CN116790736A - 一种利用单一荧光标签的dna测序方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种利用单一荧光标签的DNA测序方法，属于分子生物学技术领域。本发明提供了一种利用单一荧光标签的DNA测序方法，先使用一种荧光标签标记四种含有不同碱基的dNTP分子，并通过控制四种含有不同碱基的dNTP分子在同一DNA测序反应体系中的浓度、机械力、相对分子质量、温度、酶催化、电、声和/或光，调节其在同一DNA测序反应体系中的扩散速率，以调控其参与DNA聚合反应的速率，使其表现出反应速率常数差异，再根据反应速率常数差异，识别出四种碱基，获得待测序DNA链的基因序列。所述DNA测序方法只需要一路激发‑探测光路，不依赖复杂光路系统，这将减小测序设备中光路系统的复杂性。
Description
技术领域
本发明涉及一种利用单一荧光标签的DNA测序方法，属于分子生物学技术领域。
背景技术
荧光标签标记的单分子检测技术可以实现单分子检测，在DNA测序、蛋白相互作用、生物膜作用机制等领域获得了广泛应用。对于DNA测序，通常需要采用至少两种不同发光特性的荧光染料对四种dNTP进行标记，才能实现对基因序列中四种碱基信息的解析。而这需要十分复杂和昂贵的光路系统。
例如，如果使用两种或者两种以上的荧光标签，一般则需要配备两路或者两路以上具有不同的光谱特性的光路模块，完成光信号的激发、引导和采集功能。如果仅采用一种发射光谱的荧光标签就能对基因序列进行解析，将会极大地减小检测设备系统的复杂性。目前，如何使用一种荧光标签对基因序列的四种碱基进行识别是一项极为艰巨的挑战。鉴于此，需要发明一种不依赖复杂光路系统的DNA测序方法。
发明内容
为解决上述问题，本发明提供了一种利用单一荧光标签的DNA测序方法，所述DNA测序方法包括：使用一种荧光标签标记四种含有不同碱基的dNTP分子，并通过控制四种含有不同碱基的dNTP分子在同一DNA测序反应体系中的浓度、机械力、相对分子质量、温度、酶催化、电、声和/或光，调节经一种荧光标签标记的四种含有不同碱基的dNTP分子在同一DNA测序反应体系中的扩散速率，以调控其参与DNA聚合反应的速率，使其表现出反应速率常数差异；根据反应速率常数差异，识别出四种碱基，获得待测序DNA链的基因序列。
在本发明的一种实施方式中，所述DNA测序方法包括：使用一种荧光标签标记四种含有不同碱基的dNTP分子，以四种含有不同碱基的dNTP分子在同一DNA测序反应体系中的浓度、机械力、相对分子质量、温度、酶催化、电、声和/或光作为唯一自变量，通过控制四种含有不同碱基的dNTP分子在同一DNA测序反应体系中的浓度、机械力、相对分子质量、温度、酶催化、电、声和/或光，调节经一种荧光标签标记的四种含有不同碱基的dNTP分子在同一DNA测序反应体系中的扩散速率，以调控其参与DNA聚合反应的速率，使其表现出反应速率常数差异；根据反应速率常数差异，识别出四种碱基，获得待测序DNA链的基因序列。
在本发明的一种实施方式中，所述DNA测序方法以相对分子质量或摩尔浓度作为唯一自变量；
以相对分子质量作为唯一自变量时，所述DNA测序方法包括：使用一种荧光标签标记四种含有不同碱基的dNTP分子，并通过在四种含有不同碱基的dNTP分子上修饰有数目不等的有机基团，使其形成相对分子质量不同的dNTP分子，进而调节经一种荧光标签标记的四种含有不同碱基的dNTP分子在同一DNA测序反应体系中的扩散速率，以调控其参与DNA聚合反应的速率，使其表现出反应速率常数差异；根据反应速率常数差异，识别出四种碱基，获得待测序DNA链的基因序列；
以摩尔浓度作为唯一自变量时，所述DNA测序方法包括：使用一种荧光标签标记四种含有不同碱基的dNTP分子，并通过控制四种含有不同碱基的dNTP分子在DNA测序反应体系中的摩尔浓度，使得四种含有不同碱基的dNTP分子与待测序DNA链之间发生结合反应的几率不同，进而调节经一种荧光标签标记的四种含有不同碱基的dNTP分子在同一DNA测序反应体系中的扩散速率，以调控其参与DNA聚合反应的速率，使其表现出反应速率常数差异；根据反应速率常数差异，识别出四种碱基，获得待测序DNA链的基因序列。
在本发明的一种实施方式中，所述四种含有不同碱基的dNTP分子分别为dATP、dTTP、dCTP和dGTP。
在本发明的一种实施方式中，以相对分子质量作为唯一自变量时，所述DNA测序方法中，四种含有不同碱基的dNTP分子被有机基团修饰后，具有的相对分子质量比值为1:5~100:25~10000:125~1000000。
在本发明的一种实施方式中，以相对分子质量作为唯一自变量时，所述DNA测序方法中，四种含有不同碱基的dNTP分子被有机基团修饰后，具有的相对分子质量比值为1:5:25:125、1:10:100:1000、1:50:2500:125000或1:100:10000:1000000。
在本发明的一种实施方式中，以摩尔浓度作为唯一自变量时，所述DNA测序方法中，四种含有不同碱基的dNTP分子在DNA测序反应体系中的摩尔浓度比为1:3~10:9~100:27~1000。
在本发明的一种实施方式中，以摩尔浓度作为唯一自变量时，所述DNA测序方法中，四种含有不同碱基的dNTP分子在DNA测序反应体系中的摩尔浓度比为1:3:9:27、1:4:16:64、1:5:25:125或1:10:100:1000。
在本发明的一种实施方式中，以相对分子质量作为唯一自变量时，所述DNA测序方法包括如下步骤：
步骤一：对四种含有不同碱基的dNTP分子（dATP、dTTP、dCTP和dGTP）中的任意三种进行有机基团修饰，得到相对分子质量不同的四种dNTP分子，将相对分子质量不同的四种dNTP分子分别记为m-dATP、m-dTTP、m-dCTP和m-dGTP；
步骤二：使用同一种荧光标签对步骤一得到的相对分子质量不同的四种dNTP分子进行标记，得到相对分子质量不同且经荧光标签标记的四种dNTP分子，将相对分子质量不同且经荧光标签标记的四种dNTP分子分别记为fm-dATP、fm-dTTP、fm-dCTP和fm-dGTP；
步骤三：在DNA测序反应体系中，加入fm-dATP、m-dTTP、m-dCTP和m-dGTP，使DNA聚合反应发生，DNA聚合反应期间，记录荧光信号强度随时间的波动信息，得到荧光信号强度波动曲线；对记录得到的荧光信号强度波动信息进行分析，获得荧光信号脉冲（荧光信号脉冲是指荧光信号强度波动曲线的峰，对记录得到的荧光信号强度波动进行寻峰，即可识别出脉冲）；对荧光信号脉冲进行停留时间分析，获得碱基A对应的等待时间直方图以及dATP分子的反应速率模型曲线KA；
步骤四：在步骤三的DNA测序反应体系中，将dNTP是否含有荧光标记作为唯一自变量，重复步骤三，分别获得碱基T、C、G对应的等待时间直方图以及dNTP的反应速率模型曲线KT、KC、KG（例如，在DNA测序反应体系中，加入m-dATP、fm-dTTP、m-dCTP和m-dGTP，使DNA聚合反应发生，DNA聚合反应期间，记录荧光信号强度随时间的波动信息，得到荧光信号强度波动曲线；对记录得到的荧光信号强度波动信息进行分析，获得荧光信号脉冲；荧光信号脉冲进行停留时间分析，获得碱基T对应的等待时间直方图以及dTTP分子的反应速率模型曲线KT）；
步骤五：以步骤三和步骤四获得的四种碱基对应的反应速率模型曲线作为模板，对反应速率模型曲线中体现的荧光信号脉冲信息进行解析，识别出四种碱基，获得待测序DNA链的基因序列；
以摩尔浓度作为唯一自变量时，所述DNA测序方法包括如下步骤：
步骤一：将四种含有不同碱基的dNTP分子（dATP、dTTP、dCTP和dGTP）分别记为m-dATP、m-dTTP、m-dCTP和m-dGTP；使用同一种荧光标签对四种dNTP分子进行标记，得到经荧光标签标记的四种dNTP分子，将经荧光标签标记的四种dNTP分子分别记为fm-dATP、fm-dTTP、fm-dCTP和fm-dGTP；
步骤二：在DNA测序反应体系中，加入fm-dATP、m-dTTP、m-dCTP和m-dGTP，并控制fm-dATP、m-dTTP、m-dCTP和m-dGTP在DNA测序反应体系中的摩尔浓度不同，使DNA聚合反应发生，DNA聚合反应期间，记录荧光信号强度随时间的波动信息，得到荧光信号强度波动曲线；对记录得到的荧光信号强度波动信息进行分析，获得荧光信号脉冲（荧光信号脉冲是指荧光信号强度波动曲线的峰，对记录得到的荧光信号强度波动进行寻峰，即可识别出脉冲）；对荧光信号脉冲进行停留时间分析，获得碱基A对应的等待时间直方图以及dATP分子的反应速率模型曲线KA；
步骤三：在步骤二的DNA测序反应体系中，将dNTP是否含有荧光标记作为唯一自变量，重复步骤二，分别获得碱基T、C、G对应dNTP的反应速率模型曲线KT、KC、KG（例如，在DNA测序反应体系中，加入m-dATP、fm-dTTP、m-dCTP和m-dGTP，并控制m-dATP、fm-dTTP、m-dCTP和m-dGTP在DNA测序反应体系中的摩尔浓度不同，使DNA聚合反应发生，DNA聚合反应期间，记录荧光信号强度随时间的波动信息，得到荧光信号强度波动曲线；对记录得到的荧光信号强度波动信息进行分析，获得荧光信号脉冲；荧光信号脉冲进行停留时间分析，获得碱基T对应的等待时间直方图以及dTTP分子的反应速率模型曲线KT）；
步骤四：以步骤二和步骤三获得的四种碱基对应的反应速率模型曲线作为模板，对反应速率模型曲线中体现的荧光信号脉冲信息进行解析，识别出四种碱基，获得待测序DNA链的基因序列。
在本发明的一种实施方式中，将dNTP分子与DNA分子结合作用的反应速率常数定义为结合时间常数Kc，将dNTP分子与DNA分子解离作用的反应速率常数定义为解离时间常数Kd。DNA测序时可以使用结合时间常数或/和解离时间常数。
在本发明的一种实施方式中，以相对分子质量作为唯一自变量时，所述步骤三包括：在DNA测序反应体系中，加入fm-dATP、m-dTTP、m-dCTP和m-dGTP，使DNA聚合反应发生，DNA聚合反应期间，记录荧光信号强度随时间的波动信息，得到荧光信号强度波动曲线；对记录得到的荧光信号强度波动进行寻峰，得到荧光信号脉冲；结合荧光信号脉冲和荧光信号强度波动曲线，进行不同荧光信号脉冲之间的停留时间计算，并对整个时间历程的停留时间进行统计，获得碱基A对应的等待时间直方图；对等待时间直方图进行指数曲线拟合，获得碱基A对应的含有结合时间常数Kc或解离时间常数Kd的反应速率模型曲线KA；
以摩尔浓度作为唯一自变量时，所述步骤二包括：在DNA测序反应体系中，加入m-dATP、fm-dTTP、m-dCTP和m-dGTP，并控制m-dATP、fm-dTTP、m-dCTP和m-dGTP在DNA测序反应体系中的摩尔浓度不同，使DNA聚合反应发生，DNA聚合反应期间，记录荧光信号强度随时间的波动信息，得到荧光信号强度波动曲线；对记录得到的荧光信号强度波动进行寻峰，得到荧光信号脉冲；结合荧光信号脉冲和荧光信号强度波动曲线，进行不同荧光信号脉冲之间的停留时间计算，并对整个时间历程的停留时间进行统计，获得碱基A对应的等待时间直方图；对等待时间直方图进行指数曲线拟合，获得碱基A对应的含有结合时间常数Kc或解离时间常数Kd的反应速率模型曲线KA。
在本发明的一种实施方式中，以相对分子质量作为唯一自变量时，所述步骤三和步骤四中，使用检测光路系统记录荧光信号强度随时间的波动信息；
以摩尔浓度作为唯一自变量时，所述步骤二和步骤三中，使用检测光路系统记录荧光信号强度随时间的波动信息。
在本发明的一种实施方式中，所述检测光路系统包括零模波导芯片、激光、物镜、二向色镜、激光器和相机，其中，激光器提供的入射激光经二向色镜折射后，经物镜照射到零模波导芯片底部，并在零模波导芯片的纳米孔中形成空间受限的有效激发体积。
在本发明的一种实施方式中，所述检测光路系统由零模波导芯片、激光、物镜、二向色镜、激光器和相机组成。
在本发明的一种实施方式中，所述零模波导芯片设置有基底、金属薄膜和纳米孔，其中，基底和金属薄膜相贴，纳米孔贯穿金属薄膜并延伸至基底。
在本发明的一种实施方式中，所述纳米孔的直径为50~200nm；所述金属薄膜的厚度为50~200nm；所述基底的材料包括单一的熔融石英、普通玻璃、碳化硅和/或氮化硅；金属薄膜的材料包括金属、金属氧化物、金属的堆叠组合物、金属氧化物的堆叠组合物和/或金属与金属氧化物的堆叠组合物，所述金属包括金、铝、氧化铝、铬和/或钛；所述纳米孔延伸至基底的部分深度为10~20nm；所述纳米孔结构的水平截面形状为圆形、椭圆形或四边形。
在本发明的一种实施方式中，所述零模波导芯片上的纳米孔结构设置成阵列，其中，一张零模波导芯片上纳米孔的数量为100~10000000个，阵列周期间距为2~100μm（阵列周期间距是指相邻两个纳米孔之间的间距）。
在本发明的一种实施方式中，一张零模波导芯片上纳米孔的数量为100个、2500个、10000个、40000个、150000个或10000000个，阵列周期间距为2μm、3μm、5μm、10μm、15μm、20μm、50μm或100μm。
在本发明的一种实施方式中，所述纳米孔的侧壁和金属薄膜表面上均设置有防止非特异性吸附的钝化层；当金属薄膜的材料为金时，所述钝化层的材料为巯基-聚乙二醇（HS-PEG），当金属薄膜的材料为铝或氧化铝时，所述钝化层的材料为聚乙烯膦酸（PVPA）。
在本发明的一种实施方式中，所述纳米孔的底部（延伸至基底的一端为底部）设置有连接层；所述连接层材料为硅烷-聚乙二醇-生物素；所述连接层通过硅烷基团固定在孔底上；所述DNA聚合酶上面修饰有亲和素位点，并且，所述DNA聚合酶通过亲和素-生物素作用与连接层固定，进而固定在纳米孔底部；在纳米孔中加入待测序DNA链和荧光标记的dNTP分子，进行dNTP分子与DNA分子结合和/或解离作用的动力学检测和测序分析。
在本发明的一种实施方式中，所述纳米孔的底部设置有控制连接层的位点数量的修饰层；所述修饰层材料为聚乙二醇衍生物（mPEG）。
在本发明的一种实施方式中，所述相机为具有单分子荧光探测能力的EMCCD工业相机；相机最小曝光时间不大于20ms；相机与计算机通过数据传输线连接；通过计算机上的程序控制相机实现信号采集，并通过数据传输线经数据实时传输至计算机的存储单元中进行保存记录；通过计算机的软件对所记录的荧光信号脉冲进行分析计算，从而解析零模波导芯片的纳米孔中的DNA测序信息。
本发明提供了一种检测光路系统，包括零模波导芯片、激光、荧光、物镜、二向色镜、激光器和相机，其中，激光器提供的入射激光经二向色镜折射后，经物镜照射到零模波导芯片底部，并在零模波导芯片的纳米孔中形成空间受限的有效激发体积。
在本发明的一种实施方式中，所述检测光路系统由零模波导芯片、激光、荧光、物镜、二向色镜、激光器和相机组成。
在本发明的一种实施方式中，所述零模波导芯片设置有基底、金属薄膜和纳米孔，其中，基底和金属薄膜相贴，纳米孔贯穿金属薄膜并延伸至基底。
在本发明的一种实施方式中，所述纳米孔的直径为50~200nm；所述金属薄膜的厚度为50~200nm；所述基底的材料包括单一的熔融石英、普通玻璃、碳化硅和/或氮化硅；金属薄膜的材料包括金属、金属氧化物、金属的堆叠组合物、金属氧化物的堆叠组合物和/或金属与金属氧化物的堆叠组合物，所述金属包括金、铝、氧化铝、铬和/或钛；所述纳米孔延伸至基底的部分深度为10~20nm；所述纳米孔结构的水平截面形状为圆形、椭圆形或四边形。
在本发明的一种实施方式中，所述零模波导芯片上的纳米孔结构设置成阵列，其中，一张零模波导芯片上纳米孔的数量为100~10000000个，阵列周期间距为2~100μm（阵列周期间距是指相邻两个纳米孔之间的间距）。
在本发明的一种实施方式中，一张零模波导芯片上纳米孔的数量为100个、2500个、10000个、40000个、150000个或10000000个，阵列周期间距为2μm、3μm、5μm、10μm、15μm、20μm、50μm或100μm。
在本发明的一种实施方式中，所述纳米孔的侧壁和金属薄膜表面上均设置有防止非特异性吸附的钝化层；当金属薄膜的材料为金时，所述钝化层的材料为巯基-聚乙二醇（HS-PEG），当金属薄膜的材料为铝或氧化铝时，所述钝化层的材料为聚乙烯膦酸（PVPA）。
在本发明的一种实施方式中，所述纳米孔的底部（延伸至基底的一端为底部）设置有连接层；所述连接层材料为硅烷-聚乙二醇-生物素；所述连接层通过硅烷基团固定在孔底上；所述DNA聚合酶上面修饰有亲和素位点，并且，所述DNA聚合酶通过亲和素-生物素作用与连接层固定，进而固定在纳米孔底部；在纳米孔中加入待测序DNA链和荧光标记的dNTP分子，进行dNTP分子与DNA分子结合和/或解离作用的动力学检测和测序分析。
在本发明的一种实施方式中，所述纳米孔的底部设置有控制连接层的位点数量的修饰层；所述修饰层材料为聚乙二醇衍生物（mPEG）。
在本发明的一种实施方式中，所述相机为具有单分子荧光探测能力的EMCCD工业相机；相机最小曝光时间不大于20ms；相机与计算机通过数据传输线连接；通过计算机上的程序控制相机实现信号采集，并通过数据传输线经数据实时传输至计算机的存储单元中进行保存记录；通过计算机的软件对所记录的荧光信号脉冲进行分析计算，从而解析零模波导芯片的纳米孔中的DNA测序信息。
本发明还提供了上述DNA测序方法或上述检测光路系统在DNA测序中的应用，所述应用非疾病的诊断和治疗目的。
本发明技术方案，具有如下优点：
本发明提供了一种利用单一荧光标签的DNA测序方法，所述DNA测序方法先使用一种荧光标签标记四种含有不同碱基的dNTP分子，并通过控制四种含有不同碱基的dNTP分子在同一DNA测序反应体系中的浓度、机械力、相对分子质量、温度、酶催化、电、声和/或光，调节经一种荧光标签标记的四种含有不同碱基的dNTP分子在同一DNA测序反应体系中的扩散速率，以调控其参与DNA聚合反应的速率，使其表现出反应速率常数差异，再根据反应速率常数差异，识别出四种碱基，获得待测序DNA链的基因序列。所述DNA测序方法基于单一荧光标签和停留时间分析法实现DNA测序，只需要一路激发-探测光路，不依赖复杂光路系统，这将减小测序设备中光路系统的复杂性。
所述DNA测序方法使用检测光路系统记录荧光信号强度随时间的波动信息，所述检测光路系统包括零模波导芯片、激光、物镜、二向色镜、激光器和相机，其中，激光器提供的入射激光经二向色镜折射后照射零模波导芯片底部，并在零模波导芯片的纳米孔中形成空间受限的有效激发体积。零模波导具有极小的激发体积，能突破光学衍射极限，为DNA聚合反应的动力学检测提供高空间和时间分辨率。使用所述器件和停留时间分析法，可实现单一荧光标签对四种碱基的识别，最终完成DNA测序。单一荧光标签检测只需要一路激发-探测光路，这将减小测序设备中光路系统的复杂性。
附图说明
图1：零模波导的工作原理示意图。
图2：检测光路系统的组成示意图。
图3：零模波导阵列的示意图。
图4：纳米孔表面钝化及底部修饰处理的示意图。
图5：单分子反应动力学停留时间概念示意图。
图6：停留时间分析及等待时间直方图的示意图。图6中，停留时间定义为某个脉冲发生时刻与下一个脉冲发生时刻之间的时间间隔，或者某一个脉冲下降（off）时刻与下一个脉冲下降时刻之间的时间间隔。等待时间直方图为这些停留时间的统计表，可以据此拟合出含有反应常数的反应速率模型曲线，这代表的某种单分子在该反应体系下的反应速率。
图7：DNA测序的原理示意图。
图8：四种dNTP的相对分子质量调控的示意图。
图9：四种dNTP的相对分子质量调控和荧光标签标记的示意图。
图10：单一荧光标签的DNA测序信号及停留时间分析的示意图。图10中，实线表示荧光信号，虚线表示其他种类未标记荧光的dNTP分子理论上参与DNA聚合反应（结合）的时间轨迹。
图11：对单个dNTP进行反应速率测试的荧光脉冲信号的记录。图11中，纵轴代表荧光强度，横轴代表时间，单位时间内发生的脉冲之间的时间间隔代表停留时间（荧光标签标记的dNTP浓度越高，即荧光浓度越高，峰出现的频率越高）。
图12：测序荧光脉冲信号的记录。图12中，纵轴代表荧光强度，横轴代表时间。
图1~4和图7中，1零模波导芯片、11基底、111修饰层、112连接层、113 DNA聚合酶、114待测序DNA链、115 dNTP分子、12金属薄膜、121钝化层、13纳米孔、14溶液、15激发体积、2激光、3荧光、4物镜、5二向色镜、6激光器、7相机。
具体实施方式
提供下述实施例是为了更好地进一步理解本发明，并不局限于所述最佳实施方式，不对本发明的内容和保护范围构成限制，任何人在本发明的启示下或是将本发明与其他现有技术的特征进行组合而得出的任何与本发明相同或相近似的产品，均落在本发明的保护范围之内。
下述实施例中未注明具体实验步骤或条件者，按照本领域内的文献所描述的常规实验步骤的操作或条件即可进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规试剂产品。
实施例1：一种检测光路系统
如图1~4所示，本实施例提供了一种检测光路系统，所述检测光路系统由零模波导芯片1、激光2、物镜4、二向色镜5、激光器6和相机7组成，其中，激光器6提供的入射激光2经二向色镜5折射后，经物镜照射到零模波导芯片1底部，并在零模波导芯片1的纳米孔13中形成空间受限的有效激发体积15；
所述零模波导芯片1设置有基底11、金属薄膜12和纳米孔13，其中，基底11和金属薄膜12相贴，纳米孔13贯穿金属薄膜12并延伸至基底11，纳米孔13的直径为200nm，金属薄膜12的厚度为110nm，基底11的材料是单一的熔融石英，金属薄膜12的材料有两层，顺序自基底11向外依次是10nm厚度的钛和100nm厚度的金，纳米孔13延伸至基底的部分深度为10nm，纳米孔13结构的水平截面形状为圆形；
所述零模波导芯片1上的纳米孔13结构设置成阵列，其中，一张零模波导芯片1上纳米孔13阵列的数量为2500，阵列周期间距为2μm；
所述纳米孔13的侧壁和金属薄膜12表面上均设置有防止非特异性吸附的钝化层121，其中，钝化层材料为巯基-聚乙二醇（HS-PEG）；
所述纳米孔13的底部设置有连接层112，连接层112的材料为硅烷-聚乙二醇-生物素，连接层112通过硅烷基团固定在孔底上，DNA聚合酶113上面修饰有亲和素位点，DNA聚合酶113通过亲和素-生物素作用与连接层112固定，进而固定在纳米孔13底部（修饰方法参见文献：Kinz-Thompson CD, Palma M, Pulukkunat DK, Chenet D, Hone J, Wind SJ,Gonzalez RL Jr. Robustly passivated, gold nanoaperture arrays for single-molecule fluorescence microscopy. ACS Nano. 2013, 7(9):8158-66.）；在纳米孔13中加入待测序DNA链114和荧光标记的dNTP分子115（与待测序DNA链114结合后，dNTP分子上的荧光标签经激发光激发而产生能够被相机7探测的荧光3），进行dNTP分子115与待测序DNA链114结合和/或解离作用的动力学检测和测序分析；
所述纳米孔13的底部设置有控制连接层112的位点数量的修饰层111；所述修饰层材料为聚乙二醇衍生物（mPEG）；
所述相机7为具有单分子荧光探测能力的EMCCD工业相机；相机最小曝光时间不大于20ms；相机与计算机通过数据传输线连接；通过计算机上的程序控制相机实现信号采集，并通过数据传输线经数据实时传输至计算机的存储单元中进行保存记录；通过计算机的软件对所记录的荧光信号脉冲进行分析计算，从而解析零模波导芯片的纳米孔中的DNA测序信息。
所述检测光路系统的工作过程/工作原理如下：
激光器6发射的激光2经过二向色镜5反射后，经物镜4照射到零模波导芯片1的纳米孔13底部。激发光在纳米孔13底部形成倏逝场，使得激发体积15适合单分子荧光检测。纳米孔13内荧光标签发出的荧光3经物镜4引导，透过二向色镜5，进入相机7，形成荧光采集信号。其中，二向色镜具有波长选择性，只允许纳米孔13内荧光标签发出的荧光3穿过而进入相机，它阻挡零模波导芯片1反射的激发光2进入相机，避免其造成的干扰。
实施例2：一种利用单一荧光标签的DNA测序方法（基于相对分子质量）
如图5~10所示，本实施例提供了利用单一荧光标签的DNA测序方法，所述方法使用实施例1的检测光路系统，包括如下步骤：
步骤一：对四种含有不同碱基的dNTP分子（dATP、dTTP、dCTP和dGTP）中的任意三种进行有机基团修饰，得到相对分子质量不同的四种dNTP分子，将相对分子质量不同的四种dNTP分子分别记为m-dATP、m-dTTP、m-dCTP和m-dGTP；
步骤二：使用同一种荧光标签对步骤一得到的相对分子质量不同的四种dNTP分子进行标记，得到相对分子质量不同且经荧光标签标记的四种dNTP分子，将相对分子质量不同且经荧光标签标记的四种dNTP分子分别记为fm-dATP、fm-dTTP、fm-dCTP和fm-dGTP；
步骤三：在DNA测序反应体系中，加入fm-dATP、m-dTTP、m-dCTP和m-dGTP，使DNA聚合反应发生，DNA聚合反应期间，使用实施例1的检测光路系统记录荧光信号强度随时间的波动信息；对记录得到的荧光信号强度波动进行寻峰，得到荧光信号脉冲；结合荧光信号脉冲和荧光信号强度波动曲线，进行不同荧光信号脉冲之间的停留时间计算，并对整个时间历程的停留时间进行统计，获得碱基A对应的等待时间直方图；对等待时间直方图进行指数曲线拟合，获得碱基A对应的含有结合时间常数Kc或解离时间常数Kd的反应速率模型曲线KA（寻峰、停留时间计算、等待时间直方图绘制和指数曲线拟合使用Origin和MATLAB软件完成）；
步骤四：在步骤三的DNA测序反应体系中，将dNTP是否含有荧光标记作为唯一自变量，重复步骤三，分别获得碱基T、C、G对应dNTP的反应速率模型曲线KT、KC、KG（例如，在DNA测序反应体系中，加入m-dATP、fm-dTTP、m-dCTP和m-dGTP，使DNA聚合反应发生，DNA聚合反应期间，使用实施例1的检测光路系统记录荧光信号强度随时间的波动信息；对记录得到的荧光信号强度波动信息进行寻峰，得到荧光信号脉冲；结合荧光信号脉冲和荧光信号强度波动曲线，进行不同荧光信号脉冲之间的停留时间计算，并对整个时间历程的停留时间进行统计，获得碱基T对应的等待时间直方图；对等待时间直方图进行指数曲线拟合，获得碱基T对应的含有结合时间常数Kc或解离时间常数Kd的dTTP分子的反应速率模型曲线KT）；
步骤五：以步骤三和步骤四获得的四种碱基对应的反应速率模型曲线作为模板，对反应速率模型曲线中体现的荧光信号脉冲信息进行解析（解析过程为先把所有脉冲进行分类和组合，然后对比每种组合表现出的反应常数与步骤三和步骤四获得的结合时间常数Kc或解离时间常数Kd的相似度），识别出四种碱基，获得待测序DNA链的基因序列。
此方法中，将dNTP分子与DNA分子结合作用的反应速率常数定义为结合时间常数Kc，将dNTP分子与DNA分子解离作用的反应速率常数定义为解离时间常数Kd。DNA测序时可以使用结合时间常数或/和解离时间常数。
实施例3：一种利用单一荧光标签的DNA测序方法（基于摩尔浓度）
本实施例提供了利用单一荧光标签的DNA测序方法，所述方法使用实施例1的检测光路系统，包括如下步骤：
步骤一：将四种含有不同碱基的dNTP分子（dATP、dTTP、dCTP和dGTP）分别记为m-dATP、m-dTTP、m-dCTP和m-dGTP；使用同一种荧光标签对四种dNTP分子进行标记，得到经荧光标签标记的四种dNTP分子，将经荧光标签标记的四种dNTP分子分别记为fm-dATP、fm-dTTP、fm-dCTP和fm-dGTP；
步骤二：在DNA测序反应体系中，加入fm-dATP、m-dTTP、m-dCTP和m-dGTP至fm-dATP、m-dTTP、m-dCTP和m-dGTP的摩尔浓度比为1:10:100:1000，使DNA聚合反应发生，DNA聚合反应期间，使用实施例1的检测光路系统记录荧光信号强度随时间的波动信息；对记录得到的荧光信号强度波动进行寻峰，得到荧光信号脉冲；结合荧光信号脉冲和荧光信号强度波动曲线，进行不同荧光信号脉冲之间的停留时间计算，并对整个时间历程的停留时间进行统计，获得碱基A对应的等待时间直方图；对等待时间直方图进行指数曲线拟合，获得碱基A对应的含有结合时间常数Kc或解离时间常数Kd的反应速率模型曲线KA（寻峰、停留时间计算、等待时间直方图绘制和指数曲线拟合使用Origin和MATLAB软件完成）；
步骤三：在步骤三的DNA测序反应体系中，将dNTP是否含有荧光标记作为唯一自变量，重复步骤三，分别获得碱基T、C、G对应dNTP的反应速率模型曲线KT、KC、KG（例如，在DNA测序反应体系中，加入m-dATP、fm-dTTP、m-dCTP和m-dGTP至m-dATP、fm-dTTP、m-dCTP和m-dGTP的摩尔浓度比为1:10:100:1000，使DNA聚合反应发生，DNA聚合反应期间，使用实施例1的检测光路系统记录荧光信号强度随时间的波动信息；对记录得到的荧光信号强度波动信息进行寻峰，得到荧光信号脉冲；结合荧光信号脉冲和荧光信号强度波动曲线，进行不同荧光信号脉冲之间的停留时间计算，并对整个时间历程的停留时间进行统计，获得碱基T对应的等待时间直方图；对等待时间直方图进行指数曲线拟合，获得碱基T对应的含有结合时间常数Kc或解离时间常数Kd的dTTP分子的反应速率模型曲线KT）；
步骤四：以步骤三和步骤四获得的四种碱基对应的反应速率模型曲线作为模板，对反应速率模型曲线中体现的荧光信号脉冲信息进行解析（解析过程为先把所有脉冲进行分类和组合，然后对比每种组合表现出的反应常数与步骤三和步骤四获得的结合时间常数Kc或解离时间常数Kd的相似度），识别出四种碱基，获得待测序DNA链的基因序列。
此方法中，将dNTP分子与DNA分子结合作用的反应速率常数定义为结合时间常数Kc，将dNTP分子与DNA分子解离作用的反应速率常数定义为解离时间常数Kd。DNA测序时可以使用结合时间常数或/和解离时间常数。
实验例1：DNA测序方法的性能验证
使用实施例3的DNA测序方法对核苷酸序列如SEQ ID NO.1（5’-ACGACTCTGGCACCGACAAT-3’）所示的待测序DNA链进行检测（基于结合时间常数Kc）；
其中，步骤一和步骤二使用的材料及具体操作方法参见公开号为CN114574571A的专利申请文本；其中，荧光标签为Alexa Fluor 555；
步骤三的DNA测序过程为：将50μL浓度为0.2mM的模板（模板序列为5’-ACGACTCTGGCACCGACAATTCAGTCACGTCTAGATGCAGTCAGAT-3’，SEQ ID NO.2，模板的制备方法参见文献：Eid J, et al. Real-time DNA sequencing from single polymerase molecules.Science. 2009, 323(5910): 133-8.）添加至含0.01mM引物（引物序列5’-CTGACTGCATCTAGACGTGACTGA-3’，SEQ ID NO.3）的50μL 10×引物缓冲液（购自ECOTOPSCIENTIFIC）中，于60℃的退火温度下反应30秒，得到模板-引物二元复合物；将模板-引物二元复合物与10μL浓度为5U/μL的DNA聚合酶（EquiPhi29 DNA聚合酶，购自Thermo Fisher）混合后，在30°C下孵育30分钟，得到孵育产物；取100μL孵育产物放入含有0.15mg/mL二硫苏糖醇的50%（v/v）甘油中，得到混合物；在46μL混合物中加入2μL荧光稳定剂和2μL除氧试剂（荧光稳定剂和除氧试剂的配方参见文献：Aitken CE, Marshall RA, Puglisi JD. Anoxygen scavenging system for improvement of dye stability in single-moleculefluorescence experiments. Biophys J. 2008，94(5):1826-35.和Cordes T, VogelsangJ, Tinnefeld P. On the mechanism of Trolox as antiblinking and antibleachingreagent. J Am Chem Soc. 2009，131(14):5018-9.），得到DNA测序反应体系；在30μL DNA测序反应体系加入5μL fm-dATP（浓度1×10-4mM）、5μL m-dTTP（浓度1×10-3mM）、5μL m-dCTP（浓度1×10-2mM）和5μL m-dGTP（浓度1×10-1mM），使DNA聚合反应发生。
测序结果见图11~12。由图11可知，在相同的反应体系中，四种dNTP浓度比为1:10:100:1000时，他们表现出停留时间和反应速率的差异。由图12（图示横轴时间序列从左到右为倒序，对应待测序列SEQ ID NO.1的5’端到3’端）可知，对四种dNTP进行反应结合常数统计，利用上述获得的反应结合常数，对测序荧光脉冲信号进行识别，初步识别出了所使用待测核酸的序列。可见，使用实施例2的DNA测序方法能够在使用单一荧光标签的基础上，仅使用一路激发-探测光路，就实现DNA测序，不依赖复杂光路系统，这将减小测序设备中光路系统的复杂性。
显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。
Claims (10)
1.一种利用单一荧光标签的DNA测序方法，其特征在于，所述DNA测序方法包括：使用一种荧光标签标记四种含有不同碱基的dNTP分子，并通过控制四种含有不同碱基的dNTP分子在同一DNA测序反应体系中的浓度、机械力、相对分子质量、温度、酶催化、电、声和/或光，调节经一种荧光标签标记的四种含有不同碱基的dNTP分子在同一DNA测序反应体系中的扩散速率，以调控其参与DNA聚合反应的速率，使其表现出反应速率常数差异；根据反应速率常数差异，识别出四种碱基，获得待测序DNA链的基因序列。
2.如权利要求1所述的DNA测序方法，其特征在于，所述DNA测序方法以相对分子质量或摩尔浓度作为唯一自变量；
以相对分子质量作为唯一自变量时，所述DNA测序方法包括：使用一种荧光标签标记四种含有不同碱基的dNTP分子，并通过在四种含有不同碱基的dNTP分子上修饰有数目不等的有机基团，使其形成相对分子质量不同的dNTP分子，进而调节经一种荧光标签标记的四种含有不同碱基的dNTP分子在同一DNA测序反应体系中的扩散速率，以调控其参与DNA聚合反应的速率，使其表现出反应速率常数差异；根据反应速率常数差异，识别出四种碱基，获得待测序DNA链的基因序列；
以摩尔浓度作为唯一自变量时，所述DNA测序方法包括：使用一种荧光标签标记四种含有不同碱基的dNTP分子，并通过控制四种含有不同碱基的dNTP分子在DNA测序反应体系中的摩尔浓度，使得四种含有不同碱基的dNTP分子与待测序DNA链之间发生结合反应的几率不同，进而调节经一种荧光标签标记的四种含有不同碱基的dNTP分子在同一DNA测序反应体系中的扩散速率，以调控其参与DNA聚合反应的速率，使其表现出反应速率常数差异；根据反应速率常数差异，识别出四种碱基，获得待测序DNA链的基因序列。
3.如权利要求2所述的DNA测序方法，其特征在于，以相对分子质量作为唯一自变量时，所述DNA测序方法中，四种含有不同碱基的dNTP分子被有机基团修饰后，具有的相对分子质量比值为1:5~100:25~10000:125~1000000；以摩尔浓度作为唯一自变量时，所述DNA测序方法中，四种含有不同碱基的dNTP分子在DNA测序反应体系中的摩尔浓度比为1:3~10:9~100:27~1000。
4.如权利要求1~3任一项所述的DNA测序方法，其特征在于，以相对分子质量作为唯一自变量时，所述DNA测序方法包括如下步骤：
步骤一：对四种含有不同碱基的dNTP分子中的任意三种进行有机基团修饰，得到相对分子质量不同的四种dNTP分子，将相对分子质量不同的四种dNTP分子分别记为m-dATP、m-dTTP、m-dCTP和m-dGTP；
步骤二：使用同一种荧光标签对步骤一得到的相对分子质量不同的四种dNTP分子进行标记，得到相对分子质量不同且经荧光标签标记的四种dNTP分子，将相对分子质量不同且经荧光标签标记的四种dNTP分子分别记为fm-dATP、fm-dTTP、fm-dCTP和fm-dGTP；
步骤三：在DNA测序反应体系中，加入fm-dATP、m-dTTP、m-dCTP和m-dGTP，使DNA聚合反应发生，DNA聚合反应期间，记录荧光信号强度随时间的波动信息，得到荧光信号强度波动曲线；对记录得到的荧光信号强度波动信息进行分析，获得荧光信号脉冲；对荧光信号脉冲进行停留时间分析，获得碱基A对应的等待时间直方图以及dATP分子的反应速率模型曲线KA；
步骤四：在步骤三的DNA测序反应体系中，将dNTP是否含有荧光标记作为唯一自变量，重复步骤三，分别获得碱基T、C、G对应的等待时间直方图以及dNTP的反应速率模型曲线KT、KC、KG；
步骤五：以步骤三和步骤四获得的四种碱基对应的反应速率模型曲线作为模板，对反应速率模型曲线中体现的荧光信号脉冲信息进行解析，识别出四种碱基，获得待测序DNA链的基因序列；
以摩尔浓度作为唯一自变量时，所述DNA测序方法包括如下步骤：
步骤一：将四种含有不同碱基的dNTP分子分别记为m-dATP、m-dTTP、m-dCTP和m-dGTP；使用同一种荧光标签对四种dNTP分子进行标记，得到经荧光标签标记的四种dNTP分子，将经荧光标签标记的四种dNTP分子分别记为fm-dATP、fm-dTTP、fm-dCTP和fm-dGTP；
步骤二：在DNA测序反应体系中，加入fm-dATP、m-dTTP、m-dCTP和m-dGTP，并控制fm-dATP、m-dTTP、m-dCTP和m-dGTP在DNA测序反应体系中的摩尔浓度不同，使DNA聚合反应发生，DNA聚合反应期间，记录荧光信号强度随时间的波动信息，得到荧光信号强度波动曲线；对记录得到的荧光信号强度波动信息进行分析，获得荧光信号脉冲；对荧光信号脉冲进行停留时间分析，获得碱基A对应的等待时间直方图以及dATP分子的反应速率模型曲线KA；
步骤三：在步骤二的DNA测序反应体系中，将dNTP是否含有荧光标记作为唯一自变量，重复步骤二，分别获得碱基T、C、G对应dNTP的反应速率模型曲线KT、KC、KG；
步骤四：以步骤二和步骤三获得的四种碱基对应的反应速率模型曲线作为模板，对反应速率模型曲线中体现的荧光信号脉冲信息进行解析，识别出四种碱基，获得待测序DNA链的基因序列。
5.如权利要求4所述的DNA测序方法，其特征在于，以相对分子质量作为唯一自变量时，所述步骤三包括：在DNA测序反应体系中，加入fm-dATP、m-dTTP、m-dCTP和m-dGTP，使DNA聚合反应发生，DNA聚合反应期间，记录荧光信号强度随时间的波动信息，得到荧光信号强度波动曲线；对记录得到的荧光信号强度波动进行寻峰，得到荧光信号脉冲；结合荧光信号脉冲和荧光信号强度波动曲线，进行不同荧光信号脉冲之间的停留时间计算，并对整个时间历程的停留时间进行统计，获得碱基A对应的等待时间直方图；对等待时间直方图进行指数曲线拟合，获得碱基A对应的含有结合时间常数Kc或解离时间常数Kd的反应速率模型曲线KA；
以摩尔浓度作为唯一自变量时，所述步骤二包括：在DNA测序反应体系中，加入fm-dATP、m-dTTP、m-dCTP和m-dGTP，并控制fm-dATP、m-dTTP、m-dCTP和m-dGTP在DNA测序反应体系中的摩尔浓度不同，使DNA聚合反应发生，DNA聚合反应期间，记录荧光信号强度随时间的波动信息，得到荧光信号强度波动曲线；对记录得到的荧光信号强度波动进行寻峰，得到荧光信号脉冲；结合荧光信号脉冲和荧光信号强度波动曲线，进行不同荧光信号脉冲之间的停留时间计算，并对整个时间历程的停留时间进行统计，获得碱基A对应的等待时间直方图；对等待时间直方图进行指数曲线拟合，获得碱基A对应的含有结合时间常数Kc或解离时间常数Kd的反应速率模型曲线KA。
6.如权利要求4所述的DNA测序方法，其特征在于，以相对分子质量作为唯一自变量时，所述步骤三和步骤四中，使用检测光路系统记录荧光信号强度随时间的波动信息；
以摩尔浓度作为唯一自变量时，所述步骤二和步骤三中，使用检测光路系统记录荧光信号强度随时间的波动信息。
7.如权利要求6所述的DNA测序方法，其特征在于，所述检测光路系统包括零模波导芯片、激光、物镜、二向色镜、激光器和相机，其中，激光器提供的入射激光经二向色镜折射后，经物镜照射到零模波导芯片底部，并在零模波导芯片的纳米孔中形成空间受限的有效激发体积。
8.如权利要求7所述的DNA测序方法，其特征在于，所述零模波导芯片设置有基底、金属薄膜和纳米孔，其中，基底和金属薄膜相贴，纳米孔贯穿金属薄膜并延伸至基底。
9.一种检测光路系统，其特征在于，所述检测光路系统包括零模波导芯片、激光、荧光、物镜、二向色镜、激光器和相机，其中，激光器提供的入射激光经二向色镜折射后，经物镜照射到零模波导芯片底部，并在零模波导芯片的纳米孔中形成空间受限的有效激发体积。
10.权利要求1~8任一项所述的DNA测序方法或权利要求9所述的检测光路系统在DNA测序中的应用。
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| CN116626011A (zh) * | 2023-07-24 | 2023-08-22 | 中国科学院苏州生物医学工程技术研究所 | 一种用于单分子动力学检测的纳米光学器件 |
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2023
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