CN104568880B - 一种对软骨组织进行分析的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种对软骨组织进行分析的方法，属于软骨组织工程技术领域。所述方法包括：利用双光子共聚焦显微镜对动物模型软骨组织的软骨基质进行自发荧光扫描实验，确定软骨基质的自发荧光激发条件；在该条件下，采用包括互相垂直的x轴、y轴和z轴的三维扫描方式，利用双光子共聚焦显微镜对软骨组织样品进行全层扫描，激发软骨组织样品中不同子层的软骨基质自发荧光，获取不同子层软骨基质自发荧光图像；根据该自发荧光图像对软骨组织样品进行定量分析；利用该不同子层的软骨基质的自发荧光图像，重建软骨组织样品中软骨基质的三维图像，对软骨组织样品进行定性分析。本发明方法既能获得全面精确的软骨信息又能对软骨组织样品进行多次利用。

Description

一种对软骨组织进行分析的方法

技术领域

本发明涉及软骨组织工程技术领域，特别涉及一种对软骨组织进行分析的方法。

背景技术

软骨组织是一种在机体内主要起支持和保护作用的略带弹性的坚韧组织，由软骨细胞、软骨基质及纤维构成。其中，软骨基质占软骨组织干重的90％左右。胎儿和幼儿的软骨组织分布较广，而成年人软骨组织主要分布在关节、肋软骨、气管、耳廓、椎间盘等处。其中，关节软骨作为能动关节的承重组织，不仅能承受相当大的负荷，例如约18MPa的应力，还能减少相邻两骨的摩擦，缓冲关节运动时产生的震动，对于关节的正常活动至关重要。研究发现，关节软骨易受到疾病或创伤的影响而遭到破坏，但是由于其本身不含血管或神经，所以遭到破坏后缺乏自我修复能力，这意味着对关节软骨较小的损害既能造成明显的关节疼痛、关节不稳，并逐渐演变成骨关节炎。所以，对受损的关节软骨的修复一直是医学界关注的重点和难点。

举例来说，自20世纪40年代至今以来，兴起了一批对受损的关节软骨进行修复的方法，包括清创灌洗手术、骨髓刺激技术、骨软骨移植、以及软骨组织工程技术等。其中，软骨组织工程技术作为近年来的研究热点，通过将软骨种子细胞种植于可生物降解、组织相容性好的生物材料形成复合物，然后再把该复合物植入软骨缺损处，生物材料自行降解的过程中，种子细胞形成新的软骨来填充软骨缺损，具有极大的应用前景。

在软骨组织工程技术的研究过程中，对软骨组织，尤其是软骨基质进行定性和定量分析十分重要。通过对软骨组织，尤其是软骨组织中的软骨基质进行定性和定量分析而得到的软骨信息不仅能实时监测软骨修复效果还能为临床软骨诊断及治疗提供生理参数。目前通常采用软骨组织切片技术对软骨进行定性和定量分析。软骨组织切片技术主要是通过将软骨组织样品进行切片(厚度约为7微米，面积约为2cm²)，再进行染色处理(包括固定、脱钙、脱水、包埋操作)，然后才能在显微镜下进行观察软骨的形态。

发明人发现现有技术至少存在以下问题：

现有技术切片区域和厚度较小，所获得的软骨信息较为片面，精确度较低。而且，软骨组织样品为一次性使用，无法进行其他应用，造成软骨组织样品耗费严重。

发明内容

本发明实施例所要解决的技术问题在于，提供了一种既能获得全面精确的软骨信息又能使软骨组织样品多次利用的对软骨组织进行分析的方法。具体技术方案如下：

一种对软骨组织进行分析的方法，包括：

步骤a、利用双光子共聚焦显微镜对动物模型的软骨组织中的软骨基质进行自发荧光扫描实验，得到所述软骨基质自发荧光的激发条件；

步骤b、在所述软骨基质自发荧光的激发条件下，采用包括x轴、y轴和z轴三个互相垂直的轴的三维扫描方式，利用所述双光子共聚焦显微镜对软骨组织样品进行全层扫描，其中，所述全层扫描包括：对所述软骨组织样品在所述z轴方向上的N个子层进行扫描，N为大于5的整数，在对每个子层进行扫描的过程中，激发所述软骨组织样品中每个子层的软骨基质产生自发荧光，从而获取所述N个子层的软骨基质的自发荧光图像；

步骤c、选取所述N个子层中任意一个子层作为第一子层，将所述第一子层的软骨基质的自发荧光图像作为第一荧光图像，根据所述第一荧光图像，得到所述第一子层的软骨基质的含量，从而完成对所述软骨组织样品的定量分析；

步骤d、利用所述N个子层的软骨基质的自发荧光图像，重建所述软骨组织样品中软骨基质的三维图像；

步骤e、根据所述步骤d中重建的软骨组织样品中软骨基质的三维图像，得到所述软骨组织样品中软骨基质的形态结构，从而完成对所述软骨组织样品的定性分析。

进一步地，所述方法还包括：在所述步骤b之后，对所述软骨组织样品中的细胞核及细胞骨架进行染色，然后进行荧光扫描处理，获取所述软骨组织样品中所述N个子层的细胞核及细胞骨架的荧光图像；

根据所述软骨组织样品中所述N个子层的细胞核及细胞骨架的荧光图像，对所述软骨组织样品进行定性和定量分析。

更进一步地，所述方法还包括：

选取所述N个子层中任意一个子层作为第二子层，从所述N个子层的软骨基质的自发荧光图像中选取所述第二子层的软骨基质的自发荧光图像，作为第二荧光图像；

从所述软骨组织样品中所述N个子层的细胞核及细胞骨架的荧光图像中选取所述第二子层的细胞核及细胞骨架的荧光图像，作为第三荧光图像；

将所述第二荧光图像与所述第三荧光图像进行集成处理，获取所述第二子层的软骨组织样品的荧光图像；

根据所述第二子层的软骨组织样品的荧光图像，对所述第二子层的软骨组织样品进行定性和定量分析。

具体地，所述步骤a中，所述软骨基质自发荧光的激发条件包括：

用于激发所述软骨基质自发荧光的激光波长为405nm、488nm、561nm和633nm；

用于采集来自所述软骨基质自发荧光的光信号的检测波长为100-1300nm；

用于采集所述软骨基质的自发荧光图像的物镜的倍数为2.5倍、5倍、10倍、16倍、20倍、25倍、40倍、60倍、63倍；

电子放大倍数为0-40；

用于采集所述软骨基质的自发荧光图像的通道数为1-16通道。

具体地，所述根据所述第一荧光图像，得到所述第一子层的软骨基质的含量包括：

利用双光子共聚焦显微镜的工作站测定所述第一荧光图像的荧光强度，根据所述荧光强度得到所述第一子层的软骨基质的含量。

具体地，在利用双光子共聚焦显微镜的工作站测定所述第一荧光图像的荧光强度的过程中，在所述第一荧光图像中选取至少2个测试点，并测定所述至少2个测试点的荧光强度，取平均值，得到所述第一荧光图像的荧光强度。

具体地，所述步骤d中，利用三维细胞结构生物显微影像分析处理软件对所述N个子层的软骨基质的自发荧光图像进行三维重建处理，从而重建所述软骨组织样品中软骨基质的三维图像。

具体地，所述三维细胞结构生物显微影像分析处理软件为瑞士Bitplane公司开发的Imaris软件。

具体地，所述步骤d包括：利用所述Imaris软件中的Slice程序对所述N个子层的软骨基质的自发荧光图像进行层扫分析，确定所述N个子层的软骨基质的自发荧光图像在所述软骨组织样品中的层面位置；

根据所述N个子层的软骨基质的自发荧光图像在所述软骨组织样品中的层面位置，利用所述Imaris软件中的Surpass程序对所述N个子层的软骨基质的自发荧光图像进行三维重建，从而重建所述软骨组织样品中软骨基质的三维图像。

具体地，所述步骤e包括：利用所述Imaris软件中的Section程序对所述步骤d中重建的软骨组织样品中软骨基质的三维图像进行层切处理，获取所述软骨组织样品的多个纵切面和/或横切面的图像，并根据所述多个纵切面和/或横切面的图像，确定所述软骨组织样品中软骨基质的形态结构，来对所述软骨组织样品进行定性分析。

本发明实施例提供的技术方案带来的有益效果是：

本发明实施例提供的对软骨组织进行定性和定量分析的方法，通过采用双光子共聚焦显微镜中的包括x轴、y轴和z轴三个互相垂直的轴的三维扫描方式，即xyz扫描方式，利用双光子共聚焦显微镜对软骨组织样品中的软骨基质激发自发荧光，获取该软骨组织样品中各个不同的连续的子层的软骨基质的自发荧光图像。一方面，根据所得到的自发荧光图像能确定特定子层的软骨基质的含量，从而对软骨组织进行定量分析。另一方面，通过对所得到的自发荧光图像进行三维重建处理，构建软骨组织样品中软骨基质的三维图像，能够对软骨组织进行定性分析。可见，本发明实施例提供的方法能对整个软骨组织样品进行定性定量分析，所获得的软骨信息更加全面精确，利于实时监测软骨修复效果并为临床软骨诊断及治疗提供精确的中间信息。而且该方法对软骨组织样品不具有破坏性，软骨组织样品还可进行再利用，避免了浪费。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1-1为SD大鼠膝关节的软骨基质的自发荧光图像；

图1-2为SD大鼠膝关节的软骨下骨的自发荧光图像；

图1-3为人膝关节的软骨基质的自发荧光图像；

图1-4为人膝关节的软骨下骨的自发荧光图像；

图1-5为人膝关节的软骨基质和软骨下骨自发荧光图像分布示意图；

图2-1为正常软骨组织样品中多个不同的连续子层的软骨基质的自发荧光图像；

图2-2为受损软骨组织样品中多个不同的连续子层的软骨基质的自发荧光图像；

图2-3为利用双光子共聚焦显微镜扫描方法所获得的正常软骨组织样品表层的软骨基质的自发荧光图像；

图2-4为利用双光子共聚焦显微镜扫描方法所获得的受损软骨组织样品表层的软骨基质的自发荧光图像；

图2-5为正常软骨组织样品表层软骨基质的甲苯胺蓝荧光染色图像；

图2-6为受损软骨组织样品表层软骨基质的甲苯胺蓝荧光染色图像；

图3-1为利用双光子共聚焦显微镜的工作站软件分别对图2-3和图2-4所示的自发荧光图像进行处理所得到的荧光强度结果示意图；

图3-2为利用荧光分析仪分别对图2-5和图2-6所示的甲苯胺蓝荧光染色图像进行处理所得到的荧光强度结果示意图；

图4-1为正常软骨组织样品的三维重建图像；

图4-2为受损软骨组织样品的三维重建图像；

图4-3为图4-1所示的正常软骨组织样品的三维重建图像中一个纵切面的图像；

图4-4为图4-2所示的受损软骨组织样品的三维重建图像中一个纵切面的图像；

图5为不同放大倍数的软骨组织中同一层面的软骨基质、细胞核、细胞骨架以及三者合并后的荧光图像。

其中，附图1-1至1-5、附图2-1至2-4、附图4-1至4-4所示的荧光图像中，灰白色的区域即代表荧光的分布；

附图2-5至2-6中所示的甲苯胺蓝荧光染色图像中，黑色的区域即代表甲苯胺蓝的分布。

具体实施方式

除非另有定义，本发明实施例所用的所有技术术语均具有与本领域技术人员通常理解的相同的含义。在对本发明实施方式作进一步地详细描述之前，对理解本发明实施例一些术语给出定义。

1)本发明实施例中所述的“软骨组织样品”可以是人软骨组织样品，也可以是动物软骨组织样品。2)本发明实施例中所述的“包括x轴、y轴和z轴三个互相垂直的轴的三维扫描方式”指的是本领域中双光子共聚焦显微镜通常采用的xyz扫描方式。3)本发明实施例中所述的“子层”是为了清楚地描述双光子共聚焦显微镜对软骨组织样品的扫描过程而设定的一个词语，其指的是软骨组织样品在z轴方向某一特定位置处的一个虚拟的xy平面面层，在本发明实施例中，其可以理解为指的是软骨组织样品的一层非常薄的层面。4)本发明实施例中所述的“第一子层”、“第二子层”均指的是软骨组织样品中任选地某一个子层，其不具有特定的含义，可以选自软骨组织样品的表面、中间部位或者其它各个部位，两者可以相同或者不同，本发明实施例在此不对其作具体限定。5)本发明实施例中所述的“N个子层的软骨基质”指的是软骨组织样品中连续的全部层面的软骨基质，亦即软骨组织样品中全部的软骨基质，其中N根据软骨组织样品的大小可以任意的调整，以实现利用双光子共聚焦显微镜得到整体的不同的连续子层的软骨基质的自发荧光图像。6)本发明实施例中所述的“软骨组织样品中软骨基质的三维图像”指的是分布在整个软骨组织样品中的全部软骨基质按照其在软骨组织样品中真实存在的位置所形成的三维图像。

为使本发明的技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本发明实施方式作进一步地详细描述。

本发明实施例提供了一种对软骨组织进行分析的方法，包括以下步骤：

步骤101、利用双光子共聚焦显微镜对动物模型的软骨组织中的软骨基质进行自发荧光扫描实验，得到软骨基质的自发荧光激发条件。

步骤102、在步骤101所确定的软骨基质的自发荧光激发条件下，采用包括x轴、y轴和z轴三个互相垂直的轴的三维扫描方式(即xyz扫描方式)，利用双光子共聚焦显微镜对软骨组织样品进行全层扫描，其中，该全层扫描包括：对软骨组织样品在z轴方向上的N个子层进行扫描，N为大于5的整数，在对每个子层进行扫描的过程中，激发该软骨组织样品中每个子层的软骨基质产生自发荧光，从而获取上述N个子层的软骨基质的自发荧光图像。

步骤103、选取步骤102中的N个子层中任意一个子层作为第一子层，将该第一子层的软骨基质的自发荧光图像作为第一荧光图像，根据该第一荧光图像，得到第一子层的软骨基质的含量，从而完成对软骨组织样品的定量分析。

步骤104、利用步骤102中得到的N个子层的软骨基质的自发荧光图像，重建软骨组织样品中软骨基质的三维图像。

步骤105、根据步骤104中得到的重建的软骨组织样品中软骨基质的三维图像，得到软骨组织样品中软骨基质的形态结构，从而完成对软骨组织样品的定性分析。

本发明实施例提供的对软骨组织进行分析的方法，通过采用xyz扫描方式，利用双光子共聚焦显微镜对软骨组织样品中的软骨基质激发自发荧光，获取该软骨组织样品中各个不同的连续的子层的软骨基质的自发荧光图像。一方面，根据所得到的自发荧光图像能确定特定子层的软骨基质的含量，从而对软骨组织进行定量分析。另一方面，通过对所得到的自发荧光图像进行三维重建处理，构建软骨组织样品中软骨基质的三维图像，能够评估软骨总体形态，对软骨组织进行定性分析。可见，本发明实施例提供的方法能对整个软骨组织样品进行定性定量分析，测定软骨基质的微观变化，所获得的软骨信息更加全面精确，有助于检测软骨退变程度及评估软骨缺损修复效果，即利于实时监测软骨修复效果并为临床软骨诊断及治疗提供精确的中间信息。而且该方法对软骨组织样品不具有破坏性，软骨组织样品还可进行再利用，避免了传统组织学方法的局限性、片面性，从而促进软骨损伤的临床修复及基础研究。此外，本发明实施例提供的方法中所使用的仪器操作技术成熟、简单，更利于推广。

为了便于进一步地了解本发明，将对上述方法中的各个步骤进行说明。具体如下：

步骤101中，通过利用双光子共聚焦显微镜对动物模型的软骨组织中的软骨基质进行自发荧光扫描实验，以确定最佳的软骨基质的自发荧光激发条件。在该激发条件对软骨基质具有特异性，即在该激发条件下，仅仅能够激发软骨组织产生自发荧光，从而确保所获得的软骨组织的自发荧光图像的准确性。

具体地，步骤101中，上述软骨基质的自发荧光激发条件包括：

用于激发软骨基质自发荧光的激光波长为405nm、488nm、561nm和633nm等在405-633nm范围内的波长。

用于采集来自软骨基质自发荧光的光信号的检测波长为100-1300nm，优选为200-1100nm；

用于采集所述软骨基质的自发荧光图像的物镜的倍数为2.5倍、5倍、10倍、16倍、20倍、25倍、40倍、60倍、63倍；

电子放大倍数(zoom)为0-40；

用于采集所述软骨基质的自发荧光图像的通道数为1-16通道。

在上述软骨基质的自发荧光激发条件中，激光波长、检测波长、物镜倍数、电子放大倍数以及通道数，可以在上述列举的范围内进行选择。例如，可以为以下组合。

组合(1)：

用于激发软骨基质自发荧光的激光波长为405nm；

用于采集来自软骨基质自发荧光的光信号的检测波长为300nm；

用于采集所述软骨基质的自发荧光图像的物镜的倍数为10倍；

电子放大倍数(zoom)为20；

用于采集所述软骨基质的自发荧光图像的通道数为8通道。

组合(2)：

用于激发软骨基质自发荧光的激光波长为561nm；

用于采集来自软骨基质自发荧光的光信号的检测波长为1000nm；

用于采集所述软骨基质的自发荧光图像的物镜的倍数为63倍；

电子放大倍数(zoom)为15；

用于采集所述软骨基质的自发荧光图像的通道数为10通道。

也可以为其它组合。在上述范围的组合均可以实现上述软骨基质的自发荧光的激发。

步骤102中，通过在步骤101确定的软骨基质的自发荧光激发条件下，采用包括x轴、y轴和z轴三个互相垂直的轴的三维扫描方式(即xyz扫描方式)，利用双光子共聚焦显微镜对软骨组织样品进行全层扫描。由于采用的是双光子共聚焦显微镜的xyz扫描方式，即利用双光子共聚焦显微镜的z轴层扫功能，实现在z轴方向(即软骨组织样品在测量过程中所在的z轴方向)上获得软骨组织样品的N个子层的软骨基质的自发荧光图像。举例来说，N可以为大于5的整数，例如N可以为10、15、20、25、30、35、40、45、50等等。可以理解的是，这N个子层的软骨基质的自发荧光图像在本发明实施例中指的是多个不同的连续的子层上的位于xy平面上的软骨基质的扫描图像。如果获取软骨组织样品中全部的软骨基质自发荧光图像，就可以得到了全面而准确软骨信息，即N的数值越大，后续所得软骨信息越全面和准确。本领域技术人员可以理解的是，在扫描区域较大时，不能利用z轴扫描一次性完成对整个软骨组织样品扫描时，可利用共聚焦工作站将几个相邻的z轴扫描图像进行无缝拼接，构建更全面的软骨基质立体构象。

作为一种优选的实施方式，在进行步骤102的过程中，可以同时对软骨组织样品中的细胞核进行甲苯胺蓝染色，从而在获得的软骨基质的自发荧光图像上分布有蓝色的细胞核，更利于观察软骨基质的定位。

步骤103中，本领域技术人员可以理解的是，通过对软骨组织样品某一子层(亦即某一层面)的软骨基质进行定量分析，即可确定整个软骨组织样品中软骨基质的密度。所以为了提高对软骨组织样品定量分析的效率，仅从步骤102中得到的N个子层的软骨基质的自发荧光图像中选取任意一个子层的软骨基质的自发荧光图像作为定量分析样品。

具体地，步骤103中，根据第一荧光图像，得到第一子层的软骨基质的含量包括：利用双光子共聚焦显微镜的工作站测定第一荧光图像的荧光强度，并根据荧光强度得到第一子层的软骨基质的含量。具体地，通过如下公式确定软骨基质的含量：软骨基质的定量分析是相对定量，是利用双光子共聚焦显微镜对软骨组织样品进行荧光扫描(N≥5)，直接得到荧光强度数值。通过将该荧光强度数值与传统甲苯胺蓝染色的样品的荧光强度数值(可以将其理解为标准测定方法)进行比对，就可以反应出软骨组织样品中软骨基质的含量变化，能以此检测软骨基质含量改变，并可以与正常软骨比对。

其中，利用双光子共聚焦显微镜的工作站测定第一荧光图像的荧光强度为本领域常规技术手段，本发明实施例在此不对其作具体限定。

作为优选，为了确保所得到的第一荧光图像的荧光强度的准确性，在利用双光子共聚焦显微镜的工作站测定第一荧光图像的荧光强度的过程中，在第一荧光图像中选取至少2个测试点，测定该至少2个测试点的荧光强度，取测量得到的至少2个荧光强度的平均值，作为第一荧光图像的荧光强度。举例来说，可以在第一荧光图像中选取5个测试点。

步骤104通过对步骤102中得到的N个子层的，即不同层面的连续的软骨基质的自发荧光图像进行三维重建处理，获得软骨组织样品中全部软骨基质的三维结构。由于软骨基质占软骨组织干重的90％的左右，软骨基质的形态结构即可准确地表达软骨组织的形态，所以本发明实施例通过对软骨组织样品中的软骨基质进行三维重建，即可达到对软骨组织样品进行定性分析的目的。

具体地，步骤104利用三维细胞结构生物显微影像分析处理软件对上述N个子层的软骨基质的自发荧光图像进行三维重建处理，获得软骨组织样品中软骨基质的三维图像。举例来说，该三维细胞结构生物显微影像分析处理软件可以为瑞士Bitplane公司开发的Imaris软件。

基于上述，本发明实施例中步骤104优选包括以下步骤：

步骤1041：利用Imaris软件中的Slice程序对N个子层的软骨基质的自发荧光图像进行层扫分析，确定N个子层的软骨基质的自发荧光图像在软骨组织样品中的所在层面位置；

步骤1042：根据不同层面的软骨基质的自发荧光图像在软骨组织样品中的所在层面位置，利用Imaris软件中的Surpass程序对N个子层的软骨基质的自发荧光图像进行三维重建，获取所述软骨组织样品中软骨基质的三维图像。

进一步地，步骤105包括以下优选的步骤：利用Imaris软件中的Section程序对软骨组织样品中软骨基质的三维图像进行层切处理，获取软骨组织样品的多个纵切面和/或横切面的图像，并根据多个纵切面和/或横切面的图像对软骨组织样品进行定性分析。

步骤105通过对所获得的软骨基质的三维图像中进行纵切和/或横切，能够获得软骨组织样品的多个纵切面和/或横切面的图像，尤其是获得该软骨组织样品的不同纵切面的图像，能够在不破坏软骨组织样品的前提下，全面分析软骨组织内部的深层的形态结构，不仅避免了造成样品浪费，且提高了对软骨组织进行分析的效率及准确率。可以理解的是，基于软骨组织样品在利用双光子共聚焦显微镜进行扫描时的安放位置，本发明实施例中，上述“横切”指的是在xy平面上进行层切，亦即将“xy平面”定义为横切面；而“纵切”指的是在yz平面或者xz平面上进行层切，亦即将“yz平面或者xz平面”定义为纵切面。本发明实施例中，前述的“不同层面的软骨基质的自发荧光图像”即可理解为指的是软骨组织样品在xy平面上的横切面图像，所以本发明实施例优选获得软骨组织样品在yz平面或者xz平面上的纵切面图像，以更精确地深度分析软骨组织的形态结构。

其中，上述“Slice程序”、“Surpass程序”、“Section程序”均为Imaris软件中自带程序，本领域技术人员通过现有技术能够进行上述操作。

此外，步骤103和步骤104并无先后顺序的限制，亦即可以在进行完步骤103后顺次进行步骤104和步骤105；或者在进行完步骤104和步骤105后，再进行步骤103；或者同时进行步骤103和步骤104，然后在步骤104进行完毕后顺次进行步骤105。

进一步地，本发明实施例的方法还包括步骤106：在步骤102进行完毕之后，对软骨组织样品中的细胞核及细胞骨架进行染色，然后利用双光子共聚焦显微镜对染色后的细胞核和细胞骨架进行荧光扫描处理，获取软骨组织样品中N个子层的细胞核及细胞骨架的荧光图像；根据软骨组织样品中N个子层的细胞核及细胞骨架的荧光图像，对软骨组织样品进行定性和定量分析。

其中，上述激发上述细胞核及细胞骨架的产生荧光的条件包括：

用于激发细胞核产生荧光的激光波长为405nm；用于激发细胞骨架产生荧光的激光波长为561nm；用于采集来自细胞核和细胞骨架的荧光信号的检测波长为100-1300nm；用于采集细胞核和细胞骨架的荧光图像的物镜的倍数为2.5倍、5倍、10倍、16倍、20倍、25倍、40倍、60倍、63倍；电子放大倍数(zoom)为0-40；用于采集细胞核和细胞骨架的荧光图像的通道数为1-16通道。

本发明实施例利用双光子共聚焦显微镜对软骨组织样品进行扫描，不会对软骨组织样品造成破坏，经过扫描后的软骨组织样品还可进行再利用，提高其利用率，避免浪费。所以，步骤106再利用该软骨组织样品进行细胞核及细胞骨架的染色及荧光扫描处理，以获得软骨组织样品中N个子层的，亦即不同层面的连续的细胞核及细胞骨架的荧光图像，进一步地分析软骨组织的形态，更全面准确地获得软骨相关信息。

更进一步地，本发明实施例提供的方法还包括步骤107：选取上述N个子层中任意一个子层作为第二子层，从步骤102中得到的N个子层的软骨基质的自发荧光图像中选取第二子层的软骨基质的自发荧光图像，作为第二荧光图像；

从步骤106中得到的软骨组织样品中N个子层的细胞核及细胞骨架的荧光图像中选取上述第二子层的细胞核及细胞骨架的荧光图像，作为第三荧光图像；

将第二荧光图像与第三荧光图像进行集成处理，获取该第二子层的软骨组织样品的荧光图像；

根据该第二子层的软骨组织样品的荧光图像，对该第二子层的软骨组织样品进行定性和定量分析。

由于第二荧光图像和第三荧光图像分别代表软骨组织样品中第二子层处的软骨基质和软骨细胞的荧光图像，所以步骤107通过将软骨组织同一子层上，亦可以理解为同一层面上的软骨基质和软骨细胞的荧光图像进行整合，得到该层面处的软骨组织的荧光图像，以更全面准确地获得该第二子层处的软骨组织的信息。基于上述，此处“集成处理”指的是将第二荧光图像和第三荧光图像按照对应的位置进行整合重叠处理，以获取整体的同时具有软骨基质和软骨细胞的荧光图像。

以下将通过具体实施例进一步地描述本发明。

在以下具体实施例中，所涉及的操作未注明条件者，均按照常规条件或者制造商建议的条件进行。所用原料未注明生产厂商及规格者均为可以通过市购获得的常规产品。

实施例1

(一)利用双光子共聚焦显微镜对动物模型的软骨组织中的软骨基质进行自发荧光扫描实验，得到软骨基质的自发荧光激发条件。

1)取新鲜的斯泼累格·多雷(Sprague Dawley，SD)大鼠膝关节，解剖膝关节，并剔除膝关节周围肌肉、筋膜、脂肪等软组织。利用生理盐水冲洗膝关节表面，修剪软骨下骨，得到平整的SD大鼠膝关节的软骨组织样品，用于双光子共聚焦显微镜的检测。其中，处理过程中注意保护关节面不受破坏。

2)将SD大鼠膝关节的软骨组织样品转移到共聚焦器皿内，使其待测部分朝向下方，利用莱卡SP8型倒置双光子共聚焦显微镜对其进行荧光检测实验。实验过程中通过不断改变操作条件来采集软骨基质的荧光、透射光和反射光图像，经多次实验后确定软骨基质的自发荧光激发条件，如下所示：

用于激发软骨基质的自发荧光的激光波长为405nm、488nm、561nm、633nm；用于采集来自软骨基质的荧光信号的检测波长为100-1300nm；用于采集软骨基质自发荧光图像的物镜的倍数为2.5倍、5倍、10倍、16倍、20倍、25倍、40倍、60倍和63倍；电子放大倍数为0-40。用于采集软骨基质自发荧光图像的通道数为1-16通道。

(二)在上述步骤所确定的软骨基质的自发荧光激发条件下，采用xyz扫描方式，利用双光子共聚焦显微镜对软骨组织样品进行全层扫描，其中，该全层扫描包括：对软骨组织样品在z轴方向上的N个子层进行扫描，N为20，在对每个子层进行扫描的过程中，激发该软骨组织样品中每个子层的软骨基质产生自发荧光，从而获取N个子层的软骨基质的自发荧光图像。

1)取人膝关节置换手术切除的关节面作为待测样品，分别选取未磨损的区域以及病变区域作为正常软骨组织样品及受损软骨组织样品，不对这两种样品均作任何处理。

2)在上述确定的自发荧光激发条件下，利用莱卡SP8(Leica SP8)型倒置双光子共聚焦显微镜分别对这两种样品进行软骨基质自发荧光的检测。在检测过程中始终保持这两个样品处于湿润状态。具体地，检测过程中，在样品上选取测定区域，调整共聚焦通道；利用Z轴纵向调整，选取全层扫描的起始层面；采用xyz扫描方式对这两个样品进行全层扫描，利用双光子共聚焦显微镜进行图像自动取相(Capture)操作，采集多个不同层面的软骨基质的自发荧光图像采集软骨基质的自发荧光图像。当扫描区域较大、不能利用Z轴扫描一次性构建软骨三维结构时，可利用共聚焦工作站将几个相邻的Z轴扫描图像进行无缝拼接，构建更全面的软骨立体构象，即XYZ拼图。

3)在相同的操作条件下，对人软骨下骨和SD大鼠的软骨下骨也进行自发荧光检测，以确定上述软骨基质自发荧光激发条件对人软骨基质的特异性。

4)为了证明利用共聚焦扫描所获得的软骨基质自发荧光图像的准确性，利用传统的对软骨基质进行甲苯胺蓝染色测定软骨形态及基质含量的方法对其进行确认。其操作步骤包括常规的样品固定、脱钙、包埋及甲苯胺蓝染色。其中，所使用的样品与正常软骨组织样品和受损软骨组织样品一致。

具体操作步骤如下：样本固定：10％中性甲醛固定样本的12小时，流水冲洗24小时。脱钙处理：10％EDTA进行样品脱钙处理，处理时间大于一周，室温塑料容器内进行。流水冲洗24小时，梯度浓度酒精脱水(50％浓度的酒精中2小时，60％浓度的酒精中2小时，70％浓度的酒精中2小时，90％浓度的酒精中2小时，100％浓度的酒精中2小时)。组织浸蜡、石蜡包埋，7μm切片。石蜡切片常规脱蜡至水。1％甲苯胺蓝液染色5min～8min，清水洗去浮色。苏木素染色5min，清水洗去浮色。切片梯度酒精脱水，二甲苯透明中性树胶封固。该甲苯胺蓝染色后的软骨组织样品还可以利用双光子共聚焦显微镜进行软骨基质的自发荧光扫描，以获得同时具有细胞核和软骨基质荧光的图像。

实验结果如下所述：

实验结果1：本发明实施例所确定的软骨基质自发荧光激发条件对软骨基质具有特异性。

在上述软骨基质自发荧光激发条件下，SD大鼠膝关节的软骨基质呈现特异的自发荧光(参见图1-1)，而其软骨下骨不能激发出自发荧光，仅仅出现很弱的背景荧光(参见图1-2)。与SD大鼠一致，在上述软骨基质自发荧光激发条件下，人膝关节的软骨基质能激发出很强的自发荧光(参见图1-3)，而其软骨下骨没有激发出荧光(参见图1-4)。进一步地对人膝关节软骨组织样品的纵切面进行观察，发现软骨基质和软骨下骨的自发荧光分布具有很大的差异(参见图1-5)。可见，上述确定的软骨基质自发荧光激发条件对软骨基质呈现特异性，能够有效激发软骨基质进行自发荧光。

实验结果2：本发明实施例提供的各个层面的软骨基质自发荧光图像的有效性。

图2-1和图2-2分别为正常软骨组织样品和受损软骨组织样品中多个不同的连续子层的软骨基质的自发荧光图像。由图2-1和图2-2可知，利用本发明实施例提供的方法能够获得软骨组织样品中多个不同的连续子层的软骨基质的自发荧光图像。

图2-3是利用本发明实施例提供的双光子共聚焦显微镜扫描方法得到的正常软骨组织样品表层的软骨基质的自发荧光图像，图2-4是利用本发明实施例提供的双光子共聚焦显微镜扫描方法得到的受损软骨组织样品表层的软骨基质的自发荧光图像。由图2-3和图2-4可知，正常软骨的软骨基质的自发荧光强度明显强于受损软骨的软骨基质的自发荧光强度，这不仅说明了本实施例利用双光子共聚焦显微镜检测软骨基质自发荧光能有效地反映出软骨组织内部结构的形态，为软骨组织的研究与分析提供依据。

图2-5和图2-6分别代表正常软骨组织样品表层的软骨基质的甲苯胺蓝荧光染色图像和受损软骨组织样品表层的软骨基质的甲苯胺蓝荧光染色图像。由图2-5和图2-6可知，正常软骨组织的染色区域明显多于受损软骨组织的染色区域，即表明正常软骨组织内的软骨基质含量高于受损软骨组织内的软骨基质含量，这也与上述利用双光子共聚焦显微镜测定软骨组织内软骨基质的形态所得到的结果一致，证明了本发明实施例利用双光子共聚焦显微镜测定软骨基质自发荧光图像的有效性和准确性。

(三)选取上述N个子层中任意一个子层作为第一子层，将该第一子层的软骨基质的自发荧光图像作为第一荧光图像，根据该第一荧光图像，得到第一子层的软骨基质的含量，从而完成对软骨组织样品的定量分析。

从所获得的多个不同的连续子层的软骨基质的自发荧光图像中选取一个子层的自发荧光图像，作为定量分析图像样本，利用双光子共聚焦显微镜的工作站软件确定该图像样本的荧光强度，每张图像样本依据大小，选取五个测定点，最终以平均值作为该图像样本的荧光强度。进一步地，根据该图像样本的荧光强度即可计算该软骨组织中软骨基质的含量。此处分别对图2-3和图2-4所示的荧光图像进行荧光强度分析。与此同时，还对图2-5和图2-6所示的甲苯胺蓝荧光染色图像进行荧光强度分析。

图3-1是利用双光子共聚焦显微镜的工作站软件对图2-3和图2-4所示的荧光图像进行处理所得到的荧光强度结果示意图，其中纵坐标代表荧光强度(fluorescenceintensity)；图3-2是利用常规的荧光分析仪对图2-5和图2-6所示的甲苯胺蓝荧光染色图像进行处理所确定的荧光强度结果示意图，其中纵坐标代表光密度值(OD value)。其中，利用常规的荧光分析仪测试光密度为本领域常规技术，本发明实施例在此不对其作具体限定。由图3-1和图3-2可知，利用本发明实施例提供的方法所得到的荧光强度以及利用常规的甲苯胺蓝染色方法所得到的荧光强度一致，即对软骨组织(软骨基质)的定量结果一致。这说明了本发明实施例通过利用双光子共聚焦显微镜测定软骨基质自发荧光图像来对其进行定量分析的方法是可行以及有效的。

进一步地，本实施例为了进一步确定本发明实施例利用双光子共聚焦显微镜测定软骨基质自发荧光图像来对其进行定量分析的方法的有效性，还利用本领域常用的荧光强度分析软件：Image-Pro Plus(IPP)软件对图2-3和图2-4所示的荧光图像进行荧光强度分析，所得到的荧光强度与利用双光子共聚焦显微镜的工作站软件分析所得到的荧光强度一致，这进一步说明了本发明实施例利用双光子共聚焦显微镜的工作站软件检测荧光强度的有效性。

(四)利用上述N个子层的软骨基质的自发荧光图像，重建软骨组织样品中软骨基质的三维图像，并根据该重建的软骨组织样品中软骨基质的三维图像，获取软骨组织样品中软骨基质的形态结构，从而完成对软骨组织样品的定性分析。

1)打开所获得的多个不同的连续子层的软骨基质的自发荧光图像文件，利用瑞士Bitplane公司开发的Imaris软件中的Slice程序对各图像进行层扫分析，可以获取每一个子层的图像，通过对图像的层次构建动态扫描影像，确定不同子层的软骨基质的自发荧光图像在软骨组织样品中的层面位置。

2)根据多个不同的连续子层的软骨基质的自发荧光图像在软骨组织样品中的层面位置，利用Imaris软件中的Surpass重建程序对多个不同的连续子层的软骨基质的自发荧光图像进行三维重建，获取软骨组织样品中软骨基质的三维图像，得到软骨组织样品的三维立体结构。

图4-1和图4-2分别表示正常软骨组织样品和受损软骨组织样品的三维重建图像。由图4-1和图4-2可知，利用本发明实施例提供的方法能够对软骨组织样品的结构进行了重建，形成三维立体结构图像，不仅利于对软骨的整体形态的观察，还为软骨组织的研究提供了一种高效便捷的方法。

3)利用Imaris软件中的Section程序对所获得的三维图像进行纵切处理，获取软骨组织样品的多个纵切面的图像，并根据该多个纵切面的图像，观察软骨组织样品中软骨基质的形态结构，来对软骨组织样品进行定性分析。

图4-3和图4-4分别表示正常软骨组织样品和受损软骨组织样品的三维重建图像中某一纵切面的图像。由图4-3和图4-4可知，通过对所获得的三维图像进行纵切处理，能够进一步深度分析软骨内部结构，从而提供更多的软骨信息。

实施例2

本实施例对实施例1中经共聚焦显微镜扫描后的正常软骨组织样品进行常规的细胞核以及细胞骨架荧光染色处理，并利用莱卡SP8型双光子共聚焦显微镜对染色后的正常软骨组织样品进行荧光扫描处理，获得该正常软骨组织样品中不同层面的细胞核和细胞骨架的荧光图像，以进一步观察该样品中软骨细胞的分布及形态，进一步为分析软骨组织提供信息。

样品的制备操作步骤具体如下：样品固定：10％的中性甲醛固定样品12小时，流水冲洗24小时。4℃以及避光条件下，140nm的罗丹明-鬼笔环肽染色12小时。磷酸盐缓冲液PBS(Phosphate Buffered Saline，pH＝7.4)溶液浸泡24小时，中间换液3次。Hoechst 33258(1：800)染色2小时。PBS溶液浸泡24小时，中间换液3次。将样品移到共聚焦器皿内，

利用实施例1中所使用的莱卡SP8型双光子共聚焦显微镜进行检测，测试过程中PBS保持湿润。其中，所使用的激发软骨组织中的细胞核及细胞骨架的产生荧光的条件包括：

用于激发细胞核产生荧光的激光波长为405nm；用于激发细胞骨架产生荧光的激光波长为561nm；用于采集来自细胞核和细胞骨架的光信号的检测波长为100-1300nm；用于采集细胞核和细胞骨架的荧光图像的物镜的倍数为2.5倍、5倍、10倍、16倍、20倍、25倍、40倍、60倍、63倍；电子放大倍数为0-40；用于采集细胞核和细胞骨架的荧光图像的通道数为1-16通道。

在获得不同子层的细胞核和细胞骨架的荧光图像后，从其中选取某一特定子层作为第二子层，并获取第二子层处的细胞核和细胞骨架的自发荧光图像，同时也从实施例1提供的不同子层的软骨基质的自发荧光图像中选取该特定的第二子层处的软骨基质的自发荧光图像，将它们进行集成，既能得到合并的同时包含软骨基质、细胞核和细胞骨架的荧光图像。

图5为不同放大倍数的软骨组织中同一子层的软骨基质、细胞核、细胞骨架以及三者集成后的荧光图像。由图5可知，通过将软骨组织中同一子层上的软骨基质和软骨细胞的荧光图像进行整合，得到该子层处的软骨组织的荧光图像，能够更全面准确地获得该第二子层处的软骨组织的信息。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明的保护范围，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (9)

1.一种对软骨组织进行分析的方法，包括：

步骤a、利用双光子共聚焦显微镜对动物模型的软骨组织中的软骨基质进行自发荧光扫描实验，得到所述软骨基质自发荧光的激发条件；

步骤b、在所述软骨基质自发荧光的激发条件下，采用包括x轴、y轴和z轴三个互相垂直的轴的三维扫描方式，利用所述双光子共聚焦显微镜对软骨组织样品进行全层扫描，其中，所述全层扫描包括：对所述软骨组织样品在所述z轴方向上的N个子层进行扫描，N为大于5的整数，在对每个子层进行扫描的过程中，激发所述软骨组织样品中每个子层的软骨基质产生自发荧光，从而获取所述N个子层的软骨基质的自发荧光图像；

步骤c、选取所述N个子层中任意一个子层作为第一子层，将所述第一子层的软骨基质的自发荧光图像作为第一荧光图像，根据所述第一荧光图像，得到所述第一子层的软骨基质的含量，从而完成对所述软骨组织样品的定量分析；

步骤d、利用所述N个子层的软骨基质的自发荧光图像，重建所述软骨组织样品中软骨基质的三维图像；

步骤e、根据所述步骤d中重建的软骨组织样品中软骨基质的三维图像，得到所述软骨组织样品中软骨基质的形态结构，从而完成对所述软骨组织样品的定性分析；

所述软骨组织样品取自关节软骨；

所述方法还包括：

在所述步骤b之后，对所述软骨组织样品中的细胞核及细胞骨架进行染色，然后进行荧光扫描处理，获取所述软骨组织样品中所述N个子层的细胞核及细胞骨架的荧光图像；

根据所述软骨组织样品中所述N个子层的细胞核及细胞骨架的荧光图像，对所述软骨组织样品进行定性和定量分析。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法还包括：

选取所述N个子层中任意一个子层作为第二子层，从所述N个子层的软骨基质的自发荧光图像中选取所述第二子层的软骨基质的自发荧光图像，作为第二荧光图像；

从所述软骨组织样品中所述N个子层的细胞核及细胞骨架的荧光图像中选取所述第二子层的细胞核及细胞骨架的荧光图像，作为第三荧光图像；

将所述第二荧光图像与所述第三荧光图像进行集成处理，获取所述第二子层的软骨组织样品的荧光图像；

根据所述第二子层的软骨组织样品的荧光图像，对所述第二子层的软骨组织样品进行定性和定量分析。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤a中，所述软骨基质的自发荧光激发条件包括：

用于激发所述软骨基质自发荧光的激光波长为405nm、488nm、561nm和633nm；

用于采集来自所述软骨基质自发荧光的光信号的检测波长为100-1300nm；

用于采集所述软骨基质的自发荧光图像的物镜的倍数为2.5倍、5倍、10倍、16倍、20倍、25倍、40倍、60倍、63倍；

电子放大倍数为0-40；

用于采集所述软骨基质的自发荧光图像的通道数为1-16通道。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤c中，所述根据所述第一荧光图像，得到所述第一子层的软骨基质的含量包括：

利用双光子共聚焦显微镜的工作站测定所述第一荧光图像的荧光强度，根据所述荧光强度得到所述第一子层的软骨基质的含量。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，在利用双光子共聚焦显微镜的工作站测定所述第一荧光图像的荧光强度的过程中，在所述第一荧光图像中选取至少2个测试点，并测定所述至少2个测试点的荧光强度，取平均值，得到所述第一荧光图像的荧光强度。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤d中，利用三维细胞结构生物显微影像分析处理软件对所述N个子层的软骨基质的自发荧光图像进行三维重建处理，从而重建所述软骨组织样品中软骨基质的三维图像。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述三维细胞结构生物显微影像分析处理软件为瑞士Bitplane公司开发的Imaris软件。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述步骤d包括：利用所述Imaris软件中的Slice程序对所述N个子层的软骨基质的自发荧光图像进行层扫分析，确定所述N个子层的软骨基质的自发荧光图像在所述软骨组织样品中的层面位置；

根据所述N个子层的软骨基质的自发荧光图像在所述软骨组织样品中的层面位置，利用所述Imaris软件中的Surpass程序对所述N个子层的软骨基质的自发荧光图像进行三维重建，从而重建所述软骨组织样品中软骨基质的三维图像。

9.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述步骤e包括：利用所述Imaris软件中的Section程序对所述步骤d中重建的软骨组织样品中软骨基质的三维图像进行层切处理，获取所述软骨组织样品的多个纵切面和/或横切面的图像，并根据所述多个纵切面和/或横切面的图像，确定所述软骨组织样品中软骨基质的形态结构，来对所述软骨组织样品进行定性分析。