DE102010037406A1

DE102010037406A1 - Anordnung und Verfahren zur Gewinnung diagnostisch relevanter Parameter von humanem Knorpelgewebe mittels Multiphotonen-Fluoreszenzmikroskopie

Info

Publication number: DE102010037406A1
Application number: DE102010037406A
Authority: DE
Inventors: Dario Prof. Dr. 33824 Anselmetti; Jörg Dr. Calif. Martini; Thorsten 32584 Bergmann; Michael Dr. med. 33824 Dickob
Original assignee: DICKOB MICHAEL; Universitaet Bielefeld
Current assignee: DICKOB MICHAEL; Universitaet Bielefeld
Priority date: 2009-12-25
Filing date: 2010-09-08
Publication date: 2011-06-30

Abstract

Verfahren und Anordnung zur Gewinnung diagnostisch relevanter Parameter von humanem Knorpelgewebe in vivo mittels Multiphotonen-Fluoreszenzmikroskopie umfassend Mittel zur Erzeugung kurzer Laserpulse (10), optische Mittel (12, 14, 16, 18, 20, 22) zum Lenken der Laserpulse auf zu untersuchendes Gewebe (24) und Detektionsmittel (26) zum Erfassen von dem Gewebe ausgehenden Fluoreszenzlichts, wobei die optischen Mittel einen Scanmechanismus (12, 14) zum Einlenken der Laserpulse in ein Bündel (20) aus optischen Fasern umfassen, die optischen Fasern (20) vor einem Gradientenlinsen-Objektiv (22) münden und Mittel zur automatischen Auswertung des von den Detektionsmitteln erfaßten Fluoreszenzlichts vorgesehen sind.

Description

TECHNISCHES GEBIET DER ERFINDUNG
Die Erfindung betrifft eine Anordnung und ein Verfahren zur Gewinnung diagnostisch relevanter Parameter von humanem Knorpelgewebe mittels Multiphotonen-Fluoreszenzmikroskopie umfassend Mittel zur Erzeugung kurzer Laserpulse, optische Mittel zum Lenken der Laserpulse auf ein zu untersuchendes Gewebe und Detektionsmittel zum Erfassen von dem Gewebe ausgehenden Fluoreszenzlichts.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Zur Untersuchung von Knorpelgewebe werden bislang Röntgenaufnahmen, Computertomographie, Magnetresonanztomographie und Arthroskopie verwendet. Während Röntgen und Computertomographie eine Strahlenbelastung mit sich bringen, ist eine Magnetresonanztomographie aufgrund der erforderlichen magnetischen Abschirmung des Tomographen eine kostspielige Untersuchung. Bei der Arthroskopie kann nur die Oberfläche des Knorpelgewebes betrachtet werden.
Die bekannten Verfahren erlauben es zwar, fortgeschrittene Knorpelschädigungen sicher zu erkennen, das Erkennen initialer Knorpelschädigungen ist jedoch problematisch.
OFFENBARUNG DER ERFINDUNG
Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren und eine Anordnung anzugeben, mittels welcher auch initiale Knorpelschädigungen insbesondere im Rahmen von Eignungs- und Belastungstests aber auch im Vorfeld kosmetischer Operationen sicher erkannt werden können, ohne dabei den untersuchten Patienten unnötig zu belasten.
Die Aufgabe wird gelöst von einer Anordnung mit den Merkmalen des Anspruchs 1 bzw. einem Verfahren mit den Merkmalen des Anspruch 7. Vorteilhafte Aus- und Durchführungsformen sind Gegenstand der Unteransprüche. Der nebengeordnete Anspruch 10 betrifft die Verwendung einer erfindungsgemäßen Anordnung im ahmen von Eignungs- und Belastungstests sowie von kosmetischen Operationen.
Die Erfindung erlaubt erstmals die in vivo Anwendung der Multiphotonen-Fluoreszenzmikroskopie zur Untersuchung von humanem Knorpelgewebe und ermöglicht es, auch initiale Knorpelschädigungen sicher zu erkennen. Insbesondere schafft die Erfindung quasi ein ”Multiphotonen-Fluoreszenzmikroskop-Endoskop”, das minimal-invasiv einsetzbar ist.
Weitere Einzelheiten und Vorteile der Erfindung ergeben sich aus der nachfolgenden rein beispielhaften und nicht-beschränkenden Beschreibung eines Ausführungsbeispiels in Verbindung mit der Zeichnung.
KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNG
1 zeigt stark schematisiert den prinzipiellen Aufbau einer erfindungsgemäßen Anordnung.
2 zeigt mittels einer erfindungsgemäßen Anordnung erzielte Untersuchungsergebnisse
BESCHREIBUNG BEVORZUGTER AUSFÜHRUNGSFORMEN
Die 1 verdeutlicht stark schematisiert den prinzipiellen Aufbau einer erfindungsgemäßen Anordnung. Da die Multiphotonen-Fluoreszenzmikroskopie dem Fachmann an sich bekannt ist, kann auf eine detaillierte Darstellung der dazu benötigten Komponenten verzichtet werden.
Mittels eines hier nicht dargestellten Lasers, z. B. eines gepumpten Titan-Saphir-Lasers, wird ein Laserstrahl 10 aus kurzen, insbesondere ultrakurzen (Dauer der einzelnen Pulse in der Größenordnung von wenigen Femtosekunden) Laserpulsen erzeugt.
Der Laser ist vorzugsweise so ausgebildet, daß die einzelnen Photonen eines Laserpulses eine Energie besitzen, die in etwa der halben zur Fluoreszenzanregung des zu untersuchenden Gewebes notwendigen Energie entspricht. Damit läßt sich dann vorteilhaft der Effekt ausnutzen, daß Fluoreszenz statt durch Absorption eines einzelnen energiereichen Photons auch durch die zeitgleiche Absorption zweier energieärmerer Photonen angeregt werden kann, also langwelligeres Licht zur Anregung genutzt werden kann. Dies hat gleich mehrere Vorteile. So bedarf die Zwei-Photonen-Anregung einer hohen Photonenflußdichte, wie sie nur im Fokus eines gepulsten Laserstrahles existiert, so daß durch entsprechendes Fokussieren Fluoreszenz gezielt an bestimmten Punkten im untersuchten Gewebe angeregt werden kann. Ferner besitzt langwelligeres Laserlicht eine höhere Eindringtiefe, da es in biologischem Gewebe weniger gestreut wird, und führt zu weniger chemischen Bindungsbrüchen als z. B. kurzwelliges Laserlicht. Die Erfindung erlaubt es daher, anders als die konventionelle Arthroskopie, ein dreidimensionales Bild des untersuchten Gewebes zu gewinnen.
Die Anordnung kann ferner vorteilhaft hier nicht gezeigte, an sich bekannte Mittel zum Prechirpen der Laserpulse umfassen, so daß die Laserpulse mit dadurch vergrößerter Pulsdauer verstärkt werden können.
Die Laserpulse werden dann über eine Scaneinheit aus zwei beweglichen Spiegeln 12 und 14 und einem dichroitischen Spiegel 16 mittels eines Objektives 18 sequentiell in ein Faserbündel 20 eingekoppelt. Dabei hat sich gezeigt, daß die Anforderungen an eine zur endoskopischen in vivo Untersuchung geeignete Anordnung besonders gut erfüllt werden können, wenn das Faserbündel 20 etwa 20.000 bis etwa 40.000, vorzugsweise etwa 30.000 Fasern umfaßt. Dies ermöglicht es, die optischen Fasern in einem distalen, das heißt dem zu untersuchenden Gewebe zugewandten Abschnitt eines endoskopischen Endstücks anzuordnen und vor einer Gradientenlinse eines Gradientenlinsen-Objektivs 22 münden zu lassen, wobei das Endstück vorzugsweise einen im wesentlichen runden Querschnitt mit einem Durchmesser im Bereich von etwa 0,5 bis etwa 1,5 mm, vorzugsweise etwa 1 mm besitzt.
Das Gradientenlinsen-Objektiv 22 besteht vorzugsweise aus zwei Gradientenlinsen. Vorteilhaft sind die Linsen so ausgebildet, daß sie es ermöglichen, je nach Einstellung 1, 2, 4, 8, 16, 32 oder 64 Foki in einer Ebene zu erzeugen.
Der Scanmechanismus ist außerhalb des Endstücks angeordnet, was es vorteilhaft erlaubt, das Endstück so auszubilden, daß die Anforderungen an eine minimal-invasive endoskopische Untersuchung erfüllt werden können. Das Endstück kann z. B. Teil eines z. B. starren Handstücks oder eines längeren, z. B. über eine Vene geführten z. B. flexiblen Endoskoprohr sein.
Bei einer Untersuchung werden dann die Laserpulse nach der Propagation in einer optischen Faser des Bündels mittels des Gradientenlinsen-Objektivs 22 in oder auf dem zu untersuchenden Gewebe 24 fokussiert, so daß es dort zu einer Zwei-Photonen-Fluoreszenzanregung kommen kann.
Das nach einer Zwei-Photonen-Absorption erzeugte Fluoreszenzlicht wird zumindest zu wesentlichen Teilen von dem Gradientenlinsen-Objektiv eingefangen und zurück durch das Bündel aus optischen Fasern geleitet. Der dichroitische Spiegel 16 trennt das Fluoreszenzlicht vom anregenden Laserlicht und lenkt es zu den Detektionsmitteln, die vorzugsweise eine CCD-Kamera, insbesondere eine EMCCD-Kamera 26 umfassen.
Das so erfaßte Fluoreszenzlicht kann dann automatisch ausgewertet werden. Entsprechende Mittel zur automatischen Auswertung des von den Detektionsmitteln erfaßten Fluoreszenzlichts umfassen insbesondere einen Computer und eine Bildauswertesoftware, vorzugsweise mit einer selbstlernenden Datenbank und/oder einer selbstorganisierenden Karte.
Die Erfindung kann beispielsweise so angewandt werden, daß zunächst ein dreidimensionales Fluoreszenzbild des untersuchten Gewebes aufgenommen wird, das z. B. aus 30 parallelen Einzelschnittbildern mit jeweils um 1 μm höherer Eindringtiefe aufgenommen wird, wobei in einer Ebene z. B. 64 Foki erzeugt werden. Die Einzelbilder werden dabei vorzugsweise mit einer hochempfindlichen EMCCD-Kamera aufgenommen, deren Scanbereich z. B. 350 × 350 μm betragen kann.
Die automatische Auswertung kann dann z. B. so erfolgen, daß nach einer Normierung auf die Bilder eine diskrete (dyadische) Wavelet-Transformation (DWT) angewendet und z. B. bis zur sechsten Iterationsstufe durchgeführt wird. Auf jeder Iterationsstufe können jeweils drei Detailkoeffizienten (horizontal, vertikal, diagonal) berechnet werden, woraus dann ein Merkmalsvektor extrahiert werden kann. Es hat sich gezeigt, daß eine automatische Auswertung insbesondere dann zuverlässige Ergebnisse liefert, wenn der Merkmalsvektor die Summe der konventionellen Energie einer Transformationsebene und die Anisotropie der Energie umfaßt. Bei einer DWT auf sechs Transformationsebenen ergibt sich damit ein Merkmalsvektor aus zwölf Merkmalen. Vorteilhaft kann zu diesen Merkmalen wird noch der Mittelwert des normierten Originalbildes hinzugenommen werden.
Die so gewonnenen Daten können dann in eine selbstorganisierende Karte eingetragen werden, in welcher die Eingangsdaten hinsichtlich ihrer Ähnlichkeiten mit bereits vorhandenen Daten angeordnet und z. B. auf einem Bildschirm zweidimensional präsentiert werden, so ein Arzt das untersuchte Gewebe leicht beurteilen kann. Dabei kann auch vorgesehen sein, daß automatisch eine bestimmte Voreinteilung des Gewebes vorgenommen und dem Arzt akustisch und/oder optisch präsentiert wird. Beispielsweise kann vorgesehen sein, daß dem Arzt, der eine endoskopische Untersuchung z. B. im Rahmen eines Eignungstests durchführt, direkt an einem von ihm geführten Handstück z. B. mittels farbiger LEDs (rot gelb grün) oder durch ein tonhöhenabhängiges Signal der Zustand des gerade untersuchten Knorpelbereichs angezeigt wird.
Die Erfindung beruht auf der überraschenden Erkenntnis, daß gesundes gegenüber geschädigtem Knorpelgewebe eine bis zu zehnfach höhere Autofluoreszenzintensität aufweist. In 2 ist die Fluoreszenzintensität über der Eindringtiefe für drei verschiedene Knorpelgewebeproben aufgetragen. Bei einer automatischen Auswertung kann daher die Fluoreszenzintensität als ein Differenzierungsparameter verwandt werden. Weitere automatisch auswertbare Parameter zur Bestimmung eines Schädigungsgrades können z. B. die Struktur der extrazellulären Matrix und das Fluoreszenzspektrum sein.
In einem erfindungsgemäß erzeugten Fluoreszenzbild lassen sich deutliche Unterschiede in der Struktur des extrazellulären Matrixgewebes zwischen gesundem und geschädigtem Knorpel nachweisen. Dies wird damit erklärt, daß bei gesundem Knorpel die extrazelluläre Matrix sehr homogen mit vielen einzelnen Knorpelzellen (Chondrozyten) durchsetzt ist, während es bei einer beginnenden Arthrose zu einer Auffaserung dieser Matrix kommt.
Wenn die ersten Quervernetzungen der Kollagenfasern innerhalb der extrazellulären Matrix aufbrechen, versucht das Knorpelgewebe, die beginnende Degeneration durch eine erhöhte Anzahl von Chondrozyten auszugleichen, wobei sich häufig Chondrozytencluster bilden. Das nächste Stadium ist die weitere Degeneration der extrazellulären Matrix bis hin zu einer vollständigen Auflösung des Gewebes einhergehend mit einer deutlichen Verringerung der Chondrozyten.
Die Erfindung ermöglicht vorteilhaft eine Bestimmung der Chondrozytendichte mittels spektraler Differenzierung und erlaubt es daher erstmals, auch initiale Knorpelschädigungen zuverlässig festzustellen.
Da die Erfindung eine Auflösung im Submikrometerbereich ermöglicht besitzt, ist sie den bisher eingesetzten Verfahren auch hinsichtlich der Auflösung deutlich überlegen. Zudem erlaubt sie es, Gewebe in vivo markierungsfrei, das heißt ohne vorherige Gabe von Fluoreszenzmarkern, zu untersuchen, da erfindungsgemäß vorteilhaft die Autofluoreszenz des Knorpelgewebes nutzbar gemacht wird.

Claims

Anordnung zur Gewinnung diagnostisch relevanter Parameter von humanem Knorpelgewebe in vivo mittels Multiphotonen-Fluoreszenzmikroskopie umfassend – Mittel zur Erzeugung kurzer Laserpulse (10), – optische Mittel (12, 14, 16, 18, 20, 22) zum Lenken der Laserpulse auf zu untersuchendes Gewebe (24) und – Detektionsmittel (26) zum Erfassen von dem Gewebe ausgehenden Fluoreszenzlichts, dadurch gekennzeichnet, daß die optischen Mittel einen Scanmechanismus (12, 14) zum Einlenken der Laserpulse in ein Bündel (20) aus optischen Fasern umfassen, – daß die optischen Fasern (20) vor einem Gradientenlinsen-Objektiv (22) münden und – daß Mittel zur automatischen Auswertung des von den Detektionsmitteln erfaßten Fluoreszenzlichts vorgesehen sind.
Anordnung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß Mittel zum Prechirpen der Laserpulse (10) vorgesehen sind.
Anordnung nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß das Bündel (20) etwa 20.000 bis etwa 40.000, vorzugsweise etwa 30.000 Fasern umfaßt.
Anordnung nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß die Mittel zur Erzeugung der Laserpulse (10) so ausgebildet sind, daß die einzelnen Photonen eines Laserpulses eine Energie besitzen, die in etwa der halben zur Fluoreszenzanregung des zu untersuchenden Gewebes (24) notwendigen Energie entspricht.
Anordnung nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß das Gradientenlinsen-Objektiv (22) im distalen Abschnitt eines endoskopischen Endstücks und der Scanmechanismus (12, 14) außerhalb des Endstücks angeordnet ist, wobei das Gradientenlinsen-Objektiv (22) vorzugsweise aus zwei Gradientenlinsen besteht, die vorzugsweise so ausgebildet sind, daß sie es ermöglichen, wahlweise 1, 2, 4, 8, 16, 32 oder 64 Foki in einer Ebene zu erzeugen.
Anordnung nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß der gewebezugewandte Teil des endoskopischen Endstücks einen im wesentlichen runden Querschnitt mit einem Durchmesser im Bereich von etwa 0,5 bis etwa 1.5 mm, vorzugsweise etwa 1 mm besitzt.
Anordnung nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß die Detektionsmittel eine CCD-Kamera, insbesondere eine EMCCD-Kamera (26) umfassen.
Verfahren zur Gewinnung diagnostisch relevanter Parameter von humanem Knorpelgewebe mittels Multiphotonen-Fluoreszenzmikroskopie, umfassend die Schritte – Erzeugen kurzer Laserpulse, – Lenken der Laserpulse auf ein zu untersuchendes Gewebe und – Erfassen des von dem Gewebe ausgehenden Fluoreszenzlicht, dadurch gekennzeichnet, – daß die Laserpulse sequentiell in einzelne Fasern eines Bündels optischer Fasern eingelenkt werden, – daß die Laserpulse aus dem Faserbündel über eine Gradientenlinse auf das Gewebe in vivo gestrahlt werden, – daß das von dem Gewebe ausgehende Fluoreszenzlicht über die Gradientenlinse in das Faserbündel gelenkt wird und – daß das Fluoreszenzlicht aus dem Faserbündel auf eine CCD-Kamera, insbesondere eine EMCCD-Kamera gelenkt wird.
Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß die Laserpulse derart erzeugt werden, daß die einzelnen Photonen eines Laserpulses etwa die halbe zur Fluoreszenzanregung des untersuchten Gewebes benötigte Energie besitzen.
Verwendung einer Anordnung nach einem der Ansprüche 1 bis 8 zur in vivo Untersuchung vom humanen Knorpelgewebe bei Eignungstests, Belastbarkeitstests oder im Vorfeld kosmetischer Operationen.