-
Umfeld der Erfindung
-
Die
vorliegende Erfindung betrifft ein Messinstrument und dessen Verwendung
zur Messung eines von Gewebe erzeugten Raman-Signals, das einen
Laser, eine Signaldetektoreinheit und einen faseroptischen Messkopf
umfasst.
-
Stand der Technik
-
Atherosklerose
stellt in vielen Gebieten der Welt eine bedeutende Todesursache
dar. Daher sind zahlreiche Verfahren entwickelt worden, um Information über die
sich in Blutgefäßen bildende
Plaque zu erhalten. Bildgebende Verfahren wie z.B. die Angiographie,
die Magnetresonanztomographie, der intravaskuläre Ultraschall und die Optische
Kohärenztomographie
liefern Informationen über
die Lage einer Plaque oder eines Blutgefäßverschlusses und die Morphologie
oder die innere Struktur einer Plaque. Allerdings gestatten sie
keine In-vivo-Analyse der Molekularzusammensetzung der Plaque. Die
Kenntnis der Plaquezusammensetzung ist zum Beispiel zur Bestimmung
der Gefahr akuter kardialer Ereignisse wichtig. Es wird zwischen
der so genannten stabilen Plaque und der vulnerablen Plaque unterschieden,
wobei die vulnerable Plaque der Auslöserrolle solcher akuten, oft
fatalen Ereignissen verdächtigt
wird. Ein solches Ereignis wird durch das Reißen der dünnen fibrösen Kappe der Plaque eingeleitet,
wodurch der Inhalt des Lipidpools mit dem Blutstrom in Berührung kommt
und zu Thrombogenese und Arterienverschluss führt.
-
Es
ist gezeigt worden, dass Fluoreszenzmethoden fähig sind, zwischen einer normalen
Arterienwand und einer atherosklerotischen Plaque in vitro zu unterscheiden.
Allerdings werden Fluoreszenzspektren leicht von lichtabsorbierenden
Molekülen
in Gewebe und Blut gestört,
wodurch deren Anwendung Grenzen gesetzt sind.
-
Von
allen auf die Erhaltung von Informationen betreffend die Zusammensetzung
atherosklerotischer Plaques abzielenden und in vivo einsetzbaren
Methoden liefert die intravaskuläre
Ramanspektroskopie die ausführlichsten
Informationen. In der Ramanspektroskopie wird die Stokes-Verschiebung
zwischen dem in eine untersuchte Probe einfallenden Licht und dem
von der Probe unelastisch gestreuten Licht in relativen Wellenzahlen
angegeben (Δcm-1 = (1/λein – 1/λgestreut)10-2 mit λ (Wellenlänge) in
Meter. Zur Erhaltung dieser Informationen wird im Wellenzahlenbereich
zwischen ungefähr 400
and 2000 cm-1 des Ramanspektrum (dem so genannten
Fingerabdruckbereich) gemessen. Dieser Bereich des Spektrums enthält zahlreiche
erkennbare Bande, die einzeln oder miteinander kombiniert zur Erhaltung
von Informationen über
die Molekularzusammensetzung des Gewebes herangezogen werden können.
-
Die
Forschungsarbeiten auf dem Gebiet der Atherosklerose beziehen sich
nur auf den Fingerabdruckbereich, da dieser Bereich des Spektrums
für die
Analyse und Diagnose sehr aufschlussreich ist. Beispiele solcher
Studien sind z.B. in den Arbeiten von H.P. Buschman, E.T. Marple,
M.L. Wach, B. Bennett, T.C. Schut, H.A. Braining, A.V. Bruschke,
A. van der Laarse und G.J. Puppels, Anal.Chem. 72 (2000), 3771-3775,
zu finden, bei denen die In-vivo-Bestimmung der Molekularzusammensetzung
der Arterienwand durch Ramanspektroskopie unter Verwendung eines
Faserbündel-Messkopfs
für Messungen
im Bereich von 400-1800 cm-1; von R.H. Clarke,
E.B. Hanlon, J.M Isner, H. Brody, Appl. Optics 26 (1987), 3175-3177,
wo die Ramanspektroskopie verkalkter atherosklerotischer Läsionen in
kardiovaskulärem
Gewebe, ebenfalls im Fingerabdruckbereich erörtert wird; und von J.F. Brennan,
T.J. Romer, R.S. Lees, A.M. Tercyak, J.R. Kramer, M.S. Feld, Circulation
96 (1997), 99-105, wo die Bestimmung der Zusammensetzung der humanen
Koronararterie durch Ramanspektroskopie im Fingerabdruckbereich
behandelt wird.
-
Der
In-vivo-Einsatz der Ramanspektroskopie erfordert meistens die Verwendung
einer flexiblen Lichtführungseinheit
geringen Durchmessers. Diese kann z.B. in das Lumen einer Arterie
eingeführt
werden. Sie muss fähig
sein, die Standorte atherosklerotischer Läsionen zu erreichen und abzusuchen.
Sie kann auch im Arbeitskanal eines Endoskops oder in einer Biopsienadel
oder -zange eingesetzt werden. Der faseroptische Messkopf, der eine
oder mehrere Fasern enthält,
dient dazu, das Licht zum Gewebe zu transportieren, das vom Gewebe
zurück
gestreute Licht einzusammeln und das eingesammelte Licht weg vom
Gewebe zu einer Signalanalyseeinheit zu transportieren.
-
Leider
erzeugen im Spektralbereich von 400-2000 cm-1 die
Stoffe der optischen Faser selbst Raman-Signale, die zu einem erhöhten Störgeräusch führen. Darüber hinaus
führt das
Krümmen
der optischen Faser zu Schwankungen der vom Kern, dem Mantel und
der Beschichtung erhaltenen Signalstärke und kompliziert so die
Signaldetektion und -analyse noch mehr. Dadurch wird der Signal-Geräuschabstand
für die
Raman-Signaldetektion verschlechtert, die Signalanalyse auch auf
andere Weise kompliziert und daher der klinische Nutzen beeinträchtigt.
Somit ist es notwendig, optische Filter an oder nah an dem distalen
Ende des faseroptischen Messkopfs einzusetzen, der sich mit dem
Gewebe in Berührung
oder dicht daran befindet, um die Mitwirkung von Störgeräuschen im
detektierten Raman-Signal niederzuhalten. Allerdings erfordert das
seinerseits den Einsatz getrennter Fasern zum Transport des Lichts
zum Gewebe bzw. zum Einsammeln des zurück gestreuten Lichts und zu
dessen Transport weg vom Gewebe. Des weiteren erfordert dies oft
die Verwendung von Vorrichtungen zur Strahlenführung oder Linsen am distalen
Ende des faseroptischen Messkopfs, damit die erwünschte Überlappung der vom Laser belichteten
Gewebemenge und jener, von der das Raman-Signal eingesammelt werden
kann, erhalten wird. Daher sind faseroptische Messköpfe für die Ramanspektroskopie
komplex. Es ist schwierig, faseroptische Messköpfe für die Ramanspektroskopie zu
miniaturisieren und sie dabei flexibel zu halten, was z.B. für den intravaskulären Einsatz
und für
den Einsatz im Nebenkanal eines Endoskops erforderlich ist. Die
Komplexität
ist ebenfalls ein Hindernis im Wege der Produktion solcher Messköpfe zu Preisen,
die sie als Wegwerfutensilien in Krankenhäusern verwendbar machen. Zudem
ist die Intensität
des Gewebesignals zwischen 400 und 2000 cm-1 gering,
weshalb lange Signalerfassungszeiten notwendig sind, die für den klinischen
Gebrauch nachteilig sind. Alle oben erwähnten Probleme und Nachteile
behindern die derzeitige Implementierung der Ramanspektroskopie
für Zwecke
der klinischen Diagnose im Allgemeinen und für den intravaskulären Einsatz
im Besonderen.
-
Das
Licht wird in so genannten gebundenen Modi durch die Faser transportiert.
In den gebundenen Modi befindet sich das elektromagnetische Feld
vorwiegend im Kern der optischen Faser, wobei ein kleiner Teil in
den Mantel gelangt. Modi niederer Ordnung sind mehr auf den Kern
beschränkt
als jene höherer
Ordnung.
-
Die
Intensität
des von einer Faser transportierten Lichts wird abgeschwächt, und
zwar in Folge von Absorption, von Lichtstreuung (Rayleigh Streuung,
Streuung(Reflexion an größeren unhomogenen
Bereichen oder an Stellen, an denen das Fasermaterial beschädigt ist)
sowie von Mikro- und Makrokrümmungsverlusten.
-
Das
durch Streuungsereignisse verlorengegangene Laserlicht verlässt den
Faserkern und durchquert die Beschichtungen und die Pufferschichten
Die Beschichtung und die Pufferschicht bestehen gewöhnlich aus Silikon,
Kunststoff oder Polymermaterial.
-
In
US 5,293,872 ist der Einsatz
von Ramanspektroskopie mit Laserlichtanregung im nahen Infrarotbereich
(NIR) zur Unterscheidung zwischen normalem Arteriengewebe, verkalkter
atherosklerotischer Plaque und fibrösen atherosklerotischen Plaques
beschrieben. Für
In-vivo-Messungen im Bereich von 700-1900 cm-1, wird der Einsatz
eines Faserbündels
besprochen. Das führt
zu denselben Nachteilen, z.B. was den Geräuschabstand anbelangt.
-
In
US 5,194,913 wird das Problem
der Verwendung mehrerer Fasern erörtert, aber auch erkannt, dass der
Einsatz einer einzelnen Faser falsch wäre, weil das in der optischen
Faser erzeugte, als Störgeräusch wirkende
Raman-Signal außer
in sehr kurzen Fasern stark ist. Darin wird eine faserbasierte Vorrichtung
beschrieben, worin für
die beiden Richtungen des Lichttransports zwei verschiedene Fasern
verwendet werden, um die störende
Ramanemission der optischen Fasern herabzusetzen. Das Dokument behandelt
das Problem von über
Fasern transportierten Signalen im Allgemeinen, wobei offensichtlich
die in
US 5,194,913 angegebene Lösung, nämlich eine
axiale Konfiguration, schwerlich für In-vivo-Messungen eingesetzt
werden kann.
-
Eine
Arbeit von J.F. Aust, K.S. Booksh and M.L. Myrick, Applied Spectroscopy
50 (1996), 382-386, behandelt Fälle,
wo das von den (Polymer-)Proben erhaltene Signal verhältnismäßig stark
ist (Polymer) oder wobei spezielle Maßnahmen getroffen wurden, wie
z.B. die Vergrößerung des
Messvolumens, von dem die Raman-Signale erhalten werden, um die
Intensität
der Signale von Polymeren zu erhöhen,
die viel stärker
sind, als sie von biologischen Geweben erhalten wären. Die
Arbeit bezieht sich nicht auf die Anwendbarkeit der Methode auf
Gewebe, hält
aber fast, dass für
ein gutes Signal ein spezielles, mit Polymer gefülltes Teflonrohr mit einer
Länge von
bis zu 4 cm an der Spitze des optischen Messkopfs einzusetzen ist,
um ein entsprechendes Signal zu erhalten. Eine derartige Methode
ist üblicherweise
bei Geweben nicht anwendbar, und insbesondere nicht im Falle von In-vivo-Messungen.
-
Ähnlich wie
die Atherosklerose ist auch Krebs ein bedeutendes Gesundheitsproblem.
Bei der Bestimmung von Tumorzellen durch Ramanspektroskopie über Fasertechnik
begegnet man den gleichen Problemen wie den weiter oben erwähnten.
US 5,261,410 rät zum Einsatz
eines Faserbündels
und zur Messung im Fingerabdruckbereich. Ein derartiger Einsatz
führt zu
keinem zufriedenstellenden Signal-Geräuschabstand.
-
Aus
EP0573535 sind Verfahren
und Geräte
bekannt, die optische Fasern verwenden, welche in einem Katheter
untergebracht sind, durch die der Laserstrahl zum Zweck ärztlicher
Anwendungen einschließlich
der Diagnose und Entfernung arterieller und vaskulärer Verschlüsse (Angiochirurgie)
und insbesondere der Diagnose der atherosklerotischen Plaque sowie
der Diagnose von Krebs- und Hauterkrankungen transportiert wird. Die
Reflexion, die elastische und unelastische Streuung sowie die Ramanstreuung,
die Absorption und die Fluoreszenz werden für die Gewebediagnose herangezogen.
Die Technik umfasst die elektronische Detektion ausgewählter getrennter
Wellenlängen
der vom Material zurück
gestreuten Fluoreszenz- oder Ramanstrahlung, die ein elektronisches
den ausgewählten
Wellenlängen
der ramangestreuten Strahlung zugehöriges Signal erzeugt, und den
Vergleich des generierten elektronischen Signals mit einem gespeicherten
Referenzsignal, wobei der Vergleich zu einer Beziehung führt, welche
die Bestimmung des Gewebezustands ermöglicht. In der bevorzugten
Ausführungsform
bestehen der Kern und der Mantel aus Schmelzkieselsäure und
es wird auch ein Schutzpuffer bereitgestellt.
-
Aus
EP0573535 ist ferner bekannt,
dass das Messinstrument und das Messverfahren jeweils eingesetzt
werden, um das Vorhandensein von atherosklerotischem Gewebe festzustellen,
wobei das Gewebe Raman-Signale im Bereich (2500-3700cm
-1)
erzeugt, die von der Detektionseinheit detektiert werden, und dass das
Messinstrument und -verfahren zur Durchführung chirurgischer Eingriffe
insbesondere zur Entfernung von biologischem Gewebe eingesetzt wird.
-
Nach
den oben stehenden Angaben ist ersichtlich, dass ein Messinstrument
zur Messung von Geweben erzeugter Raman-Signale, welches die oben
erwähnten Nachteile
nicht aufweist, notwendig ist.
-
Zusammenfassung
-
Gemäß der vorliegenden
Erfindung wird ein Messinstrument und dessen Verwendung sowie ein
Verfahren zur Erzeugung und Messung eines von Gewebe erzeugten Raman-Signals
gemäß den beigefügten Patentansprüchen bereitgestellt.
-
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
-
1 zeigt die Ergebnisse eines Versuchs
zur Ramankartierung (1A), wobei Ramanspektren einer
dünnen
Arteriengewebesektion bei einem höheren Wellenzahlenbereich erhalten
wurden, welche die Identifikation von Gewebebereichen mit unterschiedlicher
Molekularzusammensetzung ermöglichen,
sowie die entsprechenden Ramanspektren (1B).
-
2 zeigt
Spektren von Lipiden und Proteinen, die in atherosklerotischen Plaques
und in Arterienwänden
vorhanden sein können.
A: Elastin, B: Cholesteryllinoleat, C: Cholesteryloleat, D: Cholesteryllinolenat, E:
Cholesterylpalmitat, F: Kollagen Typ 1, G: Trilinolein, H: Triolen,
I: Tripalmitin, J: Cholesterin.
-
3 zeigt
einen Vergleich der Lipidzusammensetzung von Segmenten humaner Arterien,
wie sie durch Ramanspektroskopie und HPTLC (High Performance Thin
Layer Chromatography = Hochleistungs-Dünnschichtchromatographie) bestimmt
wurden.
-
4 zeigt die Ergebnisse eines Experiments
zur Ramankartierung, wobei Ramanspektren einer dünnen Sektion humaner durch
Meningomia (MG) infiltrierter Dura Mater im höheren Wellenzahlenbereich erhalten
wurden, welche die Unterscheidung der beiden Gewebearten voneinander
ermöglichen
(4A) und eine anliegende mit H&E (Hematoxylin and Eosin) gefärbte Sektion.
-
5 zeigt die Ergebnisse eines Versuchs
zur Ramankartierung (5A), wobei Ramanspektren einer dünnen Sektion
humaner Glioblastoma in einem höheren
Wellenzahlenbereich erhalten wurden, welche die Identifikation von
vitalen Tumorarealen (V) und Nekrosebereichen (N) ermöglichen,
wenn 5B zum Vergleich herangezogen wird, in der eine
anliegende H&E-gefärbte Sektion
gezeigt wird.
-
6 zeigt
schematisch eine Einrichtung zur Erhaltung von Ramanspektren im
höheren
Wellenzahlenbereich.
-
7 zeigt
ein mit einer Ramaneinrichtung gemäß 6 erhaltenes
Spektrum (A) eines Lipidgemisches. Gezeigt werden ebenfalls das
Spektrum des faseroptischen Messkopfs selbst (B, in Abwesenheit
einer Probe am distalen Ende der optischen Faser) und ein Differenzspektrum
C (A-B).
-
8 zeigt Ramanspektren (t) einer normalen
Arterienwand (A) und einer atherosklerotischen Arterienwand (B),
die Ergebnisse (f) einer Kleinstquadratanpassung dieser Spektren
an den in 2 gezeigten Spektrensatz gereinigter
Komponenten, und die Residualspektren (r), die das in den Gewebespektren
enthaltene Signal darstellen, das durch den Satz der zur Anpassung
verwendeten Spektren nicht belegt ist.
-
9 zeigt
schematisch eine Ausführungsform,
in der die Ramanspektroskopie mit Fluoreszenz- und NIR-Absorptionsspektroskopie
gekoppelt wird.
-
Ausführliche Beschreibung der Erfindung
-
Die
Erfindung betrifft die Verwendung eines Messinstruments umfassend
einen Laser, eine Signaldetektoreinheit zum Messen des Raman-Signals
und einen faseroptischen Messkopf, wobei der faseroptische Messkopf
eine oder mehrere Fasern zum Transport des Laser-Lichts zum Gewebe
und zur Einsammlung des vom Gewebe zurück gestreuten Lichts sowie
zum Transport des eingesammelten Lichts weg vom Gewebe zur Signaldetektoreinheit
umfasst, wobei die optischen Fasern jeweils aus einem Kern, einem
Mantel und gegebenenfalls einer Beschichtung bestehen, und wobei
die mindestens eine zur Lichteinsammlung bestimmte Faser im Wesentlichen
kein Raman-Signal in wenigstens einem Abschnitt des Spektralbereichs
von 2500 bis 3700 cm-1 aufweist, und wobei
die Detekoreinheit das vom Gewebe in diesem Spektralbereich zurück gestreute
Raman-Signal erfasst.
-
Der
Vorteil der Verwendung dieses Gerätes besteht darin, dass die
rasche In-vivo-Kennzeichnung von Gewebe und von krankem Gewebe,
beispielsweise von atherosklerotischer Plaque, Tumoren, Gewebe im
Vorkrebsstadium und benignen Gewebeschäden mit dem Ramanspektrometer
ermöglicht
wird, und dass die Signalerfas sungszeit zum Erhalten eines Ramanspektrums
mit ausreichendem Signal-Rauschabstand verkürzt wird. Da keine zusätzlichen
Mittel wie z.B. Filter notwendig sind, die den spektralen Durchfluss
der Lichtführungen
begrenzen, besteht ein weiterer Vorteil darin, dass die Ramanmessungen
leicht mit anderen aufschlussreichen Techniken gekoppelt werden
können,
wie z.B. Fluoreszenzmessungen, Absorptionsmessungen im nahen Infrarotbereich
und optischen bildgebenden Verfahren, die dieselben Lichtführungen
benutzen könnten,
indem die Lichtführungen
sowohl für
den Transport des Lichts zum Gewebe als auch zum Einsammeln des
Lichts vom Gewebe und dessen Transport zurück zu einer Fluoreszenz- bzw.
NIR-Detektionseinheit oder auch unterschiedliche Lichtführungen
hierzu verwendet werden.
-
Die
hierin beschriebene Erfindung basiert auf der überraschenden Erkenntnis, dass
sehr ausführliche Information über die
Zusammensetzung einer atherosklerotischen Plaque sowie über die
Heterogenität
dieser Zusammensetzung erhalten werden kann, und dass Gehirntumorgewebe
von normalem Gehirngewebe und von Schädelgewebe und nekrotisches
Gehirn(tumor)gewebe von lebendigem Gewebe durch Aufzeichnung und
Analyse von Raman-Spektralkartierungen dünner Gewebesektionen unter
ausschließlicher
Verwendung des Bereichs von 2500-3700 cm-1 des
Ramanspektrums unterschieden werden können.
-
Der
Fingerabdruckbereich ist schon vorher zur Erkennung derartiger Gewebe
verwendet worden (siehe z.B.
US
5,293,872 ;
US 5,261,410 ;
Anal.Chem. 72 (2000), 3771-3775; Appl. Optics 26 (1987), 3175-3177; Circulation
96 (1997), 99-105), wobei es aber weder offenbart, noch nahe gelegt
wurde, dass das oben genannte Gewebe auch in diesem Bereich höherer Wellenzahlen
charakteristische und distinktive Raman-Signale erzeugt. Die Auswahl
dieses Bereichs bietet große
Vorteile. Für
die Messungen im Fingerabdruckbereich des Ramanspektrums ist es
notwendig, die Intensität
des elastisch zurück
gestreuten Laserlichts mit speziellen Filtern abzuschwächen, welche
eine starke Abschwächung
der Intensität
des elastisch zurück
gestreuten Lichts mit einer hohen Durchlässigkeit für Wellenlängen dicht an der Laser-Wellenlänge in sich
vereinigen. Allerdings besteht bei der vorliegenden Erfindung eine
beträchtliche
Wellenlängenverschiebung
zwischen dem einfallenden und dem Raman-gestreuten Licht im Bereich
hoher Wellenzahlen. Dadurch wird der Einsatz von sehr einfachen
und kostengünstigen Absorptionsfiltern,
wie z.B. Farbglasfiltern, im Signal-Detektionsweg zur Abschwächung der
Intensität
des elastisch zurück
gestreuten Laserlichts ermöglicht.
-
Die
Intensität
des von Gewebe erzeugten Raman-Signals ist bedeutend höher (ungefähr um den
Faktor fünf
oder höher)
in diesem höheren
Wellenzahlenbereich als im Bereich von 400-2000 cm-1 (Fingerabdruckbereich),
wodurch verkürzte
Signalerfassungszeiten z.B. ebenfalls um einen Faktor von ca. 5
oder mehr ermöglicht
werden.
-
Ein
weiterer Vorteil der Verwendung dieses Bereichs besteht darin, dass
dadurch die Aufzeichnung des Raman-Signals unter Verwendung einer
einzigen Faser zur Beleuchtung des Gewebes und zum Einsammeln des
Raman-Signals des Gewebes ermöglicht
wird, wobei die Intensität
des Raman-Signals des Gewebes vergleichbar mit der Intensität des in
der optischen Faser erzeugten Störgeräusches oder
noch größer als
dieses ist. Einige Fasern sind für
diese Art Messungen besonders gut geeignet, da die Ramanstreuung
der optischen Faser in diesem Wellenlängenbereich im Vergleich zum
Gewebesignal schwach oder vernachlässigbar ist. Das ist anders
als im Fingerabdruckbereich, wo bei derselben Konfiguration der
optischen Faser, in üblichen
Situationen, das Störgeräusch bei
Einsatz einer mehrere Meter langen Faser, eine üblicherweise wenigstens eine
Größenordnung
höhere
Intensität
aufweist als das Raman-Signal des Gewebes.
-
Zudem
besteht im Falle einiger Typen von Fasern das Störgeräusch im Bereich von 2500-3700
cm-1 aus einem einzigen Signal, dessen Intensität sich im
Vergleich zu der des Raman-Signals des Gewebes sehr wenig mit der
Wellenzahlenverschiebung ändert,
weshalb es leicht vom Raman-Signal des Gewebes unterschieden und/oder
bei der Signalanalyse berücksichtigt
werden kann. Im Fingerabdruckbereich das Störgeräusch von der optischen Faser
eine steilere Veränderung
der Eigenschaften auf, welche die Signalanalyse erschwert. Demzufolge
hat der Signal-Rauschabstand im erfindungsgemäß verwendeten Wellenzahlenbereich
einen viel größeren Wert
als im Fingerabdruckbereich. Das ist der Erkenntnis zu verdanken,
dass das Raman-Signal der optischen Faser im höheren Wellenzahlenbereich abwesend
oder stark abgeschwächt
ist, während
im Fingerabdruckbereich, wie er im Stand der Technik verwendet wird,
die Faser ebenfalls ein Raman-Signal erzeugt, welches das Raman-Signal
des Gewebes oder der Probe stört
oder sogar verdeckt.
-
Der
Bereich des Ramanspektrums von 2700-3100 cm-1 ist
für das
oben erwähnte
Gewebe besonders aufschlussreich. Daher erfasst die Detektoreinheit
des Messinstruments in einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung das
Raman-Signal innerhalb eines oder mehrerer Teile des Spektralbereichs
zwischen 2700 und 3100 cm-1. Somit besteht
ein weiterer Vorteil darin, dass nun das Signal nur in einem kleinen
Wellenzahlenbereich aufgenommen werden muss, wodurch die Verwendung
eines Mehrkanal-Lichtdetektors mit weniger Kanälen ermöglicht wird. Der Spektralbereich
von 2700-3100 cm-1 ist also besonders aufschlussreich für die Detektion,
Analyse und Diagnose von Gewebekrankheiten, vorzugsweise von atherosklerotischer Plaque
und Krebs- oder Vorkrebsgewebe, wobei die Erfassung von Messdaten
außerhalb
der erwähnten Spektralbereiche
für zusätzliche
Informationen nicht ausgeschlossen ist. Nach einer Ausführungsform
der Erfindung wird das Erfassen des Raman-Signals in anderen Spektralbereichen
(z.B. im Fingerabdruckbereich) neben dem Bereich von 2700-3100 cm-1 durchgeführt.
-
Ein
Vorteil der Verwendung des Geräts
zur Erzeugung und Detektion des Raman-Signals besteht darin, dass
die Komplexität
von Ramanspektrometern zur Messung von Proben (insbesondere (in
vivo) Gewebemessungen), der Kennzeichnung und/oder der Klassifizierung
von Geweben durch die Implementierung des Spektralbereichs höherer Wellenzahlen
sowie durch die sorgfältige
Auswahl der Lichtführungen
herabgesetzt wird, die sowohl zum Transport des Laserlichts zum
Gewebe als auch des zurück
gestreuten Lichts weg vom Gewebe dienen. Daher umfasst die Erfindung
die Verwendung eines Messinstruments, das dadurch gekennzeichnet
ist, dass der faseroptischen Messkopf eine Faser enthält, die
nicht nur das Licht zum Gewebe hin transportiert sondern auch das
vom Gewebe zurück
gestreute Licht einsammelt und das eingesammelte Licht weg vom Gewebe
zur Signaldetektoreinheit transportiert. Die Ausführungsform
umfasst auch einen faseroptischen Messkopf, der mehrere Fasern enthält, welche
dazu dienen, sowohl das Licht zum Gewebe hin zu transportieren als
auch das vom Gewebe zurück
gestreute Licht weg vom Gewebe zu transportieren. Da eine, mehrere
oder alle der optischen Fasern im Messkopf dieser Aufgabe genügen, kann
die Größe des Messkopfs
gegenüber
den dem Stand der Technik entsprechenden Messköpfen zur Gewebekennzeichnung
reduziert werden, die den Einsatz getrennter Fasern zum Transport
des Laserlichts zur Probe bzw. zur Detektion des Raman-Signals umfassen.
-
Ein
weiterer Vorteil besteht darin, dass die Größe eines Ramankatheters zum
intravaskulären
Einsatz sogar auf eine einzige Faser reduziert werden kann. Das
bedeutet, dass der Durchmesser z.B. des intravaskulären faseroptischen
Messkopfs maximal reduziert werden kann und dass eine möglichts
große
Flexibilität des
faseroptischen Messkopfs erreichbar ist, Eigenschaften, was ohnehin
für Katheter
für den
intravaskulären Einsatz
besonders wünschenswert
ist. Das Messinstrument kann auch für andere Anwendungen gebraucht werden,
bei denen kleine faseroptische Messköpfe erwünscht sind.
-
Die
wesentliche Reduzierung der Komplexität und demzufolge der Produktionskosten
des faseroptischen Messkopfs ist ein weiterer Vorteil. Die Faser
könnte
sogar als Wegwerfartikel gebraucht werden, was für einen intravaskulären Katheter
besonders wünschenswert
ist.
-
In
einer weiteren Ausführungsform
der Erfindung, können
die Ramanmessungen mit Fluoreszenz- und/oder Nahinfrarot-Absorptionsmessungen
gekoppelt werden. Die Detektoreinheit muss also auch einen Detektor
zur Fluoreszenzmessung und/oder einen Detektor für die Nahinfrarotabsorption
umfassen. In dieser Ausführungsform
besteht z.B. die Möglichkeit,
dass für
die Fluoreszenz- und/oder Nahinfrarot-Absorptionsmessungen eine
auch für
die Erhaltung des Raman-Signals eingesetzte Faser verwendet wird.
-
In
einer weiteren Ausführungsform
wird nur eine einzige Faser dazu verwendet, das Laserlicht (und das
(N)IR-Licht) zum Gewebe hin zu transportieren sowie das vom Gewebe
zurück
gestreute Licht einzusammeln und das eingesammelte Licht weg vom
Gewebe zur Signaldetektoreinheit zu transportieren, welche die entsprechenden
Detektoren enthält.
-
In
einer anderen Ausführungsform
kann eine Vielzahl von Fasern eingesetzt werden, um ein erhöhtes Signal
zu erhalten Diese Ausführung
umfasst auch die Verwendung eines Messinstruments, bei dem die Ramanmessungen
mit Fluoreszenz- und/oder Nahinfrarotabsorptionsmessungen gekoppelt
werden, wobei die Detektoreinheit auch einen Detektor zur Messung
der Fluoreszenz und/oder einen Detektor für die Nahinfrarotabsorption
umfasst. In einer weiteren Ausführungsform
kann die Messkopfgröße weiter
reduziert werden, wenn für
die Fluoreszenz- und/oder Nahinfrarot-Absorptionsmessungen eine
auch für
die Erhaltung des Raman-Signals eingesetzte Faser verwendet wird.
Hierin umfasst der Begriff Faser eine oder mehrere Fasern. Solche
Faserbündel
können
zum Messen oder Scannen eines Gewebeabschnitts eingesetzt werden.
Der Vorteil besteht darin, dass die Messstellen näher beieinander
liegen können,
als im Falle der Messköpfe
des Standes der Technik, wodurch die Auflösung erhöht wird.
-
Der
kleine Durchmesser und die hohe Flexibilität schaffen die bestmöglichen
Bedingungen zur Kopplung des Ramanmesskopfs mit anderen Erkennungsverfahren
(z.B. bei intravaskulär
eingesetztem Ultraschall und dem Zusammenbau mit einem Endoskop
für onkologische
Anwendungen) und zum Einbau in Instrumente zur Entnahme von Gewebeproben
(wie z.B. Biopsiezangen oder Instrumente zur Feinnadelaspiration)
oder mit Behandlungsverfahren (z.B. Vorrichtungen zur Hitzekoagulation
von Gewebe, z.B. Tumorgewebe, oder chirurgische Instrumente). Daher
umfasst die Erfindung ebenfalls ein Messinstrument, worin ein Teil
der optischen Faser in einen Katheter integriert oder damit gekoppelt
ist, der zusätzliche
Informationen über
das Gewebe liefert oder Mittel zur Erhaltung von Gewebeproben, Mittel
zur Gewebebehandlung und/oder bei chirurgischen Eingriffen verwendete
Mittel umfasst.
-
Alle
erwähnten
Vorteile bieten die Möglichkeit
der Instrumentenvereinfachung. Daher ermöglicht das Instrument die Ex-vivo-,
In-vitro- und In-vivo-Analyse und Diagnose der atherosklerotischen
Plaque und die Detektion von Tumorgewebe mit großen Vorteilen gegenüber dem
Stand der Technik.
-
Im
Sinne dieser Erfindung bezieht sich "Gewebe" auf Gewebe humaner, tierischer oder
pflanzlicher Herkunft, wobei aber insbesondere damit humanes oder
tierisches Gewebe gemeint ist. Gewebe umfasst eine biologische Zelle
oder Zellen, ein Organ oder einen Teil eines Menschen- oder Tierkörpers oder
eine aus einem menschlichen oder tierischen Körper oder einem deren Teile
entnommene Substanz und kann z.B. Knochensubstanz, Blut oder Gehirnsubstanz
sein. Es können
Gewebeproben untersucht werden, d.h. Raman-Signale gemessen werden,
die durch Belichtung mit vom Laser emittierten Licht in vitro oder
in vivo erzeugt werden. Das Gewebe wird als einer bestimmten klinischen
Diagnoseklasse angehörend
angesehen, wenn es ein oder mehrere charakteristische Merkmale besitzt,
die morphologische, genetische oder chemische Merkmale ein schließen können, ohne
darauf beschränkt
zu sein. Diese können
für einen
bestimmten pathologischen Zustand typisch sein.
-
Die
Faserspitze kann sich in oder auf dem Gewebe befinden, kann aber
auch nahe daran, z.B. wenige mm davon entfernt sein. Allerdings
kann der Abstand auch größer sein,
falls eine Linse verwendet wird, um ein Abbild des distalen Endes
der optischen Faser auf das Gewebe zu projizieren. In einigen Fällen kann
die Spitze nicht auf der Probe aufliegen, z.B. wenn die Probe durch
Glas gemessen wird. In diesem Fall kann der Abstand sogar einige
Zentimeter betragen. Die Nähe
zur Probe umfasst im Sinne der Erfindung beide oben erwähnten Möglichkeiten.
-
Im
Rahmen der Erfindung steht der Laser für jedwelche monochromatische
Lichtquelle mit genügend scharfer
Linienbreite, um die Messung des erwünschten Raman-Signals mit zureichender
Spektralauflösung zu
ermöglichen,
wie z.B. ein Laser. Die Linienbreite liegt in den meisten Fällen vorzugsweise
unter 5 cm-1. Der Lichtstrahl einer solchen
Lichtquelle wird in eine Faser eingekoppelt, und damit eine Probe
ausgeleuchtet. Das Raman-Signal einer derartigen Probe kann durch
dessen Ausleuchtung mit Licht von einer solchen Laserquelle erzeugt
werden, vorausgesetzt, dass die Probe Moleküle enthält, die molekulare Vibrationsmodi
besitzen, die zur Ramanstreuung des einfallenden Lichts beitragen
können.
Bevorzugt hat der Laser oder die Lichtquelle für Ramanmessungen eine Strahlung
oberhalb von ungefähr
600 nm, da auf diese Weise die Absorption des einfallenden Laserlichts
im Gewebe sowie die Autofluoreszenz des Gewebes auf ein Minimum
reduziert werden. Die Autofluoreszenz kann ein Störgeräusch im
Ramanspektrum hervorrufen, wodurch sich der Signal-Rauschabstand
bei der Detektion des Raman-Signals verschlechtert. Beispiele für Lichtquellen
sind z.B. Diodenlaser, He-Ne-Laser, Ti-Saphir-Laser usw.
-
Unter „Messinstrument" wird im Rahmen der
Erfindung ein Spektrometer verstanden, das eine Zusammenstellung
von einem Laser zur Erzeugung des Raman-Signals, einer Faser und
einer Detektoreinheit umfasst.
-
Das
Spektrometer kann ein Filter zum Dämpfen der Intensität der zum
Spektrometer transportierten Lichtkomponente enthalten, die dieselbe
Wellenlänge
wie das Laserlicht hat. Das Filter sollte die Intensität dieses
Lichts bevorzugt um 8 oder mehr Größenord nungen dämpfen, während es
die Intensität
des ramangestreuten Lichts im interessierenden Wellenzahlenbereich
um bevorzugt weniger als 10% dämpfen
sollte. Da der höhere
Wellenzahlenbereich des Spektrums verwendet wird, wodurch ein ausgedehnter
Wellenlängenabstand
zwischen dem Laserlicht und dem interessierenden Wellenzahlenbereich
gegeben ist, kann dies ein einfaches Farbglas-Absorptionsfilter
sein, wie z.B. das Farbglas-Filter RG 780 der Fa. Schott. Zwei solcher
in Serie geschalteter 3 mm dicker Filter, die beide im Handel erhältlich sind,
dämpfen
das Laserlicht unterhalb 725 nm um 10 Größenordnungen oder mehr, während sie
im Wesentlichen keine Dämpfung
des interessierenden Raman-Signals außer den Reflexionsverlusten
an der Glas/Luft-Grenzfläche
bewirken. Bevorzugt werden die der Lichtquelle zu- und abgewandten
Flächen
des Filters mit für
den interessierenden Wellenlängenbereich optimierten
Entspiegelungen beschichtet, um die Reflexionsverluste an der Glas/Luft-Grenzfläche klein
zu halten. So kann ein Durchlass für das Raman-Signal von über 90 %
leicht erreicht werden. Das Spektrometer besitzt vorzugsweise keine
beweglichen Teile, ist für
den Durchlass im NIR optimiert und hat bevorzugt eine Auflösung von
mindestens 8 cm-1.
-
Allerdings
kann die Fluoreszenz in einigen Fällen als Informationsquelle
zur Kennzeichnung des Gewebes erwünscht sein (siehe oben), wobei
das Raman-Signal und die Fluoreszenz der Probe gleichzeitig oder sequentiell
mit einer oder mehreren Fasern gemessen werden. In einer solchen
Ausführungsform
kann das Fluoreszenzanregungslicht Wellenlängen unter 600 nm besitzen
und liegt also im Blau- oder UV-Bereich.
-
Die
Signaldetektoreinheit umfasst vorzugsweise Detektoren wie einen
für die
Lichtdetektion im NIR optimierten Mehrkanal-CCD-Detektor. Ein Beispiel
für einen
solchen Detektor ist eine Deep-Depletion Back-Illuminated CCD-Kamera
(DU401-BRDD) der Fa. Andor-Technology (Belfast, Nordirland). Der
interessierende Spektralbereich kann z.B. mit einem Diffraktionsgitter
oder einem Prisma ausgewählt
werden. Die aufgenommenen Spektren werden bevorzugt mit Hilfe dedizierter
Software und eines Personalcomputers im Echtzeitbetrieb angezeigt
und/oder analysiert.
-
Im
Sinne dieser Erfindung wird eine Faser als eine Vorrichtung mit
einem proximalen und einem distalen Ende definiert, die fähig ist,
Licht vom proximalen zum distalen Ende zu transportieren. Der Begriff "eine Faser" umfasst eine oder
mehrere Fasern. Der Begriff "ein
faseroptischer Messkopf" umfasst
eine Faser oder ein Faserbündel.
-
Das
distale Ende des faseroptischen Messkopfs kann so geformt oder so
mit einem daran befestigten mikrooptischen Bestandteil ausgestattet
sein, dass bestimmte Ausleuchtungsrichtungen und/oder -Winkel eingestellt
und/oder dass bestimmte Einsammlungsrichtungen und/oder -Winkel
erreicht werden und/oder die belichtete Probenoberfläche und/oder
die Ausdehnung und/oder die Position des Probenvolumens, dessen
Raman-Signale bevorzugt detektiert werden, festgelegt werden. Im
Stand der Technik wird die Messung von Geweben durch Ramanspektroskopie
mittels Messköpfen
durchgeführt,
die gewöhnlich
eine Faser zur Anregung und wenigstens eine Faser, aber gewöhnlich eine
Anzahl von Fasern enthalten, um das Raman-Signal zu einem Detektor
zu transportieren.
-
Fasern
bestehen aus einem Kern und einem Mantel und gewöhnlich einer oder mehreren
Schutzbeschichtungen. Die Dicke einer solchen Schicht, die eine
oder mehrere Beschichtungen umfassen kann, kann in weiten Grenzen
variieren. In der Fachliteratur werden die den Mantel umgebende(n)
Schutzschicht(en) einer Faser als „Beschichtung" oder „Puffer" bezeichnet. Im Sinne
der Erfindung werden die den Mantel einer Faser umgebende(n) Schichten
als Faserbeschichtung bezeichnet. Manchmal wird eine Hülle vorgesehen,
um der Faser eine zusätzliche
mechanische Festigkeit zu verleihen oder um einer zu engen Biegung
der optischen Faser vorzubeugen. Eine Hülle wird als ein steifes oder
flexibles Schlauchmaterial definiert, in das die optische(n) Faser(n)
eingeführt
werden, die dadurch einen zusätzlichen
Schutz erhalten.
-
Es
wurde herausgefunden, dass einige Fasern für diese Art Messungen sehr
gut geeignet sind, da die Ramanstreuung der optischen Faser selbst
in diesem Wellenlängenbereich
im Vergleich zum Signal der Probe klein bis vernachlässigbar
ist. Daher umfasst das Messinstrument eine Faser, die im Wesentlichen
kein Raman-Signal im Spektralbereich besitzt, in dem die Signale
vorgefunden werden.
-
Im
Sinne der Erfindung, bedeutet „im
Wesentlichen" kein
Signal und ähnliche
Ausdrücke,
dass das betreffende Signal die gleiche oder eine kleinere Intensität besitzt
als das mit dem Messinstrument gemessene Gewebesignal und vom Gewebesignal
und von anderen Signalen unterscheidbar ist. Zum Beispiel bedeutet der
Ausdruck „ein
solches Signal tritt im Wesentlichen nicht auf", dass ein solches Signal eine Größenordnung kleiner
ist.
-
Ein
Beispiel für
eine bevorzugte Faser ist eine Faser mit einem Schmelzkieselsäurekern
und einem Schmelzkieselsäuremantel,
wie z.B. die Faser WF200/220A von Ceramoptec Industries Inc oder
FG-200-LCR von der Firma 3M oder gleichwertige Fasern.. Einige Fasern
sind weniger bevorzugt, wie z.B. die Faser WF200/220N von Ceramoptec
Industries Inc oder FT-200-EMR von der Firma 3M, die im interessierenden Spektralbereich
ein starkes Störsignal
aufweisen.
-
Gute
Ergebnisse werden mit faseroptische Messköpfen erhalten, bei denen der
faseroptische Messkopf wenigstens eine Faser mit einem Schmelzkieselsäurekern
niederen OH--Gehalts umfasst. Eine derartige Faser
enthält
sehr kleine Mengen OH-, wodurch die Absorption
des Lichts in der optischen Faser im nahen Infrarotbereich des Spektrums,
dem für
Ramanmessungen bevorzugten Spektralbereich, minimiert wird. Das kann
zum Beispiel ein faseroptischer Messkopf sein, bei dem der faseroptische
Messkopf wenigstens eine Faser mit einem Schmelzkieselsäurekern
und einen Schmelzkieselsäure-,
Teflon-, oder TECS-Mantel, die im nahen Infrarot hohe Transmissionen
aufweisen, enthält
und bei dem durch Verwendung eines Beschichtungsmaterials, worin
ein an sich kleines oder im Wesentlichen kein Signal im Wellenzahlenbereich
von 2500-3700 cm-1 generiert wird, oder
durch Maßnahmen
zur Herabsetzung der Generierung und/oder Detektion des Signals
der Beschichtung, die Beiträge
des Beschichtungsmaterials zum Störsignal klein gehalten werden.
-
In
einer besonderen erfindungsgemäßen Ausführungsform
betrifft die Erfindung ein Messinstrument gemäß den beigefügten Ansprüchen. Innerhalb
eines oder mehrerer Teile des Spektralbereichs von 2500 cm-1-2700 cm-1 ausstrahlende
Lichtquellen können
der faseroptische Messkopf, z.B. der Kern, der Mantel oder die Beschichtung
eines solchen faseroptischen Messkopfs oder die darin enthaltene(n)
Faser(n) sein. Die Formulierung „misst kein Raman-Signal" bedeutet, dass die
Detektoreinheit entweder kein derartiges Signal empfängt, oder
kein derartiges Signal detektiert, oder beides.
-
In
einer Variante dieser Ausführungssform
misst die Detektoreinheit wesentlich keine von anderen Quellen als
das Gewebe generierte Fluoreszenz. Hierin kann die Fluoreszenz z.B.
eine von dem Kern, dem Mantel oder dem Beschichtungsmaterial stammende
Fluoreszenz sein.
-
Es
wurde zum Beispiel gefunden, dass eine Polyimidbeschichtung (wie
z.B. bei der von Fiberguide Industries, Stirling, New Jersey, USA
vermarkteten SFS200/21G/233 RTF-Faser verwendet), bei Verwendung von
720 nm Laserlicht und einer Faser von 2 m Länge, zu einem starken Fluoreszenz-Störgeräusch im
Vergleich zum von Gewebe erhaltenen Raman-Signal führte.
-
Ein
weiteres Beispiel ist WF200/220 P (Ceramoptec), eine Faser mit einem
Schmelzkieselsäurekern, einem
Schmelzkieselsäuremantel
und einer Polyimidbeschichtung die auch ein starkes Fluoreszenzstörsignal aufweist.
Aus diesem Grund sind polyimidbeschichtete Fasern für diese
Erfindung weniger geeignet.
-
In
einer Ausführungsform
kann das Merkmal, dass die Detektoreinheit im Wesentlichen kein
von anderen Quellen als vom Gewebe erzeugtes Raman-Signal misst,
dadurch erreicht werden, dass zur Einsammlung des Lichts eine oder
mehrere Fasern eingesetzt werden, die innerhalb eines oder mehrerer
Teile des Spektralbereichs von 2500-3700 cm-1 im
Wesentlichen kein Raman-Signal besitzen. Beispiele geeigneter Kern-
und Mantelmaterialien sind Schmelzkieselsäure und verschiedene Formen
dotierter Schmelzkieselsäure.
Beispiele für
ungeeignete Materialien sind ZBLAN (z.B. bei den von INO, Sainte-Foy,
Quebec, Canada vermarkteten Fasertypen Z100FJ, Z100FV, Z120A1),
das eine verhältnismäßig starke
Fluoreszenz aufweist, wenn rotes oder Nahinfrarotlicht sie durchquert
(z.B. 720 nm), und optische fasern aus Kunststoff, wie jene aus PMMA
(Polymethylmetacrylat) oder Polystyrol hergestellten und andere,
die im Bereich hoher Wellenzahlen ein starkes Raman-Signal aufweisen.
Aus einem Schmelzkieselsäurekern
und einem Teflonmantel bestehende Fasern (wie z.B. die von Polymicro,
Phoenix Arizona, USA vermarkteten Fasern vom FLU-Typ) sind geeignet,
da Teflon, wie die Schmelzkieselsäure, im Bereich hoher Wellenzahlen
kein Raman-Signal aufweist. Fasern auf Saphirbasis sind wegen der
gewöhnlich
vorhandenen Chromkontamination weniger geeignet, da diese im Rot-
und Nahinfrarotbereich des Spektrums Luminiszenz hervorrufen können. Solche
optische Fasern müssen
getestet werden, um fest zustellen, ob die Fluoreszenz des Materials
genügend
schwach ist, um gute Ramanspektren von Geweben zu ermöglichen.
-
Die
auf den Mantel der optischen Faser aufgetragenen Beschichtungsmaterialien
weisen kein Raman-Signal im Bereich hoher Wellenzahlen auf. Beispiele
dafür sind
Ausführungen,
bei denen die Beschichtung der optischen Faser eine oder mehrere
Teflonbeschichtungen und Metallbeschichtungen (wie z.B. Aluminium,
Kupfer oder Gold) umfasst. Metallbeschichtete Fasern sind im Handel
z.B. von Fiberguide Industries (Stirling, New Jersey, USA) und Oxford
Electronics (Four Marks, England) erhältlich.
-
Der
Einsatz anderer Beschichtungsmaterialien als die oben genannten
ist möglich,
erfordert aber im Allgemeinen zusätzliche Maßnahmen zur Herabsetzung der
Intensität
des Ramanstörgeräuschs, das
in solchen Beschichtungsmaterialien erzeugt wird. Solche Maßnahmen
müssen
die Lichtmenge auf ein Minimum herabsetzen, die die fasergebundenen
Modi verlässt
um in das Beschichtungsmaterial zu treten und es zu durchqueren,
wodurch das Raman-Signal der Beschichtung erzeugt wird, und müssen sicherstellen,
dass nur das Licht, das aus dem Kern der optischen Faser emmitiert
und sich innerhalb der numerischen Apertur der optischen Faser befindet,
den Ramandetektor erreicht. Daher kann in einer weiteren Ausführungsform
das Merkmal, dass die Detektoreinheit im Wesentlichen kein von anderen
Quellen als vom Gewebe erzeugtes Raman-Signal misst, dadurch erreicht
werden, dass eine Detektoreinheit zum Einsatz kommt, die im Wesentlichen
nur das vom Kern der optischen Faser erhaltbare Signal misst.
-
Das
kann zum Beispiel erreicht werden, indem ein erfindungsgemäßes Messinstrument
eingesetzt wird, wobei das Laserlicht (nur) in den Zentralbereich
des Messkopfs und bei einer kleinstmöglichen numerischen Apertur
eingekoppelt wird. Auf diese Wiese wird das Laserlicht vorwiegend
in Modi niedriger Ordnung der optischen Faser gebunden. Solche Modi
sind am wenigsten verlustbehaftet und daher zur geringsten Laserbelichtung
von Beschichtungsmaterial und dementsprechend zur geringsten Generierung
von Raman-Signal der Beschichtung führen.
-
In
einer weiteren Ausführung
wird ein Messinstrument eingesetzt, bei dem die Stirnfläche der
optischen Faser, wo das Laserlicht in die Faser eingekoppelt wird,
zur Herab setzung der Unebenheiten der Oberfläche abgeschliffen ist, sodass
keine mikroskopisch sichtbaren Unebenheiten übrig bleiben. Das kann durch Verwendung
von allgemein bekannten im Handel erhältlichen Vorrichtungen zum
Schleifen von Fasern erreicht werden. Dadurch wird die Streuung
des Laserlichts an der Stirnfläche
der optischen Faser in Richtungen herabgesetzt, in denen das Laserlicht
nicht in eine gebundene Modus eingekoppelt werden kann, sodass die
Belichtung des Beschichtungsmaterials durch Laserlicht klein gehalten
wird. In einer weiteren Ausführungsform besteht
eine Maßnahme
darin, eine zweite Beschichtung aufzutragen, wobei die Faser eine
erste und eine zweite Beschichtung umfasst, die erste Beschichtung
als Beschichtung des Mantels und die zweite als Beschichtung der
ersten Beschichtung, wobei die zweite Beschichtung ein das Laserlicht
absorbierendes Material umfasst. In einer weiteren Ausführungsform
bezieht sich die Erfindung auf eine solche zweite Beschichtung,
wobei die optische Faser eine erste und eine zweite Beschichtung
umfasst, die erste Beschichtung als Beschichtung des Mantels und
die zweite als Beschichtung der ersten Beschichtung, wobei die zweite
Beschichtung aus einem Material besteht, das einen höheren Brechungsindex
besitzt als das erste Beschichtungsmaterial, wie z.B. eine Kombination
von Acrylat als erste Beschichtungslage und schwarzem Nylon als zweite
Beschichtung (wie in der von FiberTech, Berlin, Deutschland hergestellten
Faser AS200/220/IRAN). Diese Maßnahme
dämpft
die vielfachen Reflexionen des Laserlichts an der Grenzfläche zwischen
der ersten Beschichtungs und der Luft. Stattdessen tritt das Licht
in die zweite Beschichtung, wo es absorbiert wird. Das begrenzt
die Weglänge
des Laserlichts durch das Beschichtungsmaterial und dadurch die
Intensität
des Raman-Signals, das von der Beschichtung erzeugt wird.
-
Eine
weitere Maßnahme
besteht darin, dafür
zu sorgen, dass die Faser nicht gebogen wird, insbesondere, dass
sie keine Krümmung
nahe an oder unter dem vom Hersteller angegebenen minimalen Krümmungsradius
erfährt.
Die Biegung führt
zum Austritt des Lichts aus den gebundenen Modi. Das ist eine bekannte
Erscheinung, die aber für
diese Erfindung die zusätzliche
negative Auswirkung der Erzeugung eines Raman-Signals der Beschichtung
hat. Um eine minimale Krümmung
der Faser zu erreichen, kann diese in ein steifes oder flexibles
Rohr, z.B. eine Edelestahl-Monocoil (der Fa. Fiberguide Industries,
Sterling, New Jersey, USA) eingelegt werden, welche die Krümmung mechanisch
begrenzt. Die Möglichkeit,
ein solches schlauchförmiges Material
einzusetzen, ist natürlich
von möglichen
Beschränkungen
abhängig,
die von der speziellen Anwendung zur Gewebeanalyse gegeben sind.
-
Die
Detektion des Signals wird am besten so durchgeführt, dass die Signaldetektoreinheit
im Wesentlichen das Signal detektiert, das aus dem Kern der optischen
Faser unter einem Winkel innerhalb einer numerischen Apertur der
optischen Faser austritt. Das kann durch so genannte Raumfiltration
erzielt werden, wobei ein bildgebendes System eingesetzt wird, um
vor der Detektion die Stirnfläche
der Faser auf einem Membran abzubilden. Die Größe des Membrans muss kleiner
oder gleich dem Abbild des Faserkerns sein. Auf diese Weise wird
nur das Licht, das die Stirnfläche
der Faser durch den Kern verlässt,
durch das Membran durchgelassen. Zur Begrenzung der numerischen
Apertur des bildgebenden Systems auf die numerische Apertur der optischen
Faser, kann eine zweite Membran vorgesehen werden, die ggf. zwischen
der Stirnfläche
der Faser und dem ersten bildgebenden Element angeordnet wird.
-
Eine
alternative Maßnahme
besteht darin, eine Maske über
die Stirnfläche
der Faser zu setzen, die nur den Faserkern frei lässt.
-
Eine
zusätzliche
Maßnahme
besteht in der Entfernung des Beschichtungsmaterials neben der Stirnfläche der
Faser, wo das Licht in die Faser eingekoppelt wird, auf einer Länge von
5 mm oder mehr, wonach der Mantel mit schwarzem Epoxidharz (z.B.
Epotek der Fa. Billerica, Massachusetts, USA) beschichtet wird. Dadurch
wird das gesamte Licht absorbiert, das durch den Mantel in Richtung
der Signaldetektoreinheit fließt, bevor
dieses die Stirnfläche
der Faser erreicht. Daher betrifft die Erfindung in einer Ausführungsform
auch ein Messinstrument und dessen Verwendung, wobei die optische
Faser eine das Laserlicht absorbierende Beschichtung auf der Faserpitze
umfasst, wobei die Faserspitze zur Signaldetektoreinheit weist.
-
In
einer besonderen Ausführungsform,
kann die Faser mit einem Anschluss (z.B. mit einem FC-Konnektor)
zum Verbinden der Faser mit der das Laserlicht einkoppelnden Optik
und mit der der Signaldetektion zugeordneten Optik. Dadurch wird
ein einfaches Auswechseln der Fasern ohne erneutes Ausrichten des
Systems möglich.
Die einfache Auswechslung der Fasern sowie die niedrigen Kosten
fördern
die Verwendung von faseroptischen Messköpfen zur Gewebekennzeichnung
durch Ramanspektroskopie im Bereich hoher Wellenzahlen im Einwegeinsatz.
Das bietet die vorteilhafte Möglichkeit,
einen Messkopf sterilisieren und verpacken zu können, der dann erst gleich
vor dem Einsatz zur Gewebekennzeichnung der Packung entnommen wird. Nach
der Untersuchung wird der Messkopf weggeworfen, wodurch jedes Risiko
der ungenügenden
Sterilisierung vor dem nächsten
Gebrauch entfällt.
-
Wegen
der Rayleigh-Streuung des Laserlichts im Kern und Mantel der optischen
Faser kann die Laserbelichtung des Beschichtungsmaterials nicht
vollkommen verhindert werden. Die oben beschriebenen Mechanismen
die zur Laserbelichtung des Beschichtungsmaterials führen, gestatten
auch den erneuten Eintritt eines kleinen Teils des im Beschichtungsmaterial
erzeugten Raman-Signals in einen gebundenen Modus der optischen
Faser, wodurch nicht mehr verhindert werden kann, dass dieses Raman-Störgeräusch der
Faser zusammen mit dem Raman-Signal des zu untersuchenden Gewebes
detektiert wird.
-
Daher
wird allgemein Beschichtungsmaterial bevorzugt, in dem kein Raman-Signal
im Bereich hoher Wellenzahlen erzeugt werden kann, wie dies bei
den oben erwähnten
Metallbeschichteten Fasern der Fall ist.
-
Werden
die zusätzlichen
Maßnahmen
zum Teil getroffen, so können
andere Beschichtungsmaterialien verwendet werden. Ein Beispiel dafür ist ein
Messinstrument, in dem die Beschichtung der optischen Faser Acrylat,
Tefzel, TECS oder Silikon enthält.
So könnte
das Ramanstörsignal
der optischen Faser bei acrylatbeschichteten Fasern (wie z.B. die
von FiberTech, Berlin, Deutschland hergestellte Faser AS200/220/IRAN
und die von Fiberguide Industries, Sterling, New Jersey, USA vermarktete
Faser AFS200/220 Y) durch die Verwendung eines Lasers, der Laserlicht
der Wellenlänge
720 nm mit einer Laserleistung von 100 mW erzeugt, und bei einer
Signalerfassungszeit von bis zu 10 Sekunden, bis unter die Detektionsgrenze
reduziert werden.
-
Eine
solche Laserleistung und Signalerfassungszeit sind ausreichend um
Ramanspektren hoher Qualität
im Bereich hoher Wellenzahlen von Geweben zu erhalten, wenn das
von der optischen Faser erzeugte Raman-Signal in ein Ramanspektrometer
mit wenigstens 25% Signaldurchsatz eingekoppelt wird, das einen für das Nahinfrarot
optimierten Charge-Coupled-Device-(CCD)-Detektor für die Detektion
des Raman-Signals ver wendet (wie z.B. eine von der Fa. Andor Technologies,
Belfast, UK erhältliche
Back-Illuminated Deep Depletion CCD-Kamera).
-
Weitere
nicht einschränkende
Beispiele für
geeignete Fasern sind FG-200-LCR (welches eine Faser mit einem Schmelzkieselsäurekern
(mit einem Durchmesser von 200 μm),
einem Schmelzkieselsäuremantel mit
einem Durchmesser von 240 μm,
einer TECS-Beschichtung mit einem Durchmesser von 260 μm und einem
Tefzel-Buffer mit einem Durchmesser von 400 μm), FT-200-EMT (auch von der
Firma 3M), eine Faser mit einem Mantel aus TECS, und WF 200/240
A, eine Faser mit Schmelzkieselsäurekern
und -mantel mit Acrylatbeschichtung (von der Fa. Ceramoptec).
-
Silikonbeschichtete
Fasern sind weniger bevorzugt. Es wurden zahlreiche Silikonbeschichtete
Fasern getestet. Obwohl das Störsignal
von Silikon stark gemindert werden kann, bleibt ein gewisses Störsignal
von Silikon bestehen. Das kann zu begrenzter Verwendbarkeit für Messungen
führen,
bei denen sehr kleine Unterschiede zwischen den Ramanspektren wichtig
sind. Beispiele für
Fasern, die ein nachteiliges Störsignal
im Spektralbereich von 2500-3700 cm-1 hervorrufen,
sind WF 200/240 BN und WF200/240 BT, welche Fasern mit einem Schmelzkieselsäurekern,
einem Schmelzkieselsäuremantel
und einem Silikon-Buffer mit einer Beschichtung aus schwarzem Nylon
bzw. schwarzem Tefzel sind (Fa. Ceramoptec).
-
Folglich
kann erfindungsgemäß die Bereitstellung
einer oder mehrerer Fasern zur Lichteinsammlung, die kein oder im
Wesentlichen kein Raman-Signal in wenigstens einem Abschnitt des
Spektralbereichs von 2500 bis 3700 cm-1 aufweisen,
in einem Messinstrument erfolgen, indem der faseroptische Messkopf
wenigstens eine Faser umfasst, oder indem der faseroptische Messkopf
wenigstens eine einen Schmelzkieselsäurekern und einen Teflon- oder
TECS-Mantel enthaltende optische Faser umfasst oder ein Beschichtungsmaterial verwendet
wird, in dem ein an sich schwaches oder im Wesentlichen kein Signal
im Wellenzahlenbereich von 2500 bis 3700 cm-1 erzeugt
wird, oder indem die Beschichtung der Faser eine oder mehrere Teflon-
und Metallbeschichtungen umfasst, oder indem die Detektoreinheit
im Wesentlichen nur das vom Kern der Faser erhältliche Signal misst, oder
indem die Faser eine erste und eine zweite Beschichtung umfasst,
wobei die erste Beschichtung als Beschichtung des Mantels und die
zweite Beschichtung als Beschichtung der ersten Beschichtung dient,
wobei die zweite Beschichtung ein Material mit höherem Brechungsindex als das
erste Beschichtungsmaterial umfasst, oder wobei die optische Faser
eine das Laserlicht absorbierende Beschichtung der optischen Faserendspitze
umfasst, wobei die optische Faser eine das Laserlicht absorbierende
Beschichtung der Faserendspitze umfasst, oder indem die Stirnfläche der
optischen Faser an der Stelle, an der das Laserlicht in die Faser
eingekoppelt wird, abgeschliffen wird, oder Kombinationen dieser
Merkmale.
-
Es
ist selbstverständlich,
dass die Faser genügend
Transmission für
das Laserlicht und für
das interessierende Raman-Signal besitzt. Eine bevorzugte Faser
besitzt eine Transmission für
die Wellenlängen
des Laserlichts und des Raman-Signals von mindestens 50%. Besonders
bevorzugt mindestens 90%. Zur Erhöhung der Lichttransmission
wird bevorzugt das proximale Ende der Faser, wo das Laserlicht in
die Faser eingekoppelt wird, mit einer Entspiegelungsschicht versehen,
welche für
die die Laserwellenlänge
und die für
die Raman-Signalmessung geeigneten Wellenlängen umfassenden Wellenlängenbereiche
optimiert ist.
-
Der
faseroptische Messkopf kann ebenfalls ein Faserbündel umfassen, in dem die Fasern
nicht beschichtet sind. Die Fasern können in einen faseroptischen
Messkopf dicht verpackt werden.
-
In
einer weiteren Ausführungsform
ist das Messinstrument ein Messinstrument, das am distalen Ende des
faseroptischen Messkopfs einen Optikbaustein enthält, der
zur Festlegung des Orts und/oder der Probenausdehnung dient, die
ausgeleuchtet und/oder von der das zurück gestreute Licht eingesammelt
wird.
-
Unter
Plaque oder atherosklerotischer Plaque wird im Sinne der Erfindung
ein pathologischer Zustand verstanden, der den Aufbau von Fettstoffen
in der Wand einer Arterie umfasst. Sie kann in einer beliebigen Arterie
des Körpers
vorkommen, am häufigsten
aber in der Koronararterie, den Halsschlagadern, der Aorta, den
Nierenarterien und den distalen Beinarterien. Die Plaque oder die
atherosklerotische Plaque in und/oder auf Geweben weist ein oder
mehrere charakteristische Raman-Signale im Spektralbereich von 2500-3700
cm-1 auf. Solche Raman-Signale werden besonders
im Spektralbereich zwischen 2700 und 3100 cm-1 vorgefunden.
-
In
einer bevorzugten Ausführungsform
umfasst das Messinstrument eine Faser, die im Wesentlichen kein
Raman-Signal im Spektralbereich besitzt, in dem die für die atherosklerotische
Plaque charakteristischen Signale vorgefunden werden. Solche Raman-Signale
werden besonders im Spektralbereich zwischen 2700 und 3100 cm-1 gefunden. Die Erfindung betrifft ebenfalls
ein Messinstrument, worin die Faser im Wesentlichen kein Raman-Signal
in dem Spektralbereich besitzt, in dem Raman-Signale vorkommen,
die characteristisch für eines
oder mehrere Elemente der Gruppe bestehend aus Lipidpools, fibrösen Kappen
und/oder darin anwesenden Makrophagen oder darin enthaltenem Cholesterin
sind. Die Stellung der Raman-Signale dieser Verbindungen kann von
einem Fachmann durch den Vergleich der Ramanspektren von gesundem
Gewebe mit betroffenem oder solche Verbindungen enthaltendem Gewebe
abgeleitet werden. Unter „im
Wesentlichen kein Raman-Signal in einem oder mehreren Abschnitten
eines Spektralbereichs" wird
verstanden, dass die Intensität
des detektierten, von der optischen Faser erzeugten Störgeräuschs in
wenigstens einem Teil des Spektralbereichs, in dem das kennzeichnende
Raman-Signal vorgefunden wird, derselben Größenordnung oder kleiner ist
als das Raman-Signal der untersuchten Probe und dass das/die Raman-Signal(e)
der Probe leicht von diesem Störgeräusch unterschieden
werden kann/können.
Das Messinstrument kann im gesamten Spektralbereich zwischen 2500
und 3700 cm-1, bevorzugt zwischen 2700 und
3100 cm-1 messen, aber es ist ebenfalls
möglich,
einen Teil oder Teile dieses Spektralbereichs für die Messungen und die Analyse
und/oder Diagnostik auszuwählen.
-
In
einer Ausführungsform
besitzt das Messinstrument eine Faser, die im Wesentlichen kein
Raman-Signal im Spektralbereich besitzt, in dem die für das Krebsgewebe
oder Vorkrebs-Gewebe, insbesondere für den Gehirnkrebs charakteristischen
Signale vorgefunden werden. Solche Raman-Signale werden im Spektralbereich
von 2500-3700 cm-1, insbesondere im Spektralbereich
von 2700-3100 cm-1 vorgefunden. Mit „Krebsgewebe" ist Gewebe gemeint,
das Krebszellen enthält.
Vorkrebs-Gewebe ist als Gewebe zu verstehen, das ein anormales Gewebe
ist, das eine Vorstufe des Krebsgewebes darstellt.
-
Um
eine rasche und/oder automatische Analyse zu ermöglichen, umfasst das Messinstrument
gewöhnlich
eine Einheit zur Signalanalyse, welche das erfasste Raman-Signal
analysiert. Die Analyse umfasst einen Algorithmus, der Daten bereitstellt,
die z.B. die Molekularzusammensetzung der Probe und/oder die klinische
Diagnoseklasse, dem die Probe angehört, betreffen.
-
Die
Bestimmung der Molekularenzusammensetzung z.B. der Gefäßwand oder
der atherosklerotischen Plaque wird z.B. durch ein Kleistquadrat-Anpassungsverfahren
durchgeführt,
in dem das gemessene Spektrum an einen Satz von Spektren von Verbindungen
angepasst wird, die bekannterweise in der Gefäßwand oder in der Plaque vorhanden
sein können. Über die
Anpassungskoeffizienten werden dann quantitative Informationen betreffend
die Molekularzusammensetzung erhalten. Alternativ kann zur genauen
Bestimmung der molekularen Zusammensetzung ein auf der Methode der
partiellen kleinsten Quadrate basierender Algorithmus entwickelt
werden.
-
Zur
Detektion von Krebsgewebe können
verschiedene bekannte variate statistische und/oder Neuronalnetz-Analyseverfahren
wie die lineare Diskriminantenanalyse und die Analyse auf Grund
von künstlichen Neuronalnetzen
eingesetzt werden. Diese Analyse- und
Diagnoseverfahren sind im Stand der Technik bekannt, doch sind die
speziellen Parameter an die jeweils zu untersuchende Gewebeart oder
-probe anzupassen.
-
Ein
solches Instrument, das eine Signalanalyseeinheit umfasst, ist sehr
gut geeignet für
die Diagnose von Krankheiten, wie z.B. von atherosklerotischer Plaque
und/oder von Krebs- oder Vorkrebs-Gewebe. Diese Signalanalyseeinheit
kann Informationen über
die Molekularzusammensetzung der normalen und atherosklerotischen
Blutgefäßwand, die
klinische Diagnoseklasse einer atherosklerotischen Läsion, die
Dicke einer fibrösen
Kappe, das Vorhandensein von Makrophagen in der fibrösen Kappe,
das Vorhandensein und die Größe und/oder
Zusammensetzung eines Lipidpools, das Vorhandensein von Cholesterin
(als Ester), das Vorhandensein von Krebs- oder Vorkrebs-Gewebe,
von einem vitalen Tumor oder von Nekrose bereitstellen, und kann entsprechende
spezifische Signale hierzu liefern.
-
Die
Erfindung betrifft auch die Verwendung des Messinstruments zur Messung
eines Raman-Signals einer Gewebeprobe, bevor sie reseziert oder
biopsiert wird, oder kurz nach der Biopsie bzw. Resektion, bevorzugt
einer exzisierten, biopsierten oder einem menschlichen oder tierischen
Körper
entnommenen Gewebeprobe. Nach einem anderen Aspekt wird es zur Auswahl
von Gewebe für
die Biopsie oder Resektion verwendet.
-
Nach
einem weiteren Aspekt der Erfindung umfasst sie ein Messinstrument
gemäss
dem beigefügten Anspruch
1.
-
In
einer Ausführungsform
umfasst der faseroptische Messkopf eine Faser, die sowohl das Licht
zum Gewebe hin transportiert als auch das vom Gewebe zurück gestreute
Licht einsammelt und das eingesammelte Licht weg vom Gewebe zur
Signaldetektoreinheit transportiert, wobei die Faser im Wesentlichen
kein Raman-Signal in einem oder mehreren Abschnitten des Spektralbereichs
von 2500-3700 cm-1 aufweist.
-
Nach
einem weiteren Aspekt der Erfindung umfasst sie ein Verfahren zur
Messung eines Raman-Signals einer Gewebeprobe, wobei ein erfindungsgemäßes Messinstrument
gemäß dem beigefügten Anspruch 15
verwendet wird.
-
Die
Erfindung umfasst ebenfalls ein Verfahren zur Erzeugung und Messung
eines Raman-Signals gemäß dem beigefügten Anspruch
14.
-
In
einer weiteren Ausführungsform
betrifft die Erfindung ein Verfahren zum Erzeugen und Messen eines
Raman-Signals eines Gewebes, umfassend die Bereitstellung eines
Lasers, einer Signaldetektoreinheit zum Messen des Raman-Signals
sowie eines faseroptischen Messkopfs, worin der faseroptische Messkopf eine
oder mehrere aus einem Kern, einem Mantel und gegebenenfalls einer
Beschichtung bestehende optische Fasern zum Transport des Laser-Lichts
zum Gewebe hin und zur Einsammlung des vom Gewebe zurück gestreuten
Lichts sowie zum Transport des eingesammelten Lichts weg vom Gewebe
zur Signaldetektoreinheit enthält,
wobei der Transport des Laser-Lichts durch die wenigstens eine optische
Faser, die Einsammlung des Raman-Signals des Gewebes durch die wenigstens
eine optische Faser und die Detektion des Raman-Signals in einer
Signaldetektoreinheit geschieht, wobei die zur Lichteinsammlung
bestimmte(n) Faser(n) im Wesentlichen kein Raman-Signal in wenigstens
einem Abschnitt des Spektralbereichs von 2500 bis 3700 cm-1 aufweisen, und wobei die Detektoreinheit
das Raman-Signal in diesem Bereich erfasst. In einer Variante dieser Ausführungsform
betrifft die Erfindung ein Verfahren umfassend das Senden des Laserlichts
durch dieselbe Faser, die auch das Raman-Signal einsammelt, wobei
eine optische Faser verwendet wird, die im Wesentlichen kein Raman-Signal
in einem oder mehreren Abschnitten des Spektralbereichs von 2500-3700
cm-1 aufweist.
-
In
einer besonderen Ausführungsform
ist das oben genannte Verfahren ein Verfahren zur Analyse von Gewebe
durch das Messen eines Raman-Signals, umfassend das Senden des Laserlichts
durch ein Ende der optischen Faser, wobei das andere Ende der optischen
Faser in das interessierende Gewebe hinein, in Berührung damit
oder sehr nahe daran gebracht wird, das von der Probe zurück gestreute
Signal über
eine optische Faser eingesammelt und das Raman-Signal von einer
Signaldetektoreinheit detektiert wird, dadurch gekennzeichnet, dass
das Laserlicht durch dieselbe optische Faser gesendet wird, die
auch das Raman-Signal einsammelt und dadurch, dass in diesem Verfahren
eine Faser eingesetzt wird, die im Wesentlichen kein Raman-Signal
in einem oder mehreren Abschnitten des Spektralbereichs von 2500-3700
cm-1 aufweist. Falls erforderlich, z.B.
zur Erhöhung
des Signal-Rauschabstands, werden mehrere Ramanmessungen des untersuchten
Gewebes durchgeführt.
-
Nach
dem erfindungsgemäßen Verfahren,
wird das Signal der Detektoreinheit zu einer Signalanalyseeinheit
gesendet, die das erfasste Signal analysiert, wobei die Analyseeinheit
einen Algorithmus umfasst, der Daten betreffend die Molekularzusammensetzung
der Probe und/oder die klinische Diagnoseklasse, der die Probe angehört, liefert.
-
Zur
Analyse oder zur Erstellung einer Diagnose können zahlreiche Verfahren zur
Ableitung von Information herangezogen werden. Zum Beispiel umfasst
die Erfindung ein Verfahren, worin vor der Messung des interessierenden
Gewebeabschnitts, Messungen an normalerweise im interessierenden
Bereich angetroffenem Gewebe durchgeführt werden. Sie umfasst aber
auch ein Verfahren, worin vor dem Scannen des interessierenden Gewebebereichs,
Messungen an von der nachzuweisenden Krankheit betroffenem(n) Gewebe(n) im
interessierenden Gewebebereich und in demselben Spektralbereich
oder Abschnitt(en) dieses Spektralbereichs vorgenommen wird. Daher
umfasst sie ein Verfahren zur Wertung eines vom interessierenden
Gewebeabschnitt erhaltenen Raman-Signals, um festzustellen, ob das
Raman-Signal von normalem Gewebe oder von krankem Gewebe stammt.
Ein Verfahren zur Einschätzung
der Eignung eines Fasertyps zur Messung des Raman-Signals von Gewebe
umfasst
- – den
Gebrauch eines erfindungsgemäßen Messinstruments,
- – die
Durchführung
einer Messung, ohne dass ein Gewebe am distalen
- – Ende
der optischen Faser vorhanden ist,
- – die
Durchführung
einer Messung beim Vorhandensein eines Gewebes am distalen Ende
der optischen Faser,
- – den
Vergleich der Spektren miteinander, die mit bzw. ohne Vorhandensein
von Gewebe am distalen Ende der optischen Faser erzielt wurden,
und
- – die
Entscheidung, ob die optische Faser zur Messung eines Raman-Signals
eines Gewebes geeignet ist.
-
Eine
Faser ist geeignet, wenn das Raman-Signal des Gewebes vom Raman-Signal
der optischen Faser unterscheidbar ist (falls ein solches Raman-Signal
der optischen Faser vorhanden ist).
-
Gemäß einem
Verfahren zur Einschätzung
der Eignung eines Fasertyps zur Messung von Raman-Signalen von Gewebe,
wird eine Gewebeprobe vor der Messung exzisiert, biopsiert oder
einem menschlichen oder tierischen Körper entnommen, wobei das Raman-Signal
der optischen Faser für
die Probe bzw. für
eine Leerprobe gemessen wird, und wobei die Raman-Signale der Probe
und der Leerprobe miteinander verglichen werden.
-
Das
erfindungsgemäße Verfahren
kann zur Diagnose humanen oder tierischen Gewebes der Blutgefäßwand, zur
Diagnose von humanem oder tierischem Gewebe auf das Vorhandensein
von Dysplasien, zur Bestimmung der Molekularzusammensetzung normaler
und atherosklerotischer Blutgefäßwände, zur
Bestimmung der klinischen Diagnoseklasse einer atherosklerotischen
Läsion,
der Dicke der fibrösen
Kappe, des Vorhandenseins, der Größe und/oder Zusammensetzung
eines Lipidpools, des Vorhandenseins von Cholesterin (als Ester),
des Vorhandenseins von anormalem Krebs- oder Vorkrebs-Gewebe, eines vitalen
Tumors oder von Nekrose eingesetzt werden.
-
Das
erfindungsgemäße Verfahren
kann auch zur Einschätzung
der Wirkung von Arzneimitteln, Nahrung oder Diätnahrung auf krankes oder gesundes
Gewebe eingesetzt werden.
-
Das
erfindungsgemäße Verfahren
und das erfindungsgemäße Messinstrument
können
ebenfalls zur Hautdiagnose und Hautklassifizierung, wie z.B. zur
objektiven Hautklas sifizierung eingesetzt werden. Es bestehen bedeutende
Unterschiede zwischen den Ramanspektren bei hohen Wellenzahlen von
alter Haut, junger Haut und atopischer Haut. Diese Unterschiede
können
auf Unterschiede zwischen den relativen Konzentrationen von Proteinen,
Lipiden und Wasser zurückgeführt werden.
Die Ramanspektroskopie unter Verwendung von optischen Fasern bei
hohen Wellenzahlen besitzt daher die Möglichkeit, auf objektive Weise
verschiedene Hauttypen oder Hautkrankheiten zu unterscheiden. Diese
Information ist für
das Entwickeln und Prüfen
von Körperpflegeprodukten
und pharmazeutischen Produkten zur topischen Anwendung wertvoll,
sowie für
die auf den individuellen Kunden oder Patienten optimierte Auswahl
solcher Produkte, da verschiedene Hauttypen unterschiedlich auf
solche Produkte reagieren oder unterschiedliche Formulierungen zur
Erreichung einer erwünschten
Wirkung benötigen
können.
-
In
der Erfindung bezieht sich „Licht,
das vom Gewebe zurück
gestreut wird" auf
die Ramanstreuung des Gewebes. Das schließt nicht aus, dass das Gewebe
selbst auch Fluoreszenz infolge der Laseranregung aufweist.
-
Die
durch den Einsatz des Instruments erhaltenen Ergebnisse werden allgemein
nicht zu einem Resultat führen,
das sofort das Treffen einer Entscheidung und/oder einen Diagnoseschluss
ermöglicht.
Ebenfalls umfassen die erfindungsgemäße Verwendung und das erfindungsgemäße Verfahren
nicht alle für
die Diagnose erforderlichen Schritte und werden hauptsächlich oder
ausschließlich
Interimergebnisse liefern. Daher kann „Diagnose" im Sinne der Erfindung die Bedeutung
einer Analyse, die keine unmittelbare Diagnose ermöglicht, oder
einer Analyse, die eine unmittelbare Diagnose ermöglicht,
haben.
-
Beispiele
-
Beispiel 1. Raman-Mapping einer atherosklerotischen
Arterie.
-
Dieses
Experiment belegt die Möglichkeiten
der Ramanspektroskopie im erfindungsgemäßen Spektralbereich zur Untersuchung
der atherosklerotischen Plaque.
-
Die
zur Erhaltung der in 1 gezeigten Raman-Map
verwendete Probe aus einer humanen Koronararterie wurde bei der
Autopsie erhalten (weniger als 24 Std post mor tem). Sie wurde in
flüssigem
Stickstoff blitzgefroren und bei -80°C bis zur Verwendung aufbewahrt.
Für die
Ramanmessungen wurde eine 20 mm dicke Kryosektion in ein Calciumfluorid
(CaF2) Fenster gelegt (Fa. Crystran UK)
und passiv bis zur Erreichung der Raumtemperatur erwärmt. Nach
den Ramanmessungen wurde sie nach einem Standardverfahren mit Hematoxylin
und Eosin gefärbt.
-
Zur
Einsammlung der Ramanspektren wurde das 719 nm Laserlicht eines
von einem Argon-Ionen-Laser optisch gepumpten Titan: Saphir-Lasersystems
(Fa. Spectra Physics, Mountain View, CA) verwendet. Das eingesetzte
Ramanmikrospektrometersystem wurde eingehend in Van de Poll SWE,
Bakker Schut TC, Van der Laarse A, Puppels GJ "In Situ Investigation of the Chemical
Composition of Ceroid in Human atherosclerosis by Raman Spectroscopy" J. Raman spectrosc.
33:544-551 (2002) beschrieben. Ein 80x NIR-optimiertes Objektiv
(Fa. Olympus MIR-plan 80x/0.75, Japan) mit einer Arbeitsdistanz
von ungefähr
1,6 mm wurde eingesetzt, um das Laserlicht auf die Koronararteriensektion
zu fokussieren, und das von der Gewebeprobe zurück gestreute Licht einzusammeln.
Zum automatischen Scannen der Gewebesektionen wurde das Mikroskop
mit einer motorisierten computergesteuerten Probenbühne ausgestattet.
Die Pixelfläche
wurde bei jeder Messung in beide Richtungen durch den Laserfokus
gescannt, um ein mittleres Ramanspektrum des gesamten Pixels zu
erhalten. Die Aufnahme des Ramanspektrums und die mikroskopische
Bewegung der Probenbühne
war durch Grams/32 Spectral Notebase Software (Galactic Industries
Corp., Salem, NH) computergesteuert. Die Laserleistung unter dem
Mikroskopobjektiv betrug ca. 40 mW.
-
Das
CaF2-Fenster wurde unter dem Mikroskop angeordnet.
Die computergesteuerte Probenbühne wurde über ein
zweidimensionales Gitter bewegt, und die Ramanspektren wurden mit
einer Erfassungszeit von 1 s pro Gitterpunkt erfasst.
-
Die
Wellenlängenkalibrierung
der Spektren erfolgte unter Verwendung dreier bekannter Raman-Kalibrierstandards
(4-Acetamidophenol, (Fa. Sigma), Naphthalin, Cyclohexan (Fa. ICN
Biochemicals)), und der Emissionslinien einer Neon- und einer Neon-Argon-Lampe.
Die Spektren wurden um die kosmische Strahlung korrigiert und unter
Verwendung einer kalibrierten Tungstenlampe mit bekannter Temperatur
um die wellenlängenabhängige Detektionseffizienz
der Vorrichtung korrigiert. Anschließend wurde das von den optischen
Elementen im Emissionsweg des Laserlichts stammende Störgeräusch abgezogen.
-
Verarbeitung der Ramandaten
-
Für die gesamte
Datenverarbeitung wurde Matlab 6.1 Version R12 (Fa. Mathworks Inc.,
Natick, MA) verwendet.
-
Die k-Means-Clusteranalyse
-
Es
wurde die Hauptkomponentenanalyse (PCA), gefolgt von der k-Means-Clusterananlyse
(KCA) eingesetzt, um die Heterogenität der Ramanspektren in jeder
Gewebeprobe zu bestimmen. Dieser Gruppenanalysenalgorithmus wurde
eingesetzt, um Gruppen von Spektren mit ähnlichen spektralen Merkmalen
(Cluster) zu finden. Kurz gesagt, die Analyse wurde auf Grund von
normalisierten Ableitungen erster Ordnung der Spektren (2700 to
3100 cm-1) durchgeführt, um jeden Einfluss der
Veränderung
der absoluten Intensität
des Ramansignals klein zu halten und um ein schwaches, sich langsam
veränderndes
Störgeräusch zu
korrigieren, das auf eine schwache Selbstfluoreszenz des Gewebes
zurückzuführen ist.
Zuerst wurden die Spektren der PCA unterzogen, um die zur Darstellung
der Streuung im spektralen Datensatz notwendigen Parameter zu orthogonalisieren
und deren Anzahl zu reduzieren. Es wurden die ersten 100 Hauptkomponenten
berechnet, die typischerweise für
99% der Signalstreuung verantwortlich sind. Die für jedes
Spektrum erhaltenen PC-Werte wurden als Eingangsgrößen für die KCA
verwendet. Die Anzahl der Cluster, in die die Spektren durch KCA gruppiert
werden, wird vom Benutzer definiert. Nach der KCA wurde jedem Cluster
ein bestimmter Grauton zugeordnet. Jedem Gitterelement der Raman-Map
wurde dann der Grauton des jeweiligen Clusters zugeordnet. Auf diese
Weise wurde ein Grautonbild der gefrorenen Sektion geschaffen, worin
Flächen
mit ähnlichen Spektren
denselben Grauton hatten. Schließlich wurde das gemittelte
Ramanspektrum eines jeden Clusters berechnet.
-
1 zeigt das Ergebnis eines Raman-Mapping
Experiments, in dem die Spektren von einem dünnen Querschnitt einer nicht
fixierten humanen atherosklerotischen Arterienwand in einem 2-dimensionalen
Gitter von 80 × 70
Punkten erhalten wurden. Die Unterschiede zwischen den von Gitterpunkten
mit dem gleichen Grauton erhaltenen Spektren waren kleiner als zwischen
von Gitterpunkten mit verschiedenem Grauton erhaltenen Spektren,
wie durch eine k-Means-Cluster-Analyse der Daten festgestellt wurde.
Die Gitterpunkte des Gewebes mit gleichem Grauton haben also eine ähnliche
Zusammensetzung. Die Gitterpunkte des Gewebes mit verschiedenem
Grauton weisen bedeutende Unterschiede ihrer Molekularzusammensetzung
auf.
- A) Das Ergebnis einer k-Means Cluster-Analyse mit 4
Cluster. Cluster 1 stimmt mit adventitiellem Fett überein. Cluster
2 stimmt mit der Arterienwand überein.
Cluster 3 und 4 stimmen mit der atherosklerotischen Läsion überein.
- B) Cluster-gemittelte Ramanspektren für Cluster 1, 2, 3 und 4.
-
Die
Unterschiede zwischen den Spektren in 1B, sowie
die hochstrukturierte Lokalisierung der Gewebegitterpunkte mit sehr ähnlichen
Spektren (die einem Cluster angehören) illustrieren die Empfindlichkeit der
Ramanspektroskopie bei hohen Wellenzahlen gegenüber der Architektur einer atherosklerotischen Plaque,
was ihre Molekularzusammensetzung anbelangt. Aus den Spektren kann
Information betreffend die Molekularzusammensetzung der Gewebegitterpunkte
z.B. durch ein klassisches Anpassungsverfahren mit der Methode der
kleinsten Quadrate abgeleitet werden, worin die Gewebespektren an
Spektren z.B. von isolierten Verbindungen, die im Gewebe vorhanden
sein können,
angepasst werden.
-
2 zeigt
Spektren solcher Verbindungen: A: Elastin, B: Cholesteryllinoleat,
C: Cholesteryloleat, D: Cholesteryllinolenat, E: Cholesterylpalmitat,
F: Typ-1-Kollagen, G: Trilinolein, H: Triolen, I: Tripalmitin, J:
Cholesterin. Die Figur zeigt, dass diese Verbindungen, die in der
atherosklerotischen Plaque und in der Arterienwand vorhanden sein
können,
im interessierenden Spektralbereich unterschiedliche Ramansignale
aufweisen. Die Ramanspektren dieser Chemikalien wurden unter Verwendung
derselben Ramanvorrichtung aufgenommen, wie die für die in 1 dargestellten Messungen.
-
Tabelle
1 zeigt das Ergebnis einer Anpassung durch die Methode der kleinsten
Quadrate der Cluster-gemittelten Spektren 1 bis 4 von 1B an
die Spektren der reinen Verbindungen von 2 und einem Polynom
ersten Grades zum Einbeziehen eines eine leichte Steigung aufweisenden
Rauschens. Cluster-gemittelte Ramanspektren wurden an den Ramanspektrensatz
dieser reinen Verbindungen angepasst, wobei eine nicht-negative
(d.h., dass nur positive Anpassungskoeffizienten erlaubt sind) lineare
Anpassungsroutine mit der Methode der kleinsten Quadrate verwendet
wurde. Das Polynom ersten Grades wurde in die Anpassung aufgenommen,
um einem schwachen (Fluoreszenz-)Rauschen Rechnung zu tragen. Die
Summe der nicht-negativen Beiträge
der Verbindungsspektren zur Kleinstquadratanpassung wurde auf 100
% angesetzt.
-
Die
angegebenen Prozentsätze
beziehen sich auf die relativen Signalbeiträge der in
2 dargestellten
Protein-, Cholesterin-, Triglicerid- und Cholesterinester-Spektren.
Die Signalbeiträge
der verschiedenen Cholesterinester („gesamte Triglyceride") sowie jene von
Kollagen und Elastin („gesamte
Protein") wurden
zusammengezählt. Tabelle 1: Aus verschiedenen Abschnitten
einer eine atherosklerotische Läsion
enthaltenden Arterienwand erhaltene relative Signalbeiträge des Cholesterin-,
Cholesterinester-, Triglycerid- und Proteinsignals
Cluster | Ort | Cholesterin | Gesamte
Cholesterin-ester | Gesamte
Triglyceride | Gesamtes
Proteine |
1 | Adventitielles Fett | 0% | 11% | 88% | 1% |
2 | Normale
Arterienwand | 2% | 0% | 0% | 98% |
3 | Atherosklerotische
Läsion | 14% | 33% | 29% | 24% |
4 | Die
die Arterienwand umgebende Läsion | 2% | 21% | 3% | 73% |
-
3 zeigt
das Ergebnis des Vergleichs der Lipidzusammensetzung von Segmenten
humaner Arterien, wie sie durch Ramanspektroskopie und HPTLC (High
Performance Thin Layer Chromatography = Hochleistungs-Dünnschichtchromatographie)
bestimmt wurden. 58 Arteriensegmente von etwa 1 cm2 wurden
unter einem Ramanmikrospektrometer gescannt, wobei das Ramansignal
im höheren
Wellenzahlenbereich eingesammelt wurde (dasselbe Instrument wie
für die 1 und 2 verwendetes).
Nach den Ramanmessungen wurden die Lipide aus den Artereinsegmenten
extrahiert und durch HPTLC analysiert. Die gesamte Lipidfraktion
wurde auf 100 % normalisiert. Es wurde ein auf die Raman- und HPTLC-Ergebnisse
für 57
Segmente gestütztes
partielles Kleinstquadratmodell entwickelt und auf das 58. Segment
des Ramanspektrums angewendet, um dessen Lipidzusammensetzung vorauszuberechnen.
Das Ergebnis wurde mit dem Resultat der HPTLC-Analyse des 58. Segments
verglichen. Diese Einschätzung
für ein
ausgelassenen Elements wurde für jedes
der 58 Segmente wiederholt, 3 zeigt
einen Vergleich zwischen der Ramanmethode für höhere Wellenzahlen zur Bestimmung
der Lipidzusammensetzung in humanen Arterien (in situ) und HPTLC
zur Bestimmung der relativen Gewichtsanteile von Cholesterin, gesamten
Cholesterinestern und gesamten Triglyceriden. Es wurden hohe Korrelationskoeffizienten
erhalten (r = 0,95 für
Cholesterin, r = 0,93 für
Cholesterylester, r = 0,96 für
Triglyceride).
-
Das
Experiment zeigt, dass die Ramanmessungen im erfindungsgemäßen Spektralbereich
sehr gute Ergebnisse und mit der HPTLC vergleichbare Information
liefern, weshalb die Ramanspektroskopie als In-vivo-Technik zur
Untersuchung der atherosklerotischen Plaque einsetzbar ist.
-
Beispiel 2: Raman-Mapping von Krebsgewebe
-
Dieses
Experiment belegt die Möglichkeiten
der Ramanspektroskopie im erfindungsgemäßen Spektralbereich zur Untersuchung
von Krebsgewebe.
-
Der
Bereich der hohen Wellenzahlen kann ebenfalls vorteilhaft in verschiedenen
klinischen onkologischen Anwendungen eingesetzt werden. 4A zeigt
zum Beispiel eine von einer dünnen
Gewebesektion von mit Meningiomen infiltrierter humaner Dura auf ähnliche
Weise wie die Karte der in 1 dargestellten atherosklerotischen
Läsion
erhaltene Raman-Map. Zur Zeit ist keine entsprechende intraoperative
Einschätzung
des Exzisionsrands möglich.
Allerdings ist bekannt, dass das zurückgelassene Meningiomgewebe
zum Wiederauftreten des Tumors führen
kann. 4B zeigt ein Bild eines benachbarten
Gewebebereichs nach Färben
mit Hematoxylin und Eosin (H&E-gefärbt). Überraschenderweise
zeigen die histopathologische Einschätzung dieser Sektion und deren
Vergleich mit der Raman-Map, dass die hellgrauen Flächen der
Dura entsprechen, während
die dunkelgrauen Flächen
den Meningiomen (MG) entsprechen.
-
Das
Experiment beweist, dass die Ramanmessungen im erfindungsgemäßen Spektralbereich
wertvolle Informationen über
das Krebsgewebe des Gehirns liefern, weshalb die Ramanspektroskopie
als In-vivo-Technik zur Untersuchung derartigen Gewebes einsetzbar
ist.
-
Beispiel 3: Raman-Mapping von Krebsgewebe
-
Dieses
Experiment belegt die Möglichkeiten
der Ramanspektroskopie im erfindungsgemäßen Spektralbereich bei der
Untersuchung von Krebsgewebe.
-
5A zeigt
eine Raman-Map einer dünnen
Sektion humaner Glioblastomen mit Abschnitten sowohl vitaler Tumore
als auch nekrotischen Gewebes. Überraschenderweise
zeigt der Vergleich der Ramankarte mit der benachbarten H&E-gefärbten, von
einem Neuropathologen eingeschätzten
Sektion, dass die hellgrauen Flächen
dem vitalen Tumor entsprechen, während
die dunkelgrauen Flächen
auf der Raman-Map nekrotischem Gewebe entsprechen.
-
Das
Experiment beweist, dass die Ramanmessungen im erfindungsgemäßen Spektralbereich
wertvolle Informationen über
das Krebsgewebe des Gehirns liefern, weshalb die Ramanspektroskopie
zur Unterscheidung zwischen vitalem Tumorgewebe und nekrotischem
Gewebe einsetzbar ist.
-
Beispiel 4. Schematische Darstellung eines
Ramanspektrometers.
-
6 zeigt
eine typische Vorrichtung zur Ramanmessung und -analyse umfassend
einen Laser 100, die Einkopplungsoptik 110, mit
deren Hilfe das Laserlicht auf einem ersten Lichtweg 105 in
einen faseroptischen Messkopf 120 eingekoppelt wird, der
das Laserlicht zum zu untersuchenden Gewebe 130 hin transportiert
und das vom Gewebe zurück
gestreute Licht einsammelt und es zurück zur Einkopplungsoptik 110 transportiert,
ein Filter 140, das einen Lichtweg 145 für das vom
Gewebe 130 zurück
gestreute, im Vergleich zum Laserlicht des Lasers 100 wellenlängenverschobene
Licht schafft, ein Filter 150 zur starken Dämpfung des
zurückgebliebenen
Lichts derselben Wellenlänge
wie das Laserlicht im Lichtweg 145, eine Messeinheit 160,
welche die Intensität
des ramangestreuten Lichts bei einer Vielzahl von Wellenlängen misst,
eine Signalspeichereinheit 170 die elektronisch mit der
Messeinheit 160 verbunden werden kann und welche die gemessenen Intensitäten speichert,
und eine Signalanalyseeinheit 180, die mit der Signalspeichereinheit 170 mechanisch verbunden
sein kann oder nicht, oder die mit der Signalspeichereinheit 170 übereinstimmen
kann, und welche die gemessenen Signale analysiert, z.B. um Information über die
Molekularzusammensetzung des Gewebes 130 zu liefern oder
um die Klassifikation des Gewebes, z.B. die Bestimmung der klinischen
Diagnoseklasse, der das Gewebe angehört, zu ermöglichen. Das System kann eine
Einheit umfassen, die ein hörbares
oder sichtbares Signal abgibt wenn bestimmtes Gewebe angetroffen
wird. Die Erfindung ist nicht auf diese Konfiguration beschränkt. Der
Fachmann kann die Komponenten, die gemäß seines Wissens erwünscht oder
erforderlich sind, wechseln und/oder auswählen.
-
Beispiel
5 Schritte zur Durchführung
einer Gewebeanalyse Dieses Experiment beschreibt die zur Durchführung einer
Gewebeanalyse unter Verwendung der Ramanspektroskopie bei hohen
Wellenzahlen. Die Schritte können
auf verschiedene Weisen implementiert werden (folgende Beschreibung
der Schritte ist deshalb nur beispielhaft und hat keinerlei einschränkende Bedeutung):
- 1) Das Gewebe wird mittels einer Faser beleuchtet
und das vom Gewebe zurück
gestreute Licht wird von derselben Faser eingesammelt.
- 2) Das Ramanspektrum des eingesammelten Lichts wird in der Form
Signalintensität
gegenüber
Detektorkanalnummer erfasst.
- 3) Das gemessene Spektrum wird vor der Endanalyse vorher bearbeitet.
Dieser Vorbearbeitungsschritt kann die Wellenlängenkalibrierung der Detektorkanäle, eine
Anpassungskorrektur aufgrund der wellenzahlenabhängigen Effizienz der Signaldetektion,
eine Anpassungskorrektur der gemessenen Spektren um den Beitrag
des irgendwo innerhalb des Ramanmesssystems erzeugten Störgeräuschs, das
aber nicht vom untersuchten Gewebe stammt.
- 4) Die Analyse der vorbearbeiteten Spektren. Zum Beispiel kann
eine klassische Kleinstquadratmethode verwendet werden, worin das
gemessene Spektrum an Spektren der Verbindungen angepasst wird,
von denen bekannt ist, dass sie im Gewebe in genügend großen Mengen vorhanden sein können, um
einen detektablen Beitrag zum gesamten Gewebespektrum zu haben,
und z.B. ein Polynom mit Koeffizienten, die ebenfalls angepasst
werden können,
um dem sich langsam verändernden
Rauschen in den Spektren Rechnung zu tragen, der z.B. auf in der
Probe angeregte Fluoreszenz zurückzuführen ist.
Werden die Spektren der Verbindungen vor der Anpassung der Gewebespektren
daran, derart in der Intensität
genormt, dass die aus einer Anpassung des Spektrums einer gleiche
Mengen dieser Verbindungen enthaltenden Probe hervorgegangenen Anpassungskoeffizienten
an die Spektren der Verbindungen gleich sind, dann sind die Anpassungskoeffizienten,
abgesehen von der Tatsache, dass in der Praxis verschiedene Effizienzwerte
für die
Signalerfassung von verschiedenen Gewebemengen gültig sind, und dass das Gewebe
als Molekularzusammensetzung heterogen sein kann, direkt proportional
mit den prozentuellen Gewichtsanteilen der jeweiligen im Gewebe
vorhandenen Verbindungen, vorausgesetzt, dass das Gewebe genügend homogen
ist. Ist das nicht der Fall, wird die bestimmte Zusammensetzung
zwar qualitativ aber nicht notwendigerweise auch quantitativ der
tatsächlichen
Zusammensetzung entsprechen. Da zum Beispiel die Arterienwand und
die atherosklerotische Plaque keine homogene Molekularzusammensetzung
besitzen, und da geometrieabhängig
das Ramansignal von verschiedenen Gewebemengen mit unterschiedlicher
Effizienz eingesammelt wird, sowie wegen der Signaldämpfung innerhalb
des Gewebes werden bestimmte Gewebemengen mit potentiell unterschiedlicher
Zusammensetzung stärker
zum Signal beitragen als andere. Die prozentuellen Gewichtsanteile
der im Gewebe vorhandenen Verbindungen können die eigentliche angestrebte
Information darstellen, oder sie können zur Bestimmung des Gewebetyps
oder dessen klinischer Gewebeklasse dienen. Alternative Ansätze zur
Bestimmung der prozentuellen Gewichtsanteile bestimmter Verbindungen
oder Gruppen von Verbindungen umfassen die bekannte partielle Kleinstquadratanalyse.
Es können
auch andere Ansätze
der multivariaten statis tischen Analyse zur Bestimmung der klinischen
Diagnoseklasse eines Gewebes zum Einsatz kommen wie z.B. die Hauptkomponentenanalyse,
die lineare Diskriminantenanalyse oder z.B. die auf künstlichen
Neuralnetzen basierten Methoden.
- 5) Die Lieferung der erwünschten
Daten in lesbarer oder hörbarer
Form, sowie die Speicherung der Daten mit entsprechenden Hinweisen
für die
zukünftige
Auswertung und/oder für
den Querverweis mit anderen Daten, wie z.B. Koordinaten der Messposition,
oder Abbildungen der Stelle, an der das Ramanspektrum aufgenommen
wurde, z.B. eine Angiogramm oder intravaskuläre Ultraschall-Abbildungen.
-
Beispiel 6 Lipidmessungen
-
7 zeigt
ein mit einer Ramaneinrichtung gemäß 6 erhaltenes
Spektrum (A) eines Lipidgemisches. Hier war der Laser 100 ein
Laserlicht bei 720 nm erzeugender Ti-Saphir Laser (Modell 3900S
der Fa. Spectra Physics, USA). Das Filter 140 war ein eigens
dafür erstelltes
dielektrisches Filter (erzeugt von der Fa. Ornitec, UK), das das
Laserlicht bei 720 nm durchlässt
und das von der Probe zurückkehrende
Licht mit einer Wellenlänge über 850
nm reflektiert. Die Richtung des einfallenden Laserlichts und die
Normale zur Filteroberfläche
bildeten einen Winkel von 15 Grad. Die Linse 110 war ein
Mikroskopobjektiv für
den Nahinfrarotbereich (x20 PL-FL Nachet, numerische Apertur 0,35).
Die optische Faser 120 war eine WF200/220A optische Faser der
Fa. Ceramoptec. Das Filter 150 war ein Farbglasfilter RG
780 (Fa. Schott). Das vom Filter 150 durchgelassene Licht
wurde auf eine Faser mit einem Kern von 1000 μm abgebildet, die an ein rundes
Bündel
aus 64 Fasern mit einem Kerndurchmesser von 100 μm angeschlossen war. Am distalen
Ende des Bündels
wurden die Fasern linear angeordnet und das Licht in dieser Anordnung
in das Spektrometer 160 geleitet. Das Spektrometer 160 war
ein Renishaw System RA 100 bildgebendes Spektrometer mit einer Deep
Depletion CCD-Kamera zur Mehrkanaldetektion. Gezeigt werden ebenfalls
das Spektrum des faseroptischen Messkopfs selbst (B, erhalten in
Abwesenheit von einer Probe am distalen Ende der optischen Faser)
und ein Differenzspektrum A-B, das zeigt, dass mit einer entsprechend
ausgewählten,
ohne Filter versehenen Faser, Spektren hoher Qualität von Proben
mit ähnlicher
Molekularzusammensetzung, wie sie in atherosklerotischem Gewebe
anzutreffen sind, erhalten werden können.
-
8 zeigt Ramanspektren (t) einer normalen
Arterienwand (A) und einer atherosklerotischen Arterienwand (B),
die Ergebnisse (f) einer Kleinstquadratanpassung dieser Spektren
an den in 2 gezeigten Spektrensatz gereinigter
Komponenten, und die Residualspektren (r), die das in den Gewebespektren
enthaltene Signal darstellen, das durch den Satz der zur Anpassung
verwendeten Spektren nicht belegt ist. Wie aus der schwachen Intensität der Residualspektren
ersichtlich ist, ist die Anpassung der Spektren sehr genau und erlaubt
die Erhaltung ausführlicher
Information betreffend die Molekularzusammensetzung der Gewebe.
Dieses Ergebnis ist als Beispiel angeführt. Der Satz von Verbindungsspektren,
die zur Anpassung der Gewebespektren verwendet werden kann, kann
zum Beispiel aus anderen Spektren oder aus einer unterschiedlichen
Anzahl Spektren zusammengesetzt sein.
-
Tabelle
2 zeigt eine Aufstellung der prozentuellen Gewichtsanteile von Verbindungen
oder Gruppen von Verbindungen aus den Arterienproben, deren Spektren
in den
8A und
8B dargestellt
sind, wie sie auf Grund der Ergebnisse der Anpassungsanalyse mit
der Kleinstquadratmethode bestimmt worden sind. Das Spektrum der
normalen Arterie wird von Beiträgen
der Triglyceride dominiert, die Beiträge des adventitiellen Fettsignals
darstellen, wobei, im Gegensatz zu dem von der atherosklerotischen
Arterie erhaltenen Signal, das wesentliche Signalbeiträge von Cholesterin
und Cholesterinestern enthält,
keine oder unwesentlich kleine Signalbeiträge von Cholesterin und Cholesterinestern
umfasst. Tabelle 2 Gewichtsanteile von Verbindungen
oder Gruppen von Verbindungen aus den Arterienproben, deren Spektren
in den Figuren 8A und 8B dargestellt sind,
| Normale
Arterie | atherosklerotische
Arterie |
Cholesterinoleat | 0,0078 | 0,3776 |
Cholesteryloleat | 0 | 0,0532 |
Cholesteryllinolenat | 0,02 | 0 |
Cholesterylpalmitat | 0,0187 | 0,1155 |
Trilinolein | 0,0477 | 0,0235 |
Triolen | 0,7937 | 0,1436 |
Tripalmitin | 0,0032 | 0 |
Cholesterin | 0 | 0,1530 |
Kollagen | 0,063T | 0,0756 |
Elastin | 0,0456 | 0,0574 |
-
Das
Experiment zeigt dass das erfindungsgemäße Spektrometer die Ramanspektroskopie
als in vivo Technik zur Untersuchung der atherosklerotischen Plaque
befähigt,
nun aber mit den oben genannten Vorteilen dieses Spektrometers.
-
Beispiel 7 Instrument umfassend Fasern
zur Messung von Fluoreszenz und NIR-Absorption
-
9 zeigt
schematisch eine Ausführungsform,
in der die Ramanspektroskopie mit Fluoreszenz- und NIR-Absorptionsspektroskopie
gekoppelt wird. Diese Ausführungsform
weist eine einzige Faser auf der rechten Seite der Figur auf, und
Anregungslicht, das über
Reflektoren in die Faser eingekoppelt wird. Derselbe oder ein anderer
Reflektor wird zur Entkopplung des Fluoreszenzlichts des erhaltenen
Signals aus der optischen Faser heraus zur Detektoreinheit eingesetzt.
Weiter rechts, koppelt ein anderer Reflektor Licht in die Faser,
zur Erzeugung eines Ramansignals einer Probe. Derselbe oder ein
anderer Reflektor wird zur Entkopplung des Ramansignals aus der
optischen Faser heraus zur Detektoreinheit eingesetzt. Auf der rechten
Seite der Figur, wird das Licht einer NIR-Quelle in die Faser eingekoppelt,
und das von derselben Faser zurück
geführte NIR-Signal
von einem geeigneten Detektor gemessen. Die Messungen können sequenziell
oder gleichzeitig durchgeführt
werden. Die dargestellte Faser kann auch ein Faserbündel sein.
Es lieg im Rahmen des Könnens eines
Fachmanns, die Optik, die Lichtquellen, die Detektoreinheiten usw.
diesem Zweck, sowie dem zu messenden Gewebe oder der erwünschten
Information anzupassen.
-
Im
Vorhergehenden sind zwar bestimmte Ausführungsformen der Erfindung
beschrieben, aber es liegt nahe, dass die Erfindung auch auf anderer
als die beschriebene Weise durchgeführt werden kann. Zum Beispiel
kann das Messinstrument ebenfalls zur Messung biologischer Moleküle, wie
z.B. Lipide usw. in anderen Proben außer Gewebe eingesetzt werden,
z.B. zur Analyse von Milch, Öl,
usw. Die Beschreibung und die Beispiele sollen auf keinen Fall die
Erfindung einchränken.