CN114965390A - 一种对非切片标本新生骨组织进行检测及分析的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种对非切片标本新生骨组织进行检测及分析的方法，属于骨组织工程技术领域。该方法利用高分辨在体双光子激光扫描显微成像系统对标本新生骨组织中的Ⅰ型胶原、荧光标记的矿化结构进行荧光扫描检测得到骨基质图像；采用包括x轴、y轴和z轴三个互相垂直的轴的三维扫描方式，利用所述高分辨在体双光子激光扫描显微成像系统对新生骨组织样品进行全层扫描，通过扫描得到的荧光图像对新生骨组织进行定量分析。本发明方法解决了硬组织切片用于新生骨检测造成的骨组织标本浪费、新生骨组织显示不全面、标记定位不确定及定量不准确问题。该方法操作简单，定量数据可靠，能够全面反应新生骨的情况。
Description
技术领域
本发明属于骨组织工程技术领域，具体涉及一种对非切片标本新生骨组织进行检测及分析的方法。
背景技术
新生骨组织的评估是骨修复研究中关注的重点，骨组织是由骨细胞和周围的骨基质构成，骨基质包含Ⅰ型胶原和周围的矿化结构。胶原具有自发荧光的特性，同时周围的矿化结构也可以通过荧光物质与钙离子络合来实现荧光标记。目前新生骨检测的主要办法就是对动物生前进行荧光物质标记，然后将其处死，取标本，并制作硬组织切片在荧光显微镜或者激光共聚焦显微镜下观察(Tissue engineering Part B:Reviews,2010,16，209-217.)，然后根据荧光的定量或者不同荧光之间的距离来评估新骨生成的速度(Frontiersin Bioengineering and Biotechnology,2020,8.)，(RSC Advances.2020，10，25652-25661.)。
目前评估新生骨组织的方法需要将标本浸塑制作为硬组织切片，操作繁琐，且标本无法进行其他生物学检测，造成骨组织标本和资源的浪费；且现有方法只关注新生骨骨基质中的矿化结构，无法全面显示骨基质中的Ⅰ型胶原，更无法将二者结合在一起进行显像；同时标记的新生骨矿化结构位置具有不确定性，所以某一个层面的切片不一定有激发荧光产生，容易遗漏或误判；此外，尽管针对切片标记的新生骨也有一些定量分析的办法，但是其得到的数据只能代表一个层面的情况，并不能代表新生骨的全貌，无法对新生骨进行准确的量化评估。现有技术提供了一种对新生骨组织进行分析的方法，是将骨组织样品进行切片，再进行染色处理，然后才能在双光子共聚焦显微镜下进行观察骨的形态，但其操作繁琐，仍需要进行切片。
发明内容
为了克服上述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种对非切片标本新生骨组织进行检测及分析的方法，为了解决硬组织需要切片，用于新生骨检测造成的骨组织标本浪费，新生骨组织显示不全面、标记定位不确定及定量不准确问题。
为了达到上述目的，本发明采用以下技术方案予以实现：
本发明公开了一种对非切片标本新生骨组织进行检测及分析的方法，包括以下步骤：
1)结合胶原二次谐波成像和所标记矿化结构的荧光物质激发光波长，利用高分辨在体双光子激光扫描显微成像系统对非切片标本新生骨组织中的Ⅰ型胶原及矿化结构进行荧光扫描检测，得到胶原及矿化结构的荧光激发条件；
其中，所标记矿化结构的荧光物质为钙黄绿素和茜素红，钙黄绿素标记的矿化组织吸收波长为503-555nm，茜素红标记的矿化物吸收波长为578-634nm；
2)在胶原及矿化结构的荧光激发条件下，采用包括x轴、y轴和z轴三个互相垂直的轴的三维扫描方式，利用高分辨在体双光子激光扫描显微成像系统对非切片标本新生骨组织样品进行全层扫描，获取N个子层的胶原及矿化结构的荧光图像；
3)利用所述N个子层的胶原及矿化结构的荧光图像，重建骨组织样品中骨基质的三维图像；
4)根据所述步骤3)中重建的胶原及矿化结构的三维图像，得到所述非切片标本新生骨组织样品中骨基质的形态结构，从而完成对非切片标本新生骨组织样品的定性和定量分析。
优选地，步骤1)中，进行荧光扫描检测前，将颅骨缺损标本进行表面处理和修整，保证成像效果，然后将其置于载玻片上，得到非切片标本新生骨组织，用于观察成像；
其中，表面处理和修整为将表面肌肉、骨膜等软组织全部剔除，同时修剪标本周围骨组织，确保新生骨部位在同一水平面。
优选地，用生物胶或者胶布将处理好的标本固定于载玻片上，在缺损区域滴1滴PBS，将合适大小的盖玻片置于缺损上方，然后置于载物台上进行观察成像。
优选地，步骤1)中，所述胶原及矿化结构的荧光激发条件为：激发光波长940nm。
优选地，步骤1)中，胶原二次谐波成像吸收波长为465-475nm。
优选地，步骤2)中，所述全层扫描是指：将圆形缺损x轴、y轴方向所固定的平面，在z轴方向上的N个子层进行扫描，N为大于5的整数，在对每个子层进行扫描的过程中，激发所述新生骨组织样品中每个子层的胶原及矿化结构产生荧光，从而获取N个子层的胶原及矿化结构的荧光图像。
优选地，步骤3)中，所述N个子层的胶原及矿化结构的荧光图像重建处理为：将扫描得到的N个子层的胶原或矿化结构图片使用软件分别得到胶原或矿化结构荧光三维图像，然后对胶原或者矿化组织的荧光进行定量，得到的数值即为该非切片标本中胶原或矿化组织的定量参数。
优选地，所述软件为leica Application Suite X软件或Image J软件。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明公开了一种对非切片标本新生骨组织进行检测及分析的方法，利用高分辨在体双光子激光扫描显微成像系统对非切片标本新生骨组织中的Ⅰ型胶原及矿化结构进行荧光扫描检测，与硬组织切片荧光显微镜扫描得到的图像相比，该方法不仅可以显示荧光标记的矿化组织，而且可以全方位的显示胶原，使新生骨组织的成像更加全面；采用包括x轴、y轴和z轴三个互相垂直的轴的三维扫描方式，利用高分辨在体双光子激光扫描显微成像系统对非切片标本新生骨组织样品进行全层扫描，与硬组织切片荧光显微镜扫描方法相比，该方法可以实现x、y及z轴全方位的扫描，能够准确定位荧光标记的新生骨组织，同时对新生骨组织的生成量和生成速度定量更加精确；此外，与硬组织切片方法相比，本发明采用非切片标本，操作简单，且标本可以进行其他生物学检测，不会造成骨组织标本的浪费。
进一步地，胶原及矿化结构的荧光激发光波长为940nm，在该激发波长下，胶原和矿化组织均可以得到清晰的发射波图像。
附图说明
图1为本发明用于高分辨在体双光子激光扫描显微成像系统标本的固定图；
图2为本发明使用高分辨在体双光子激光扫描显微成像系统对标本在某XY平面的二维成像，其中，(a)胶原图片，(b)钙黄绿素标记的矿化结构，(c)茜素红标记的矿化结构，(d)三者的merge图；
图3为本发明使用leica Application Suite X软件对高分辨在体双光子激光扫描显微成像系统所成像序列图进行重建得到的三维图像；其中，(a)胶原，(b)钙黄绿素标记的矿化结构，(c)茜素红标记的矿化结构；
图4为本发明的成像操作和成像效果的示意图。
具体实施方式
为了使本技术领域的人员更好地理解本发明方案，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分的实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都应当属于本发明保护的范围。
需要说明的是，本发明的说明书和权利要求书及上述附图中的术语“第一”、“第二”等是用于区别类似的对象，而不必用于描述特定的顺序或先后次序。应该理解这样使用的数据在适当情况下可以互换，以便这里描述的本发明的实施例能够以除了在这里图示或描述的那些以外的顺序实施。此外，术语“包括”和“具有”以及他们的任何变形，意图在于覆盖不排他的包含，例如，包含了一系列步骤或单元的过程、方法、系统、产品或设备不必限于清楚地列出的那些步骤或单元，而是可包括没有清楚地列出的或对于这些过程、方法、产品或设备固有的其它步骤或单元。
大、小鼠的颅骨缺损模型是评估骨再生最常用的动物模型，所以本发明涉及的非切片标本新生骨组织均来自大鼠或小鼠的颅骨缺损模型，所研究小鼠的颅骨域及大鼠颅骨造模区域，其厚度均小于1000μm，符合二次谐波成像深度及成像条件，而且其周围没有其他组织结构干扰。
本发明提供了一种对非切片标本新生骨组织进行检测及分析的方法，包括以下步骤：
步骤a、将大鼠或小鼠的颅骨缺损标本进行表面处理和修整，将表面肌肉、骨膜等软组织全部剔除，同时修剪标本周围骨组织，确保新生骨部位尽量在同一水平面，保证成像效果，然后将其置于载玻片上用于观察成像；具体处理方式为，用生物胶或者胶布将处理好的标本固定于载玻片上，将缺损区域滴1滴PBS，然后将合适大小的盖玻片置于缺损上方，然后置于载物台进行观察，标本的固定图参见图1；
步骤b、结合胶原二次谐波成像和所标记荧光物质的激发光波长，利用高分辨在体双光子激光扫描显微成像系统对非切片标本新生骨组织中的Ⅰ型胶原及矿化结构进行荧光扫描实验，具体为：激发光统一从1000nm开始逐渐递减，然后采集胶原二次谐波信号及矿化组织的发射波，二次谐波信号在通道1接收，采用465-475nm滤光片；钙黄绿素标记的矿化组织在通道2接收发射波，采用503-555nm滤光片；茜素红标记的矿化组织在通道3接收发射波，采用578-634nm滤光片。经预实验确定钙黄绿素和茜素红标记的荧光均可用940nm激发光激发，因此实验所用激发波长为940nm，胶原二次谐波成像吸收波长为465-475nm，钙黄绿素标记的矿化组织吸收波长在503-555nm，茜素红标记的矿化物吸收波长在578-634nm。
图2为本发明使用高分辨在体双光子激光扫描显微成像系统对标本在某XY平面的二维成像，从图2a和2b可得知，高分辨在体双光子激光扫描显微成像系统可以清楚的显示茜素红和钙黄绿素标记的矿化结构的二维图像，从图2c可得知，高分辨在体双光子激光扫描显微成像系统清楚的显示了通过二次谐波生成的胶原二维图像，同时可以显示胶原取向；图2d清楚的显示了茜素红和钙黄绿素标记的矿化结构，以及二次谐波显示胶原组织的merge图像。
步骤c、在所述胶原及矿化结构的荧光激发条件下，采用包括x轴、y轴和z轴三个互相垂直的轴的三维扫描方式，利用所述高分辨在体双光子激光扫描显微成像系统对非切片标本的新生骨组织样品进行全层扫描，其中，所述全层扫描是指：将圆形缺损平面(即X、Y所固定的平面)在所述z轴方向上的N个子层进行扫描，N为大于5的整数，在对每个子层进行扫描的过程中，激发所述新生骨组织样品中每个子层的胶原及矿化结构产生荧光，从而获取所述N个子层的胶原及矿化结构的荧光图像；
步骤d、利用所述N个子层的胶原及矿化结构的荧光图像，重建所述非切片标本新生骨组织样品中骨基质的三维图像；具体为：将扫描得到的N个子层的胶原或矿化结构图片使用leica Application Suite X软件或导入Image J软件，分别得到胶原或矿化结构荧光三维图像。
图3为本发明使用leica Application Suite X软件对高分辨在体双光子激光扫描显微成像系统所成像序列图进行重建得到的三维图像。图3a和3b分别显示了茜素红和钙黄绿素标记的矿化组织的三维图像，图3c显示了通过二次谐波生成的胶原三维图像。由图3可知，利用本发明提供的方法能够对新生骨组织样品中胶原和矿化结构进行重建，形成三维立体结构图像，不仅有利于对骨整体形态的观察，还为新生骨组织中胶原和矿化结构的定量提供了一种准确、快捷的方法。
步骤e、根据所述步骤d中重建的胶原及矿化结构的三维图像，得到所述非切片标本新生骨组织样品中骨基质的形态结构，将扫描得到的N个子层的胶原或矿化结构图片导入Image J软件，分别得到胶原或矿化结构荧光三维图像，然后使用Image J软件对胶原或者矿化组织的荧光量进行定量，得到的数值即为该非切片标本中胶原或矿化组织的定量参数。从而完成对所述非切片标本新生骨组织样品的定性和定量分析。
图4为本发明的成像操作和成像效果的示意图，从图中可以得出使用高分辨在体双光子激光扫描显微成像系统直接进行标本检测，可以对新生骨组织中的胶原和矿化结构直接快速成像，从而提供更多的新生骨组织信息，是一种高效、便捷的分析方法。
以上内容仅为说明本发明的技术思想，不能以此限定本发明的保护范围，凡是按照本发明提出的技术思想，在技术方案基础上所做的任何改动，均落入本发明权利要求书的保护范围之内。
Claims (8)
1.一种对非切片标本新生骨组织进行检测及分析的方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)结合胶原二次谐波成像和所标记矿化结构的荧光物质激发光波长，利用高分辨在体双光子激光扫描显微成像系统对非切片标本新生骨组织中的Ⅰ型胶原及矿化结构进行荧光扫描检测，得到胶原及矿化结构的荧光激发条件；
其中，所标记矿化结构的荧光物质为钙黄绿素和茜素红，钙黄绿素标记的矿化组织吸收波长为503-555nm，茜素红标记的矿化物吸收波长为578-634nm；
2)在胶原及矿化结构的荧光激发条件下，采用包括x轴、y轴和z轴三个互相垂直的轴的三维扫描方式，利用高分辨在体双光子激光扫描显微成像系统对非切片标本新生骨组织样品进行全层扫描，获取N个子层的胶原及矿化结构的荧光图像；
3)利用所述N个子层的胶原及矿化结构的荧光图像，重建骨组织样品中骨基质的三维图像；
4)根据所述步骤3)中重建的胶原及矿化结构的三维图像，得到所述非切片标本新生骨组织样品中骨基质的形态结构，从而完成对非切片标本新生骨组织样品的定性和定量分析。
2.根据权利要求1所述的一种对非切片标本新生骨组织进行检测及分析的方法，其特征在于，步骤1)中，进行荧光扫描检测前，将颅骨缺损标本进行表面处理和修整，保证成像效果，然后将其置于载玻片上，得到非切片标本新生骨组织，用于观察成像；其中，表面处理和修整为将表面肌肉、骨膜等软组织全部剔除，同时修剪标本周围骨组织，确保新生骨部位在同一水平面。
3.根据权利要求2所述的一种对非切片标本新生骨组织进行检测及分析的方法，其特征在于，用生物胶或者胶布将处理好的标本固定于载玻片上，在缺损区域滴1滴PBS，将合适大小的盖玻片置于缺损上方，然后置于载物台上进行观察成像。
4.根据权利要求1所述的一种对非切片标本新生骨组织进行检测及分析的方法，其特征在于，步骤1)中，所述胶原及矿化结构的荧光激发条件为：激发光波长940nm。
5.根据权利要求1所述的一种对非切片标本新生骨组织进行检测及分析的方法，其特征在于，步骤1)中，胶原二次谐波成像吸收波长为465-475nm。
6.根据权利要求1所述的一种对非切片标本新生骨组织进行检测及分析的方法，其特征在于，步骤2)中，所述全层扫描是指：将圆形缺损x轴、y轴方向所固定的平面，在z轴方向上的N个子层进行扫描，N为大于5的整数，在对每个子层进行扫描的过程中，激发所述新生骨组织样品中每个子层的胶原及矿化结构产生荧光，从而获取N个子层的胶原及矿化结构的荧光图像。
7.根据权利要求1所述的一种对非切片标本新生骨组织进行检测及分析的方法，其特征在于，步骤3)中，所述N个子层的胶原及矿化结构的荧光图像重建处理为：将扫描得到的N个子层的胶原或矿化结构图片使用软件分别得到胶原或矿化结构荧光三维图像，然后对胶原或者矿化组织的荧光进行定量，得到的数值即为该非切片标本中胶原或矿化组织的定量参数。
8.根据权利要求7所述的一种对非切片标本新生骨组织进行检测及分析的方法，其特征在于，所述软件为leica Application Suite X软件或Image J软件。
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