层设置在所述纳米孔的侧壁以及所述金属薄膜远离所述基底的表面，所述修饰层设置在所述纳米孔底部，所述修饰层用于控制所述纳米孔中所述连接层的位点数量；当纳米孔中加入待测溶液时，待测溶液中的锚定蛋白和连接层固定连接；当纳米孔中加入荧光标记的目标蛋白时，目标蛋白和锚定蛋白反应结合，并在激光的照射下进行解离。
12.根据权利要求5所述的用于单分子动力学检测的纳米光学器件，其特征在于，还包括：钝化层、磷脂修饰层和脂质体类生物膜，所述钝化层设置在所述纳米孔的侧壁以及所述金属薄膜远离所述基底的表面，所述磷脂修饰层设置在所述纳米孔底部，所述磷脂修饰层用于固定所述脂质体类生物膜；当纳米孔中加入待测溶液时，待测溶液中的膜蛋白和脂质体类生物膜固定连接；当纳米孔中加入荧光标记的目标蛋白时，目标蛋白和膜蛋白反应结合，并在激光的照射下进行解离。
13.根据权利要求3所述的用于单分子动力学检测的纳米光学器件，其特征在于，还包括：处理器，所述处理器接收所述相机转发的荧光信号，提取所述荧光信号中的上升沿或者下降沿之间的时间间隔，对所述时间间隔进行统计拟合，得到包含结合时间常数或解离时间常数的曲线。
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- 2023-07-24 CN CN202310906330.6A patent/CN116626011B/zh active Active
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| CN116626011B (zh) | 2023-10-03 |
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